PT1624076E - Detecção quantitativa do hdv por pcr à ta em tempo real - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "Detecção quantitativa do HDV por PCR à TA em tempo real" A invenção presente diz respeito a reagentes específicos para a determinação quantitativa do HDV e mais em especial para se seguir a carga virai de HDV em pacientes cronicamente infectados. A invenção presente também diz respeito a uma tal determinação quantitativa 0 Vírus Delta da hepatite (HDV) é responsável por hepatite aguda severa e crónica em pacientes previamente ou co-infectados com o vírus da hepatite B. 0 tratamento baseia-se na administração a longo prazo de alfa-interferão (IFN) e a sua eficácia é em geral monitorizada pela detecção de IgM específico anti-HDV ou do genoma de HDV no soro. 0 Vírus Delta da hepa :e (HDV) é uma partícula V1Γ d 1 com 36 n m qi " P d epende do vi ru s ts da hep idtl tG i ;HBV) Q ã Γ 5 a montag ΘΓΓι 0 p 8 Σ d 8. pr ~opag, 3 Ç ã o d o V í ríâo -. A partic ular de HDV é cc ίΠ S i" í tu ^ da por um CfcH orna círcu 1 P γ- Ηρ cadeia singela de AR N com a n 1, 6'. 1 0 1 a PS : 697 nucle ót idOS qu e se mont a C( dill duas pro teíi (13 ^ SHD e LHD / formar a ribonr ide* oproteír :a, Dur <ã repl rcaç cX Ο V 1 ra 1, a ο ζ. ribonucleopr oteina brota através do retículo € ;ndoplásmico do hepatóci t o, e adquire um envelope no qual es mão imersos antigénios da superfície da hepat ite B (H .BsAg) . Uma complementar idade íntramolecular extensiva leva ao emparelhamen to de bases e permite ao genoma do HDV uma estrutura de pseudo dupla cadeia J (Figura 1 ) . Análises sequenciais extensivas de numerosos isolados perrrti tiram fazer-se a classificação do HDV em pelo menos 7 ciados distintos, com distribuições geográficas diferentes2. Em suma, os vírus do ciado 1 do HDV (genótipc I, doravante denominado, neste documento, HDV-1) estão disseminados em quase todas as áreas, os ciados 2 e 4 (genótipos ΙΙΆ e IIB, respectivamente, denominados doravante respectivamente HDV-2 e HDV-4) estão localizados nas áreas do extremo leste, o ciado .3 (genótipo TTI, HDV-3) no norte da América do Sul, e os ciados 5, 6 e 7 í HDV—5, HDV-6, e HDV-7), na África Ocidental 2,4~' (veja-se também o WO 03/027291). A infecção com HDV pode provocar uma doença severa do fígado, ocorrendo urna hepatite fulminante pelo me nos 10 ve zes ruais f req’ jentemente do que com só , é uma 1 - dXâ CJ.6 1 nf ecç ãc crónica que atinge cr onic ida de de 7 0 a 90% no caso de uma super í Em muitos c £3os, a hepat ite delta crónica evo C1 rros 0 í 6 0-70%) e para cancro do fígado ef τρίο ncia do trata mento desaponta 12,1 3. De fc de 12 me s es 8. Í H t θ Γ ferão -alfa (IFN â dose el ,, 1,8,! por semana/ (que e o único regime que parece aumentar a 14) , só cerca de 50% dos sobrevivência a longo prazo C8lCd

pacientes responde ao tratamento, e 40% daqueles que reagem têm uma recaída durante os 6 meses que se seguem ao fim da terapia 12. Nem a lamivudína, um análogo de nucieósidos inibídor da ADN pclímerase do HBV 13'ib, nem a ribavirina, o aciclovir, ou o farnciciovír são eficientes no controlo da infeccão cor HDV 0 diagnóstico da infecção por HDV baseia-se em geral na detecçâo de anticorpos específicos anti-HDV, reflectíndo a presença de IgM anti-HDV IgM a ocorrência da replicação virai. No entanto, esta via sorológica a detecçâo da replicação do vírus é pouco sensível 20,zl.

Apresenta-se uma revisão acerca da evolução dos marcadores de B e de delta durante as co-infecções e uma super infecção no Pedido Internacional de PCT WO 03/027291. O antigénio de HDV é raramente detectado no soro, excepto no caso de infecção aguda (antes ria transformação do soro pelos anticorpos), ou entre pacientes altamente imuno-suprímidos e com infecção crónica z2. A replicação do HDV é portanto avalia a.â da forma ma i s eficiente pela detecçâo de ARN de HDV no soro , ut íiizando testes qualitativos por POR desenvolvidos no laboratório

Embora a detecçâo do ARN de HDV no soro se relacione em geral com danos no fígado e tenha resultados fracos ela não permite avaliar a eficácia do tratamento com a mesma precisão do que uma avaliação quantítalva - 4 A PCR em tempo real permite dispor de um meio preciso e sensível para quantificar qenomas virais, com a vantagem pri I i C 1 p â 1 de evitar maníp ulaçoes após a PCR, as quais podem sempre constituir uma f once de contaminação laboratorial com ADN. Diversos estudos descrevem as vantagens desta técnica para a quantificação de genomas virais em amostras dc sangue “6~28 Recentemente, Yamashíro -p ^ J~ -,7 1 . cr L d .1 . desenvolveram uma deter mi nação por PCR em tempo real e à TA, para quantificar o ARN de HDV no soro, e sugeriram uma correlação possível entre a carga virai e o estádio clínico da doença do fígado O Os iniciadores utilizados por Yamashíro T. et ai. foram designados na base da região conservada entre os genótípos de tipos 1, 2a e 2b de HDV. Esses iniciadores não levam portanto em conta os outros genótípos de HDV.

Os princípios gerais da PCR quantitativa à TA em tempo real sâc conhecidos na técnica e foram por exemplo descritos em Poítras et al. e em Gibson et al. 44. A PCR em tempo real com base na tecnologia TacMan® permite a quantificação do AND ou do cADN por toda uma larga gama dinâmica (10 to 10' cópias), e está portanto bem adaptada para a quantificação de genomas virais. No caso do HDV, uma gama de quantificação al γρuii~o â ! t^s pfd após inoculação dír ίΙϋθΓαΠΟΟ CJU0 S0 CÍ0 L ΘΟ ’C 8 Ud.II! Câ£'CjdS VI hímpanzés (durante a fase aauda da ínfe ac fígado! que tratamento D I0CiSd G ci p USbl í J J_ i. _dadí Q0 s eauimeni detecte 5 quantidades muito pequenas de ARN. Para além disto, a POS síbíl idade de manipular muitas amostras e a ir lexiscênoía de maní pulação a seguir ao PCR torna-a via segura e conveniente para o diagnóstico clinico.

No entanto, nenhum dos métodos já propostos é capaz de detectar com boa sensibilidade e com uma elevada especificidade qualquer genótipo de HDV incluindo o tipo 3 e os tipos 5, 6, e 7 recentemente descritos.

Para além disto, o desenvolvimento de um teste preciso e sensível para a quantificação do ARN de HDV em amostras de sangue levanta dois problemas técnicos. Em primeiro iugar, a estrutura "em bastão" do ARN de HDV, que é devida a um emparelhamento com base intramolecular de mais do que 70% da sequência 3,j7, tende a conferir eficácia na síntese do cADN, e portanto eficácia ao PCR. Em segundo lugar, a variabilidade genética do vírus ‘,4“7 implica uma concepção específica dos iniciadores e da sonda. De facto, demonstrou-se já que a divergência existente entre os tipos de HDV pode ser tão elevada quanto 37%, ao longo de toda a sequência de nucleótidos do genoma 3.

