CN101563362B - 重组hcv e2糖蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了经修饰的丙型肝炎病毒(HCV)E2糖蛋白，其包含包括HVR1、HVR2和igVR可变区的HCV-E2受体结合结构域(RBD)，其中在所述可变区的至少一个中，可变区的至少一部分被柔韧的连接体序列替代。本发明还提供了包含所述经修饰的糖蛋白的疫苗组合物以及其使用方法。

Description

重组HCV E2糖蛋白
发明领域
本发明涉及用于丙型病毒性肝炎(HCV)感染的新型和改进的治疗。特别地，本发明涉及疫苗组合物，其用于基于施用重组HCV多蛋白来预防性和治疗性地治疗HCV感染。
发明背景
根据世界卫生组织的报告，丙型肝炎病毒(HCV)在世界范围内感染大约1.7亿至2亿人。尽管政府已增加了关于HCV如何传播的教育，以及尽管采取了预防计划，但是HCV仍继续扩散。大约80％的感染了HCV的人仍然是该病毒的携带者。在澳大利亚，每年报导大约16,000例新的HCV感染病例，新感染在静脉注射吸毒者(injection drug user)中最为盛行。HCV是最常见的血液传播的病毒感染，其导致相当大比例的人口死亡。
已知HCV感染受害者的肝脏和某些免疫细胞。因此，HCV比其他形式的肝炎更频繁地导致严重的肝病，例如纤维化、肝硬变、脂肪变性和肝细胞癌(肝癌)。HCV是导致需要肝移植的首要原因。通常认为，感染的急性期常常由于该感染的亚临床性质而未被识别，并且80％的个体发展成慢性状态。慢性感染是免疫系统不能产生针对该病毒的足够免疫应答的结果。
目前，没有用于HCV的疫苗，并且唯一可获得的用于治疗HCV的疗法依赖于抗病毒药物和药物组合的开发。抗病毒药物设计背后的一般理念是鉴定可以被使得丧失功能或被抑制的病毒蛋白质或蛋白质的部分。选择用于患有中度或严重纤维化的患者的标准治疗包括α-干扰素或利巴韦林的组合。α-干扰素和利巴韦林联合疗法的抗病毒效果导致血液中HCV水平的快速降低，甚至在单次剂量后。然而，用于HCV的常规α-干扰素治疗具有几个缺点。例如，(i)当在数周或数月的治疗后停止α-干扰素治疗时，已知病毒载量水平快速地重新建立；(ii)使用α-干扰素/利巴韦林的治疗伴随着严重的副作用，包括流感样症状，减少的红细胞或白细胞计数，骨髓抑制，神经精神效应，特别是抑郁症和贫血；(iii)有效的治疗需要患者坚持接受频繁的给药方案，因为α-干扰素快速地被吸收和被从身体中去除；以及(v)此类治疗的高费用。
上述缺点中的一些(特别地提及上述的第(iii)项)已通过使α-干扰素经历其中将聚乙二醇分子附着至干扰素的‘PEG化’而得到了解决。PEG化的干扰素与利巴韦林的联合施用增加了干扰素的半衰期，并且具有减少给药频率从而增加患者顺应性的优点。然而，已证明这样的治疗在少于50％的接受治疗的患者中是有效的。基于慢性HCV受害者的数目不断增加的情况，存在对于开发用于预防性和治疗性目的的疫苗的需要。
开发提供针对HCV感染的保护的成功疫苗一直以来是很困难的。该困难的一个所提及的原因是，作为RNA病毒的HCV在遗传上是不稳定的，这使得其能够达到高的病毒突变率，从而逃避身体的免疫应答。因此，鉴定病毒的保守的部分是对研究者的挑战。
HCV被分类在黄病毒科(Flaviviridae)的分开的属(丙型肝炎病毒属(Hepacivirus))中。HCV是非致细胞病变的，而是触发免疫应答，该免疫应答快速清除感染或起始炎症反应，从而导致慢性感染和肝损伤。在～30％的急性病例中发生永久性地清除HCV RNA而无需治疗的自发解除感染，这暗示了对HCV的天然免疫性，从而对于疫苗开发的前景而言是令人鼓舞的。然而，HCV感染的该结果的决定因素是未知的。
HCV病毒粒子包含大约9.5kb的正义单链RNA基因组。该基因组编码具有3,010至3,030个氨基酸的单个多蛋白。结构蛋白包括形成病毒核壳体的核心蛋白和两个包膜糖蛋白E1和E2。一些最近的向着HCV疫苗开发的努力集中在HCV包膜糖蛋白E1和E2上。已发现，E1和E2在病毒粒子的表面上形成非共价结合的异二聚体，其介导病毒的附着和进入，并从而提供了用于宿主免疫应答的靶标。
最近的研究表明，包膜糖蛋白E2与CD4+T细胞表面上的CD81结合。在该结合过程中，E2经历快速的构象变化。迄今为止，还没有研究能够提供合适的经修饰的包膜糖蛋白，其可以展现出“野生型”水平的CD81结合。
在整个本说明书(包括权利要求)中，HCV包膜糖蛋白E1和E2的多肽残基的所有编号均基于原型HCV-H77多蛋白序列，Genbank登录号AF009606。糖蛋白E1的成熟形式被包括于多蛋白残基191和383之间，糖蛋白E2的成熟形式被包括于多蛋白残基384和746之间。
E2的受体结合结构域(RBD)被包括于多蛋白残基384和661之间(E2661)。重组形式的E2661RBD有效地从经转染的细胞中分泌，并且能够与CD81和其他细胞表面分子相互作用。E2 RBD包含两个可变区，HVR1(384-410)和HVR2(474-482)。
位于E2的N-末端的可变区1是HCV基因组中最可变的区域，其具有高度的免疫原性并且快速地积累中和逃避突变(neutralizationescape mutation)。尽管HVR1中存在高水平的氨基酸变异性，但存在对于病毒进入而言重要的碱性残基的总体保守性。
可变区2位于侧翼为Cys-459和Cys-486的区域内。尽管最初被描述为7-残基序列，但是来自不同HCV基因型的E2序列的比较表明其可从残基461延伸至481。与HVR1相比，HVR2的序列在被HCV感染的人中是相对稳定的，虽然在该位置处的突变的积累已显示与对干扰素-α治疗的应答性相关。
在导致本发明的工作中，本发明人观察到，代表了HCV的6种主要基因型的E2序列的比对揭示出了之前未描述过的在多蛋白残基570和580之间可变区，其在基因型之内相对保守，但由于氨基酸的插入和缺失而在各基因型之间发生变化。因此，氨基酸570-580被称为基因型间可变区(intergenotypic variable region，igVR)。来自HCV的所有6种基因型以及其中的趋异分离株(divergent isolate)的相应区域的检查显示，igVR的侧翼也为保守的半胱氨酸残基(Cys-569和Cys-581)，这表明这些序列形成受二硫化物约束的环(disulfide-constrained loops)。
迄今为止，使用适应性免疫应答途径进行的HCV的疫苗治疗还未曾获得成功。由于用于治疗HCV的目前的实验性疗法的缺点，因而存在对于提供细胞介导的免疫应答以治疗HCV感染的未满足的需要。
本发明的一个目的是提供用于预防或治疗HCV感染的免疫治疗方法。本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗HCV感染的免疫治疗方法。本发明的另一个目的是提供经修饰的E2糖蛋白，所述糖蛋白接近对于HCV感染的天然细胞受体的“野生型”结合水平。
