ES2176342T5 - Secuencias del genotipo 7 del virus de la hepatitis c y su utilizacion como agentes profilacticos, terapeuticos y de diagnosticos. - Google Patents

Secuencias del genotipo 7 del virus de la hepatitis c y su utilizacion como agentes profilacticos, terapeuticos y de diagnosticos. Download PDF

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS GENOMICOS Y A LAS SECUENCIAS DE AMINOACIDOS CORRESPONDIENTES A LA REGION DE CODIFICACION DE ESTOS GENOMAS. LA INVENCION SE REFIERE A NUEVAS SECUENCIAS DE TIPOS Y SUBTIPOS DE HCV QUE SON DIFERENTES DE LAS SECUENCIAS DE TIPOS Y SUBTIPOS DE HCV CONOCIDAS. EN PARTICULAR, LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVAS SECUENCIAS DEL HCV TIPO 7, NUEVAS SECUENCIAS DEL HCV TIPO 9, NUEVAS SECUENCIAS DEL HCV TIPO 10 Y NUEVAS SECUENCIAS DEL HCV TIPO 11. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A NUEVAS SECUENCIAS DE LOS SUBTIPOS 1D, 1E, 1F Y 1G DEL HCV TIPO 1; NUEVAS SECUENCIAS DE LOS SUBTIPOS 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2K Y 2L DEL HCV TIPO 2; NUEVAS SECUENCIAS DEL SUBTIPO 3G DEL HCV TIPO 3; NUEVAS SECUENCIAS DE LOS SUBTIPOS 4K, 4L Y 4M DEL HCV TIPO 4; A UN PROCESO PARA LA PREPARACION DE LAS MISMAS Y A SU USO PARA DIAGNOSTICOS, PROFILAXIS Y TERAPIAS. EN PARTICULAR, EN LA PRESENTE INVENCION SE PRESENTAN NUEVAS SECUENCIAS ESPECIFICAS PARA LOS TIPOSDE LAS REGIONES DEL NUCLEO, LAS REGIONES E1 Y LA NS5 DE NUEVOS HCV TIPO 7, 9, 10 Y 11, ASI COMO NUEVAS VARIANTES (SUBTIPOS) DE LOS HCV TIPO 1, 2, 3 Y 4. ESTAS SECUENCIAS NUEVAS DE HCV SON UTILES PARA DIAGNOSTICAR LA PRESENCIA GENOTIPOS O SEROTIPOS DEL HCV TIPO 1 Y/O TIPO 2 Y/O TIPO 3 Y/O TIPO 4 Y/O TIPO 7 Y/O TIPO 9 Y/O TIPO 10 Y/O TIPO 11 EN UNA MUESTRA BIOLOGICA. ADEMAS, LA DISPONIBILIDAD DE ESTAS NUEVAS SECUENCIAS ESPECIFICAS PARA LOS TIPOS PUEDE AUMENTAR LA SENSIBILIDAD GENERAL DE DETECCION DEL HCV Y DEBERIA DEMOSTRAR TAMBIEN SU UTILIDAD PARA FINES PROFILACTICOS Y TERAPEUTICOS.

Description

Secuencias del genotipo 7 del virus de la hepatitis C y su utilización como agentes profilácticos, terapéuticos y de diagnósticos.
La presente invención se refiere a nuevas secuencias de genotipo 7 del virus de la hepatitis C (HCV) y a su utilización como agentes profilácticos, terapéuticos y de diagnóstico.
La presente invención se refiere a secuencias genómicas de nucleótidos y secuencias de aminoácidos correspondientes a la zona de codificación de estos genomas. La invención se refiere a nuevas secuencias de tipos y subtipos que son diferentes de las secuencias conocidas de tipos y subtipos de HCV. Más particularmente, la presente invención se refiere a secuencias del tipo 7 de HCV, un procedimiento para prepararlas y su utilización para diagnóstico, profilaxis y terapia.
El problema técnico que subraya la presente invención es proporcionar nuevas secuencias de HCV de los tipos y/o subtipos de HCV desconocidos hasta ahora. Más particularmente, la presente invención proporciona nuevas secuencias de tipo específico de la parte central, de las zonas E1 y NS5 del nuevo tipo 7 del HCV. Estas nuevas secuencias de HCV son útiles para diagnosticar la presencia de genotipos o serotipos del tipo 7 del HCV en una muestra biológica. Por otra parte, la disponibilidad de estas nuevas secuencias de tipo específico puede aumentar la sensibilidad general de la identificación del HCV y podrían demostrar así mismo ser útiles con fines profilácticos y terapéuticos.
Se ha descubierto que los virus de la hepatitis C (HCV) son la causa principal de hepatitis no-A y no-B. Se han determinado las secuencias de los clones de cADN que abarcan el genoma completo de cepas de varios prototipos (Kato y otros, 1990; Choo y otros, 1991; Okamoto y otros, 1991; Okamoto y otros, 1992). La comparación de estas cepas demuestra que la variabilidad en las secuencias del nucleótido se puede utilizar para distinguir por lo menos 2 genotipos diferentes, tipo 1 (HCV-1 y HCV-J) y tipo 2 (HC-J6 y HC-J8), con una homología media del 68% aproximadamente. Dentro de cada tipo, existen por lo menos dos subtipos (p. ej. representados por HCV-1 y HCV-J), que presentan una homología media de aproximadamente el 79%. Los genomas de HCV que pertenecen al mismo subtipo muestran homologías medias de más del 90% (Okamoto y otros, 1992). Sin embargo, la secuencia parcial del nucleótido de la zona NS5 de las cepas HCV-T presentó en su mayor parte el 67% de homología con las secuencias publicadas anteriormente, indicando la existencia de todavía otro tipo de HCV (Mori y otros, 1992). Se han publicado partes de la zona 5' no-traducida (UR),de la parte central, de las zonas de NS3 y NS5 de este tipo 3, estableciendo además distancias evolutivas similares entre los 3 genotipos principales y sus subtipos (Chan y otros, 1992). El tipo 4 se descubrió posteriormente (Stuyver y otros, 1993b; Simmonds y otros, 1993a; Bukh y otros, 1993; Stuyver y otros, 1994b). Además de grupos del HCV del tipo 5 (Stuyver y otros, 1993c; Simmonds y otros, 1993c; Bukh y otros, 1993; Stuyver y otros, 1994b) y del tipo 6 (Bukh y otros, 1993; Simmonds y otros, 1993c). En la Tabla 3 se da una panorámica del estado actual de la técnica con relación a los genotipos del HCV. El sistema de nomenclatura propuesto por los inventores de la presente solicitud ha sido aceptado actualmente por científicos de todo el mundo (Simmonds y otros, 1994).
El objetivo de la presente invención es proporcionar unas nuevas secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del HCV que permitan la detección de la infección por HCV.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar unas nuevas secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del HCV que faciliten la clasificación de los fluidos biológicos infectados en diferentes grupos serológicos.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar nuevas secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del HCV que mejoren la magnitud de la identificación general del HCV.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar nuevas secuencias de HCV, útiles para el diseño de composiciones de vacunas profilácticas o terapéuticas de HCV.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que consiste en anticuerpos producidos contra los polipéptidos codificados por estas nuevas secuencias de HCV, para terapia o diagnóstico.
Todos los objetivos de la presente invención se satisfacen a través de las siguientes formas de realización de la presente invención.
La presente invención se refiere más particularmente a un ácido polinucleico del HCV, que tiene una secuencia de nucleótido que es exclusiva para un tipo o subtipo de HCV no identificado en lo sucesivo, que es distinta de los subtipos de HCV 1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, 2d, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 5a ó 6a, estando dichos subtipos de HCV clasificados en la Tabla 3 por comparación de una parte de la secuencia del nucleótido del gen NS5 que abarca la posiciones 7932 a 8271, mostrándose dicha numeración de aminoácidos en la Tabla 1 y conteniendo dicho ácido polinucleico por lo menos un nucleótido diferente a dichas secuencias conocidas de nucleótidos del HCV o de su complemento. La secuencia de las cepas conocidas del HCV se pueden observar en cualquier base de datos de secuencias de nucleótidos conocidas en la materia (tal como, por ejemplo, en la base de datos de EMBL).
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La presente invención se refiere también a un ácido polinucleico que presenta una secuencia de nucleótidos que es exclusiva por lo menos para uno de los subtipos 7a, 7c ó 7d de HCV, estando dichos subtipos del HCV clasificados según se definió anteriormente.
Se ha de indicar que la diferencia de nucleótido(s) en los ácidos polinucleicos de la invención puede implicar una diferencia de aminoácidos en las correspondientes secuencias de aminoácidos codificadas por dichos ácidos polinucleicos. Una composición según la presente invención puede contener sólo secuencias de ácido polinucleico o secuencias de ácido polinucleico mezcladas con cualquier excipiente conocido en materia de diagnóstico, profilaxis o terapia.
Según una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un ácido polinucleico que codifica una poliproteína que comprende en su secuencia de aminoácidos por lo menos uno de los restos de aminoácido siguientes:
A58, H70, Q71 ó N71, D106, I134, E135, E150, K197, L235, A242, E260 ó K260, L293, 1300, S2646, V2642, Q2653, H2656, K2663, A2667 ó V2667, D2677, I2707, A2709, F2730, L2746, S2749 ó P2749, T2752 ó V2752, D2753 ó G2753,
estando dicha anotación compuesta por una letra que representa el residuo de aminoácido de su código de una letra y un número que representa la numeración del aminoácido según Kato y otros (1980), como se muestra en la Tabla 1, o una parte de dicho ácido polinucleico que es exclusiva del tipo 7 del HCV definido en la Tabla 5 y que contiene por lo menos un nucleótido diferente de las secuencias del nucleótido conocidas del HCV, o de su complemento.
Cada uno de los residuos mencionados anteriormente se pueden observar en la Figuras 2, 4 ó 6 que presentan las nuevas secuencias de aminoácidos de la presente invención alineadas con las secuencias conocidas de otros tipos o subtipos del HCV para la zona central/E1.
Según otra forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un ácido polinucleico que codifica una poliproteína del HCV que comprende en su secuencia de aminoácidos por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista siguiente:
VRHQTGRTWAQ según los subtipos 7a y 7c
(SEC ID nº 115)
VRQNQGRTWAQ según el subtipo 7d
(SEC ID nº 116)
AHYTNKSGLYHL según el subtipo 7c
(SEC ID nº 136)
LNYANKSGLYHL según el subtipo 7d
(SEC ID nº 137)
VYEAETLILHL según el subtipo 7c
(SEC ID nº 153)
VYEANGMILHL según el subtipo 7d
(SEC ID nº 154)
VKXXNQSRCWVQA según el subtipo 7c
(SEC ID nº 172)
VKTGNLTKCWLSA según el subtipo 7d
(SEC ID nº 173)
VPNASTPVTG según el subtipo 7c
(SEC ID nº 188)
VQNASVSIRG según el subtipo 7d
(SEC ID nº 189)
RPRMHQVVQE según el subtipo 7c
(SEC ID nº 205)
RPRMYEIAQD según el subtipo 7d
(SEC ID nº 206)
o una parte de dicho ácido polinucleico que es exclusiva del tipo 7 del HCV según se definió en la Tabla 5 o en su complemento.
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Utilizando el sistema LiPA no codificador de 5' (Stuyver y otros, 1993) y un nuevo sistema LiPA de la parte central que comprende sondas múltiples para los subtipos 1a, 1b, 1c, 2a, 2b ó 2c procedentes de la zona del núcleo (Stuyver y otros, 1995), seleccionaron muestras procedentes del Benelux, Camerún, Francia y Vietnan debido a sus reactividades aberrantes (cepas CAM1078, FR2, FR1, VN4, VN12, VN13 y NE98). Algunas muestras, junto con muchas otras muestras, se secuenciaron como control para tipificación. Los resultados del secuenciado, sin embargo, indicaron el descubrimiento de nuevos subtipos (cepas BNL1, BNL2, BNL3, FR4, BNL4, BNL5, BNL6, BNL7, BNL8, BNL9, BNL10, BNL11 y BNL12). Se analizaron en el marco de la invención las secuencias del nucleótido en zonas centrales y de E1 que no han sido todavía notificadas anteriormente,. Las secuencias genómicas de las cepas subtipo 7a, 7c y 7d se publicaron por vez primera en la presente invención. Se analizó así mismo la zona NS5B.
El termino "ácido polinucleico" se refiere a una secuencia de un ácido nucleico de una o doble hélice que puede contener por lo menos 8 nucleótidos contiguos en común con la secuencia completa de nucleótidos. Un ácido polinucleico de más de 100 nucleótidos aproximadamente de longitud se refiere también con frecuencia como un oligonucleótido. Un ácido polinucleico se puede componer de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, nucleótidos análogos o nucleótidos modificados o se puede haber adaptado con fines terapéuticos. Un ácido polinucleico puede además comprender un clon del cADN de doble hélice que se puede utilizar con fines de clonación o para terapia in vivo o en profilaxis.
Los oligonucleótidos según la presente invención, utilizados como cebadores o sondas además pueden contener o estar compuestos por nucleótidos análogos tales como fosforotioatos (Matsukura y otros, 1987), alquilfosforiatos (Miller y otros, 1979) o péptidos de ácidos nucleicos (Nielsen y otros, 1991; Nielsen y otros, 1993) o pueden contener agentes intercaladores (Asseline y otros, 1984).
Como la mayoría de las demás variaciones o modificaciones introducidas en las secuencias originales de ADN de la invención, estas variaciones necesitarán adaptaciones con respecto a las condiciones en las que se debería utilizar el oligonucleótido para conseguir la especificidad y sensibilidad requeridas. Sin embargo, los resultados eventuales serán esencialmente los mismos a los obtenidos con los oligonucleótidos sin modificar.
La introducción de estas modificaciones puede ser ventajosa para influir positivamente en las propiedades tales como las cinéticas de hibridación, la reversibilidad de la formación del híbrido, la estabilidad biológica de las moléculas de oligonucleótido, etc.
Los ácidos polinucleicos de la invención pueden estar comprendidos en una composición de cualquier clase. Dicha composición puede ser para utilización de diagnóstico, terapéutica o profiláctica.
La expresión "secuencias que son exclusivas para un tipo o subtipo de HCV" se refiere a una secuencia que no es compartida por ningún otro tipo o subtipo de HCV y se puede utilizar por eso para identificar exclusivamente este tipo o subtipo de HCV. La variabilidad de la secuencia se demuestra en la presente invención entre los tipos y subtipos de HCV descubiertos recientemente (véase Tabla 5) y los tipos y subtipos conocidos de HCV (véase Tabla 3) y es por lo tanto a partir de estas zonas de variabilidad de secuencias en particular que se pueden obtener ácidos polinucleicos específicos de tipos o subtipos, oligonucleótidos, polipéptidos y péptidos. El término "específicos de tipos o subtipos" se refiere a que la secuencia es exclusiva para este tipo o subtipo de HCV implicado.
