PT2343374E - Moléculas de ácidos nucleicos de hdv, os seus fragmentos e suas aplicações - Google Patents
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Description
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Descrição "Moléculas de ácidos nucleicos de HDV, os seus fragmentos e suas aplicações" A presente invenção diz respeito a moléculas de ácidos nucleicos obtidas a partir de novas estirpes ou isolados do virus da hepatite D constituindo genótipos diferentes dos genótipos conhecidos I, II e III, aos seus fragmentos, às proteinas correspondentes, assim como às suas aplicações como reagentes de diagnóstico. A presente invenção diz igualmente respeito a um processo de diagnóstico sensivel do virus da hepatite D (ou virus da hepatite delta) , assim como a um processo de monitorização epidemiológica de infecções por HDV. 0 virus da hepatite D (VHD ou DHV, para o virus da hepatitis D), ou delta é um virus satélite da hepatite B. Este virus possui uma estrutura particular: estrutura quimérica que associa aos compostos especificos de HDV (ARN virai e proteinas HD) , um envelope possuindo três glicoproteinas de HBV: grande (préSl-préS2-S) , média (préS2-S) e pequena (S). 0 diâmetro médio das partículas de HDV situa-se entre o das partículas de HDV maduras (partículas de DANE: 42 nm) e o dos envelopes vazios de HBV (formas esféricas ou filamentosas: 22 nm) e a densidade de flotação é de 1,24-1,25 g/cm3.
No seio dos viriões o ARN de HDV é circular e de polaridade negativa. 0 genoma mais pequeno conhecido dos vírus que infectam os mamíferos, esta cadeia simples circular fechada possui uma percentagem elevada de GC (60%) .
O ARN de HDV replica-se independentemente do HBV, cujo papel limita-se a fornecer o envelope do HDV. As únicas proteínas encontradas (sHD e LHD) são codificadas pelo ARN 2 anti-genómico que na célula infectada, é completo, circular e de pseudo cadeia dupla, serve de intermediário de replicação e suporta a edição. 0 ARN de HDV pertence a um tipo de ribozima especifica. A reacção de auto-clivagem necessita do ARN e um catião divalente (Mg++) . A clivagem cria uma extremidade 2', 3' fosfato ciclico e uma extremidade 5'-hidróxilo.
As ribozimas delta (genómicas e anti-genómicas) possuem uma configuração secundária vizinha em pseudo-nó. As sequências implicadas incluem principalmente, ou exclusivamente sequências situadas em 3' do local de auto-clivagem (cerca de 84 nucleótidos).
No decurso do ciclo virai, o ARN do HDV codifica para uma proteína que existe em duas formas: uma proteína de 194-195 aminoácidos (forma "s" para small) de 24 kilodaltons (kDa) e uma proteína de 214 aminoácidos (forma "L" de Large) de 27 kDa que existem em proporções variáveis. Estas proteínas transportam a antigenicidade "delta" e são detectadas no fígado ou no soro de doentes ou de animais infectados (chimpanzé, marmota). Estas duas proteínas virais sHD e LHD iniciam-se no primeiro ATG da grelha de leitura aberta situada na posição 1598 (de acordo com a numeração de Wang et al., 1986 ou 1987) do ARN anti-genómico. Ao longo da replicação, uma mutação, dependente de uma enzima celular da adenosina desaminase dependente dos ARN de cadeia dupla aparece na posição 1012, transformando o codão de paragem âmbar (UAG) em codão triptofano (UGG), prolongando em 3" a grelha de leitura de 19 ou 20 codões, e conferindo propriedades diferentes às duas formas sHD e LHD. O ARN é terminado por uma cauda de poli(A), 15 nucleótidos após o sinal de consenso de poliadenilação AAUAAA (posições 954-959). 3
No ciclo de replicação, as funções das proteínas de 24 e 27 Kd opõe-se: sHD activa a replicação virai, quando o LHD a reprime e desempenha um papel na construção das partículas virais. Estas proteínas são fosforiladas nos resíduos serina, mas não são glicosiladas (Tabela 1). Elas são constituídas por domínios funcionais comuns e por um domínio específico da grande proteína LHD.
Tabela I: Resumo e comparação das funções das duas formas p24 e p27
Actividades bioquímicas e biológicas p24 (S) P27(L) Aminoácidos 195 214 Transactivação da replicação + - Trans-inibição da replicação - + Dimerização e polimerização + + Fixação do ARN + + Estabilização do ARN + + Localização nuclear + + Construção — + Fosforilação + + (x6) Terminais carbóxi 19aa específicos ' + Farnesilação — +
Resumidamente os diferentes domínios destas duas proteínas são os seguintes: * Domínios comuns - 0 dominio de polimerização que compreende a sequência entre os resíduos de aminoácidos 13 e 48 formado por um encadeamento da leucina, ou da isoleucina organizada em hélice α do tipo "leucine zipper" (fecho de correr de leucina), implicada na polimerização das proteínas, 4 indispensável na (i) a transactivação da replicação virai pela Ag-sHD, (ii) inibição da replicação pela Ag-LHD e (iii) construção de complexos de sHD-LHD nos envelopes de HBV. - 0 sinal de localização nuclear (SLN) que implica duas sequências de localização nucleares identificadas na região 67-88, essenciais para a translocação de Ag-sHD sintetizada no citoplasma e, pode ser a proteina ribonuclear após a sua entrada na células na direcção do núcleo. 0 local de fixação do ARN que assenta sobre duas sequências ricas em arginina localizadas entre os residuos 97 e 163 que permite a ligação das proteínas sHD ao ARN genómico ou anti-genómico. Esta fixação é indispensável para que a Ag-sHD active a replicação. *Domínios específicos
Os 19-20 aminoácidos situados na extremidade COOH da grande proteína possuem um papel importante no ciclo do HDV. Com efeito, estes aminoácidos (aa 195-214) intervêm na construção das partículas virais (Chang et al., 1991). Esta actividade poderia ser em parte ligada à presença de uma cisteína na posição 211 (Glenn et al., 1992), conservada para todos os genomas virais caracterizados até hoje. Esta cisteína, situada 4 aminoácidos antes da extremidade COOH da proteína, forma uma caixa "CXXX" e fixa um agrupamento farnesilo (Glenn et al., 1992) cadeia de 15 carbonos derivada do ácido mevalónico por acção de uma farnesiltransferase. Esta maturação pós-tradução orienta as proteínas na direcção das membranas celulares. A pequena e a grande proteína foram além disso diferenciadas por anticorpos monoclonais (clone 9E4) (Hwang 5 et Lai, 1993 a) . Estes anticorpos só reconhecem sHD (Lai et al., 1993). A sequência de aminoácidos da pequena proteina está inclusa na grande, estes resultados sugerem uma conformação diferente entre sHD e LHD no seio dos 30 aminoácidos de terminal carbóxi da pequena proteina sHD, sugerindo que o epitopo reconhecido na sHD está mascarado no LHD em condições não desnaturantes. O HDV transmite-se sobretudo através de agulhas contaminadas e pelo sangue, isto é, através dos portadores de HDV ou HBV.
Na América do Norte e na Europa Ocidental a hepatite D encontra-se por isso sobretudo nos utilizadores de drogas intravenosas, nos hemofílicos e nas pessoas que receberam numerosas transfusões. A epidemiologia e os modos de contaminação sobrepõe-se em parte. Estima-se globalmente 5% na proporção dos portadores de Ag-HBs infectados pelo HDV. No entanto, são constatadas disparidades de prevalência geográfica e epidemiológica.
Existe uma elevada prevalência desta doença nos portadores de virus da hepatite B em determinadas regiões do globo incluindo a bacia da Amazónia da América do Sul, da África Central, do sul da Itália e nos paises do Médio Oriente.
No portador mediterrânico, em particular na Itália do Sul, na Grécia e no Médio Oriente, em que a frequência de portadores crónicos de HBV é intermédia (1% a 5%), a infecção por HDV é elevada. Nestas regiões, a transmissão intrafamiliar foi sugerida, suportada por estudos filogenéticos do virus que infecta os membros de uma mesma familia (Niro et al., 1999) . Na Itália do sul, a prevalência no sujeito Ag-HBs positivo diminui passando de 23% em 1987 a 8% em 2000 (Gaeta e tal., 2000). 6
Em África e na Ásia onde os portadores crónicos de HBV possuem uma frequência elevada (10% a 20%), assim como na América do Sul e nas Ilhas do Pacifico, em que ela é intermédia (1% a 5%) , a distribuição do HDV é paradoxalmente díspar. Em África, os estudos de prevalência no soro mostram uma distribuição muito heterogénea dos doentes que possuem anticorpos anti-HD, enquanto que a prevalência global de infecção por HBV estimada pela detecção de Ag-HBs estabilizam entre 12 e 14% (Roingeard et al., 1992) . Assim, taxas variáveis de 4% (zona Norte do Senegal) a 44% (arredores de Dakar) fazem emergir factores socioeconómicos prováveis implicados na transmissão.
Os estudos de prevalência de HDV são para interpretar de forma prudente. Com efeito, nas populações estudadas, há uma inclusão preferencial de doentes que sofrem de hepatopatias. Nos doentes que sofrem de hepatite aguda, ou crónica, a prevalência por infecção com o HDV é mais importante do que nos portadores crónicos assintomáticos de HBV. Além disso, a investigação serológica de uma infecção de HDV baseia-se na detecção de Ag-HD e dos Ac anti-HD totais no soro. Com efeito, as infecções agudas benignas no decurso das quais se desenvolveria uma produção transitória isolada de IgM anti-HD não seriam recenseadas. O HDV é responsável por hepatites agudas e crónicas. Estas infecções são particularmente severas e evoluem mais rapidamente no sentido da cirrose do que as hepatites B isoladas. É uma das razões porque o diagnóstico fiável de HDV associado a HBV é crucial. A infecção por HDV está dependente do HBV. Os isolados de HDV de regiões geográficas diferentes mostram uma variabilidade genética. Actualmente são identificados três genótipos e designados como genótipo I, II e III. 7 0 genótipo serve para a epidemiologia das transmissões virais, permite estudar a repartição geográfica e poderia estar correlacionada com o poder patogénico. 0 HDV só se desenvolve nos doentes igualmente infectados pelo HBV. Esta dupla infecção decorre, seja de uma co-infecção, seja de uma sobre-infecção. - a co-infecção está na origem de uma hepatite aguda. 0 diagnóstico evocado ao longo de uma citólise hepática assenta na detecção dos marcadores de HDV associados à presença de IgM anti-HBc. 0 Ag-HBS geralmente presente seria excepcionalmente negativo, justificando a repetição de pré-colheitas para seguir a cinética de evolução dos marcadores. É clássico constatar uma inibição da replicação do HBV pelo HDV. Os IgM anti-HBc testemunham a infecção recente por HBV. A Ag-HD muito precoce é raramente detectada, tendo em vista a sua fugacidade. Os anticorpos aparecem 2 a 3 semanas após o inicio dos sintomas: predominam os IgM anti-HD, mas mantêm um titulo moderado (<1:1000). Observam-se dois picos de elevação das transaminases, separados por duas a cinco semanas em 10 a 20% de co-infecções, reflectindo provavelmente diferentes cinéticas de replicação dos virus. A co-infecção é por isso caracterizada por uma severidade da hepatite aguda muitas vezes superior àquela provocada pelo HBV isolado. Assim, as hepatites fulminantes são descritas na América do Sul e na África Sub-Sariana, ou em determinadas populações. A evolução é geralmente marcada por uma resolução da hepatite depois da fase aguda e a imagem da história natural do HBV, apenas 5% dos doentes co-infectados evoluem para a doença crónica. - A sobre-infecção é caracterizada pelo aparecimento de uma conversão do soro do HDV num doente portador crónico de Ag-HBs. A virulência de HDV precede a aparição de anticorpos 8 anti-HDV na ausência de detecção dos IgM anti-HBc. A detecção destes marcadores pode preceder uma elevação das transaminases por vários meses. Na fase aguda a sobre-infecção traduz-se por uma hepatite fulminante em mais do que 10% dos casos. Além disso, quando passa a fase aguda a sobre-infecção acarreta frequentemente (60 a 70%) uma hepatite crónica activa com evolução rápida na direcção da cirrose. Na fase aguda da sobre-infecção, a detecção de Ag-HD é seguida rapidamente da aparição de anticorpos que persistem em proporções elevadas. Contrariamente aos modelos clássicos de infecção virai, IgG anti-H e IgM anti-HD são simultaneamente detectados nas hepatites B-delta crónicas. A tabela II seguinte resume a evolução dos marcadores B e delta ao longo das co-infecções e das sobre-infecções.
