JPWO2003068973A1

JPWO2003068973A1 - 肝炎の診断に有用なｄｎａ配列とコードされたポリペプタイド

Info

Publication number: JPWO2003068973A1
Application number: JP2003568084A
Authority: JP
Inventors: 暉勝有馬; 和明石橋; 王　紅; 紅王
Original assignee: 暉勝有馬
Priority date: 2002-02-13
Filing date: 2002-12-03
Publication date: 2005-06-02
Also published as: EP1536013A1; WO2003068810A1; AU2002349383A1; WO2003068973A1; AU2003208851A1; EP1536013A4

Abstract

慢性非Ｂ非Ｃ肝炎、急性非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ非Ｇ（以下非Ａ−Ｇ）肝炎のある患者の血清中の抗体により認識される、以前は未知の、ポリペプタイド抗原をコードするものとして、新しいｃＤＮＡクローンＫが単離され、その特徴が検討された。患者血清中の抗Ｋポリペプタイド抗体に関連した肝炎は、防するために必要であると考えられる。クローンＫに対応するＲＮＡ配列は、肝炎ウィルスＡ、肝炎ウィルスＢ、肝炎ウィルスＣ、肝炎ウィルスＤ、肝炎ウィルスＥ、および肝炎ウィルスＧ以外の外因性の感染性病原物質の核酸に含まれており、ヒトにおける非Ａ−Ｇ肝炎の進行に付加的な疫学的病因物質あるいは関連する一つの因子を表しているのかもしれない。Ｋ核酸と対応するポリペプタイドおよび、それぞれの変異株は、非Ａ−Ｇ肝炎の予防、診断および治療を目指した一連の手段において有用であるだろう。

Description

技術分野
６種類のヒト肝炎ウイルスが、報告されてきた。肝炎ウイルスＡ、肝炎ウイルスＢ、肝炎ウイルスＣ、肝炎ウイルスＤ、肝炎ウイルスＥそして、肝炎ウイルスＧである（肝炎ウイルスＧは肝炎を起こすとは考えにくい）。この発明は、一つのＤＮＡ配列とその配列がコードするペプチドについてのものである。そのコードされたペプチドは、非Ｂ非Ｃ慢性肝炎のある患者の抗体により特異的に認識される一つの抗原を代表するものである。結果的に、そのペプチドは急性の非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ、非Ｅ、そして非Ｇ型急性肝炎（これらのうち急性Ｂ型肝炎と急性Ｃ型肝炎が慢性化する可能性がある）に特異的である。本発明の、その塩基配列とコードされたポリペプチドは非Ａ−Ｇ型肝炎の診断に有用である。
背景技術
ウイルス性肝炎は主要な公衆健康に関する問題の一つであり、世界中の肝臓病のもっとも一般的な原因である。年間３００，０００の急性ウイルス性肝炎の症例が米国では発生しているが、幸にも劇症肝炎になる例はまれな結果であるが、Ｂ型肝炎とＣ型肝炎は多くは、慢性ウイルス性肝炎となる。慢性ウイルス性肝炎に感染した例は５０００，０００人おり、疑いもなく慢性肝臓病のもっとも一般的な原因である。より効果的な公衆衛生手段と肝炎ウイルスＢワクチンの実施により、世界中で急性ウイルス性肝炎のインシデンスは減少しつつあるが、Ｃ型急性肝炎のケースは８５％の頻度である。１５，０００人のアメリカ人（約４０，０００人の日本人）が、慢性ウイルス性肝炎の結果として年間死亡している。そして、Ｃ型肝炎のケースでは、次の２０年間に年間死亡率は２５，０００人に達すると見積もられる。ウイルス性肝炎の年間治療費は莫大であり何億ドルにものぼるばかりか、生活の質は、説明しようの無い障害を受ける。
引用されたように、６つの肝炎ウイルス、肝炎ウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥそしてＧは、遺伝子組成および構造が異っている。ＤＮＡウイルスであるＨＢＶ以外は、すべてＲＮＡ遺伝子をもつウイルスである。ＨＢＶはＤＮＡ遺伝子を複製する際に、ＲＮＡを中間型として利用する。ＨＤＶは、ＨＢＶの表面抗原をウイルスそれ自身の構築のために必要としており以下の文献に詳細は述べられている。（Ｓｃｈｉｆｆｅｔａｌ．ｅｄｓ．，ｓｕｐｒａ，ｐａｇｅｓ７２５−７４４（１９９８）．ＨＧＶｄｏｅｓｎｏｔａｐｐｅａｒｔｏｃａｕｓｅｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｔａｎｅｔａｌ．，ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ１７９：１０５５（１９９９））
肝炎ウイルスの非経口的感染様式
肝炎ウイルスにとって非経口的感染様式をとることがよく知られている。（Ｓｊｏｇｒｅｎ，Ｃｈａｎｅｔａｌ．，Ｄａｖｉｓ，Ｒｉｚｚｅｔｔｏｅｔａｌ．，Ｋｒａｗｃｚｙｎｓｋｉｅｔａｌ．ａｎｄＳｃｈｉｆｆ，Ｓｃｈｉｆｆｅｔａｌ．ｅｄｓ．，ｓｕｐｒａ，ｐａｇｅｓ７４５−８６９（１９９８））既知の肝炎ウイルスＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、ＨＥＶ及びＨＧＶは非経口的に感染する。それらの伝染様式は以下のような形式である。
Ａ型肝炎：主な感染経路は糞便から口、人と人との接触または汚染された食物または水の経口感染である。性的感染は同性愛男性の間で著しい。まれではあれ、非経口的な感染ルートも輸血または血液製剤にひきつづき起こったことが報告されている。
Ｂ型肝炎：輸血、性交渉、経皮的そして周産期の感染、ヘルスケアー環境そして移植。そのほか、密接な身体の接触、蚊のように血液を摂取する昆虫、精液、唾液などの様々な体液などにより起こりうる。
Ｃ型肝炎：輸血、移植、不法な肝炎Ｃ。輸血などを通した大量のまたは経皮的曝露、感染したドナーや不法な薬物の共有、性的行動により感染した接触による曝露、家庭内接触、周産期の曝露、およびヘルスケアーの環境による周産期の曝露などである。
Ｄ型肝炎：Ｂ型肝炎の伝染様式と同じ径路である。つまり、周産期の感染かまたは顕性または不顕性感染である。
Ｅ型肝炎：糞便経口感染経路が感染のもっともよくある感染経路である。Ｅ型肝炎は、東南アジア、中央アジア、中近東、アフリカの一部、そしてメキシコにおける大量の伝染性の急性肝炎、また散発性肝炎の大部分を占める。いくつかの報告では、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎または輸血後のＥ型肝炎の発症から、非経口的感染径路が示唆されている。
Ｇ型肝炎：Ｇ型肝炎の肝炎における役割は明らかに定義されていないし、Ｇ型肝炎は、前述のように肝炎を起こすとは考えがたいが、Ｇ型肝炎は非経口的、性交渉、周産期に感染する。
６番目の（非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ非Ｇ）肝炎ウイルス
過去３０年間５個の肝炎因子（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ及びＨＥＶ）が発見されてきた。そしてなお少なくとも１つのウイルスの証拠がある。（Ｐｕｒｃｅｌｌ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９１：２４０１（１９９４）．）先述のように、Ｇ型肝炎は肝炎を起こすようではないので非Ａ−Ｇ肝炎は６番目の肝炎ウイルスとなる。
散発性急性非Ａ−Ｇ肝炎は輸血を介した感染を示唆している
１９７１年から１９７４年までの急性肝炎の入院患者のうち保存されていた血清の５７例、当時は非Ａ非Ｂ肝炎の診断であったが、抗ＨＡＶＩｇＭ、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、抗ＨＣＶＩｇＧ及び抗ＨＥＶＩｇＧの存在について再検された。非Ａ非Ｂ肝炎患者の２７血清（４７％）はすべての検査において陰性であった。これらの非Ａ−Ｇ肝炎には、小児、老人の患者も含まれているが、入院しているコントロールの患者に比べ経静脈的薬物投与歴のあるグループであるようだった。（Ｂｉｎｏｔｔｏｅｔａｌ．，ＡｕｓｔＮＺＪＭｅｄ３０：６６８（２０００））
輸血による慢性非Ｂ非Ｃ型肝炎
われわれは、輸血に関連した急性肝炎（急性ＴＡＨ）のインシデンスがほとんどゼロに近づきつつある時点にある。そして、１回の輸血歴についてほとんどおそらく０．５％以下の頻度であると、Ａｌｔｅｒは報告し、輸血後急性肝炎は仮想的に駆除されてしまったと報告している。また、Ｇｅｒｌｉｃｈらは、安全における改良改善は、とても小さくそして莫大な費用がかかるだろうと述べている。
しかしながら、輸血後の慢性非Ｂ非Ｃ型肝炎が存在する証拠が示唆されている。１９７０年代の早期に５回の輸血研究で同定された非Ａ非Ｂ肝炎の患者たちは、その後経過観察され生存している１２９例の内３９例（３０％）は以前輸血後急性肝炎と診断されたわけであるが、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型およびＧ型肝炎ウイルスには関連していなかった。このことは、ほかの同定されていない感染因子が慢性非Ｂ非Ｃ型肝炎の慢性期の状態に存在することを示している。
最近発見された候補（ＴＴＶ，ＳＥＮＶ）は肝炎ウイルスとされているが肝炎を起こしていない
可能性のある肝炎ウイルスとして、ＴＴウイルス（ＴＴＶ）は輸血後の非Ａ−Ｇ肝炎の患者血液から発見された。しかしながら、ＴＴＶは、肝炎に関連がないこと、もともと肝炎ウイルスではないかもしれないと報告された。さらに、ＴＴＶ感染は透析患者では一般的であるが、肝臓病患者とは関連がないとされている。最近、ＳＥＮウイルス（ＳＥＮＶ）と命名されたＤＮＡウイルスは、非Ａ−Ｇ肝炎の主要な原因であると発表された。この新型ウイルスは現在のアメリカの献血車のほとんど２．０％でＳＥＮＶに感染したほとんど大多数は、肝炎に至らないことがわかっている。他の肝炎をもつ日本人患者３７８例の研究では、ＳＥＮＶはおそらく肝炎には関連する因子ではないことが示唆されている。
慢性ウイルス性肝炎は肝細胞癌のもっとも高い危険因子である
慢性肝炎は、以下に示すように肝細胞癌の主要な原因である。
症例数の予測：１９８５年には、３１５，０００例の新規の肝細胞癌の世界的な発症がみられる。これは、全部のヒトのがんのうち４．１％を占める。アジアでの発症が最も多く、世界中の肝臓癌の７０％を占める。アフリカは、患者総数では３７６００例を占める。日本は一年間におおよそ２３０００例を占める。北アメリカでは、年間に７０００例の発症があり、ヨーロッパでは、３００００、旧ソビエト連邦では１２０００の発生がある。また、オーストラリア、ニュージーランドおよび太平洋諸島では年間１００００以下の発症であると、Ｂｏｓｃｈは上記の引用文献の１３−１４ページにおいて論評している。
