EP2343374A1 - Molécules d'acides nucléiques d'HDV, leurs fragments et leurs applications - Google Patents

Molécules d'acides nucléiques d'HDV, leurs fragments et leurs applications Download PDF

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EP2343374A1
EP2343374A1 EP10005982A EP10005982A EP2343374A1 EP 2343374 A1 EP2343374 A1 EP 2343374A1 EP 10005982 A EP10005982 A EP 10005982A EP 10005982 A EP10005982 A EP 10005982A EP 2343374 A1 EP2343374 A1 EP 2343374A1
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EP
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hdv
seq
genome
fragment
sequences
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EP10005982A
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EP2343374B1 (fr
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Paul Deny
Nadjia Radjef
Patricia Huc-Anais
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Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
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Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid molecules derived from new strains or isolates of the hepatitis D virus constituting genotypes different from the known genotypes I, II and III, their fragments, the corresponding proteins, as well as their applications as diagnostic reagents.
  • the present invention also relates to a method for the sensitive diagnosis of hepatitis D virus (or hepatitis delta virus) as well as to a method for epidemiological monitoring of HDV infections.
  • the hepatitis D virus (HDV or HDV, for hepatitis D virus ) or delta is a hepatitis B satellite virus.
  • This virus has a particular structure: a chimeric structure associating with the specific components of HDV (viral RNA and HD proteins), an envelope comprising the three glycoproteins of HBV: large (preS1-preS2-S), medium (preS2-S) and small (S).
  • the mean diameter of the HDV particles is between that of the mature HBV particles (DANE particles: 42 nm) and that of the empty HBV envelopes (spherical or filamentous shapes: 22 nm) and the flotation density is 1.24 -1.25 g / cm 3 .
  • HDV RNA is circular and of negative polarity.
  • HDV RNA replicates independently of HBV, whose role is limited to providing the envelope of HDV.
  • the only proteins found (sHD and LHD) are encoded by antigenome RNA which, in the infected cell, is complete, circular and pseudo double-stranded, serves as a replication intermediate and supports editing.
  • HDV RNA belongs to a specific type of ribozyme.
  • the auto-cleavage reaction requires RNA and a divalent cation (Mg ++ ). Cleavage creates a 2 ', 3' cyclic phosphate end and a 5 'hydroxyl end.
  • the delta ribozymes (genomic and anti-genomic) have a secondary configuration close pseudo-node.
  • the sequences involved mainly or exclusively include sequences located 3 'from the self-cleavage site (about 84 nucleotides).
  • HDV mRNA encodes a protein of which there are two forms: a 194-195 amino acid protein (form 's' for small) of 24 kilodaltons (kDa) and a protein of 214 Amino acids ('L' form for Large) of 27 kDa, which exist in varying proportions.
  • These proteins carry 'delta' antigenicity and are detected in the liver or serum of infected patients or animals (chimpanzee, marmot).
  • These two sHD and LHD viral proteins are initiated at the first ATG of the open reading frame at position 1598 (according to the Wang et al., 1986 or 1987 numbering) of the antigenomic RNA.
  • RNA-dependent adenosine deaminase cell enzyme During replication, a mutation, dependent on a double-stranded RNA-dependent adenosine deaminase cell enzyme, appears at position 1012, transforming the amber stop codon (UAG) into a tryptophan codon (UGG), lengthening to 3 the reading frame of 19 or 20 codons, and conferring on the two forms sHD and LHD different properties.
  • the mRNA is terminated by a poly (A) tail, 15 nucleotides after the polyadenylation consensus signal, AAUAAA (positions 954-959).
  • sHD activates the viral replication whereas LHD represses it and plays a role in the assembly of the viral particles.
  • These proteins are phosphorylated on the serine residues but not glycosylated (Table I). They consist of common functional domains and a domain specific to the large LHD protein.
  • the small and large proteins were further differentiated by monoclonal antibodies (clone 9E4) (Hwang and Lai, 1993a). These antibodies only recognized sHD (Lai et al., 1993). Since the amino acid sequence of the small protein is included in the large, these results suggest a different conformation between sHD and LHD within the 30 carboxy terminal amino acids of the small sHD protein, suggesting that the epitope recognized on sHD is masked in LHD. in non-denaturing conditions.
  • HDV is mainly transmitted through contaminated needles and blood, therefore via carriers of HDV or HBV.
  • hepatitis D occurs mainly among intravenous drug users, hemophiliacs and those who have received multiple transfusions.
  • Prevalence studies of HDV should be interpreted with caution. Indeed, in the populations studied, there is a preferential inclusion of patients with hepatopathies. In patients with acute or chronic hepatitis, the Prevalence of HDV infection is greater than in asymptomatic chronic carriers of HBV. In addition, the serologic investigation of an HDV infection is based on the detection of Ag-HD and total anti-HD Ab in the serum. As a result, acute benign infections, during which isolated transient production of anti-HD IgM would develop, would not be identified.
  • HDV is responsible for acute and chronic hepatitis. These infections are particularly severe and progress more rapidly to cirrhosis than hepatitis B alone. This is one of the reasons why the reliable diagnosis of HDV associated with HBV is crucial.
  • HDV infection is dependent on HBV.
  • HDV isolates from different geographical regions show genetic variability.
  • genotype-II is identified and designated genotype-III.
  • the genotype is used for the epidemiology of viral transmissions, makes it possible to study the geographical distribution and could be correlated with the pathogenicity.
  • Co-infection and superinfection are clinically indistinct.
  • Virological diagnosis is usually based on the different serum markers. More rarely, Ag-HD can be detected on anatomopathological sections of the liver biopsy.
  • the markers make it possible to follow the evolution of the disease towards healing or chronicity, to decide on the treatment of a patient and to evaluate its effectiveness.
  • HD-Ag is actually difficult to detect, while viraemia precedes the appearance of antibodies.
  • nucleic and protein reagents allowing the diagnosis of HDV, whatever the genotype, are necessary.
  • detection techniques are dependent on the genetic variability of the desired virus; the known reagents, in particular from the genotype-I, -II or -III specific sequences, do not make it possible to detect the variant HDV infections and in particular the HDV of genotype different from those mentioned above.
  • the detection techniques specified above may lead to negative results both at the nucleic level and with respect to the antibody response.
  • the detection and the taking into account of new variants are important to develop reagents of detection and diagnosis of hepatitis D (serodiagnosis, PCR, hybridization), sufficiently sensitive and specific, that is to say not leading not to false negative or false positive results: indeed, a negative anti-HD IgM / HDV-RNA IgM dissociation can, at present, be observed in the context of severe hepatopathy.
  • the inventors have therefore set themselves the goal of providing nucleic acid molecules of HDV capable of allowing the detection of a variant HDV with respect to the three previously described genotypes.
  • the R0 region is preferably obtained by amplification of the HDV RNA with primers 900S (SEQ ID NO: 33) and 1280AS (SEQ ID NO: 34).
  • nucleic acid molecule is intended to mean a cDNA or RNA molecule having one of the HDV genomic sequences as defined above and their sense and antisense complementary sequences. .
  • the positions of the fragments in the HDV genome are indicated on the genome-wide circular genome, according to the numbering of Wang et al., 1986 or 1987.
  • the invention also encompasses complementary nucleotide fragments of the foregoing as well as modified fragments, relative to the above, by removal, or addition of nucleotides in a proportion of about 15%, relative to the length of the above fragments and / or or modified at the nature of the nucleotides since the modified nucleotide fragments retain a hybridization capacity with the genomic or antigenome RNA sequences of the isolates as defined above.
  • these different viral strains in the same patient, at a given moment, shows a heterogeneous population of HDV RNA molecules; in addition, during chronic infection, in addition to the heterogeneities observed at the editing site (position 1012), mutations are likely to occur.
  • Viral sequences appear to evolve within viral populations with a variable substitution rate of 3.10-2 to 3.10 -3 per nucleotide per year.
  • fragments are specific and are used as probes or primers; they specifically hybridize to a variant HDV strain as defined above or to a related strain; HDV related to a variant as defined above, an HDV having a genetic divergence ⁇ 15%.
  • Such fragments are used for the detection and epidemiological monitoring of HDV infections.
  • the R0 fragment is used for the detection (RT-PCR) and genotyping (PCR-RFLP) of HDV.
  • the other fragments that cover the entire HDV genome are used for the molecular characterization of HDV variants; phylogenetic analysis of the complete sequence of the genome or fragments thereof corresponding in particular to R0 or R2 can link the profiles observed in PCR-RFLP to a given genotype or to characterize new genotypes.
  • the analysis step (3) may be carried out by restriction, sequencing or hybridization; in the latter case, the probe used (in particular in DNA chips) will advantageously be a fragment of 15 to 20 nucleotides, specific for said amplified fragments.
  • the amplification step (b) is advantageously carried out with primers 900S (SEQ ID NO: 33) and 1280AS (SEQ ID NO: 34).
  • the method according to the invention makes it possible to define new restriction profiles and to classify the HDVs into seven distinct genotypes.
  • this additional step can characterize new genotypes.
  • these complementary PCR-RFLP analyzes make it possible to link the new observed profile to a given genotype, or to characterize a new genotype, by phylogenetic analysis.
  • the present invention also relates to a recombinant vector, in particular a plasmid comprising an insert consisting of a nucleic acid molecule as defined above.
  • the present invention also relates to a cell transformed with a nucleic acid molecule as defined above.
  • the present invention also relates to translation products encoded by one of the RNA molecules of SEQ ID NO: 1, 6, 11, 16, 21 and 26 respectively corresponding to the complete genomic RNA isolates or variants respectively designated dFr45, dFr47, dFr73, dFr910, dFr48 and dFr644 or by their complementary sense or antisense sequences.
  • the present invention also relates to the proteins encoded by the genome of a variant HDV as defined above.
  • the present invention further relates to the use of a nucleic acid molecule as defined above or of a protein as defined above for the preparation of a detection and genotyping kit. an HDV.
  • RNAs are precipitated with 500 ⁇ l of cold isopropanol, in the presence of 1 ⁇ g of glycogen.
  • the samples are centrifuged at 14,000 rpm for 10 min at + 4 ° C. After rinsing with 70% ethanol, the tubes are again centrifuged at 14,000 rpm for 10 min at + 4 ° C. The pellets are dried under a hood at room temperature and then taken up in 100 .mu.l of sterile water comprising a ribonuclease inhibitor (RNasin, Promega). At this stage, precautions are taken to avoid possible contamination of buffers and samples by ribonucleases.
  • a ribonuclease inhibitor Rasin, Promega
  • This step consists in synthesizing a DNA strand complementary to the HDV RNA by reverse transcription.
  • RNA extracted previously are added to a reaction mixture containing 5 .mu.l (or 0.5 pmoles) of deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) and 1 .mu.l (0.4 pmoles) d random hexanucleotides.
  • dNTPs deoxynucleotide triphosphates
  • 1 .mu.l 0.4 pmoles
  • RNA samples Ten ⁇ l of a reaction mixture, containing 2.5 ⁇ l of dithiothreitol (DTT), 100 units (U) of Superscript II reverse transcriptase, (Gibco BRL, Life Technologies) and its reaction buffer, as well as 20 U of ribonuclease inhibitor (RNasin, Promega) are added to the denatured RNA.
  • DTT dithiothreitol
  • U Superscript II reverse transcriptase
  • Rasin ribonuclease inhibitor
  • the amplification of the cDNAs is carried out, exponentially, by PCR ( Polymerase Chain Reaction ).
  • Two types of polymerase were used: AmpliTaq Gold polymerase ( Thermophilus aquaticus ) (PE Applied Biosystems) and Pwo polymerase ( Pyrococcus woesi ) or Expand TM High Fidelity PCR System (Roche).
  • the amplification was carried out starting from 5 ⁇ l of cDNA which are added to a PCR reaction mixture containing: 0.25 pmoles / ⁇ l sense and antisense primer (Table III), 200 ⁇ mol of each dNTP, 1, 5 mM MgCl 2 , 1 U AmpliTaq Gold or 2.6 U Expand TM polymerase in the presence of corresponding PCR buffers.
  • the PCR reaction was carried out in a thermocycler (PCR Sprint, Hybaid, Coger), according to the following protocol: denaturation of the cDNA-RNA hybrids at 94 ° C.
  • the pair of primers 6S and 6As makes it possible to amplify a DNA fragment corresponding to the carboxy-terminal end of the gene coding for the delta antigen.
  • the R0 region comprising the carboxy-terminal end of the gene encoding HD-Ag and a portion of the non-coding region was amplified for all samples using primers 900S (SEQ ID NO: 33) and 1280As (SEQ ID NO: 34).
  • the 900S primer used was deleted 7 nucleotides at the 5 'end, compared to that used by Casey et al., 1993a, supra, for the classification of HDV genotypes.
  • the complete sequences of the HDV viral genome of four samples were obtained by amplification of two overlapping regions R'1 (850 bases) and R'2 (1050 bases), respectively, using the primer pairs 318S / 1150AS and 960S / 345AS.
  • the R0 nucleotide sequence made it possible to define new and sample-specific primers to amplify the complete genome.
  • Two pairs of primers were chosen: primers R910S and R910AS, amplifying a fragment of 1400 bases corresponding to the G910 region.
  • Another pair of primers S1910R and AS1910R amplifying a fragment of 650 bases (region p910) was essential to cover the entire genome.
  • a volume of 8 ⁇ l of the PCR product is deposited in the presence of 2 ⁇ l of deposition solution in a 1.3% agarose gel prepared in 0.5X Tris-Borate / EDTA buffer and containing 0.5 ⁇ g / ml. ethidium bromide (BET). Electrophoresis is performed in 0.5X TBE buffer. The migration is carried out in the presence of a size marker (Raoul TM , Appligene). The amplified fragment is visualized under ultraviolet radiation at 312 nm and photographed.
  • the amplification products Prior to the cloning and sequencing step, the amplification products were purified to remove any traces of salts and enzymes.
  • This step is carried out in the case where the amplification of the product has been carried out with Pwo polymerase. It makes it possible to add the deoxyadenosine residues (A) to the 3 'ends of the PCR products, because the Pwo polymerase, with a 5' ⁇ 3 'exonuclease activity, decreases the incorporation of deoxyadenosines. .
  • a volume of 10 ⁇ l of purified DNA is added to a reaction mixture of 70 ⁇ l containing: 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl 2 , 1X buffer and 2.5 U Taq Polymerase (Perkin Elmer) . Elongation is performed at 72 ° C for 30 minutes. The PCR products are then re-purified with phenol-chloroform and ethanol precipitation and then taken up in 10 ⁇ l of sterile water.
  • Cloning is used to confirm the nucleotide sequence of the amplified DNA. It is carried out using the vector pCRII (Invitrogen).
  • the vector pCRII is in linear form. It has residues of deoxythymidine (T) allowing the cloning of the amplified product thanks to the additional residues of deoxyadenosine (A) added by the Taq polymerase. It also has the promoter sequences Sp6 and T7, two Eco RI restriction sites that frame the PCR product insertion site and the ampicillin and kanamycin resistance genes. A fraction of the lac Z ⁇ gene coding for ⁇ -galactosidase facilitates the selection of recombinants by colony color. Indeed, the plasmids having integrated the insert do not express the lac Z ⁇ gene.