La expresión "nucleótidos correspondientes a" se refiere a nucleótidos que son homólogos o complementarios a una secuencia de nucleótido indicada o a una zona dentro de una secuencia de HCV específica.
El término "zona de codificación" corresponde a la zona del genoma del HCV que codifica la poliproteína del HCV. De hecho, comprende el genoma completo con excepción de la zona 5' no traducida y de la zona 3' no traducida.
El término "poliproteína del HCV" se refiere a la poliproteína del HCV de la cepa HCV-J (Kato y otros, 1990). El resto de adenina en la posición 330 (Kato y otros, 1990) es el primer resto del codón ATG que inicia la larga poliproteína del HCV de 3010 aminoácidos en las cepas HCV-J y de otro tipo 1b y de 3011 aminoácidos en cepas de HCV-1 y de otro tipo 1a y de 3033 aminoácidos en las cepas HC-J6 y HC-J8 del tipo 2 (Okamoto y otros, 1992).
Esta adenina se designa a la posición 1, a nivel del ácido nucleico y esta metionina se designa a la posición 1, a nivel del aminoácido, en la presente invención. Como las cepas del tipo 1a contienen 1 aminoácido extra en la zona NS5A, las secuencias de codificación del tipo 1a y 1b tienen idéntica numeración en la zona central, de E1, de NS3 y de NS4 pero difieren en la zona NS5B como se indica en la Tabla 1. Las cepas del tipo 2 tienen 4 aminoácidos más en la zona E2 y 17 ó 18 aminoácidos más en la zona NS5 comparadas con las cepas de tipo 1 y se diferenciarán en la numeración de las cepas del tipo 1 en la zona NS3/4 y en las zonas NS5b según se indica en la Tabla 1. Inserciones similares comparadas con el tipo 1 (pero de diferente tamaño) se pueden observar también en las secuencias del tipo 3a que afectan a la numeración de los aminoácidos del tipo 3a de acuerdo con esto. Otras inserciones o eliminaciones se pueden observar fácilmente en las secuencias de tipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11 después de la alineación con secuencias conocidas del HCV.
TABLA 1
1
Tabla 1:
Comparación del sistema de numeración de nucleótidos y aminoácidos del HCV utilizado en la presente invención (*) con la numeración utilizada para otras cepas del prototipo. Por ejemplo, 8352/8564 indica la zona designada por la numeración desde el nucleótido 8352 al nucleótido 8564, descrita por Kato y otros (1990). Ya que el sistema de numeración de la presente invención empieza en el sitio de inicio de la poliproteína, los 329 nucleótidos de la zona 5' sin traducir descritos por Kato y otros (1990) se han de sustraer y la zona correspondiente se numera desde el nucleótido 8023 ("8352-329") hasta el 8325 ("8564-329").
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El término "genotipo" utilizado en la presente invención se refiere a ambos tipos y/o subtipos.
El término "tipo de HCV" corresponde a un grupo de cepas de HCV de las que el genoma completo presenta más del 73% , preferentemente más del 74% de homología a nivel del ácido nucleico, o del que la zona NS5 entre las posiciones de nucleótidos 7932 y 8271 muestran más del 75,4% de homología a nivel del ácido nucleico, o que la poliproteína completa del HCV muestra más del 78% de homología a nivel de aminoácidos, o del que la zona NS5 entre aminoácidos en las posiciones 2645 y 2757 muestran más del 80% de homología al nivel de aminoácidos, en poliproteínas de las demás cepas del grupo, comenzando con dicha numeración en el primer codón ATG o en la primera metionina de la larga poliproteína del HCV de la cepa HCV-J (Kato y otros, 1990). Las cepas que pertenecen a diferentes tipos de HCV presentan homologías, en todo el genoma completo, de menos del 74%, preferentemente menos del 73%, al nivel del ácido nucleico y menos del 78% al nivel de aminoácidos. Las cepas que pertenecen al mismo tipo generalmente presentan homologías de aproximadamente el 90 al 99% al nivel del ácido nucleico y del 95 al 96% al nivel de aminoácidos cuando pertenecen al mismo subtipo, y los que pertenecen al mismo tipo pero diferentes subtipos presentan homologías preferentemente de aproximadamente el 76% al 82% (más particularmente de aproximadamente el 77% al 80%) al nivel del ácido nucleico y del 85% al 86% al nivel de aminoácido.
Más preferentemente la definición de los tipos de HCV se concluye a partir de la clasificación de las cepas de HCV según sus distancias al nucleótido calculadas como de detalla a continuación:
(1)
basado en el análisis filogenético de las secuencias del ácido nucleico en la zona NS5B entre los nucleótidos 7935 y 8274 (Choo y otros, 1991) ó 8261 y 8600 (Kato y otros, 1990) ó 8342 y 8681 (Okamoto y otros, 1991), las cepas que pertenecen al mismo tipo de HCV presentan distancias menores de 0,34, típicamente menores de 0,33, y más típicamente menores de 0,32, y las cepas que pertenecen al mismo subtipo presentan distancias de nucleótido de menos de 0,135, frecuentemente de menos de 0,13 y con más frecuencia de menos de 0,125, variando frecuentemente entre 0,0003 y 0,1151 y por consiguiente las cepas que pertenecen al mismo tipo, pero a diferentes subtipos presentan distancias de nucleótido que varían desde 0,135 a 0,34, variando con frecuencia desde 0,1384 a 0,2977 y con más frecuencia variando de 0,15 a 0,32 y las cepas que pertenecen a diferentes tipos de HCV presentan distancias de nucleótido mayores de 0,34, con frecuencia mayores de 0,35 y más frecuentemente mayores de 0,358, variando con más frecuencia de 0,3581 a 0,6670.
(2)
basado en el análisis filogenético de las secuencias del ácido nucleico en la zona E1 de la parte central entre los nucleótidos 378 y 957, las cepas que pertenecen al mismo tipo de HCV presentan distancias de nucleótido de menos de 0,38, frecuentemente de menos de 0,37 y con más frecuencia de menos de 0,364, y las cepas que pertenecen al mismo subtipo presentan distancias de nucleótido menores de 0,17, con frecuencia menores de 0,16 y con más frecuencia menores de 0,15, más frecuentemente menores de 0,135, más frecuentemente menores de 0,134, y por consiguiente las cepas que pertenecen al mismo tipo pero a diferentes subtipos presentan distancias de nucleótido que varían de 0,15 a 0,38, variando frecuentemente de 0,16 a 0,37, y variando con más frecuencia de 0,17 a 0,36, variando más frecuentemente de 0,133 a 0,379, y las cepas que pertenecen a diferentes tipos de HCV presentan distancias de nucleótido mayores de 0,34, 0,35, 0,36, frecuentemente de más de 0,365 y con mayor frecuencia mayores de 0,37.
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TABLA 2
2
En un análisis filogenético comparativo de secuencias disponibles, se calcularon los intervalos de las distancias moleculares evolutivas para diferentes formas del genoma, basadas en 19.781 comparaciones de parejas mediante el programa DNADIST del paquete PHYLIP versión 3.5c (Felsenstein, 1993) de interferencia de filogenia. Los resultados se muestran en la Tabla 2 e indican que aunque la mayoría de las distancias obtenidas en cada zona están de acuerdo con la clasificación de una cepa determinada, solamente los intervalos obtenidos en la zona 340bp NS5B no se solapan y por consiguiente son concluyentes. Sin embargo, como se realizó en la presente invención, es preferible obtener la información de la secuencia de por lo menos 2 zonas antes de la clasificación final de una cepa dada.
La designación de un número para los diferentes tipos de HCV y la nomenclatura del HCV se basa en el descubrimiento cronológico de diferentes tipos. El sistema de numeración utilizado en la presente invención puede fluctuar todavía según acuerdos o pautas internacionales. Por ejemplo, el "tipo 4" se debería cambiar por el "tipo 5" o el "tipo 6". Así mismo las distancias en al límite elegidas arbitrariamente entre los tipos, subtipos y las cepas pueden estar todavía sujetos a cambios según pautas o acuerdos internacionales. Por consiguiente los tipos 7a, 8a, 8b y 9a pueden por ejemplo denominarse 6b, 6c, 6d y 6d en el futuro; y el tipo 10a que presenta afinidad con el genotipo 3 se puede indicar 3g en lugar de 10a.
El término "subtipo" corresponde a un grupo de cepas del HCV del que la poliproteína completa presenta una homología de más del 90% a los niveles de ácido nucleico y de aminoácido, o de la zona NS5 entre las posiciones del nucleótido. 7932 y 8271 muestran una homología de más del 90% a nivel del ácido nucleico en las partes correspondientes de los genomas de las demás cepas del mismo grupo, comenzando con dicha numeración con el resto de adenina del codón de iniciación de la poliproteína del HCV. Las cepas que pertenecen al mismo tipo pero a diferentes subtipos de HCV presentan homologías de más del 74% al nivel de ácido nucleico y más 78% a nivel del aminoácido.
Se ha de entender que las zonas extremadamente variables tales como las zonas E1, E2 y NS4 presentarán homologías inferiores que la homología media del genoma completo de la poliproteína.
Utilizando este criterio, se pueden clasificar las cepas de HCV en por lo menos 11 tipos. Se pueden distinguir claramente varios subtipos en los tipos 1, 2, 3, 4 y 7: 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 1g, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 2k, 2l, 3a, 3b, 3c, 3d, 3f, 3g, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 4k, 4l, 4m, 7a, 7c y 7d basados en homologías de UR 5' y en las zonas de codificación. En la Tabla 3 se presenta una panorámica de la mayoría de las cepas publicadas y su clasificación propuesta según el sistema de tipificación de la presente invención así como de otras clasificaciones propuestas.
TABLA 3
3
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El término "complemento" se refiere a una secuencia de nucleótido que es complementaria de una secuencia indicada y que es capaz de hibridar a las secuencias indicadas.
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La composición de la invención puede comprender muchas combinaciones. A modo de ejemplo, la composición de la invención puede comprender:
- dos (o más) ácidos nucleicos de la misma zona o,
- dos ácidos nucleicos (o más), de diferentes zonas respectivamente, para la misma cepa o para cepas diferentes,
- o ácidos nucleicos de las mismas zonas y de por lo menos dos zonas diferentes (para la misma cepa o para diferentes cepas).
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La presente invención se refiere particularmente a un ácido polinucleico definido anteriormente que tiene una secuencia seleccionada de cualquiera de SEC ID nº 43, 45, 47, 89, 91, 93 ó una parte de dicho ácido polinucleico que es exclusivo para el tipo 7 del HCV como se definió en la Tabla 5, o su complemento.
La presente invención se refiere más particularmente a un ácido polinucleico definido anteriormente, que codifica las zonas de 5' UR,de la parte central/E1, de la NS4 o de la NS5B o una parte de ellas.
Más particularmente, la presente invención se refiere a un ácido polinucleico definido anteriormente que presenta una secuencia de cADN.
Las variantes de la secuencia de los ácidos polinucleicos también están incluidas en la presente invención seleccionadas de entre cualquiera de las secuencias del nucleótido dadas en cualquiera de los números de SEC ID dados anteriormente con dichas variantes de secuencia que contienen la eliminación y/o las inserciones de uno o más nucleótidos, especialmente las inserciones o eliminaciones de 1 ó más codones, principalmente en los extremos de los oligonucleótidos (3' ó 5'), o las sustituciones de algunos nucleótidos no esenciales (es decir, nucleótidos no esenciales para discriminar entre diferentes genotipos de HCV) por otros (que comprenden nucleótidos modificados y/o inosina), por ejemplo, una secuencia de tipo 1 ó 2 se puede modificar en una secuencia de tipo 7 sustituyendo algunos nucleótidos de la secuencia de tipo 1 ó 2 con nucleótidos de tipo específico del tipo 7 mostrados por ejemplo en las Figuras 1 y 2.
Las variantes de ácidos polinucleicos preferidos particularmente de la presente invención comprenden además secuencias que presentan un alto grado de homología (similitud) con cualesquiera de los ácidos polinucleicos de la invención descritos anteriormente. Particularmente las secuencias que son por lo menos el 80%, 85%, 90%, 95% o más homólogas a dichas secuencias de ácido polinucleico de la invención. Preferentemente dichas secuencias que presentan variación menor del del 20%, 15%, 10% ó 5% de los nucleótidos originales de dicha secuencia de ácido polinucleico.
Las secuencias de ácido polinucleico según la presente invención que son homólogas a la secuencias representadas por una SEC ID nº se pueden caracterizar y aislar según cualquiera de las técnicas conocidas en la materia, tales como la amplificación mediante cebadores específicos de secuencia, hibridación con sondas específicas de secuencia en condiciones más o menos severas, procedimientos de detección serológica o vía sistema de tipificación LiPA.
Otras variantes preferidas de ácidos polinucleicos de la presente invención comprenden secuencias que son redundantes como resultado de la degeneración del código genético comparadas con cualesquiera de los ácidos polinucleicos de la presente invención dados anteriormente. Estas secuencias variantes de ácido polinucleico codificarán de este modo la misma secuencia de aminoácidos ya que los ácidos polinucleicos proceden de ellos.
Así mismo se incluyen dentro del alcance de la presente invención las secuencias de la zona 5' no codificadora que se pueden obtener fácilmente a partir de las cepas tipo 7 subtipo 7a, 7c ó 7d descritas en esta memoria. Dichas secuencias pueden contener motivos específicos del tipo o subtipo que se pueden emplear para análisis de hibridación específica del tipo y/o subtipo, p. ej. tales como las descritas por Stuyver y otros (1993).
Las secuencias del ácido polinucleico de los genomas indicados anteriormente de las zonas no descritas todavía en los presentes ejemplos, el listado de las figuras y de la secuencia se pueden conseguir mediante cualquiera de las técnicas conocidas en la materia, tales como las técnicas de amplificación que utilizan cebadores adecuados de las secuencias de estos nuevos genomas dados en la Figura 1 de la presente invención.
La presente invención también se refiere a un cebador de oligonucleótido que comprende parte de un ácido polinucleico definido anteriormente, siendo dicho cebador capaz de actuar como cebador para los ácidos nucleicos del tipo 7 del HCV específicamente ampliador.
El término "cebador" se refiere a una secuencia de oligonucleótido de ADN de una hélice capaz de actuar como un punto de inicio para la síntesis de un producto de amplificación del cebador complementario de la hélice del ácido nucleico a copiar. La longitud y la secuencia del cebador debe ser tal que permita al cebador la síntesis de producto de amplificación. Preferentemente el cebador es aproximadamente de 5 a 50 nucleótidos. La longitud y secuencia específicas dependerán de la complejidad de los objetivos del ADN o del ARN necesarios, así como de las condiciones de utilización del cebador tales como la temperatura y la fuerza iónica.
El hecho de que los cebadores de amplificación no tengan que ser exactamente iguales a la secuencia de la plantilla correspondiente para garantizar la propia amplificación se documenta ampliamente en la bibliografía (Kwok y otros, 1990).
