JP2008508874A - リアルタイムrt−pcrによるhdvの定量的検出 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は、このような定量的アッセイにも関する。
TaqMan (登録商標)に基づくリアルタイムPCRは、広いダイナミックレンジ(10〜107コピー)にわたるDNA又はcDNAの定量を可能にし、よって、ウイルスゲノムの定量によく適合している。HDVの場合、チンパンジーでは非常に高いウイルス量が検出された(直接肝臓接種の後の感染の急性期の間)こと36、及び治療のフォローアップが非常に少量のRNAの検出の可能性を必要とすることを考慮して、このような広い範囲の定量が必要とされる。
さらに、血液試料中のHDV-RNA定量のための正確で感度の高い試験の開発は、2つの技術的問題を有する。第一に、配列の70%を超える分子内塩基対形成によるHDV-RNAの「桿状」構造3、37は、cDNA合成効率及びそれによりPCR効率を減ずる傾向にある。第二に、ウイルスの遺伝的変異性2、4〜7は、プライマー及びプローブの特定の設計を含む。実際に、HDVの型の間の多様性は、ゲノムのヌクレオチド配列全体の37%にわたるほど高いことが示されている2。
さらに、これは、HDV感染の自然な進展を理解し、慢性デルタ型肝炎の管理のためのガイドラインを規定する助けとなる。
(1) 生体試料からHDV-RNAを抽出する工程と、
(2)
- それに対応するcDNAを、以下のプライマー対:
(a) Delta-F (ダイレクトプライマー):5'-GCATGGTCCCAGCCTCC-3'(配列番号1)とDelta-R (リバースプライマー):5'-TCTTCGGGTCGGCATGG-3' (配列番号2)、及び
(b) T3-Delta-F (ダイレクトプライマー):5'-GCATGGCCCCAGCCTCC-3' (配列番号3)とDelta-R (リバースプライマー):5'-TCTTCGGGTCGGCATGG-3' (配列番号2)
からなる群より選択される少なくとも1つのプライマー対の存在下で増幅し(III型ゲノムの配列と1つのミスマッチが存在するので、第二のダイレクトプライマーは、HDV-3単離体の増幅のために特異的に設計された:T3-Delta-F:5'-GCATGGCCCCAGCCTCC-3' (配列番号3);よって、上記の2対のプライマーは、同時に用いることが有利である);そして
- 形成されたアンプリコンの量を検出し、該量を少なくともコントロール試料と比較する
ことを含む、リアルタイムRT-PCR定量化により該HDV-RNAの量を測定する工程と
を含むことを特徴とする。
さらに、上記のプローブの上記の末端の一方、好ましくは3'末端は、MGB (副溝バインダー(Minor Groove Binder))基でも標識され、これはプローブのハイブリダイゼーション温度を人為的に上昇させ、よって長さが減少されたプローブの使用を可能にする。
有用な消光色素も当該技術において公知である。これらは、例えば以下のものから選択される:メチルレッド又はTAMRA (6-カルボキシテトラメチルローダミン) 42又はダーククエンチャー。
5'-FAM-ATGCCCAGGTCGGAC-MGB-3' (= 5'-FAM-配列番号4-MGB-3')。
- 上記で規定する蛍光発生プローブと、
- 位置305〜1161に相当するHDVゲノムのR'1領域、アンプリコン(位置692〜904)を含む該R'1領域のフラグメント、及びHDVのゲノム全体からなる群より選択されるポジティブコントロール試料と、
- HDV陰性血清のようなネガティブコントロールと
をさらに含む。
- 図1は、HDVゲノムの概略図である。HDVゲノムは、約1680ヌクレオチドの環状一本鎖RNA分子である。これは、広範囲の分子内塩基対形成のために、偽二本鎖桿状分子として従来表されている。デルタ抗原コード領域(アンチゲノム鎖上の)は、位置1012の複製部位(edition site)(Wangら3による)を有する白色の方形で表す。リボザイムは、ヌクレオチド900/901 (アンチゲノムリボザイム)及び685/686 (ゲノムリボザイム)に位置する。定性RT-PCRアッセイを用いて増幅されたR0領域(900〜1280)、及びpCRIIにクローニングされかつリアルタイムRT-PCRアッセイにおいて定量のための標準物質として用いられたR1 (305〜1161)は、灰色の線で表す。フォワード(Delta-F)及びリバース(Delta-R)のプライマー及びプローブ(Delta-P)は、中抜きの矢印で示す。