Co-infecção por HDV Fase Aguda Evolução Crónica Cura Ag-HBs + + - IgM anti-HBc + - - Ag-HD + /- - - IgM anti-HD + /- + - IgG anti-HD + /- + + ARN HDV + + - Ag-HD intrahepático + + 9
Sobre- Evolução infecção por HDV Crónica Cura Ag-HBs + + - IgM anti-HBc - - - Ag-HD + /- - - IgM anti-HD + + - IgG anti-HD + + + ARN HDV + + - Ag-HD intra-hepático + + A co-infecção e a sobre-infecção são indistintas clinicamente. 0 diagnóstico virológico baseia-se habitualmente nos diferentes marcadores séricos. Mais raramente, o Ag-HD pode ser detectado sobre os cortes anatomopatológicos da biopsia ao fígado.
Os marcadores permitem seguir a evolução da doença no sentido da cura ou da doença crónica, decidir a colocação em tratamento de um doente e de avaliar a sua eficácia. Não se isola o HDV em cultura celular e o diagnóstico baseia-se essencialmente na pesquisa de Ag-HD (ELISA, IF) ou do genoma virai (hibridização, PCR, PCR de tempo real) para as técnicas directas e para a detecção de anticorpos IgM anti-HD e IgM anti-HD para os processos indirectos (ELISA). - A investigação da Ag-HD intrahepática pode ser discutida nas hepatites fulminantes tendo em conta a cinética de aparecimento de marcadores séricos. Este exame possui um valor de referência para estudar a replicação do HDV, mas não pode ser utilizado em rotina. 10 -A Ag-HD sérica é pesquisada no soro na presença de um agente dissociante que expõe o Ag-HD incluso no envelope virai que transporta a Ag-HBs. A presença de anticorpos (Ac) anti-HD em taxas elevadas (hepatites crónicas) fixando os antigénios séricos prejudica a detecção. As técnicas de transferência de Western são desenvolvidas com objectivos de pesquisa. A presença do virus no sangue é transitória e limitada à fase precoce da infecção e à possibilidade de detectar a Ag-HD diminui nos dias seguintes à aparição dos sintomas. - A imunocaptura é utilizada para detectar os IgM- anti-HD e a competição para os IgG anti-HD. As técnicas ELISA utilizaram primeiro como antigénio a Ag-HD do soro ou do figado dos doentes ou de animais infectados. Os novos testes baseiam-se em Ag-HD recombinantes ou em péptidos de síntese. -As técnicas de hibridização ou de RT-PCR permitem a detecção de ARN genómico após extracção dos ácidos nucleicos e desnaturação das estruturas secundárias. Foram descritos vários sistemas de iniciadores: a sua escolha é determinante, uma vez que a variabilidade genética nas regiões ditas conservadas pode conduzir a falsos negativos se os iniciadores escolhidos não forem adequados às estirpes virais circulantes. A escolha dos iniciadores de PCR devem entrar em linha de conta com a epidemiologia local dos genótipos descritos e é primordial conhecer bem a repartição destes genótipos no mundo.
De qualquer forma, tanto no caso de co-infecção como no caso de sobre infecção o Ag-HD é de facto difícil de detectar, quando a virulência precede a aparição dos anticorpos.
Neste contexto, e em particular devido à evidência dos novos genótipos são necessários reagentes nucleicos e 11 proteicos que permitam o diagnóstico do HDV, qualquer que seja o genótipo.
Com efeito, o estudo das sequências nucleótidicas de HDV por diferentes equipas no mundo só permitiu diferenciar até ao momento três genótipos diferentes: - o genótipo-1 é o mais frequente e o mais espalhado no mundo. Desde a sua descrição inicial (chimpanzé infectado experimentalmente) por Wang (Wang et al., 1986; Wang et al. 1987), vários grupos sequenciaram o genoma de HDV de isolados geográficos diferentes. A primeira sequência de um HDV no homem foi descrita em 1987, nos estados Unidos por S. Makino et al., num doente toxicómano (Makino et al., 1987) . 0 genótipo I está muito espalhado na Itália, nos Estados Unidos, Taiwan, Nauru, França, Líbano, China (Makino et al., 1987; Chao et al., 1991b; Imazeki et al., 1991; Lee et al., 1992; Niro et al., 1997; et Shakil et al., 1997). No interior do genótipo-I é descrita uma percentagem de semelhança nucleótidica superior a 85%.
Um isolado japonês (Imazeki et al., 1990; Imazeki et al., 1991) é o protótipo de um 2o sub-grupo de HDV. Este genótipo II que só tinha sido descrito inicialmente no Japão e em Taiwan (Imazeki et al., anteriormente citado; Lee et al., 1996b) parece ter uma distribuição geográfica muito mais larga. Em particular, as sequências do genótipo I e do genótipo II proveniente de Yakoutie (Rússia) foram igualmente caracterizadas. Finalmente, determinados autores apoiam-se sobre uma diversidade intra-genotipica permitindo a divisão em sub-tipos IIA (Imazeki et al., 1990; Imazeki et al., 1991; Lee et al., 1996b), IIB (Wu et al., 1998; Sakugawa et al., 1999) e IIC. Em determinados países a infecção pelos vírus do genótipo-II associam-se a hepatites menos severas do que aquelas provocadas pelos HDV do genótipo-I ou III (Wu et al., 1995b). 12
Em 1993 um 3o grupo foi descrito para os genomas dos virus peruvianos e colombianos (Casey et al., 1993 a) . 0 genótipo-III só foi descrito na América do Sul, e em particular na bacia da Amazónia associada a hepatites graves, isto é, epidemias de hepatites fulminantes com esteatose micro vesicular (Casey et al., 1993a; Casey et al., 1996b) e de morbidez e mortalidade elevadas. Nesta região geográfica observa-se que o HDV do genótipo-III encontra-se associado de forma privilegiada com o HBV do genótipo F. Outros isolados deste grupo foram recentemente isolados na Venezuela (Nakano et al., 2001).
Comparando o conjunto dos genomas são descritas duas a quatro regiões conservadas (Chao et al., 1991b). Duas são constantemente encontradas e centram-se à volta dos locais de auto-clivagem dos genomas e anti-genomas implicados nas actividades auto-catalíticas. As outras duas regiões conservadas situam-se na grelha de leitura que codifica para a proteína HD (Chao et al., 1991b).
De qualquer maneira as técnicas de detecção são tributárias da variabilidade genética do vírus procurado; os reagentes conhecidos, em particular a partir das sequências específicas do genótipo-I, II, ou III não permitem detectar as infecções por variante de HDV e em particular de HDV de genótipo diferente dos anteriormente citados.
Consequentemente, as técnicas de detecção precisadas abaixo possuem o risco de chegarem a resultados negativos tanto ao nível nucleico como no que diz respeito à resposta em anticorpos. A colocação em evidência do facto de se considerar que as novas variantes são importantes para preparar reagentes de detecção e de diagnóstico das hepatites D (diagnóstico do soro, PCR, hibridização), suficientemente sensíveis e específicos, isto é não conduzindo a resultados falsamente 13 negativos ou falsamente positivos: com efeito, uma dissociação IgM anti-HD positiva/ARN-HDV negativa pode presentemente ser observada no contexto de uma hepatopatia grave.
No âmbito dos seus trabalhos, os inventores caracterizaram agora de forma surpreendente que a diversidade genética de HDV era significativamente mais importante do que anteriormente descrita, o que tem consequências na fiabilidade do dito diagnóstico.
Colocaram particularmente em evidência nove novas sequências completas de HDV (três originárias de Yakoutie e seis originárias de África), que circulam igualmente na ilha de França e que não pertence a nenhum dos genótipos conhecidos. A análise destes novos isolados: - confirma a existência de uma variabilidade muito mais importante de HDV do que aquela que estava descrita até ao momento, -coloca em causa a classificação dos HDV em apenas três genótipos -conduziu os inventores a propor um algoritmo de PCR-RFLP a partir de uma região parcial do genoma para a genotipagem de HDV e - conduziu os inventores a preparar reagentes adaptados a um diagnóstico fiável das infecções por HDV e qualquer que seja o genótipo, enquanto anteriormente, se observavam numerosos resultados falsos negativos (existências de novos genótipos).
Os inventores tomaram assim como objectivo a disponibilização de moléculas de ácidos nucleicos de HDV aptas a permitir a detecção de uma variante de HDV em relação aos três genótipos descritos anteriormente. 14 São descritas moléculas de ácidos nucleicos isoladas, caracterizadas por serem seleccionadas no grupo constituído por: -genoma completo da variante de HDV denominada dFr48 que apresenta a sequência SEQ ID N°:21 e - os genomas completos dos isolados ou variantes de HDV denominadas dFr45, dFr47, dFr73, dFr910, dFr48 e dFr644 que apresentam respectivamente as sequências SEQ ID N° 1, 6, 11, 16, 21 e 26, e o genoma de um HDV que apresenta uma divergência ou distância genética ^ 15% com a sequência SEQ ID N°: 21.
De acordo com uma concretização vantajosa das ditas moléculas, a região RO é de preferência obtida por amplificação do ARN de HDV com os iniciadores 900S (SEQ ID N° : 33) e 1280AS (SEQ ID N°:34).
No âmbito da presente invenção, entende-se por molécula de ácido nucleico, uma molécula de ADNc ou de ARN que apresenta uma das sequências genómicas de HDV, tais como as definidas acima e as suas sequências complementares de sentido e anti-sentido. A presente invenção possui igualmente como objecto moléculas de ácido nucleico isoladas que compreende pelo menos um dos fragmentos das sequências de uma variante de HDV, tais como as definidas acima, selecionadas no grupo constituído pelo: a) fragmento RO da variante de HDV isolada seguinte: dFr48, que apresenta a sequência seguinte: SEQ ID N° 50, b) fragmento Rl que se estende das posições 307 a 1289 do genoma de HDV, c) fragmento R2 que se estende das posições 889 à 328 do genoma de HDV, 15 d) fragmento R3 que se estende das posições 1486 à posição 452 do genoma de HDV, e) fragmento R'l que se estende das posições 305 a 1161 do genoma de HDV, f) fragmento R'2 que se estende das posições 984 a 331 do genoma de HDV, g) fragmento R644 que se estende das posições 889 a 446 do genoma de HDV, h) fragmento G910 que se estende das posições 1206 à posição 929 do genoma de HDV, i) fragmento p910 que se estende das posições 553 a 1550 do genoma de HDV, j) ADNc que codifica para a proteína sHD, de sequência SEQ ID N°24, k) ADNc que codifica para a proteína LHD, de sequência SEQ ID N° 22 e
No sentido da presente invenção, as posições dos fragmentos no genoma de HDV são indicadas sobre o genoma circular na orientação genómica, de acordo com a numeração de Wang et al., 1986 ou 1987. A invenção engloba igualmente os fragmentos nucleótidicos complementares dos anteriores, assim como de fragmentos modificados em relação aos anteriores por supressão, ou adição de nucleótidos numa proporção de cerca de 15%, em relação ao prolongamento dos fragmentos abaixo e/ou modificados ao nível da natureza dos nucleótidos, desde que os fragmentos nucleótidicos modificados conservem uma capacidade de hibridização com as sequências de ARN genómicas, ou antigenómicas dos isolados, tais como definidas acima.