Os inventores definiram portanto como objectívc para o seu trabalno, o de proporcionar reagente para moléculas de ácido nucleico de HDV capazes de serem utilizados num teste que Demitisse cuanti ficar o ARN ce HDV para todos os tipos de HDV, no soro dos pacientes infectados. A quantificação do ARN de HDV no soro, com entre os reagentes da invenção presente seleccionados de ribozimas, constitui inesperadamente uma melhoria para o seguimento de pacientes, face ao estado da técnica.

De facto, os iniciadores e a sonda concebidos nestas regiões, apesar de possuírem estruturas secundárias fortes, levam a uma eficácia de PCR superior a 93%.

Para além disto, a invenção ajudará a conhecer a história natural do desenvolvimento da infecçãc- pelo HDV e a definir as linhas mestras para a gestão da hepatite deita crónica.

Verificou-se que o teste referido era, inesperadamente, suficientemente sensível para detector 100 cópias de ARN de HDV por mL de soro, era reprodutível, e era eficiente na deteeção do genoma de todos os tipos de HDV incluindo o tipo 3 bem como os tipos 5, 6 e 7 recentemente descritos. A determinação da carga virai em pacientes infectados seria útil para discriminar entre aqueles que respondem e os que não respondem à terapia com IFN, com uma precisão maior do que quer a via qualitativa habitual, quer a via quantitativa baseada na utilização de iniciadores seleccionados na região que codifica para o antígénío deita. método A matéria que e assunto da invenção presente è portanto um método para se detectar o ARN de HDV numa amostra biológica, método esse que é caracterizado por 7 7 incluir : (1) um passo de exLracção do ARN de HDV a partir de uma amostra biológica e (2) um passo de avaliar a quantidade do ARN de HDV referido por PCR à TA em tempo real quantitativo, incluindo: - amplificar-se o seu cADN correspondente na presença de pelo menos um par de iniciadores seleccionados de entre o conjunto constituído pelos seguintes pares: (a) Delta-F (iniciador directo): 5'- GCATGGTCCCAGCCTCC-3' , (SSQ ID N°:l) e

Delta-R (iniciador reverso): 5'- TCTTCGGGTCGGCATGG-3', (SBQ IDN°:2) e (b) T3-Delta-F (iniciador directo): 5' -GCATGGCCCCAGCCTCC-3', (SEQ ID N°:3) e

Delta-R (iniciador reverso): 5'- TCTTCGGGTCGGCATGG-3', (SEQ ID N° :2) .

Por causa de existência de uma desadaptação com as sequências do genoma do tipo III, foi especlficamente concebido um segundo iniciador para a amplificação dos isolados de HDV-3. 13-Delta-F: 5'-GCATGGCCCCAGCCTCC-3' (SEQ ID N°:3); por utilizar-se em vantagem os dois mencionados acima essa razão, podem simultâneo e com pares de iniciadores e - detectar-se a quantidade dos produtos de amplificação formados e comparar-se essa quantci dade com pelo menos uma amostra de controlo.

De acordo com uma concretização vantajosa do método referido, o passo de detecção é levado a cabo na presença de uma sonda fluorogénica (Delta-P (sonda)] definida pela seguinte sequência: 5'- ATGCCCAGGTCGGAC-3' (SEQ ID N° : 4) .

De acordo com outra concretização vantajosa do método referido, o passo de detecção referido inclui como amostra de controlo uma amostra de controlo positivo seleccionada de entre o conjunto constituído peia região E'l de um genonta de HDV, correspondendo às posições 305- 116 1 ! (veja-se c Pedido Internac xonal de PCT WO 03/ 027291 ) , um f ra gmento da região R’l refe rida : incluindo 0 f ragmen to de amp li f ica< :ão (posições 632-9 04) θ c geiioma toc io de um HDV / assumi .ncio ^__O- Π d J— ± Cd posi tivo re: feri do, de |prp £ ΘΙΓ incia, - f cd i. orma de um plasm ídeo.

- Q

De acordo com. outra concretização vantajosa do método referido, o passo de detecção referido inclui a título de amostra de controlo, uma amostra de controlo positivo tal como se definiu acima e um controlo negativo (amostra de soro, negativa quanto a HDV, por exemplo) .

As posições dos diferentes iniciadores e da sequência (SEQ ID N° s: 1- 4) no genoma do HDV estão ilustradas na Figura 1, β s posições no genoma do HDV sendo indicadas no genoma circular na orientação genómíca, de acordo com o sistema de numeração do genoma do HDV de Wang et al. 3.

Seleccionam-se as posições dos iniciadores de modo a se obterem produtos de amplificação ccm cerca de 215-221 pares de bases (bp). Seleccionam-se as posições dos iniciadores de modo a se obter uma hibridização específica: com ausência de hibridização cruzada, com uma Ta (Temperatura de hibridização) de cerca de 60°C e com elevado conteúdo em GC; para além disto, conceberam-se os iniciadores referidos de modo a se obter uma eficácia elevada na estrutura secundária conservada no ríbozíma.

De forma vantajosa, a sonda fluorogénica referida é marcada em pelo menos uma das suas extremidades com um corante fluorescente. De preferência, marca-se a extremidade 5' com um corante fluorescente relator e marca-se a extremidade 3' com um corante de exterminação. - 10 -

Para além diste, uma das extremidades referidas, e de preferência a extremidade 3' da referida sonda, também é marcada com um grupo MGB (Lígante de Nervura Menor), que faz aumentar artífíeíalmente a temperatura de nibridização da sonda, e portanto torna possível utilizar sondas de menor comprimento. São conhecidos na técnica corantes relatores fluorescentes úteis; eles são seleccíonados, por exemplo, de entre os seguintes: 6-FAM (β-carboxifluoresceína), TET (tetracloro-6-carboxifluoresceína) , HEX (hexacloro-6-carboxi-fluoresceína), isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, cíanína (CY3, CY5) e vermelho do Texas 42

Também são conhecidos na técnica corante exterminadores úteis; eles são seleccí.onados por exemplo de entre os seguintes: vermelho de mecilo ou TAMRA (6-carboxitetrametil-rodamína) 4~, ou corantes escuros.

Uma sonda preferida de acordo com a invenção presente é a seguinte: 5'-FAM-ATGCCCAGGTCGGAC-MGB-3' (~ 5'-FAM-SEQ ID N°:4-MGB-3' ) . 0 teste de PCR à TA em tempo real da invenção é sufi .cientemente sensível para q e t β c ;;tar 130 C 0 pias de ARN ue HDV por mL de soro, q; ualqu er q ue se j a 0 tipo de HDV test ado, e foi utilizado pB rd quan ti f: Lear as cargas virais sequenciais obtidos de pacientes com hepatite em soros 11 delta crónica e previamente tratados com IFN. Os resultados obtidos mostram que a eficiência do tratamento pode ser monitorizada com muito ma is precisão utilizando uma via quantitativa combinada com os iniciadores e a sonda específicos em apreço. Assim, o método em apreço constitui uma melhoria para a gestão de pacientes com infecções crónicas, e deveria ajudar a definir as linhas mesuras para o tratamento padrão. 0 método de PCR à TA em tempo real em apreço é capaz de substituir o teste qualitativo no procedimento de diagnóstico de rotina. Isto foi tornado possível por causa da sensibilidade do método, e por causa da sua capacidade potencial para detectar o ARN de HDV de rodos os tipos conhecidos, evitando resultados negativos falsos. No que toca às sequências de HDV-3, e existência de uma desadaptação com um dos iniciadores levou a que se utilizasse um iniciador específico para o sentido directo para quando se suspeitar de uma infecção com HDV-3 (levando em conta os dados clínicos, a origem geográfica do paciente, e a ausência de detecçâo de ARN de HDV apesar da presença de IgM específico anti-HDV). Podem utilízar-se ambos os pares de iniciadores. A possibilidade de se detectar ARN de HDV no soro ou no plasma é uma melhoria para o seguimento do paciente, em comparação com a detecçâo de IgM, que é específico mas não é sufícientemente sensível A Quando se leva a cabo uma PCR qualitativa à TA, a intensidade do sinal observado