国际专利公开号WO 02/22155(Hawaii Biotechnology Group，Inc.)公开了截短的HCV E2多肽，其缺少HVR1区域并且当在宿主细胞中以重组形式表达时能够分泌入生长培养基中。该多蛋白也可以缺少在残基662之后的其C-末端。国际专利公开号WO 03/022880(XTLBiopharmaceuticals Ltd.)也公开了缺少HVR1区域的E2蛋白的截短形式。
上述论述意在介绍本发明的领域，而无论如何不应当解释为承认了该领域中的共有一般知识的状态。本说明书中提及的出版物的参考书目详情列于本说明书的末尾。不将并且不应当将在本说明书中对于任何现有技术文献的参考视作对于该文献形成共有一般知识的一部分的承认或任何形式的暗示。
发明概述
在整个本说明书和其后的权利要求书中，除非上下文另外要求，词语“包括”和/或变化形式例如“包含”或“含有”将理解为意指包括所述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。
在一个方面，本发明提供了经修饰的丙型肝炎病毒(HCV)E2糖蛋白，其包含包括HVR1、HVR2和igVR可变区的HCV-E2受体结合结构域(RBD)，其中在所述可变区的至少一个中，可变区的至少一部分被柔韧的连接体序列替代。
在另一个方面，本发明提供了经修饰的丙型肝炎病毒(HCV)E2糖蛋白，其包含包括HVR1、HVR2和igVR可变区的HCV-E2受体结合结构域(RBD)，其中HVR2可变区的至少一部分被去除或被柔韧的连接体序列替代。
在另外一个方面，本发明提供了经修饰的丙型肝炎病毒(HCV)E2糖蛋白，其包含包括HVR1、HVR2和igVR可变区的HCV-E2受体结合结构域(RBD)，其中igVR可变区的至少一部分被去除或被柔韧的连接体序列替代。
如上宽泛地描述的经修饰的HCV E2糖蛋白是这样的糖蛋白，其基本上接近HCV病毒粒子的野生型构象，并且保持结合HCV受体CD81和构象依赖性抗体的能力。
本发明还提供了包含如上宽泛地描述的经修饰的HCV E2糖蛋白和药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。
可以将这样的组合物配制成疫苗组合物，其优选地包含佐剂。
在另外一个方面，本发明还提供了用于在患者中引发免疫应答的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如上宽泛地描述的经修饰的HCV E2糖蛋白。
在这一方面，本发明包括用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如上宽泛地描述的经修饰的HCV E2糖蛋白。
在进一步的方面，本发明提供了如上宽泛地描述的经修饰的HCVE2糖蛋白的用途，所述用途为用于在患者中引发免疫应答，或者用于制备用于在患者中引发免疫应答的药物。
在该进一步的方面，本发明包括如上宽泛地描述的经修饰的HCVE2糖蛋白的用途，所述用途为用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染，或者用于制备用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染的药物。
在更进一步的方面，本发明提供了用于在患者中引发免疫应答的试剂，所述试剂包含如上宽泛地描述的经修饰的HCV E2糖蛋白。
在该进一步的方面，本发明包括用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染的试剂，所述试剂包含如上宽泛地描述的经修饰的HCV E2糖蛋白。
本发明还提供了针对如上宽泛地描述的经修饰的HCV E2糖蛋白而产生的分离的抗体。所述抗体可以是单克隆的或多克隆的。
在该方面，本发明还提供了用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如上所述的抗体。
本发明还提供了如上所述的抗体的用途，所述用途为用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染，或者用于制备用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染的药物。
在该方面，本发明还提供了用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染的试剂，所述试剂包含如上所述的抗体。
此外，本发明提供了用于在患者中检测HCV感染的方法，所述方法包括在允许形成抗体-抗原复合物的条件下，使来自所述患者的生物样品与如上所述的抗体相接触；以及检测所述复合物，其中所述复合物的形成表明在所述样品中存在有HCV。
附图简述
图1显示了在细胞裂解物中含有单一可变区缺失的E1E2的表达和异二聚化。在i)非还原性条件和ii)还原性条件(+β-巯基乙醇)下，用A.抗-E1E2多克隆抗体(779)、B.抗-E1单克隆抗体(A4)、C.抗-E2单克隆抗体(A11)、和D.抗-E2构象依赖性单克隆抗体(H53)来免疫沉淀用野生型(pE1E2)、含有一个可变区缺失的pE1E2、或空载体转染的293T细胞的经代谢性标记的细胞裂解物。所有样品在10-15％SDS-PAGE梯度凝胶上走样，并使用磷光成像仪(phosphoimager)来可视化。该数据是两次独立实验的代表。
图2显示了来自基因型1-6的不同HCV E2糖蛋白序列的ClustalX比对。两个公认的高变区HVR1和HVR2以及新的可变区igVR被突出显视(灰色)。还标示出了位于HVR2和igVR区侧翼的保守半胱氨酸残基以及被提出将N-末端区域锚定至E2糖蛋白的其余部分的第一个保守半胱氨酸残基(黑体)。标示出了CD81-结合决定子(加框的)和关于广泛中和性抗体AP33的表位的位置。还显示了与可变区相关的N-联糖基化位点(树状物)。预测的跨膜结构域加有下划线。
图3显示了含有单一可变区缺失的E1E2糖蛋白向逆转录病毒假型HIV-1颗粒中的掺入。A.从293T细胞的组织培养液中沉淀出经代谢性标记的HCV糖蛋白假型HIV-1颗粒(HCV glycoprotein pseudotypedHIV-1 particles)，所述293T细胞在裂解前用野生型(pE1E2)、含有可变区缺失的pE1E2或空载体进行转染。用构象依赖性抗-E2单克隆抗体H53来免疫沉淀E1E2异二聚体。所有样品在非还原性条件下在10-15％SDS-PAGE梯度凝胶上进行分离，并使用磷光成像仪来可视化。B.HIV-1结构蛋白的加工和掺入至逆转录病毒假型HIV-1颗粒中。使用来自被HIV-1感染的个体的IgG(IgG14)来免疫沉淀来自裂解的经代谢性标记的HCV糖蛋白假型HIV-1颗粒的HIV-1结构蛋白Pr55Gag、p24CA、p66RT和p17MA。所有样品在7.5-15％SDS-PAGE梯度凝胶上进行分离，并使用磷光成像仪来可视化。该数据是两次独立实验的代表。