原発性肝臓癌の順位：予測されるすべての癌患者数に関して比較的な頻度の点で、それぞれの原発部位を別々に勘定すると、原発性肝臓癌は５番目にランクされる。発展途上国では、原発性肝臓癌は、統計的に、男性では、胃癌、肺癌に次いで、３番目にポピュラーな癌であると上記のＢｏｓｃｈ引用文献１４ページに論評されている。
原発性肝臓癌の死亡率：癌登録で報告された死亡数／発生数比は、１に近いか、１以上である。このことは、大多数の患者が１年以上生存しないことを示唆している。とくに発展途上国では、多くの臨床研究で確認されている。ヨーロッパのうち、イタリー、スペイン、フランス、スイスおよびいくつかの東ヨーロッパ諸国では、比較的高い死亡率である。（１００，０００件につき５．０以上）ギリシャは確立された癌登録が無いのだが、上記のＢｏｓｃｈは引用文献１５−１６ページで、男１６．１、女７．８と最も高い死亡率はであると論評している。
原発性肝臓癌の頻度：もっともハイリスクの地域は、東南アジアの沿岸地域、中国、日本、サハラ砂漠周囲のアフリカ諸国そしてメラネシア諸島である。中間リスクの地域は、北地中海諸国であり、低リスクであるのは、北ヨーロッパ、ほとんどのアメリカ諸国そしてオーストラリアであると上記のＢｏｓｃｈは引用文献１６ページで、論評している。
原発性肝臓癌の傾向：９６の癌登録統計では、最近２回の期間（１９７８年から１９８２年と１９８３年から１９８６年）が、その登録の多様性と診断力の差はあるのだが、傾向を評価するために選ばれた。ヨーロッパではスカンジナビア諸国で増加傾向と報告された。日本では原発性肝臓癌の登録された発生率は、１５−２０％増加している。日本における増加傾向は１９７０年から報告されており、多くは１９６０年代初頭にその当時生存している集団が、輸血または汚染された注射針によりＣ型肝炎ウイルスに多くのヒトが暴露されたのが大きな要因であるとされてきた。増加傾向を示唆するほかの癌登録統計には、オーストラリア、カナダ（男性）と米国におけるいくつかの民族集団での登録がある。とくに男性における緩やかな増加は、フランス、イタリー、そして英国のいくつかの登録された統計でも記録されてきた。原発性肝臓癌の年令補正発症率における減少は、インド、イスラエル、スペイン、そしてラテンアメリカで報告されてきた。ＨＢＶのハイリスクの諸国で誕生の早期に、多くは母親から、ＨＢＶに暴露されることは、早期の肝臓癌の発症と発症率の増加と男性に早期に肝臓癌が起こることを説明しているのかもしれない。他のＨＣＶ、アルコール、経口避妊薬そしてたばこのようなほかの危険因子は、部分的には癌の発症が遅いこと、年令とともに発症率が累進的に増加すること、そして男性の患者が多い点で年令のピークが比較的高いことなどを説明しているのかもしれないと、上記のＢｏｓｃｈは引用文献２０−２１ページで、論評している。
原発性肝臓癌の危険因子と不均一な一貫性：米国、ヨーロッパ、そして日本における原発性肝臓癌の低リスクの集団で、ＨＢＶとＨＣＶは、原発性肝臓癌の７０％から７５％を占める。したがって、非Ａ−Ｇ肝炎は、その残り、すなわち原発性肝臓癌の２０％ぐらいまでに、これらの地域では関与している。東南アジア、中国、そしてサハラ砂漠周辺諸国などのハイリスクの諸国ではＨＢＶの有病率が高く、原発性肝臓癌の６０％以上は、ＨＢＶによるものである。これらの地域では、ＨＣＶの関与は少なく、おそらく１０％以下であるようだ。経口避妊薬は、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎の発癌過程において、共因子または促進因子としての役割があるかもしれない。上記のＢｏｓｃｈが引用文献２３−２５ページで、論評しているように、われわれにはアフラトキシンの危険性について定量する能力が限られているので長期にわたるそれぞれの曝露を評価する信頼される技術が欠如している。
出願人らのクリニックにおける非Ａ−Ｇ肝炎関連肝臓病の頻度
１９９８年に６３３名の慢性肝臓病患者を表１に示すように診察した。患者たちはＨＢＶ−ＤＮＡ，ＨＣＶ−ＲＮＡ，ＨＴＬＶ−Ｉ，ＨＩＶの検査がされた。慢性非Ｂ非Ｃ肝炎の患者の肝生検の組織像は、慢性ウイルス性肝炎の組織像に矛盾のないものであった。約１０−２０％の慢性肝臓病の患者は非Ｂ非Ｃのタイプであり、それはまた、下記の引用文献のように非Ａ−Ｅまたは非Ａ−Ｇのタイプである（表１）。

肝炎ウイルス抗原をターゲットとする非中和抗体
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子によりコードされ、また感染肝細胞に発現される２つの抗原に対する血清非中和抗体、それらはＨＢＶの遺伝子複製に関連している内部抗原（ＨＢｃ抗原）ともう一つの分泌抗原（ＨＢｅ抗原）は、進行中のＢ型慢性肝炎または肝炎が休止した患者で検出できることがよく知られている。同様に、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子のコードし感染肝細胞に発現される構造蛋白および非構造蛋白を含む抗原に対する非中和抗体も、Ｃ型肝炎感染の臨床経過の中で検出されうる。（Ｃｈａｎｅｔａｌ．ａｎｄＤａｖｉｓ，Ｓｃｈｉｆｆｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ｓｕｐｒａ，ｐａｇｅｓ７５７−７９１ａｎｄｐａｇｅｓ７９３−８３６（１９９８）．）したがって、同様の現象が非Ａ−Ｇ肝炎患者でも容易に予想されうる。
肝臓病の患者およびコントロールにおいて循環している肝由来のｍＲＮＡ
ある研究で、比重遠心法により抽出された末梢血リンパ球から総ＲＮＡが、抽出された。そのうちｍＲＮＡは逆転写され肝リパーゼ特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより肝リパーゼの相補的ＤＮＡが増幅された。
増幅されたＤＮＡは肝臓癌患者のサンプルでも正常コントロールのそれでもエチヂウムブロマイドの存在下でアガロースゲル電気泳動で証明された。Ｌｅｏｎｈａｒｄｔｅｔａｌ．，ＥｕｒＪＳｕｒｇ１６５：５３９（１９９９）同様に急性及び慢性肝臓病患者の大多数では、末梢血単核球からアルブミンのｍＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲにより検出されることが報告されている。（Ｍｕｌｌｅｒｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２５：８９６（１９９７））さらに、肝臓の細胞に主にみられるアルファーフェト蛋白のｍＲＮＡも、同じ方法で、肝臓病患者および健康ボランティアの末梢血細胞から、高頻度に検出されることが報告されている。（Ｉｓｈｉｋａｗａｅｔａｌ．，ＪｐｎＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ２８：７２３（１９９８））このことは、肝臓を含む幾つかの組織で増殖を続ける非Ａ−Ｇ肝炎ウイルス由来のｍＲＮＡが、非Ａ−Ｇ肝炎の患者末梢血の中に存在すると予想することは可能である。
肝炎を診断する抗体テストの鋭敏度
Ａ型肝炎とＢ型肝炎のためのスクリーニングテストは１９７０年台の中期に、輸血後肝炎の症例を検査することを可能にした。またその結果、輸血後肝炎の約２５％がＢ型肝炎ウイルスによるものであり、Ａ型肝炎ウイルスによる輸血後肝炎がないことが示された。結果的に、約７５％の輸血後肝炎は非Ａ非Ｂ肝炎に分類された。１９８９年にカイロン社の研究者たちが単一抗原を用いた酵素抗体法をＣ型肝炎ウイルス感染の検出のために開発するまでは、非Ａ非Ｂ肝炎原因物質はウイルス学的謎のままであった。ＮＩＨに保管されていた素性の明らかなサンプルについて、過去にさかのぼってＨＣＶ抗原を対象とする抗体検査ＥＩＡ−１を用いた検査では、献血者のうちの非Ａ非Ｂ肝炎の７０％から９０％は、Ｃ型肝炎ウイルス関連であることが示された。献血者血液のＨＣＶ検査は、甚大な効果をもたらした。ＥＩＡ−１は、開発後１年で４０，０００ものＣ型肝炎感染を予防し、第二世代の検査方法ＥＩＡ−２は、輸血によるＣ型肝炎感染をほとんどゼロにまで減少させた。（Ａｌｔｅｒ，ＡｍＪＭｅｄ１０７：１６Ｓ（１９９９）．）
出願人の非Ａ非Ｂそして非Ａ非Ｂ非Ｃ肝炎ウイルスの分子クローニングの経験
非Ａ非Ｂ輸血後肝炎の感染したチンパンジーの血漿から見つけられたＲＮＡの分子クローニングは、約１０ｋｂのウイルス遺伝子の存在を示していた。（Ｃｈｏｏｅｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：３５９（１９８９））同様に、出願人は、非Ａ非Ｂ肝炎患者から非Ａ非Ｂ肝炎に関連したクローンを同定していた。（ＡｒｉｍａａｎｄＦｕｋａｉ，ＥＰＯＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．８９３０９２６１．９（１９８９）．）ほとんどの非Ａ非Ｂ輸血後肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス感染に関連したものであり、非Ａ非Ｂ輸血後肝炎の強力な診断検査として広く受け入れられている。しかしながら、ほかのウイルス性の要因がこの症候群をおこすかどうかは、以前明確ではない。この発明者のうちの一人（有馬暉勝）を含めて、複数の研究者は、非Ａ非Ｂ肝炎患者血清と反応するポリペプタイドをコードするｃＤＮＡ核酸配列を発見してきたが、Ｃ型肝炎ウイルスおよびその変異株の塩基配列には対応する部分がない。（Ａｒｉｍａｅｔａｌ．，ＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙＪｐｎ２４：５４０（１９８９）；Ａｒｉｍａｅｔａｌ．，ＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙＪｐｎ２４：５４５（１９８９）；Ａｒｉｍａｅｔａｌ．，ＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙＪｐｎ２４：６８５（１９８９）；Ａｒｉｍａｅｔａｌ．，ＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙＪｐｎ２５：１８（１９９０）．）これらのｃＤＮＡは明らかにヒト遺伝子のそれではなく、また、したがって、肝炎の状態に反応する宿主特異的な反応でもない。
発明の開示
ごく最近、ヒトの肝炎ウイルスのなかで、Ｂ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルスだけが慢性肝炎を引き起こすことが知られている。しかしながら、他のまだ発見されていない慢性肝炎を起こす因子が存在することが、申請者らおよび以下に引用する米国で出版された論評により示唆されている。
慢性肝炎の原因である構造的また液体性のウイルスの構造物と新しいウイルスの構造物に対する抗体が、上記のように、その病気のある患者の血清中に共存している。さらに、少なくとも、アルブミン、アルファーフェト蛋白（ＡＦＰ）、肝特異的リパーゼなどのｍＲＮＡの断片が、患者血清中のみならず、正常人の末梢血中に放出されていることが知られている。結果的に、肝細胞の中で複製する際にウイルス遺伝子が転写され、そのｍＲＮＡが血液中に放出されていると予想するのは、比較的容易である。