cc m coi 1 tj y p sta Ç α 0 dos pro H \ vt~ rp o wU. OO amplificaç ão por -0 remeto de r i ; iio (e ev entualrnente a Q Tf: p. mchas a S' Li _L , S\J So u t nem kl ot) c jue S Θ ine seguirá) 1 p C ti ! 0 Q d. r uma indic L d Ç d O C ro s s e ^ r a da car ga vir R í — f ma s ma ntém- S 0 ímorecíso e nao u ermite di scrímina: r er itre cargas virai S qu ando estas excede m 50.000 có P 1 d S por mL de plasma. i Jm outro aspe cto que é objectc j da r n v 0 π ç ã o pr esent e é ta mbém um estojo para detecção, carac te IlZâGO por conter para além dos tampões e dos reagentes indispensáveis para se extrair o ARN áe KDV de uma amostra biológica, para sintetizar o correspondente cADN e para amplificar o cADN referido, pelo menos dois pares de iniciadores tal como se definiram acima neste documento,

De acordo com uma concretização vantajosa do estojo referido, ele contém também ainda: - uma sonda fluorogénica, tal como se definiu acima neste documento, uma amostra para controlo positivo, seleccionada de entre o conjunto constituído pela região R'1 de um genoma de HDV, correspondendo às posições 305-1161, um fragmento da referida região R'l que inclua c produto de amplificação R'l (posições 692-904) e a totalidade dc genoma de HDV, e - 13 - um controlo negativo, tal como um soro negativo quanto ao HDV.

De acordo com uma concretização vantajosa do estejo referido, a sonda fluorogénica referida está marcada na sua extremidade 5' com um corante fluorescente relator, e na sua extremidade 3' com um corante exterminatíor, de preferência um corante escuro, e com um grupo MGB.

Outra matéria que é objecto da invenção presente é também pares de iniciadores capazes de amplificar qualquer genoma de HDV, sendo os pares de iniciadores referidos seleccionados de entre o conjunto constituído pelo par de iniciadores com a SEQ ID N°: 1 e com a SEQ ID N°:2 e pelo par de iniciadores com a SEQ ID N°:3 e com a SEQ ID N°:2.

Outra matéria que é objecto da invenção presente é também uma sonda específica para o fragmento de ácidc nucleico amplificado pelos pares de iniciadores mencionados acima neste documento, sendo a sonda referida definida pela SEQ ID N°:4.

Para além das configurações que se definiram acima, a invenção também inclui OU blâS C Ο Γ1 f Í Q U Γ â Ç Ο Θ 3 C u Θ emergirão da descr .i cão que se sf sgue, e que se referem a dois exer iplos de i mo .ementacão da invenção presente e também aos desenhes apensos, nos quais: A Figura 1 é uma represe ntação esquem á.ica do enoi ria do HDV. 0 genoma do q ny ç , ima mel écula de RN de cadeia singela, ci ocular, c om c :erca oe 680 PUCi DOS F. -SP ícament e repr C; ,“-i vç 4~ a ao orno uma molécula em forrr a de t eastão com uma pseudo dupla cadeia, devido a um emparelhamento de bases intramolecular extensivo. A região que codifica para o antígénio delta (na cadeia antigenómica) έ representada sob a forma de um rectângulo branco, com c local de edição na posição 1012 (de acordo com Wang et ai. 3) . Os ribozimas estão localizados no nucleótido 900/901 (ribozima antí genoma) e no 685/686 (ribozíma genoma). A região RO (900-1280), amplificada no teste qualitativo de PCR à TA, e a P.l (305-1161), que foi clonada em pCRII e foi utilizada como padrão para quantificação no teste de PCR à TA em tempo real, estão representadas sob a forma de linhas a cinzento. Os iniciadores de sentido directo (Delta-F) e de sentido reverso (Delta-R), e a sonda (Delta-P) estão representados por set as de corpo branco.

representa iniciadores e sonda regiões do ribozíma dc genoma de com Perrotta et al. u) A: Ribozíma do genoma: a sequência tíc iniciador de sentido directo está sublinhada a cinzento escuro. B: Ribozima iniciador de a cinzento anti genoma: a sequência do sentido reverso está sublinhada escuro, a sonda em cinzento claro. - A Figura 3 representa sensibilidades comparadas dos testes por PCR à TZ, qualitativo e quantitativo. Exemplo de amostra n°40. As diluições no ponto final (10 μΐ.) do cADN (amostra n°40) foram testadas tanto pelo teste qualitativo como pelo teste quantitativo. Com o teste qualitativo, a última diluição visível após a contrastação com brometo de etídío de um gel de agarose a 1,5%, foi de 1/1.000. Com o teste de PCR quantitativa à TA em tempo real, 1 cópia foi detectada em 10 μΐ de cADN diluído a 1/5.000. A Figura 4 ilustra, uma gama de cargas virais obtida de um painel de diversos ciados de HDV; testaram-se vinte e três amostras de HDV-1. A carga virai mediana foi de 1.950 cópias/10 μΐ de cADN (compreendidas na gama de entre 2 e 986.000 cópias/10 μη de cADN). Testaram- se dezasseis HDV não 1 (HD^ 7 O -L·, n=l, HDv- 5, n-6, Hí W-6, n=4, HDV-7, n=5). A car ga virai mediana era de 1.300 cópias/10 μΐ de cADN (compreend idas na gama de entre 2 e 1.000.000 de cópias/10 μΐ de cADN). Não 16 se detectou nenhuma diferença significativa entre a canga de KDv-l e de HDv-nâc-i (teste não paramétrico U de Mann Whitney;. A Figura 5 ilustra uma quantificação do ARN de HDV em pacientes cronicamente infectados: A: Pacientes que exibem um perfil de

"rcspondedores": os pacientes A e B responderam ao tratamento com IFN anulando a sua carga virai. Os pacientes C e D mantiveram cargas detectáveis no final do tratamento, mas a carga virai demonstrou uma diminuição superior a 5 log:0 cópias/mL de plasma. B: Pacientes que exibem um perfil "não respondedor": o decréscimo da carga virai não excedeu 2 logiC cópías/mL durante o decurso do tratamento. No caso dos pacientes E, F, H e I, a carga virai inicial era superior a 6 logio cópias/nL. C: Paciente J: Um super infecção com HDV num paciente infectado com HBV-HIV. Paciente K: transplante de fígado após 2 tratamentos falhados.

Exemplo 1: MATERIAL E MÉTODOS 1 Ί _

Pacientes e amostras

Utílízaram-se oitenta e quarto amostras de sangue a validação técnica do teste (Tabela 1).