Com efeito, estas diferentes estirpes virais num mesmo doente, num determinado momento mostram uma população heterogénea de moléculas de ARN de HDV; além disso, ao 16 longo de uma infecção crónica para além de heterogeneidades observadas ao nível do local de edição (posição 1012) é possível aparecerem mutações. As sequências virais parecem evoluir no sentido das populações virais com uma razão de substituição variável de 3,10~2 a 3,10“3 por nucleótido e por ano.
Alguns destes fragmentos são específicos e são utilizados como sondas ou como iniciadores; eles hibridizam-se especificamente com uma estirpe variante de HDV, tal como definida acima, ou com uma estirpe aparentada; entende-se por HDV aparentado uma variante tal como definida acima, um HDV que apresenta uma divergência genética de ^ 15%.
Tais fragmentos são utilizados para a detecção e para o seguimento epidemiológico das infecções de HDV. Por exemplo, é utilizado o fragmento RO para a detecção de (RT-PCR) e a genotipagem (PCR-RFLP) de HDV. Os outros fragmentos que cobrem a totalidade do genoma de HDV são utilizados para a caracterização molecular das variantes de HDV; a análise filogenética da sequência completa do genoma ou dos fragmentos deste correspondendo em particular a RO ou a R2 que permite ligar os perfis observados em PCR-RFLP a um dado genótipo ou de caracterizar novos genótipos.
Consequentemente a presente invenção tem como objectivo um processo de detecção de uma variante de HDV de acordo com a invenção por hibridização e/ou amplificação, realizada a partir de uma amostra biológica, cujo processo é caracterizado por compreender: (1) Uma etapa de extracção de ácido nucleico a detectar que pertence ao genoma do vírus eventualmente presente numa amostra biológica. (2) a realização de pelo menos uma ampliação génica com o auxílio de um par de iniciadores seleccionados no grupo constituído por iniciadores aptos a amplificar uma das 17 regiões seguintes de ARN genómico de HDV: RO, Rl, R2, R3, R644, G910, p910, R'l e R' 2 e (3) a análise do produto amplificado por comparação com uma das moléculas de SEQ ID N°: 21 ao genoma completo da variante denominada dFr48.
De forma vantajosa, a etapa (3) de análise pode ser efectuada por restrição, sequenciamento, ou hibridação; neste último caso, a sonda utilizada (em particular nos chips de ADN) será vantajosamente um fragmento de 15 a 20 nucleótidos específicos dos ditos fragmentos amplificados.
De acordo com uma concretização vantajosa do dito processo, os iniciadores específicos para amplificação das regiões RO, Rl, R2, R3, R644, G910, p910, R'l, e R'2 efectuada na etapa (2) são seleccionados a partir do grupo constituído por: -iniciadores 900S (SEQ ID N°33) e 1280AS (SEQ ID N°34) , para a amplificação de RO (cerca de 400 pb) , -os iniciadores 320S (SEQ ID N°39) e 1280AS (SEQ ID N°:34), para a amplificação do fragmento Rl (cerca de 960 pb), -os iniciadores 900S (SEQ ID N°33) e 320AS (SEQ ID N°45) , para a amplificação de R2 (cerca de 1100 pb), que contém o gene sHD correspondente às posições 1598-950, -os iniciadores 1480S (SEQ ID N°:46) e 440AS (SEQ ID N°:47), para amplificação de R3 (cerca de 650 pb), -os iniciadores 900S (SEQ ID N° 33) e 420AS (SEQ ID N°:40), para amplificação da região R644 (cerca de 1250 pb) do isolado dFr644, -os iniciadores 318S (SEQ ID N°35) e 1150AS (SEQ ID N°:36), para amplificação de R'1 (cerca de 850 pb) , -os iniciadores 960S (SEQ ID N°37) e 345AS (SEQ ID N°38), para amplificação de R'2 (cerca de 1050 pb) , 18 -os iniciadores R910S (SEQ ID N°41) e R910As (SEQ ID N°:42) para amplificação da região G910 (cerca de 1400 pb) do isolado dFr910, -os iniciadores S910R (SEQ ID N° : 43) e Asl910R (SEQ ID N°:44) para amplificação da região p910 (cerca de 650 pb) do isolado dFr910. A presente invenção tem como objectivo um processo de detecção e de genotipagem de HDV a partir de uma amostra biológica, cujo processo é caracterizado por compreender: (a) uma etapa de extracção do ácido nucleico que pertence ao genoma do virus HDV, (b) uma etapa de amplificação da região RO delimitada pelas posições 889 a 1289 do genoma do HDV, (c) um primeiro tratamento de moléculas de ácidos nucleicos amplificados por enzimas de restrição Smal e Xhol, para produzir um primeiro conjunto de fragmentos de restrição, e (d) um segundo tratamento de moléculas de ácidos nucleicos pela enzima de restrição SacII, para produzir um segundo conjunto de fragmentos de restrição (e) análise combinada de dois conjuntos de fragmentos de restrição produzidos por RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism), de forma a detectar a presença e/ou determinar o tipo de HDV presente na dita amostra biológica.
De acordo com uma concretização vantajosa do dito processo, a etapa (b) de amplificação é realizada vantajosamente com os iniciadores 900S (SEQ ID N°: 33) e 1280AS (SEQ ID N° : 34) . O processo de acordo com a invenção permite definir novos perfis de restrição e de classificar os HDV em sete genótipos distintos. 19
De acordo com uma outra concretização do dito processo ele compreende além disso: (f) amplificação de moléculas de ácido nucleico da dita amostra por RT-PCR com os iniciadores 900S (SEQ ID N° 33) e 320AS (SEQ ID N° 45) de forma a amplificar a região R2 e (g) sequenciação directa da região R2 amplificada e a comparação com uma das moléculas de ARN das sequências SEQ ID N° 1, 6, 11, 16, 21 e 26, correspondente respectivamente aos genomas completos dos isolados ou variantes denominadas respectivamente dFr45, dFr47, dFr73, dFr910, dFr48 e dFr644, por exemplo por análise filogenética.
Quando são observados perfis não habituais, esta etapa suplementar permite caracterizar novos genótipos. Com efeito, estas análises complementares da PCR-RFLP permitem ligar o novo perfil observado a um determinado genótipo, ou de caracterizar um novo genótipo por análise filogenética. A presente invenção tem igualmente como objectivo um vector recombinante, em particular um plasmídeo, compreendendo uma inserção constituída por uma molécula de ácido nucleico, tal como a definida acima. A presente invenção tem igualmente como objectivo uma célula transformada por uma molécula de ácido nucleico, tal como a definida acima. A presente invenção tem igualmente como objectivo produtos de tradução codificados por uma das moléculas de ARN de sequência SEQ ID N°: 21 correspondente ao ARN genómico completo da variante denominada dFr48, ou pela sua sequência complementar de sentido, ou anti-sentido. A presente invenção tem igualmente como objectivo as proteínas codificadas pelo genoma de uma variante de HDV, tal como a definida acima.
De acordo com uma concretização vantajosa da invenção, a dita proteína é seleccionada no grupo constituído pela: 20 - proteína LHD de dFr48 que apresenta respectivamente a SEQ ID N°: 23 e - proteína sHD de dFr48 e que apresenta respectivamente a SEQ ID N° 25. A presente invenção tem igualmente como objectivo um péptido caracterizado por ser constituído por um fragmento de uma proteína, tal como definida acima, seleccionada a partir do grupo constituído pelo: - péptido A constituído pelos 19 aminoácidos da extremidade carbóxi-terminal das sequências SEQ ID N° 23, - péptido C constituído por 9 aminoácidos precedendo a SEQ ID N° 59 (da SEQ ID N°:60 à SEQ ID N°65).
Tais péptidos são úteis para o diagnóstico indirecto (serologia) de uma infecção por HDV, em particular por um processo imunoenzimático (ELISA): o péptido B que é conservado permite a detecção do conjunto de variantes de acordo com a invenção e do genótipo II de HDV, e - o péptido C é específico das diferentes variantes de HDV de acordo com a invenção. A presente invenção tem igualmente como objectivo a utilização de uma molécula de ácido nucleico, tal como a definida acima ou de uma proteína, tal como definida acima para a preparação de um kit de detecção e de genotipagem de um HDV.
Para além das disposições anteriores são ainda descritas outras disposições que resultarão da descrição que se segue, que se refere a exemplos de concretizações da presente invenção, assim como às figuras em anexo, nas quais: 21 - a figura 1 representa a árvore filogenética da região RO obtida, através do processo mais próximo vizinho "neighbor joining". Os números em itálico indicam os valores de bootstraping (BV) em 104 amostragens e o sinal ► indica os BV < 50%. A escala representa o número de substituições de nucleótidos por local. - a figura 2 representa a árvore filogenética das regiões RO de HDV obtidas, através do processo de parcimónia máxima. Os isolados Perul, Peru2 e Colombia são escolhidos como "outgroup". Os números em itálico indicam os valores de bootstraping (BV) em 104 amostragens, - a figura 3 ilustra os dados clinicos de cada um dos seis doentes infectados pelos isolados de HDV de origem africana.* indica respectivamente os PCR 6S/6AS e PCR RO, - a figura 4 representa a árvore filogenética dos genomas completos de HDV, obtidos pelo processo do vizinho mais próximo "neighbor-joining". Os números em itálico, ao nivel de cada nó indicam os valores de bootstraping (BV) em 104 amostragens. A escala representa o número de substituição de nucleótidos por local. -a figura 5 representa a árvore filogenética dos genomas completos de HDV obtidos pelo método da parcimónia máxima. Os números em itálico, ao nivel de cada nó indicam os valores de bootstraping (BV) em 104 amostragens, - a figura 6 representa o alinhamento das sequências de aminoácidos das proteínas delta de seis isolados de origem africana (linhas 7, 8, 9, 10, 11 e 12) com as sequências conhecidas do genótipo I (linhas 13, 14 e 15), genótipo (II (linhas 3,4,5 e 6), genótipo III (linha 16) e TW2b/Miyako (linhas 1 e 2), com o auxílio do software Clustal (versão 1.8). O aminoácido na posição 196 da proteína p27 corresponde ao codão de terminação da proteína p24 (Z) ou ao codão triptofano (W) que conduz à síntese da proteína p27 que se estende aos aminoácidos 1 a 215. 22
Deverá ser sempre entendido que estes exemplos são fornecidos unicamente a titulo ilustrativo do objecto da invenção, não constituindo por isso de algum modo uma limitação.
Exemplo 1: Materiais e Métodos 1- Doentes e amostras
Foram analisados 22 soros provenientes de sujeitos seguidos em diferentes centros hospitalares da região parisiense. Os doentes eram portadores crónicos de Ag-HBs. Foi efectuado o diagnóstico de infecção delta pela pesquisa dos marcadores serológicos (Ag-HD, anti-AgHD do tipo IgM e IgG) e a detecção do genoma virai do HDV pela RT-PCR. A Ag-HD não foi detectada em nenhum dos soros analisados. Os anticorpos anti-AgHD do tipo IgM que testemunham o carácter crónico da infecção delta, e do tipo IgG foram encontrados em todos os doentes. A totalidade do genoma de HDV foi caracterizada em seis doentes. Todos os soros foram conservados a -80°C até à extracção do ARN virai.