图4显示了含有单一可变区缺失的HCV糖蛋白假型HIV-1颗粒进入Huh7细胞的能力。以三次重复，将来自用载体NL4-3.LUC.R-E-和野生型(pE1E2)、在可变区中含有缺失的pE1E2或空载体共转染的293T细胞的组织培养液用于感染Huh7细胞。裂解Huh7细胞，并使用装配有发光光学器件(luminescence optics)的Fluostar来测量萤光素酶活性(相对光单位)。从三次重复的感染中计算平均值和标准偏差。数据是三次独立实验的代表。
图5显示了含有单一可变区缺失的HCV E1E2结合CD81-LEL的能力。A.E2的细胞内形式结合CD81-LEL的能力。以渐进式的两倍稀释，将用野生型(pE1E2)、具有可变区缺失的pE1E2或空载体转染的293T细胞的经代谢性标记的细胞裂解物施加至用CD81 MBP-LEL(残基113-201)包被的酶免疫测定平板。使用抗-E2构象依赖性抗体H53和兔抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP)缀合物来检测结合的E2。在450nm处读取吸光度值(光密度)，并减去在620nm处的背景。B.掺入病毒粒子中的E2糖蛋白结合CD81-LEL。以渐进式的两倍稀释，将经代谢性标记的HCV糖蛋白假型HIV-1颗粒的裂解物施加至用CD81 MBP-LEL(残基113-201)包被的酶免疫测定平板。如对于A所描述的，检测结合的E2。数据是两次独立实验的代表。
图6显示了在细胞裂解物中含有经修饰的单一可变区缺失的E1E2的表达和异二聚化。在i)非还原性条件和ii)还原性条件(+β-巯基乙醇)下，用A.抗-E1E2多克隆抗体(779)、B.抗-E1单克隆抗体(A4)、C.抗-E2单克隆抗体(A11)、和D.抗-E2构象依赖性单克隆抗体(H53)来免疫沉淀用野生型(pE1E2)、或含有具有延长的连接体的单一可变区缺失的pE1E2、或空载体转染的293T细胞的经代谢性标记的细胞裂解物。所有样品在10-15％ SDS-PAGE梯度凝胶上走样，并使用磷光成像仪来可视化。数据是两次独立实验的代表。
图7显示了含有经修饰的单一可变区缺失的E1E2糖蛋白向HCV糖蛋白假型HIV-1颗粒中的掺入。A.从293T细胞的组织培养液中沉淀出经代谢性标记的E1E2-假型HIV-1颗粒，所述293T细胞在裂解前用NL4-3.LuC.R-E-和野生型(pE1E2)、含有具有延长的连接体的单一可变区缺失的pE1E2或空载体进行转染。用构象依赖性抗-E2单克隆抗体H53来免疫沉淀E1E2异二聚体。所有样品在非还原性条件下在10-15％SDS-PAGE梯度凝胶上进行分离，并使用磷光成像仪来可视化。B.HIV-1结构蛋白的加工和掺入至HCV糖蛋白-假型HIV-1颗粒中。使用来自被HIV-1感染的个体的IgG(IgG14)来免疫沉淀来自裂解的经代谢性标记的E1E2-假型HIV-1颗粒的HIV-1结构蛋白Pr55Gag、p17MA、p24CA和p66RT。所有样品在7.5-15％SDS-PAGE梯度凝胶上进行分离，并使用磷光成像仪来可视化。数据是两次独立实验的代表。
图8显示了含有单一经修饰的可变区缺失的HCV糖蛋白-假型H IV-1颗粒进入Huh7细胞的能力。以三次重复，将来自用NL4-3.LUC.R-E-和野生型(pE1E2)、含有具有延长的连接体的单一可变区缺失的pE1E2或空载体(pCDNA4)共转染的293T细胞的组织培养液用于感染Huh7细胞。裂解Huh7细胞，并使用装配有发光光学器件的Fluostar来测量萤光素酶活性(相对光单位)。从三次重复的感染中计算平均值和标准偏差。使用Student′s t-检验来计算P-值。数据是三次独立实验的代表。
图9显示了含有单一经修饰的一个可变区缺失的E2结合CD81-LEL的能力。A.以渐进式的两倍稀释，将用野生型(pE1E2)、含有经修饰的一个可变区缺失的pE1E2或空载体(pCDNA4)转染的293T细胞的经代谢性标记的细胞裂解物施加至用CD81 MBP-LEL(残基113-201)包被的酶免疫测定平板。使用抗-E2构象依赖性单克隆抗体H53和兔抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP)缀合物来检测结合的E2。在450nm处读取吸光度值，并减去在620nm处的背景。数据是两次独立实验的代表。B.在病毒裂解物中，掺入病毒粒子中的E2糖蛋白结合CD81-LEL。以渐进式的两倍稀释，将经代谢性标记的E1E2-假型HIV-1颗粒的裂解物施加至用CD81 MBP-LEL(残基113-201)包被的酶免疫测定平板，并检测结合的E2，如上所描述的。在450nm处读取吸光度值，并减去在620nm处的背景。C.B的独立重复。
图10显示了含有多重可变区缺失的E 1E2的未成熟形式的表达和异二聚化。在i)非还原性条件和ii)还原性条件(+β-巯基乙醇)下，用A.抗-E1E2多克隆抗体(779)、B.抗-E1单克隆抗体(A4)、C.抗-E2单克隆抗体(A11)、和D.抗-E2构象依赖性单克隆抗体(H53)来免疫沉淀用野生型(pE1E2)、含有多重可变区缺失的pE1E2、或空载体转染的293T细胞的经代谢性标记的细胞裂解物。所有样品在10-15％SDS-PAGE梯度凝胶上走样，并使用磷光成像仪(phosphoimager)来可视化。数据是两次独立实验的代表。
图11显示了含有多重可变区缺失的E1E2糖蛋白向HCV糖蛋白-假型HIV-1颗粒中的掺入。A.从293T细胞的组织培养液中沉淀出经代谢性标记的E1E2-假型HIV-1颗粒，所述293T细胞在裂解前用NL4-3.LUC.R-E-和野生型(pE1E2)、含有多重可变区缺失的pE1E2或空载体进行共转染。用构象依赖性抗-E2单克隆抗体H53来免疫沉淀E1E2异二聚体。所有样品在非还原性条件下在10-15％SDS-PAGE梯度凝胶上进行分离，并使用磷光成像仪来可视化。B.HIV-1结构蛋白的加工和掺入至HCV糖蛋白-假型HIV-1颗粒中。使用来自被HIV-1感染的个体的IgG(IgG14)来免疫沉淀来自裂解的经代谢性标记的E1E2-假型HIV-1颗粒的HIV-1结构蛋白Pr55Gag、p17MA、p24CA和p66RT。样品在还原性条件下在7.5-15％SDS-PAGE梯度凝胶上进行分离，并使用磷光成像仪来可视化。数据是两次独立实验的代表。
图12显示了含有多重可变区缺失的E1E2-假型HIV-1颗粒进入Huh7细胞的能力。以三次重复，将来自用HIV-1萤火虫萤光素酶载体(NL4-3.LUC.R-E-)和野生型(pE1E2)、含有多重可变区缺失的pE1E2或空载体(pCDNA4)共转染的293T细胞的组织培养液用于感染Huh7细胞。裂解Huh7细胞，并使用装配有发光光学器件的Fluostar来测量萤光素酶活性。从三次重复的感染中计算平均值和标准偏差。数据是三次独立实验的代表。