Tabela 1: Amostras utilizadas para a validação técnica do

Número da Características amos' td Amostras 1 a 5 positiva a HbsAg negativas 8 a 11 positiva a ARN de HCV anti HDV 12 a 15 positiva a IgG anti HAV 16 a 20 positiva a ARN de HIV 21 positiva a ARN de HEV negativa para marcadores de 22 a 26 hepatite virai Amostras 2 / câ 33 reprodutibilidade intra-teste positivas 34 a 37 reprodutibiiidade inter-testes anti. HDV 38 a 40 sensibilidade do teste 41a ít HDV-1 64 HDV-2 β b a 70 HDV-5 71 a 74 HDV-6 ?5 p 7 g HDV-7 80 a 84 HDV-3 a Anti HDV, HbsAg, M <N de H CV, IgA entii HAVr ARN de HíV 6 ARN d Θ Η E V 18

As amostras 1 a 26, cujos soros eram negativos face ao HDV, foram testadas para se avaliar a especificidade do teste. Entre estas amostras, 5 deram resultados positivos para o Antiqénío HBs e para o ADN de HBV, e 16 deram resultados negativos no despiste dos Antigéníos de HBs , mas deram resultados positivos quer para o ARN do vírus C da hepatite (HCV) (n=6) , ou para o IgM contra o vírus A da hepatite (HAV) (n=4), ou para o ARN do vírus da imunodeficíência humana (HIV) (carga virai > 10.000 cópias/mL, n=5) , para o ARN do vírus E da hepatite (n=l). As cinco restantes eram negativas para o ARN do HCV, para o IgM do HAV e para o ARN do HIV. As amostras 41 a 79, correspondendo a HDV-1 (n=23), a HDV-2 (n=l), a HDV-5 (n-6), a HDV-6 (n=4), e a HDV-7 (n=5) (de acordo com Radjef et al. z) foram testadas tanto por um teste qualitativo de PCR à TA, como pelo teste de PCR quantitativo à TA em tempo real, para avaliar a capacidade do teste de PCR quantitativo á TA em tempo real para detectar e quantificar o genoma para qualquer tipo de HDV. As amostras de HDV-3 (80 a 84) estavam disponíveis por que eram provenientes de uma colecção de restos de espécimes abandonados de papel de filtro com pingos de sangue, que haviam sido obtidos picando dedos na região da Amazónia, em populações locais infectadas. Os papéis de filtro foram secos ao ar e armazenados à temperatura ambiente até serem utilizados. Para o teste, cortaram-se discos de 7 mm de diâmetro com um punção, no centre de cada mancha de sangue, e colocaram-se em 500 μΕ de uma solução de NaCi a 9% a -20°C. Extraiu-se o ARN dos eluatos com 250 pL, utilizando o QIAamp MínElute Vírus Vacuum (QiAGEN), de acordo com as instruções do fabricante.

Utilizou-se ARN de fígado de marmota-5 total infectado com HDV (infectado com protótipo de HDV-1 j0) como controlo externo para o PCR quantitativo à TA em tempo real ~ .

Onze pacientes, designados A a K, (76 amostras) aos quais era administrado IRN (ou a sua forma derivada com polietilenogiicol: PEG-IFN) para uma infecção crónica com HDV, e dos quais haviam sido mantidas amostras plasmáticas sequenciais congeladas a -80°C, foram seleccionados para uma quantificação retrospectiva do ARN de HDV. Estas amostras tinham anteriormente sido testadas com uma determinação qualitativa concebida para amplificar a região RO do genoma de HDV, tal como definida no Pedido Internacional de PCT WO 03/0227291 (nucleótidos 889 a 1289) (Figura 1) “ . A idade, o género, o tipo de HDV e o estado destes pacientes face ao HIV estão apresentados na Tabela 2. 20 -

Tabela 2: Características clinicas dos pacientes seleccíonados para uma quantificação sequencial retrospectiva, em amostras de sangue, do ARN de HDV. Género idade ciado de Estado CD T5 o ÍS HDV t cl C Θ d O amostras HIV testadas Paciente A M 54 Ia NEGC 7 Paciente B M 4 (j lb NEG 4 Paciente C F 45 Ia NEG 8 Paciente D M 37 Ί a NEG 6 Paciente E M 52 Ia NEG 4 Paciente F M 44 lb NEG 11 Paciente G M 42 r NEG 4 Paciente H M 37 lb POSc 9 Paciente I M 43 lb POS 4 Paciente J M 54 ί b 1 POS 10 Paciente K M 40 5b POS 9 a Genótípo ta 1 como determinado com RFLP b Genótípo ta 1 como determinado após sequenciação da região RO c NEG: sor 0 ± ogia negativa qua nto ao H IV, POS: soroloqía positiva qu .anto ao H .1V yuau tificação p Λν, D0 -3 em tempo real de amostras de soro μΐ de soro ou de ARN de HDV de 21 21 r ·—~ C* ^Γ· l 1 o /""Λ xabJid Ubduí w 'GEN) . Levou-s? sistema QIAamp MmElute Vírus Vacuum a cabo a síntese de cADN com 5 L do produco de extracção, em 25 L de mistura contendo 0,5 irimol/L de GeneAmp tíNTPs (Applied Biosyst.ems) , 0,4 pmol/L de

Randcm Hexames (Promega), 100 (Applied Biosystems), ;μ de Superscript 1 TU/pL de RNasm A RMase H Reverse ranscriptase nví ti IX Tampão rirst-Strand (Invitrogen), e 10 mmol/pL de DTT (Invitrogen) , Levou-se a cabo a reacção durante 45 minutos a 42°C.Purificou-se o cADN usando Dispositivos de Filtros Centrífugos Para Montagens de PCR (Millipore). O cADN é purificado em colunas Mícrocon 50.

Conceberam-se os iniciadores e a senda utilizando a versão 2.0 do Programa Prímer Express (Applied Biosystems) com pequenas modificações para levar em conta a seieccionado na região do ribozíma do genoma, e o iniciador reverso na região I do ribozíma anti genoma. A sonda, que foi definida na mesma região que o iniciador reverso, foi concebida para hibridizar na sequência anti genómica, para evitar o seu emparelhamento com o iniciador reverso (Figura 2). Os nomes e as sequências dos iniciadores e da sonda foram: Delta-F ( iniciador directo) : 5’-GCATGGTCCCAGCCTCC-3’ , 1qQO Γ :onaa) CGGGTCGGCATGG-3’ (SEQ ID N°:2), D? ÍSEO ID N0:4' q^qmeqçragGTCGGAC-KGB- - 22

Por caos a da existência da desadaptação em .L S· CL Ci Mv d O 5 0- Oí kX L-* i 1 L-' ~i- as do genoma do tipo 111, foi concebido directamente um segundo iniciador d í r e c t o para a amplificação dos isolados de HDV-3: T3-Delta-F: 5'- GCATGGCCCCAGC CTCC-3 ’ (SEQ ID N°:3).

Levaram-se a cabo as reacções de PCR à TA em tempo real utilizando a Mistura de Base Universal TaqMan Para PCR (Applied Biosystems). Adícíonou-se cADN purificado (10 pL) a uma mistura de 40 pL para PCR, que continha 25 pL de Mistura de Base Universal TaqMan Para PCR, 0,3 mmol/L de cada um dos iniciadores e 0,2 mmol/L de sonda fluorogénica. A mistura reaccional era constituída por um passo de iniciação de 2 minutos a 50°C, seguindo-se 10 minutos a 95°C, e 45 ciclos de amplificação que incluíam 15 segundos a 95°C e 1 minuto a 60°C. Levaram-se a cabo a reacção, a aquisição de dados e a análise utilizando o Sistema de Detecção de Sequências ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). Deduziu-se o número de cópias do alvo na mistura reaccional a partir dos valores do ciclo limiar (CT) que correspondem ao número fraccional do ciclo no qual a fluorescência libertada excedeu 20 vezes o desvio padrão da emissão correspond ente à média da unha c íe base. { 3 p 1 âSiuiceo [ pC RII- -dFr 4 5 -RI A con ter ao uma cópia d d região R’l do ger .oma de HDV Lcíl COIÍIO S 6 d Θ S 1Γ1.. lu ric Ped ido Int ernacíonal p, WO 0 3/027291 í OS nuclec b b*- w CD 305 d í 1 O 1 f 0r0r0y| cia de Wang et al, J) í H igara 1 / Ldi nti lizadc como padrão par ci ci quant ifícação 3o cADN do HDV. 23