2- Extracção do ARN do HDV
Para extrair o ARN do HDV, um volume de 250 μΐ de soro foi adicionado a 75 μΐ de TRIzol LS Reagent (Gibco BRL, Life Technologies) . Após 30 segundos de homogeneização, a mistura foi incubada durante 5 minutos à temperatura ambiente. A extracção dos lipidos é efectuada adicionando 200 μ de clorofórmio arrefecido a +4°C. Após uma nova homogeneização em vórtice, os tubos são incubados e depois centrifugados a 14000 rotações por minuto (rpm) durante 10 min, a 4°C. A fase aquosa foi transferida nos tubos de 23 extracção e os ARNs são precipitados por 500 μΐ de isopropanol frio, na presença de 1 yg de glicogénio. Após 15 minutos de homogeneização, as amostras são centrifugadas a 14000 rpm durante 10 min, a 4°C. Após lavagem com etanol a 70% os tubos são de novo centrifugados a 14000 rpm durante 10 min, a +4°C. Os sedimentos são secos em hotte à temperatura ambiente, depois colocados novamente em 100 μΐ de água estéril compreendendo um inibidor de ribonucleases (RNasin, Promega). Nesta etapa são tomadas precauções para evitar eventuais contaminações dos tampões e das amostras pelas ribonucleases. 3. Síntese de um ADN complementar (ADNc)
Esta etapa consiste em sintetizar uma cadeia de ADN complementar ao ARN de HDV por transcrição inversa.
Para eliminar a estrutura secundária do HDV do ARN, 5 μΐ do extracto de ARN anterior é adicionado a uma mistura reaccional contendo 5 μΐ (ou 0,5 pmoles) de desóxinucleótidos trifosfatos (dNTP) e 1 μΐ (0,4 pmoles) de hexanucleótidos aleatórios. Os ARNs são de seguida desnaturados durante 3 min a 95°C. Para fixar os ARNs desnaturados, os tubos são congelados imediatamente em etanol arrefecido a -20°C. Dez μΐ de uma mistura reaccional, contendo 2,5 μΐ de ditiotreitol (DTT), 100 unidades (U) de transcriptase reversa Superscript II, (Gibco BRL, Life Technologies) e o seu tampão reaccional, assim como 20 U de inibidor de ribonucleases (RNasin, Promega) são adicionados ao ARN desnaturado. A reacção de transcrição inversa é realizada a 42°C durante 45 min, depois interrompida por incubação a 94°C durante 5 min. Os ADNc são de seguida conservados a -80°C. 4-Amplificação génica 24 A amplificação dos ADNc é efectuada de forma exponencial por PCR (Polymerase Chain Reaction). Foram utilizados os dois tipos de polimerases: a polimerase AmpliTaq Gold (Thermophilus aquaticus) (PE Applied Biosystems) e a polimerase Pwo (Pyrococcus woesi) ou Expand ™ High Fidelity PCR System (Roche). A amplificação foi efectuada a partir de 5 μΐ de ADNc que são adicionados a uma mistura reaccional de PCR contendo: 0,25 pmoles/ μΐ de iniciador de sentido e anti-sentido (Tabela III), 200 pmoles de cada dNTP, 1,5 mM de MgCl2, 1 U de Ampli Taq Gold ou 2,6 U de polimerase Expand™ na presença de tampões de PCR correspondentes. A reacção de PCR foi realizada num termociclador (PCR Sprint, Hybaid, Coger), de acordo com o protocolo seguinte: desnaturação de híbridos de ADNc-ARN a 94°C durante 9 min, seguida de 40 ciclos sucessivos, compreendendo cada um uma desnaturação dos ADNs a 94°C durante 45 s, uma hibridização dos iniciadores (900S/1280As ou 6S/6As) a 58°C durante 30 s, síntese da cadeia complementar com a polimerase por elongação a 72°C durante 45 s. Finalmente, uma elongação final a 72°C durante 4 min 30 s a 72°C. 25
Tabela III: Sequências de iniciadores utilizados para as reacções de PCR e sua posição sobre o genoma de HDV.
Iniciadores Sequência 5'->3' Número de identificação Posições * 6S gaggaaagaaggacgcgagacgcaa SEQ ID N° 31 904-929 6As accccctcgaaggtggatcga SEQ ID N° 32 1141- 1121 900S catgccgacccgaagaggaaag SEQ ID N° 33 889-911 12 8 OAs gaaggaaggccctcgagaacaaga SEQ ID N° 34 1289- 1265 318S ctccagaggaccccttcagcgaac SEQ ID N° 35 305-328 1150AS cccgcgggttggggatgtgaaccc SEQ ID N° 36 1161- 1138 9 6 0 S gtacactcgaggagtggaaggcg SEQ ID N° 37 962-984 345As tctgttcgctgaaggggtcct SEQ ID N° 38 331-311 320S ccagaggaccccttcagcgaac SEQ ID N° 39 307-328 42 OAs aacaccctcctgctagcccc SEQ ID N° 40 446-427 R910S ccggagttcctcttcctcctcc SEQ ID N° 41 1206- 1227 R910AS gttcgcgtcegagtccttettte SEQ ID N° 42 929-907 S1910R gagctttcttcgattcggac SEQ ID N° 43 1531- 1550 AS1910R gactggtcccctcatgttcc SEQ ID N° 44 572-553 *De acordo com a numeração Wang et al. (Nature, 1986, 323, 508-514; Nature, 1987, 328, 456)
4.1 -Estratégia de amplificação do genoma virai de HDV 0 par de iniciadores 6S e 6As permite amplificar um fragmento de ADN correspondente à extremidade de terminal carbóxi do gene que codifica para o antigénio delta. A região RO compreende a extremidade de terminal carbóxi do gene que codifica para a Ag-HD e uma parte da 26 região não codificante foi amplificada para todas as amostras com o auxilio dos iniciadores 900S (SEQ ID N° 33) e 1280As (SEQ ID N° 34). Foram suprimidos 7 nucleótidos da extremidade 5' do iniciador 900S utilizado, em relação aquele utilizado por Casey et al., 1993 a, anteriormente citado para a classificação dos genótipos de HDV. A selecção destes iniciadores permite de forma surpreendente a amplificação de um fragmento apto para permitir distinguir os genótipos conhecidos (I, II e III) dos novos genótipos.
As sequências completas do genoma virai de HDV de quatro amostras (dFr45, dFr47, dFr48 e dFr73) foram obtidas por amplificação das duas regiões de sobreposição R'1 (850 bases) e R'2 (1050 bases), respectivamente com o auxilio de pares de iniciadores 318S/1150AS e 960S/345AS.
Para a amostra de dFr644, a variabilidade observada na região correspondente aos iniciadores anteriormente descritos conduziu a amplificar a região 644 (R644) com o auxilio de um par de iniciadores específicos: 900S e 480AS.
Para a amostra de dFr910 a sequência nucleótidica RO, permitiu definir novos iniciadores e especificamente a amostra para amplificar o genoma completo. Foram escolhidos dois pares de iniciadores: os iniciadores R910S e R910AS, amplificando um fragmento de 1400 bases correspondente à região G910. Um outro par de iniciadores S1910R e AS 1910R que amplifica um fragmento de 650 bases (região p910) foi indispensável para cobrir a totalidade do genoma. A amplificação das diferentes regiões (Rl, R2, R3, R644, R'l, R'2, G910 e p910) é efectuada como anteriormente descrita. As temperaturas de hibridização e de elongação, assim como o tempo de enlongação utilizado para cada uma das PCR são indicados na tabela IV. 27
Tabela IV: Amplificação dos diferentes fragmentos do genoma
Regiões amplificadas Dimensão dos fragmentos (bases) Temperatura de hibridação (SC) Temperatura de elongação (~ C) Tempo de elongação RI 960 62 72 1 min 15 s R2 1100 56 72 1 min 30 s R3 650 50 72 1 min R644 1250 58 72 40 s G910 1400 58 72 1 min 40 s p910 650 58 72 1 min R' I 850 63 72 1 min R' 2 1050 60 72 1 min 20 s 5- Análise dos produtos de amplificação
Um volume de 8 μΐ do produto PCR é depositado na presença de 2 μΐ de solução de depósito num gel a 1,3% de agarose preparado num tampão de Tris-Borato/EDTA 0,5x e contendo 0,5 pg/ml de brometo de etidio (BET). A electroforese é efectuada em tampão TBE 0,5x. A migração é efectuada na presença de um marcador de dimensão (Raoul™, Appligène). O fragmento amplificado é visualizado sob raios ultravioletas a 312 nm e fotografado.
6- Clonagem e sequenciação dos genomas de HDV
Antes da etapa de clonagem e de sequenciação, os produtos de amplificação foram purificados para eliminar todos os traços de sais e de enzimas. 6.1-Elongação pelo padrão de Taq-polimerase
Esta etapa foi efectuada no caso em que a amplificação do produto foi realizada com a polimerase Pwo. Ela permite 28 adicionar os resíduos das desoxiadenosinas (A) às extremidades 3' dos produtos de PCR, uma vez que a polimerase Pwo, dotada de uma actividade exonucleásica 5'—>3', diminui a incorporação das desoxiadenosinas.
Um volume de 10 μΐ de ADN purificado é adicionado a uma mistura reaccional de 70 μΐ contendo: 0,2 mM de dNTP, 1,5 mM de MgCÍ2, de tampão IX e 2,5U de Taq polimerase (Perkin Elmer). A elongação é efectuada a 72°C, durante 30 minutos. Os produtos PCR sofrem então uma nova purificação com fenol-clorofórmio e uma precipitação com etanol e depois são colocados em 10 μΐ de água estéril. 6.2-Clonagem no vector pCRII-TA-de clonagem (Invitrogen). A clonagem é utilizada para confirmar a sequência nucleótidica de ADN amplificada. É realizada utilizando o vector pCRII (Invitrogen). 0 vector pCRII apresenta-se na forma linear. Possui os residuos de desóxitimidina (T) que permite a clonagem do produto amplificado graças aos residuos complementares da desoxiadenosina (A) adicionados pela Taq polimerase.
Possui igualmente sequências promotoras Sp6 e T7, dois locais de restrição ECORI que enquadram o local de inserção do produto de PCR e os genes de resistência à ampicilina e à canamicina. Uma fracção do gene lacZa, que codifica para a β-galactosidase facilita a selecção dos recombinantes através da cor das colónias. Com efeito os plasmideos que possuem integrado a inserção não exprimem o gene lacZa. As colónias bacterianas são então brancas na presença do substrato de β-galactosidase (X-Gal ou 5-bromo-4-cloro-3-indol β-galactosidase, Roche) e um indutor do gene (IPTG ou isopropil-tio^-galactosidase, Roche). Deste modo, as 29 bactérias recombinantes são seleccionadas graças à sua resistência à ampicilina e a um peneiro azul-branco. A proporção molecular escolhida inserção/vector é de 3/1 e o volume do produto PCR utilizado é variável, de acordo com a quantidade de ADN estimada por electroforese em gel de agarose como anteriormente descrito. A mistura reaccional de 10 μΐ contém 50 ng do vector pCRII, a quantidade de inserção correspondente, 4U de T4 ADN ligase, e o tampão ligase IX. A reacção de ligação é conduzida durante 18 horas a 14°C. Os tubos são de seguida conservados a +4°C.