El procedimiento de amplificación utilizado puede ser la reacción en cadena de polimerasa (PCR; Saiki y otros, 1988), la reacción en cadena de la ligasa (LCR; Landgren y otros, 1988; Wu & Wallace, 1989; Barany, 1991), la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA; Guatelli y otros, 1990; Compton, 1991), el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS; Kwoh y otros, 1989), la amplificación del desplazamiento de la hélice (SDA; Duck, 1990; Walker y otros, 1992) o la amplificación mediante Q\beta replicasa (Lizardi y otros, 1988; Lomeli y otros, 1989) o cualquier otro procedimiento adecuado para amplificar las moléculas de ácido nucleico utilizando la extensión del cebador. Durante la amplificación, los productos amplificados se pueden marcar convenientemente bien utilizando cebadores marcados o incorporando nucleótidos marcados. Los marcadores pueden ser isotópicos (^{32}P, ^{35}S, etc.) o no isotópicos (biotina, digoxigenina, etc.). La reacción de amplificación se repite entre 20 y 70 veces, ventajosamente entre 25 y 45 veces.
La presente invención así mismo se refiere a una sonda de oligonucleótido que comprende parte de un ácido polinucleico definido anteriormente, siendo dicha sonda capaz de actuar como sonda de hibridación para detección específica y/o clasificación en tipos y/o subtipos de un ácido nucleico del HCV que contiene dicha secuencia de nucleótido, estando dicha sonda marcada o unida a un sustrato sólido.
El término "sonda" se refiere a oligonucleótidos específicos de secuencia de una sola hélice que presentan una secuencia que es complementaria de la secuencia objetivo de el/los genotipo(s) del HCV a detectar.
Preferentemente, estas sondas son aproximadamente de 5 a 50 nucleótidos de longitud, más preferentemente de aproximadamente 10 a 25 nucleótidos.
El término "soporte sólido" se puede referir a cualquier sustrato al que se pueda acoplar una sonda de oligonucleótido, con la condición de que mantenga sus propiedades de hibridación y con la condición de que el nivel de fondo de hibridación se mantenga bajo. Con frecuencia el sustrato sólido será una placa de microvaloración, una membrana (p. ej. nylón o nitrocelulosa) o microesferas (lecho). Antes de la aplicación a la membrana o fijación puede ser conveniente modificar la sonda de ácido nucleico para facilitar la fijación o mejorar la eficacia de hibridación. Dichas modificaciones pueden abarcar la terminación del homopolímero, el acoplamiento con diferentes grupos reactivos tales como los grupos alifáticos, grupos NH_{2}, grupos SH, grupos carboxílicos o acoplamiento con biotina o haptenos.
La presente invención también se refiere a un equipo de diagnóstico para utilización en la determinación del genotipo del HCV, comprendiendo dicho equipo un cebador definido anteriormente.
La presente invención se refiere también a un equipo de diagnóstico para utilización en la determinación del genotipo del HCV, comprendiendo dicho equipo una sonda definida anteriormente.
La presente invención se refiere también a un equipo de diagnóstico definido anteriormente, en el que dicha(s) sonda(s) está(n) unida(s) a un sustrato sólido.
La presente invención se refiere también a un equipo de diagnóstico definido anteriormente, en el que un intervalo de dichas sondas está unido a posiciones específicas sobre un sustrato sólido.
La presente invención se refiere también a un equipo de diagnóstico definido anteriormente, en el que dicho soporte sólido es una tira de membrana y dichas sondas están acopladas a la membrana en forma de líneas paralelas.
La presente invención se refiere también a un procedimiento para la identificación de los ácidos nucleicos del HCV presentes en una muestra biológica, que comprende:
(i) la extracción del ácido nucleico de la muestra, si es posible
(ii) la amplificación del ácido nucleico con un cebador por lo menos definido anteriormente,
(iii) la identificación de los ácidos nucleicos amplificados.
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La presente invención se refiere también a un procedimiento para la identificación de los ácidos nucleicos del HCV presentes en una muestra biológica, que comprende:
(i) la extracción del ácido nucleico de la muestra, si es posible
(ii) la amplificación del ácido nucleico, si es posible, con un cebador por lo menos definido anteriormente, o con un cebador universal del HCV,
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(iii) la hibridación de los ácidos nucleicos de la muestra biológica, si es posible en condiciones desnaturalizadas, en condiciones apropiadas con una o más sondas definidas anteriormente, estando dichas sondas preferentemente unidas a un sustrato sólido,
(iv) el lavado en condiciones apropiadas, si es posible
(v) la identificación de los híbridos formados.
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La presente invención se refiere también a un procedimiento para la identificación de la presencia de uno o más genotipos del HCV presentes en la muestra biológica, que comprende:
(i) la extracción del ácido nucleico de la muestra, si es posible
(ii) específicamente la amplificación del ácido nucleico con un cebador por lo menos definido anteriormente,
(iii) la identificación de dichos ácidos nucleicos amplificados.
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La presente invención se refiere también a un procedimiento para la identificación de la presencia de uno o más genotipos del HCV presentes en una muestra biológica, que comprende:
(i) la extracción del ácido nucleico de la muestra, si es posible
(ii) si es posible, la amplificación del ácido nucleico con un cebador por lo menos definido anteriormente o con un cebador universal del HCV,
(iii) la hibridación de los ácidos nucleicos de la muestra biológica, si es posible en condiciones desnaturalizadas, en condiciones apropiadas con una o más sondas definidas anteriormente, estando dichas sondas preferentemente unidas a un sustrato sólido,
(iv) el lavado en condiciones apropiadas, si es posible
(v) identificación de los híbridos formados,
(vi) deducción de la presencia de uno o más genotipos del HCV presentes del modelo de hibridación observado.
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La presente invención se refiere también a un procedimiento definido anteriormente, en el que dichas sondas se caracterizan además según se definió anteriormente.
La presente invención se refiere también a un procedimiento definido anteriormente, en el que dichos ácidos nucleicos están marcados durante o después de la amplificación.
Preferentemente, esta técnica se podría realizar en la zona 5' no codificadora, de la parte central o de la NS5B.
El término "ácido nucleico" se puede también referir a una hélice del analito y corresponde a una molécula de ácido nucleico de una o de doble hélice. Está hélice del analito es preferentemente un ARN, cADN o un cADN amplificado con hélice positiva o negativa.
El término "muestra biológica" se refiere a cualquier muestra biológica (tejido o fluido) que contenga secuencias de ácido nucleico del HCV y se refiere más particularmente a muestras de suero o de plasma sanguíneos.
El término "cebador universal del HCV" se refiere a secuencias complementarias de oligonucleótido de cualquiera de las zonas conservadas del genoma del HCV.
La expresión hibridación "apropiada" y las condiciones de lavado se han de entender como severas y son generalmente conocidas en la materia (p. ej. Maniatis y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
Sin embargo, según la solución de hibridación (SSC, SSPE, etc.), estás sondas se deberían hibridar a su temperatura apropiada para alcanzar suficiente especifidad.
El término "marcado" se refiere a la utilización de ácidos nucleicos marcados. Éste puede comprender la utilización de nucleótidos incorporados mediante la etapa de amplificación de la polimerasa tal como ilustra Saiki y otros (1988) o Bej y otros (1990) o cebadores marcados, o mediante cualquier otro procedimiento conocido por los expertos en la materia.
El procedimiento de la invención comprende las etapas de contacto de cualquiera de las sondas definidas anteriormente, con uno de los siguientes elementos:
-
una muestra biológica en la que los ácidos nucleicos están disponibles para hibridación,
-
o los ácidos nucleicos purificados contenidos en la muestra biológica,
-
o una única copia procedente de los ácidos nucleicos purificados,
-
o una copia amplificada procedente de los ácidos nucleicos purificados, estando dichos elementos o dichas sondas unidos a un sustrato sólido.
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La expresión "deduciendo la presencia de uno o más genotipos del HCV presentes en el modelo de hibridación observado" se refiere a la identificación de la presencia de genomas en la muestra analizando el modelo de enlace de un panel de sondas de oligonucleótido. Las sondas individuales pueden proporcionar información útil concerniente a la presencia o ausencia de genomas del HCV en una muestra. Por otra parte, la variación de los genomas del HCV está dispersada en la naturaleza, por eso con poca frecuencia alguna sonda es capaz de identificar únicamente un genoma específico del HCV. Además, la identidad de un genotipo del HCV se puede deducir del modelo de unión de un panel de sondas de oligonucleótido, que son específicas para (diferentes) segmentos de los diferentes genomas del HCV. Dependiendo de la elección de estas sondas de oligonucleótido, cada genotipo conocido del HCV corresponderá a un modelo de hibridación específico en la utilización de una combinación específica de sondas. Cada genotipo del HCV será capaz además de ser discriminado por cualquier otro genotipo del HCV amplificado con los mismos cebadores, dependiendo de la elección de las sondas de oligonucleótido. La comparación de los modelos generados o de las sondas definitivamente de hibridación para una muestra que contiene una o más secuencias desconocidas del HCV en un esquema de modelos de hibridación esperados, permite a uno deducir claramente los genotipos del HCV presentes en dicha muestra.
La presente invención se refiere de este modo a un procedimiento definido anteriormente, en el que una o más sondas de hibridación se seleccionan de entre cualquiera de las SEC ID nº 43, 45, 47, 89, 91, 93, o variantes de la secuencia de éstas definidas anteriormente.
Para distinguir los genomas del HCV amplificados de otros, los ácidos polinucleicos objetivo se hibridan con una serie de sondas de ADN de secuencia especifica que se dirigen a las zonas genotípicas del HCV (zonas exclusivas) localizadas en los ácidos polinucleicos del HCV.
La mayoría de estas sondas se dirigen a la mayoría de las zonas de tipo o subtipo específicos de los genotipos del HCV, pero algunas pueden estar motivadas para hibridar a más de un genotipo del HCV.
Según la solución de hibridación (SSC, SSPE, etc.), estas sondas deberían estar severamente hibridadas a su temperatura apropiada para alcanzar suficiente especifidad. Sin embargo, modificando ligeramente las sondas de ADN, bien añadiendo o borrando uno o unos pocos nucleótidos en sus extremos (3' ó 5'), o sustituyendo algunos nucleótidos no esenciales (es decir, nucleótidos no esenciales para discriminar entre tipos) por otros (incluyendo nucleótidos modificados o inosina) estas sondas o sus variantes pueden estar motivadas para hibridar específicamente en las mismas condiciones de hibridación (es decir la misma temperatura y la misma solución de hibridación). También puede ser beneficioso cambiar la cantidad (concentración) de la sonda utilizada para obtener más resultados de hibridación específica. Debería indicarse en este contexto, que las sondas de la misma longitud, respecto a su contenido de GC, se hibridarán específicamente aproximadamente a la misma temperatura en soluciones de TMACI (Jacobs y otros, 1988).
Los procedimientos de análisis adecuados para los objetivos de la presente invención para detectar los hibridos formados entre la sondas de oligonucleótidos y las secuencias de ácido nucleico en una muestra puede comprender cualesquiera de los formatos de análisis conocidos en la materia, tal como el formato convencional de manchas puntuales, la hibridación en sándwich o hibridación inversa. Por ejemplo, la identificación se puede realizar utilizando un formato de manchas puntuales, estando unida a una membrana la muestra amplificada sin marcar, estando incorporada la membrana a una sonda marcada por lo menos en condiciones adecuadas de hibridación y de lavado, y estando controlada la presencia de la sonda de enlace.
Un procedimiento alternativo y preferido es un formato de manchas puntuales, en el que la secuencia amplificada contiene una marca. En esta formato, las sondas de oligonucleótido sin marcar se unen a un soporte sólido y se exponen a la muestra marcada en condiciones de hibridación severa apropiada y posterior lavado. Se debe entender que se puede utilizar también cualquier otro procedimiento de análisis que cuente con la formación de un híbrido entre los ácidos nucleicos de la muestra y las sondas de oligonucleótidos según la presente invención.
Según una forma de realización ventajosa, el procedimiento para identificar uno o más genotipos del HCV contenidos en una muestra biológica comprende las etapas de puesta en contacto de las copias amplificadas del ácido nucleico del HCV procedentes de la muestra biológica, con sondas de oligonucleótido que han sido inmovilizadas como líneas paralelas en un soporte sólido.
Según este procedimiento ventajoso, las sondas se inmovilizan en un formato de análisis de sonda de línea (LiPA). Este es un formato de hibridación inversa (Saiki y otros, 1989) que utilizan tiras de membrana en las diversas sondas (oligonucleótidos de control positivo o negativo inclusive) que se pueden aplicar convencionalmente como líneas paralelas.
La invención se refiere también de este modo a un soporte sólido, preferentemente una tira de membrana, que lleva en su superficie, una o más sondas definidas anteriormente, acopladas al soporte en forma de líneas paralelas.
El LiPA es una prueba de hibridación muy rápida y de utilización fácil. Los resultados se pueden leer después de 4 horas después del inicio de la amplificación. Después de la amplificación durante la que generalmente se incorpora una marca no isotópica en el producto no amplificado, y de la desnaturalización alcalina, el producto amplificado se pone en contacto con las sondas en la membrana y se realiza la hibridación durante 1 a 1,5 h aproximadamente, se detecta el ácido polinucleico hibridado. Del modelo de hibridación generado, se puede deducir visualmente el tipo de HCV, pero utilizando preferentemente software dedicado. El formato LiPA es totalmente compatible con los equipos de detección disponibles en el comercio, dando de este modo una interpretación automática muy fiable de los resultados. Todas estas ventajas hacen al formato LiPA capaz para la utilización de la detección del HCV en una situación de rutina. El formato LiPA sería particularmente ventajoso para detectar la presencia de diferentes genotipos
de HCV.
La presente invención también se refiere a un procedimiento para detectar e identificar nuevos genotipos de HCV, diferentes de los genomas conocidos del HCV, que comprenden las etapas de:
- determinar a qué genotipo de HCV pertenecen los nucleótidos presentes en una muestra biológica, según el procedimiento definido anteriormente,
- secuenciado de la porción de la secuencia del genoma del HCV correspondiente a la sonda hibridante aberrantemente del nuevo genotipo a determinar, en el caso de observar una muestra que no genera un modelo de hibridación compatible con los definidos en la Tabla 3.
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La presente invención se refiere además a un procedimiento para preparar un ácido polinucleico según la presente invención. Estos procedimientos incluyen cualquier procedimiento conocido en la materia para preparar ácidos polinucleicos (p. ej. el procedimiento del fosfodiéster para sintetizar oligonucleótidos según describe Agarwal y otros,1972, Agnew. Chem. Int., Ed. Engl. 11:451, el procedimiento fosfotriéster de Hsiung y otros, 1979, Nucleic Acid Res. 6:1371, o el procedimiento de dietilfosforamidita automatizado de Beaucage y otros, 1981, Tetrahedron Letters 22:1859 a 1862.). Por otra parte, los ácidos polinucleicos de la presente invención pueden ser aislados de fragmentos de ADN o ARN naturales o clonados. Además, los oligonucleótidos según la presente invención se pueden sintetizar automáticamente en instrumentos comerciales vendidos por una variedad de fabricantes.