したがって、出願人は物理的あるいは化学的手段で、ＨＢＶ−ＤＮＡとＨＣＶ−ＲＮＡ両者陰性の慢性非Ｂ非Ｃ肝炎患者血清の末梢血単核球、血漿、血清の分画からＲＮＡを用意した。これらの分画の中に、非Ａ−Ｇ肝炎ウイルス、ウイルス様粒子そして肝細胞を含む感染細胞に由来するｍＲＮＡが患者の末梢血に存在することが予想される。抽出した核酸は二本鎖の相補的ＤＮＡに変換され（ｃＤＮＡ）λｇｔ１１というバクテリオファージの発現ベクターに組み込まれた。慢性非Ｂ非Ｃ肝炎患者由来のリコンビナントＤＮＡを含むλｇｔ１１は、プラークイムノスクリーニング法により慢性非Ｂ非Ｃ肝炎患者血清抗体と反応する遺伝子再構成タンパクを産生するものがスクリーニングされた。
一つの遺伝子再構成ファージ、Ｋと命名されたクローンは、慢性ＮＢＮＣ肝炎患者血清の７０％以上と特異的に反応するポリペプタイド配列をコードする挿入部分のある再構成ＤＮＡを含むことが判明した。
大腸菌に発現させたグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合クローンＫタンパクとプラーク免疫スクリーニングで陽性の血清との反応をウエスターンブロティングで検討すると、クローンＫのタンパクとＧＳＴ融合タンパクは、予想された分子量の場所に一本のｂａｎｄとして同定された。
プラーク免疫スクリーニングでは、アガーゲル上で増殖する大腸菌の溶菌したプラークとして再構成λＧＴ１１の発現するこのポリペプチド抗原は、慢性非Ｂ非Ｃ型肝炎の７２％、急性非Ａ−Ｇ型肝炎の２７．６％、そして維持透析患者の１４．５％、輸血歴のある透析患者の２３％、そしてＡＬＴが基準値を上回る献血ドナーの１２．５％を、検出することができる。抗Ｋ抗体（以後ａｎｔｉ−Ｋ）は、無症状の無作為抽出血液ドナーでは、めったに検出できないが、輸血に関連した肝炎の予防のためにドナー血液を検査できる有用性は、以上および以下に示唆された。
世界的なａｎｔｉ−Ｋの分布は、日本、台湾、韓国、米国、ブラジル、ドイツ、イタリー、ギリシャ、そしてチェコで確認された。したがって、この抗原は、以後Ｋ−ポリペプタイドと称し、すくなくともプラーク免疫スクリーニングにより、その病気の検出とスクリーニングに有用であるようである。
クローンＫの核酸塩基配列とそのコードするポリペプタイドは非Ｂ非Ｃ肝炎を起こすと考えられるウイルスに関連している。さらに、その核酸塩基配列はヒト染色体ＤＮＡの中には含まれていないようである。後者の結果は、クローンＫが既知の肝炎ウイルス以外の非Ａ−Ｇ肝炎に関連した外来性感染性の病因ゲノムに含まれていること、を示唆しており、結果的に慢性非Ｂ非Ｃ肝炎に進展する因子としてはたらく付加的および疫学的な因子およびヒトの急性非Ａ−Ｇ肝炎を代表するものかもしれない。
この発明の他の態様として、出願人は、さまざまな免疫診断およびヒト由来の検体におけるａｎｔｉ−Ｋ抗体の検出とＫ関連核酸の検出プローブアッセイを表す。議論されている問題のＫ−ポリペプタイドは遺伝子再構成バクテリオファージの宿主細胞または、遺伝子再構成プラスミド、または化学合成により生産される。
クローンＫにより代表される病因物質に対する予防のためのワクチンは、Ｋポリペプタイドに代表される免疫診断的エピトープの一つ若しくは複数を含む構成物として規定される。さらに、Ｋポリペプタイドの免疫診断的エピトープの一つ若しくは複数の抗原決定基に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、既知の熟練した技術を用いることで、容易に生産される。そのような抗体、またはそれからのアクティブな断片は、クローンＫに代表されるエージェントに対する受動的免疫として有用である。
さらに、この発明のなかに記載されたＤＮＡ配列の近傍の核酸配列は、非Ａ−Ｇ肝炎の診断と外の疾患の鑑別診断において、有効である。これらの付加的な配列はクローンＫのここに記載された配列に基づき標準的な技術により容易に発見できる。
発明を実施するための最良の形態
慢性非Ｂ非Ｃ肝炎（結果的に非Ａ−Ｇ肝炎を含めて）の診断に有用なポリペプタイドと代表的な核酸およびアミノ酸配列は、他に報告されたどの非Ａ−Ｇ肝炎エージェントと関連がなく、優先的技術を越える重大な進歩を意味するものであろう。そのようなポリペプタイドは、相当する核酸と同様に、非Ａ−Ｇ肝炎の完全な予防と診断の手段を開発しようとする労力においてとても大きな価値のあるものであろう。この発明はそのようなポリペプタイドとそれに呼応した核酸配列を含むものである。
慢性非Ｂ非Ｃ肝炎、結果的に非Ａ−Ｇ肝炎に特異的なクローンＫの同定
ＲＮＡは、臨床的および組織学的に慢性非Ｂ非Ｃ肝炎を示す５名の患者の末梢血単核球、血漿、および血清から分離された。これらのプールされた末梢血単核球、血漿、血清は、Ｔｉｎｇｅｔａｌ．，ＶｏｘＳａｎｇ２０：５６１（１９７１）に報告されたように全血から分離された。それらは、ウイルスおよびウイルス様粒子が豊富と考えられる。ＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより評論されているようにＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＧａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇＭＤ，ＵＳＡ）のＴｒｉｚｏｌ試薬という商業化製品を使い、抽出された。そのＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーの構築は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより紹介されている様に、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＣｈｉｏｃｅシステムという商品を用いて行われた。さらに、発現ベクターのλｇｔ１１ファージのＥｃｏＲＩサイトに組み込まれ、Ｓａｍｂｒｏｏｋらに引用されているＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のギガパックＩＩＩゴールドを用いてｉｎｖｉｔｒｏｐａｃｋａｇｉｎｇを行った。
プラーク免疫スクリーニングとして、Ｓａｍｂｒｏｏｋの記載しているようにバクテリオファージλｇｔ１１ベクターに構築された発現ライブラリーの発色スクリーニングが行われた。図１に示すように、リコンビナントのバクテリオファージは、大腸菌に感染して増殖し結果的に１０^７個のｃＤＮＡクローンから、５名の慢性非Ｂ非Ｃ肝炎患者のプール血清由来の抗体と反応する、慢性非Ｂ非Ｃ肝炎関連抗原が存在するものが免疫スクリーニングされた。一つの陽性クローン“Ｋ”が、３回の継続したプラーク免疫スクリーニング法で同定され、純化された。１回目のスクリーニングで、５８３個の陽性ｃＤＮＡクローンが、スクリーニングプレートからピックアップされた。第２回目のスクリーニングで、そのうち２４個が明らかな陽性とされ、最終的に４個のクローンがピックアップされた。その４個のクローンのなかから、慢性Ｂ型肝炎、慢性Ｃ型肝炎、慢性非Ｂ非Ｃ肝炎および正常コントロールの血清からなる血清パネルによってクローンＫが選択された。
クローンＫの新たな核酸配列とアミノ酸配列
クローンＫに挿入された核酸配列と挿入された核酸配列にコードされた演繹されるアミノ酸配列（以下Ｋポリペプタイド）は、図２に示されている。核酸配列もアミノ酸配列も、化学論文あるいは様々な特許出願に報告されたＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスの核酸配列とは相同性がない。クローンＫのＤＮＡ配列もアミノ酸配列も肝炎ウイルスＡ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＧの利用可能な塩基配列とも相同性がなく、また、主要なデータベースに記録された他の塩基配列との相同性もない。このように、クローンＫは新たなポリペプタイドをコードする新たな塩基配列を代表しており、臨床的および組織学的に慢性非Ｂ非Ｃ肝炎、結果的には慢性非Ａ−Ｇ肝炎を呈する患者の抗体が認識する一つ若しくは、複数のエピトープを保持していることになる。そのようなわけで、その病因物質は、ヒトに非Ａ−Ｇ肝炎を引き起こす付加的因子を代表しているのかもしれない。
クローンＫの核酸配列には、古典的グリコシレーション部位は存在しない
この公開されたクローンＫの核酸配列には古典的なグリコシレーション部位はない。このことは、真核細胞および他の宿主細胞に発現されたＫポリペプタイドは、公開されたＫポリペプタイドの機能的エピトープの特徴を所有しているに違いないことを示唆している。さまざまなタンパクが特異的なグリコシレーションパターンを要求することは、よく見られることであるが、このように、適切な宿主細胞が予想できないことは、Ｋポリペプタイドの配列と関連した配列の一因ではないに違いない。
グルタチオンＳトランスフェラーゼとクローンＫの融合タンパクの作成
Ｋポリペプチドをコードするインサートは、発現プラスミドにサブクローニングされ上記のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ，ｐａｇｅｓＡ９．２７−９．２８（２００１）にしたがって、大腸菌のＧＳＴ融合タンパクとして発現された。クローンＫのインサートを含んだプラスミドｐＵＣ１９は、ＥｃｏＲＩで切断され、Ｋの断片はＧｅａｒｉｎｇｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ８：３６６７（１９８９）にしたがってプラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔのバリアントにサブクローニングされた。このバリアントは、ｐＧＥＸ−２Ｔａと名付けられ、ＢａｍＨＩ制限酵素で切断されたｐＧＥＸ−２Ｔのプラスミドに、上記のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ，ｐａｇｅｓＡ６．４，１５．６−１５．８ａｎｄＡ４．１５−Ａ４．１７（２００１）の方法に従って、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片の酵素活性により５′断端が突出したものを末端平滑にし、ライゲーションして作成された。クローンＫがコードするポリペプタイドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの融合タンパクとして、ｐＧＥＸ−２ＴａプラスミドによりＳｍｉｔｈｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ６７：３１（１９８８）の方法により大腸菌株ＤＨ５ａに発現された。また、ＧＳＴとクローンＫの融合タンパクは上記のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ｐａｇｅｓ１５．４−１５．８（２００１）により精製された。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量を示すＧＳＴ融合Ｋタンパクの同定