  • the bacterial colonies are then white in the presence of ⁇ -galactosidase substrate (X-Gal or 5-bromo 4-chloro-3-indoyl ⁇ -galactoside, Roche) and a gene inducer (IPTG or isopropyl-thio ⁇ -D -galactoside, Roche).
  • ⁇ -galactosidase substrate X-Gal or 5-bromo 4-chloro-3-indoyl ⁇ -galactoside, Roche
  • IPTG isopropyl-thio ⁇ -D -galactoside
  • the selected insert / vector molecular ratio is 3/1 and the volume of PCR product used is variable, depending on the amount of DNA estimated by electrophoresis in agarose gel as previously described.
  • the reaction mixture of 10 .mu.l contains 50 ng of pCRII vector, the corresponding amount of insert, 4 U of T4 DNA Ligase, and 1X Ligase buffer.
  • the ligation reaction is conducted for 18 hours at 14 ° C.
  • the tubes are then stored at + 4 ° C.
  • the bacteria Escherichia coli TOP10F '(Invitrogen), made competent by treatment with calcium chloride, are stored at -80 ° C., ready for use.
  • a volume of 50 .mu.l of competent bacteria is brought into contact with 3 .mu.l of the ligation solution for 30 minutes in ice.
  • Heat shock (30 sec at 42 ° C) penetrates the plasmid DNA into the bacteria, which are immediately put back on ice for a few minutes, before being incubated for 1 hour at 37 ° C., in 250 ⁇ l of SOC medium (Tryptone 2%, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl 2 , 20 mM glucose, yeast extracts 5 g / l).
  • SOC medium Tryptone 2%, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl 2 , 20 mM glucose, yeast extracts 5 g / l.
  • the colonies are then isolated on Petri dishes containing LB agar (Luria-Bertani medium), supplemented with ampicillin (50 ⁇ l / ml), 40 ⁇ l of X-Gal (40 mg / ml) and 40 ⁇ l of IPTG ( 100 mM) are distributed.
  • the white colonies are inoculated into LB-ampicillin broth (50 .mu.l / ml) and incubated for 18 hours at 37.degree. C. with stirring.
  • a blue colony, that is to say not having inserted a fragment is retained as a negative ligation control.
  • the plasmid extraction is carried out using a QIAprep® Spin Miniprep commercial kit (Qiagen). Briefly, after centrifugation (3000 rpm at + 4 ° C.) and removal of the supernatant, the bacterial pellet is suspended in 250 ⁇ l of buffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA, 100 ⁇ l / ml RNase). and lysed by addition of 250 .mu.l of alkaline buffer (200 mM NaOH, 1% SDS). After 5 min of homogenization, 350 ⁇ l of buffer (3M potassium acetate, pH 5.5) are added. The supernatant containing the plasmid DNA is then transferred to a QIAprep column. Centrifugation removes the eluate in the collection tube.
  • buffer 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA, 100 ⁇ l / ml RNase
  • alkaline buffer 200 mM NaOH, 1%
  • the column is washed with an ethanol buffer, dried, and the DNA is eluted in 50 .mu.l of sterile water.
  • the plasmid is then digested with the restriction enzyme EcoRI.
  • the digestion is carried out in a reaction mixture of 30 .mu.l containing: 2 .mu.l of the plasmid solution, 10 U of EcoRI enzyme (Appligene) and 1X reaction buffer. Digestion lasts 2 hours at 37 ° C and the result is visualized by agarose gel electrophoresis.
  • Sequencing is carried out on PCR products previously purified on Microcon 50 columns (Amicon) or on the plasmid DNA.
  • the fragments are either sequenced directly with the PCR primers (R0 fragment sequenced with the 900S and 1280As primers) or after cloning into the pCRII vector using the universal primers (Sp6 and T7).
  • Two different clones were selected for each of the amplified regions, in order to remove any ambiguities during the reading of the nucleotide sequences.
  • Sequencing is performed using the BigDye Terminator reagent (PE, Applied Biosystems).
  • the sequencing principle consists of vertical polyacrylamide gel electrophoresis of DNA labeled with four different fluochromes.
  • the DNA templates are deposited on the gel and separated according to their size, before subjecting the gel to a continuous laser beam.
  • the laser excites fluochromes that each emit at a different wavelength, detected by a spectrograph.
  • Computer software coupled with the sequencer, allows automatic analysis and conversion of data into nucleotide sequences.
  • the reaction mixture of 10 ⁇ l comprises: 4 ⁇ l of the labeling solution (deoxynucleoside triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), AmpliTaq DNA polymerase, MgCl 2 , Tris-HCl buffer pH 9), 20 pmoles of primer (meaning or antisense) and 500 ng of plasmid purified on columns of Centricon type. Sequence and antisense sequences reactions are performed in a Perkin 9600 thermal cycler with 25 cycles (96 ° C for 10 sec, 50 ° C for 5 sec, 60 ° C for 4 min). The products are then precipitated in 40 ⁇ l of 70% ethanol, deposited on gel and analyzed using an ABI PRISM 377 type automatic sequencer.
  • the raw sequences obtained are in the form of electro-phoregrams.
  • the validation and exploitation of the sequences is done using the Sequence Navigator Software (PE, Applied Biosystems). They are subject to at least a double reading, by two different sequencing primers (Sense and Antisense), in order to minimize errors.
  • PE Sequence Navigator Software
  • sequences are then directly entered on a computer using the DNA Strider 1.3 software allowing a fast analysis of the sequences.
  • sequences read and corrected are compared and subjected to different phylogenetic algorithms.
  • the first step consists generally of aligning the sequences of interest with the HDV reference sequences described and listed in the database (Genbank), using the CLUSTAL W1.8 program ( Thompson et al. NAR, 1994, 22, 4673-4680 ). Minor manual corrections were sometimes required using SeqPup software to optimize alignment.
  • phylogenetic trees are constructed by different algorithms.
  • the analyzes are based on distance matrices (phenetic approach), maximum parsimony (MP, cladistic approach) and maximum likelihood (ML) calculations.
  • the principle of this method is to find pairs of neighboring sequences, minimizing the total length of the branches of the tree.
  • This approach allows to reconstruct a phylogeny based on the computation of the overall resemblance between the sequences compared in pairs that is expressed by a distance. It is a method that converts sequence data into numeric distance values, arranged in a matrix.
  • the topology of the tree is constructed to group the sequences that have the most characters in common, using one of the clustering methods such as the neighbor-neighbor method (Saitou et al., 1987). ).
  • the principle of this method is to establish kinship relationships between sequences by searching for shared nucleotide bases, minimizing genetic events.
  • the maximum parsimony algorithm constructs a phylogenetic tree in such a way that it involves the minimum of mutations.
  • the selected tree is the one that requires the least change.
  • This method is sensitive to differences in rates of mutations along the branches.
  • “Clades” or “monophyletic groups” are constituted by groups of sequences sharing a common ancestor, to the exclusion of any other sequence.
  • the maximum likelihood method is considered a statistical approach.
  • the program calculates the probability that a sequence evolves towards another in time. In other words, it consists in considering the changes at the level of each site or character as independent probabilistic events.
  • This likelihood algorithm is aggregated on all sites, and the sum is maximized to estimate the branch length of the tree. This method requires a significant calculation time to find the phylogenetic tree, the most likely, corresponding to the sequences observed because it takes into account the probability of change of each character.
  • the distance analysis was calculated by the two-parameter Kimura method, which considers transition rates (T ⁇ -> C and G ⁇ -> A mutations) at each site, and transversion (A or G mutations). ⁇ ---> "T or C") at each site as different.
  • results obtained are in the form of a phylogenetic tree visualized by the Treeview program (version 1.6.5), proposing different presentations of the tree (cladogram, radial and phylogram). It also makes it possible to visualize the bootstrap values, at each node and to determine a taxon like outgroup (genotype-III sequences).
  • the amino acid translation of the delta gene is performed using the DNAStrider version 1.3 program.
  • the alignment of the protein sequences is carried out as previously described.
  • EXAMPLE 2 EVIDENCE OF NEW GENOTYPES OF HDV
  • the phylogenetic study was carried out from a sequence alignment of 336 bases of R0 (the ambiguous regions are eliminated), including, in addition to the 22 sequences studied, 15 reference sequences and 6 HDV R0 sequences. Yakutia (Pt13, 26 (SEQ ID NO: 66), 29, 62 (SEQ ID NO: 67), 63 and 704). The name given to the sequences corresponds to dFr (for "delta France”) followed by the serum number of the patient.
  • the phylogenetic tree obtained by reconstruction from genetic distances of the R0 region is presented to the figure 1 .
  • the topology of the tree individualizes the genotypes-I and -III, respectively represented by seven and three nucleotide sequences of reference.
  • the other reference sequences are represented by the type II sequences (Japan, Taiwan-3 and Yakutia sequences), and a group of two sequences (TW2b, Miyako) respectively described as a prototype of "sub-types IIB and IIC” respectively. ".
  • the phylogenetic tree obtained by reconstruction from the maximum parsimony of the R0 region, is presented to the figure 2 .
  • the parsimony analysis supports the same topology as the analysis of genetic distance.
  • the reconstruction shows the existence within the 11 variant sequences, of the same three monophyletic groups; for example, with this approach, the group of five molecules dFr47, JFr910, dFr69, dFr73 and dFrl953 is also supported by a 97% BV ( Figure 2 ).
  • the 11 variant molecules, the genotype II molecules and the [TW2b, Miyako] set seem to derive from a common branch that could, by comparison with the genotype I and genotype III sequences, individualize all the genotype II sequences. .
  • the average distance between the different subgroups defined within the 11 HDV variants or between these variants and the genotype-II sequences appears to be higher than between all the genotype-I isolates or within the three molecules defining the genotype-III.
  • a tryptophan codon (UGG) is the only one to be characterized for two sequences ( dFr47, dFr910 ) and an ambiguity (G / A) found for the other four sequences indicates that the small and large delta proteins are most likely synthesized.
  • the variable regions comprise the non-coding portion as well as the 5 'and 3' ends of the LHD gene .
  • an insertion of 7 nucleotides exists in the dFr48 sequence .
  • This insertion is present in a loop corresponding to one end of the genome in its pseudo double-stranded form (at position 797 of the reference sequence Italy (Wang et al., 1987).
  • nucleotide similarity with the isolate of Peru is only from 63.9% to 66.0% confirming the particular remoteness of this molecule (Table VII).
  • Table VII the nucleotide similarity with the isolate of Peru
  • the dFr45, dFr48 and dFr644 molecules are as far apart as genotypes I, II, TW2b / Miyako sequences and the group of dFr73, dFr910 and dFr47 molecules (of the order of 73.2% at 78%) (Table VIII).
  • Phylogenetic analysis was conducted on the six complete sequences of African origin, sixteen reference sequences and two sequences of Yakutia (Pt26 and Pt62).
  • the Figure 4 illustrates the results obtained by distance analysis.
  • the phylogenetic tree reconstructed by Neighbor-Joining (NJ) shows that none of the six sequences studied (dFr45, dFr47, dFr48, dFr73, dFr644 and dFr910) is grouped with the genotype I or genotype III reference sequences. .
  • the six African sequences are subdivided into 3 distinct subgroups (supported by BVs greater than 90.3% for 4 resamplings).
  • the sequences dFr47, dFr73 and dFr910 constitute a group whose branch is based on a bootstrap value of 100%.
  • the topology of the other sequences supports the distribution of African and Asian isolates in several groups; this shows the interest of using the R0 region.
  • Ag-HD is represented by the two forms p24 (sHD) and p27 (LHD) of the delta protein.
  • the protein sequence from 1 to 194-195 amino acids corresponds to the small delta protein (sHD) or p24 form.
  • the large delta protein (LHD) or p27 form has the same amino terminus and an extension of 19-20 amino acids at its carboxy terminus.
  • the size of the proteins corresponding to the new isolates varies between 213 and 214 amino acids. All these proteins have the same hydrophobicity profile.
  • the p24 form has 2 small hydrophobic regions, one located around amino acids 50-60 (between the polymerization site and the SLN) and the other between positions 160 and 172 (opposite an extremely conserved motif). ).
  • Two other domains are well conserved between the different genotypes: this is the RNA binding domain and the nuclear localization domain.
  • the carboxy-terminal end of the delta protein (between amino acids 195 and 215) constitutes a hypervariable region. Only two amino acids out of 19-20 are retained.
  • cysteine corresponding to the farnesylation site of the broad form of the HD protein and the carboxy-terminal glycine (G).
  • G carboxy-terminal glycine
  • variable domain is represented by amino acids 197 to 205 and the conserved domain ranging from amino acids 206 to 215 (RLPLLECTPQ) ( Figure 5 ).
  • EXAMPLE 3 METHOD OF GENOTYPING HDV-1 to HDV-7 by PCR-RFLP
  • Genotyping is performed according to the protocol described in Example 1.8.
  • PCR 6A / 6S amplifies a 234 bp cDNA fragment corresponding to the carboxy terminal end portion of the LHD gene (positions 904-1141 on the viral genome).
  • RNAs extracted from the serum of these same patients were reamplified using the pair of primers 900S and 1280AS defining the R0 region.

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Abstract

Molécules d'acides nucléiques issues de nouvelles souches ou isolats du virus de l'hépatite D constituant des génotypes différents des génotypes connus I, II et III, leurs fragments, protéines correspondantes, ainsi que leurs applications, en tant que réactifs de diagnostic. Méthode de diagnostic sensible du virus de l'hépatite D (ou virus de l'hépatite delta) ainsi qu'une méthode de suivi épidémiologique des infections à HDV.

Description

  • La présente invention est relative à des molécules d'acides nucléiques issues de nouvelles souches ou isolats du virus de l'hépatite D constituant des génotypes différents des génotypes connus I, II et III, à leurs fragments, aux protéines correspondantes, ainsi qu'à leurs applications, en tant que réactifs de diagnostic.
  • La présente invention est également relative à une méthode de diagnostic sensible du virus de l'hépatite D (ou virus de l'hépatite delta) ainsi qu'à une méthode de suivi épidémiologique des infections à HDV.
  • Le virus de l'hépatite D (VHD ou HDV, pour hepatitis D virus) ou delta est un virus satellite de l'hépatite B. Ce virus a une structure particulière : structure chimère associant aux composants spécifiques de l'HDV (ARN viral et protéines HD), une enveloppe comportant les trois glycoprotéines de l'HBV : grande (préS1-préS2-S), moyenne (préS2-S) et petite (S). Le diamètre moyen des particules HDV se situe entre celui des particules HBV matures (particules de DANE : 42 nm) et celui des enveloppes vides de l'HBV (formes sphériques ou filamenteuses : 22 nm) et la densité de flottaison est de 1,24-1,25 g/cm3.
  • Au sein des virions, l'ARN HDV est circulaire et de polarité négative. Plus petit génome connu des virus infectant les mammifères, ce brin monocaténaire circulaire fermé, a un pourcentage élevé de GC (60%).
  • L'ARN HDV se réplique indépendamment de l'HBV, dont le rôle se limite à fournir l'enveloppe de l'HDV. Les seules protéines retrouvées (sHD et LHD) sont codées par l'ARN antigénomique qui, dans la cellule infectée, est complet, circulaire et pseudo double-brin, sert d'intermédiaire de réplication et supporte l'édition.