A:ゲノムリボザイム:フォワードプライマー配列は、濃い灰色で強調する。
B:アンチゲノムリボザイム:リバースプライマー配列は、濃い灰色で強調し、プローブは薄い灰色で強調する。
- 図3は、定性及び定量のRT-PCRアッセイの感度の比較を表す。試料番号40の例である。cDNA (試料番号40)の終点希釈(10μl)を、定性及び定量アッセイの両方で試験した。定性アッセイでは、1.5%アガロースゲルのエチジウムブロミド染色後の目視可能な最終希釈は、1/1000であった。定量リアルタイムPCRアッセイでは、1/5000希釈したcDNA 10μl中に1コピーを検出した。
A:「応答者」のプロフィールを示す患者:患者A及びBは、IFN治療に応答し、そのウイルス量が減少した(negativated)。患者C及びDは、治療の最後で検出可能なままであったが、ウイルス量は5 log10コピー/ml血漿を超える減少を示した。
B:「非応答者」プロフィールを示す患者:ウイルス量の減少は、治療の期間中に2 log10コピー/mlを超えなかった。患者E、F、H及びIの場合、初期のウイルス量は、6 log10コピー/mlを超えていた。
C:患者J:HBV-HIV感染患者でのHDV重複感染。患者K:2回の治療の失敗後に肝臓移植。
1.1 患者及び試料
84個の血液試料を、アッセイの技術的妥当性検査のために用いた(表1)。
HDV-RNAを、QIAamp MinElute Virus Vacuum (QIAGEN)を用いて250μlの血清又は血漿から抽出した。cDNA合成を、5μlの抽出生成物から、0.5 mmol/l GeneAmp dNTPs (Applied Biosystems)、0.4 pmol/μl Random Hexamers (Applied Biosystems)、1 IU/μl RNasin (Promega)、100 IU/μl Superscript II RNase H Reverse Transcriptase (Invitrogen)、1×First-Strand Buffer (Invitrogen)及び10 mmol/μl DTT (Invitrogen)を含む25μlの混合物中で行った。反応を、42℃にて45分間行った。cDNAを、Montage PCR Centrifugal Filter Devices (Millipore)を用いて精製した。
cDNAを、Microcon 50カラムで精製する。
Delta-F (ダイレクトプライマー):5'-GCATGGTCCCAGCCTCC-3' 配列番号1)、
Delta-R (リバースプライマー):5'-TCTTCGGGTCGGCATGG-3' (配列番号2)、
Delta-P (プローブ):5'-FAM-ATGCCCAGGTCGGAC-MGB-3' (配列番号4)。
RNA抽出及びcDNA合成は、定量アッセイについて記載したようにして行った。国際PCT出願WO 03/027291 (ヌクレオチド889〜1289)を参照するゲノムのR0領域を、該国際PCT出願に記載されるようにして、プライマー900s及び1280asを用いて、以前に記載されたようにして32増幅した(図1)。アンプリコンは、エチジウムブロミドで染色した1.5%アガロースゲルでの電気泳動後に検出した。
マン−ホイットニーノンパラメトリックU検定(StatView 4.02)は、統計的な比較のために用いた。差は、P≦0.05で有意であると考えた。
アッセイの特異性を、45サイクルの増幅の後に一連の26個のコントロール血清試料で得られた陰性の結果により確かめた(結果は示さず)。
血清中の異なるクレードのHDV-RNAを定量するアッセイの能力を、41〜84の番号を付した44個の血清試料中のHDV-RNAの検出により確かめた(図4)。HDV-1ウイルスで得られたウイルス量の範囲とその他の型のウイルスで得られたウイルス量の範囲との間に著しい違いは見られず、該アッセイは、いずれのHDVの検出及び定量にも適合することが示唆された。41〜63の番号を付した23個のHDV-1試料を試験し、2〜986000コピー/10μl cDNAの範囲で、平均コピー数が1950であった。HDV-2 (n=1)、5 (n=6)、6 (n=4)及び7 (n=5)を含有する血清試料も試験し、2〜1000000コピー/10μl cDNAの範囲で、平均ウイルス量が1300であった。同じ試料を定性アッセイを用いて試験し、エチジウムブロミド染色バンドの強度は、≧500コピー/10μl cDNAのウイルス量の全ての試料について同じに見えた(結果示さず)。