La presente invención se refiere además particularmente a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido polinucleico según se definió anteriormente, o una parte de éste que es exclusiva para el tipo 7 del HCV definido en la Tabla 5, o un análogo de éste que es sustancialmente homólogo y biológicamente equivalente, según se define en la reivindicación 23.
El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos y no hace referencia a una longitud específica del producto; de este modo, péptidos, oligopéptidos y proteínas están comprendidos dentro de la definición de polipéptido. Este término tampoco se refiere o excluye modificaciones post-expresión del polipéptido, por ejemplo, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Comprendidos dentro de la definición están, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, PNA, etc.), polipéptidos con conexiones sustituidas, además de otras modificaciones conocidas en la materia que tienen lugar o no en la naturaleza.
Al término "exclusivo" se hizo referencia anteriormente.
"Biológicamente equivalente" según se utiliza en toda la memoria y las reivindicaciones, significa que las composiciones son inmunológicamente equivalentes a las proteínas (polipéptidos) o péptidos de la invención definidas anteriormente y más adelante.
"Sustancialmente homólogo" según se utiliza en toda la memoria subsiguiente y en las reivindicaciones para describir proteínas y péptidos, significa un grado de homología en la secuencia de aminoácidos para las proteínas o péptidos de la invención. Preferentemente el grado de homología es superior a 90, preferentemente superior a 95, siendo para un grupo de proteínas preferidas particularmente superior a 99, homólogo con las proteínas o péptidos de la
invención.
El término "análogo" según se utiliza en toda la memoria o en las reivindicaciones, para describir proteínas y péptidos de la presente invención, comprende cualquier proteína o péptido que tenga una secuencia de restos de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia específicamente mostrada en esta memoria en la que uno o más restos han sido sustituidos conservadoramente por un resto biológicamente equivalente. Ejemplos de sustituciones conservadoras comprenden la sustitución de un resto unipolar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, la sustitución del resto unipolar (hidrófilo) por otro tal como arginina o lisina, glutamina o asparagina, glicina o serina, la sustitución de un resto básico tal como lisina, histidina o arginina por otro, o la sustitución de un resto ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro. En la Tabla 4 se pueden encontrar ejemplos de mutaciones admisibles según la presente invención.
La frase "sustitución conservadora" comprende también la utilización de un resto derivado químicamente en lugar de un resto no derivado con la condición de que la proteína o péptido resultante sea biológicamente equivalente a la proteína o péptido de la invención.
"Derivado químico" se refiere a una proteína o un péptido que tiene uno o más restos derivados químicamente mediante reacción de un grupo funcional secundario. Ejemplos de dichas moléculas derivadas comprenden, pero no se limitan a, las moléculas en las que los grupos amino libres se han derivado para formar cloruros de amina, grupos p-toluensulfonil, grupos carbobenzoxi, grupos terc-butoxicarbonil, grupos cloracetil o grupos formil. Los grupos carboxil libres se pueden derivar para formar sales, metil y etil ésteres u otros tipos de ésteres o hidrazidas. Los grupos hidroxil libres se pueden derivar para formar derivados de O-acil o de O-alquil. El imidazol nitrógeno de histidina se puede derivar para formar N-imbenzilhistidina. También están comprendidos como derivados químicos las proteínas o péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos naturales y de los veinte aminoácidos típicos. Por ejemplo: 4-hidroxiprolina se puede sustituir por prolina; 5-hidroxilisina se puede sustituir por lisina; 3-metilhistidina se puede sustituir por histidina; homoserina se puede sustituir por serina y ornitina se puede sustituir por lisina. Las proteínas o péptidos de la presente invención también comprenden cualquier proteína o péptido que tenga una o más adiciones y/o eliminaciones o restos relativos a la secuencia de un péptido cuya secuencia se muestra en esta memoria, con tal que el péptido sea biológicamente equivalente a las proteínas o péptidos de la invención.
Obsérvese que, en el nivel de la secuencia aminoácido, por lo menos un aminoácido diferente (con respecto a secuencias conocidas de aminoácidos del HCV) es suficiente para formar parte de la invención, lo que significa que los polipéptidos de la invención corresponden a ácidos polinucleicos que tienen por lo menos un nucleótido diferente (con respecto a las secuencias conocidas de ácido polinucleico del HCV) que implican un aminoácido diferente en la poliproteína codificada.
Como las zonas NS4 y de la parte central son conocidas por contener diversos epítopos, por ejemplo caracterizados en la solicitud de la patente EP-A-0 489 968, y como es de esperar que la proteína E1 esté sometida al ataque inmunitario como parte de la envoltura vírica y es de esperar que contenga epítopos, los epítopos de NS4, de la parte central y de E1 de los nuevos tipos y subtipos dados a conocer en esta memoria diferirán consecuentemente de los epítopos presentes en los genotipos conocidos anteriormente. Esto está ejemplificado mediante la especificidad de tipo de los péptidos sintéticos de NS4 según describen Simmonds y otros (1993c) y Stuyver y otros (1993b) y PCT/EP 94/01323 y la especificidad de tipo de las proteínas E1 recombinantes según describen Martens y otros (1994).
Los péptidos según la presente invención contienen preferentemente por lo menos 3 aminoácidos contiguos del HCV, preferentemente 4 ó 5, preferentemente 6 ó 7 sin embargo por lo menos 8 aminoácidos contiguos del HCV, por lo menos 10 ó por lo menos 15 (por ejemplo por lo menos 9, 10, 11, 12, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más aminoácidos).
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 4
4
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Los polipéptidos de la invención, y particularmente los fragmentos, se pueden preparar mediante síntesis química clásica.
La síntesis se puede realizar en solución homogénea o en fase sólida.
Por ejemplo, la técnica de síntesis en solución homogénea que se puede utilizar es la descrita por Houbenweyl en el libro titulado "Methode der organischen chemie" (Procedimiento de química orgánica) editado por E. Wunsh, vol. 15-1 y II. THIEME, Stuttgart, 1974.
Los polipéptidos de la invención se pueden preparar así mismo en fase sólida según los procedimientos descritos por Atherton y Shepard en su libro titulado "Solid phase peptide synthesis" (IRL Press, Oxford, 1989).
Los polipéptidos según esta invención se pueden preparar mediante técnicas de ADN recombinante como las descritas por Maniatis y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
La presente invención se refiere particularmente a un polipéptido según se definió anteriormente, que comprende en su secuencia de aminoácidos por lo menos uno de los siguientes restos de aminoácidos:
A58, H70, Q71 ó N71, D106, I134, E135, E150, K197, L235, A242, E260 ó K260, L293, I300, S2646, V2652, Q2653, H2656, K2663, A2667 ó V2667, D2677, I2707, A2709, F2730, L2746, S2749 ó P2749, T2752 ó V2752, D2753 ó G2753.
estando compuesta dicha notación por una letra que representa el resto de aminoácido mediante su código de una letra y un número que representa la numeración del aminoácido según Kato y otros, 1990 como se muestra en la Tabla 1 (véase también la numeración en las Figuras 2, 4 y 6), o una parte de éste que es exclusiva para el tipo 7 del HCV según se define en la Tabla 5, o un análogo de éste que es sustancialmente homólogo y biológicamente equivalente a dicho polipéptido o a parte de éste, según se define en alguna de las reivindicaciones 23 a 27.
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Estos restos de aminoácido exclusivos se pueden deducir de la alineación de las nuevas secuencias de aminoácidos del HCV dadas en la Figura 3 para todas las secuencias del HCV conocidas. En las Figuras 2, 4 y 6 se da por ejemplo un alineamiento con las nuevas secuencias, representado por la SEC ID nº 1 a 106. Debería ser obvio que las alineaciones dadas en estas figuras se pueden completar con todas las secuencias de HCV conocidas para ilustrar que cualquiera de los restos exclusivos dados anteriormente es verdaderamente exclusivo para por lo menos una de las nuevas secuencias de HCV de la presente invención.
Dentro del grupo de restos de aminoácidos exclusivos y nuevos de la presente invención, se pueden encontrar restos exclusivos que son específicos para los siguientes nuevos tipos (subtipos) de HCV según el sistema de clasificación de HCV utilizado en la presente invención: cepas del tipo 1 subtipo 1d, 1e, 1f ó 1g; cepas del tipo 2 subtipo 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 2k ó 2l; cepas del tipo 3 subtipo 3g; cepas del tipo 1 subtipo 4k, 4l ó 4m; cepas del tipo 7 subtipo 7a, 7b, ó 7d; cepas del tipo 9, del tipo 10 o del tipo 11. Para conseguir estos restos se pueden utilizar las alineaciones dadas en la Figuras 2, 4 y 6 para deducir la especificidad de tipo y/o subtipo de cualquiera de los restos exclusivos dados anteriormente.
Por ejemplo, T190 (identificado en el tipo 1d) se refiere a una treonina en la posición 190 (véase Figura 2). En otras secuencias se puede identificar sólo una serina (S190) o excepcionalmente una alanina (A190 en el tipo 10a).
Los polipéptidos según esta forma de realización de la invención pueden estar marcados posiblemente, o unidos a un sustrato sólido, o acoplados a una molécula de portador tal como la biotina o mezclados con un adyuvante apropiado, todos conocidos en la materia y según la utilización pretendida (de diagnóstico, terapéutica o profiláctica).
La presente invención se refiere además a un polipéptido definido anteriormente, que comprende en su secuencia de aminoácidos por lo menos una de las secuencias representadas por SEC ID nº 115, 116, 136, 137, 153, 154, 172, 173, 188, 189, 205 ó 206 como se relacionó anteriormente, o una parte de éstas que es exclusiva para el tipo 7 del HCV definido en la Tabla 5, o un análogo de éste que es sustancialmente homólogo y biológicamente equivalente a dicho polipéptido o de parte de éste, definido en la reivindicación 25.
La presente invención se refiere además a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en cualesquiera de las SEC ID nº 44, 46, 48, 90, 92 ó 94, o una parte de éstas que es exclusiva para el tipo 7 según se define en la Tabla 5, o un análogo de éstas que es sustancialmente homólogo y biológicamente equivalente a dicho polipéptido o de parte de éstas, definido en la reivindicación 26.
La zona variable en la proteína de la parte central (PARTE CENTRAL V en la Fig. 2) ha demostrado ser útil para serotipado (Machida y otros, 1992). La secuencia de las secuencias del tipo 7 (subtipo de secuencias 7a, 7c y 7d) de la presente invención presentan características de tipo específico en esta zona. El péptido de los aminoácidos 68 a 78 (zona central V) presenta la secuencia exclusiva para las secuencias de la presente invención (véase la Figura 2):
VRHQTGRTWAQ como para los subtipos 7a y 7c
(SEC ID nº 115)
VRQNQGRTWAQ como para el subtipo 7d
(SEC ID nº 116)
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Se pueden identificar cinco zonas variables de tipo específico (V1 a V5) después de la alineación de las secuencias de aminoácidos de E1 de los genotipos de la presente invención con los genotipos ya conocidos, como se muestra en la Figura 2.
La zona V1 abarca los aminoácidos 192 a 203, es decir los 10 aminoácidos con terminal amino de la proteína E1. Se pueden deducir las secuencias exclusivas siguientes mostradas en la Figura 2:
AHYTNKSGLYHL como para el subtipo 7c
(SEC ID nº 136)
LNYANKSGLYHL como para el subtipo 7d
(SEC ID nº 137)
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La zona V2 abarca los aminoácidos 213 a 223. Las secuencias exclusivas siguientes se pueden encontrar en la zona V2, como se muestra en la Figura 2:
VYEAETLILHL como para el subtipo 7c
(SEC ID nº 153)
VYEANGMILHL como para el subtipo 7d
(SEC ID nº 154)
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La zona V3 abarca los aminoácidos 230 a 242. Las siguientes secuencias exclusivas de la zona V3 se pueden deducir de la Figura 2:
VKXXNQSRCWVQA como para el subtipo 7c
(SEC ID nº 172)
VKTGNLTKCWLSA como para el subtipo 7d
(SEC ID nº 173)
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La zona V4 abarca los aminoácidos 248 a 257. Las siguientes secuencias exclusivas de la zona V4 se pueden deducir de la Figura 2:
VPNASTPVTG como para el subtipo 7c
(SEC ID nº 188)
VQNASVSIRG como para el subtipo 7d
(SEC ID nº 189)
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La zona V5 abarca los aminoácidos 294 a 303. Los siguientes péptidos exclusivos de la zona V5 se pueden deducir de la Figura 2:
RPRMHQVVQE como para el subtipo 7c
(SEC ID nº 205)
RPRMYEIAQD como para el subtipo 7d
(SEC ID nº 206)
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La lista de péptidos dada anteriormente es particularmente útil para el desarrollo para el tratamiento, y el desarrollo de la vacuna y del diagnóstico.
Así mismo está comprendido en la presente invención cualquier péptido o polipéptido sintético (véase más adelante) que contenga en su cadena peptídica por lo menos un derivado del epítopo de los péptidos definidos anteriormente. Así mismo está comprendido dentro de la presente invención cualquier péptido o polipéptido que comprenda en su cadena peptídica por lo menos 6, 7, 8 ó 9 aminoácidos contiguos derivados de los péptidos definidos anterior-
mente.
Según se utiliza en esta memoria, "epítopo" o "determinante antigénico" significa una secuencia de aminoácidos que es inmunorreactiva. Generalmente un epítopo consta por lo menos de 3 a 4 aminoácidos, y más generalmente, consta por lo menos de 5 ó 6 aminoácidos, algunas veces el epítopo consta de aproximadamente 7 a 8, o incluso aproximadamente 10 aminoácidos.
La presente invención se refiere particularmente a cualquier péptido (véase más adelante) o polipéptido contenido en cualesquiera de las secuencias de aminoácidos representadas en SEC ID nº 44, 46, 48, 90, 92, 94 (véase Tabla 5 y Figura 3, sección de Ejemplos).
La presente invención se refiere así mismo a un polipéptido recombinante codificado por un ácido polinucleico definido anteriormente, o a una parte de éste que es exclusiva para cualesquiera de los subtipos o tipos definidos en la Tabla 5, o a un análogo de éste que sea sustancialmente homólogo y biológicamente equivalente a dicho polipéptido.
La presente invención se refiere así mismo a un vector de expresión recombinante que comprende un ácido polinucleico o a una parte de éste como se definió anteriormente, ligado operativamente a elementos de control de transcripción y traducción procarióticos, eucarióticos o víricos.