  • L'ARN HDV appartient à un type de ribozyme spécifique. La réaction d'auto-clivage nécessite l'ARN et un cation divalent (Mg++). Le clivage crée une extrémité 2',3' phosphate cyclique et une extrémité 5' hydroxyle.
  • Les ribozymes delta (génomique et anti-génomique) ont une configuration secondaire voisine en pseudo-noeud. Les séquences impliquées incluent principalement ou exclusivement des séquences situées en 3' du site d'auto-clivage (environ 84 nucléotides).
  • Au cours du cycle viral, l'ARNm de l'HDV code pour une protéine dont il existe deux formes : une protéine de 194-195 acides aminés (forme 's' pour small) de 24 kilodaltons (kDa) et une protéine de 214 acides aminés (forme 'L' pour Large) de 27 kDa, qui existent en proportions variables. Ces protéines portent l'antigénicité 'delta' et sont détectées dans le foie ou le sérum de patients ou d'animaux infectés (chimpanzé, marmotte). Ces deux protéines virales sHD et LHD s'initient au premier ATG du cadre de lecture ouvert situé à la position 1598 (selon la numérotation de Wang et al., 1986 ou 1987) de l'ARN antigénomique. Au cours de la réplication, une mutation, dépendante d'une enzyme cellulaire 'l'adénosine déaminase dépendante des ARN double brin' apparaît à la position 1012, transformant le codon stop ambre (UAG) en codon tryptophane (UGG), rallongeant en 3' le cadre de lecture de 19 ou 20 codons, et conférant aux deux formes sHD et LHD des propriétés différentes.
  • L'ARNm est terminé par une queue de poly(A), 15 nucléotides après le signal consensus de polyadénylation, AAUAAA (positions 954-959).
  • Dans le cycle de réplication, les fonctions des protéines de 24 et 27 Kd s'opposent : sHD active la réplication virale alors que LHD la réprime et joue un rôle dans l'assemblage des particules virales. Ces protéines sont phosphorylées sur les résidus sérine mais non glycosylées (Tableau I). Elles sont constituées de domaines fonctionnels communs et d'un domaine spécifique à la grande protéine LHD. Tableau I : Résumé et comparaison des fonctions des deux formes p24 et p27
    Activités biochimiques et biologiques p24 (S) p27 (L)
    Acides aminés 195 214
    Transactivation de la réplication + -
    Trans-inhibition de la réplication - +
    Dimérisation et polymérisation + +
    Fixation à l'ARN + +
    Stabilisation de l'ARN + +
    Localisation nucléaire + +
    Assemblage - +
    Phosphorylation + +(x6)
    19 aa carboxy-terminaux spécifiques - +
    Farnésylation - +
  • Brièvement, les différents domaines de ces deux protéines sont les suivants :
    • * domaines communs
      • Le domaine de polymérisation, qui comprend la séquence entre les résidus d'acides aminés 13 et 48 formée d'un agencement de leucine ou isoleucine, organisé en hélice α de type "leucine zipper" (crémaillère à leucine), impliquée dans la polymérisation des protéines, indispensable à (i) la trans activation de la réplication virale par l'Ag-sHD, (ii) l'inhibition de la réplication par l'Ag-LHD et (iii) l'assemblage des complexes sHD-LHD dans les enveloppes de l'HBV.
      • Le signal de localisation nucléaire (SLN) qui implique deux séquences de localisation nucléaire identifiées dans la région 67-88, essentielles pour transloquer l'Ag-sHD synthétisé dans le cytoplasme et, peut-être la ribonucléoprotéine après son entrée dans la cellule, vers le noyau.
      • Le site de fixation à l'ARN qui repose sur deux séquences riches en arginine localisées entre les résidus 97 et 163 qui permettent l'attachement des protéines sHD sur l'ARN génomique ou antigénomique. Cette fixation est indispensable pour que l'Ag-sHD active la réplication.
    • * domaines spécifiques
  • Les 19-20 acides aminés situés à l'extrémité COOH de la grande protéine ont un rôle important dans le cycle de l'HDV. En effet, ces acides aminés (aa 195-214), interviennent dans l'assemblage des particules virales (Chang et. al., 1991). Cette activité pourrait être en partie liée à la présence d'une cystéine à la position 211 (Glenn et al., 1992), conservée pour tous les génomes viraux caractérisés à ce jour. Cette cystéine, située 4 acides aminés avant l'extrémité COOH de la protéine, forme une boîte "CXXX" et fixe un groupement farnésyle (Glenn et al., 1992) chaîne de 15 carbones dérivée de l'acide mévalonique, par action d'une farnésyltransférase. Cette maturation post-traductionelle oriente les protéines vers les membranes cellulaires.
  • La petite et la grande protéine ont été par ailleurs différenciées par des anticorps monoclonaux (clone 9E4) (Hwang et Lai, 1993a). Ces anticorps ne reconnaissaient que sHD (Lai et. al., 1993). La séquence en acides aminés de la petite protéine étant incluse dans la grande, ces résultats suggèrent une conformation différente entre sHD et LHD au sein des 30 acides aminés carboxyterminaux de la petite protéine sHD, suggérant que l'épitope reconnu sur sHD soit masqué dans LHD en conditions non-dénaturantes.
  • L'HDV se transmet surtout par le biais des aiguilles contaminées et le sang, donc via les porteurs du HDV ou du HBV.
  • En Amérique du Nord et en Europe de l'Ouest, l'hépatite D se rencontre donc surtout chez les utilisateurs de drogues intraveineuses, les hémophiles et ceux qui ont reçu de multiples transfusions.
  • L'épidémiologie et les modes de contamination se superposent en partie. On estime globalement à 5 % la proportion de porteurs d'Ag-HBs infectés par l'HDV. Cependant, des disparités de prévalence géographique et épidémiologique sont constatées.
  • Une haute prévalence de cette maladie, chez les porteurs du virus de l'hépatite B, existe dans certaines régions du globe incluant le bassin amazonien de l'Amérique du Sud, l'Afrique centrale, le sud de l'Italie et dans les pays du Moyen-Orient.
  • Sur le pourtour méditerranéen, tout particulièrement en Italie du Sud, en Grèce et au Moyen-Orient où la fréquence du portage chronique de l'HBV est intermédiaire (1 % à 5 %), l'infection par l'HDV est élevée. Dans ces régions, la transmission intra-familiale a été suggérée, argumentée par des études phylogénétiques de virus infectant les membres d'une même famille (Niro et al., 1999). En Italie du Sud, la prévalence chez le sujet Ag-HBs positif diminue, passant de 23 % en 1987 à 8 % en 2000 (Gaeta et al., 2000).
  • En Afrique et en Asie, où le portage chronique de l'HBV est de fréquence élevée (10 % à 20 %), ainsi qu'en Amérique du Sud et dans les îles du Pacifique, où elle est intermédiaire (1 % à 5 %), la répartition de l'HDV est paradoxalement disparate. En Afrique, les études de séroprévalence montrent une distribution très hétérogène des patients ayant des anticorps anti-HD, alors que la prévalence globale d'infection HBV, estimée par la détection de l'Ag-HBs, se stabilise entre 12 et 14 % (Roingeard et al., 1992). Ainsi, des taux variables de 4 % (zone Nord du Sénégal) à 44 % (banlieue de Dakar) font émerger de probables facteurs socioéconomiques impliqués dans la transmission.
  • Les études de prévalence de l'HDV sont à interpréter prudemment. En effet, dans les populations étudiées, il y a une inclusion préférentielle des patients atteints d'hépatopathies. Chez les patients atteints d'hépatite aiguë ou chronique, la prévalence de l'infection par l'HDV est plus importante que chez les porteurs chroniques asymptomatiques de l'HBV. De plus, l'enquête sérologique d'une infection HDV repose sur la détection de l'Ag-HD et des Ac anti-HD totaux dans le sérum. De ce fait, des infections aiguës bénignes, au cours desquelles une production transitoire isolée d'IgM anti-HD se développerait, ne seraient pas recensées.
  • L'HDV est responsable d'hépatites aiguës et chroniques. Ces infections sont particulièrement sévères et évoluent plus rapidement vers la cirrhose que les hépatites B seules. C'est l'une des raisons pour lesquelles le diagnostic fiable d'HDV associé à HBV est crucial.
  • L'infection par un HDV est dépendante de l'HBV. Les isolats HDV de régions géographiques différentes montrent une variabilité génétique. Actuellement trois génotypes sont identifiés et désignés génotype-I, -II et -III.
  • Le génotype sert à l'épidémiologie des transmissions virales, permet d'étudier la répartition géographique et pourrait être corrélé au pouvoir pathogène.
  • L'HDV ne se développe que chez les patients également infectés par l'HBV. Cette double infection découle soit d'une co-infection ou d'une surinfection :
    • la co-infection est à l'origine d'une hépatite aiguë. Le diagnostic, évoqué au cours d'une cytolyse hépatique, repose sur la détection des marqueurs de l'HDV associée à la présence d'IgM anti-HBc. L'Ag-HBs, généralement présent serait exceptionnellement négatif, justifiant de répéter les prélèvements pour suivre la cinétique d'évolution des marqueurs. Il est classique de constater une inhibition de réplication de l'HBV par l'HDV. Les IgM anti-HBc témoignent de l'infection récente par l'HBV. L'Ag-HD, très précoce, est rarement détecté, compte tenu de sa fugacité. Les anticorps apparaissent 2 à 3 semaines après le début des symptômes : les IgM anti-HD prédominent, mais gardent un titre modéré (<1:1000). Deux pics d'élévation des transaminases, séparés de deux à cinq semaines s'observent dans 10 à 20 % des co-infections, reflétant probablement différentes cinétiques de réplication des virus. La co-infection est donc caractérisée par une sévérité de l'hépatite aiguë souvent supérieure à celle occasionnée par l'HBV isolé. Ainsi, des hépatites fulminantes sont décrites en Amérique du sud et en Afrique Sub-saharienne ou dans certaines populations. L'évolution est généralement marquée par une résolution de l'hépatite après la phase aiguë et à l'image de l'histoire naturelle de l'HBV, seuls 5 % des patients co-infectés évoluent vers la chronicité.
    • La surinfection est caractérisée par l'apparition d'une séroconversion HDV chez un patient porteur chronique de l'Ag-HBs. La virémie HDV précède l'apparition d'anticorps anti-HDV en l'absence de détection des IgM anti-HBc. La détection de ces marqueurs peut précéder une élévation des transaminases de plusieurs mois. En phase aiguë, la surinfection se traduit par une hépatite fulminante dans plus de 10 % des cas. De plus, passée la phase aiguë, la surinfection entraîne fréquemment (60 à 70 %) une hépatite chronique active avec évolution rapide vers la cirrhose. A la phase aiguë de la surinfection, la détection de l'Ag-HD est rapidement suivie de l'apparition des anticorps qui persistent à des taux élevés. Contrairement aux modèles classiques d'infection virale, IgG anti-HD et IgM anti-HD sont simultanément détectés dans les hépatites B-delta chroniques.
  • Le Tableau II ci-après résume l'évolution des marqueurs B et delta au cours des co-infections et des surinfections
    Co-infection par l'HDV phase aiguë Évolution
    Chronique Guérison
    Ag-HBs + + -
    IgM anti-HBc + - -
    Ag-HD +/- - -
    IgM anti-HD +/- + -
    IgG anti-HD +/- + +
    ARN HDV + + -
    Ag-HD intrahépatique + + -
    Surinfection par l'HDV Évolution
    Chronique Guérison
    Ag-HBs + + -
    IgM anti-HB c - - -
    Ag-HD +/- - -
    IgM anti-HD + + -
    IgG anti-HD + + +
    ARN HDV + + -
    Ag-HD intra-hépatique + + -
  • Co-infection et surinfection sont cliniquement indistinctes. Le diagnostic virologique repose habituellement sur les différents marqueurs sériques. Plus rarement, l'Ag-HD peut être détecté sur les coupes anatomopathologique de la biopsie de foie.
  • Les marqueurs permettent de suivre l'évolution de la maladie vers la guérison ou la chronicité, de décider la mise sous traitement d'un malade et d'en évaluer l'efficacité.
  • L'HDV ne s'isole pas en culture cellulaire et le diagnostic repose donc essentiellement sur la recherche de l'Ag-HD (ELISA, IF) ou du génome viral (hybridation, PCR, PCR temps réel) pour les techniques directes et sur la détection des anticorps IgM anti-HD et IgG anti-HD pour les méthodes indirectes (ELISA).
    • La recherche de l'Ag-HD intrahépatique peut être discutée dans les hépatites fulminantes compte tenu de la cinétique d'apparition des marqueurs sériques. Cet examen a valeur de référence pour étudier la réplication de l'HDV, mais ne peut pas être utilisée en routine.
    • L'Ag-HD sérique est recherché dans le sérum en présence d'un agent dissociant qui expose l'Ag-HD, inclus dans l'enveloppe virale portant l'Ag-HBs. La présence d'anticorps (Ac) anti-HD à taux élevé (hépatites chroniques) fixant les antigènes sériques gêne la détection. Les techniques de Western blot sont développées à visée de recherche. La présence du virus dans le sang est transitoire et limitée à la phase précoce de l'infection et la possibilité de détecter l'Ag-HD diminue dans les jours suivant l'apparition des symptômes.
    • L'immunocapture est utilisée pour détecter les IgM anti-HD et la compétition pour les IgG anti-HD. Les techniques ELISA ont d'abord utilisé comme antigène l'Ag-HD de sérum ou de foie de patients ou d'animaux infectés. Les nouveaux tests reposent sur des Ag-HD recombinants ou des peptides de synthèse.
    • Les techniques d'hybridation ou de RT-PCR permettent la détection de l'ARN génomique après extraction des acides nucléiques et dénaturation des structures secondaires. Plusieurs systèmes d'amorces ont été décrits : leur choix est déterminant car la variabilité génétique dans des régions dites conservées peut conduire à des faux négatifs si les amorces choisies ne sont pas appropriées aux souches virales circulantes. Le choix des amorces de PCR doit tenir compte de l'épidémiologie locale des génotypes décrits et il est primordial de bien connaître la répartition de ces génotypes dans le monde.
  • Toutefois, aussi bien en cas de co-infection qu'en cas de surinfection, l'Ag-HD est en fait difficile à détecter, alors que la virémie précède l'apparition des anticorps.
  • Dans ce contexte, et notamment en raison de la mise en évidence de nouveaux génotypes, des réactifs nucléiques et protéiques permettant le diagnostic du HDV, quel que soit le génotype, sont nécessaires.
  • En effet l'étude des séquences nucléotidiques de l'HDV par différentes équipes dans le monde n'a permis de différencier, jusqu'à présent, que trois génotypes distincts :
    • le génotype-I, qui est le plus fréquent et le plus largement répandu dans le monde. Depuis sa description initiale (chimpanzé infecté expérimentalement) par Wang (Wang et al., 1986 ; Wang et al., 1987), plusieurs groupes ont séquencé le génome de l'HDV d'isolats géographiques différents. La première séquence d'un HDV chez l'homme a été décrite en 1987, aux Etats-Unis par S. Makino et al., chez un patient toxicomane (Makino et al., 1987). Le génotype-I est très largement répandu en Italie, aux Etats-Unis, Taiwan, Nauru, France, Liban, Chine (Makino et al., 1987 ; Chao et al., 1991 b ; Imazeki et al., 1991 ; Lee et al., 1992 ; Niro et al., 1997 ; et Shakil et al., 1997). A l'intérieur du génotype-I un pourcentage de similarité nucléotidique de plus de 85 % est décrit.