As bactérias Escherichia coli TOP 10 F' (Invitrogen), tornadas competentes pelo tratamento com cloreto de cálcio são conservadas a -80°C, prontas para serem utilizadas. Um volume de 50 μΐ de bactérias competentes é colocado em contacto com 3 μΐ da solução de ligação durante 30 minutos no gelo. Um choque térmico (30 s a 42°C) faz penetrar o ADN plasmidico nas bactérias que são colocadas imediatamente sobre o gelo durante alguns minutos antes de serem incubadas 1 hora a 37°C, em 250 μΐ de meio SOC (Triptona, 2%; NaCl 10 mM; KC1 2,5 mM; MgCl2 10 mM; glucose 2 0 mM, extractos de levedura 5 g/1). Isola-se de seguida colónias em caixas de Petri contendo agar LB (meio de Luria-Bertani) suplementado em ampicilina (50 μΐ/ml), 40 μΐ de X-Gal (40 mg/ml) e 40 μΐ de IPTG (100 mM) e são replicadas. 6.3-Extracção plasmídica e análise da inserção
As colónias brancas são inoculadas no caldo de LB-ampicilina (50 μΐ/ml) e incubadas durante 18 horas a 37°C, sob agitação. Uma colónia azul, isto é que não tem inserido o fragmento é retida como testemunha negativa de ligação. A extracção plasmidica é efectuada com o auxilio de um kit comercial QIAprep® Spin Miniprep (Qiagen). Brevemente 30 após centrifugação (3000 voltas por min a +4°C) e eliminação do sobrenadante, o residuo bacteriano é suspenso em 250 μΐ de tampão (Tris-HCl 50 mM pH 8, EDTA 10 mM, RNase A 100 μΐ/ml) é lisada por adição de 250 μΐ de tampão alcalino (NaOH 200 mM, SDS 1%) . Após 5 min de homogeneização, adiciona-se 350 μΐ de tampão (acetato de potássio 3M, PH 5,5). 0 sobrenadante contendo ADN plasmidico é de seguida transferido para uma colónia QIAPrep. Uma centrifugação elimina o eluente no tubo colector. A coluna é lavada com um tampão de etanol, seco, depois o ADN é eluido em 50 μΐ de água estéril.
Para verificar a inserção do fragmento de interesse, o plasmideo é então digerido pela enzima de restrição EcoRI. A digestão é efectuada numa mistura reaccional de 30 μΐ contendo: 2 μΐ da solução plasmidica, 10 U de enzima EcoRI (Appligène) e tampão reaccional lx. A digestão dura 2 horas a 37°C e o resultado é visualizado por electroforese em gel de agarose. 6.4-Sequenciação pelo método BigDye Terminator A sequenciação é efectuada sobre os produtos PCR previamente purificados em colunas Microcon 50 (Amicon) ou em ADN plasmidico. Os fragmentos são sequenciados directamente com os iniciadores de PCR (fragmento R0 sequenciado com os iniciadores 900S e 1280As) ou após clonagem no vector pCRII utilizando os iniciadores universais (Sp6 e T7).
Foram mantidos dois clones diferentes por cada uma das regiões amplificadas a fim de levantar eventuais ambiguidades quando da leitura das sequências nucleótidicas. 31 A sequenciação é efectuada com o auxílio do reagente Big Dye Terminator (PE, Applied Biosystems). 0 princípio de sequenciação consiste numa electroforese vertical em gel de poliacrilamida de ADN marcado por quatro fluorocromos diferentes. As matrizes de ADN são depositadas num gel e separadas de acordo com a sua dimensão antes de submeter o gel a um feixe de laser contínuo. 0 laser excita os fluorocromos que emitem cada um a um comprimento de onda diferente, detectado por um espectrógrafo. Um software informático acoplado ao sequenciador permite a análise automática e a conversão de dados em sequências nucleótidicas. A mistura reaccional de 10 μΐ compreende: 4 μΐ da solução de marcação (desoxinucleósidos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), AmpliTaq de ADN polimerase, MgCl2, tampão Tris-HCl pH 9) , 20 pmoles de iniciador (sentido ou anti-sentido) e 500 ng de plasmídeo purificado em colunas do tipo Centricon. As reacções de sequências (sentido e antisentido) são efectuadas num termociclador do tipo Perkin 9600, com 25 ciclos (96°C durante 10 s; 50°C durante 5 s; 60°C durante 4 min) . Os produtos são de seguida precipitados em 40 μΐ de etanol a 70%, depositados sobre gel e analisados graças a um sequenciador automático do tipo ABI PRISM 377.
As sequências brutas obtidas apresentam-se na forma de electroforegramas. A validação e exploração das sequências faz-se com o auxílio de software Sequence Navigator (PE, Applied Biosystems) . Elas são objecto de pelo menos uma leitura dupla, por dois iniciadores de sequenciação diferentes (sentido e anti-sentido), com o objectivo de minimizar os erros.
Estas sequências são de seguida seleccionadas directamente num computador utilizando o software DNA Strider 1.3 permitindo uma análise rápida das sequências. 32 7-Análise informática das sequências nucleótidicas e proteicas
As sequências lidas e corrigidas são comparadas e submetidas a diferentes algoritmos filogenéticos.
As sequências obtidas (22 sequências) foram comparadas com 21 sequências genómicas completas de HDV disponíveis na GenBank (Tabela V).
Tabela V: Número de acesso dos diferentes isolados Números de Acesso (GenBank) Nome do isolado Origem geográfica 1 X04451 Itália 1 (A20) Itália 2 M84917 Libano 1 Libano 3 X85253 Doente A Cagliari (Itália) 4 X60193 7/18/83 (doente S) (doente S) Japão 5 M92448 Taiwan Taiwan 6 L22061 Colombia Colombia 7 X77627 Soro chinês humano China central 8 L22064 Peru-2 Peru 9 L22063 Peru-1 Peru 10 L22066 US-2 Estados Unidos 11 M58629 Nauru Ilha de Nauru 12 U81988 Somália Somália 13 U81989 Etiópia 1 Etiópia 14 AFO98261 Canadá Canadá (Quebec) 15 U19598 Taiwan 3 Taiwan 16 AF018077 TW2b Taiwan 17 L22062 Japão 3 Japão 18 AF30942 Miyako Ilha de Miyako (Okinawa, Japão) 33
Tabela V (continuação)
Numeros de Acesso (GenBank) Nome do isolado Origem geográfica 19 D01075 Us-1 Estados Unidos 20 M21012 W15 Transmissão experimental (Marmotte) 21 AJ307077 W5 Transmissão experimental (Marmotte) 22 AJ309868 a AJ309881 Isolados de Yakoutie Yakoutie (Rússia) A primeira etapa consiste globalmente em alinhar as sequências de interesse com as sequências de HDV de referência descritas e registadas na base de dados (GenBank) utilizando o programa CLUSTAL W1.8 (Thompson et al., N. A. R, 1994, 22, 4673-4680). Foi às vezes necessário efectuar correcções manuais menores com o auxílio do software SeqPup com o objectivo de optimizar o alinhamento.
Foram seguidas duas estratégias: utilização do alinhamento das proteínas para o gene HD e estudo da estabilidade das posições alinhadas com o auxílio de um software de alinhamento adaptado. A partir deste alinhamento de sequências nucleótidicas, são construídas as árvores filogenéticas por algoritmos diferentes. As análises são baseadas em matrizes de distâncias (estratégia fenética), cálculos de máxino de parcimónia (MP; estratégia cladistica) e máximo de semelhança (ML; estratégia estatística). -estratégia fenética (distância genética) 34 0 princípio deste método é encontrar os pares de sequências vizinhas, minimizando o comprimento total dos ramos da árvore. Esta estratégia permite reconstruir uma filogenia com base no cálculo da semelhança global entre as sequências comparadas duas a duas que é expressa por uma distância. É um processo que permite converter os dados das sequências em valores numéricos de distâncias dispostas em matriz. A tipologia de árvore é construída de maneira a reagrupar as sequências que possuem mais características em comum, utilizando um dos processos de reagrupamento como o método do vizinho mais próximo ("neighbor joining") (Saitou et al., 1987). -estratégia cladística (máximo de parcimónia) 0 princípio deste processo consiste em estabelecer relações de parentesco entre as sequências, através da pesquisa das bases nucleótidicas partilhadas, minimizando os eventos genéticos. 0 algoritmo de máximo de parcimónia constrói uma árvore filogenética de tal maneira que implica o mínimo de mutações. A árvore retida é aquela que necessita de menos alterações. Este processo é sensível à diferença das taxas de mutação ao longo dos ramos. Os "ciados" ou " grupos monofiléticos" são constituídos por grupos de sequências que partilham um antepassado comum, excluindo qualquer outra sequência. -estratégia estatística 0 processo máximo de semelhança é considerado como uma estratégia estatística. 0 programa calcula a probabilidade de uma sequência evoluir para outra ao longo do tempo. Noutros termos, consiste em considerar as alterações ao nível de cada local ou carácter como acontecimentos 35 probabilísticos independentes. Este algoritmo de semelhança é acumulado em todos os locais, e a soma é maximizada para estimar o comprimento do ramo da árvore. Este processo necessita de um prolongado tempo de cálculo para pesquisar a árvore filogenética, o mais provável, corresponde às sequências observadas, visto que entra em linha de conta com a probabilidade de alteração de cada caractere.
Todas as análises filogenéticas foram realizadas utilizando os softwares informáticos Phylip 3.75 (PHY Logenetic Inference Package) (Felsenstein et al., 1989) et Paup* versão 4. 0bêta6 (Phylogenetic Analysis Using Parsimony) (Swofford et al., 1998). A análise da distância foi calculada através do processo de Kimura a dois parâmetros que considera as taxas de transição (mutações T <-» C e G <-» A) em cada local e de transversão (mutações "A ou G" <-» "T ou C") em cada local como diferentes. A fiabilidade e robustez dos agrupamentos de sequências (ou topologias) são avaliadas estatisticamente pela aproximação de amostragem (ou bootstrap) em 103 e 104 amostragens.
Os resultados obtidos apresentam-se na forma de uma árvore filogenética visualizada pelo programa Treeview (versão 1.6.5), que propõe diferentes representações da árvore (cladograma, radial e filograma). Permite igualmente visualizar os valores de bootstrap em cada nó e determinar um taxão como outgroup (sequências do genótipo-III). A tradução em aminoácidos do gene delta é efectuada com o auxilio do programa DNAStrider versão 1.3. 0 alinhamento das sequências proteicas é realizado como anteriormente descrito. 8-Análise genotipica do HDV por polimorfismo de restrição (RFLP) 36 A genotipagem de HDV é efectuada por PCR-RFLP da região RO de acordo com as etapas seguintes: -Etapa 1: Os produtos PCR são digeridos pelas duas enzimas de restrição Smal e Xhol (New England Biolabs) : 10 μΐ de produto amplificado é digerido separadamente em dois tubos por 5 U de enzimas Smal ou Xhol, respectivamente a 30°C e 37°C durante 3 horas num volume final de 50 μΐ na presença do tampão adequado e de água estéril. Os produtos de digestão são visualizados sob raios ultravioletas como anteriormente descrito e as dimensões dos fragmentos são determinadas por comparação com um marcador de dimensão (50 pb escala de ADN, ou os marcadores V e VI, Life Tecnologies GibcoBRL). -Etapa 2: as amostras que apresentam um perfil diferente do perfil do genótipo I são digeridas por uma outra enzima SacII (New England Biolabs) durante 3 horas a 37°C e os produtos de digestão são visualizados como na etapa 1. -Etapa 3: o genótipo do virus é determinado a partir da análise da combinação dos perfis de restrição Smal, Xhol e Saci.
9-Algoritmo de genotipagem de HDV por PCR-RFLP
0 algoritmo de genotipagem de HDV por PCR-RFLP compreende pelo menos duas etapas: a primeira consiste na cisão por duas enzimas de restrição, Smal e Xhol do fragmento RO amplificado por RT-PCR a partir dos extractos de ARN dos soros dos doentes; - a segunda para os doentes de "perfil não-I" consiste numa cisão de RO pela enzima SacII; -a sequenciação da região RO ou da região codificante para p24 (ou se necessário da totalidade do genoma), seguida de 37 análises filogénicas que só serão realizadas se perfis de restrição não habituais forem obtidos.