En general dicho vector recombinante comprenderá una secuencia del vector, una secuencia del iniciador procariótico, eucariótico o vírico apropiado, seguida de las secuencias del nucleótido definidas anteriormente, permitiendo dicho vector recombinante la expresión de cualesquiera de los polipéptidos definidos anteriormente, en un huésped procariótico o eucariótico o en mamíferos vivos cuando se inyectan como ADN desnudo, y más particularmente un vector recombinante que permite la expresión de cualesquiera de las nuevas secuencias del HCV de la invención abarcando particularmente las siguientes posiciones de aminoácidos:
- un polipéptido que empieza en la zona entre las posiciones 1 y 10 y que acaba en cualquier posición en la zona entre las posiciones 70 y 420, más particularmente un polipéptido que abarca las posiciones 1 a 70, 1 a 85, las posiciones 1 a 120, las posiciones 1 a 150, las posiciones 1 a 191, o las posiciones 1 a 200, para la expresión de la proteína de la parte central, y un polipéptido que abarca las posiciones 1 a 263, las posiciones 1 a 326, las posiciones 1 a 383, o las posiciones 1 a 420, para la expresión de la proteína de la parte central y de E1;
- un polipéptido que empieza en cualquier posición en la zona entre las posiciones 117 y 192 y que acaba en cualquier posición en la zona entre las posiciones 263 y 420, para la expresión de E1, o las formas que tienen la zona hidrófoba eliminada (posiciones 264 a 293 más o menos 8 aminoácidos);
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- un polipéptido que empieza en cualquier posición en la zona entre las posiciones 1556 y 1688 y que acaba en cualquier posición en la zona entre las posiciones 1739 y 1764, para la expresión del antígeno NS4, más particularmente; un polipéptido que empieza en las posición 1658 y que acaba en la posición 1711, para la expresión del antígeno NS4a, y más particularmente, un polipéptido que empieza en la posición 1712 y que acaba en la zona entre las posiciones 1743 y 1972 (por ejemplo 1712 a 1743, 1712 a 1764, 1712 a 1782, 1712 a 1972, 1712 a 1782, 1712 a 1902), para la expresión del antígeno NS4b o de partes de éste.
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Cualquier otra construcción del vector HCV conocida en la materia se puede utilizar también para los polipéptidos recombinantes de la presente invención.
Así mismo cualesquiera de los procedimientos de purificación conocidos para las proteínas recombinantes se pueden utilizar para la producción de los polipéptidos recombinantes de la presente invención, particularmente los procedimientos de purificación del polipéptido recombinante expuestos en el documento nº WO 96/04385 in nombre de Innogenetics N.V.
El término "vector" puede comprender un plásmido, un cósmido, un fago, o un animal transgénico. Los vectores BCG o adenovíricos, así como los virus recombinantes de avipox, pueden ser particularmente útiles para el desarrollo de la vacuna.
La presente invención se refiere además a un procedimiento para la producción de un polipéptido recombinante definido anteriormente, que comprende:
- la transformación de un huésped celular apropiado con un vector recombinante, en el que se ha insertado un ácido polinucleico o una parte de este según se definió anteriormente, bajo el control de elementos reguladores apropiados,
- el cultivo de dicho huésped celular transformado en condiciones que permitan la expresión de dicha inserción, y,
la recogida de dicho polipéptido.
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El término "expresado recombinantemente" utilizado en el contexto de la presente invención se refiere al hecho de que las proteínas de la presente invención se producen mediante procedimientos de expresión recombinantes que existen en los procarióticas, o eucarióticas inferiores o superiores tratados en detalle más adelante.
El término "eucariótica inferior" se refiere a las células huésped tales como levaduras, hongos y similares. Los eucariótas inferiores son generalmente (pero no necesariamente) unicelulares. Los eucariótas inferiores preferidos son las levaduras, particularmente especies dentro de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia (p. ej. Pichia pastoris), Hansenula (p. ej. Hansenula polymorpha), Yarowia, Schwaniomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces y similares. Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis y K. lactis son los huéspedes de levadura más utilizados generalmente, y son huéspedes apropiados de hongos.
El término "procariótas" se refiere a los huéspedes tales como E. coli, Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus subtilis o Streptomyces. Estos huéspedes también están contemplados en la presente invención.
El término "eucarióta superior" se refiere a las células huésped procedentes de animales superiores tales como mamíferos, reptiles, insectos y similares. Las células huésped de eucariótas superiores preferidas actualmente proceden del hamster chino (p. ej. CHO), del mono (p. ej. células COS y Vero), del riñón de la cría del hamster (BHK), del riñón del cerdo (PK15), de las células 13 del riñón del conejo (RK13), de la línea celular 143B del osteosarcoma humano, de la línea celular humana HeLa y de las líneas celulares similares a Hep G2 del hepatoma humano y de las líneas celulares de insectos (p. ej. Spodoptera frugiperda). Las células huésped se pueden proporcionar en suspensión o en cultivos en matraz, cultivos de tejidos, cultivos de órganos y similares. Por otra parte las células huésped pueden ser también animales transgénicos.
El término "polinucleótido o ácido nucleico recombinante" significa un polinucleótido o ácido nucleico del cADN genómico, de origen semisintético o sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está relacionado con toda o parte de un polinucleótido con el que está relacionado en la naturaleza, (2) está ligado a un polinucleótido distinto al que se une en la naturaleza, o (3) no tiene lugar en la naturaleza.
El término "células huésped recombinantes", "células huésped", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares" y dichos otros términos que indican microorganismos o líneas celulares eucarióticas superiores cultivadas como entidades unicelulares se refieren a células que pueden existir o han existido utilizadas como receptoras para un vector recombinante u otro polinucleótido de transferencia, y comprenden la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Se comprende que la progenie de una célula paterna individual puede no ser necesariamente totalmente idéntica en morfología o en el complemento del ADN genómico o total como el original paterno, debido a la mutación natural, accidental o deliberada.
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El término "replicón" es cualquier elemento genético, p. ej., un plásmido, un cromosoma, un virus, un cósmido, etc., que se comporta como una unidad autónoma de replicación dentro de una célula; es decir, capaz de replicación bajo su propio control.
El término "vector" es un replicón que comprende así mismo secuencias que proporcionan la replicación y/o la expresión de un marco de lectura abierto deseado.
El término "secuencia de control" se refiere a las secuencias de polinucleótido que se necesitan para efectuar la expresión de las secuencias codificadoras a las que están unidas. La naturaleza de dichas secuencias de control se diferencia dependiendo del organismo; en los procariótas, dichas secuencias de control comprenden generalmente el iniciador, el sitio de unión ribosónica, los sitios de corte y empalme y los finalizadores; en los eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control comprenden iniciadores, sitios de corte y empalme, finalizadores y, en algunos casos, aumentadores. El término "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia sea necesaria para la expresión, y puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, las secuencias del líder que gobierna la secreción.
El término "iniciador" es una secuencia de nucleótido que está compuesta por secuencias de consenso que permiten la unión de la ARN polimerasa a la plantilla del ADN de tal forma que la producción de mARN comienza en el sitio de inicio de la transcripción normal para el gen estructural adyacente.
La expresión "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos de este modo están en una relación que les permite funcionar en su manera pretendida. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia de codificación está unida de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.
El segmento del cADN del HCV que codifica la secuencia deseada insertada en la secuencia del vector puede estar unida a una señal en secuencia. Dicha señal en secuencia puede ser de una fuente distinta del HCV, p. ej. la secuencia principal de IgG o del activador plasminógeno del tejido (tpa) para la expresión en las células de mamíferos, o la secuencia del factor \alpha de apareamiento para la expresión en las células de levadura, pero las construcciones particularmente preferidas según la presente invención contienen secuencias en señal que aparecen en el genoma HCV antes de los respectivos puntos de partida de las proteínas.
Se puede utilizar una variedad de vectores para obtener la expresión recombinante de las proteínas de la envoltura oligoméricas específicas de la presente invención. Los eucariotas inferiores tales como levaduras y cepas mutantes de glucosilación se transforman típicamente en plásmidos, o se transforman en un virus recombinante. Los vectores se pueden replicar en el huésped independientemente o se pueden integrar en el genoma de la célula huésped.
Los eucariótas superiores se pueden transformar con vectores o se pueden infectar con un virus recombinante, por ejemplo un virus de vacuna recombinante. Las técnicas y los vectores para inserción de ADN extraño en el virus de la vacuna son bien conocidas en la materia, y utilizan, por ejemplo la recombinación homóloga. Una amplia variedad de secuencias de iniciación víricas, si es posible secuencias del finalizador y secuencias de adición de poli(A), si es posible secuencias del aumentador, y si es posible secuencias de amplificación, requeridas todas para la expresión en mamíferos, están disponibles en la materia. La vacuna es particularmente preferida, ya que la vacuna detiene la expresión de las proteínas de la célula huésped. La vacuna es así mismo mucho más preferida ya que permite la expresión de p. ej. las proteínas E1 y E2 del HCV en células o individuos que está inmunizados con el virus vivo de la vacuna recombinante. Para la vacunación de humanos el avipox y el virus modificado de Ankara (AMV) son particularmente útiles los vectores.
Son así mismo conocidos los vectores de transferencia de expresión de insectos procedentes del baculovirus Autographa californica del virus de la polihedrosis nuclear (AcNPV), que es un vector de expresión vírica independiente del cooperador. Los vectores de expresión procedentes de este sistema utilizan generalmente el iniciador del gen de polihedrina vírica fuerte para dirigir la expresión de los genes heterólogos. Los vectores diferentes, así como los procedimientos para la introducción del ADN heterólogo en el sitio deseado del baculovirus, están disponibles para los expertos en la materia para la expresión del baculovirus. Así mismo son conocidas en la materia las diferentes señales de modificación post-traductora reconocidas por las células de insectos.
La presente invención se refiere así mismo a una célula huésped transformada con un vector recombinante como se definió anteriormente.
La presente invención también se refiere a un procedimiento para detectar anticuerpos en el HCV presentes en la muestra biológica, que comprende:
(i) puesta en contacto de la muestra biológica a analizar por la presencia del HCV con un polipéptido como se definió anteriormente,
(ii) identificación del complejo inmunológico formado entre dichos anticuerpos y dicho polipéptido.
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La presente invención se refiere además a un procedimiento para la tipificación, que comprende:
(i) puesta en contacto de la muestra biológica a analizar para la presencia del HCV con un polipéptido definido anteriormente,
(ii) identificación del complejo inmunológico formado entre dichos anticuerpos y dicho polipéptido.
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La presente invención se refiere además a un equipo de diagnóstico para utilización en la identificación de la presencia del HCV, comprendiendo dicho equipo por lo menos un polipéptido definido anteriormente, estando dicho polipéptido preferentemente unido a un soporte sólido.
La presente invención se refiere además a un equipo de diagnóstico para tipificación del HCV, comprendiendo dicho equipo por lo menos un polipéptido definido anteriormente, estando dicho polipéptido preferentemente unido a un soporte sólido.
La presente invención se refiere además a un equipo de diagnóstico según se definió anteriormente, comprendiendo dicho equipo un intervalo de dichos polipéptidos que están unidos a posiciones específicas sobre un sustrato sólido.
La presente invención se refiere además a un equipo de diagnóstico según se definió anteriormente, en el que dicho soporte sólido es una tira de membrana y dichos polipéptidos están acoplados a la membrana en forma de líneas paralelas.
Los procedimientos de inmunoanálisis según la presente invención pueden utilizar antígenos de diferentes campos de las secuencias del nuevo y único polipéptido de la presente invención que se mantienen lineales (en el caso de los péptidos) y de los epítopos conformacionales (en el caso de los polipéptidos) reconocidos por los anticuerpos en el suero de individuos infectados por HCV. Está dentro del alcance de la invención utilizar, por ejemplo, antígenos oligoméricos individuales o específicos, antígenos diméricos, así como combinaciones de antígenos oligoméricos individuales o específicos. Los antígenos del HCV de la presente invención se pueden emplear prácticamente en cualquier formato de análisis que emplee un antígeno conocido para detectar anticuerpos. Desde luego, debería ser evitado o adaptado un formato que desnaturalice el epítopo conformacional del HCV. Una característica común de todos estos análisis, es que el antígeno se pone en contacto con el componente corporal sospechoso de contener anticuerpo del HCV en condiciones que permitan al antígeno unirse a cualquier anticuerpo presente en el componente. Dichas condiciones serán típicamente la temperatura fisiológica, el pH y la fuerza iónica utilizando un exceso de antígeno. La incubación
del antígeno con la muestra es seguida de la identificación de los inmunocomplejos comprendidos en el antígeno.
El diseño del inmunoanálisis está sujeto a una cantidad de variación y se conocen muchos formatos en la materia. Los protocolos pueden utilizar, por ejemplo, soportes sólidos o inmunoprecipitación. La mayoría de los análisis implican la utilización de anticuerpo o polipéptido marcado; las marcas pueden ser, por ejemplo, enzimáticas, fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas o moléculas coloreadas. Los análisis que amplifican las señales del inmunocomplejo son también conocidas; ejemplos de los cuales son los análisis que utilizan biotina y avidina o estreptavidina, e inmunoanálisis con enzima marcada y mediada, tales como los análisis ELISA.
Los inmunoanálisis pueden estar, sin limitación, en un formato heterogéneo u homogéneo, y ser de tipo estándar o competitivo. En formato heterogéneo, el polipéptido está unido típicamente a una matriz o soporte sólido para facilitar la separación de la muestra del polipéptido después de la incubación. Ejemplos de soportes sólidos que se pueden utilizar son la nitrocelulosa, (p. ej., en forma de membranas o pocillos de microvaloración), cloruro de polivinilo (p. ej., en hojas o pocillos de microvaloración), látex de poliestireno (p. ej., en lechos o placas de microvaloración, fluoruro de polivinilidina (conocido como Immunolon^{TM}), papel diazotado, membranas de nylón, lechos activados y lechos de Proteína A. Por ejemplo, se pueden utilizar placas de microvaloración de Dinatech Immunolon^{TM} 1 ó Immunolon^{TM} 2 ó lechos de poliestireno de 0,25 pulgadas (Precision Plastic Ball) en el formato heterogéneo. El soporte sólido que contiene los polipéptidos antigénicos se lava típicamente después de separarlo de la muestra de la prueba y antes para identificación de los anticuerpos unidos. Ambos formatos estándar y competitivo son conocidos en la materia.
En un formato homogéneo, la muestra de prueba se incuba con la combinación de antígenos en solución. Por ejemplo, puede estar en condiciones que precipite cualquier complejo antígeno-anticuerpo que se forme. Ambos formatos estándar y competitivo para estos análisis son conocidos en la materia.
En un formato estándar, se controla directamente la cantidad de anticuerpos del HCV en los complejos anticuerpo-antígeno. Esto se puede realizar determinando si los anticuerpos marcados por anti-xenogenéico (p. ej. antihumano) que reconocen un epítopo se unirá sobre anticuerpos anti-HCV debido a la formación del complejo. En un formato competitivo, la cantidad de anticuerpos de HCV en la muestra se deduce controlando el efecto competitivo sobre la unión de una cantidad conocida de anticuerpo marcado (u otro ligando en competencia) en el complejo.