    • Un isolat japonais (Imazeki et al., 1990 ; Imazeki et al., 1991) est le prototype d'un 2ème sous-groupe d'HDV. Ce génotype-II qui n'avait été décrit dans un premier temps qu'au Japon et à Taiwan (Imazeki et al., précités ; Lee et al., 1996b) semble avoir une répartition géographique beaucoup plus large. En particulier, des séquences de génotype-I et de génotype-II provenant de Yakoutie (Russie) ont également été caractérisées. Enfin, certains auteurs s'appuient sur une diversité intra-génotypique permettant la division en sous-types IIA (Imazeki et al., 1990 ; Imazeki et al., 1991 ; Lee et al., 1996b), IIB (Wu et al., 1998 ; Sakugawa et al., 1999) et IIC. Dans certains pays, l'infection par des virus de génotype-II s'associerait à des hépatites moins sévères que celles causées par les HDV de génotype-I ou -III (Wu et al., 1995b).
    • En 1993 un 3ème groupe a été décrit pour des génomes de virus péruviens et colombiens (Casey et al., 1993a). Le génotype-III n'a été décrit qu'en Amérique du Sud, et plus particulièrement dans le Bassin Amazonien associé à des hépatites sévères, voire à des épidémies d'hépatites fulminantes avec stéatose microvésiculaire (Casey et al., 1993a ; Casey et al., 1996b) et à une morbidité et à une mortalité élevées. Dans cette région géographique, on observe que l'HDV de génotype-III est associé de manière privilégiée avec l'HBV de génotype F. D'autres isolats de ce groupe ont récemment été isolés au Vénézuela (Nakano et al., 2001).
  • En comparant l'ensemble des génomes, deux à quatre régions conservées sont décrites (Chao et al., 1991b). Deux sont constamment retrouvées et sont centrées autour des sites d'autoclivage des génomes et antigénomes impliqués dans les activités auto-catalytiques. Les deux autres régions conservées sont situées dans le cadre de lecture codant pour la protéine HD (Chao et al., 1991b).
  • Toutefois, les techniques de détection sont tributaires de la variabilité génétique du virus recherché ; les réactifs connus, notamment à partir des séquences spécifiques de génotype-I, -II ou -III, ne permettent pas de détecter les infections à HDV variant et notamment les HDV de génotype différent de ceux précités.
  • En conséquence, les techniques de détection précisées ci-dessus risquent d'aboutir à des résultats négatifs tant au niveau nucléique qu'en ce qui concerne la réponse en anticorps.
  • La mise en évidence et la prise en compte de nouveaux variants sont importantes pour mettre au point des réactifs de détection et de diagnostic des hépatites D (sérodiagnostic, PCR, hybridation), suffisamment sensibles et spécifiques, c'est-à-dire ne conduisant pas à des résultats faussement négatifs ou faussement positifs : en effet, une dissociation IgM anti-HD positif / ARN-HDV négatif peut, à l'heure actuelle, être observée dans le contexte d'une hépatopathie sévère.
  • Dans le cadre de leurs travaux, les Inventeurs ont maintenant caractérisé, de manière surprenante, que la diversité génétique de l'HDV était significativement plus importante qu'antérieurement décrit, ce qui a des conséquences sur la fiabilité du diagnostic.
  • Ils ont en particulier mis en évidence neuf nouvelles séquences complètes d'HDV (trois originaires de Yakoutie et six originaires d'Afrique), circulant également en Île de France et qui n'appartiennent à aucun des génotypes connus.
  • L'analyse de ces nouveaux isolats :
    • confirme l'existence d'une variabilité beaucoup plus importante de l'HDV que celle qui était décrite jusqu'à présent,
    • remet en question la classification des HDV en seulement trois génotypes
    • a conduit les Inventeurs à proposer un algorithme de PCR-RFLP, à partir d'une région partielle du génome pour le génotypage HDV et
    • a conduit les Inventeurs à mettre au point des réactifs adaptés à un diagnostic fiable des infections à HDV, et ce quel que soit le génotype, alors que précédemment, on observait de nombreux résultats faussement négatifs (existence de nouveaux génotypes).
  • Les Inventeurs se sont donc donné pour but de pourvoir à des molécules d'acides nucléiques d'HDV, aptes à permettre la détection d'un HDV variant par rapport aux trois génotypes antérieurement décrits.
  • La présente invention a donc pour objet des molécules d'acide nucléique isolées, caractérisées en ce qu'elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par :
    • le génome d'un HDV, qui moléculairement présente, sur l'ensemble de son génome, une divergence ou distance génétique ≥ 20 % (moins de 80 % de similitude) par rapport aux séquences d'un HDV de génotype I, d'un HDV de génotype II ou d'un HDV de génotype III,
    • le génome d'un HDV, qui moléculairement présente une divergence ou distance génétique ≥ 25 % (moins de 75 % de similitude) sur une région dénommée R0, délimitée par les positions 889 à 1289 du génome HDV, par rapport aux séquences R0 correspondantes d'un HDV de génotype I, d'un HDV de génotype II ou d'un HDV de génotype III,
    • les génomes complets des isolats ou variants d'HDV dénommés dFr45, dFr47, dFr73, dFr910, dFr48 et dFr644 qui présentent respectivement les séquences SEQ ID NO: 1, 6, 11, 16, 21 et 26, et
    • le génome d'un HDV qui présente une divergence ou distance génétique ≤ 15 % avec au moins l'une des séquences SEQ ID NO: 1, 6, 11, 16, 21 et 26.
  • Selon un mode de réalisation avantageux desdites molécules, la région R0 est de préférence obtenue par amplification de l'ARN HDV avec les amorces 900S (SEQ ID NO:33) et 1280AS (SEQ ID NO:34).
  • Au sens de la présente invention, on entend par molécule d'acide nucléique, une molécule d'ADNc ou d'ARN présentant l'une des séquences génomiques d'HDV telles que définies ci-dessus et leurs séquences complémentaires sens et anti-sens.
  • La présente invention a également pour objet des molécules d'acide nucléique qui comprennent au moins l'un des fragments des séquences d'un HDV variant telles que définies ci-dessus, sélectionnés dans le groupe constitué par :
    1. a) les fragments R0 des HDV variants isolés suivants : dFr45, dFr47, dFr48, dFr69, dFr73, dFr644, dFr910, dFr1843, dFr1953, dFr2020 et dFr2066, qui présentent respectivement les séquences suivantes : SEQ ID NO:48 à SEQ ID NO:58,
    2. b) le fragment R1 qui s'étend des positions 307 à 1289 du génome d'HDV,
    3. c) le fragment R2 qui s'étend des positions 889 à 328 du génome d'HDV,
    4. d) le fragment R3 qui s'étend des positions 1486 à 452 du génome d'HDV,
    5. e) le fragment R'1 qui s'étend des positions 305 à 1161 du génome d'HDV,
    6. f) le fragment R'2 qui s'étend des positions 984 à 331 du génome d'HDV,
    7. g) le fragment R644 qui s'étend des positions 889 à 446 du génome d'HDV,
    8. h) le fragment G910 qui s'étend des positions 1206 à 929 du génome d'HDV,
    9. i) le fragment p910 qui s'étend des positions 553 à 1550 du génome d'HDV,
    10. j) les ADNc codant pour la protéine sHD, de séquences SEQ ID NO:4, 9, 14, 19, 24 et 29,
    11. k) les ADNc codant pour la protéine LHD, de séquences SEQ ID NO:2, 7, 12, 17, 22 et 27 et
    12. l) les amorces de séquence SEQ ID NO:33 à SEQ ID NO:47.
  • Au sens de la présente invention, les positions des fragments dans le génome d'HDV sont indiquées sur le génome circulaire en orientation génomique, selon la numérotation de Wang et al., 1986 ou 1987.
  • L'invention englobe également des fragments nucléotidiques complémentaires des précédents ainsi que des fragments modifiés, par rapport aux précédents, par enlèvement, ou addition de nucléotides dans une proportion d'environ 15 %, par rapport à la longueur des fragments ci-dessus et/ou modifiés au niveau de la nature des nucléotides dès lors que les fragments nucléotidiques modifiés conservent une capacité d'hybridation avec les séquences d'ARN génomiques ou antigénomiques des isolats tels que définis ci-dessus.
  • En effet, ces différentes souches virales, chez un même patient, à un moment donné, montre une population hétérogène de molécules d'ARN HDV ; en outre, au cours d'une infection chronique, en plus des hétérogénéités observées au niveau du site d'édition (position 1012), des mutations sont susceptibles d'apparaître. Les séquences virales semblent évoluer au sein de populations virales avec un taux de substitution variable de 3.10-2 à 3.10-3 par nucléotide et par an.
  • Certains de ces fragments sont spécifiques et sont utilisés comme sonde ou comme amorces ; ils s'hybrident spécifiquement à une souche d'HDV variante telle que définie ci-dessus ou à une souche apparentée ; on entend par HDV apparenté à un variant tel que défini ci-dessus, un HDV présentant une divergence génétique ≤ à 15 %.
  • De tels fragments sont utilisés pour la détection et le suivi épidémiologique des infections à HDV. Par exemple, le fragment R0 est utilisé pour la détection (RT-PCR) et le génotypage (PCR-RFLP) d'HDV. Les autres fragments qui couvrent la totalité du génome d'HDV sont utilisés pour la caractérisation moléculaire des HDV variants ; l'analyse phylogénétique de la séquence complète du génome ou de fragments de celui-ci correspondant en particulier à R0 ou à R2 permettent de rattacher les profils observés en PCR-RFLP à un génotype donné ou de caractériser de nouveaux génotypes.
  • En conséquence, la présente invention a également pour objet une méthode de détection d'un HDV variant selon l'invention, par hybridation et/ou amplification, réalisée à partir d'un échantillon biologique, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend :
    1. (1) une étape d'extraction de l'acide nucléique à détecter, appartenant au génome du virus éventuellement présent dans l'échantillon biologique,
    2. (2) la réalisation d'au moins une amplification génique à l'aide d'une paire d'amorces sélectionnée dans le groupe constitué par les amorces aptes à amplifier l'une des régions suivantes de l'ARN génomique d'HDV : R0, R1, R2, R3, R644, G910, p910, R' 1 et R'2 et
    3. (3) l'analyse du produit amplifié par comparaison avec l'une des molécules de séquences SEQ ID NO:1, 6, 11, 16, 21 et 26, correspondant respectivement aux génomes complets des isolats ou variants dénommés dFr45, dFr47, dFr73, dFr910, dFr48 et dFr644.
  • De manière avantageuse, l'étape (3) d'analyse peut être mise en oeuvre par restriction, séquençage ou hybridation ; dans ce dernier cas, la sonde utilisée (notamment dans des puces à ADN) sera avantageusement un fragment de 15 à 20 nucléotides, spécifique desdits fragments amplifiés.
  • Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode, les amorces spécifiques pour l'amplification des régions R0, R1, R2, R3, R644, G910, p910, R'1 et R'2, mises en oeuvre à l'étape (2) sont sélectionnées dans le groupe constitué par :
    • les amorces 900S (SEQ ID NO:33) et 1280AS (SEQ ID NO:34), pour l'amplification de R0 (environ 400 pb),
    • les amorces 320S (SEQ ID NO:39) et 1280AS (SEQ ID NO:34), pour l'amplification du fragment R1 (environ 960 pb),
    • les amorces 900S (SEQ ID NO:33) et 320AS (SEQ ID NO:45), pour l'amplification de R2 (environ 1100 pb), qui contient le gène sHD correspondant aux positions 1598-950,
    • les amorces 1480S (SEQ ID NO:46 ) et 440AS (SEQ ID NO:47),, pour l'amplification de R3 (environ 650 pb),
    • les amorces 900S (SEQ ID NO:33) et 420AS (SEQ ID NO:40), pour l'amplification de la région R644 (environ 1250 pb) de l'isolat dFr644,
    • les amorces 318S (SEQ ID NO:35) et 1150AS (SEQ ID NO:36), pour l'amplification de R' 1 (environ 850 pb),
    • les amorces 960S (SEQ ID NO:37) et 345AS (SEQ ID NO:38), pour l'amplification de R'2 (environ 1050 pb),
    • les amorces R910S (SEQ ID NO:41) et R910As (SEQ ID NO:42) pour l'amplification de la région G910 (environ 1400 pb) de l'isolat dFr910,
    • les amorces S1910R (SEQ ID NO:43) et As1910R (SEQ ID NO:44) pour l'amplification de la région p910 (environ 650 pb) de l'isolat dFr910.
  • La présente invention a également pour objet une méthode de détection et de génotypage d'HDV à partir d'un échantillon biologique, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend :
    1. (a) une étape d'extraction de l'acide nucléique appartenant au génome du virus HDV,
    2. (b) une étape d'amplification de la région R0 délimitée par les positions 889 à 1289 du génome HDV,
    3. (c) un premier traitement des molécules d'acides nucléiques amplifiées par les enzymes de restriction SmaI et XhoI, pour produire un premier ensemble de fragments de restriction, et
    4. (d) un deuxième traitement des molécules d'acides nucléiques par l'enzyme de restriction SacII, pour produire un deuxième ensemble de fragments de restriction
    5. (e) l'analyse combinée des deux ensembles de fragments de restriction produits par RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), de manière à détecter la présence et/ou déterminer le type d'HDV présent dans ledit échantillon biologique.
  • Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode, l'étape (b) d'amplification est avantageusement mise en oeuvre avec les amorces 900S (SEQ ID NO: 33) et 1280AS (SEQ ID NO:34).
  • La méthode selon l'invention permet de définir de nouveaux profils de restriction et de classer les HDV en sept génotypes distincts.
  • Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode, elle comprend en outre :
    • (f) l'amplification des molécules d'acide nucléique dudit échantillon par RT-PCR avec les amorces 900S (SEQ ID NO:33) et 320AS (SEQ ID NO: 45) de manière à amplifier la région R2 et
    • (g) le séquençage direct de la région R2 amplifiée et la comparaison avec l'une des molécules d'ARN de séquences SEQ ID NO: 1, 6, 11, 16, 21 et 26, correspondant respectivement aux génomes complets des isolats ou variants dénommés respectivement dFr45, dFr47, dFr73, dFr910, dFr48 et dFr644, par exemple par analyse phylogénétique.
  • Lorsque des profils inhabituels sont observés, cette étape supplémentaire permet de caractériser de nouveaux génotypes. En effet, ces analyses complémentaires de la PCR-RFLP permettent de rattacher le nouveau profil observé à un génotype donné, ou de caractériser un nouveau génotype, par analyse phylogénétique.
  • La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant, notamment un plasmide comprenant un insert constitué par une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus.
  • La présente invention a également pour objet une cellule transformée par une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus.
  • La présente invention a églament pour objet des produits de traduction codés par l'une des molécules d'ARN de séquences SEQ ID NO:1, 6, 11, 16, 21 et 26 correspondant respectivement aux ARN génomiques complets des isolats ou variants dénommés respectivement dFr45, dFr47, dFr73, dFr910, dFr48 et dFr644 ou par leurs séquences complémentaires sens ou anti-sens.
  • La présente invention a également pour objet les protéines codées par le génome d'un HDV variant tel que défini ci-dessus.
  • Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite protéine est sélectionnée dans le groupe constitué par :
    • la proteine LHD de dFr45, dFr47, dFr73, dFr910, dFr48 et dFr644 qui présente respectivement les séquences SEQ ID NO: 3, 8, 13, 18, 23 et 28, et
    • la proteine sHD de dFr45, dFr47, dFr73, dFr910, dFr48 et dFr644 qui présente respectivement les séquences SEQ ID NO: 5, 10, 15, 20, 25 et 30.
  • La présente invention a également pour objet un peptide, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'une protéine telle que définie ci-dessus, sélectionné dans le groupe constitué par:
    • le peptide A constitué par les 19 acides aminés de l'extrémité carboxy-terminale des séquences SEQ ID NO: 3, 8, 13, 18, 23 et 28,
    • le peptide B de séquence (code à une lettre) RLPLLECTPQ (SEQ ID NO:59) constitué par les 10 acides aminés de l'extréminé carboxy-terminale des séquences SEQ ID NO: 3, 8, 13, 18, 23 et 28, et
    • le peptide C constitué par les 9 acides aminés précédents la séquence SEQ ID NO:59 (SEQ ID NO:60 à SEQ ID NO:65).
  • De tels peptides sont utiles pour le diagnostic indirect (sérologie) d'une infection par HDV, notamment par une méthode immunoenzymatique (ELISA) :
    • le peptide B, qui est conservé, permet la détection de l'ensemble des variants selon l'invention et du génotype II d'HDV, et
    • le peptide C est spécifique des différents variants d'HDV selon l'invention.
  • La présente invention a en outre pour objet l'utilisation d'une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus ou d'une protéine telle que définie ci-dessus pour la préparation d'un kit de détection et de génotypage d'un HDV.
  • Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels :
    • la figure 1 représente l'arbre phylogénétique de la région R0 obtenu par la méthode du plus proche voisin "neighbor-joining". Les nombres en italique indiquent les valeurs de bootstraping (BV) sur 104 rééchantillonnages et le signe ◢ indique les BV < 50 %. L'échelle représente le nombre de substitution de nucléotides par site.
    • la figure 2 représente l'arbre phylogénétique des régions R0 d'HDV obtenu par la méthode de maximum de parcimonie. Les isolats Pérou1, Pérou2 et Colombie sont choisis comme "outgroup". Les chiffres en italique indiquent les valeurs de bootstraping (BV) sur 104 rééchantillonnages,
    • la figure 3 illustre les données cliniques de chacun des six patients infectés par les isolats d'HDV d'origine africaine. * indique respectivement les PCR 6S/6As et PCR R0,
    • la figure 4 représente l'arbre phylogénétique des génomes complets d'HDV, obtenu par la méthode du plus proche voisin "neighbor-joining". Les nombres en italique, au niveau de chaque noeud, indiquent les valeurs de bootstraping (BV) sur 104 rééchantillonnages. L'échelle représente le nombre de substitution de nucléotides par site.
    • la figure 5 représente l'arbre phylogénétique des génomes complets d'HDV, obtenu par la méthode de maximum de parcimonie. Les nombres en italique, au niveau de chaque noeud, indiquent les valeurs de bootstraping (BV) sur 104 rééchantillonnages,
    • la figure 6 représente l'alignement des séquences en acides aminés des protéines delta des six isolats d'origine africaine (lignes 7, 8, 9, 10, 11 et 12) avec les séquences connues de génotype I (lignes 13, 14 et 15), génotype II (lignes 3, 4, 5 et 6), génotype III (ligne 16) et TW2b/Miyako (lignes 1 et 2), à l'aide du logiciel Clustal (version 1.8). L'acide aminé en position 196 de la protéine p27 correspond au codon de terminaison de la protéine p24 (Z) ou au codon tryptophane (W) qui conduit à la synthèse de la protéine p27 qui s'étend des acides aminés 1 à 215.
  • Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
    • EXEMPLE 1: MATERIELS ET METHODES 1- Patients et échantillons.
  • 22 sérums provenant de sujets suivis dans les différents centres hospitaliers de la région parisienne ont été analysés. Les patients étaient porteurs chroniques de l'Ag-HBs. Le diagnostic de l'infection delta a été effectué par la recherche des marqueurs sérologiques (Ag-HD, anti-AgHD de type IgM et IgG) et la détection du génome viral de l'HDV par RT-PCR. L'Ag-HD n'a été détecté dans aucun des sérums analysés. Les anticorps anti-AgHD de type IgM témoignant de la chronicité de l'infection delta, et de type IgG ont été retrouvés chez tous les patients. La totalité du génome de l'HDV a été caractérisée sur six patients. Tous les sérums étaient conservés à -80°C jusqu'à l'extraction de l'ARN viral.
    • 2- Extraction de l'ARN HDV.
  • Pour extraire l'ARN HDV, un volume de 250 µl de sérum est ajouté à 75 µl de TRIzol LS Reagent (Gibco BRL, Life Technologies). Après 30 secondes d'homogénéisation, le mélange est incubé pendant 5 min à température ambiante. L'extraction des lipides s'effectue en ajoutant 200 µl de chloroforme refroidi à +4°C. Après une nouvelle homogénéisation au vortex, les tubes sont incubés puis centrifugés à 14 000 rotations par minute (rpm) pendant 10 min, à +4°C. La phase aqueuse est transférée dans des tubes d'extraction et les ARNs sont précipités par 500 µl d'isopropanol froid, en présence d'l µg de glycogène. Après 15 min d'homogénéisation, les échantillons sont centrifugés à 14 000 rpm pendant 10 min, à +4°C. Après rinçage à l'éthanol à 70 %, les tubes sont à nouveau centrifugés à 14 000 rpm pendant 10 min, à + 4°C. Les culots sont séchés sous une hotte à température ambiante, puis repris dans 100 µl d'eau stérile comprenant un inhibiteur de ribonucléases (RNasin, Promega). A cette étape, des précautions sont prises pour éviter d'éventuelles contaminations des tampons et des échantillons par les ribonucléases.
    • 3- Synthèse d'un ADN complémentaire (ADNc).
  • Cette étape consiste à synthétiser un brin d'ADN complémentaire à l'ARN HDV par transcription inverse.
  • Pour éliminer la structure secondaire de l'ARN HDV, 5 µl d'ARN extrait précédemment sont ajoutés à un mélange réactionnel contenant 5 µl (ou 0,5 pmoles) de désoxynucléotides triphosphates (dNTP) et 1 µl (0,4 pmoles) d'hexanucléotides aléatoires. Les ARNs sont ensuite dénaturés pendant 3 min, à 95°C. Pour fixer les ARNs dénaturés, les tubes sont congelés immédiatement dans l'éthanol refroidi à -20°C. Dix µl d'un mélange réactionnel, contenant 2,5 µl de dithiothréitol (DTT), 100 unités (U) de transcriptase réverse Superscript II, (Gibco BRL, Life Technologies) et son tampon réactionnel, ainsi que 20 U d'inhibiteur de ribonucléases (RNasin, Promega) sont ajoutés à l'ARN dénaturé. La réaction de transcription inverse est effectuée à 42°C pendant 45 min, puis arrêtée par incubation à 94°C pendant 5 min. Les ADNc sont ensuite conservés à -80°C.
    • 4- Amplification génique.
  • L'amplification des ADNc est effectuée, de manière exponentielle, par PCR (Polymerase Chain Reaction). Deux types de polymérases ont été utilisés : la polymérase AmpliTaq Gold (Thermophilus aquaticus) (PE Applied Biosystems) et la polymérase Pwo (Pyrococcus woesi) ou Expand TM High Fidelity PCR System (Roche).
  • L'amplification a été effectuée à partir de 5 µl d'ADNc qui sont ajoutés à un mélange réactionnel de PCR contenant : 0,25 pmoles/µl d'amorce sens et antisens (Tableau III), 200 µmoles de chaque dNTP, 1,5 mM de MgCl2, 1 U d'AmpliTaq Gold ou 2,6 U de polymérase Expand™ en présence des tampons PCR correspondants. La réaction de PCR a été réalisée dans un thermocycleur (PCR Sprint, Hybaid, Coger), selon le protocole suivant : dénaturation des hybrides ADNc - ARN à 94°C pendant 9 min, suivie de 40 cycles successifs, chacun comprenant une dénaturation des ADNs à 94°C pendant 45 sec, une hybridation des amorces (900S/1280As ou 6S/6As) à 58°C pendant 30 sec, synthèse du brin complémentaire grâce à la polymérase par élongation à 72°C pendant 45 sec. Enfin, une élongation finale à 72°C pendant 4 min 30 sec à 72°C. Tableau III : Séquences des amorces utilisées pour les réactions de PCR et leur position sur le génome HDV.
    Amorces Séquence 5' ----> 3 ' numéro d'identification positions*
    6S gaggaaagaaggacgcgagacgcaa SEQ ID NO:31 904-929
    6As accccctcgaaggtggatcga SEQ ID NO: 32 1141-1121
    900S catgccgacccgaagaggaaag SEQ ID NO: 33 889-911
    1280As gaaggaaggccctcgagaacaaga SEQ ID NO:34 1289-1265
    318S ctccagaggaccccttcagcgaac SEQ ID NO:35 305-328
    1150As cccgcgggttggggatgtgaaccc SEQ ID NO:36 1161-1138
    960S gtacactcgaggagtggaaggcg SEQ ID NO:37 962-984
    345As tctgttcgctgaaggggtcct SEQ ID NO:38 331-311
    320S ccagaggaccccttcagcgaac SEQ ID NO 39 307-328
    420As aacaccctcctgctagcccc SEQ ID NO: 40 446-427
    R910S ccggagttcctcttcctcctcc SEQ ID NO:41 1206-1227
    R910AS gttcgcgtcegagtccttettte SEQ ID NO:42 929-907
    S1910R gagctttcttcgattcggac SEQ ID NO:43 1531-1550
    AS1910R gactggtcccctcatgttcc SEQ ID NO:44 572-553
    * Selon la numérotation de Wang et al. (Nature, 1986, 323, 508-514 ; Nature, 1987, 328, 456)
    • 4.1 - Stratégie d'amplification du génome viral HDV
  • Le couple d'amorces 6S et 6As permet d'amplifier un fragment d'ADN correspondant à l'extrémité carboxy-terminale du gène codant pour l'antigène delta.
  • La région R0 comprenant l'extrémité carboxy-terminale du gène codant pour l'Ag-HD et une partie de la région non codante a été amplifiée pour tous les échantillons à l'aide des amorces 900S (SEQ ID NO:33) et 1280As (SEQ ID NO:34). L'amorce 900S utilisée a été délétée de 7 nucléotides à l'extrémité 5', par rapport à celle utilisée par Casey et al., 1993a, précité, pour la classification des génotypes d'HDV.
  • La sélection de ces amorces permet, de manière surprenante, l'amplification d'un fragment apte à permettre de distinguer les génotypes connus (I, II et III) de nouveaux génotypes.
  • Les séquences complètes du génome viral HDV de quatre échantillons (dFr45, dFr47, dFr48 et dFr73) ont été obtenues par amplification de deux régions chevauchantes R'1 (850 bases) et R'2 (1050 bases), respectivement, à l'aide des couples d'amorces 318S/1150AS et 960S/345AS.
  • Pour l'échantillon dFr644, la variabilité observée dans la région correspondant aux amorces précédemment décrites a conduit à amplifier la région 644 (R644) à l'aide d'un couple d'amorces spécifique : 900S et 480AS.
  • Pour l'échantillon dFr910, la séquence nucléotidique R0, a permis de définir des amorces nouvelles et spécifiques de l'échantillon pour amplifier le génome complet. Deux couples d'amorces ont été choisis : les amorces R910S et R910AS, amplifiant un fragment de 1400 bases correspondant à la région G910. Un autre couple d'amorces S 1910R et AS 1910R amplifiant un fragment de 650 bases (région p910) a été indispensable pour couvrir la totalité du génome.
  • L'amplification des différentes régions (R1, R2, R3, R644, R'1, R'2, G910 et p910) est effectuée comme décrite précédemment. Les températures d'hybridation et d'élongation ainsi que le temps d'élongation utilisés pour chacune des PCR, sont indiqués dans le Tableau IV. Tableau IV :Amplification des différents fragments du génome
    Régions amplifiées Taille des fragments (bases) Température d'hybridation (°C) Température d'élongation (°C) Temps d'élongation
    RI 960 62 72 1 min 15 s
    R2 1100 56 72 1 min 30 s
    R3 650 50 72 1 min
    R644 1250 58 72 40 s
    G910 1400 58 72 1 min 40 s
    p910 650 58 72 1 min
    R'I 850 63 72 1 min
    R'2 1050 60 72 1 min 20 s
    • 5-Analyse des produits d'amplification.
  • Un volume de 8 µl du produit PCR est déposé en présence de 2 µl de solution de dépôt dans un gel à 1,3 % d'agarose préparé dans du tampon Tris-Borate/EDTA 0,5X et contenant 0,5 µg/ml de bromure d'éthidium (BET). L'électrophorèse est effectuée en tampon TBE 0,5X. La migration est effectuée, en présence d'un marqueur de taille (Raoul™, Appligène). Le fragment amplifié est visualisée sous rayons ultraviolets à 312 nm et photographié.
    • 6- Clonage et séquençage des génomes HDV.
  • Avant l'étape de clonage et de séquençage, les produits d'amplification ont été purifiés afin d'éliminer toutes traces de sels et d'enzymes.
    • 6.1- Élongation par la Taq-polymérase standard.
  • Cette étape est effectuée dans le cas où l'amplification du produit a été réalisée avec la polymérase Pwo. Elle permet d'ajouter les résidus de désoxyadénosines (A) aux extrémités 3' des produits de PCR, du fait que la polymérase Pwo, dotée d'une activité exonucléasique 5' ----> 3', diminue l'incorporation des désoxyadénosines.
  • Un volume de 10 µl d'ADN purifié est ajouté à un mélange réactionnel de 70 µl contenant : 0,2 mM de dNTP, 1,5 mM de MgCl2, du tampon 1X et 2,5 U de Taq Polymérase (Perkin Elmer). L'élongation est effectuée à 72°C, pendant 30 minutes. Les produits de PCR subissent alors une nouvelle purification au phénol-chloroforme et une précipitation à l'éthanol, puis sont repris dans 10 µl d'eau stérile.
    • 6.2- Clonage dans le vecteur pCRII-TA-cloning (Invitrogen).
  • Le clonage est utilisé pour confirmer la séquence nucléotidique de l'ADN amplifié. Il est réalisé en utilisant le vecteur pCRII (Invitrogen).
  • Le vecteur pCRII se présente sous forme linéaire. Il possède des résidus de désoxythymidine (T) permettant le clonage du produit amplifié grâce aux résidus complémentaires de désoxyadenosine (A) ajoutés par la Taq polymérase. Il possède également les séquences promoteurs Sp6 et T7, deux sites de restriction EcoRI qui encadrent le site d'insertion du produit de PCR et les gènes de résistance à l'ampicilline et à la kanamycine. Une fraction du gène lacZα, codant pour la β-galactosidase, facilite la sélection des recombinants par la couleur des colonies. En effet, les plasmides ayant intégré l'insert n'expriment pas le gène lacZα. Les colonies bactériennes sont alors blanches en présence de substrat de β-galactosidase (X-Gal ou 5-bromo 4-chloro 3-indoyl β-galactoside, Roche) et d'un inducteur du gène (IPTG ou isopropyl-thio β-D-galactoside, Roche). Ainsi, les bactéries recombinantes sont sélectionnées grâce à leur résistance à l'ampicilline et à un crible bleu-blanc.