Exemplo 2: Evidência de Novos Genótipos de HDV
1-Análise filogenética da região RO
Foram analisadas 22 amostras de doentes infectados por HBV e HDV. A região RO foi amplificada por PCR depois o fragmento obtido foi sequenciado utilizando os iniciadores 900S e 12 8OAs. 0 estudo filogenético foi efectuado a partir de um alinhamento de sequências de 336 bases de RO (as regiões ambiguas são eliminadas) e incluindo adicionalmente as 22 sequências estudadas, 15 sequências de referência e 6 sequências RO de HDV de Yakoutie (Ptl3, 26 (SEQ ID N°:66), 29, 62 (SEQ ID N° 67), 63 e 704). O nome dado às sequências corresponde a dFr (para "delta França") seguindo-se o número do soro do doente. a) Análise da distância genética A árvore filogenética obtida por reconstrução a partir das distâncias genéticas da região RO é apresentada na figura 1. A topologia da árvore individualisa os genótipos-I e III, representados respectivamente por sete e três sequências nucleótidicas de referência. As outras sequências de referência são representadas pelas sequências do tipo II (Japão, Taiwan-3 e as sequências de Yakoutie), e um grupo de duas sequências (TW2b, Miyako) descritas respectivamente cada uma como protótipo dos "sub-tipos IIB e IIC". 38
Esta árvore mostra que as sequências virais provenientes das 22 amostras analisadas correspondem a duas situações: -11 sequências são filiadas nas sequências do genotipo I, com a excepção da sequência dFr46, que parece ser aparentada com a sequência Us-1 descrita por Makino (Makino et al., 1987); todas estas sequências são distribuídas de
forma heterogénea no seio do genótipo-I as 11 sequências que restam são muito afastadas do genótipo I e do genótipo III. Além disso, nenhuma das sequências se agrupa directamente com as sequências do tipo-II (Japão Taiwan-3, Yakoutie 13, 26, 29, 62, 63,704) ou no grupo das sequências (TW2b, Miyako); estas sequências de referência formam elas mesmas dois grupos distintos. A topologia da árvore obtida por reconstrução a partir das distâncias genéticas da região RO mostra que as moléculas nucleicas isoladas a partir de diversas variantes de HDV repartem-se no seio de quatro sub-grupos (figura 1): A molécula dFr644 que aparece isolada; ela possui sempre conjuntamente com um grupo de três moléculas (dFr45, dFr2066 e dFrl843), um nó que é sustentado por um valor de amostragem de apenas 66,7%. pelo contrário, o ramo que une as moléculas dFr45, dFr2066, dFrl843 é robusto, uma vez que é sustentado por um valor de bootstrap (BV) de 99,9%. - um conjunto de cinco moléculas: dFr47, dFr910, dFr69, dFr73 e dFrl953 é sustentado por um BV de 100% e -um par de moléculas dFr48 e dFr2020, que é igualmente sustentado por uma BV de 100%. b) Análise do máximo de parcimónia 39 A árvore filogenética obtida por reconstrução a partir do máximo de parcimónia da região RO é apresentada na figura 2.
A análise do máximo de parcimónia sustenta a mesma topologia que a análise da distância genética. A reconstrução coloca em evidência a existência no seio das 11 sequências variantes, dos mesmos três grupos monofiléticos; por exemplo, com esta estratégia, o grupo de cinco moléculas dFr47, dFr910, dFr69, dFr73 e dFrl953 é igualmente sustentado por uma BV de 97% (Figura 2).
As 11 moléculas variantes, as moléculas dos genótipos II e o conjunto [TW2b, Miyako] parecem derivar de um ramo comum que poderia por comparação com as sequências do genótipo I e do genótipo III, individualizar o conjunto de sequências do genótipo II. No entanto, os valores de bootstrap que sustentam esta ramificação são relativamente modestos: 88,5% em NJ e 64,5% em MP (amostragem efectuada em 104 amostras) comparadas com aquelas do genótipo-I (BV=99,8%) e do genótipo-III (BV=100%). Além disso, a distância média entre os diferentes subgrupos definidos no seio das 11 variantes de HDV ou entre estas variantes e as sequências do genótipo-II, aparece mais elevada do que entre o conjunto dos isolados do genótipo-I e no seio de três moléculas que definem o genótipo-III. 0 conjunto destes resultados valoriza a caracterização dos novos genótipos de HDV. 2-Análise filogenética da totalidade dos genomas a)Reconstrução do genoma completo a partir de fragmentos amplificados 40
Com o objectivo de estudar o genoma completo destas variantes e com o objectivo de precisar a sua afiliação foram amplificadas várias regiões do genoma de HDV (Tabela II) a partir de 6 amostras incluindo pelo menos um membro de cada um dos 4-subgrupos e foram seleccionados três representantes do grupo maioritário: dFr45, dFr47, dFr48, dFr73, dFr644 r dFr910.
De forma mais precisa, foram amplificados os fragmentos seguintes por PCR (Tabela IV) : -os fragmentos de 850 pb (R'I) e 1050 pb (R'2) sobrepostos nas suas extremidades para dFr45, dFR47, dFr48 e dFr73, -dois fragmentos sobrepostos de 960 pb e de 1250 pb para dFr644, e -dois fragmentos de 1400 pb e 650 pb para dFr910.
Todas estas regiões genómicas amplificadas foram clonadas num vector pCRII™ (Tabela VI). Foram sequenciados dois clones correspondentes a cada um dos fragmentos amplificados. A reconstrução das sequências completas consenso de ADNc de HDV foi efectuada após o alinhamento das regiões sobrepostas e alinhamento com as sequências de referência. 41
Tabela VI: Clones de pcRII contendo as diferentes inserções RO R'l R'2 G910 RI dFr45 dFr45R'l clone 2 dFr45R'l clone 4 dFr45R2 clone 8 dFr45R2 clone 10 dFr4 7 dFr47R'l clone 13 dFr47R'l clone 16 dFr47R2 clone 19 dFr47R2 clone 22 dFr48 dFr48R'l clone 23 dFr48R'l clone 28 dFr48R2 clone 19 dFr48R2 clone 22 dFr73 dFr73R'l clone 36 dFr73R'l clone 39 dFr73R2 clone 29 dFr48R2 clone 33 dFr644 644R1 clone 4 644R1 clone 8 dFr910 910R0-clone 4 910R0-clone 4 R910 clone 29 R910 clone 31 910R1 clone 4 910R1 clone 5 b) Análise de seis novas sequências genómicas completas de HDV de origem Africana bl) Caracteristicas clinicas de 6 doentes
Cinco doentes são originários da África Oriental e um doente que residiu no Camarão. No momento da colheita estes doentes residiam na região Parisiense há pelo menos dois anos. Todos estes doentes sofriam de hepatite grave e os dados clínicos encontram-se resumidos na figura 3. 42
b2) Organização genómica das novas sequências de HDV A análise comparativa das regiões RO de 22 doentes infectados com HDV e HBV com aquelas disponíveis nas bases de dados colocou em evidência a grande diversidade genética do genoma virai de HDV. A dimensão dos genomas completos é diferente para as seis sequências dos seis isolados de HDV de origem Africana, o que confirma a variabilidade do HDV: -o genoma virai dos isolados dFr910, dFr47 e dFr73 que compreende 1697 nucleótidos é a mais longa jamais descrita para o HDV. - o genoma do isolado dFr45 aparece entre os mais pequenos (1672 nt) e - as sequências genómicas dos vírus dFr644 e dFr48 são respectivamente de 1680 nt e de 1687 nt. A análise após o alinhamento das diferentes sequências estudadas revela um grau elevado de conservação nas regiões do genoma de HDV correspondente aos ribozimas responsáveis pelas clivagens dos ARN genómicos e anti-genómicos. Além disso, a grelha de leitura que codifica para o antigénio delta é encontrado sobre a cadeia anti-genómica. Um codão triptofano (UGG) é o único a ser caracterizado por duas sequências (dFr47, dFr910) e uma ambiguidade (G/A) encontrada para as outras quatro sequências indica que a pequena e a grande proteína delta são muito provavelmente sintetizadas. As regiões variáveis compreendem a porção não codificante, assim como as extremidades 5' e 3' do gene LHD. De forma notável, uma inserção de 7 nucleótidos existe na sequência de dFr48. Esta inserção encontra-se presente num laço correspondente a uma das extremidades do genoma na sua forma de pseudo cadeia dupla (na posição 797 da sequência de referência Itália (Wang e tal., 1987). 43 c) Comparação das seis sequências de HDV de origem africana com as sequências representativas dos diferentes genótipos. A comparação das seis novas moléculas com as moléculas conhecidas representativas dos três genótipos conhecidos indica uma semelhança em nucleótidos que se situa entre 71,7% (dFr45 em relação ao Libano) e 80,0% (dFr73 em relação a Yakoutie p26) no que diz respeito às moléculas dos genótipos I, II e das moléculas TW2b e Miyako. Com efeito, para cada um dos seis isolados, a média da semelhança em nucleótidos é da ordem de 73,3% a 74,6% com as moléculas do genótipo I, de 74,5% a 78,8% com aquelas do genótipo II e da ordem de 74,6% a 77,8% com as moléculas TW2b e Miyako. Pelo contrário, a semelhança nucleótidica com o isolado do Peru (genótipo-III) só é de 63,9% a 66,0% confirmando o afastamento particular desta molécula (Tabela VII) . Além disso, quando se compara entre elas as seis moléculas correspondentes a estes genomas completos e que definem as seis variantes dFr45, dFr47, dFr48, dFr73, dFr644 e dFr910, apenas o grupo de moléculas dFr73, dFr910 e dFr47 apresentam uma semelhança de sequência da ordem de 90%. As moléculas dFr45, dFr48 e dFr644 encontram-se também igualmente afastadas das outras que dos genótipos I, II, das sequências TW2b/Miyako e do grupo das moléculas dFr73, dFr910, dFr47 (da ordem de 73,2% a 78%) (Tabela VIII). 44
Tabela VII: Percentagem de semelhança das sequências completas de HDV africanos com os diferentes genótipos conhecidos (cálculo da média).
Isolados de HDV* Tipo I Tipo II TW2b/Miyako Tipo III dFr 4 5 73,3 71,7-74,6 74,5 73,2-75,5 74,6 66 dFr4 7 74,2 73,0-75,0 78, 6 78,2-79,9 77,4 65, 5 dFr48 73,3 72,0-74,0 77,1 76,6-77,7 75,5 74,4-76,6 65, 4 dFr7 3 74,1 73,0-75,0 78, 8 77,7-80,0 77,8 77,5-78,0 65, 9 dFr644 73, 6 72,2-74,6 76,8 76,2-77,2 77,0 76,9-77,2 63, 9 dFr910 74,6 73,0-75,8 77,9 77,0-78,6 77,2 77,0-77,5 64, 6 *0s isolados de HDV de referência correspondem aos genomas completos estudados no exemplo 2.1.