Los complejos formados que comprenden el anticuerpo anti-HCV (o en el caso de análisis competitivos, la cantidad de anticuerpo en competencia) se identifica mediante cualquiera de las numerosas técnicas conocidas, dependiendo del formato. Por ejemplo, los anticuerpos del HCV marcados en el complejo se pueden identificar utilizando un conjugado anti-xenogenéico 1g acomplejado con un marca (p. ej. una marca de enzima).
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En un formato de análisis de inmunoprecipitación o aglutinación la reacción entre los antígenos del HCV y el anticuerpo forman una red que precipita de la solución o suspensión y forma una capa visible o película de precipitado. Si ningún anticuerpo anti-HCV está presente en la muestra de prueba, no se forma ningún precipitado visible.
Actualmente existen 3 tipos específicos de análisis de aglutinación de partículas (PA). Estos análisis se utilizan para la identificación de anticuerpos para varios antígenos cuando recubren a un soporte. Un tipo de este análisis es el análisis de hemaglutinación utilizando glóbulos rojos (RBCs) que están sensibilizados por un antígeno (o anticuerpo) que adsorbe pasivamente los RBC. La adición de anticuerpos del antígeno específico presentes en el componente corporal, si existe, da lugar a que los RBCs recubiertos con el antígeno purificado se aglutinen.
Para eliminar las reacciones potenciales no específicas en el análisis de hemaglutinación, se pueden utilizar dos portadores artificiales en lugar de RBC en la PA. Los más habituales de éstos son las partículas de látex. Sin embargo,se pueden utilizar también partículas de gelatina. Los análisis que utilizan uno de estos portadores se basan en la aglutinación pasiva de las partículas recubiertas con antígenos purificados.
Los antígenos del HCV de la presente invención comprendidos en los epítopos comformacionales se empaquetarán típicamente en forma de un equipo para utilizar en estos inmunoanálisis. El equipo contendrá normalmente en recipientes separados el antígeno del HCV natural, las formulaciones del anticuerpo de control (positivo y/o negativo), el anticuerpo marcado cuando el formato del análisis necesita el mismo y los reactivos generadores de la señal (p. ej. el sustrato de la enzima) si la marca no genera una señal directamente. El antígeno natural del HCV puede estar ya unido a una matriz sólida o separado con reactivos para unirlo a la matriz. Las instrucciones (p. ej. escritas, cinta magnetofónica, CD-ROM, etc.) para realizar el análisis están incluidas generalmente en el equipo.
Los inmunoanálisis que utilizan el antígeno del HCV natural son útiles en la detección sanguínea para la precipitación de una irrigación en la que falta el HCV potencialmente infeccioso. El procedimiento para la preparación del riego sanguíneo comprende las siguiente etapas. La reacción de un componente corporal, preferentemente sangre o un componente de la sangre, de la sangre de un individuo donante con polipéptidos del HCV de la presente invención que permitan una reacción inmunológica entre los anticuerpos del HCV, si existen, y el antígeno del HCV. La detección si se forman complejos antígeno anti-HCV - antígeno del HCV como resultado de la reacción. La sangre que contribuye al riego sanguíneo es de donantes que no presentan anticuerpos en los antígenos del HCV natural.
En el caso de reactividad positiva del antígeno del HCV, es preferible repetir el inmunoanálisis para reducir la posibilidad de falsos positivos. Por ejemplo, en la detección a gran escala de la sangre para la producción de productos sanguíneos (p. ej. transfusión sanguínea, plasma, Factor VIII, inmunoglobulina, etc.) las pruebas de "detección" están formateadas típicamente para aumentar la sensibilidad (para asegurar que no pasa sangre contaminada) a expensas de la especifidad; es decir, se aumenta la cantidad de falsos positivos. Así pues, es típico aplazar solamente para prueba adicional a aquellos donantes que son "repetidamente reactivos"; es decir positivos en dos o más pruebas de inmunoanálisis en la muestra del donante. Sin embargo, para confirmación de la positividad del HCV, las pruebas de "confirmación" se formatean típicamente para aumentar la especificidad (para asegurar que ninguna muestra de falso positivo se ha confirmado) a expensas de la sensibilidad.
La fase sólida seleccionada puede comprender granos de polímeros o de vidrio, de nitrocelulosa, de micropartículas, micropocillos de un plato de reacción, tubos de ensayo y lechos magnéticos. La señal que genera el compuesto puede comprender un enzima, un compuesto luminiscente, un elemento radioactivo y un compuesto quimioluminiscente. Ejemplos de enzimas comprenden la fosfatasa alcalina, la peroxidasa del rábano picante y la beta-galactosidasa. Ejemplos de compuestos intensificadores comprenden la biotina, anti-biotina y avidina. Para bloquear los efectos de sustancias similares al Factor reumatoide la muestra de la prueba se somete a condiciones suficientes para bloquear el efecto de las sustancias similares al Factor reumatoide. Estas condiciones comprenden el poner en contacto la muestra de prueba con una cantidad de IgG anti-humana para formar una mezcla, y la incubación de la mezcla durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para formar un producto de mezcla de reacción sustancialmente exento de sustancias similares al Factor reumatoide.
La presente invención se refiere a un formato de inmunoanálisis en el que los polipéptidos (o péptidos) de la invención están acoplados a una membrana en forma de líneas paralelas. Este formato de análisis es particularmente ventajoso con fines de tipificación del HCV.
La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende por lo menos un polipéptido (recombinante) según se definió anteriormente y un excipiente, diluyente o portador adecuado.
La presente invención se refiere además a un procedimiento de prevención de la infección por HCV, que comprende la administración de la composición farmacéutica según se definió anteriormente para un mamífero en una cantidad eficaz para estimular la producción del anticuerpo protector o la respuesta del linfocito T protector.
La presente invención se refiere a la utilización de una composición según se definió anteriormente en un procedimiento para la prevención de la infección por HCV.
La presente invención se refiere además a una vacuna para la inmunización de un mamífero contra la infección por HCV, que comprende por lo menos un polipéptido (recombinante) definido anteriormente, en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
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El término "inmunogénico" se refiere a la capacidad de una sustancia para producir una respuesta humoral y/o celular, sola o ligada a un portador, en presencia o ausencia de un adyuvante. "Neutralización" se refiere a una respuesta inmunitaria que bloquea la infecciosidad, bien parcial o totalmente, de un agente infeccioso. Una vacuna es una composición inmunógena capaz de conseguir protección frente al HCV, parcial o completamente. Una vacuna puede además ser útil para el tratamiento de un individuo, en cuyo caso se denomina vacuna terapéutica.
El término "terapéutico" se refiere a una composición capaz de tratar la infección por HCV. El término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de polipéptido que lleva suficiente epítopo para provocar una respuesta inmunógena en el individuo al que se administra o por otra parte inmunoreacciona detectablemente en su sistema pretendido (p. ej. inmunoanálisis). Preferentemente, la cantidad eficaz es suficiente para efectuar el tratamiento, según se definió anteriormente. La cantidad exacta necesaria variará según la aplicación. Para las aplicaciones como vacuna o para la generación de antisuero/anticuerpos policlonales, por ejemplo, la cantidad eficaz puede variar dependiendo de las especies, edad, y condición general del individuo, de la gravedad de la enfermedad a tratar, del polipéptido en particular seleccionado y su modo de administración, etc. Se cree además que las cantidades eficaces, se encuentran dentro de un intervalo no crítico, relativamente grande. Una cantidad eficaz apropiada se puede determinar fácilmente utilizando sólo experimentación de rutina. Los intervalos de proteínas preferidos para la profilaxis de la enfermedad por el HCV son 0,01 a 100 \mug/dosis, preferentemente de 0,1 a 50 \mug/dosis. Pueden ser necesarias varias dosis por individuo para conseguir una respuesta inmunitaria suficiente y protección posterior frente a la enfermedad por HCV.
La presente invención se refiere además a una vacuna definida anteriormente, que comprende por lo menos un polipéptido (recombinante) definido anteriormente, siendo dicho polipéptido exclusivo para por lo menos uno de los subtipos o tipos definidos anteriormente.
Dichas composiciones de vacuna pueden comprender composiciones de vacuna profilácticas así como terapéuticas.
Los portadores farmacéuticamente aceptables comprenden cualquier portador que no provoque él mismo la producción de anticuerpos poderosos en el individuo que recibe la composición. Portadores adecuados son macromoléculas típicamente largas, metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos; y partículas de virus inactivas. Dichos portadores son bien conocidos por los expertos en la materia.
Los adyuvantes preferidos para aumentar la eficacia de la composición comprenden, pero no se limitan a: hidróxido de aluminio (alum), N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) como se encuentra en la patente U.S. nº 4.606.918, N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE) y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de las bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa y el esqueleto de la pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión de escualeno al 2%/Tween 80. Cualquiera de los 3 componentes MPL, TDM o CWS se puede también utilizar solo o combinado 2 a 2. Adicionalmente, los adyuvantes tales como Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA).
Las composiciones inmunógenas utilizadas como vacunas comprenden una "cantidad suficiente" o "una cantidad inmunológicamente eficaz" de las proteínas de la presente invención, así como cualquier otro de los componentes necesitados, mencionados anteriormente. "Cantidad inmunológicamente eficaz", significa que la administración de la cantidad a un individuo, bien en una sola dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento, definido anteriormente. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratar, del grupo taxonómico del individuo a tratar (p. ej. primates no humanos, primate, etc.), de la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, del grado de protección deseado, de la formulación de la vacuna, del juicio del doctor sobre el tratamiento de la situación médica, de la cepa del HCV infectante, y de otros factores relevantes. Es de esperar que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar mediante pruebas de rutina. Generalmente, la cantidad variará de 0,01 a 1000 \mug/dosis, más particularmente de 0,1 a 100 \mug/dosis.
Las proteínas de la invención pueden servir así mismo como portadores de vacuna al presentar homólogos (p. ej. epítopos de linfocitos T o epítopos de linfocitos B de por ejemplo zonas de la parte central, E1, E2, NS2, NS3, NS4 ó NS5) o haptenos heterólogos (distintos del HCV), de la misma forma que el antígeno de superficie de la hepatitis B (véase la solicitud de la patente europea nº 174 444). En esta utilización, las proteínas de la envoltura proporcionan un portador inmunógeno capaz de estimular una respuesta inmunitaria a los haptenos o antígenos conjugados en el agregado. El antígeno puede estar conjugado bien mediante procedimientos químicos convencionales, o puede estar clonado en el gen que codifica E1 y/o E2 en una posición que corresponde a una zona hidrófila de la proteína. Dichas zonas hidrófilas comprenden la zona V1 (que abarca las posiciones de los aminoácidos 191 a 202), la zona V2 (que abarca las posiciones de los aminoácidos 213 a 223), la zona V3 (que abarca las posiciones de los aminoácidos 230 a 242), la zona V4 (que abarca las posiciones de los aminoácidos 230 a 242), la zona V5 (que abarca las posiciones de los aminoácidos 294 a 303) y la zona V6 (que abarca las posiciones de los aminoácidos 329 a 336). Otra posición útil para la inserción de haptenos es la zona hidrófoba (que abarca aproximadamente las posiciones de los aminoácidos 264 a 293). Se demuestra en la presente invención que esta zona se puede eliminar sin afectar la reactividad de la proteína E1 eliminada con antisueros. Por lo tanto, los haptenos se pueden insertar en el sitio de la eliminación.
Las composiciones inmunógenas se administran convencionalmente por vía parenteral, típicamente mediante inyección, por ejemplo, por vía subcutánea o por vía intramuscular. Las formulaciones adecuadas para otros procedimientos de administración comprenden las formulaciones orales y los supositorios. La dosis de tratamiento puede ser un programa de una sola dosis o un programa de dosis múltiple. La vacuna se puede administrar junto con otros agentes inmunorregulatorios.
La administración de el/los inmunogen(es) de la presente invención puede ser bien con fines profilácticos o terapéuticos. Cuando se suministra profilácticamente, el/los inmunogen(es) se suministra(n) antes de cualquier exposición al HCV o antes de cualquier síntoma debido a la infección del HCV. La administración profiláctica del inmunogen sirve para prevenir o atenuar cualquier infección posterior del HCV en un mamífero. Cuando se suministra terapéuticamente, el/los inmunogen(es) se suministra(n) al principio (o inmediatamente después) de la infección o al principio de cualquier síntoma de infección o de la enfermedad producida por el HCV. La administración terapéutica de el/los inmunogen(es) sirve para atenuar la infección o la enfermedad.
Además para utilizar como vacuna, las composiciones se pueden utilizar para preparar anticuerpos para las proteínas (E1) del HCV. Los anticuerpos se pueden utilizar directamente como agentes antivíricos. Para preparar anticuerpos, se inmuniza un animal huésped utilizando las proteínas naturales E1 en la partícula de virus unida a un portador como se describió anteriormente para las vacunas. El suero o el plasma del huésped se recoge después de un intervalo de tiempo apropiado para proporcionar una composición que comprende anticuerpos que reaccionan con la proteína (E1) de la partícula de virus. La fracción de gammaglobulina de los anticuerpos de IgG se puede obtener, por ejemplo, utilizando sulfato de amonio saturado o DEAE Sephadex, u otras técnicas conocidas en la materia. Los anticuerpos están sustancialmente exentos de muchos de los efectos secundarios adversos que pueden estar relacionados con otros agentes antivíricos tales como los fármacos.
La presente invención se refiere así mismo particularmente a un péptido que corresponde a una secuencia de aminoácidos codificada mediante por lo menos una de las secuencias genómicas del HCV definidas anteriormente, siendo dicho péptido exclusivo para el tipo 7 del HCV definido en la Tabla 5, o un análogo de éste sustancialmente homólogo y biológicamente equivalente.
La presente invención se refiere particularmente a un péptido que comprende por lo menos un epítopo exclusivo de las nuevas secuencias de la invención representadas por las SEC ID nº 43, 45, 47, 89, 91, 93, 44, 46, 48, 90, 92, 94, 115, 116, 136, 137, 153, 154, 172, 173, 188, 189, 205 ó 206.
La presente invención se refiere así mismo particularmente a un péptido que comprende en su secuencia un resto de aminoácidos exclusivo de la invención definido anteriormente.
La presente invención se refiere particularmente a un péptido que está biotinilado según se explica en el documento nº WO 93/18054.
Todas las formas de realización (formatos de inmunoanálisis, vacunas, composiciones, utilizaciones, etc.) ilustradas para los polipéptidos de la invención como anteriormente se refieren así mismo a los péptidos de la invención.
La presente invención se refiere así mismo a un procedimiento para la identificación de los anticuerpos para el HCV presentes en una muestra biológica, que comprende:
(i) la puesta en contacto de la muestra biológica a analizar la presencia del HCV con un péptido definido anteriormente,
(ii) la identificación del inmunocomplejo formado entre dichos anticuerpos y dicho péptido.