リアルタイムRT-PCRアッセイを、慢性デルタ型肝炎についてIFNを受けた感染患者の血漿中のHDVウイルス量の進展を追跡する手段として評価した。実験室において定性RT-PCRを用いて以前に試験した一連の試料が利用可能な11人の患者について、このフォローアップを考慮した。血漿1 ml当たりのコピー数のlog10として表されるウイルス量を、図5に報告する。
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Claims (10)
- (1) 生体試料からHDV-RNAを抽出する工程と、
(2)
- 前記HDV-RNAに対応するcDNAを、以下のプライマー対:
(a) Delta-F (ダイレクトプライマー):5'-GCATGGTCCCAGCCTCC-3'(配列番号1)とDelta-R (リバースプライマー):5'-TCTTCGGGTCGGCATGG-3' (配列番号2)及び
(b) T3-Delta-F (ダイレクトプライマー):5'-GCATGGCCCCAGCCTCC-3' (配列番号3)とDelta-R (リバースプライマー):5'-TCTTCGGGTCGGCATGG-3' (配列番号2)
からなる群より選択される少なくとも1対のプライマーの存在下で増幅させ;そして
- 形成されたアンプリコンの量を検出し、前記量を少なくともコントロール試料と比較する
ことを含む、リアルタイムRT-PCR定量化により前記HDV-RNAの量を測定する工程と
を含むことを特徴とする生体試料中のHDV-RNAを検出する方法。 - 前記検出が、次の配列:5'- ATGCCCAGGTCGGAC-3' (配列番号4)により規定される蛍光発生プローブ[Delta-P (プローブ)]の存在下で行われることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記検出工程が、コントロール試料として、HDVゲノムの位置305〜1161に対応する該ゲノムのR'1領域、前記ゲノムの位置692〜904を含む前記領域R'1のフラグメント及びHDVのゲノム全体からなる群より選択されるポジティブコントロール試料を含むことを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 前記検出工程が、コントロール試料として、請求項3で規定されるポジティブコントロール試料とネガティブコントロールとを含むことを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 前記蛍光発生プローブが、蛍光色素によりその末端の1つで少なくとも標識されていることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1つに記載の方法。
- 生体試料からHDV-RNAを抽出し、それに対応するcDNAを合成し、そして前記cDNAを増幅するために必要な緩衝液及び試薬のほかに、請求項1で規定される少なくとも2対のプライマーを含むことを特徴とする検出キット。
- - 請求項2で規定される蛍光発生プローブと、
- 請求項3で規定されるポジティブコントロール試料と、
- ネガティブコントロールと
をさらに含むことを特徴とする請求項6に記載の検出キット。 - 前記蛍光発生プローブが、その5'末端にて蛍光レポーター色素で、及びその3'末端にて消光色素及びMGB基で標識されていることを特徴とする請求項7に記載の検出キット。
- 配列番号1と配列番号2のプライマー対、及び配列番号3と配列番号2のプライマー対からなる群より選択される、いずれのHDVゲノムを増幅可能なプライマー対。
- 配列番号4で規定される、請求項9で規定されるプライマーの1対により増幅される核酸フラグメントに特異的なプローブ。
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