上記の精製されたＧＳＴ融合Ｋタンパクは、界面活性剤と還元剤により溶解されＳａｍｂｒｏｏｋらの上記参考文献ｐａｇｅｓＡ８．４０−Ａ８．５５（２００１）にしたがって、Ｌａｅｍｍｌｉの不連続緩衝液システムを用いたｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分子量に応じて分離された。そのゲルは、１５％の分離ゲル（ｐＨ８．８）と４．５％のスタッキングゲル（ｐＨ６．８）とからなり、２％ＳＤＳ，０．１２５ＭＴｒｉｓｐＨ６．８，１０％グリセロール，１％２−メルカプトエタノールと０．０２％ｐｙｒｏｎｉｎＹｔｒａｃｋｉｎｇｄｙｅに溶解された精製されたＧＳＴ−Ｋ抗原は、５分間ボイルした後で、そのゲルのウエルに入れられ、電気泳動で分離された。１つのウエルに１２８マイクロＬ（２．７ｍｇ相当）をアプライし、定電流で色素がゲルの下端に達するまで電気泳動した。図２のＳＤＳ−ＰＡＧＥの２つのウエル（レーンＡとＢ）レーンＡは、低分子の分子量マーカーでレーンＢは精製ＧＳＴ融合クローンＫタンパクである。それらは、ＧＳＴ融合クローンＫタンパクの分子量を同定する目的でＣＢＢで染色された。ウエルＢで泳動されたＧＳＴ融合クローンＫタンパクの明らかな分子量は、ウエルＡで泳動されたその分子量とレインボー分子量マーカー（ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐ．，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）の泳動距離の対数プロットによる標準曲線から推定された。そして、予想された分子量（３２ＫＤ）の融合タンパクと同一であることが確認された。
ウエスターンブロティングによるＧＳＴ融合クローンＫタンパクと抗Ｋ抗体の反応
上記のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．ｐａｇｅＡ９．２８（２００１）のウエスターンブロティングにしたがい、ＧＳＴ融合クローンＫタンパクとそれに特異的な抗Ｋポリペプタイド抗体の反応を検討した。
プラーク免疫スクリーニングで強い陽性を示した血清と、２つの陰性コントロール予想されたＧＳＴ融合クローンＫタンパクの分子量の位置に抗体と反応するバンドがでることが上記の図２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウエスターンブロティングで確認された。
精製されたＧＳＴ融合クローンＫタンパクは３つのウエル（レーンＣ、ＤそしてＥ）にアプライされ図２のウエルＢの横でＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動された。電気泳動の後、レーンＣ、ＤそしてＥのゲルは、そのポリアクリルアミドゲルから、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写された。
その膜は次に風乾され、泳動のレーンに沿って３枚に切断され、別々に前処置された上記３種類の血清と反応させた。前処置にはＧＳＴに対する血清中の抗体を吸収してしまうためにＫのインサートの含まれないワイルドタイプのｐＧＥＸ−２Ｔを含む細菌培養液を使用して行った。レーンＣは、プラーク免疫スクリーニング法で陽性の血清、目標のＫポリペプタイドに特異的と仮定される血清と、他の２つのウエル（レーンＤとＥ）は、同様のプラーク免疫スクリーニング法で陰性のコントロール血清のために準備された。最終的に、結合した抗体は二次抗体、西洋わさびペルオキシデース標識抗ヒトＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体とその酵素の基質による発色反応により検出された。その結果、ＧＳＴ融合クローンＫタンパクは、一人の患者血清の抗Ｋ抗体によりその泳動上の局在が、ウエルＣに示されるように予想された分子量の大きさで３２ＫＤのポリペプタイドとして検出された（図２）。より詳しいその方法については、酵素抗体法については上記の文献Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ，ｐａｇｅｓＡ９．２８ｆｏｒｒｅｖｉｅｗ，Ａ９．３４−Ａ９．３７を参照。ポリアクリルアミドゲル電気泳動についてはＡ８．４０−Ａ８．４５を参照。免疫ブロティングについてはＡ８．５２−Ａ８．５３を参照。そして免疫ブロティングにおけるタンパクの染色についてはＡ８．５４−Ａ８．５５（２００１）を参照のこと。
Ｋポリペプチドの大量精製用の大腸菌プラスミド中のＫ核酸配列の発現
公開されるＫ核酸配列はファージベクター、およびプラスミドベクターに下記のようにクローン化された。そのＫポリペプタイドは、現在は、大腸菌を宿主としたベクターに発現されているが、たとえば真核細胞、酵母、哺乳動物細胞に発現することも、上記ＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌｐａｇｅｓＡ３．１−Ａ３．１０（２００１）により可能である。
サブクローニングそしてまたクローンＫまたは、その関連した核酸配列を発現するのに使用できるベクターは、挿入された核酸配列が適切な転写および翻訳のために必要な他の配列に沿って挿入することができる。そのようなベクターは、上記の宿主細胞の一つ又はそれ以上で翻訳され、複製することができる。現在の発明で有用なベクターには以下の性格のいくつかまたはすべてを保有することが望ましい。
（１）長期間宿主細胞の中で安定に維持されること
（２）望ましい宿主細胞の中で高率に複製されたコピーができるように増殖できること
（３）挿入された配列の翻訳をプロモートできる配列を所有していること
（４）薬剤耐性などの選択可能な配列を保有すること
（５）翻訳を終了させる配列を保有すること
発現のためには、ベクターには少なくとも一つのプロモーター、あるいは、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列（Ｓｈｉｎｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２５４：３４（１９７５））、あるいは、それに類似した配列で開始コドンと少なくとも一つの終止コドン、および少なくとも一つの分泌主導またはシグナルが含まれることが望ましい。クローンＫの転写および翻訳に必要な他の要素には、ベクターを使用する方法論について記載された科学的文献が追加されているかもしれない。真核細胞および原核細胞に適したベクターの一般的なアプローチの仕方、さまざまなクローニングの実例およびベクターに組み込まれた挿入遺伝子の発現は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ１−４，７，１４−１７（２００１）に述べられている。酵母ベクターは、酵母の人工的染色体ベクターとして、たとえば、Ｂｕｒｋｅｅｔａｌ．がＳｃｉｅｎｃｅ２３６：８０６（１９８７）に記載している。
輸血に関連した遅発性の非Ａ−Ｇ肝炎に有用な抗Ｋ抗体テスト
上記の免疫アッセイの結果は、明らかに、非Ａ−Ｇ肝炎に特異的なマーカーとしてのクローンＫに対する抗体が免疫診断方法として有用性であることを示している。このように、Ｋポリペプタイドは、非Ａ−Ｇ肝炎の診断に値する少なくとも一つのエピトープを所有している。ここに公開された結果に基づき、非Ａ−Ｇ肝炎の診断に有効なエピトープまたは、Ｋポリペプタイドのエピトープは、非Ａ−Ｇ肝炎のある比率における免疫反応性の陽性率が、一般の献血ポピュレーションの無作為な血液ドナーにおけるそれよりも高いことであると定義されるかもしれない。クローンＫが単離されたファージライブラリーを構築するために使用されたプール血清は、完全に人由来であった。したがって、クローンＫは人に限定された宿主をホストとする原因物質に由来すると考えるのが可能である。急性輸血関連肝炎の頻度は、ほとんどゼロに近づきつつあり、ほとんど輸血のエピソード一回当たり、０．５％以下であるとＶｏｘ−Ｓａｎｇ６７：Ｓｕｐｐｌ３１９（１９９４）で、Ａｌｔｅｒは述べている。しかしながら、長期的な研究では、以前輸血関連肝炎と診断された生存者の１２９例のうち３０％は、Ａ、Ｂ、ＣおよびＧ型肝炎ウイルスには関連していないことが示された。このことは、慢性の非Ｂ−Ｃ肝炎、おそらく遅発型の非Ａ−Ｇ肝炎の、慢性期に当たる患者において、ほかの現在同定されていない原因物質が存在することを示している。（ＳｅｅｆｆＬｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３３：４５５（２００１））以下に示すように、（実施例３における表４）ＡＬＴが上昇しているが、ＨＣＶ−ＲＮＡおよびＨＢＶ−ＤＮＡ陰性の４０例のドナーのうち１２．５％は、プラーク免疫スクリーニング法で抗Ｋ抗体が陽性であった。さらに、下記の（実施例３における表４）ように、維持透析をうけている患者の研究では、１００例の輸血歴のある患者のうち１０％はプラーク免疫スクリーニング法で、抗Ｋ抗体陽性であったのにくらべ、輸血歴のない７２例では、わずか２．８％が同方法で抗Ｋ抗体陽性であった。さらに、イタリーおよびドイツにおいて実施例３の表５に示すように、それぞれ複数回輸血をうけた患者の１３例中２３．１％および３８例中１０．５％が、同方法で抗Ｋ抗体陽性であった。
輸血関連非Ａ−Ｇ肝炎を予防するための献血に対する抗Ｋ抗体テストの有用性
輸血と抗Ｋ抗体の間の密接な関係は明らかに、上に示された。さらに実施例３の表３に示されたようにＡＬＴ正常の日本人の血液ドナー６０例の１．７％（１例）は、ＨＢＶ−ＤＮＡおよびＨＣＶ−ＲＮＡ陰性で抗Ｋ抗体陽性であった。また、実施例３の表５に示されたように１５６例のイタリーの健常コントロールのうち４例（２．７％）は抗Ｋ抗体陽性であった。さらに興味深いことにブラジル、チェコスロバキア、ドイツでは、表５に示すように、血液ドナーにおいて、同プラーク免疫スクリーニング法による抗Ｋ抗体陽性率は、より高く、１２．５％位が陽性と観察された。これらの証拠は、血液ドナーに対する抗Ｋ抗体テストは、クローンＫ関連非Ａ−Ｇ肝炎の伝播を予防するために有効であるに違いないことを示している。
慢性非Ａ−Ｇ肝炎の診断に有用な抗Ｋ抗体テスト