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La presente invención se refiere así mismo a un procedimiento para la tipificación del HCV, que comprende:
(i) la puesta en contacto de la muestra biológica a analizar la presencia del HCV con un péptido definido anteriormente,
(ii) la identificación del inmunocomplejo formado entre dichos anticuerpos y dicho péptido.
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La presente invención se refiere así mismo a un equipo de diagnóstico para utilización en la identificación de la presencia del HCV, comprendiendo dicho equipo por lo menos un péptido definido anteriormente, estando dicho péptido preferentemente unido a un soporte sólido.
La presente invención se refiere así mismo a un equipo de diagnóstico para la tipificación del HCV, comprendiendo dicho equipo un péptido por lo menos definido anteriormente, estando dicho péptido preferentemente unido a un soporte sólido.
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La presente invención se refiere así mismo a un equipo de diagnóstico definido anteriormente, en el que dichos péptidos se seleccionan de entre los siguientes:
- por lo menos un péptido NS4,
- por lo menos un péptido NS4 y por lo menos un péptido de la parte central,
- por lo menos un péptido NS4 y por lo menos un péptido de la parte central y por lo menos un péptido de E1,
- por lo menos un péptido NS4 y por lo menos un péptido de E1.
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La presente invención se refiere así mismo a un equipo de diagnóstico definido anteriormente, comprendiendo dicho equipo un intervalo de dichos péptidos que está unido a posiciones específicas en un sustrato sólido.
La presente invención se refiere así mismo a un equipo de diagnóstico definido anteriormente, en el que dicho soporte sólido es una tira de membrana y dichos péptidos están acoplados a la membrana en forma de líneas paralelas.
La presente invención se refiere así mismo a una composición farmacéutica que comprende por lo menos una definida anteriormente y un excipiente, diluyente o portador adecuado.
La presente invención se refiere así mismo a un procedimiento de prevención de la infección por HCV, que comprende la administración de la composición farmacéutica definida anteriormente para un mamífero en una cantidad eficaz para estimular la producción del anticuerpo protector o la respuesta protectora de los linfocitos T.
La presente invención se refiere así mismo a la utilización de una composición definida anteriormente en un procedimiento para la prevención de la infección por HCV.
La presente invención se refiere así mismo a una vacuna para la inmunización de un mamífero contra la infección por HCV, que comprende por lo menos un péptido definido anteriormente, en un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere así mismo a una vacuna definida anteriormente, que comprende por lo menos un péptido definido anteriormente, siendo dicho péptido exclusivo para el tipo 7 del HCV definido en la Tabla 5.
La presente invención se refiere a un anticuerpo producido en la inmunización por lo menos con un polipéptido o un péptido definidos anteriormente, siendo dicho anticuerpo específicamente reactivo con cualesquiera de dichos polipéptidos o péptidos, y siendo dicho anticuerpo preferentemente un anticuerpo monoclonal.
Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden producir mediante cualquier hibridoma que tenga tendencia a formarse según los procedimientos clásicos de las células esplénicas de un animal, particularmente de un ratón o de una rata, inmunizada contra los polipéptidos del HCV según la invención definidos anteriormente por una parte, y de las células de una línea celular de mieloma por otra parte, y para ser seleccionadas por la capacidad del hibridoma para producir los anticuerpos monoclonales que reconocen los polipéptidos que se han utilizado inicialmente para la inmunización de los animales.
Los anticuerpos implicados en la invención se pueden marcar mediante una marca apropiada de tipo enzimático, fluorescente o radiactivo.
Los anticuerpos monoclonales según está forma de realización preferida de la invención pueden ser versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales de ratón elaborados mediante tecnología de ADN recombinante, a partir de partes de secuencias de ADN genómico de ratón y/o humano que codifican cadenas de H y L o que codifican clones de cADN para cadenas de H y L.
Por otra parte los anticuerpos monoclonales según esta forma de realización preferida de la invención pueden ser anticuerpos monoclonales humanos. Estos anticuerpos según la presente forma de realización de la invención pueden proceder de linfocitos de la sangre periférica de pacientes infectados con el tipo 7 del HCV (subtipos 7a, 7c ó 7d), o vacunados contra el HCV. Dichos anticuerpos monoclonales humanos se preparan, por ejemplo, mediante repoblación de linfocitos de la sangre periférica humana (PBL) de ratones con carencia inmunitaria combinada grave (SCID) (para reseña reciente, véase Duchosal y otros, 1992) o mediante detección de los linfocitos transformados por el virus de Eppstein Barr de individuos infectados o vacunados por la presencia de linfocitos B reactivos mediante los antígenos de la presente invención.
La invención se refiere así mismo a la utilización de la proteínas de la invención, de sus muteínas o de los péptidos procedentes de éstos para la selección de anticuerpos recombinantes mediante el procedimiento de clonación de repertorio (Persson y otros, 1991).
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Los anticuerpos dirigidos a los péptidos procedentes de un determinado genotipo se puede utilizar bien para la detección de 5 de dichos genotipos del HCV o como agentes terapéuticos.
La presente invención se refiere así mismo a un procedimiento para la detección de antígenos presentes en una muestra biológica, que comprende:
(i) la puesta en contacto de dicha muestra biológica con un anticuerpo definido anteriormente,
(ii) la identificación de inmunocomplejos formados entre dichos antígenos del HCV y dicho anticuerpo.
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La presente invención se refiere así mismo a un procedimiento para la tipificación del HCV, que comprende:
(i) la puesta en contacto de dicha muestra biológica con un anticuerpo definido anteriormente,
(ii) la identificación de inmunocomplejos formados entre dichos antígenos del HCV y dicho anticuerpo.
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La presente invención se refiere así mismo a un equipo de diagnóstico para utilización en la detección de la presencia del HCV, comprendiendo dicho equipo por lo menos un anticuerpo definido anteriormente, estando dicho anticuerpo preferentemente unido a un soporte sólido.
La presente invención se refiere así mismo a un equipo de diagnóstico para la tipificación del HCV, comprendiendo dicho equipo por lo menos un anticuerpo definido anteriormente, estando dicho anticuerpo preferentemente unido a un soporte sólido.
La presente invención se refiere así mismo a un equipo de diagnóstico definido anteriormente, comprendiendo dicho equipo un intervalo de dichos anticuerpos que están unidos en posiciones específicas sobre un sustrato sólido.
La presente invención se refiere así mismo a una composición farmacéutica que comprende por lo menos un anticuerpo definido anteriormente y un excipiente, diluyente o portador adecuado.
La presente invención se refiere así mismo a un procedimiento de prevención o tratamiento de la infección por HCV, que comprende la administración de la composición farmacéutica definida anteriormente para un mamífero en una cantidad eficaz.
La presente invención se refiere así mismo a la utilización de una composición definida anteriormente en un procedimiento para la prevención o el tratamiento de la infección por HCV.
El genotipo se puede también identificar mediante un anticuerpo de tipo específico definido anteriormente, que puede también estar unido a cualquier secuencia de polinucleótido que puede ser amplificada después mediante PCR para detectar el inmunocomplejo formado (Immuno-PCR, Sano y otros, 1992).
Algunas publicaciones de la solicitudes de patentes referidas en esta memoria se incorporan como referencia. Los ejemplos siguientes ilustran aspectos de la invención pero no pretenden de ninguna manera limitar su alcance.
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Leyendas de las figuras
Figura 1
Alineación de las secuencias del nucleótido de la zona central/E1 de algunas de las cepas de los tipos y subtipos identificados recientemente de la presente invención, con otras cepas de subtipos de prototipo conocido.
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Figura 2
Alineación de las secuencias de aminoácidos de la zona central/E1 de algunas de las cepas de los tipos y subtipos identificados recientemente de la presente invención, con otras cepas de subtipos de prototipo conocido.
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Figura 3
Secuencias de nucleótidos y aminoácidos obtenidas a partir de nuevas cepas del HCV de la presente invención (SEC ID nº 1 a 106).
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Figura 4
Alineación de las secuencias de aminoácidos de la zona central /E1 de algunas de las cepas de los tipos y subtipos identificados recientemente de la presente invención, con otras cepas de subtipos de prototipo conocido.
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Figura 5
Alineación de las secuencias de nucleótido de la zona NS5b de algunas de las cepas de los tipos y subtipos identificados recientemente de la presente invención, con otras cepas de subtipos de prototipo conocido.
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Figura 6
Alineación de las secuencias de aminoácidos de la zona NS5b de algunas de las cepas de los tipos y subtipos identificados recientemente de la presente invención, con otras cepas de subtipos de prototipo conocido.
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Tabla 5
Panorámicas de los nuevos subtipos y tipos de la presente invención y de las zonas secuenciadas. Los subtipos entre paréntesis se han sustituido por los tipos sin paréntesis siguiendo la clasificación de Tokita y otros (1994).
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Ejemplos Muestras de suero
Se examinaron los anticuerpos del HCV en las muestras de suero de donantes de sangre cameruniana (CAM) con Innotest HCV AbIII y se confirmaron mediante INNO-LIA HCV III (Innogenetics, Amberes, Bélgica). Se consiguieron muestras de suero de pacientes con infección de hepatitis C crónica de varios centros en los países del Benelux (BNL), de Francia (FR), de Paquistán (PAK), de Egipto (EG) y de Vietnam (VN).
Se seleccionaron muestras del Benelux, Camerún, Francia y Vietnam a causa de sus reactividades aberrantes (cepas CAM1078, FR2, FR1, VN4, VN12, VN13, NE98 y otras (véase Tabla 5)).
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Clonación y secuenciado de cPCR y LiPA
El aislamiento del ARN, la síntesis del cADN, PCR, la clonación y el genotipado de LiPA utilizando productos de amplificación UR de 5' biotinilados, se realizaron según describe (Stuyver y otros, hacía 1994). Se utilizaron los productos UR de 5', de la parte central/E1 y de PCR de NS5B para secuenciado directo. La secuencia de los cebadores universales HCPr95, HCPr96, HCPr98 y HCPr29 de 5' UR, se describió anteriormente (Stuyver y otros, antes de 1993). Se describieron así mismo los siguientes cebadores (Stuyver y otros, hacía 1994): HCPr41, un cebador de la cadena transcrita para la amplificación de la zona central; HCPr52 y HCPr54 para la amplificación de la zona central/E1 y HCPr206 y HCPr207 para la amplificación de una zona de NS5B de 340-bp.
Se analizaron muestras de suero BNL1, BNL2, BNL3, BNL4, BNL5, BNL6, BNL7, BNL8, BNL9, BNL10, BNL11, BNL12, CAM1078, FR2, FR16, FR4, FR13, VN13, VN4, VN12, FR1, NE98 y FR19 en la zona central/E1 por secuenciado directo. Las muestras de suero BNL1, BNL2, FR17, CAM1078, FR2, FR16, BNL3, FR4, BNL5, FR13, FR18, PAK64, BNL8, BNL12, EG81, VN13, VN4, VN12, FR1, NE98, FR14, FR15 y FR19 se analizaron también en la zona de NS5B por secuenciado directo. Se obtuvieron las secuencias parciales de 5' UR,de la parte central, de E1 y de NS5B. La longitud de las secuencias obtenidas es suficiente para clasificar las secuencias obtenidas en nuevos tipos o subtipos, basados en las distancias filogenéticas para secuencias conocidas. Las siguientes secuencias se podrían obtener (las secuencias de nucleótido tienen la SEC ID nº impar, las secuencias de aminoácidos tienen la SEC ID nº par): SEC ID nº 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 y 105. Las secuencias de aminoácidos deducidas de éstos se dan en SEC ID nº 2, 4, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104 y 106. La Tabla 5 da una panorámica de estas secuencias.
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Análisis filogenético
Las secuencias publicadas anteriormente se tomaron de la base de datos EMBL/Genbank. Las alineaciones se crearon utilizando el programa HCVALIGN (Stuyver y otros, hacia 1994). Las secuencias se presentaron en un formato secuencial en el Paquete de Inferencias de filogenia (PHYLIP) versión 3.5 (programa de dominio público disponible libremente de la Universidad de Washington, Seattle, USA). Se produjeron matrices de distancia mediante DNADIST utilizando la asignación del parámetro Kimura-2 y se analizaron además en NEIGHBOR, utilizando la asignación de acoplamiento neighbor. Se utilizó el programa DRAWTREE para crear resultados gráficos.
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Identificación de nuevos subtipos
Estos análisis indicaron el agrupamiento de BNL1, BNL2, CAM1078, FR2, FR16 y FR17 con cepas del tipo 1, todavía ninguna de estas secuencias agrupadas junto con cualquiera de los subtipos de tipo 1 conocidos 1a, 1b ó 1c. BNL1, BNL2 y FR17 se agruparon claramente juntas y se podrían asignar a un nuevo subtipo d de tipo 1, mientras que CAM1078 se podría clasificar en otro nuevo subtipo 1e, FR2 se podría clasificar en otro subtipo 1f de tipo 1 y FR16 se podría clasificar todavía en otro subtipo 1g de tipo 1. Ventajosamente, las 3 cepas del tipo 1d (BNL1, BNL2 y FR17) y la cepa FR16 del 1g se obtuvieron de pacientes de origen étnico marroquí que residían en Europa.
Otro grupo de cepas mostró homología en otras secuencias de tipo 2, pero ninguna de las cepas BNL3, FR4, BNL4, BNL5, BNL6, FR13 ó FR18 se prodrían clasificar en uno de los subtipos 2a, 2b, 2c conocidos de tipo 2 (Bukh y otros, 1993), ó 2d (Stuyver y otros, hacia 1994). Basada en las distancias filogenéticas a otras cepas de tipo 2 y a otras cepas del grupo, cada una de estas cepas se podría clasificar en un nuevo subtipo del tipo 2. A BNL3 se le asignó el subtipo 2e, a FR4 el subtipo 2f, a BNL4 el subtipo 2g, a BNL5 el subtipo 2h y BNL6 se prodría clasificar todavía en otro subtipo 2i del tipo 2. Si la cepa HN4 publicada anteriormente está clasificada como 2j, las FR13 y FR18 se pueden clasificar en dos nuevos subtipos 2k y 2l del tipo 2. Sin embargo, la posibilidad de que FR13 y FR18 puedan pertenecer a los subtipos 2g ó 2i no ha sido todavía excluida. La clasificación definitiva se puede conseguir determinando las secuencias NS5B de las cepas BNL4 y BNL6, que pertenecen a los subtipos 2g y 2i, respectivamente.
La cepa PAK64 presentaba homología con las secuencias de tipo 3, pero no se podía clasificar en uno de los subtipos 3a a f de tipo 3. Basado en las distancias filogenéticas a otras cepas de tipo 3, PAK64 se podría clasificar en un nuevo subtipo de tipo 3. A PAK64 se le asignó el subtipo 3g. Sin embargo, la posibilidad de que PAK64 pertenezca a un nuevo subtipo de tipo 3 no se puede excluir estrictamente ya que se ha secuenciado solamente una zona del genoma. La clasificación definitiva se puede conseguir determinando las secuencias de la parte central/E1 de la cepa PAK64 tras la amplificación con los cebadores HcPr52 y HcPr54.