Depois de uma digestão do plasmídeo com KooRI (Bi olabs} , purificou-se a região R' 1 a partir de ura gel de agarose utilizando QIAEX II (Qiagen). Determinou-se a concentração do ADN do R' 1 purificado cora um espectrcfotómetro muitícanal, e calculou-se o número de cópias que lhe correspondia . 1,3 PCR qualitativa à TA para a detecção de ARN de HDV em amostras de soro. A extracção de ARN e a síntese do cADN fo ram levadas a cabo tal como se descreveu par a o te ste quantitativo Amplificou-se a região RO do genoma / de acordo com a referida no Pedido Internacional de PCT WG 03/027291 (nucleótidos 889 a 1289), tal como se descreveu no referido Pedido Internacional de PCT, recorrendo aos iniciadores 900s e 1280as, tal como já referido '5,í (Figura 1). Detectaram-se os materiais de amplificação após uma electroforese sobre um gel de agarose a 1,5%, contrastado com brometo de etídio. A determinação do tipo de HDV foi levada a cabo sobre a região RO amplificada, utilizando quer um processo de RFLP em dois passos tal como descrito no WO 03/027291, quer uma análise fílogenética da sequência tal como jά se descreveu

Análise estatística 24 - U t X lizou-se o f- 0 g 0 H não paramétrico de Man Whitnev (Stac Víew 4.02) p<3 Γ â âS comparações estatísticas As diferenças f Ο Σ 3. TP c Ο Ί 5 sideradas significativas a P<0.0S.

Exemplo 2: Especificidade, sensibilidade, e reprodutibilidade do teste de PCR à TA em tempo real, para a detecção e para a quantificação do ARN de HDV no soro. A especificidade do teste foi avaliada pelos resultados negativos obtidos com um painel de 26 amostras de soro de controlo, após 45 ciclos de amplificação (resultados não ilustrados). 0 fragmento R'1 de HDV foi utilizado como padrão para quantificar o ARN de HDV. Testaram-se em triplicado diluições a 1/10 em série, de entre 10 e 10' cópias, registando os valores médios de CT graficamente em função do número de cópias, para se construir a curva padrão. O coeficiente de correlação era repetidamente superior a 0, 997 e o coeficiente a ngular era de .... Q A eficiência de amplific ação , calculada coroo [ 10i~1/( coeficiente anaular) η q — X j X 10 0, era de 93%. A dílu ição que corre spond Í â a uma e n t r aoa de 10 c ópia 3 por reacç ão foi ronpf i i v__jw"\___i_ lamente detectada c on um 0 C; 0 pó sibi lidade de 1001 ( resulta ioc r _Á V> ij 2 ião ilustrado 3 } . De sta fo rma, ci θ acordo com os f a c t o r e s de 0 1 uiçdo dura m 0 0 a extracção de ARN e durante os p: “OC6 d 1 mentos à TA, a C 0 nsibil idad a do t r s x θ para <, if íca çâo de amo st ras r. ' ΘΓ3 de cerca de 1.000 cópias/ inL da sequência al to. As amo st x a s relativamen te 's o: uais o teste de PCR à TA em 25 tempo real detectava entre 1 e 1.000 cópias/mL de plasma, foram consideradas positivas para c ARN de HDV, embora abaixo do limite de quantificação. A reprodutifcilicade intra teste foi avaliada por dois caminhos diversos. No primeiro, testaram-se 8 répiicas das diluições padrão a 1/20, entre 10 e 107 cópias por mistura reaccíonal testada na mesma experiência. TOS coeíicientes de variação (CV) dos CT encontravam-se na gama de entre 0,4% e 2,6% e estão listados na Tabela 3. TABELA 3: Reprodutibilidade intra teste para a amplificação do padrão plasmidico

Equivalente ao genoina presente plasmidico em padrão 10 100 1.000 104 105 106 io7

Valores médios de CV 38,74 32,75 29, 66 26,04 22,57 19,21 16, 92 CV % 2,6 1,6 1,4 0,5 0,7 0,4 0, 6

Em segundo lugar, 3 replicados de 7 amostras de soro (ccrn os números 27 a 33 Tabela 1), forma independentemente submetidas a uma extracção do ARN, a uma síntese do cADN e a uma PCR em tempo real numa mesma experiência. A carga média varal encontrava-se na gama de entre 70 e 21.oOO cópias e o seu CV na gama oe entre 1,8% e 25% (Tabela 4). - 26 - TABELA 4: Keprodutibílidade intra teste para amost: soro extraídas independentemente Número da amostra 27 28 29 30 31 32 33 Número médio de cópias (/10 μ-L) 21.300 4.700 3.200 2.100 750 130 70 ^ V '6 2,7 7,4 1,8 7,2 7,7 25 7,1

Para avaliar a variabilidade entre testes, extraiu-se ARN de 4 amostras de soro (com os números 34 a 37), 3 vezes, sendo a extracção levada a cabo por 3 operadores diferentes, em 3 dias diferentes. A carga virai média das amostras variava entre 17 e 2,200 cópias, e o CV variava entre 3,3% e 25,4% (Tabela 5). TABELA 5: Reprodutíbilidade entre testes Número da amostra 34 35 36 37 Número médio de cópias (/10 μρ) 2.200 1.300 880 17 CV % 25,4 24,1 3,3 17,3 A determinação por PCR em tempo real e a determinação qualitativa foram compa radas em termos de sensíbi1 idade . Três cAL)N Obtido s de 3 amost ras diferentes de soro (numerados 38 a 4 0) foram diluídas para se d θ t θ xm i n â x o v e. l ο x no ρ ο π χ. o í i r* ã χ ρ 3. x 3 c 3. cl 5 t θ s x θ Diluíram-se ccmo se segue os cADN purificados: a 1/2, 1/5, 27 1/10, 1/25, 1 / c η η / Ί π r> i / 7 ii n i / 0 0 f i / 1 u sj t i / Z, f 1/500, 1/1.000, 1/5.000 e 1/10.000, e testou-se cada dilui ção em paralelo tanto pe la determinação qualitativa como pela quantitativa. Com determinação qualitativa, a últi ma diluição visível após a contrastação do gel de agarose corn brometo de etídio foi a diluição a 1/100 para a amostra 38, e a diluição a 1/1.000 para as amostras 39 e 40. Com o teste de FCR em tempo real, as diluições no ponto final foram de, respectívamente, de 1/500, 1/1.000, e 1/5.000, para as amostras 38, 39 e 40, indicando que o teste quantitativo era pelo menos tão sensível como o teste qualitativo (Figura 3) .

Exemplo 3: Quantificação do ARN de HDV em amostras de sangue A capacidade do teste para quantificar o ARN de HDV de diferentes ciados foi verificada pela cetecção ARN de HDV em 44 amostras de soro com os números 41 a 8 4 (Figura 4) . Não se notou nenhuma diferença significativa entre a gama de cargas virais obtida com vírus HDV-i e com vírus do outros tipos, indicando que o teste se encontrava adaptado a detectar e a quantificar qualquer HDV. Vinte e três amostras de HDV-1, numeradas de 41 a 63, foram testadas sendo o número mediano de cópias de 1.950, e apresentando pipo nf v*' c*. to V-' v >pías na gama de entre 2 e 986.000 /10 μ! de cADN. Testara ΓΠ“ S 0 também amostras de soro contendo HDV-2 (n=l) , HDV-5 ( H = 6) , HDV-6 (n=4), e HD V-7 (n-5), em que a carga média víral era de 1.300, compreendida na gama de 2 a 1.000.000 de cópias/10 μΐ de cADN. Estas amostras 28 foram testadas pelo tes te qualitativo, e a intensidade das bandas contras tada com brometo de etidio parecia idêntica para todas as amostras com cargas virais de 500 cópias/10 μΐ de cADN (resultados Π30 ilustrados}.