Tabela VIII: Percentagem de semelhança das novas moléculas de HDV entre elas dFr 4 7 dFr 4 8 dFr 7 3 dFr644 dFr910 dFr 4 5 74,8 73,2 75 78 74,7 dFr 4 7 77,1 90 76, 3 89 dFr 4 8 77,7 75,5 76, 1 dFr 7 3 76, 3 89 dFr644 76, 1 d) Análise filogenética das seis moléculas de HDV de origem africana e moléculas representativas dos diferentes genótipos 45
Foi realizada a análise filogenética das seis sequências completas de origem africana, dezasseis sequências de referência e 2 sequências de Yakoutie (Pt26 e Pt62) . A figura 4 ilustra os resultados obtidos pela análise de distância. A árvore filogenética reconstruída por "Neighbor-Joining" (NJ) mostra que nenhuma das seis sequências estudadas (dFr45, dFr47, dFr48, dFr73, dFr644 e dFr910) não se agrupam com as sequências de referência do genótipo I ou do genótipo II. A afiliação destas sequências africanas com as sequências dos genótipos II (às sequências TW2b e Miyako descritas respectivamente como os subtipos IIB e IIC) não está baseada em valores de bootstrap elevados (<70%) (Wu et al., 1998) . Além disso, as sequências TW2b e Miyako parecem formar um grupo distinto e monofilético com um BV de 100%. Estas duas sequências parecem constituir elas mesmo um "ciado" representando um genótipo diferente do tipo II.
Nas análises de distância, as seis sequências africanas são sub-divididas em 3 subgrupos distintos (suportados por BV superiores a 90,3% para amostragens de 104) . As sequências dFr47, dFr73 e dFr910 constituem um grupo, cujo ramo baseia-se no valor de bootstrap de 100%. Para apoiar estes resultados, o estudo de máximo de parcimónia foi conduzido pelo mesmo jogo de sequências (Figura 5). Enraizando a árvore de forma artificial graças à sequência "Peru-1" individualiza-se como em todas as análises efectuadas anteriormente o conjunto das sequências do genótipo-I (BV=100%). A topologia das outras sequências suporta a distribuição dos isolados africanos e asiáticos em vários grupos; este mostra o interesse de utilização da região R0. O genótipo-II agrupa as sequências de Yakoutie, Taiwan-3 e Japão com um BV de 99,9% em 104 amostragens. Igualmente a individualização de TW2b e Miyako confirma-se (BV=100%). Finalmente, as sequências africanas indicam a 46 existência de pelo menos 3 sub-grupos. A monofilia das sequências dFr47, dFr!3, dFr910 (BV=100%) suporta a filiação destas sequências num subgrupo. Pelo contrário, a sequência dFr48 que possui com os isolados do grupo anterior (dFr910, dFr47, dFr73) uma semelhança nucleótidica respectiva de 76, 1, 77,1 e 77,7% agrupam-se com estas sequências apenas em 55,4% das amostragens sugerindo a sua individualização possível. Se bem que parecendo distantes um do outro, o agrupamento dFr45 e dFr644 observa-se com um BV elevado (NJ=96,5/MP=88,6) no contexto estudado.
Consequentemente, as análises filogenéticas das regiões RO e a análise por sua vez das sequências completas das sequências africanas indicam que os grupos diferem uns dos outros e poderiam constituir três (ver quatro) genótipos distintos; estes resultados colocam assim em evidência a existência de pelo menos sete genótipos de HDV. 3-Análise da sequência dos aminoácidos (aa) do antigénio delta (Ag-HD). 0 Ag-HD é representado por duas formas p24 (sHD) e p27 (LHD) da proteína delta. A sequência proteica de 1 a 194-195 aminoácidos corresponde à pequena proteína delta (sHD) ou forma p24. A grande proteína delta (LHD) ou forma p27 possui a mesma extremidade amino-terminal e uma extensão de 19 a 20 aminoácidos na sua extremidade de terminal carbóxilo. O alinhamento de uma sequência do antigénio HD de seis sequências africanas com as sequências das proteínas HD conhecidas encontra-se presente na figura 6. A análise das sequências mostra que os seis isolados de origem africana possuem uma identidade em aminoácidos da ordem de 69 a 77% com as sequências do genótipo I, de 71 a 79% com isolados do genótipo II, de 72% a 78% com as 47 sequências TW2b/Miyako e de 63% com o isolado do Peru (genótipo III). A dimensão das proteínas correspondente aos novos isolados varia entre 213 e 214 aminoácidos. Todas estas proteínas possuem o mesmo perfil de hidrofobicidade. A forma p24 possui duas pequenas regiões hidrófobas, uma situada na vizinhança dos aminoácidos 50-60 (entre o local de polimerização e o SLN) e o outro entre as posições 160 e 172 (no que diz respeito a um motivo extremamente conservado). Dois outros domínios são bem conservados entre os diferentes genótipos: trata-se do domínio de fixação ao ARN e do domínio de localização nuclear. A imagem do que foi descrito na literatura, a extremidade do terminal carbóxilo da proteína delta (entre os aminoácidos 195 e 215) constitui uma região hipervariável. Apenas dois aminoácidos em 19-20 aminoácidos são conservados. Trata-se de uma cisteína (c) correspondente ao local de farnesilação da forma larga da proteína HD e da glicina (G) carboxi-terminal. Além disso, encontram-se as sequências de assinatura específicas dos isolados do mesmo genótipo, por exemplo, os 19 aminoácidos específicos da grande proteína do genótipo 1 ou os 20 aminoácidos do genótipo-III.
Além disso, nas sequências proteicas dos isolados de origem africana, dos isolados do genótipo II e de Tw2b/Miyako, a extremidade de terminal carbóxilo parece subdividida em dois domínios. O domínio variável é representado pelos aminoácidos 197 a 205 e o domínio conservado vai dos aminoácidos 206 a 215 (RLPLLECTPQ) (Figura 5) .
4- Definição de 7 ciados de HDV 48 A análise das sequências completas dos seis isolados de África permite definir sete ciados de HDV correspondentes aos genótipos seguintes (Tabela IX):
Tabela IX: Correspondência Clado/Genótipo
Ciado Genótipo Isolados 1 I Itália, W5, W15, Us 1, Us2, Libano, Etiópia, Somália, ilha de Nauru, China, Cagliari, Canadá... 2 I IA Japão, Taiwan3, Yakoutie2 6, Yakutie62 3 III Peru-1 4 IIB, IIC TW2b, Miyako 5 9 dFr910,dFr73, dFr47 6 9 dFr4 8 7 ? dFr45, dFr644
Exemplo 3: Processo de Genotipagem de HDV-1 a HDV-7 por PCR-RFLP A genotipagem é efectuada de acordo com o protocolo descrito no exemplo 1.8.
1-Falta de sensibilidade da PCR 6A/6S
Inicialmente, três doentes Ag-HBs positivos colocaram um problema de diagnóstico de infecção delta. Com efeito, nestes doentes observa-se uma hepatite grave associada à presença de IgM anti-HDV, mas uma ausência de replicação de HDV por RT-PCR com o auxilio de iniciadores 6A-6S descritos em Deny et al. (1991, 1993, 1994, anteriormente citados)
para o diagnóstico em rotina da infecção por HDV. A PCR 49 6A/6S amplifica um fragmento de ADNc de 234 pb correspondente à parte da extremidade de terminal carbóxilo do gene LHD (posições 904 a 1141 sobre o genoma virai).
Os extractos de ARN do soro destes mesmos doentes foram novamente amplificados com o auxilio do par de iniciadores 900S e 1280AS que definem a região RO.
Os resultados obtidos a partir das amostras destes três doentes colocaram em evidência a presença reprodutível de uma banda de 400 pb (RO) com os iniciadores 900S e 1280AS, enquanto que a PCR 6A-6S permanecia negativa.
Estes resultados foram confirmados numa série de amostras de soro de doentes que foram analisadas em paralelo com os pares de iniciadores 6A-6S e 900S-1280AS. Em 286 amostras 14 são positivos unicamente com a PCR RO.
Estes resultados demonstram uma maior especificidade e uma melhor sensibilidade dos iniciadores 900S e 1280AS, em comparação com os iniciadores 6S e 6A, para a detecção de ARN de HDV no soro dos doentes infectados. 2-Perfis de restrição esperados para HDV-1 a HDV-7
Os métodos utilizados classicamente de PCR-RFLP (Wu et al., 1995a; Wu et al., 1995b; Casey et al., 1996) permitem a distinção de três diferentes genótipos delta. A utilização da enzima de restrição Smal não diferencia todos os genótipos-I, -IIA, -IIB conhecidos até hoje e a enzima Xhol foi utilizada para diferenciar o "sub-tipo IIA" do "sub-tipo IIB" (Wu et al., 1995b) A associação das duas enzimas Smal e Xhol numa primeira etapa revela sete perfis distintos (de Pl a P7) (Tabela X) . Estes sete perfis não se sobrepõem exactamente aos sete ciados (HDV-1 a HDV-7).Como consequência as amostras de perfil "não-Pl" são cortadas numa segunda etapa pela enzima SacII chegando-se assim, à obtenção de forma 50 combinada de 10 perfis delta distintos (de Dl a D10) (Tabela XI) podendo ser associados especificamente aos diferentes ciados descritos, através das análises de filogenia.
Tabela X: Perfis de cisão por restrição da região RO, pelas enzimas Smal e Xhol.
Etapa 1 Genótipos descritos Fragmentos Smal Dimensão (pb) Perfil Smal Fragmentos Xhol Dimensão (pb) Perfil Xhol Perfil combinado Smal-Xhol I 220,179 SI 383,16 XI S1X1 PI I IA 397 S2 303,78, 16 X2 S2X2 P2 IIB 397 S2 319, 79 X3 S2X3 P3 IIC (Miyako) 397 S2 157,162, 79 X4 S2X4 P4 III 298,107 S3 405 X5 S3X5 P5 II Yakutie 178,117, 110 S4 303,78, 16 X2 S4X2 P6 dFr45 217,179 SI 303,78, 16 X2 S1X2 P7 dFr644 217,179 SI 303,78, 16 X2 S1X2 P7 dFr4 7, 73, 910 179,111, 107 S4 303,78, 16 X2 S4X2 P6 dFr 4 8 397 S2 303,78, 16 X2 S2X2 P2 51
Tabela XI: Perfis de restrição esperados após cisão da região RO, pelas enzimas Smal e Xhol e SacII.