Entre las muestras del Benelux y de Egipto que se analizaron, algunas secuencias se agruparon con los subtipos 4c y 4d del tipo 4 identificados anteriormente. Sin embargo, BNL7, BNL8, BNL9, BNL10, BNL11, BNL12 y EG81 se agruparon en nuevos subtipos de tipo 4. Las cepas BNL7, BNL8, BNL9, BNL10 y BNL11 se agruparon de nuevo por separado de BNL12 y EG81 en un nuevo subtipo 4k. Este subtipo fue el subtipo predominante en los países del Benelux. BNL12 y EG81 se segregaron así mismo en subtipos separados. A BNL12 se asignó a otro nuevo subtipo 41 y EG81 se asignó a todavía otro nuevo subtipo 4m.
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Identificación de nuevos tipos principales de HCV
Las cepas FR1, VN4, VN12, VN13, NE98, FR14, FR15 y FR19 no se agrupan con ninguno de los tipos 6 principales del HCV. VN4, VN12 y VN13 estaban muy distanciadas respecto al genotipo 6, pero los análisis filogenéticos indicaban que estas cepas deberían estar asignadas a nuevos tipos principales. VN13, VN4 y VN12 se relacionaron con el nivel del subtipo y se asignaron a los tipos 7a, 7c y 7d, respectivamente.
FR1 no se relacionó con ninguna cepa conocida y se le asignó el genotipo 9a. NE98 presenta una distancia relacionada con las secuencias de tipo 3. FR14, FR15 y FR19 presentan una distancia muy relacionada con las secuencias de tipo 2, todavía el análisis filogenético indicó que las cepas a clasificar en un nuevo tipo 11 principal, pertenecen todas al mismo subtipo denominado 11a. Dependiendo de las pautas internacionales de asignación de los nivelas de tipo y subtipo, FR14, FR15 y FR19 se pueden también clasificar en un subtipo de tipo 2 adicional.
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Referencias
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Claims (61)

1. Un poli(ácido nucleico) de HCV tipo 7 seleccionado del grupo constituido por:
-
una secuencia de nucleótidos de HCV que tiene una homología de al menos 90% o más con las secuencias representadas en SEQ ID NO 45,
-
una secuencia de nucleótidos de HCV que tiene homología de al menos 85% o más con cualquiera de las secuencias representadas en SEQ ID NO 43 ó 47,
-
una secuencia de nucleótidos de HCV que tiene una homología de al menos 80% o más con cualquiera de las secuencias representadas en SEQ ID NO 89, 91 ó 93,
-
o el complemento del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un poli(ácido nucleico) de HCV tipo 7 que contiene una secuencia de 8 o más nucleótidos contiguos, secuencia que es exclusiva para una secuencia de nucleótidos de HCV seleccionada del grupo constituido por:
-
SEQ ID NO 45 en la región que abarca las posiciones 1 a 413 de la región Core,
-
SEQ ID NO 43 ó 47 en la región que abarca las posiciones 1 a 957 de la región Core/E1,
-
SEQ ID NO 89, 91 ó 93 en la región que abarca las posiciones 7932 a 8271 de la región NS5,
-
o el complemento del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un poli(ácido nucleico) de HCV tipo 7 de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 que codifica una poliproteína de HCV tipo 7 que comprende en su secuencia de aminoácidos al menos uno de los residuos de aminoácidos siguientes:
- A58, H70, Q71 o N71, D106, I134, E135, E150, K197, L235, A242, E260 o K260, L293, I300, S2646, V2652, Q2653, H2656, K2663, A2667 o V2667, D2677, I2707, A2709, F2730, L2746, S2749 o P2749, T2752 o V2752, D2753 o G2753,
estando compuesta dicha notación por una letra que representa el residuo de aminoácido de acuerdo con su código de una sola letra, y un número que representa la numeración del aminoácido como se muestra en la Tabla 1, o el complemento de dicho poli(ácido nucleico) de HCV.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un poli(ácido nucleico) que codifica una poliproteína de HCV que comprende en su secuencia de aminoácidos al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista siguiente:
100
o el complemento de dicho poli(ácido nucleico) de HCV.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un poli(ácido nucleico) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que tiene una secuencia seleccionada de cualquiera de SEQ ID NOs 43, 45, 47, 89, 91 ó 93, o el complemento de dicho poli(ácido nucleico) de HCV tipo 7 o dicha parte.
6. Un poli(ácido nucleico) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que codifica la región 5' UR, Core/E1, NS4 o NS5B.
7. Un poli(ácido nucleico) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que es una secuencia de cDNA.
8. Un iniciador oligonucleotídico que comprende parte de un poli(ácido nucleico) de HCV tipo 7 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, siendo capaz dicho iniciador de actuar como iniciador para amplificar específicamente ácidos nucleicos de HCV tipo 7.
9. Una sonda oligonucleotídica que comprende parte de un poli(ácido nucleico) de HCV tipo 7 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, siendo capaz dicha sonda de actuar como sonda de hibridación para detección y/o clasificación específicas de un ácido nucleico de HCV tipo 7 que contiene dicha secuencia de nucleótidos.
10. Un kit de diagnóstico para uso en la determinación del genotipo de HCV, comprendiendo dicho kit un iniciador de acuerdo con la reivindicación 8.
11. Un kit de diagnóstico para uso en la determinación del genotipo de HCV, comprendiendo dicho kit una sonda de acuerdo con la reivindicación 9.
12. Un kit de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicha o dichas sondas está(n) fijada(s) a un sustrato sólido.
13. Un kit de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 12, en donde una gama de dichas sondas están fijadas a localizaciones específicas en un sustrato sólido.
14. Un kit de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicho sustrato sólido es una tira de membrana y dichas sondas están acopladas a la membrana en la forma de líneas paralelas.
15. Un método para la detección de ácidos nucleicos de HCV presentes en una muestra biológica, que comprende determinar la presencia de una secuencia de ácido nucleico de HCV tipo 7 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 por medio de una reacción en secuencia.
16. Un método para la detección de ácidos nucleicos de HCV presentes en una muestra biológica, que comprende:
(i)
amplificar los ácidos nucleicos de dicha muestra biológica con al menos un iniciador de acuerdo con la reivindicación 8, y,
(ii)
detectar los ácidos nucleicos amplificados.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Un método para la detección de ácidos nucleicos de HCV presentes en una muestra biológica, que comprende:
(i)
hibridar los ácidos nucleicos de dicha muestra biológica en condiciones apropiadas con una o más sondas de acuerdo con la reivindicación 9, y,
(ii)
detectar los híbridos formados.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Un método para detectar la presencia de uno o más genotipos de HCV presentes en una muestra biológica, que comprende:
(i)
amplificar específicamente el ácido nucleico con al menos un iniciador de acuerdo con la reivindicación 8,
(ii)
detectar dichos ácidos nucleicos amplificados, y,
(iii)
inferir la presencia de uno o más genotipos de HCV a partir del patrón observado de fragmentos amplificados.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
19. Un método para detectar la presencia de uno o más genotipos de HCV presentes en una muestra biológica, que comprende:
(i)
hibridar los ácidos nucleicos de la muestra biológica en condiciones apropiadas con una o más sondas de acuerdo con la reivindicación 9,
(ii)
detectar los híbridos formados, y,
(iii)
inferir la presencia de uno o más genotipos de HCV del patrón de hibridación observado.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Un método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dichas sondas se caracterizan adicionalmente como se define en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.
21. Un método de acuerdo con la reivindicación 16 ó 18, en donde dichos ácidos nucleicos se marcan durante o después de la amplificación.
22. Un polipéptido de HCV tipo 7 que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un poli(ácido nucleico) de HCV tipo 7 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
23. Un polipéptido de HCV tipo 7 de acuerdo con la reivindicación 22 que comprende en su secuencia de aminoácidos al menos uno de los residuos de aminoácidos siguientes: A58, H70, Q71 o N71, D106, I134, E135, E150, K197, L235, A242, E260 o K260, L293, I300, S2646, V2652, Q2653, H2656, K2663, A2667 o V2667, D2677, I2707, A2709, F2730, L2746, S2749 o P2749, T2752 o V2752, D2753 o G2753, estando compuesta dicha notación por una letra que representa el residuo de aminoácido por su código de una sola letra, y un número que representa la numeración del aminoácido como se muestra en la Tabla 1.
24. Un polipéptido de HCV tipo 7 de acuerdo con la reivindicación 22, que comprende en su secuencia de aminoácidos al menos una de las secuencias representadas por cualquiera de SEQ ID NOs 115, 116, 136, 137, 153, 154, 172, 173, 188, 189, 205 ó 206 como se enumeran en la reivindicación 4.
25. Un polipéptido de HCV tipo 7 que tiene una secuencia de aminoácidos como la representada en cualquiera de SEQ ID NOs 44, 46, 48, 90, 92 ó 94, o una parte de la misma, que es exclusiva para de HCV tipo 7.
26. Un polipéptido recombinante codificado por un poli(ácido nucleico) de HCV tipo 7 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
27. Un método para producción de un polipéptido recombinante de la reivindicación 26, que comprende:
-
transformar un hospedador celular apropiado con un vector recombinante, en el cual un poli(ácido nucleico) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 se ha insertado bajo el control de los elementos reguladores apropiados,
-
cultivar dicho hospedador celular transformado en condiciones que permiten la expresión de dicha inserción, y
-
cosechar dicho polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
28. Un vector de expresión recombinante que comprende un poli(ácido nucleico) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 enlazado operativamente a elementos de transcripción procariotas, eucariotas o virales y elementos de control de la traducción.
29. Una célula hospedadora transformada con un vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 28.
30. Un método para detección de anticuerpos para de HCV presentes en una muestra biológica, que comprende:
(i)
poner en contacto la muestra biológica a analizar en cuanto a la presencia de HCV con un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, y,
(ii)
detectar el complejo inmunológico formado entre dichos anticuerpos y dicho polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
31. Un método para tipificación de HCV, que comprende:
(i)
poner en contacto la muestra biológica a analizar respecto a la presencia de HCV con un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, y,
(ii)
detectar el complejo inmunológico formado entre dichos anticuerpos y dicho polipéptido.
\global\parskip1.000000\baselineskip
32. Un kit de diagnóstico para uso en la detección de la presencia de HCV, comprendiendo dicho kit al menos un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26.
33. Un kit de diagnóstico para tipificación de HCV, comprendiendo dicho kit al menos un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26.
34. Un kit de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 32 ó 33, comprendiendo dicho kit una gama de polipéptidos que están fijados a localizaciones específicas sobre un sustrato sólido.
35. Un kit de diagnóstico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, en donde dicho sustrato sólido es una tira de membrana y dichos polipéptidos están acoplados a la membrana en la forma de líneas paralelas.
36. Una composición farmacéutica que comprende al menos un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26 y un excipiente, diluyente o vehículo adecuado.
37. Uso de una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 36 para la preparación de una composición farmacéutica que estimula la producción de anticuerpo protector o respuesta protectora de las células T.
38. Uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 36 para la preparación de una composición farmacéutica para prevención de la infección por HCV.
39. Una vacuna para inmunización de un mamífero contra la infección por HCV, que comprende al menos un polipéptido de HCV tipo 7 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
40. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 39, que comprende al menos un polipéptido de HCV tipo 7 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26.
41. Un péptido de HCV tipo 7 correspondiente a una secuencia de aminoácidos codificada por al menos uno de los poli(ácidos nucleicos) de HCV tipo 7 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
42. Un método para detección de anticuerpos para de HCV presentes en una muestra biológica, que comprende:
(i)
poner en contacto la muestra biológica a analizar en cuanto a la ausencia de anticuerpos de HCV con un péptido de acuerdo con la reivindicación 41, y,
(ii)
detectar el complejo inmune formado entre dichos anticuerpos y dicho péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
43. Un método para tipificación de HCV, que comprende:
(i)
poner en contacto la muestra biológica a analizar en cuanto a la presencia de HCV con un péptido de acuerdo con la reivindicación 41, y,
(ii)
detectar el complejo inmune formado entre dichos anticuerpos y dicho péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
44. Un kit de diagnóstico para uso en la detección de la presencia de HCV, comprendiendo dicho kit al menos un péptido de acuerdo con la reivindicación 41.
45. Un kit de diagnóstico para tipificación de HCV, comprendiendo dicho kit al menos un péptido de acuerdo con la reivindicación 41.
46. Un kit de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 44 ó 45, en donde dichos péptidos se seleccionan de la lista siguiente:
-
al menos un péptido NS4,
-
al menos un péptido NS4 y al menos un péptido Core,
-
al menos un péptido NS4 y al menos un péptido Core y al menos un péptido E1, o,
-
al menos un péptido NS4 y al menos un péptido E1.
\vskip1.000000\baselineskip
47. Un kit de diagnóstico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46, comprendiendo dicho kit una gama de péptidos que están fijados a localizaciones específicas en dicho sustrato sólido.
48. Un kit de diagnóstico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 44 a 47, en donde dicho sustrato sólido es una tira de membrana y dichos péptidos están acoplados a la membrana en forma de líneas paralelas.
49. Una composición farmacéutica que comprende al menos un péptido de acuerdo con la reivindicación 41 y excipiente, diluyente o vehículo adecuado.
50. Uso de una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 49 para la preparación de una composición farmacéutica que estimula la producción de anticuerpo protector o respuesta protectora de las células T.
51. Uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 49 para la preparación de una composición farmacéutica que previene la infección por HCV.
52. Una vacuna para inmunizar un mamífero contra la infección por HCV, que comprende al menos un péptido de acuerdo con la reivindicación 41, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
53. Un anticuerpo generado por inmunización con al menos un polipéptido o péptido de HCV tipo 7 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26 ó 41, siendo dicho anticuerpo específicamente reactivo con cualquiera de dichos polipéptidos o péptidos, y siendo preferiblemente dicho anticuerpo un anticuerpo monoclonal.
54. Un método para la detección de los antígenos de HCV presentes en una muestra biológica, que comprende:
(i)
poner en contacto dicha muestra biológica con un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 53, y,
(ii)
detectar los complejos inmunes formados entre dichos antígenos de HCV y dicho anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
55. Un método para tipificación de HCV, que comprende:
(i)
poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 53, y,
(ii)
detectar los complejos inmunes formados entre dichos antígenos de HCV y dicho anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
56. Un kit de diagnóstico para uso en la detección de la presencia de HCV, comprendiendo dicho kit al menos un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 53.
57. Un kit de diagnóstico para tipificación de HCV, comprendiendo dicho kit al menos un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 53.
58. Un kit de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 56 ó 57, comprendiendo dicho kit una gama de anticuerpos que están fijados a localizaciones específicas en un sustrato sólido.
59. Una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 53, y un excipiente, diluyente o vehículo adecuado.
60. Uso de una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 59 para la preparación de una composición farmacéutica que previene o trata la infección por HCV.
61. Uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 59 para la preparación de una vacuna para tratar o prevenir la infección por HCV.
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