图13显示了含有多重可变区缺失的E2结合CD81-LEL的能力。A.以渐进式的两倍稀释，将用野生型(pE1E2)、含有多重可变区缺失的pE1E2或空载体(pCDNA4)转染的293T细胞的经代谢性标记的细胞裂解物施加至用CD81 MBP-LEL(残基113-201)包被的酶免疫测定平板。使用抗-E2构象依赖性单克隆抗体H53和兔抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP)缀合物来检测结合的E2。在450nm处读取吸光度值，并减去在620nm处的背景。B.掺入病毒粒子中的形式的含有多重可变区缺失的E2结合CD81-LEL的能力。以渐进式的两倍稀释，将经代谢性标记的E1E2-假型HIV-1颗粒的裂解物施加至用CD81 MBP-LEL(残基113-201)包被的酶免疫测定平板。如上所描述的，检测结合的E2。在450nm处读取吸光度值，并减去在620nm处的背景。数据是两次独立实验的代表。
图14显示了在细胞裂解物中含有单一和多重可变区缺失的E2 RBD(残基384-661)的表达。A.用抗-E2构象依赖性抗体H53来免疫沉淀用野生型(E2-myc)、含有单一或多重可变区缺失的E2-myc或空载体转染的293T细胞的经代谢性标记的细胞裂解物。B.含有单一和多重可变区缺失的E2 RBD(残基384-661)分泌入上清液中。用抗-E2构象依赖性抗体H53来免疫沉淀来自用野生型(E2-myc)、含有单一或多重可变区缺失的E2-myc或空载体转染的经代谢性标记的293T细胞的上清液。所有样品在10-15％SDS-PAGE梯度凝胶上进行分离，并使用磷光成像仪来可视化。关于单一可变区缺失的数据来自一个实验。
图15显示了含有单一可变区缺失的E2 RBD(残基384-661)结合CD81-LEL的能力。A.以渐进式的两倍稀释，将来自用野生型(E2-myc)、含有单一可变区缺失的E2-myc或空载体转染的经代谢性标记的293T细胞的细胞裂解物施加至用CD81 MBP-LEL(残基113-201)包被的酶免疫测定平板。使用抗-E2构象依赖性抗体H53和兔抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP)缀合物来检测结合的E2。在450nm处读取吸光度值，并减去在620nm处的背景。B.分泌的含有单一可变区缺失的E2 RBD(残基384-661)结合CD81-LEL的能力。以渐进式的两倍稀释，将来自用野生型(E2-myc)、含有单一可变区缺失的E2-myc转染的经代谢性标记的293T细胞的组织培养液施加至用CD81 MBP-LEL(残基113-201)包被的酶免疫测定平板。使用抗-E2构象依赖性抗体H53和兔抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP)缀合物来检测结合的E2。在450nm处读取吸光度值，并减去在620nm处的背景。数据来自单次实验。
图16显示了含有多重可变区缺失的E2 RBD(残基384-661)结合CD81-LEL的能力。A.以渐进式的两倍稀释，将来自用野生型(E2-myc)、含有多重可变区缺失的E2-myc或空载体转染的经代谢性标记的293T细胞的细胞裂解物施加至用CD81 MBP-LEL(残基113-201)包被的酶免疫测定平板。在450nm处读取吸光度值，并减去在620nm处的背景。B.分泌的含有多重可变区缺失的E2 RBD(残基384-661)结合CD81-LEL的能力。以渐进式的两倍稀释，将来自用野生型(E2-myc)、含有多重可变区缺失的E2-myc或空载体转染的经代谢性标记的293T细胞的上清液施加至用CD81 MBP-LEL(残基113-201)包被的酶免疫测定平板。在450nm处读取吸光度值，并减去在620nm处的背景。数据来自单次实验。
图17显示了E2-myc蛋白与全长的表面表达的CD81的结合。将等量的从293T细胞产生的、单体的、分泌的E2-myc蛋白施加至用编码全长CD81的载体转染的CHO-K1细胞。在于γ计数器中进行测量之前，用碘化的9E10来检测结合的E2-myc。三次独立测定的平均值±标准误差。通过使用Students t检验(假定不等方差(unequal variance))与E2 Δ23-myc E2构建体进行比较来得出P值。
图18显示了E2-myc和E2 Δ123-myc被人构象敏感型单克隆抗体检测出的能力。对野生型(E2-myc)和E2Δ123-myc进行代谢性标记，并用对于E2的三个免疫原性结构域(A、B和C)特异的构象依赖性人单克隆抗体的“CBH”组来进行免疫沉淀。通过下列方式来分析经免疫沉淀的蛋白质：在非还原性条件下在10-15％聚丙烯酰胺梯度凝胶中进行SDS-PAGE，然后在磷光成像仪中进行扫描。
图19显示了含有单一和多重可变区缺失的E1E2多蛋白的示意图。pE1E2载体编码E1(暗灰色)和E2(浅灰色)的全长H77c序列，其中包括在E1和E2的C-末端处的其跨膜结构域(水平条纹)和具有所标示的信号肽酶切割位点(箭头)的信号肽。E2可变区(加点的)和与HVR1相邻的保守区(斜条纹)独个地和组合地被所示的柔韧的Gly-Ser-Ser-Gly(GSSG)连接体基序替代。
图20显示了重叠延伸PCR策略的示意图。使用两个寡核苷酸对从HCV糖蛋白模板序列(斜条纹)中删除可变区，所述两个寡核苷酸对各自包括所示的用于扩增与HVR1相邻的5′或3′片段的一个外部引物和一个内部引物。内部引物序列引入Gly-Ser-Ser-Gly连接体基序(粗体)和与各自的5′或3′片段互补的短‘重叠’序列。这些序列退火从而形成用于第二轮PCR扩增的模板，所述第二轮PCR扩增使用外部引物来扩增缺失了HVR1的糖蛋白序列。
图21显示了含有经修饰的单一可变区缺失(具有延长的连接体)的HCV E1E2多蛋白的示意图。pE1E2载体编码E1(暗灰色)和E2(浅灰色)的全长H77c序列，其中包括在E1和E2的C-末端处的其跨膜结构域(垂直条纹)。还标示了信号肽酶切割位点(箭头)。E2可变区和与HVR1相邻的保守区(con)被部分删除，并且用柔韧的Gly-Ser-Ser-Gly连接体基序替代。
图22显示了包含单一或多重可变区缺失的E2受体结合结构域(E2RBD661)的示意图。pE2661载体编码E2 RBD编码性残基384-661(E2-myc)。可变区(加点的)和与HVR1相邻的保守序列(斜条纹)独个地和组合地被所示的短的柔韧的Gly-Ser-Ser-Gly(GSSG)连接体基序替代。还在这些构建体的C-末端处引入myc表位标签(垂直条纹)。
图23显示了用于产生HCV糖蛋白-假型HIV-1颗粒的策略的示意图。将编码E1E2(pE1E2)或含有可变区缺失的pE1E2的HCV糖蛋白表达载体以及缺少其天然包膜基因且包含萤光素酶报告基因的逆转录病毒载体(HIV-1 NL4-3.LUC.R-E-)共转染入293T细胞中。由于逆转录病毒核心蛋白在细胞内装配，因而它们通过从质膜中出芽、掺入HCV E1E2糖蛋白而获得包膜。然后，收集这些病毒粒子，并用于经历一轮在Huh7细胞中的感染和复制。然后，通过在这些经感染的Huh7细胞内的所得的萤光素酶活性来定量由E1E2介导的进入的水平。