Avaliou-se a capacidade do teste para detectar ARN de HDV-3 utilizando as amostras 8 0 a 8 4, que haviam sido obtidas pela eluição das manchas de sangue seco, e obtiveram-se resultados positivos para ARN de HDV pelo teste qualitativo (embora apenas se visse um sinal leve no gel de agarose contrastado com brometo de etidio, para as amostras 82 a 84 - Tabela 6). TABELA 6: Resultados de PCR à TA para HDV-3 PCR Valores de CT de PCR à TA em qualítat iva a tempo real TAa Usando o Usando 0 iniciador iniciador T3- Delta-F Delta- 1? L· Amostra 80 ++ 44,55 35,38 Amostra 81 + 39,54 32,84 Amostra 82 ± >4 Sb 41,28 Amostra 83 ± >45 36,56 Amostra 84 ± >4 5 >45b 3 Apreciação visual da intens :idade do sinal 3ET: ±, banda tenuainente visível; +, banda com pequena irr lensidade, . ++, banda com intensidade média b valores de CT (> 45 indica um resultado negatí vo) 29

Considerando a natureza destas amostras, os resultados quantitativos obtidos com as determinações por PCE à TA em tempo real não foram levados em conta. Detectou-se o ARN de HDV nas amostras 80 e 81 utilizando como iniciador dírecto quer o Delta-F (SEQ ID N°:l), quer o T3-Delta-F (SEQ ID N°: 3) . Para as amostras 82 e 83, só se deteccou o ARN de HDV com o iniciador T3~Delta-F (SEQ ID N°:3), e a amostra 84 permaneceu negativa sob ambas as

condições (Tabela 6). No entanto, pode espcrar-se que o ARN virai obtido directamente de amostras de plasma poderia ter dado melhores resultados.

Exemplo 4: Quantificação de ARN de HDV em pacientes cronicamente infectados A deterrrd nação por PCR à TA em tempo real foi avaliada em termos de meio de seguir a evolução da carga virai de HDV nc plasma de pacientes infectados a quem estava a ser administrado IFN para hepatite delta crónica. Onze pacientes, dos quais haviam sido testadas amostras em série, no laboratório, com o teste de PCR qualitativo à TA, díspondo-se dos respectívos resultados, foram levados em consideração para este trabalho de continuação. As cangas virais, expressas soba forma de logio do número de cópias per inL de plasma, estão ilustradas na Figura 5.

Os pacientes foram considerados em três grupos distintos. No primeiro grupo (Figura 5A) , a evolução das 30 ca r gs s virais mcíi cava uma resposta positiva a rerapia I t com uma diminuíça c de pelo menos 5 logi< i/inL duran Q 0 € ur so do tr atamentc. Para OS pclC i Θí!'L Θ S A Θ B, verifí se que o ARN de HDV já não era detectável com nenhum dos testes qualitativo ou quantitativo, no final do tratamento. O paciente C, que tinha recebido PEG-IFN entre Dezembro de 2002 e Dezembro de 2003, apresentava uma carqa virai que tinha sofrido uma diminuição notável, mas ainda era detectável 2 meses depois do fim do tratamento, e o paciente C, que não tinha respondido a uma terapia com IFN anterior, respondeu ao PEG-IFN (diminuindo a sua carga virai em 5 logio cópias por mL). Nestes dois casos o ARN de HDV permaneceu indetectável no teste qualitativo, sem nenhuma indicação de nenhuma resposta vírológíca.

No segundo grupo de pacientes, (Figura 5B) a diminuição da carga virai utilizando a terapia com PEG-TFN não excedeu as 2,5 logio cópias/mL. Os pacientes E, F, H e I, apresentavam cargas virais maiores do que 6,5 logi0 cópias/mL no início da terapia, e os pacientes Hei estavam co-infectados com HIV (Tabela 2). WÓ LCÍOUD UU5 individualmente interpretados que tinha uma infecção crónica Quâiilc a marcadores oe HDV até Γ11Θ s J e K têm que ser i -r - \ £ -i y u L o. 5C) . ( D pac > i p p f 0 O com HBV, tinha S íde PíPQPÍ· *j \7 Ç) que havia ocorrido 1 ima super j ηίαρη^ρ de 2000 e Setembro de 2001. Em Dez em; iro cetectava nenhum ARN virai, o que suger j_ d j_

No espontânea do vírus. No entanto, em Outubro de 2002, a carga virai tinha voltado a 5,5 log-i0 cópias/mL. Iniciou-se então um tratamento com PEG-IFN em Fevereiro de 2003, levando a uma diminuição rápida da carga virai, a qual tem permanecido indetectável desde essa aloura, tanto para o tesoe qualitativo como para o quantitativo. O paciente K, que tinha recebido com sucesso o IFN habitual em 1999, desenvolveu um carcinoma hepático em 2301, enquanto estava a ser tratado. Este paciente levou um transplante de fígado em Maio de 2002, e desde essa altura a sua carga virai tem permanecido indetectável.

Os onze pacientes com infecção crónica por HDV, e para os quais estavam disponíveis amostras sequenciais de plasma, foram avaliadas em termos de carga virai de HDV. Distinguiram-se duas modalidades de resposta virológica ao IFN. No primeiro grupo, observou-se uma diminuição significativa da carga virai (pelo menos 5 Iogio/mL) durante o decurso do tratamento, permitindo classificar cs pacientes A e B como "respondedores", relativamente à terapia durante um ano com PEG-IFN. Para o paciente C, o PCR à TA qualitativo levado a cabo no laboratório durante o decurso do tratamento, tinha permanecido constantemente positivo, não fornecendo nenhuma indicação de uma resposta v:r ológi ca posí tiva. No entanto, q- j d lido οθ COÍ. 5 iClBidlc m os res ultad os da PCR quantitatíva, o paciente respc ndia obv iamen t- p ao t Γ 5 u amento (com ama diminuição de 5,5 log X 3 / IIIL j Te rim LflOU-S e o tratamento ao fim de um ano, ma s eie teri ã prcvavelne rte sido pross eguido se os r esuit ados 3 2 quant1 tativcs houvessem estaco disponíveis. No caso do paciente D, observou-se uma diminuição significativa da CârQa do ΐ VRN d C ; HDV durante o dec; urso da tera; pia c cm PEG- IFN, emhor a o p laciente tivesse per mane eido res is ter- t 8 3 UIT, trata mento an ríor com a dura ÇâC de i im ano c·. om if: N. Isto poder 13 1Π dic. ar que existia um; a me lhor eficáci 3 ΓΐΟ PEG -IFN para o tratamen to da nepacite delt. a cr óníca, e que c t este quant itat i. vc de PCR â TA se r" Λ ú t i 1 pa r a a valia este aspec to. Os pacientes Ξ a T permane ceram "não respe ndedo Y' (Cs p !f ao PEG-IFN, m d ΐ C 3 .ndo que exi -Stem ou tros factores que pedem interferir com o sucesso do tratamento. Per exemplo, a carga virai inicial era globalmente superior no grupo dos não respondedores (P=0,C5), e isto poderia indicar que a carga virai de linha de base poderia ser utilizada para prever a eficácia do tratamento, e poderia ser levada em conta na gestão do tratamento, em termos da sua dose e da sua duração.