  • Le rapport moléculaire choisi insert/vecteur est de 3/1 et le volume de produit PCR utilisé est variable, selon la quantité d'ADN estimée par électrophorèse en gel d'agarose comme décrit précédemment. Le mélange réactionnel de 10 µl contient 50 ng de vecteur pCRII, la quantité d'insert correspondante, 4 U de T4 DNA Ligase, et le tampon Ligase 1X. La réaction de ligature est conduite pendant 18 heures à 14°C. Les tubes sont ensuite conservés à +4°C.
  • Les bactéries Escherichia coli TOP10F' (Invitrogen), rendues compétentes par traitement au chlorure de calcium, sont conservées à -80°C, prêtes à l'utilisation. Un volume de 50 µl de bactéries compétentes est mis au contact de 3 µl de la solution de ligature pendant 30 minutes, dans de la glace. Un choc thermique (30 sec à 42°C) fait pénétrer l'ADN plasmidique dans les bactéries, qui sont remises immédiatement sur glace quelques minutes, avant d'être incubées 1 heure à 37°C, dans 250 µl de milieu SOC (Tryptone 2 % ; NaCl 10 mM ; KCl 2,5 mM ; MgCl2 10 mM; glucose 20 mM, extraits de levure 5 g/l). On isole ensuite les colonies sur boîtes de Pétri contenant du LB agar (milieu de Luria-Bertani), supplémenté en ampicilline (50 µl/ml), 40 µl de X-Gal (40 mg/ml) et 40 µl d'IPTG (100 mM) sont répartis.
    • 6.3-Extraction plasmidique et analyse de l'insert.
  • Les colonies blanches sont ensemencées en bouillon LB-ampicilline (50 µl/ml) et incubées 18 heures, à 37°C, sous agitation. Une colonie bleue, c'est-à-dire n'ayant pas inséré de fragment est retenue comme témoin négatif de ligation.
  • L'extraction plasmidique est réalisée à l'aide d'un kit commercial QIAprep® Spin Miniprep (Qiagen). Brièvement, après centrifugation (3000 tours par min à +4°C) et élimination du surnageant, le culot bactérien est suspendu dans 250 µl de tampon (Tris-HCl 50 mM pH 8, EDTA 10 mM, RNase A 100 µl/ml) et lysé par ajout de 250 µl de tampon alcalin (NaOH 200 mM, SDS 1 %). Après 5 min d'homogénéisation, on ajoute 350 µl de tampon (acétate de potassium 3M, pH 5,5). Le surnageant contenant l'ADN plasmidique est ensuite transféré dans une colonne QIAprep. Une centrifugation élimine l'éluat dans le tube collecteur.
  • La colonne est lavée par un tampon éthanol, séchée, puis l'ADN est élué dans 50 µl d'eau stérile.
  • Pour vérifier l'insertion du fragment d'intérêt, le plasmide est alors digéré par l'enzyme de restriction EcoRI. La digestion est effectuée dans un mélange réactionnel de 30 µl contenant : 2 µl de la solution plasmidique, 10 U d'enzyme EcoRI (Appligène) et du tampon réactionnel 1X. La digestion dure 2 heures à 37°C et le résultat est visualisé par électrophorèse en gel d'agarose.
    • 6.4- Séquençage par la méthode BigDye Terminator
  • Le séquençage est réalisé sur les produits PCR préalablement purifiés sur colonnes Microcon 50 (Amicon) ou sur l'ADN plasmidique. Les fragments sont, soit séquencés directement avec les amorces de PCR (fragment R0 séquencé avec les amorces 900S et 1280As) soit après clonage dans le vecteur pCRII en utilisant les amorces universelles (Sp6 et T7).
  • Deux clones différents ont été retenus pour chacune des régions amplifiées, afin de lever d'éventuelles ambiguïtés lors de la lecture des séquences nucléotidiques.
  • Le séquençage est effectué à l'aide du réactif BigDye Terminator (PE, Applied Biosystems). Le principe de séquençage consiste en une électrophorèse verticale en gel de polyacrylamide de l'ADN marqué par quatre fluochromes différents. Les matrices d'ADN sont déposées sur le gel et séparées selon leur taille, avant de soumettre le gel à un faisceau laser en continu. Le laser excite les fluochromes qui émettent chacun à une longueur d'onde différente, détectée par un spectrographe. Un logiciel informatique, couplé au séquenceur, permet l'analyse automatique et la conversion des données en séquences nucléotidiques.
  • Le mélange réactionnel de 10 µl comprend : 4 µl de la solution de marquage (désoxynucléosides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), AmpliTaq DNA polymérase, MgCl2, Tampon Tris-HCl pH 9), 20 pmoles d'amorce (sens ou anti-sens) et 500 ng de plasmide purifié sur colonnes de type Centricon. Les réactions de séquences (sens et antisens) sont effectuées dans un thermocycleur de type Perkin 9600, avec 25 cycles (96°C pendant 10 sec ; 50°C pendant 5 sec ; 60°C pendant 4 min). Les produits sont ensuite précipités dans 40 µl d'éthanol à 70 %, déposés sur gel et analysés grâce à un séquenceur automatique de type ABI PRISM 377.
  • Les séquences brutes obtenues se présentent sous forme d'électro-phorégrammes. La validation et l'exploitation des séquences se fait à l'aide du Logiciel Séquence Navigator (PE, Applied Biosystems). Elles font l'objet d'au moins une double lecture, par deux amorces de séquençage différentes (Sens et Antisens), afin de minimiser les erreurs.
  • Ces séquences sont ensuite directement saisies sur un ordinateur en utilisant le logiciel DNA Strider 1.3 permettant une analyse rapide des séquences.
    • 7- Analyse informatique des séquences nucléotidiques et protéiques
  • Les séquences lues et corrigées sont comparées et soumises aux différents algorithmes phylogénétiques.
  • Les séquences obtenues (22 séquences) ont été comparées à 21 séquences génomiques complètes d'HDV disponibles dans GenBank (Tableau V). Tableau V : Numéros d'accession des différents isolats
    Numéros d'accès (GenBank) Nom d'isolat Origine géographique
    1 X04451 Italy 1 (A20) Italie
    2 M84917 Lebanon 1 Liban
    3 X85253 PatientA. Cagliari (Italie)
    4 X60193 7/18/83 (patient S) (patient S) Japon
    5 M92448 Taiwan Taiwan
    6 L22061 Columbia Colombie
    7 X77627 Chinese human serum Chine centrale
    8 L22064 Peru-2 Pérou
    9 L22063 Peru-1 Pérou
    10 L22066 US-2 États-Unis
    11 M58629 Nauru Île de Nauru
    12 U81988 Somalia Somalie
    13 U81989 Ethiopia 1 Ethiopie
    14 AF098261 Canada Canada(Quebec)
    15 U19598 Taiwan 3 Taiwan
    16 AF018077 TW2b Taiwan
    17 L22062 Japan 3 Japon
    18 AF309420 Miyako Ile de Miyako (Okinawa, Japon)
    19 D01075 Us- 1 États-Unis
    20 M21012 W15 Transmission expérimentale (Marmotte)
    21 AJ307077 W5 Transmission expérimentale (Marmotte)
    22 AJ309868 à AJ309881 Isolats de Yakoutie Yakoutie (Russie)
  • La première étape consiste globalement à aligner les séquences d'intérêt avec les séquences HDV de référence décrites et répertoriées dans la banque de données (Genbank), en utilisant le programme CLUSTAL W1.8 (Thompson et al., N.A.R., 1994, 22, 4673-4680). Des corrections manuelles mineures ont parfois été nécessaires à l'aide du logiciel SeqPup afin d'optimiser l'alignement.
  • Deux approches ont été suivies : l'utilisation de l'alignement des protéines pour le gène HD et l'étude de la stabilité des positions alignées à l'aide d'un logiciel d'alignement adapté.
  • A partir de cet alignement de séquences nucléotidiques, des arbres phylogénétiques sont construits par différents algorithmes. Les analyses sont basées sur des matrices de distances (approche phénétique), des calculs de maximum de parcimonie (MP ; approche cladistique) et de maximum de vraisemblance (ML ; approche statistique).
    • - approche phénétique (distance génétique)
  • Le principe de cette méthode est de trouver des paires de séquences voisines, en minimisant la longueur totale des branches de l'arbre. Cette approche permet de reconstruire une phylogénie sur la base du calcul de la ressemblance globale entre les séquences comparées deux à deux qui est exprimée par une distance. C'est une méthode qui permet de convertir les données de séquences en valeurs numériques de distances, arrangées en matrice. La topologie de l'arbre est construite de manière à regrouper les séquences qui possèdent le plus de caractères en commun, en utilisant une des méthodes de regroupement comme la méthode du plus proche voisin ou "neighbor-joining" (Saitou et al., 1987).
    • - approche cladistique (maximum de parcimonie)
  • Le principe de cette méthode consiste à établir des relations de parenté entre les séquences par la recherche de bases nucléotidiques partagées, en minimisant les évènements génétiques. L'algorithme de maximum de parcimonie construit un arbre phylogénétique de telle manière qu'il implique le minimum de mutations. L'arbre retenu est celui qui nécessite le moins de changement. Cette méthode est sensible aux différences de taux de mutations le long des branches. Les "clades" ou "groupes monophylétiques" sont constitués par les groupes de séquences partageant un ancêtre commun, à l'exclusion de toute autre séquence.
    • - approche statistique
  • La méthode de maximum de vraisemblance est considérée comme une approche statistique. Le programme calcule la probabilité pour qu'une séquence évolue vers une autre dans le temps. En d'autres termes, il consiste à considérer les changements au niveau de chaque site ou caractère comme des évènements probabilistes indépendants. Cet algorithme de vraisemblance est cumulé sur tous les sites, et la somme est maximisée pour estimer la longueur de branche de l'arbre. Cette méthode nécessite un temps de calcul important pour rechercher l'arbre phylogénétique, le plus vraisemblable, correspondant aux séquences observées du fait qu'elle prend en compte la probabilité de changement de chaque caractère.
  • Toutes les analyses phylogénétiques ont été conduites en utilisant les logiciels informatiques Phylip 3.75 (PHY Logenetic Inference Package) (Felsenstein et al., 1989) et Paup * version 4. Obêta6 (Phylogenetic Analysis Using Parsimony) (Swofford et al., 1998).
  • L'analyse de distance a été calculée par la méthode de Kimura à deux paramètres, qui considère les taux de transition (mutations T <-> C et G <-> A) à chaque site, et de transversion (mutations « A ou G » <---> « T ou C ») à chaque site comme différents.
  • La fiabilité et la robustesse des groupements de séquences (ou des topologies) sont évaluées statistiquement par l'approche de rééchantillonnage (ou bootstrap) sur 103 et 104 rééchantillonnages.
  • Les résultats obtenus se présentent sous la forme d'un arbre phylogénétique visualisé par le programme Treeview (version 1.6.5), proposant différentes présentations de l'arbre (cladogramme, radial et phylogramme). Il permet également de visualiser les valeurs de bootstrap, à chaque noeud et de déterminer un taxon comme outgroup (séquences du génotype-III).
  • La traduction en acides aminés du gène delta est effectuée à l'aide du programme DNAStrider version 1.3. L'alignement des séquences protéiques est réalisé comme décrit précédemment.
    • 8- Analyse génotypique de l'HDV par polymorphisme de restriction (RFLP)
  • Le génotypage de l'HDV est effectué par PCR-RFLP de la région R0, selon les étapes suivantes :
    • Etape 1 : Les produits PCR sont digérés par les deux enzymes de restriction SmaI et XhoI (New England Biolabs) : 10 µl de produit amplifié sont digérés séparément dans deux tubes par 5 U d'enzymes SmaI ou XhoI, respectivement à 30°C et 37°C pendant 3 heures dans un volume final de 50 µl en présence du tampon approprié et d'eau stérile. Les produits de digestion sont visualisés sous rayons ultraviolets comme décrit précédemment et les tailles des fragments sont déterminées par comparaison avec un marqueur de taille (50 pb échelle d'ADN, ou les marqueurs V et VI, Life Technologies GibcoBRL).
    • Etape 2 : Les échantillons présentant un profil autre que le profil de génotype 1 sont digérés par une autre enzyme SacII (New England Biolabs) pendant 3 heures à 37°C et les produits de digestion sont visualisés comme à l'étape 1.
    • Etape 3 : le génotype du virus est déterminé à partir de l'analyse de la combinaison des profils de restriction SmaI, XhoI et SacI.
    9- Algorithme de génotypage de l'HDV par PCR-RFLP
  • L'algorithme de génotypage de l'HDV par PCR-RFLP comprend au moins deux étapes :
    • la première, consiste en la coupure par deux enzymes de restriction, SmaI et XhoI du fragment R0 amplifié par RT-PCR à partir des ARN extraits des sérums des patients ;
    • la seconde pour les patients de « profil non-I », consiste en une coupure de R0 par l'enzyme SacII;
    • le séquençage de la région R0 ou de la région codant pour la p24 (ou si nécessaire de la totalité du génome), suivi d'analyses phylogéniques ne seront réalisés qu'en deuxième intention si des profils de restriction inhabituels sont obtenus.
    EXEMPLE 2: MISE EN EVIDENCE DE NOUVEAUX GENOTYPES D'HDV 1- Analyse phylogénétique de la région R0
  • 22 échantillons de patients infectés par HBV et HDV ont été analysés. La région R0 a été amplifiée par PCR puis le fragment obtenu a été séquencé en utilisant les amorces 900S et 1280As.
  • L'étude phylogénétique a été effectuée à partir d'un alignement de séquences de 336 bases de R0 (les régions ambiguës sont éliminées), en y incluant, en plus des 22 séquences étudiées, 15 séquences de référence et 6 séquences R0 d'HDV de Yakoutie (Pt13, 26 (SEQ ID NO:66), 29, 62 (SEQ ID NO:67), 63 et 704). Le nom donné aux séquences correspond à dFr (pour "delta France") suivi du numéro de sérum du patient.
    • a) analyse de la distance génétique
  • L'arbre phylogénétique, obtenu par reconstruction à partir de distances génétiques de la région R0 est présenté à la figure 1.
  • La topologie de l'arbre individualise les génotypes-I et -III, représentés respectivement par sept et trois séquences nucléotidiques de référence. Les autres séquences de référence sont représentées par les séquences de type II (Japon, Taiwan-3 et les séquences de Yakoutie), et un groupe de deux séquences (TW2b, Miyako) décrites respectivement chacune comme prototype de « sous-types IIB et IIC ».
  • Cet arbre montre que les séquences virales provenant des 22 échantillons analysés correspondent à deux situations :
    • 11 séquences sont affiliées aux séquences de génotype I, à l'exception de la séquence dFr46, qui semble être apparentée à la séquence Us-1 décrite par Makino (Makino et al., 1987) ; toutes ces séquences sont réparties de façon hétérogène au sein du génotype-I.