１９９８年には、慢性肝炎、肝硬変、原発性肝臓癌に罹患した６３３名の患者が、表１に示すように出願人のクリニックを受診した。これらの患者の肝臓の組織学的所見は慢性ウイルス性肝炎に矛盾のない例である。そのうち１３．４％に当たる８５名には、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子はＰＣＲ法で検出されなかった。したがって、これらの８５名には慢性非Ｂ非Ｃ肝炎、既知の肝炎ウイルスのうちＢ型とＣ型肝炎ウイルスだけが慢性肝炎を引き起こすことがわかっているので慢性非Ａ−Ｇ肝炎と命名してもいいかもしれないが、または慢性の原因不明肝炎の可能性がある。肝硬変および原発性肝臓癌患者では、表１に示すように、抗Ｋ抗体の陽性率が慢性肝炎の患者におけるそれよりも高いことは、注目されるべきことである。
急性非Ａ−Ｇ肝炎の診断に対する抗Ｋ抗体テストの有用性
既知の肝炎ウイルス、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、急性肝炎を引き起こすことができる。それらのうち、Ｄ型肝炎ウイルスは、その複製のためにＢ型肝炎ウイルスを必要とするし、Ｅ型肝炎ウイルスは限られた地域にしかみられない。急性肝炎が流行する場合、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎ウイルスは通常同定されうる。しかしながら、Ｓｃｈｉｆｆが上記のＳｃｈｉｆｆｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ７１９−７２４に記載するように、肝臓病の約１７％は説明がつかず現在でも原因不明の肝炎あるいは病因不明の肝炎、非Ａ−Ｅ肝炎、非Ａ−Ｇ肝炎または、Ｅ型肝炎がごくまれにしかみられない地域では、非Ａ−Ｃ肝炎と呼ばれてきた。下記の表５に示すように、プラーク免疫スクリーニング法による抗Ｋ抗体は、非Ａ−Ｇ肝炎および急性期の急性非Ａ−Ｃ肝炎患者の６．７から２７．６％にみられる。ヒト免疫グロブリンに対する二次抗体は、ヒトＩｇＧ抗体に対する免疫グロブリンとヒトＩｇＭ抗体に対する抗体が含まれているので、ヒトＩｇＭ抗体に対して高タイターの二次抗体を使用すれば抗Ｋ抗体陽性の率は急性非Ａ−Ｇ肝炎で、さらに増加する可能性がある。
抗Ｋ抗体テストのための酵素抗体法
さらに別の態様により、今回の発明であるＫポリペプタイドをマイクロタイタープレートのウェルにコートし、古典的な酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）において、サンプルと反応させ洗浄した後に酵素標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を添加することにより測定されうる。固相化の方法としては、放射状パーティションクロマトグラフィーにおいてグラスファイバーも利用できる。検出は、慣例的に最適な基質／色素反応物質を添加することにより行うことができるし、結果的な産物は測定できる。一般的なＥＬＩＳＡの議論については、Ｂｅｌａｇｅｒｅｔａｌ．，ＫｌｏｔｚａｎｄＮｏｔｅｒｍａｎｓ，Ｌａｎｇｏｎｅｅｔａｌ．ｅｄｓ，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐａｒｔＤ：ＳｅｌｅｃｔｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ８４：１９−３１，１９４−２０１ａｎｄ２２３−２３８，（１９８２）のそれぞれを参照のこと。
抗Ｋ抗体検出のためのほかの方法
今回の発明のポリペプタイドに応用できる互換性のある検出方法には、上記に記載され、ウエスターンブロット法に限らず、Ｔｏｗｂｉｎらが引用したＴｏｗｂｉｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ７６：４３５０（１９７９）；ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ，ｐａｇｅｓＡ９．２９−Ａ９．３０（２００１）；ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅａｓｓａｙｓ，Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，ＣｌｉｎＢｉｏｃｈｅｍ２１：１３９（１９８８）；ｎｏｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅａｓｓａｙｓ，Ｔｈｏｍａｅｔａｌ．，ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ１２３：６１３（１９８２）；ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，Ｔｏｊｏｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣｈｅｍ３４：２４２３（１９８８）；ｄｏｔｂｌｏｔｓ，Ｊａｈｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８１：１６８４（１９８４）；そしてｐａｒｔｉｃｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ法（ＰＣＦＩＡ），Ｊｏｌｌｅｙｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈ６７：２１（１９８４）などがある。
Ｋ核酸およびＫポリペプタイドの化学的合成
別の態様として、クローンＫの核酸およびその断片のみならず、Ｋポリペプタイドの配列およびその断片は化学的によく知られた方法により合成可能である。化学的な合成方法の総説としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ１０．４２−１０．４６（２００１）ａｎｄＩｔａｋｕｒａｅｔａｌ．，ＡｎｎＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ５３：３２３−３５６（１９８４）を参照のこと。合成したい配列のポリペプタイドは、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−ＢｉｏｓｅａｒｃｈＭｏｄｅｌ９６００ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｓのような商業化され利用できうる自動ポリペプタイド合成機により化学的に合成できる。
非Ａ−Ｇ肝炎に対するワクチン開発のためのＫポリペプタイドの有効性
Ｋポリペプタイドおよびその断片は、予防に有効なワクチン、慢性非Ｂ非Ｃ肝炎および急性非Ａ−Ｇ肝炎の改善および治療のための、潜在的な有効性を持っている。下記の実施例３に記載されたように、その抗原決定基およびＫポリペプタイドに代表される抗原決定基は慢性非Ｂ非Ｃ型肝炎と急性非Ａ−Ｇ肝炎の血清に存在する抗体と反応することが示されている。したがって、Ｋポリペプタイドまたはその断片が、もし必要なら適切なキャリアー巨大分子と結合させることにより、非Ａ−Ｇ肝炎に特異的な免疫反応をヒトにそのようなポリペプタイドを免疫することにより惹起させることが可能である。Ｔａｍ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８５：５４０９（１９８８）ａｎｄＨｕｄｅｃｚｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ．１０：７８１（１９９９）を参照のこと。Ｋポリペプタイドまたは適切な断片は、ポリペプタイドとしても、あるいは融合蛋白の部分として、リコンビナントベクターに発現させて得ることもできれば、化学的に合成することも可能である。Ｋポリペプタイドに代表される病因物質に直接向けられた免疫応答を惹起するために、ポリペプタイドあるいは融合蛋白は薬理学的によく知られた技術をもちいてヒトに投与可能である。
非Ａ−Ｇ肝炎の受動免疫療法の開発のためのＫポリペプタイド
Ｋポリペプタイドは、よく知られた方法、あるいは材料を使用して受動免疫療法の一部として機能するように制御するために使用できるかもしれない。たとえば、Ｋポリペプタイドあるいはその断片は、Ｋポリペプタイドに代表される病因物質に対する直接的な抗体としての、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の作成に使用できる可能性がある。そのような抗体あるいは免疫反応部分は部分的に、薬理学的に使用可能なキャリアーとともにヒトの血液中に直接注入することにより、Ｋ抗原に対する免疫を誘導するのに使用できる。受動免疫に関する理論的根拠は、注入された抗体が、患者の内因性の免疫システムには依存せずに、その疾患を引き起こす病因物質に結合し、不活化を助長し助け、除去するというものである。受動免疫は、少なくとも病因物質の広い陣容に対して、一過性の免疫として有効であるとされている。例えば、モノクローナル抗体を用いた受動免疫は、いくつかのウイルスに関して有効であることが知られている。Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｌａｓｋｅｙｅｄ．，ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＶａｃｃｉｎｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐａｇｅｓ１１−２０（１９８８）を参照のこと。同様に、ポリクローナル抗体を使用した受動免疫はサルの免疫不全ウイルスおよびヒトの免疫不全ウイルスＩＩに有効であることが知られている。Ｐｕｔｋｏｎｅｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２：４３６（１９９１）参照のこと。
Ｋポリペプタイドを標的としたモノクローナル抗体
ポリペプタイドをスタート材料とした、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作成する方法は、様々な科学的論文により確立されている。たとえば、Ｋポリペプタイドで免疫された個体の免疫グロブリン分画は、固相化されたＫポリペプタイドを含むカラムで親和性により精製されうる。このことは、Ｋポリペプタイドに対するポリクローナルな抗体の作成を可能にする。同様に、Ｋポリペプタイドは、分泌型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作ることも可能である。そのようなハイブリドーマは、制御可能で分泌型モノクローナル抗体が、よく知られた方法により、単離され精製されうる。Ｋｏｈｌｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３：１２８１（１９８６）参照のこと。
患者血清または組織におけるクローンＫ関連核酸の検出に使用できるプローブ