BIBLIOGRAFIA

Delta Virai Wílkín 1. Gerrn JL, Casey JL, Purcell RB. Kepatitis Vírus. Em: Hollinger FB, Purcell RH, Gerín JL, eds. hepatítis. Philadelphía: Lippincott Williams e s; 2002: 169-182. 2. P.adjef N, Gordien E, Ivaníushina V, Gault E,

Anais P, Drugan T, Trínchet JC, Roulot D, Tamby M, Milinkovitch MC, Deny P. Molecular Phyloqenecic Anaiyses Indíeate a Wíde and Ancient Radíation of Áfrican Hepatítis - 33 uexta Vírus, Dugges Img a Deltavirus Genus ot at Least

Seven Major Clades. J Virol. 2004; 78: 2537-2544. 3. wang KS, Choo QLf Keiner AJ, Ou jH, Najarian RC, Thaver RM, Mullenbach GT, Denniston KJ, Gerín JL, Houghton M. Scruccure, sequence and expression of the hepatitís delta (delta) virai genorne. Nature. 1986; 323: 508-514 . 4. Casey JL, Brown TL, Colan EJ, Wignall FS, Gerin JL. A genotype of hepatitis D vírus that occurs ín northern South America. Proc Natl Acad Sei U S A. 1993; 90: 9016-9020. 5. Imazeki F, Omata M, Ohto M. Complete nucleotide sequence of hepatitis delta virus RNA m Japan. Nucleic Acids Res. 1991; 19: 5439. 6. Shakil AO, Hadziyannis S, Hoofnagle JH, Di

Bisceglie AM, Gerin JL, Casey JL. Geographic distribution and genetic variability of hepatitis delta virus genotype T. Virology. 1997; 234: 160-167. 7. Wu JC, Chiang TY, Sheen IJ. Characterízation and phylogenetic analysís of a novel hepatitis D virus strai.n díscovered by restríction f ragment length polymorphism analysís. J Gen Virol. 1998; 79: 1105-1113.

8. Farei P. Delta hepatitis: an update. J 34 -

Hepatol. 2003; 39: 5212-S219. 9. Rizzetto M, verme G, Recchia S, Bor.ino F, Farei P, Arico S, Calzia R, Piccíotro A, Colombo M, Popper H. Chronic hepatitis in carríers of hepatitis B surfaoe antigen, witb íntrahepatíc expression of the delta antigen. An active and Progressive disease unresponsive to immunosuppressíve treatment. Ann Intern Med. 1983; 98: 437-441. 10. Fattovich G, Giustina G, Christensen E, Pantalena M, Zagni I, Realdi G, Schalm SW. Influence of hepatitis delta virus infection on morbidíty and mortality in compensated cirrhosís type B. The European Concerted Action on Virai Hepatitis (Eurohep). Gut. 2000; 46: 420-426. 11. Saracco G, Rosina F, Brunetto MR, Amoroso P, Caredda F, Farei P, Piantinc· P, Bonino F, Rizzetto M. Rapidly Progressive HBsAg-positive hepatitis in Itaiy. The role of hepatitis deita virus infection. J Hepatol. 1987; 5: 274-281. 12. Farei P, Mandas A, Coiana A, Lai ME, Desmet V, Van Eyken P, Gibo Y, Caruso L, Scaccabarozzi S, Criscaolo D, et al. Treatment of chronic hepatitis D with interferon alfa-2s. N Engl J Med. 1994; 330: 88-94. 13. Rosina F, Fintus C, Meschievitz C, Rizzetto 35 Μ. A randomized controlled trial of a 12-month course of recombinant humar; ínterferon-alpha in chronic delta (type D) hepatitis: a multicenter Italían study. Hepatology. 1991; 13: 1052-1056. 14. Farei P, Roskams T, Chessa L, Peddis G, Mazzolerii AP, Scioscia R, Serra G, Lai ME, Loy M, Caruso L, Desmet V, Purcell RH, Ralestríerí A. Long-term benefit cf ínterferon alpha therapy of chronic hepatitis D: regression of advanced hepatic. f íbrosis. Gastroenterology. 2004; 126: 1740-1749. 15. Lau DT, Doo E, Park Y, Rleiner DE, Schmid P, Kuhns MC, Hoofnagle JH. Lamivudine for chronic delta hepatitis. Hepatology. 1999; 30: 546-549. 16. Wolters LM, van Nunen AB, Hcnkoop P, Vossen AC, Niesters HG, Zondervan PE, de Man RA. Lamivudine-high dose ínterferon combination therapy for chronic hepatitis B patíents co-infected with the hepatitis D vírus. J Virai Hepat. 2000; 7: 428-434. 17. Berk L, de Man RA, Housset C, Bcrthelot P, Schalm SW. Alpha lymphoblastoid ínterferon and acyclcvir for chronic hepatitis delta. Prog Clín Bíol Res. 1991; 364: 411-420. C, Smedile 8. Garripoli A,

Ma tc

Fabiano A, Boníno F V, Oozzolongo R, Costa R i z z Θ11 o M,

Verme G, 36

Craxí A, et al. Ríbavírin treatment for chronic hepaii D: a pílot study. Liver. 1994; 14: 154-157.

Gurel S, Tillmann HL, Yalcin K, Iliman N, Faraciclcvír treatment . 2002; 37: 266-271. 19. Yurdaydín C, Bozkaya H, Aslan N, Okcu-Heper A, Erden E, Uzunalímoglu 0, Manns MP, Bozdayi AM. of chronic delta hepatitis. J Hepatol 20. Deny P, Lecot C, Jeantils V, Ovaguimian L, Krívítzky A, Brechot C. Polymerase chain reaction-based detection of hepatitis D virus genome in patients infected with human immunodeficiency virus. J Med Virol. 1993; 39: 214-218 . 21. Madejon A, Cotonat T, Bartolome J, Castillo I, Carreno V. Treatment cf chronic hepatitis D virus infection with low and high doses of interferon-alpha 2a: utility of polymerase chain reaction in monitoring antiviral response. Hepatology. 1994; 19: 1331-1336. 22. Goudeau A, Dubois F, Leturcq P. [Delta hepatitis], Presse Med, 1987; 16: 2117-2122. 23. Jardl R, Butí M, Cotrina M, Rodríguez F, Aliende H, Esteban R, G^ardia J. Determination of hepatitis delta virus RN A by polymerase chain reaction in acute and chronic delta infection. Hepatology. 1995; 21: 25-29. 24. Wu JC, Lee SD, Govíndarajan S, Kung TW, Tsai 37 YT, Lo KJ, Tmg LP. Correlation of serum delta RNA with clinicai course of acute hepatites delta vírus superinfection ín Taiwan: a. longitudinal study. j Infeco Dis. 1990; 161: 1116-1120. 25. Denv P, Fattovich G, Le Gal F, Gíustina G, Lecot C, Morsica G, Poinsot H, Alberti A, Brechot C. Polymerase-chain-reaction-based semi-quantification of hepatitis D viraemia in patients treated with high doses of alpha 2b interferon. Res Virol. 1991; 145: 287-295. 26. Gault E, Michel Y, Dehee A, Belabani C, Nicolas JC, Garbarg-Chenon A. Quantification of human cytomegaiovirus DNA by real-time PCR. J Clin Microbiol. 2001; 39: 772-775. 27. Gourlain K, Salmon D, Gault E, Leport C, Kallama C, Matheron S, Costagliola D, Mazeron MC, Fillet AM. Quantitation of cytomegaiovirus (CtMV) DNA by real-time PCR for occurrence of CMV disease in HlV-infected patients receiving highly active antiretroviral therapy, J Med Virol. 2003; 69: 401-407. 28. Takeuchi T, Katsume A, Tanaka T, Abe A, Inoue K, Tsukiyama-Kohara K, Kawaguchi R, Tanaka S, Kohara M. Real-time detection system for quantification of hepatitis C vi rus genome. Gastroenterology. 1 999; 116: 636-642. 29. Yamshiro T, Nagayama K, Enomoto N, Watanabe 38 H, Miyagi T, Naka sone H t Sakugawa H, Watanabe M. Quantification of the levei of h epatitis delta virus RNA in serum, by real-Lime polymer d S 6 chain reaction - and its possible orrelation with the clinicai stage of liver dísease. J Infect Dis . 2004; 189 : 1151-1157. 30 Po: nzettc i A, Cote PJ , Popper H, Hoyer R, London WT, Ford E, Ferruccio B, Purcell R, Geri n J. Transmission of the hepatitis B virus-asso ciated delta agent to the eastern woodchuck. Proo NaLl Acad Sei U S A. 1984; 81: 22C8-2212. 31. Deny P, Zignego AL, Rascalou N, Ponzetto A, Tíollaís P, Brechoc C. Nucleotide sequence analvsis of three different hepatitis delta viruses isolated from a woodchuck and humans. J Gen Virol. 1991; 72: 735-739. 32. Ivaniushina V, Radjef N, Alexeeva M, Gault E, Semenov S, Salhi M, Kiselev 0, Deny p. Hepatitis delta virus genotypes I and II cocirculate in an enderaic area of Yakutia, Rússia. J Gen Virol. 2001; 82: 2708-2718. 33. Manns MP, McHutchison JG, Gordon SC, Rustqi VK, Shiffman M, Reíndollar R, Goodman ZD, Koury K, Ling m Albrecht JK. Pegínterferon aifa~2b plus ribavirín compared with interferon alfa-2b plus ribavirín for initial treatment of chroníc hepatitis C: a randomised trial. Lancet. 2001; 358: 958-965. 34. Smedi1 p A, Ri zze4 :to M, Denniston R, Bon: no L r We lis F, Verme G, Cc Π s ol o F, Hr ;yer B, Parcel1 P H, Ger: n J T Tv pe D hepatítis: tne cl ímcal significar.ee of hepatí t" s c VI rus RNA in seruiri Ci c detect ed by a hybridí zatíon- D 3. S ed α S say . Hepatology. 1 9 8 6; 6: 12) 97 — 1302 . 35. Rasshofer R, Buti M, Esteban Rf Jardi R, Roggendorf M. Demonstraticn of hepatítis D vírus RNA in patients with chroníc hepatítis. 0 Infecc Dis. 1988; 157; qr 191-1 36. Bonino F, Heermann KH, Rizzetto M, Gerlích WH. Hepatítis delta vírus: protein composition of delta antigen and its hepatítis B virus-derived envelope. J Virol. 1986; 58: 945-950. 37. Kcs A, Díjkema R, Arnberg AC, var. der Meide PH, Scheliekens H. The hepatítis delta (delta) vírus possesses a circular RNA. Nacure. 1986; 323: 558-560. s8. Motíahl LE, uai MM, Hepat moiecu Sei. 2000; 37: 95-92. asis of laboratery diagnosís. delta ' rit Re1; :ne