图24显示了E2-myc和E2 Δ123-myc蛋白被一组从受HCV感染的个体中获得的人血清免疫沉淀的能力。通过下列方式来分析经免疫沉淀的蛋白质：在非还原性条件下在10-15％聚丙烯酰胺梯度凝胶中进行SDS-PAGE，然后在磷光成像仪中进行扫描。每一个泳道下面是对于该血清样品而言的HCV RNA的状态，使用BioRad Monolisa、Abbot Murex或Chiron RIBA测定法之一检测的HCV特异性抗体的存在，和50％中和抗体滴度。分子量标准参照物示于左边。
图25显示了含有可变区缺失的E2-myc蛋白与重组的CD81大细胞外环相互作用的能力。A.野生型E2-myc、E2 Δ12-myc、E2 Δ23-myc和含有突变L441M(其破坏与CD81的相互作用)的E2-myc蛋白与野生型重组MBP-LEL相互作用的能力。将E2-myc蛋白在用MBP-LEL包被的酶免疫测定平板中进行系列稀释。数据是2至7次独立实验的平均值，并且表示为相对于野生型E2-myc而言的平均结合百分比±标准偏差。B.WTE2-myc、E2Δ13-myc和E2Δ123-myc与野生型重组MBP-LEL(实线)或含有F186S突变(其破坏E2结合)的重组MBP-LEL(虚线)相互作用的能力。数据是2至7次独立实验的平均值，并且表示为相对于野生型E2-myc而言的平均结合百分比±标准偏差。
图26显示了含有可变区缺失的E2-myc蛋白与全长的表面表达的CD81相互作用的能力。A.WT E2-myc、E2Δ12-myc、E2Δ23-myc和含有突变L441M的E2-myc蛋白与用全长CD81转染的CHO-K1细胞相互作用的能力。将野生型或缺失了可变区的E2-myc蛋白的稀释物施加至冰冷的用人CD81转染的CHO-K1细胞，并在冰上温育4小时。在洗涤后，加入1×106 CPM 125I-9E10，并且将平板在室温下温育1小时，洗涤，并在Packard Auto GammaCounter中进行计数。所显示的数据是2至5次独立实验的相对于野生型而言的平均结合百分比±标准误差。B.WTE2-myc、E2Δ123-myc和E2Δ13-myc与用全长人CD81(实线)或F186S-CD81(虚线)转染的CHO-K1细胞相互作用的能力。所显示的数据是2至5次独立实验的相对于野生型而言的平均结合百分比±标准误差。
图27显示了纯化的HCV E2蛋白变体在4-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶中的SDS-PAGE，其中包括不含可变区缺失(野生型)或者含有一个或多个可变区缺失的E2-his蛋白。通过用考马斯亮蓝染色来使蛋白质可视化。
图28显示了E2-his蛋白的蓝非变性PAGE(blue-native PAGE)分析。在非变性条件下在5-15％聚丙烯酰胺梯度凝胶中对纯化的蛋白质(10μg)进行电泳。在电泳后，使凝胶脱色过夜，并在Licor Odyssey扫描仪中于680nm处进行扫描。蛋白质标准参照物的迁移位置显示于右边。
图29显示了纯化的E2-his蛋白的Western印迹分析。使纯化的蛋白质的样品经历还原性SDS-PAGE，随后电泳转移至硝酸纤维素膜。通过使用非构象依赖性E2特异性单克隆抗体，随后使用偶联至Alexafluor680nm的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Invitrogen)，来检测E 2蛋白。在Licor Odyssey扫描仪中扫描免疫印迹。分子量标准参照物显示于左边(kDa)。
图30显示了HCV E2-his蛋白结合重组形式的CD81大细胞外环(CD81-LEL)的能力。使用融合至下列部分的麦芽糖结合蛋白来包被酶免疫测定平板：(A)野生型CD81大细胞外环(残基113-201)(CD81-LEL)，或(B)在CD81-LEL的E2结合位点中含有F186S突变的CD81-LEL。用牛血清白蛋白封闭平板，然后将其与E2-his蛋白的系列稀释物(于50μl含有5mg/ml牛血清白蛋白和0.05％Tween20的PBS中)一起温育2小时。使用E2特异性单克隆抗体和偶联至辣根过氧化物酶的兔抗小鼠免疫球蛋白(Dako)来检测结合的E2-his。平板用四甲基联苯胺盐酸盐底物来进行显色，并通过加入1M HCl来终止。在450nm处测量吸光度，并减去在620nm处的背景。通过将每种蛋白的吸光度值除以对于野生型E2-his而获得的最大吸光度，并乘以100来计算结合百分比。
图31显示了在用E2-his蛋白进行2次免疫接种后获得的小鼠血清的针对同源E2-his抗原的免疫反应性。在用雪花莲(Galanthisnivalis)(GNA)凝集素预包被的96孔Maxisorb微量滴定板(Nunc)上捕获E2-his蛋白。将免疫小鼠血清的系列稀释物与捕获的用于免疫接种的相应的E2蛋白变体一起温育，并用偶联至辣根过氧化物酶的兔抗小鼠免疫球蛋白来检测结合的免疫球蛋白。该测定用四甲基联苯胺盐酸盐底物来进行显色，并通过加入1M HCl来终止。在Fluostar平板阅读器(BMG technologies)中于450nm处测量吸光度值，并减去在620nm处的背景。将各个血清的抗体滴度测定为产生5倍背景吸光度的血清稀释度。显示了对于各免疫原组的最大(上方的误差条)、第75和第25百分位数(分别为框的上和下边缘)、中间(框内的水平线)和最小(下方的误差条)的滴度。
图32显示了在用E2蛋白变体进行2次免疫接种后获得的小鼠血清的针对E2-his(A)和E2Δ123-his(B)抗原的免疫反应性。如图31中所描述的，在96孔Maxisorb微量滴定板上捕获E2-his和E2Δ123-his蛋白，并测定各个血清的抗体滴度。显示了对于各免疫原组的最大(上方的误差条)、第75和第25百分位数(分别为框的上和下边缘)、中间(框内的水平线)和最小(下方的误差条)的滴度。
图33显示了在用E2-his蛋白进行3次免疫接种后获得的小鼠血清的针对同源E2-his抗原的免疫反应性。如图31中所描述的，在96孔Maxisorb微量滴定板上捕获E2-his蛋白，并测定各个血清的抗体滴度。显示了对于各免疫原组的最大(上方的误差条)、第75和第25百分位数(分别为框的上和下边缘)、中间(框内的水平线)和最小(下方的误差条)的滴度。
图34显示了在用E2蛋白变体进行3次免疫接种后获得的小鼠血清的针对E2-his(A)和E2Δ123-his(B)抗原的免疫反应性。如图31中所描述的，在96孔Maxisorb微量滴定板上捕获E2-his和E2Δ123-his蛋白，并测定各个血清的抗体滴度。显示了对于各免疫原组的最大(上方的误差条)、第75和第25百分位数(分别为框的上和下边缘)、中间(框内的水平线)和最小(下方的误差条)的滴度。