公開されたクローンＫの核酸配列は、核酸ターゲットを利用した種々のアッセイ方法において有用である。例えば、クローンＫの核酸配列は、患者血清または組織におけるクローンＫ関連核酸の存在を検出するプローブとして使用できるかもしれない。クローンＫの配列あるいはその断片は、適切な放射性タグ（たとえば^３２Ｐ）でラベルしたり、適切な非放射性タグ（たとえばビオチン）でラベルして、患者血清あるいは組織由来の、増幅のためには、患者血清あるいは、増幅したあるいは非増幅核酸とハイブリダイゼーションさせることが可能である。患者血清あるいは組織由来の核酸の増幅には、よく知られた増幅システムが使用できるであろう。例えば、公開されたクローンＫの核酸配列に基づくプライマーにより、患者血清あるいは組織から抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡ由来の相補的ＤＮＡを鋳型にすることにより、ポリメラーゼチェインリアクション（以下ＰＣＲ）で増幅されうる。ＰＣＲを実施するための様々なステップは、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ｐａｇｅｓ８．１−８．１２６（２００１）に記載されている。
クローンＫ関連非Ａ−Ｇ肝炎のＫ核酸配列検出のためのｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法
増幅されたあるいは非増幅核酸のハイブリダイゼーションは組織内でも遂行することが可能であり、抽出された核酸でも可能である、そして液体シンチレーションカウンターあるいはオートラジオグラフィあるいは、適切な非放射性タグを用いた検出方法でも可能である。核酸ハイブリダイゼーションの技術的な総説として上記、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ，ｐａｇｅｓ９．３５，９．７３−９．８１ａｎｄ１０．１−１０．１０（２００１）を参照のこと。図２Ａに公開された核酸配列に相応するＲＮＡ配列は、最適な条件下でＲＮＡプローブの利用も最適な技術を利用した方法により可能である。
クローンＫの標準的な部位特異的突然変異法および他の方法
全長にわたるクローンＫの配列、またはそのほかの標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出できる適切な診断に有用な断片は、上記の核酸ハイブリダイゼーションに使用できる。同様に、すでに準備されたクローンＫの配列が、標準的な部位特異的突然変異法あるいは他の方法により変更されうるということは、理解できることである。Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ，ｐａｇｅｓ１３．２−１３．１０（２００１）を参照のこと。突然変異の多様性を示す非Ａ−Ｇ肝炎と関連したクローンＫと関連する病因を検出するのに有用なプローブの陣容を提供しているといえる。たとえば、多くのＲＮＡウイルスは高率に多様性があるということはよく知られている。そしてそのような変異株の適切な検出に適したクローンＫ関連の配列を提供することは、上に示されたよく知られた方法を使用することが必要であるだろう。一般的に、公開されたクローンＫにハイブリダイズできる核酸配列は、つぎのような条件で洗浄することで可能である。すなわち、完全にマッチしたＫとＫのハイブリッドのＴｍ値という計算された融解温度よりも約２０から３０℃低い温度で塩濃度との組み合わせの条件で洗浄の条件を低から中等度にするという条件である。これについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，の上記文献のｐａｇｅｓ１０．２−１０．６ａｎｄ１０．４７−１０．４８（２００１）を参照のこと。そしてこの洗浄条件をゆるめることは、クローンＫに代表される診断的プローブの潜在的有用性をもつことになるだろう。
Ｋ核酸のコドンの第３番目の位置の核酸を変更した核酸配列とＫポリペプタイドのマイナーチェンジ
公開されるクローンＫの塩基配列は、コードするアミノ酸の配列を変更せずに、似たような方法で、その核酸配列の第３番目の位置の核酸を変更することができる。上記Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，のｐａｇｅ１５．１２（２００１）を参照のこと。一方、アミノ酸配列においても、例えば、置換、付加および欠失といったマイナーチェンジをしても、その測定の能力に明らかな悪影響を与えない可能性がある。なぜならば、その抗原決定基またはクローンＫに代表されるＫポリペプタイドの抗原決定基は、Ｋ病原因子の測定系においてそのような変更されたポリペプタイドが免疫的診断能力を破壊しない程度であれば、変化しないからである。そのようなわけで、ポリペプタイドと対応する抗原決定基、それは構造上のマイナーチェンジをもつものであるが、実質上は、公開されるクローンＫの核酸配列がコードするポリペプタイドあるいは抗原決定基の厳密に相同性があるポリペプタイドあるいは抗原決定基と、同じ、あるいは同等のものと考えられる。
診断的有用性を増加させるために、Ｋ核酸配列を伸張させること
公開されるクローンＫの配列に対応する核酸配列の近傍の遺伝子配列に代表される付加的核酸は、標準的な方法を用いることにより、容易に得ることができる。Ｋ配列の５′側であれ、３′側であれ、そのような核酸配列は、公開されるクローンＫの診断的有用性を増加させ得る。または、核酸プローブとして別個の有用性も考えられる。さらに付け加えるに、そのような核酸配列は、公開されるＫポリペプタイドの診断的有用性を増加させるアミノ酸配列をコードする可能性がある。または、そのような核酸配列が、非依存性の免疫診断有用性をもつ付加的な非Ａ−Ｇ肝炎の抗原決定基をコードする可能性もある。そのような近傍の核酸配列を同定したり単離する方法（遺伝子のクローリング、あるいはウオーキングと呼ばれる）は、よく知られた技術により可能である。近傍の核酸配列を同定したり単離するさまざまな方法の総説としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの前述の文献ｐａｇｅｓ４．８−４．１０ａｎｄ１３．１５−１３．１８（２００１）を参照のこと。例えば、上記の文献に引用され下記に記述する例に述べられたλｇｔ１１ライブラリーは、公開されたクローンＫの配列の５′側あるいは３′側の部分に特異的なオリゴヌクレオタイドプローブによって再度スクリーニングすることで、上記のような近傍の核酸配列が同定あるいは単離される可能性がある。そのような場合には、オリジナルの公開されるクローンＫとオーバーラップするクローンが単離される可能性もあるし、クローンＫの近傍の核酸配列を含むこともあるであろう。または、公開されるクローンＫの核酸配列をもとにしたオリゴヌクレオタイドは新しいｃＤＮＡライブラリーのプライマーとして使用される可能性もあり、そのライブラリーからクローンの近傍の核酸配列を含むクローンが単離され得る。
今回の発明は、以下の例に、それらは今回の発明の限られた展望に制限される訳ではないが、詳述されている。
図面の簡単な説明
第１図は、プラーク免疫スクリーニングの結果を示す。
第２図は、ウエスターンブロティングによるａｎｔｉ−Ｋ抗体の同定結果を示す。
実施例
実施例１
クローンＫの単離とＤＮＡの性格付け
ＮＹＣＯＭＥＤＰＨＡＲＭＡＡＳＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｏｓｌｏ，ＮｏｒｗａｙのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐをもちいて分離された末梢血単核球をプールして準備されたｃＤＮＡライブラリーのプラーク免疫スクリーニングを通して、慢性非Ｂ非Ｃ肝炎患者から得られた血清と反応するファージクローンが、以下のような方法により同定された。
ステップ１
１０ｍｌの末梢血が、１ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐに重層され、Ｔｉｎｇらの方法により単核球が得られた。（参考文献：Ｔｉｎｇｅｔａｌ．，ＶｏｘＳａｎｇ２０：５６１（１９７１））そして、ＲＮＡは販売会社の指示書により抽出された。同様に血漿および血清のＲＮＡは、ＧＩＢＣＯＢＲＬ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）のＴＲＩＺＯＬ−ＬＳを使用することにより抽出された。
ステップ２
ｃＤＮＡへの変換および二本鎖ｃＤＮＡライブラリーの構築には、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＣｈｏｉｃｅＳｙｓｔｅｍが使用された、ＥｃｏＲＩアダプターリンカーを結合した後、そのｃＤＮＡはλｇｔ１１アーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に結合させ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩＧｏｌｄにより、ｉｎｖｉｔｒｏｐａｃｋａｇｉｎｇを行い、ファージとして活性化させた。結果的に、約１０００万個のファージライブラリーが得られ、そのうち約６６％は挿入部分があるファージ（いわゆるリコンビナントファージ）であった。
ステップ３
大腸菌株Ｙ１０９０を５０μｇ／ｍｌアンピシリン，０．２％ｗ／ｖマルトースａｎｄ１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＬＢブロス培地で１００ｍｌ培養し、６００ｎｍの波長で吸光度０．５まで培養を継続した。その大腸菌は遠心によりペレットとして回収し、氷冷した１０ｍＭ硫酸マグネシウムの９．２ｍｌに懸濁した。
５０，０００プラーク形成単位のバクテリオファージを３００ｍｌのＳＭ緩衝液と、４５０ｍｌの上記の細菌懸濁液に混ぜ、３７℃１０分間１５０／分の回転で緩やかに混ぜた。つづいて、チューブを４７℃にて暖め、９ｍｌのトップアガロース（０．７５％ｗ／ｖのアガロースとアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢｂｒｏｔｈ）をそれぞれの大腸菌とファージを含んだチューブに加えた。チューブはそれから、直径１５０ｍｍのアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含んだＬＢアガープレートに注ぎ、固体にさせ、４２℃で逆さまの状態で培養した。おおよそ、３時間の後ファージの増殖に伴いプラークが見えるようになる。それから、イソプロピル・チオ・β・ガラクトサイドの低濃度の溶液にあらかじめ浸して、乾かしたニトロセルロース膜（径１３７ｍｍ）をそのプレートの上にかけて、さらに３７℃で３時間培養した。そして、膜は方向が判別できるようにインクつきの針でマークをした。それから、その膜は剥がされ、蒸留水で洗われ、そして、乾燥された。乾燥された膜を２％の無脂肪乾燥ミルクを含んだＴＢＳ緩衝液（０．１ＭＴｒｉｓｐＨ７．４，０．５ＭＮａＣｌ，０．１％ｗ／ｖＮａＮ_３）でブロッキングするために、１５分から６０分室温で反応した。
ステップ４