39. Branch AI .udíes of a tertíary 1 o cí d. CJ θ Γ. L W Π 1_ C Π T U Γί C L ement. Nucleíe Acids F s κ o v d j A, S c h r e i o e j ructure rrom tne 's ín vítro as a . 1995; 23: 4391 human hepe - k ô

Q Q . Tm , n 1' r

4 0 Chao YC, Ghana MF, Gust I, Lai MI 4. Sequenc ion anci diveraence c jf heoatit.i s del ta vírus RNA 178: .rology 41. Perrotta AT, Been MD. A pseudoknot-like seructure requirec for effícient self-cleavage of hepatítís delta virus RNA. Nature. 1991; 350: 434-436. 42. Livak K et al., Guidelines for desígníng

TaqMan™ fluorogenic probes for 5' nuclease assays. 43. Poitras et al., Reviews in Biology and Bíotechnology, 2002, 2, 1-11. 44. Gibson UEM et al., Genome Research, 1996, 6, 995-1001.

Η. I Η. I ae

IAS

<110> Assistência pública - Hospitais de Paris <12G> Detecção quantitativa de HDV <130> F1020 CAS 24 EP <160> 4 <170> Patente na versão 3.1 <210> 1 < 211> 17 <212> ADN <213> Artificial <400 1 gcatggtccc agcctcc 17 <210> 2 <210 17 <212> ADN <213> Artificial <400> 2 tcttcgggtc ggcatgg 17

i <211> 17

<212> ADN <213> Artificial < 4 C Ο > 3 gcatggcccc sgcctcc 17 <210> 4 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial <400> 4 atgcccaggt cggac 17

Lisboa, 25 de Maio de 2007

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para detectar ARN de HDV numa amostra óçica, método que é caracterizado por incluir: (1) um passe de se extrair o ARN de HDV de uma amostra biológica e (2) Urn passe de se avaliar a quantidade do ARN de HDV referido por quantificação por PCR à TA em tempo real, incluindo: - amplificar-se o cADN que corresponde ao ARN HDV referido na presença de pelo menos um par de iniciadores seleccionados de entre o conjunto constituído pelos seguintes pares : fa) Delta-F (iniciador directo): 5'- GCATGGICCCAGCCTCC-3' (SEQ ID N°:l) e Delta-R (iniciador reverso): 5'- TCTICGGGTCGGCATGG-3' (SEQ ID N°:2) e (b) T3-Delta~F (iniciador directo): 5'-GCATGGCCCCAGCCTCC-3' (SEQ ID Nc:3) e Delta-R (iniciador reverso): 5'- IC7ICGGGIC6GCAIGG-3 ' (SEQ ID N°:2); e — Q Θ L Θ C L H J- ~ S Θ 3 OliSTlLldâde dos p Γ O Cl U O S de amplificação formados e comparar-se essa quantidade com pelo menos uma amostra de controlo.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a detecção ser levada a cabo na presença de uma sonda fluorcgénica [Delta-P (sonda)] definida pela seguinte sequência: 5'- ATGCCCAGGTCGGAC-3' (SEQ ID N°:4).
3. 3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o passo de detecção referido incluir como amostra de controlo, uma amostra de controlo positivo seleccionada de entre o conjunto constituído pela região R'l do genoma de um HDV, correspondendo às posições 305-1161 do genoma referido, um fragmento da região R'l referida que inclua as posições 692-904 do genoma referido, e o genoma completo de um HDV.
4. 4. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o passo de detecção referido incluir como amostra de controlo, uma amestra de controlo positive tal como se definiu na reivindicação 3, e um controlo negativo. ndícações 1 a 1, caracterizado por a S ΟΠΟ.d ogéníca referira r· v" yy\ ··' v -> /4 h t; „ liia Carla p~-lo 1X1Θ TI C S o ΓΗ. d. 03 S extremidades com ura corante fli ] o~i r~ n C r H f- P 4. >-/ -i_ kO '.-j' í * 1». ·
5. 6. Um estojo de detecçãc caracterizado por incluir para além dos tampões e dos reagentes necessários para exorair o ARN de HDV de uma amostra biológica, para sintetizar o cADN correspondente e amplificar o cADN referido, pelo menos dois pares de iniciadores tal como se definiram na reivindicação 1.
6. 7. Estojo de detenção de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por incluir também: uma sonda fluorogénica, tai como se definiu na reivindicação 2, - uma amostra de controlo positivo, tal como se definiu na reivindicação 3, e - um controlo negativo. Um estojo para dececção de acordo com a 7, caracterizado por a referida sonda reivmdicí fluorogénica ser m a r c a d a na sua extremidade 5' com uir corante relator, e na sua extremidade 3' com um corante extintcr e com nir grupo MGB • 9. Pa res de ir: mídoores Capazes ae amplifrcar qualquer genoma de HDV, sondo os referidos pares de pelo oar de iiciaaores com entre o conjunto cons i SEQ ID N0 :1 e com a N°:2 e ο par de iniciadores com a SEQ ID N°: 3 e com a SEQ τη kt O , O 1 u Π - Δ . para o fragmento de ácido de iniciadores tal como se sendo a sonda referida
7. 10, Sonda especifica nncleico amplificado por um par definiram na reivindicação 9, identificada pela SEQ ID N°':4. LÍ SDOâ r de Maio de 2007