图35显示了在用E2蛋白变体进行3次免疫接种后获得的小鼠血清的针对Con1 E2RBD-his(A)和JFH1 E2RBD-myc(B)抗原的免疫反应性。如图31中所描述的，在96孔Maxisorb微量滴定板上捕获Con1和JFH1RBD蛋白，并测定各个血清的抗体滴度。显示了对于各免疫原组的最大(上方的误差条)、第75和第25百分位数(分别为框的上和下边缘)、中间(框内的水平线)和最小(下方的误差条)的滴度。
图36显示了在用E2-his蛋白进行3次免疫接种后获得的小鼠血清的80％中和滴度(log10)。将热灭活的免疫小鼠血清的系列5倍稀释物与H77c HCV糖蛋白-假型HIV-1萤光素酶报告病毒(1小时)一起于37℃预温育1小时，然后添加至一式四份的在48-孔组织培养板中的Huh7细胞单层。在4小时的温育(37℃，5％CO2)后，用PBS洗涤细胞，并更换培养基。在额外的3天温育(37℃，于5％CO2中)后，裂解细胞，并在装配有发光光学器件的fluostar中测定萤光素酶活性。将各个血清的中和滴度测定为相比于仅用培养基预温育的HCV糖蛋白-假型HIV-1萤光素酶报告病毒而言产生80％中和的血清稀释度。
发明详述
HCV病毒粒子的经修饰的E2核心结构(其中通过除去或删除可变区的至少一部分，并且任选地插入连接体序列，来修饰至少一个可变区，特别是由本发明人鉴定的可变区igVR)可实际用作能够引发针对不同株系的HCV的广泛中和性抗体的疫苗。该经修饰的E2糖蛋白的结合效能展示出野生型的与HCV受体CD81的结合，并且该经修饰的E2糖蛋白提供了通过下列方式来治疗HCV感染的手段：模拟对于有效的CD81结合来说所必需的E2胞外域的复杂构象变化，从而起始免疫反应而无需细胞侵入。
在一个方面，本发明提供了经修饰的丙型肝炎病毒(HCV)E2糖蛋白，其包含包括HVR1、HVR2和igVR可变区的HCV-E2受体结合结构域(RBD)，其中在所述可变区的至少一个中，可变区的至少一部分被柔韧的连接体序列替代。
在另一个方面，本发明提供了经修饰的丙型肝炎病毒(HCV)E2糖蛋白，其包含包括HVR1、HVR2和igVR可变区的HCV-E2受体结合结构域(RBD)，其中HVR2可变区的至少一部分被去除或被柔韧的连接体序列替代。
在另外一个方面，本发明提供了经修饰的丙型肝炎病毒(HCV)E2糖蛋白，其包含包括HVR1、HVR2和igVR可变区的HCV-E2受体结合结构域(RBD)，其中igVR可变区的至少一部分被去除或被柔韧的连接体序列替代。
此处的“HVR1”和“HVR2”可变区是指HVR1(384-410)和HVR2(461-481)这两个可变区，而此处的“igVR”是指由本发明人鉴定的基因型间可变区igVR(570-580)。
术语“柔韧的连接体序列”在此处用于指短的、柔韧的多肽序列，其允许在经修饰的糖蛋白中的半胱氨酸残基之间形成二硫键连接，从而导致保留天然或“野生型”二硫键连接，特别是保留结合HCV CD81受体和构象依赖性抗体的能力。合适的连接体序列在George和Heringa，2002以及Argos，1990的综述文章中进行了论述，并且可由多至20个氨基酸残基例如Gly和Ser组成，且包括，和包含选自Gly、Ser、Ala、Thr和Arg的氨基酸，更特别地Gly-和Ser-Ser-Gly(GSSG)。合适的连接体序列包括例如下列序列
(Gly)2-Ala-(Gly)2、(Gly)5或(Gly)8(参见Sabourin等人，2007)，
(Gly)6、(Gly)7或(Gly)10(参见Yang和Gruebele，2006)，
Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(参见Dipti等人，2006)，
(Gly)4(参见Anandarao等人，2006)，
Gly-Ala-Gly(参见Wyatt等人，1995)，
(Gly)2-Arg-(Gly)2-Ser(参见Bellamy-McIntyre等人，2007)，
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n＝3～4(参见Arai等人，2006)，和
Ser-(Gly)2-Ser-Gly(参见Bahrami等人，2007)。
优选的序列是此处公开的序列Gly-(Ser)2-Gly。应当理解，合适的多肽连接体序列的选择对于本领域技术人员来说是个常规实验的问题，并且本发明的经修饰的HCV E2糖蛋白不限于此处公开的特定的连接体序列。不希望受任何理论的束缚，通过用短的柔韧的连接体替代HVR1、HVR2和igVR，Cys-569和Cys-581之间以及Cys-459和Cys-486之间二硫键的形成，例如，和保守的E 2核心结构域的固有折叠，在经修饰的糖蛋白中基本上得到保留。
在本说明书中，HCV E2受体结合结构域的可变区之一的至少一部分的“缺失”是指删除或除去可变区序列的至少一部分，以及任选地插入柔韧的连接体序列以替代被删除的序列。
本发明的经修饰的HCV E2糖蛋白可通过任何合适的方法来制备，特别地包括通过表达本文实施例中所描述的合适的DNA缺失构建体来以重组产物的形式制备所述经修饰的糖蛋白。
优选地，核心E2受体结合结构域的第二个和第三个可变区(HVR2和igVR)中的至少一个通过除去所述区域内的至少一部分残基并且插入柔韧的连接体序列来进行修饰。已发现，HVR2区域的至少一部分的缺失，与其他可变区缺失一起，显著地减少了E1E2的异二聚化。
在进一步的实施方案中，所有三个所述可变区通过除去这些区域内的至少一部分残基并且插入连接体序列来进行修饰。
从已包含HVR1和HVR2缺失的E2糖蛋白中删除基因间可变区(igVR)，相对于仅HVR1和HVR2的同时缺失而言，改善了与CD81的结合。
本发明人已发现，HVR1、HVR2和igVR全都是由E1E2-pp介导的病毒进入Huh7细胞所必需。已发现，包含HVR1、HVR2和igVR中的至少每一个的缺失的E1E2-pp保持野生型水平的重组CD81结合。这表示在下列能力方面的显著改善：(a)模拟HCV病毒粒子的细胞结合，和(b)起始免疫应答，而无需使患者暴露于可以为免疫诱饵(immune decoy)的高变免疫显性区域。
在优选的实施方案中，所有三个可变区可以被删除，并且保留核心E2折叠结构域，其是装配至少三个参与CD81-结合位点的不连续结合元件所必需。从E2受体结合结构域中HVR1、HVR2和igVR的各种组合式删除的另外的优点是，可获得可溶形式的E2核心结构域，其适合用作免疫原。
本发明还提供了组合物，其包含如上宽泛地描述的经修饰的HCVE2糖蛋白和药学上可接受的载体或稀释剂。
这样的组合物可以配制为疫苗组合物，优选包含佐剂。