慢性非Ｂ非Ｃ肝炎のあることが疑われる５人の血漿あるいは血清（それぞれ１０ｍｌ）はプールされ、同量の大腸菌Ｙ１０９０溶解液であらかじめ吸収された。その溶解液は、４リットルの培養で得られたその大腸菌のペレットを３回にわたりホモゲナイゼーションすることで得られたものである。その大腸菌溶解液と血清あるいは血漿の混合液は、１０分間７１００Ｇで遠心され、その約４ｍｌの上清（非処置のプール血漿の１０ｍｌに相当する量である）は、５％の無脂肪乾燥ミルクを含む１倍のＴＢＳ液９６０ｍｌで希釈された。
ステップ５
ステップ３の膜のミルク／ＴＢＳ液を吸引で取り除き、ステップ４の処理後の抗体と膜を反応させた。膜は抗体液と室温で一晩ゆっくり振盪させながら反応させた。抗体溶液は吸引により取り除き、膜は３０分間づつ６回ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎを交換して洗浄した。そして、西洋馬鈴薯ペロキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ（Ｃａｐｐｅｌ／ＩＣＮ社）を１倍のＴＢＳで２％の非脂肪乾燥ミルクを含む液体で３５００倍に希釈し、膜はこの二次抗体溶液それぞれ２０ｍｌのなかで２．５時間室温で反応させられた、そして前回と同様に６回ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎを交換して洗浄された。最後の洗浄の後基質液、５００μｇ／ｍｌｏｆ４−ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａｐｈｔｏｌ（Ｓｉｇｍａ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．５，１５０ｍＭＮａＣｌ溶液が添加され、約２−７分後に反応したプラークの濃い発色が得られるまで反応された。その発色反応は蒸留水で洗浄することで停止された。
反応したプラークは、濃い青い円形の約１ｍｍ直径の、しばしばドーナツ様の外観を呈し、同定された。１つのクローンは、クローンＫと後になるクローンであるが、非Ｂ非Ｃ肝炎患者のプール血清と反応することが判明した。このバクテリオファージは膜上での配置からもとのバクテリオファージのアガロースプレートから、広径のパスツールピペットを用いてアガロースの層ごとプラグとして打ち抜くことで拾い上げられた。そのプラグに含まれたファージは、一晩４℃で１ｍｌのＳＭバッファーで５０マイクロリットルのクロロホルムを含む溶液に懸濁する事により溶出された。そのバクテリオファージクローンは引き続いてプラーク免疫スクリーニングを上記のように三回繰り返すことで、増殖され精製された。
図１（Ｃ）に示されたように、クローンＫのリコンビナントのλｇｔ１１と同量の野生型（非リコンビナント）のλｇｔ１１とを同量混合して、上記のように発現ののち膜にそのポリペプタイドをブロットした膜は、２×３ｃｍに切断され、抗Ｋポリペプタイド抗体の検出（プラーク免疫スクリーニング法）に使用された。下記に述べるような慢性肝炎Ｂ、Ｃおよび非Ｂ非Ｃ肝炎、さらに血液ドナー、維持透析の患者、多数回の輸血を受けた患者の血清中の抗体の有無は、このプラーク免疫スクリーニング法で検討され、表２、３、４および５に示されている。
実施例２
クローンＫのＤＮＡとそのコードするアミノ酸配列
クローンＫのファージに含まれる挿入されたＤＮＡ配列を検討するために以下のステップが行われた。
ステップ１
プラーク免疫スクリーニングにより選別されたファージクローンＫから得られたリコンビナントＤＮＡの挿入部分は、ｇｔ１１のＥｃｏＲＩｓｉｔｅ近傍のプライマーとして、順方向ＧＧＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧ，と逆方向のＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＧ，の二つのプライマーにより増幅された。その増幅されたＤＮＡは、順方向のプライマーにより、ＡＢＩＰＲＩＳＭＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）をもちいてラベルされた。そのラベルされたＤＮＡは、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０で電気泳動され、ＳｅｑｕｅｎｃｅＮａｖｉｇａｔｏｒＳｏｆｔｗａｒｅ（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）により解析された。
上記の方法により決定されたクローンＫのリコンビナントＤＮＡ配列は、それがコードするアミノ酸配列が演繹され、下記の図２に示されている。その配列には古典的なＮ−関連または、Ｏ−関連のグリコシール化部位は含まれていない。
このＤＮＡの解析とそのコードする蛋白の配列は、科学的文献または特許出願されたものに報告されたＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、およびＧ型肝炎ウイルスの塩基配列と有意のホモロジーは見いだせなかった。また、同様に、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、およびＧ型肝炎ウイルスのアミノ酸レベルでのホモロジーも出版された文献、上記の有馬らの特許出願の文献でも見いだせず、２００１年１２月７日付けのＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースでも、ホモロジーのある塩基配列の報告はみられなかった。
実施例３
ヒト血清における抗Ｋ抗体の検出のためのプラーク免疫スクリーニング法
クローンＫ抗原は、急性非Ａ−Ｇ肝炎患者、慢性非Ｂ非Ｃ肝炎（非Ａ−Ｇ肝炎と同義）、維持透析患者、頻回の輸血歴のある患者からの血清において、その免疫的反応性がプラーク免疫スクリーニング法で検討された。慢性Ｂ型肝炎、慢性Ｃ型肝炎そして健常人の血清は、コントロールとして、そのテストに含まれていた。
プラーク免疫スクリーニングのために、プラークとして発現されたクローンＫのポリペプタイドは、ニトロセルロース膜に転写され固相化された。そしてその結合蛋白は、固相化された蛋白に対する抗Ｋ抗体として結合することのできる条件で血清中の抗Ｋ抗体がテストされた。抗Ｋ抗体の結合は、酵素ラベルされた抗体のシグナルにより検出された。そのシグナル抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体から成るものである。図１（Ｃ）に示すように、西洋わさびに対する適切な色素基質との反応によって、目に見える指標として抗Ｋ抗体の存在または、非存在を個別の患者由来の検体で判別できる。この免疫診断方法において、固相化されたＫポリペプタイドとシグナル抗体とに挟まれた患者の抗Ｋポリペプタイド抗体の存在を意味している。一方、抗Ｋポリペプタイド抗体陰性の例は、抗原と抗体の結合による複合物が形成されず、色素反応がバックグラウンド以上に検出されなかったことを意味していている。
下記の表２、３、４および５に示すように、抗原決定基あるいはＫポリペプタイドに代表される抗原決定基は、慢性非Ｂ非Ｃ肝炎、結果的には急性非Ａ−Ｇ肝炎、そして特に血液ドナーのスクリーニングテストで、著しい診断的有用性を持っている。出願人のクリニックでは、慢性非Ｂ非Ｃ患者の２５例（７２％）が、プラーク免疫スクリーニング法でテストしたところＫポリペプタイドに対して反応する抗体が検出され、その抗体を保有していた。対照的に慢性Ｂ型肝炎の３０例、慢性Ｃ型肝炎の１１０例のうち２例（１．８％）が、その検出できる抗Ｋ抗体を保有していた。付け加えれば、慢性Ｃ型肝炎で陽性であった後者の２例には輸血歴があったことは強調されるべきであろう。

その後、日本人の一般ポピュレーションにおける抗Ｋ抗体の存在を調べる目的で、無作為な血液ドナー（ＨＢＶ−ＤＮＡ，ＨＣＶ−ＲＮＡ，ＨＩＶ−ＲＮＡａｎｄＨＴＬＶ−１−ＲＮＡ陰性）を上記のプラーク免疫スクリーニングでテストした（表３）。ＡＬＴ（ＧＰＴ）が基準値内の血液ドナー６０例のうち、ただ１例（１．７％）が抗Ｋ抗体陽性であった。一方これに反して、ＡＬＴ（ＧＰＴ）が基準値を超えた血液ドナー４０例では５例（１２．５％）という有意な数が抗Ｋ抗体陽性であり、このことは、外因性のＫ抗原が無症状の一般ポピュレーションにおいて、感染に関連していることを示唆している。

上記に記載されたように、抗Ｋ抗体陽性に関連した肝炎は、輸血で伝播されるように思われ、血液で伝播する疾患のハイリスク集団であると考えられる維持透析を受けている１７２例の患者について、抗Ｋ抗体の有無をプラーク免疫スクリーニング法で検査した。（表４）維持透析の患者は、日本の血液センターが第一世代の抗ＨＣＶ抗体テストを開始した１９９０年以前に血液透析を開始した６９例のグループと、その１９９０年以降に血液透析が開始された１０３例の２群に分けて検討された。さらに輸血歴により抗ＨＣＶテストの影響で現在の抗Ｋ抗体の有無とその血清中のＨＣＶ−ＲＮＡの有無から、さらに分類された。対象患者はＨＢＶ−ＤＮＡとＨＣＶ−ＲＮＡが検討された。対象患者は前例ＨＩＶ−ＲＮＡおよびＨＴＬＶ−ＩＲＮＡ陰性であった。２例の患者、１例は１９９４年に透析を開始し輸血歴もない例、もう１例１９７５年に透析を開始して輸血歴のある１例は、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ陽性で抗Ｋ抗体およびＨＣＶ−ＲＮＡ両者陰性であった。血清ＡＬＴ（ＧＰＴ）が異常に上昇している６例のうち２例はＨＣＶ−ＲＮＡ陽性であったが、いずれも抗Ｋ抗体は陰性であった。全症例中１３例のＨＣＶ−ＲＮＡキャリアーのうち１例のみが抗Ｋ抗体陽性であり、肝炎ウイルスＣと抗Ｋ抗体関連肝炎の重感染はまれであることを示唆していた。輸血歴のある１００例のうちそれぞれ、１０例（１０％）が抗Ｋ抗体陽性で、１２例（１２％）がＨＣＶ−ＲＮＡ陽性であった。一方、７２例の輸血歴のない症例では、それぞれ、２例（２．８％）が抗Ｋ抗体陽性で、１例（１．４％）がＨＣＶ−ＲＮＡ陽性であった。この知見は肝炎ウイルスＣが血液で伝播することがよく知られているのと同様に、抗Ｋ抗体関連肝炎が血液伝播であることを示唆している。輸血歴のある患者において献血血液に抗ＨＣＶ抗体テストが導入されたことにより、ＨＣＶ−ＲＮＡ陽性患者が１０／５３（１８．９％）から２／４７（４．３％）に減少させている。逆に抗Ｋ抗体陽性例は、同期間に、９．４％から１０．６％にわずかに増加している。さらに、全患者でみると、ＨＣＶ抗体テストの導入により、ＨＣＶ抗体陽性の患者の比率は、１５．９％から１．９％に減少したのに比べ、抗Ｋ抗体陽性の率は、８．７％から５．８％にわずかに減少したことをみても、ＨＣＶの伝播と抗Ｋ抗体関連肝炎病原物質との間の関連はきわめてまれな相関関係であるということを示唆している。