    • les 11 séquences restantes sont très éloignées du génotype-I et du génotype-III. De plus, aucune de ces séquences ne se regroupe directement avec les séquences de type-II (Japon, Taiwan-3, Yakoutie 13, 26, 29, 62, 63, 704) ou au groupe de séquences (TW2b, Miyako) ; ces séquences de référence forment par elles-mêmes deux groupes distincts.
  • La topologie de l'arbre, obtenu par reconstruction à partir des distances génétiques de la région R0, montre que les molécules nucléiques isolées à partir des divers HDV variants se répartissent au sein de quatre sous-groupes (figure 1) :
    • la molécule dFr644 qui apparaît isolée ; elle possède toutefois, avec un groupe de trois molécules (dFr45, dFr2066 et dFr1843), un noeud qui est soutenu pour une valeur de rééchantillonnage de seulement 66,7 %.
    • . en revanche, la branche unissant les molécules dFr45, dFr2066, dFr1843 est robuste, puisqu'elle est soutenue par une valeur de bootstrap (BV) de 99,9%.
    • . un ensemble de cinq molécules : dFr47, dFr910, dFr69, dFr73 et dFr1953 est soutenue par une BV de 100 % et
    • . une paire de molécules dFr48 et dFr2020, qui est également soutenue par une BV de 100 %.
    b) analyse du maximum de parcimonie
  • L'arbre phylogénétique, obtenu par reconstruction à partir du maximum de parcimonie de la région R0, est présenté à la figure 2.
  • L'analyse en maximum de parcimonie soutient la même topologie que l'analyse de la distance génétique. La reconstruction met en évidence l'existence au sein des 11 séquences variantes, des mêmes trois groupes monophylétiques ; par exemple, avec cette approche, le groupe de cinq molécules dFr47, JFr910, dFr69, dFr73 et dFrl953 est également soutenu par une BV de 97 % (Figure 2).
  • Les 11 molécules variantes, les molécules de génotype II et l'ensemble [TW2b, Miyako] semblent dériver d'une branche commune qui pourrait, par comparaison aux séquences de génotype I et de génotype III, individualiser l'ensemble des séquences du génotype II. Cependant, les valeurs de bootstrap soutenant ce branchement sont relativement modestes : 88,5 % en NJ et 64,5 % en MP (rééchantillonnage effectué sur 104 échantillons) comparées à celles du génotype-I (BV = 99.8 %) et du génotype-III (BV= 100 %). De plus, la distance moyenne entre les différents sous-groupes définis au sein des 11 HDV variants ou entre ces variants et les séquences de génotype-II, apparaît plus élevée qu'entre l'ensemble des isolats du génotype-I ou au sein des trois molécules définissant le génotype-III.
  • L'ensemble de ces résultats mettent en valeur la caractérisation de nouveaux génotypes d'HDV.
    • 2 - Analyse phylogénétique de la totalité des génomes a) Reconstruction du génome complet à partir de fragments amplifiés
  • Afin d'étudier le génome complet de ces variants et, dans le but de préciser leur affiliation, plusieurs régions du génome HDV ont été amplifiées (Tableau II) à partir de 6 échantillons incluant au moins un membre de chacun des 4 sous-groupes et trois représentants du groupe majoritaire ont été sélectionnés : dFr45, dFr47, dFr48, dFr73, dFr644 et dFr9l0.
  • De manière plus précise, les fragments suivants ont été amplifiés par PCR (Tableau IV) :
    • des fragments de 850 pb (R'1) et 1050 pb (R'2) chevauchants à leurs extrémités pour dFr45, dFr47, dFr48 et dFr73,
    • deux fragments chevauchants de 960 pb et de 1250 pb pour dFr644, et
    • deux fragments de 1400 pb et 650 pb pour dFr9l0.
  • Toutes ces régions génomiques amplifiées ont été clonées dans un vecteur pCRII™ (Tableau VI). Deux clones correspondant à chacun des fragments amplifiés ont été séquencés. La reconstruction de séquences complètes consensus d'ADNc HDV a été effectuée après alignement des régions chevauchantes et alignement avec les séquences de référence. Tableau VI : Clones de pcRII contenant les différents inserts
    R0 R'1 R'2 G910 R1
    dFr45 - dFr45R'1 clone 2 dFr45R2 clone 8 - -
    dFr45R'1 clone 4 dFr45R2 clone 10
    dFr47 - dFr47R'1 clone 13 dFr47R2 clone 19 - -
    dFr47R'1 clone 16 dFr47R2 clone 22
    dFr48 - dFr48R'1 clone 23 dFr48R2 clone 19 -
    dFr48R'1 clone 28 dFr48R2 clone 22
    dFr73 - dFr73R'1 clone 36 DFr73R2 clone 29 - -
    dFr73R'1 clone 39 dFr48R2 clone 33
    dFr644 - - - - 644R1 clone 4
    644R1 clone 8
    dFr910 910R0-clone 4 - - R910 clone 29 910R1 clone 4
    910R0-clone 4 R910 clone 31 910R1 clone 5
    • b) Analyse de six nouvelles séquences génomiques complètes d'HDV, d'origine africaine. b1) Caractéristiques cliniques des 6 patients
  • Cinq patients sont originaires d'Afrique de l'Ouest, et un patient a séjourné au Cameroun. Au moment du prélèvement, ces patients résidaient en région parisienne depuis au moins deux ans. Tous ces patients étaient atteints d'hépatite sévère et les données cliniques sont résumées dans la figure 3.
    • b 2 ) l'organisation_génomique des_nouyelles_séguençes_d'HDV
  • L'analyse comparative des régions R0 de 22 patients infectés par HDV et HBV avec celles disponibles dans les bases de données a mis en évidence la grande diversité génétique du génome viral de l'HDV.
  • La taille des génomes complets est différente pour les six séquences des six isolats d'HDV d'origine africaine, ce qui confirme la variabilité de l'HDV :
    • le génome viral des isolats dFr9l0, dFr47 et dFr73 qui comprend 1697 nucléotides est le plus long jamais décrit pour HDV.
    • le génome de l'isolat dFr45 apparaît parmi les plus petits (1672 nt), et
    • les séquences génomiques des virus dFr644 et dFr48 sont respectivement de 1680 nt et de 1687 nt.
  • L'analyse après l'alignement des différentes séquences étudiées, révèle un degré élevé de conservation dans les régions du génome HDV correspondant aux ribozymes responsables des clivages des ARN génomiques et antigénomiques. De même, le cadre de lecture codant pour l'antigène delta est retrouvé sur le brin anti-génomique. Un codon tryptophane (UGG) est le seul à être caractérisé pour deux séquences (dFr47, dFr910) et une ambiguïté (G/A) retrouvée pour les quatre autres séquences indique que la petite et la grande protéine delta sont très probablement synthétisées. Les régions variables comprennent la portion non codante ainsi que les extrémités 5' et 3' du gène LHD. De façon remarquable, une insertion de 7 nucléotides existe dans la séquence dFr48. Cette insertion est présente dans une boucle correspondant à l'une des extrémités du génome dans sa forme pseudo double brin (à la position 797 de la séquence de référence Italie (Wang et al., 1987).
    • c) Comparaison des six séquences HDV d'origine africaine avec les séquences représentatives des différents génotypes.
  • La comparaison des six nouvelles molécules avec les molécules connues, représentatives des trois génotypes connus, indique une similarité en nucléotides se situant entre 71,7 % (dFr45 versus Liban) et 80,0 % (dFr73 versus Yakoutie p26) au regard des molécules de génotypes I, II, et des molécules TW2b et Miyako. En effet, pour chacun des six isolats, la moyenne de similarité en nucléotides est de l'ordre de 73,3 % à 74,6 % avec les molécules du génotype I, de 74,5 % à 78,8 % avec celles du génotype II et de l'ordre de 74,6 % à 77,8 % avec les molécules TW2b/Miyako. En revanche, la similarité nucléotidique avec l'isolat du Pérou (génotype-III), n'est que de 63,9 % à 66,0 % confirmant l'éloignement particulier de cette molécule (Tableau VII). De plus, lorsque l'on compare, entre elles les six molécules correspondant à ces génomes complets et définissant les six variants dFr45, dFr47, dFr48, dFr73, dFr644 et dFr910, seul le groupe de molécules dFr73, dFr9l0 et dFr47 présente une similarité de séquence de l'ordre de 90 %. Les molécules dFr45, dFr48, et dFr644 sont aussi éloignées l'une de l'autre que des génotypes I, II, des séquences TW2b / Miyako et du groupe de molécules dFr73, dFr9l0 et dFr47 (de l'ordre de 73,2 % à 78 %) (Tableau VIII). Tableau VII : Pourcentage de similarité des séquences complètes HDV Africaines avec les différents génotypes connus (Calcul de la moyenne).
    Isolats HDV* Type I Type II TW2b/Miyako Type III
    dFr45 73,3 74,5 74,6 66
    71,7 - 74,6 73,2 - 75,5
    dFr47 74,2 78,6 77,4 65,5
    73,0 - 75,0 78,2 - 79,9
    dFr48 73,3 77,1 75,5 65,4
    72,0 - 74,0 76,6 - 77,7 74,4 - 76,6
    dFr73 74,1 78,8 77,8 65,9
    73,0 - 75,0 77, 7 - 80, 0 77,5 - 78,0
    dFr644 73,6 76,8 77,0 63,9
    72,2 - 74,6 76,2 - 77,2 76,9 - 77,2
    dFr910 74,6 77,9 77,2 64,6
    73,0 - 75,8 77,0 - 78,6 77,0 - 77,5
    * Les isolats HDV de référence correspondent aux génomes complets étudiés à l'exemple 2.1.
    Tableau VIII : Pourcentage de similarité des nouvelles molécules HDV entre elles.
    dFr47 dFr48 dFr73 dFr644 dFr9l0
    dFr45 74,8 73,2 75 78 74,7
    dFr47 77,1 90 76,3 89
    dFr48 77,7 75,5 76,1
    dFr73 76,3 89
    dFr644 76,1
    • d) Analyse phylogénétique des six molécules HDV d'origine africaine et des molécules représentatives des différents génotypes
  • L'analyse phylogénétique a été menée sur les six séquences complètes d'origine africaine, seize séquences de référence et 2 séquences de Yakoutie (Pt26 et Pt62). La Figure 4 illustre les résultats obtenus par analyse de distance. L'arbre phylogénétique reconstruit par "Neighbor-Joining" (NJ) montre qu'aucune des six séquences étudiées (dFr45, dFr47, dFr48, dFr73, dFr644 et dFr9l0) ne se regroupe avec les séquences de référence du génotype I ou du génotype III. L'affiliation de ces séquences africaines aux séquences du génotypes II (aux séquences TW2b et Miyako décrites respectivement comme les sous-types IIB et IIC) n'est pas soutenue, par des valeurs de bootstrap élevées (<70 %) (Wu et al., 1998). De plus, les séquences TW2b et Miyako apparaissent former un groupe distinct et monophylétique avec une BV de 100 %. Ces deux séquences semblent constituer par elles-mêmes un "clade" représentant un génotype différent du type II.
  • Dans les analyses de distance, les six séquences africaines sont subdivisées en 3 sous-groupes distincts (supportés par des BV supérieures à 90,3 % pour 104 rééchantillonnages). Les séquences dFr47, dFr73 et dFr910 constituent un groupe dont la branche repose sur une valeur de bootstrap de 100 %. Pour appuyer ces résultats, l'étude du maximum de parcimonie a été conduite sur le même jeu de séquences (Figure 5). En enracinant, l'arbre de façon artificielle grâce à la séquence 'Peru-1', on individualise comme dans toutes les analyses menées précédemment l'ensemble des séquences du génotype-I (BV = 100 %). La topologie des autres séquences soutient la répartition des isolats africains et asiatiques en plusieurs groupes ; ceci montre l'intérêt de l'utilisation de la région R0. Le génotype-II regroupe les séquences de Yakoutie, Taiwan-3 et Japan avec une BV de 99,9 % sur 104 rééchantillonnages. De même, l'individualisation de TW2b et Miyako se confirme (BV = 100 %). Enfin, les séquences africaines indiquent l'existence d'au moins 3 sous-groupes. La monophylie des séquences dFr47, dFr73, dFr9l0 (BV =100 %) soutient l'affiliation de ces séquences dans un sous-groupe. En revanche, la séquence dFr48, qui possède avec les isolats du groupe précédant (dFr9l0, dFr47, dFr73) une similarité nucléotidique respective de 76,1, 77,1 et 77,7 % se regroupe avec ces séquences seulement dans 55,4 % des rééchantillonages, suggérant son individualisation possible. Bien qu'apparaissant distantes l'une de l'autre, le groupement dFr45 et dFr644, s'observe avec une BV élevée (NJ = 96.5 / MP = 88,6) dans le contexte étudié.
  • Par conséquent, à la fois les analyses phylogénétiques des régions R0 et des séquences complètes des séquences africaines indiquent que les groupes diffèrent les uns des autres et pourraient constituer trois (voir quatre) génotypes distincts ; ces résultats mettent ainsi en évidence l'existence d'au moins sept génotypes d'HDV.
    • 3- Analyse de la séquence en acides aminés (aa) de l'antigène delta (Ag-HD).
  • L'Ag-HD est représenté par les deux formes p24 (sHD) et p27 (LHD) de la protéine delta. La séquence protéique de 1 à 194-195 acides aminés correspond à la petite protéine delta (sHD) ou forme p24. La grande protéine delta (LHD) ou forme p27 possède la même extrémité amino-terminale et une extension de 19 à 20 acides aminés à son extrémité carboxy-terminale.
  • L'alignement de la séquence de l'antigène HD des six séquences africaines avec les séquences des protéines HD connues est présenté à la figure 6.
  • L'analyse des séquences montre que les six isolats d'origine africaine ont une identité en amino-acides de l'ordre de 69 à 77 % avec les séquences du génotype I, de 71 à 79 % avec les isolats du génotype II, de 72 à 78 % avec les séquences TW2b / Miyako et de 63 % avec l'isolat du Pérou (génotype III).
  • La taille des protéines correspondant aux nouveaux isolats varie entre 213 et 214 acides aminés. Toutes ces protéines ont le même profil d'hydrophobicité. La forme p24 possède 2 petites régions hydrophobes, l'une située aux alentours des acides aminés 50-60 (entre le site de polymérisation et le SLN) et l'autre entre les positions 160 et 172 (en regard d'un motif extrêmement conservé). Deux autres domaines sont bien conservés entre les différents génotypes : il s'agit du domaine de fixation à l'ARN et du domaine de localisation nucléaire. A l'image de ce qui a été décrit dans la littérature, l'extrémité carboxy-terminale de la protéine delta (entre les acides aminés 195 et 215) constitue une région hypervariable. Deux acides aminés seulement sur les 19-20 sont conservés. Il s'agit de la cystéine (C) correspondant au site de farnésylation de la forme large de la protéine HD et de la glycine (G) carboxy-terminale. De plus, on retrouve les séquences signatures spécifiques des isolats du même génotype, par exemple, les 19 acides aminés spécifiques de la grande protéine du génotype I ou les 20 acides aminés du génotype-III.
  • En revanche, pour les séquences protéiques des isolats d'origine africaine, des isolats du génotype Il et de TW2b/Miyako, l'extrémité carboxy-terminale semble subdivisée en deux domaines. Le domaine variable est représenté par les acides aminés 197 à 205 et le domaine conservé allant des acides aminés 206 à 215 (RLPLLECTPQ) (Figure 5).