常规的药学上可接受的载体、赋形剂、缓冲剂或稀释剂可被包括在本发明的疫苗组合物中。通常，根据本发明的疫苗组合物将包含免疫有效量的经修饰的HCV E2糖蛋白和任选地佐剂，以及一种或多种常规的药学上可接受的载体和/或稀释剂。大量的尽管并非穷尽的佐剂列表可见于Cox和Coulter，″Advances in Adjuvant Technology andApplication″，Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology，第4章，Ed.Young，W.K.，CRC Press 1992，和见于Cox和Coulter，″Adjuvants-A Classification and Review of Their Modes ofAction″，Vaccine 15(3)，248-256，1997。此处所使用的“药学上可接受的载体和/或赋形剂”包括任意溶剂、分散介质、水溶液、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂，等等。此类介质和试剂用于药学活性物质的用途在本领域内是熟知的，并且例如描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack PublishingCompany，Pennsylvania，U.S.A中。
在另外一个方面，本发有还提供了用于在患者中引发免疫应答的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如上宽泛地描述的经修饰的HCV E2糖蛋白。
在该方面，本发明包括用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如上宽泛地描述的经修饰的HCV E2糖蛋白。
此处的“治疗”将在其最宽的背景中来进行理解。因此，术语“预防性地(的)治疗”包括用于保护患者免受感染或减少感染可能性的治疗。类似地，术语感染的“治疗性地(的)治疗”不是必需意味着对患者进行治疗直至从感染中完全恢复，而是包括感染的症状的改善以及降低感染的严重度或消除感染。
本发明的经修饰的HCV E2糖蛋白以有效量进行施用。“有效量”是指对于获得所期望的应答或者对于延迟感染的发作或抑制感染的进展或完全停止感染的发作或进展而言至少部分地所必需的量。该量随待治疗的个体的健康和身体状况、待治疗的个体的人种背景、所期望的保护程度、组合物的配制、医学状态的评估和其他相关因素而变化。预期该量将落在可通过常规试验而确定的相对较宽的范围之内。如果需要，可一次或数次重复施用有效量。施用的实际量将通过待治疗的感染的性质和通过活性免疫原的施用速率来确定。
优选地，患者是人，然而本发明扩展至对其他哺乳动物患者(包括灵长类动物和实验室的实验动物(例如，小鼠、兔子、大鼠、豚鼠))的治疗和/或预防。
根据本发明，优选通过肠胃外施用途径来将经修饰的HCV E2糖蛋白施用给患者。肠胃外施用包括不通过消化道(即，非肠内的)的任何施用途径，包括通过注射、输注等的施用。通过注射的施用包括例如注射至静脉(静脉内)、动脉(动脉内)、肌肉(肌内)和皮肤下(皮下)。还可以以足以获得所期望的药理学效应的剂量，例如通过皮下、皮内或肌内方式，以贮库制剂或缓释制剂的形式来施用经修饰的HCV E2糖蛋白。
适合于肠胃外施用的组合物方便地包含活性组分的无菌水性制剂，其优选与受者的血液等渗。可以使用合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂，根据已知的方法来配制该水性制剂。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在聚乙二醇和乳酸中的溶液。在可以使用的可接受的载体和溶剂之中包括，水、林格溶液、合适的糖类(例如，蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖)和等渗的氯化钠溶液。此外，方便地将无菌的固定油用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何温和的固定油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可用于制备注射剂。
在进一步的方面，本发明提供了如上宽泛地描述的经修饰的HCVE2糖蛋白的用途，所述用途为用于在患者中引发免疫应答，或者用于制备用于在患者中引发免疫应答的药物。
在进一步的方面，本发明包括如上宽泛地描述的经修饰的HCV E2糖蛋白的用途，所述用途为用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染，或者用于制备用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染的药物。
在该进一步的方面，本发明提供了用于在患者中引发免疫应答的试剂，所述试剂包含如上宽泛地描述的经修饰的HCV E2糖蛋白。
在该进一步的方面，本发明包括用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染的试剂，所述试剂包含如上宽泛地描述的经修饰的HCV E2糖蛋白。
在本发明的一个实施方案中，已发现，其中至少区域igVR经历在该区域中的残基缺失以及用柔韧的连接体序列替代的重组E2糖蛋白改善了被构象依赖性抗体的识别。此外，已发现，在与‘野生型’E2糖蛋白的比较研究中，单独地和以与HVR1和HVR2的各种组合形式进行的区域igVR的修饰显示出接近野生型的与全长CD81-LEL(人四跨膜蛋白(tetraspanin)CD81的大细胞外环(large extracellular loop))的结合。
本发明人已揭示，跨越6种主要基因型之间的不同E2糖蛋白序列的比对鉴定出了在残基560和581之间的新的第三个可变区，“igVR”。表明，“igVR”不是严格意义上的高变区，因为其在不同基因型之间展示出其最大的可变性，然而其在基因型内相对保守，从而不可能处于免疫选择压下。此外，其由移动(但总是维持)位于该区域内的糖基化位点的一系列插入或缺失组成。本发明人还已观察到，可变区HVR2和“igVR”的侧翼都为保守的半胱氨酸残基，从而提出这些区域可形成通过这些残基之间的二硫键而稳定化的暴露于溶剂的环。
本发明人已提出，所述高变区形成柔韧的暴露于溶剂的亚结构域，所述亚结构域使得E 2糖蛋白能够在‘开放的’和‘关闭的’构象之间移动，前者通过暴露位于本研究中所描绘的核心E2结构域内的保守CD81-结合决定子而更具有结合CD81的能力。事实上，之前在CD81结合后已观察到E2糖蛋白内的构象变化。此外，非中和抗体与E2糖蛋白的结合已被证明降低了其对中和抗体的易感性，并且符合这样的模型，在所述模型中，非中和抗体抑制这些表面暴露的高变区的柔韧性，从而阻断了与位于E2核心结构域内的保守表位的接近。
因此，这暗示，经修饰的E2核心结构域代表了用于引发针对E2糖蛋白内的保守表位(包括CD81-结合决定子)的中和抗体的具有前景的疫苗候选物，所述表位被这些表面暴露的可变区遮蔽，所述可变区可在HCV复制期间用作在糖蛋白复合物表面上的免疫学诱饵。
本发明还提供了针对如上宽泛地描述的经修饰的HCV E2糖蛋白而产生的分离的抗体。