Etapa 2 Genótipos descritos Fragmentos SacII Dimensão (pb) Perfil SacII Perfil combinado Smal-Xhol I 362,38 Scl SlXlScl Dl I IA 266, 92,38 Sc2 S2X2Sc2 D2 IIB 268,130 Sc3 S2X3SC3 D3 IIC (Miyako) 268,130 Sc3 S2X4Sc3 D4 III 405 Sc4 S3X5Sc4 D5 II Yakutie 266, 92,38 Sc2 S4X2Sc2 D6 dFr45 268,130 Sc3 S1X2SC3 D7 dFr644 397 Sc4 S1X2SC4 D8 dFr4 7, 73, 910 268,130 Sc3 S4X2SC3 D9 dFr 4 8 268,130 Sc3 S2X2Sc3 D10
3-Genotipagem das amostras de doentes por PCR-RFLP A partir da análise por PCR-RFLP de amostras (mais de 50) : -não foi encontrado nenhum genótipo-II ou III. -89,7% dos doentes apresentavam um perfil Dl (genótipo-I) e 10,3% um perfil "não-I" - foram detectados dois novos perfis Xhol (X6 e X7) que trazem três combinações novas (Dll, D12 e D13) suplementares (Tabelas XII e XIII). 52
Tabela XII: Novos perfis de restrição Xhol obtidos nos cinco doentes originários da África Oriental
Doentes da Etapa 1 Fragmentos Small Dimensão (pt>) Perfil Smal Fragmentos Xhol Dimensão (pt>) Perfil Xhol Perfil Combinado Smal-Xhol dFrl843 218, 179 SI 303,78,16 X2 S1X2 P7 dFrl953 218,179 SI 303,78,16 X2 S1X2 P7 dFr2020 392 SI 303,73,16 X2 S2X2 P2 dFr2088 220, 179 SI 242,171,16 X6 S1X6 P8 dFr2066 217,179 SI 237,66,16 X7 S1X7 P9
Tabela XIII: Novos perfis de restrição Xhol, Smal, SacII, obtidos nos cinco doentes originários da África Oriental
Doentes da Etapa 2 Fragmentos SacII Dimensão (pb) Perfil SacII Perfil Combinado Smal-Xhol SacII dFrl843 267, 130 Sc3 SlX2Sc3 D7 dFrl953 267,92,38 Sc2 SlX2Sc2 Dll dFr2 02 0 262,130 Sc3 S2X2Sc3 D10 dFr2 0 8 8 396 Sc4 S1X6SC4 D12 dFr2066 396 Sc4 S1X7SC4 D13 A correspondência entre os perfis combinados e os genótipos identificados por análise filogenética é apresentada na Tabela XIV. 53
Tabela XIV; Resumo dos diferentes resultados baseados nas análises filogenéticas e nos diferentes perfis correspondentes
Ciados Genótipo Isolados Perfis combinados (Smal- Xhol/SacII) HDV-1 I Itália DIA dFr2088 DIB HDV-2 I IA Japão isolados D2A de Yakoutie D2B HDV-3 III Perul D3 HDV-4 IIB TW2b D4A IIC Miyako D4B HDV-5 V dFr47, dFr73 e D5A dFr910, D5B dFrl953 HDV-6 VI dFr48, dFr2 02 0 D6 HDV-7 VII dFr45, D7A dFrl843, D7B dFr2066, D7C dFr644 54
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Listagem de Sequências
<110> ASSISTANCE PUBLIQUE-HOPITAUX DE PARIS DENY Paul RADJEF Nadjia HUC-ANAIS Patrícia <12 0> . <130> S1020FR17 <140> <141> <160> 67
<170> Patentln ver. 2.1 <210> 1 <211> 1672 <212> DNA <213> hepatitis D virus <22 0> <221> source <222> (1) .. (1672) <223> complete genomic sequence of dFr45 <4 0 0> 1 57 gscgs&^&sss Φ»*««99β»κ agastasses atggtagasa sgsgegsspse sefcstgsssfe taeapgifefeaa sasttstssfee ea^s;i$&áséè 9t:á^ffig*t:»3 gsggspstige &mmmzm #scta#©§&f QCQ®gqp»tt fcggstawcts fggfaetísgf §ãe*«&eg§$ eeseaetôse tseaascisg «qsy&fcscifcã sãettttstt ge*®ggès*© sfcsccga^g asgsttss«a $ag®f&tós& &sgte©&ssfc teggatgssis aagsfgisáág ásgfattsfg fcassMsgsg «sgt§f»&M fgtsfcçsfeéf fstffeegsf& feaffetfsfg asegaagdíf e&t«eees»e e^sfwss^ fceetf&gfefes SftsSt&ttOO tottffcteoe fsg^sstt* eett$fctae$ «ttttteeefc fcegsegffff *§çtosmtm fsaafgf&fct gt«sr£se*e* egagfctefcfc» «gsftsttsss tssgggatst sttsgfcatsg çttastcfctt: ttsSSgmsOá a^aegfaga tggg&gagga stcfcg&ggag aggactccca aaasgssiggít aaaçctcttç tcet^asbac gagafctceoe a&fgtâgçae agtrgaggcas sfctèafçgá* cág&àgsgss fcsfssfè&fãí gsgsgassgg tffâtffctse geeeeeajfct sseeaastaf qstgteeegg fi&tagefies efesa&tggtfeg fffsstsasà. tesMagatg «ssfcfctfgee ggestfgtee g&ssgteecfe sfffcsatg-fe OfOfffcf®*·1 ffg«*efc«ee sggfesggace ««gggg&ggt acfeasàíKSfc gfcpgtgfsa mmmmm topeis* eestcteseçr tfcetgg&gas sccecgggcg sfceteefcsgtg fetatistfcc ttfefceíífcteg t«Ottgf«fcg» gfgaetefctòe :*¥ft$egfc«fgít gsgseegtet: :§$tãs§gs§t cgsséiSKeat «»»gte«efa e©tftt-«east «ffefetíÊfcfeg» fcggfcofcfcstt *8&ψ&**Φ* eec*efc«;<sg4 qmtW&e* fceteggea-gs ggsgscigct ggeçgctç&g ç&g&g&®ee« egagg&çgca 60 ag*ffgace®s **Bff*et««a 120 gaatg»gpf*a sssgggtEfgg ISO ggsèete^&g 240 tceacc&gga gststcggac· 300 tgtccsgçts gaatt^tes® 360 gss«g»«a®f 4:20 §getes#aft «pffstt&ts 4S0 atsísse&tes aratgsssgg 340 &3«£as«gs& #ea«eís«a*% 300 fa&etsssse- cstcswftt 360 ¢¢9¾¾¾¾¾¾ g^tggsgaeg 120 gaat®g®aee es&fasstss ISO titgásàfeee gsftgossgt 340 $$«#»*«&$» i%ee®m6&3 300 g«tfrgss:stt tattfgfggf 360 IggfcSSttSt ggáissc&gt« 1020 gggfpi&te* $g$e$se«&* 1ÓS0 feggõeesfcof gfsggfttssi IMO etegfeeafeeg fg^issast 1800 tcstgffig^ÃS sgstifSffciSt 1230 «te&fcsíftsf ftfssfèíSts 1388 ssf&l«fcgtt «§fgsfcç*»fc 1388 tsfefcoefeOtf stftttssss 1440 tgtcttesgg sgsstcstst ISOO «4f8Sfc«**ó %®çtíttsm& 1330 ç$e99$e$&t ccteagfctst 1320 ccft-ffe-ssga §« 1312 <210> 2 <211> 642 <212> DNA <213> hepatitis D virus <22 0> <221> CDS <222> (D · · (642)
Lisboa 1 de Agosto de 2012.
Claims (15)
1 Reivindicações 1. Moléculas de ácido nucleico isoladas, caracterizadas por serem seleccionadas no grupo constituído pelo: - genoma completo da variante de HDV denominada dFr48 que apresenta a SEQ ID N° 21, e - genoma de um HDV que apresenta uma divergência genética ^15% com a sequência SEQ ID N°:21.
2. Moléculas de ácido nucleico caracterizadas por compreenderem pelo menos um dos fragmentos da sequência de uma variante de HDV de acordo com a reivindicação 1, seleccionadas no grupo constituído pelo: a) fragmento RO que apresenta a SEQ ID N° 50, b) fragmento RI que se estende das posições 307 a 1289 do genoma de HDV, c) fragmento R2 que se estende das posições 889 à 328 do genoma de HDV, d) fragmento R3 que se estende das posições 1486 à posição 452 do genoma de HDV, e) fragmento R'l que se estende das posições 305 a 1161 do genoma de HDV, f) fragmento R' 2 que se estende das posições 984 a 331 do genoma de HDV, g) fragmento R644 que se estende das posições 889 a 446 do genoma de HDV, h) fragmento G910 que se estende das posições 1206 a 929 do genoma de HDV, i) fragmento p910 que se estende das posições 553 a 1550 do genoma de HDV, 2 j) ADNc que codifica para a proteína sHD de SEQ ID N°:24 e k) ADNc que codifica para a proteína LHD de sequência SEQ ID N°:22.
3. Processo de detecção de uma variante de HDV, tal como definida na reivindicação 1, por hibridação e/ou amplificação realizada a partir de uma amostra biológica, cujo processo é caracterizado por compreender: (1) uma etapa de extracção de ácido nucleico a detectar que pertence ao genoma do vírus eventualmente presente numa amostra biológica. (2) a realização de pelo menos uma amplificação génica com o auxílio de um par de iniciadores seleccionados no grupo constituído por iniciadores aptos a amplificar uma das regiões seguintes de ARN genómico de HDV: RO, Rl, R2, R3, R644, G910, p910, R'l e R'2 e (3) a análise do produto amplificado por comparação com uma molécula da SEQ ID N°:21.
4. Processo de detecção de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a etapa 3 de análise poder ser realizada por restrição, sequenciação, ou hibridação.
5. Processo de acordo com a reivindicação 3, ou a reivindicação 4, caracterizado por os iniciadores específicos para a amplificação das regiões RO, Rl, R2, R3, R644, G910, p910, R' 1 e R' 2 utilizados na etapa (2) serem seleccionados no grupo constituído por: -iniciadores 900S (SEQ ID N°33) e 1280AS (SEQ ID N°34) para a amplificação de RO (cerca de 400 pb), 3 -iniciadores 320S (SEQ ID N°39) e 1280AS (SEQ ID N°:34), para a amplificação do fragmento RI (cerca de 960 pb) , -iniciadores 900S (SEQ ID N°33) e 320AS (SEQ ID N°45), para a amplificação de R2 (cerca de 1100 pb) , que contém o gene sHD correspondente às posições 1598-950, -iniciadores 1480S (SEQ ID N°:46) e 440AS (SEQ ID N°:47), para amplificação de R3 (cerca de 650 pb) , -iniciadores 318S (SEQ ID N°35) e 1150AS (SEQ ID N°:36), para amplificação de R'1 (cerca de 850 pb) , -iniciadores 960S (SEQ ID N°37) e 345AS (SEQ ID N°38), para amplificação de R'2 (cerca de 1050 pb),
6. Processo de detecção e genotipagem de HDV a partir de uma amostra biológica, cujo processo é caracterizado por compreender: (a) uma etapa de extracção do ácido nucleico que pertence ao genoma do virus HDV, (b) uma etapa de amplificação da região R0 delimitada pelas posições 889 a 1289 do genoma do de HDV, (c) um primeiro tratamento de moléculas de ácidos nucleicos amplificados por enzimas de restrição Smal e Xhol, para produzir um primeiro conjunto de fragmentos de restrição, (d) um segundo tratamento de moléculas de ácidos nucleicos pela enzima de restrição SacII, para produzir um segundo conjunto de fragmentos de restrição (e) análise combinada de dois conjuntos de fragmentos de restrição produzidos por RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) , de forma a detectar a presença de HDV dFr4 8 presente na dita amostra biológica.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a etapa (b) de amplificação de moléculas de ácido nucleico da dita amostra por RT-PCR ser vantajosamente 4 preparada com os iniciadores 900S (SEQ ID N°:33) e 1280AS (SEQ ID N°34).
8. Processo de acordo com a reivindicação 6 ou a reivindicação 7, caracterizado por compreender além disso: (f) amplificação de moléculas de ácido nucleico da dita amostra por RT-PCR com os iniciadores 900S (SEQ ID N° 33) e 320AS (SEQ ID N° 45) de forma a amplificar a região R2 e (g) sequenciação directa da região R2 amplificada e a comparação com a molécula de ARN da sequência SEQ ID N°21.
9. Vector recombinante, em particular um plasmideo compreendendo uma inserção constituída por uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, ou 2.
10. Célula transformada por uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, ou 2.
11. Produtos de tradução codificados pela molécula de ARN da sequência SEQ ID N° 21, ou pelas suas sequências complementares de sentido, ou anti-sentido.
12. Proteínas caracterizadas por serem codificadas por uma das moléculas de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, ou 2.
13. Proteína de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por ser seleccionada no grupo constituído pela: - proteína LHD de dFr48 que apresenta a SEQ ID N° 3, e -proteína sHD de dFr48 que apresenta a sequência SEQ ID N° 25. 5
14. Péptido, caracterizado por ser constituído por um fragmento de uma proteína de acordo com a reivindicação 12, ou a reivindicação 13, seleccionado no grupo constituído pelo: - péptido A constituído pelos 19 aminoácidos de extremidade de terminal carbóxilo da sequência SEQ ID N° 23, - péptido C de SEQ ID N°:64.
15. Utilização de uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de uma proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14 para a preparação de um kit de detecçao e de genotipagem de um HDV. Lisboa, 1 de Agosto de 2012.
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