    • 4- Définition de 7 clades d'HDV
  • L'analyse des séquences complètes des six isolats d'Afrique permet de définir sept clades d'HDV correspondants aux génotypes suivants (Tableau IX) : Tableau IX : Correspondance Clade/Génotype
    Clade Génotype Isolats
    1 I Italie, W5, W15, Us 1, Us2, Liban, Ethiopie Somalie, Ile de Nauru, Chine, Cagliari, Canada...
    2 IIA Japon, Taiwan3, Yakutie26, Yakutie62
    3 III Pérou1
    4 IIB, IIC TW2b, Miyako
    5 ? dFr91 0, dFr73, dFr47
    6 ? dFr 48
    7 ? dFr45, dFr644
    • EXEMPLE 3: METHODE DE GENOTYPAGE DE HDV-1 à HDV-7 par PCR-RFLP
  • Le génotypage est effectué selon le protocole décrit à l'exemple 1.8.
    • 1- Manque de sensibilité de la PCR 6A/6S
  • Initialement, trois patients Ag-HBs positifs, ont posé un problème diagnostique d'infection delta. En effet chez ces patients on observe une hépatite sévère associée à la présence d'IgM anti-HDV mais une absence de réplication d'HDV par RT-PCR à l'aide des amorces 6A-6S décrites dans Deny et al. (1991, 1993, 1994, précités) pour le diagnostic en routine de l'infection par HDV. La PCR 6A/6S amplifie un fragment d'ADNc de 234 pb correspondant à la partie de l'extrémité carboxyterminale du gène LHD (positions 904 à 1141 sur le génome viral).
  • Les ARN extraits du sérum de ces mêmes patients ont été réamplifiés à l'aide du couple d'amorces 900S et 1280AS définissant la région R0.
  • Les résultats obtenus à partir des échantillons de ces trois patients ont mis en évidence la présence reproductible d'une bande de 400 pb (R0) avec les amorces 900S et 1280AS, alors que la PCR 6A-6S restait négative.
  • Ces résultats ont été confirmés sur une série d'échantillons de sérum de patients qui ont été analysés en parallèle avec les couples d'amorces 6A-6S et 900S-1280AS. Sur 286 échantillons, 14 sont positifs uniquement avec la PCR R0.
  • Ces résultats démontrent une plus grande spécificité et une meilleure sensibilité des amorces 900S et 1280AS, en comparaison avec les amorces 6S et 6A, pour la détection de l'ARN d'HDV dans le sérum des patients infectés.
    • 2- Profils de restriction attendus pour HDV-1 à HDV-7
  • Les méthodes classiquement utilisées de PCR-RFLP (Wu et. al., 1995a ; Wu et al., 1995b ; Casey et al., 1996) permettent la distinction de trois différents génotypes delta. L'utilisation de l'enzyme de restriction SmaI ne différencie pas tous les génotype-I, -IIA, -IIB reconnus à ce jour et l'enzyme XhoI a été utilisée pour différencier le «sous-type IIA» du «sous-type IIB» (Wu et al., 1995b).
  • L'association des deux enzymes SmaI et XhoI dans une première étape révèle sept profils distincts (de P1 à P7) (Tableau X). Ces sept profils ne se superposent pas exactement aux sept clades (HDV-1 à HDV-7). En conséquence, les échantillons de profil «non-P1» sont coupés dans une deuxième étape par l'enzyme SacII, aboutissant ainsi à l'obtention, de façon combinée, de dix profils delta distincts (de D1 à D10) (Tableau XI) pouvant être rattachés spécifiquement aux différents clades décrits, grâce aux analyses de phylogénie. Tableau X : Profils de restriction coupure de la Région R0, par les enzymes SmaI et XhoI.
    ETAPE 1
    Génotypes
    décrits    		 Fragments
    SmaI
    Taille (pb)    		 Profil
    SmaI     		Fragments
    XhoI
    Taille (pb)    		 Profil
    XhoI     		Profil
    Combiné
    SmaI-XhoI
    I 220,179 S1 383,16 X1 S1 X1 P1
    IIA 397 S2 303,78,16 X2 S2 X2 P2
    IIB 397 S2 319,79 X3 S2 X3 P3
    IIC (Miyako) 397 S2 157,162,79 X4 S2 X4 P4
    III 298,107 S3 405 X5 S3 X5 P5
    II Yakutie 178,117,110 S4 303,78,16 X2 S4 X2 P6
    dFr45 217,179 S1 303,78,16 X2 S1 X2 P7
    dFr644 217,179 S1 303,78,16 X2 S1 X2 P7
    dFr47, 73, 910 179,111,107 S4 303,78,16 X2 S4 X2 P6
    dFr48 397 S2 303,78,16 X2 S2 X2 P2
    Tableau XI : Profils de restriction attendus après coupure de la Région R0, par les enzymes SmaI, XhoI et SacII.
    ETAPE 2 Génotypes décrits Fragments SacII Taille (pb) Profil SacII Profil Combiné SmaI- XhoI / SacII
    I 362,38 se1 S1 X1 Sc1 D1
    IIA 266,92,38 Sc2 S2 X2 Sc2 D2
    IIB 268,130 Sc3 S2 X3 Sc3 D3
    IIC (Miyako) 268,130 Sc3 S2 X4 Sc3 D4
    III 405 Sc4 S3 X5 Sc4 D5
    II Yakutie 266,92,38 Sc2 S4 X2 Sc2 D6
    dFr45 268,130 Sc3 S1 X2 Sc3 D7
    dFr644 397 Sc4 S1 X2 Sc4 D8
    dFr47, 73, 268,130 Sc3 S4 X2 Sc3 D9
    910
    dFr48 268,130 Sc3 S2 X2 Sc3 D10
    • 3- Génotypage des échantillons de patients par PCR-RFLP
  • A partir de l'analyse par PCR-RFLP d'échantillons (plus de 50) :
    - aucun génotype-II ou -III n'a été retrouvé.
    - 89,7 % des patients présentaient un profil D1 (génotype-I) et 10,3% un profil « non-I »
    - deux nouveaux profils XhoI (X6 et X7) entraînant trois combinaisons nouvelles (D11, D12 et D 13) supplémentaires ont été détectés (Tableaux XII et XIII). Tableau XII : Nouveaux profils de restriction XhoI obtenus chez cinq patients originaires d'Afrique de l'Ouest
    ETAPE 1
    PATIENTS    		 Fragments SmaI
    Taille (pb)    		 Profil
    SmaI    		 Fragments XhoI
    Taille (pb)    		 Profil
    XhoI    		 Profil Combiné
    SmaI-XhoI
    dFr1843 218,179 S1 303, 78, 16 X2 S1 X2 P7
    dFr1953 218, 179 S1 303, 78, 16 X2 S1 X2 P7
    dFr2020 392 S1 303, 73, 16 X2 S2 X2 P2
    dFr2088 220, 179 S1 242, 171, 16 X6 S1 X6 P8
    dFr2066 217, 179 S1 237, 66, 16 X7 S1 X7 P9
    Tableau XIII : Nouveaux profils de restriction XhoI, SmaI, SacII, obtenus chez cinq patients originaires d'Afrique de l'Ouest
    ETAPE 2
    PATIENTS    		 Fragments SacII
    Taille (pb)    		 Profil
    SacII     		Profil Combiné
    SmaI-XhoI / SacII
    dFr1843 267, 130 Sc3 S1 X2 Sc3 D7
    dFr1953 267,92,38 Sc2 S1 X2 Sc2 D11
    dFr2020 262, 130 Sc3 S2 X2 Sc3 D10
    dFr2088 396 Sc4 S1 X6 Sc4 D12
    dFr2066 396 Sc4 S1 X7 Sc4 D13
  • La correspondance entre les profils combinés et les génotypes identifiés par l'anlyse phylogénétique est présentée dans le Tableau XIV. Tableau XIV : Résumé des différents résultats basés sur les analyses phylogénétiques et les différents profils correspondants
    Clades Génotypes Isolats Profils combinés
    (SmaI-XhoI / SacII)
    HDV-1 I Italie D1A
    dFr2088 D1B
    HDV-2 IIA Japon D2A
    isolats de Yakoutie D2B
    HDV-3 III Pérou1 D3
    HDV-4 IIB TW2b D4A
    IIC Miyako D4B
    HDV-5 V dFr47, dFr73 et dFr910 D5A
    dFr1953 D5B
    HDV-6 VI dFr48, dFr2020 D6
    HDV-7 VII dFr45, dFr1843 D7A
    dFr2066 D7B
    dFr644 D7C
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    Figure imgb0001
    Figure imgb0002
    Figure imgb0003
    Figure imgb0004
    Figure imgb0005
    Figure imgb0006
    Figure imgb0007
    Figure imgb0008
    Figure imgb0009
    Figure imgb0010
    Figure imgb0011
    Figure imgb0012
    Figure imgb0013
    Figure imgb0014
    Figure imgb0015
    Figure imgb0016
    Figure imgb0017
    Figure imgb0018
    Figure imgb0019
    Figure imgb0020
    Figure imgb0021
    Figure imgb0022
    Figure imgb0023
    Figure imgb0024
    Figure imgb0025
    Figure imgb0026
    Figure imgb0027
    Figure imgb0028
    Figure imgb0029
    Figure imgb0030
    Figure imgb0031
    Figure imgb0032

Claims (15)

  1. Molécules d'acide nucléique isolées, caractérisées en ce qu'elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par :
    - le génome complet du variant d'HDV dénommé dFr48 qui présente la séquence SEQ ID NO: 21, et
    - le génome d'un HDV qui présente une divergence génétique ≤ 15 % avec la séquence SEQ ID NO: 21.
  2. Molécules d'acide nucléique, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins l'un des fragments des séquences d'un HDV variant selon la revendication 1, sélectionnés dans le groupe constitué par :
    a) le fragments R0 qui présente la séquence SEQ ID NO: 50,
    b) le fragment R1 qui s'étend des positions 307 à 1289 du génome d'HDV,
    c) le fragment R2 qui s'étend des positions 889 à 328 du génome d'HDV,
    d) le fragment R3 qui s'étend des positions 1486 à 452 du génome d'HDV,
    e) le fragment R'1 qui s'étend des positions 305 à 1161 du génome d'HDV,
    f) le fragment R'2 qui s'étend des positions 984 à 331 du génome d'HDV,
    g) le fragment R644 qui s'étend des positions 889 à 446 du génome d'HDV,
    h) le fragment G910 qui s'étend des positions 1206 à 929 du génome d'HDV,
    i) le fragment p910 qui s'étend des positions 553 à 1550 du génome d'HDV,
    j) l'ADNc codant pour la protéine sHD, de séquence SEQ ID NO: 24 et
    k) l'ADNc codant pour la protéine LHD, de séquences SEQ ID NO: 22.
  3. Méthode de détection d'un HDV variant tel que défini à la revendication 1, par hybridation et/ou amplification, réalisée à partir d'un échantillon biologique, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend :
    (1) une étape d'extraction de l'acide nucléique à détecter, appartenant au génome du virus, éventuellement présent dans l'échantillon biologique,
    (2) la réalisation d'au moins une amplification génique à l'aide d'une paire d'amorces sélectionnée dans le groupe constitué par les amorces aptes à amplifier l'une des régions suivantes de l'ARN génomique d'HDV : R0, R1, R2, R3, R644, G910, p910, R'1 et R'2 et
    (3) l'analyse du produit amplifié par comparaison avec la molécule de séquence SEQ ID NO: 21.
  4. Méthode de détection selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'étape (3) d'analyse peut être mise en oeuvre par restriction, séquençage ou hybridation.
  5. Méthode selon la revendication 3 ou la revendication 4, caractérisée en ce que les amorces spécifiques pour l'amplification des régions R0, R1, R2, R3, R644, G910, p910, R'1 et R'2, mises en oeuvre à l'étape (2) sont sélectionnées dans le groupe constitué par :
    - les amorces 900S (SEQ ID NO:33) et 1280AS (SEQ ID NO:34), pour l'amplification de R0 (environ 400 pb),
    - les amorces 320S (SEQ ID NO:39) et 1280AS (SEQ ID NO:34), pour l'amplification du fragment R1 (environ 960 pb),
    - les amorces 900S (SEQ ID NO:33) et 320AS (SEQ ID NO:45), pour l'amplification de R2 (environ 1100 pb), qui contient le gène sHD correspondant aux positions 1598-950,
    - les amorces 1480S (SEQ ID NO:46) et 440AS (SEQ ID NO:47), pour l'amplification de R3 (environ 650 pb),
    - les amorces 318S (SEQ ID NO:35) et 1150AS (SEQ ID NO:36), pour l'amplification de R' 1 (environ 850 pb),
    - les amorces 960S (SEQ ID NO:37) et 345AS (SEQ ID NO:38), pour l'amplification de R'2 (environ 1050 pb).
  6. Méthode de détection et de génotypage d'HDV à partir d'un échantillon biologique, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend :
    (a) une étape d'extraction de l'acide nucléique appartenant au génome du virus HDV,
    (b) une étape d'amplification de la région R0 délimitée par les positions 889 à 1289 du génome HDV,
    (c) un premier traitement des molécules d'acides nucléiques amplifiées par les enzymes de restriction SmaI et XhoI, pour produire un premier ensemble de fragments de restriction,
    (d) un deuxième traitement des molécules d'acides nucléiques par l'enzyme de restriction SacII, pour produire un deuxième ensemble de fragments de restriction,
    (e) l'analyse combinée des deux ensembles de fragments de restriction produits par RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), de manière à détecter la présence de l'HDV dFr48 présent dans ledit échantillon biologique.
  7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'étape (b) d'amplification des molécules d'acide nucléique dudit échantillon par RT-PCR est avantageusement mise en oeuvre avec les amorces 900S (SEQ ID NO: 33) et 1280AS (SEQ ID NO:34).
  8. Méthode selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre :
    (f) l'amplification des molécules d'acide nucléique dudit échantillon par RT-PCR avec les amorces 900S (SEQ ID NO:33) et 320AS (SEQ ID NO: 45) de manière à amplifier la région R2 et
    (g) le séquençage direct de la région R2 amplifiée et la comparaison avec la molécule d'ARN de séquence SEQ ID NO: 21.
  9. Vecteur recombinant, notamment un plasmide comprenant un insert constitué par une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2.
  10. Cellule transformée par une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2.
  11. Produits de traduction codés par la molécule d'ARN de séquence SEQ ID NO: 21 par ses séquences complémentaires sens ou anti-sens.
  12. Protéines, caractérisées en ce qu'elles sont codées par l'une des molécules d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2.
  13. Protéine selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par :
    - la proteine LHD de dFr48 qui présente la séquence SEQ ID NO: 23, et
    - la proteine sHD de dFr48 qui présente la séquence SEQ ID NO: 25.
  14. Peptide, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'une protéine selon la revendication 12 ou la revendication 13, sélectionné dans le groupe constitué par :
    - le peptide A constitué par les 19 acides aminés de l'extrémité carboxy-terminale de la séquence SEQ ID NO: 23,
    - le peptide C de séquence SEQ ID NO: 64.
  15. Utilisation d'une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3 ou d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 pour la préparation d'un kit de détection et de génotypage d'un HDV.
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