プラーク免疫スクリーニング法により抗Ｋ抗体の世界的な分布が、日本（表２、３及び４）、台湾、韓国、ブラジル、ドイツ、イタリー、ギリシャ、そしてチェコの研究者らから提供された血清サンプルで検討され、下記に示すような結果であることが確かめられた（表５）。台湾の急性期の非Ａ−Ｇ急性肝炎の２９例のうち８例（２７．６％）が抗Ｋ抗体陽性であった。この陽性率の上昇は、これらの患者が回復期にあることが予想される。また、慢性の非Ｂ非Ｃ肝炎での抗Ｋ抗体は、イタリーの１２例のうち２例（１６．７％）、ドイツの２１例のうち７例（３３．３％）でも検出された。頻回輸血患者では、イタリーの１３例のうち３例（２３．１％）で、ドイツの３８例のうち４例（１０．５％）が、抗Ｋ抗体陽性であった。さらに、ドイツの６４例の血液ドナーでは、８例（１２．５％）が陽性で、イタリーの１５６人の健常人のうち４例（２．７％）が抗Ｋ抗体陽性であった。これらの知見は、とくに肝臓病患者と頻回輸血患者、さらに血液ドナーおよび健常人での、抗Ｋ抗体陽性のポピュレーションが世界的に分布していることを示している。上記のようにＳｊｏｇｒｅｎｅｔａｌ．，Ｃｈａｎｅｔａｌ．，Ｒｉｚｚｅｔｏｅｔａｌ．，Ｋｒａｗｃｚｙｎｋｉｅｔａｌ．ａｎｄＳｃｈｉｆｆｅｔａｌ．，ｐａｇｅｓ７４５−８６７（１９９８）に記載されたように、既知の肝炎ウイルスは血液ドナーおよび健常人において、検出される。

検体は以下の研究者らの懇意により提供されたものである。
^１Ｄｒ．Ｙｕｎ−ＦｕｎＬｉａｗ，ＬｉｖｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＵｎｉｔ，ＣｈａｎｇＧｕｎｇＭｅｍｏｒｉａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｈａｎｇＧｕｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ，
^２Ｄｒ．ＣｈｒｉｓｔｉａｎＮｉｅｌ，ＤｅｐｔｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，ＦｕｎｄａｃａｏＯｓｗａｌｄｏＣｒｕｚ，ＲｉｏｄｅＪａｎｅｉｒｏ，Ｂｒａｚｉｌ，
^３Ｄｒ．ＶｌａｄｉｍｉｒＳｔｒａｋｒｌｅ，ＤｅｐｔｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｅｓｅａｓｅｓ，ＣｕｓｔｏｄｙＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｒｎｏ，ＣｚｅｃｈＲｅｐｕｂｌｉｃ，
^４Ｄｒ．ＧａｂｒｉｅｌｅＰｏｚｚａｔｏ，ＯｓｐａｄａｌｅＣａｔｔｉｎａｒａ，ＭｅｄｉｃｉｎａＩｎｔｅｒｎａ，Ｔｒｉｅｓｔｅ，Ｉｔａｌｙ，
^５Ｄｒ．ＳｅｒｇｅｉＶｉａｚｏｖ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｆｕｒＶｉｒｏｌｏｇｉｅ，ＵｎｉｋｌｉｎｉｋｕｍＥｓｓｅｎ，Ｅｓｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，
^６Ｄｒ．ＪｏｎｇｙｏｕｎｇＣｈｏｉ，ＤｅｐｔｏｆＩｎｔｅｒｎＭｅｄ，ＣａｔｈｏｌｉｃＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａａｎｄ
^７Ｄｒ．ＡｎｊｅｌｏｓＨａｔｚａｋｉｓ，ＮａｔｉｏｎａｌＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓＲｅｆｅｒｅｎｃｅＣｅｎｔｅｒ，ＡｔｈｅｎｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇｒｅｅｃｅ．
抗原性エピトープ又はエピトープをマッピングするために、Ｋペプタイド（６９残基）の５領域に相当する部分的にオーバーラップした合成ペブタイド：１−２２残基（Ｋ１）、１１−３４（Ｋ２）、２３−４６（Ｋ３）、３５−５８（Ｋ４）及び４７−６９（Ｋ５）を、慢性非Ｂ非Ｃ肝炎患者４０名からの血清を用いてテストした。このテストで用いた酵素免疫法により、Ｋ１及びＫ２のみが、プラークイムノスクリーニングで陽性である２０患者のうちの同じ６名に対して反応した。プラークイムノスクリーイングで陰性だった別の２０患者へはいずれも反応していなかった。さらに４０患者はいずれもＫ３、Ｋ４及びＫ５には反応しなかった。これらの結果は、Ｋペプタイドの１１−２２アミノ酸残基の配列に少くとも１つのエピトープが存在していることを示す。
より精細なエピトープマッピングのために、３分子次いで１分子ずらした直列のアミノ酸１２分子からなるペプチドを用いた研究によって、９−２０番目のアミノ酸配列が少なくとも重要なエピトープのひとつであることが明らかになった。
上述の詳細な記載は、この発明のよりよき理解のためだけに提供されたものであり、その精神と以下に付加する請求権利に逸脱しない熟練した技術によりいくつかの部分的変更が明らかになる可能性があるので、不必要に限定されないと理解されるべきである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１：プラーク免疫スクリーニング
（Ａ）クローンＫ組込みλｇｔ１１が感染した大腸菌を含む細菌学シャーレから取り上げられた膜と慢性非Ｂ非Ｃ肝炎罹患患者血清との反応。膜に結合した抗体は、４−ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａｐｈｔｏｌと酵素の反応により結果的に濃い青のスポットとして検出される。
（Ｂ）野生型の（遺伝子組み替えされていない）λｇｔ１１が感染した大腸菌を含む細菌学シャーレから取り上げられた膜と図１Ａで使用した血清との反応。図１Ａでみられた酵素反応により検出可能な膜に結合できる抗体は検出できない。
（Ｃ）図１Ａで用いられたクローンＫ組込みλｇｔ１１と図１Ｂで用いられた野生型ラムダｇｔ１１が同力価感染した大腸菌の含まれる細菌学シャーレから取り上げられた膜と、図１Ａおよび図１Ｂで用いられた同じ血清との反応。濃い青のスポットと薄い青のスポットが混合した結果を示している。この膜はａｎｔｉ−Ｋ抗体の検出に使用可能である（プラーク免疫スクリーニング法）この免疫診断方法により、陽性の結果は、固相化されたＫポリペプタイドと酵素抗体に挟まれた、Ｋポリペプタイド抗体が患者には存在することを示している。Ａｎｔｉ−Ｋ抗体が無い場合には（結果が陰性のとき）、抗原と抗体と酵素抗体の複合物は形成されず、バックグラウンド以上の色素反応は検出されない。
図２：ウエスターンブロティングによるａｎｔｉ−Ｋ抗体の同定
（Ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより分離された低分子量マーカー（ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐ．，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）とそのゲルのクーマシー・ブリリアント・ブルーによる染色
（Ｂ）近接のレーン（ｌａｎｅＡ）に泳動された、精製および液化されたグルタチオンＳトランスフェラーゼとクローンＫの融合タンパクは、その融合タンパクとして予測された３２ＫＤの分子量であることが明らかとなった。
同じ板で泳動された融合タンパクの他の３つのレーンは、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）の膜に転写し、レーンに沿って切断された。切断された膜（レーンＣ、Ｄ、そしてＥ）は、別個に血清抗体と、順々に反応させた。結合した抗体は、二次抗体の西洋馬鈴薯ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ抗体とそれに引き続く基質の青色を呈する酵素反応により染色された
（Ｃ）プラーク免疫スクリーニング法で陽性であった患者血清と反応させ、ＤＡＢで酵素抗体により発色させたら、予想通りＧＳＴとクローンＫの融合タンパクは、３２ＫＤ付近の単一の茶色のバンドであることを示している。
（ＤおよびＥ）Ｃの横のプラーク免疫スクリーニングで陰性の２つのコントロール血清と反応させたレーンでは茶色のバンドは検出できない。

Claims

配列番号２で規定された核酸配列を含む精製単離されたＤＮＡ分子。
配列番号１に規定されたポリペプタイドの免疫診断的な有用性を保持したポリペプタイドをコードするＤＮＡ配列を含む精製単離されたＤＮＡ分子。
配列番号１に配列を記載し定義されたポリペプタイドをコードするＤＮＡ配列を含む請求項１に記載の精製単離されたＤＮＡ分子。
配列番号１に規定されたアミノ酸配列にある非Ａ−Ｇ肝炎の診断に有効な抗原決定基と実質上同じ抗原決定基を保持するポリペプタイドをコードするＤＮＡ配列を含む精製単離ＤＮＡ分子。
配列番号１に規定されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
配列番号１に規定されたポリペプタイドの免疫診断的有用性を有するアミノ酸配列を含むポリペプタイド。
配列番号１に規定されたポリペプタイドにおける非Ａ−Ｇ肝炎の診断に有用な抗原決定基と実質上同等の抗原決定基を保持するアミノ酸配列を含むポリペプタイド。
配列番号１に規定されたポリペプタイドのアミノ酸配列を含むポリペプタイド。
請求項１のＤＮＡ配列を含むベクター。
請求項３のＤＮＡ配列を含むベクター。
請求項７または８のベクターにより形質転換された宿主細胞。
宿主細胞が原核細胞である請求項９に記載の宿主細胞。
宿主細胞が真核細胞である請求項９に記載の宿主細胞。
請求項９に記載の宿主細胞をポリペプタイドを発現させるために適した条件で培養しポリペプタイドを回収することを含む配列番号１に規定されたポリペプタイドの免疫診断的有用性を有するポリペプタイドを調製する方法。
ポリペプタイドを化学的に合成することを含む、配列番号１に規定されたポリペプタイドの免疫診断的有用性を有するポリペプタイドを調製する方法。
配列番号１に規定されたポリペプタイドの免疫診断的有用性を有するポリペプタイドと患者の血清とを接触させること、及び当該血清が当該ポリペプタイドと免疫反応し得る物質を含むかどうか決定すること、を含む非Ａ−Ｇ肝炎の診断の方法。
血液から血清を分離すること、当該血清と配列番号１に規定されるポリペプチドの免疫診断的有用性を有するポリペプチドとを接触させること、当該血清が当該ポリペプチドと免疫反応し得る構成物を含んでいるかどうかを決定すること、及び当該決定に基づいて血液の分類ならびに取扱うことを含む、輸血用血液の篩い分け方法。
配列番号１に規定されたポリペプタイドの免疫診断的有用性を有するポリペプタイド及び薬学的に許容される担体とを含む、非Ａ−Ｇ肝炎の予防、改善、または治療のためのワクチン。
配列番号１に規定されるポリペプチドに存する非Ａ−ＧＨ診断に利用し得るエピトープと実質的に同じエピトープに対して特異性を有する抗体の抗原結合部位を有する、精製及び単離されたポリペプチド。
ポリペプタイドがモノクローナル抗体である、請求項１６に記載のポリペプタイド。
請求項１６のポリペプタイド及び薬学的に許容される担体を含む、非Ａ−Ｇ肝炎に対する受動免疫用組成物。