术语“抗体”在此处宽泛地用于包括特异性地结合该经修饰的HCVE2糖蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，以及此类抗体的抗原结合片段，包括例如保持了对于该经修饰的HCV E2糖蛋白的特异性结合活性的抗体的Fab、F(ab1)2、Fd和Fv片段。
可以使用本领域熟知的方法(参见，例如，Harlow和Lane，″Antibodies，A laboratory manual″，Cold Spring HarborLaboratory Press，1988)来获得具有所期望的特异性的抗体(单克隆的和多克隆的)。用于制备抗体及其抗原结合片段的方法还描述于国际专利公开WO 02/22155中。
本发明还提供了用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如上所述的抗体。因此，该方法提供了患者的被动免疫疗法。
如之前所描述的，本发明还提供了如上所述的抗体的用途，所述用途为用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染，或者用于制备用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染的药物。
在该方面，本发明还提供了用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染的试剂，所述试剂包含如上所述的抗体。
此外，本发明提供了如上宽泛地描述的抗体在诊断HCV感染中的用途。在该方面，本发明提供了用于在患者中检测HCV感染的方法，所述方法包括在允许形成抗体-抗原复合物的条件下，使来自所述患者的生物样品与如上所述的抗体相接触；以及检测所述复合物，其中所述复合物的形成表明在所述样品中存在有HCV。
优选地，所述抗体被可检测地标记。合适的标记是本领域熟知的，并且包括例如酶，放射性同位素，荧光化合物，胶态金属，以及化学发光化合物、磷光化合物和生物发光化合物。优选地，所述生物样品是来自所述患者的体液样品，例如血液样品。
本发明的经修饰的HCV E2糖蛋白还可以用于药物发现技术，包括例如小分子筛选技术。
本发明通过下列非限制性的实施例来进一步举例说明。
实施例1
下面描述用于本实施例的材料和方法。
1.各个可变区在E1E2糖蛋白结构和功能中的作用
各种不同的可变区缺失突变体的结果概述于表1中。
细胞内E1E2前体的折叠和异二聚化
为了检查各个可变区在细胞内E 1E2生物合成中的作用，使用与E1和/或E2表位具有反应性的抗体来免疫沉淀用单一可变区缺失构建体转染的293T细胞的经代谢性标记的细胞裂解物。在非还原性和还原性条件下分析这些制剂，以表征在先前所观察到的共价连接的聚集体的大细胞内群体中存在的非共价缔合的E1E2异二聚体。
使用多克隆抗-E1E2抗体(779)来进行的免疫沉淀检测出，E1(～30kDa)和E2(～70kDa)糖蛋白的总细胞内群体对于每一种单一可变区缺失构建体显示出发生了有效的表达和从多蛋白上的切割(参见图1A)。突变型E2糖蛋白展示出可变地比野生型更低的分子量：HVR1con＜HVR2和“igVR”＜HVR1＜WT。这与下列糖基化位点的丢失相一致：被预测存在于HVR1con缺失中的两个糖基化位点，在HVR2和“igVR”缺失的每一个中的一个糖基化位点，以及在HVR1缺失中没有糖基化位点(图2)。然而，需要对这些E2糖蛋白进行去糖基化以确认如表2中所预测的它们的主链分子量。迁移至～100kDa的条带代表未被宿主信号肽酶切割的E1E2多蛋白，并且在单一HVR2和“igVR”缺失构建体这两者中更显著(图1A)。这反映在对于HVR2和“igVR”突变体所观察到的总细胞内E1和E2的水平减少，暗示这些缺失可能影响多蛋白的加工。
在还原性和非还原条件下，对于突变型和野生型构建体，非构象依赖性抗-E1单克隆抗体(A4)于～30kDa和～27kDa处将E1双重带(doublet)沉淀出来(图1B)。该双重带代表备选的E1糖基化状态或信使RNA剪接同种型，如先前所观察到的。此外，在非还原性条件下，E1共沉淀低水平的野生型E2糖蛋白，然而在还原性条件下，其有效地共沉淀野生型和突变型E2糖蛋白。这表明，A4识别在共价连接的细胞内E1E2复合物中更加暴露的E1表位。
对于所有独个可变区缺失构建体，非构象依赖性抗-E2单克隆抗体(A11)检测出细胞内的E 2糖蛋白表达(图1C)。然而，在非还原性和还原性条件下，只有包含HVR1con或HVR1缺失的突变型E 2糖蛋白共沉淀可检测的量的E1。这表明，独个HVR2和“igVR”缺失直接或间接地破坏了细胞内E1E2异二聚体的形成。值得注意的是，该减少的异二聚化不是由于对于HVR2和“igVR”缺失所观察到的更低的总细胞内E1和E2而导致的，因为在这两种突变体中，通过A11检测到野生型水平的E2糖蛋白表达。此外，E2通常共沉淀低水平的E1，特别是在还原性条件下，这暗示A11表位在细胞内E1E2异二聚体复合物中被部分地遮蔽。
已显示，构象依赖性抗-E2单克隆抗体(H53)识别在HCV病毒粒子表面上的天然E2，从而与该E2种类共沉淀的E1的量是功能性非共价缔合的E1E2异二聚体形成比例的良好指标。使用H53来进行的免疫沉淀对于所有独个可变区缺失构建体均检测出细胞内E2糖蛋白表达(图1D)。这表明，所插入的Gly-Ser-Ser-Gly连接体基序在这些E2糖蛋白内提供了足够的柔韧性，从而保留了对于呈现该构象依赖性表位而言所需的天然E2糖蛋白的固有折叠。然而，细胞内的包含HVR2或“igVR”缺失的E2糖蛋白不能共沉淀E1，这暗示这些区域在非共价缔合的E1E2异二聚体的细胞内装配中是直接或间接需要的。
E1E2糖蛋白的成熟和向假型HIV-1颗粒中的掺入
为了检查各个可变区在E1E2糖蛋白成熟中的作用，富集从经ER通过分泌途径进行运输中逃脱的少量E1和E2，以将这些复合物掺入假型HIV-1颗粒中，如先前所描述的。在使用构象依赖性抗-E2单克隆抗体(H53)和来自被HIV-1感染的个体的IgG(IgG14)进行免疫沉淀之前，裂解这些经代谢性标记的E1E2-假型HIV-1颗粒。
使用IgG14来进行的免疫沉淀证明，所述单一可变区缺失构建体中没有一个影响HIV-1结构蛋白Pr55Gag、p17RA、p24CA或p66RT的加工和病毒粒子掺入(图3B)。使用H53来进行的免疫沉淀将掺入病毒粒子中的E2糖蛋白检测出为对于包含各种复合类型和杂合类型的糖修饰的成熟糖蛋白而言典型的弥散性分子量条带(～70-90kDa)，如先前所描述的(图3A)。不同的突变型E2糖蛋白展示出在它们的相对分子量方面的另外的变化(HVR1con＜HVR2和“igVR”＜HVR1＜WT)，这反映了位于这些缺失的区域内的糖基化位点的丢失，如对于细胞内数据所描述的。所有突变型E2糖蛋白以大致野生型的水平掺入E1E2-假型HIV-1颗粒中，除了显示出显著减少的E2条带的HVR1con缺失外。这暗示，与HVR1相邻的保守区是完成E2折叠、成熟和掺入假型HIV-1颗粒中所必需的。
使用H53来进行的免疫沉淀还检测出迁移至～33kDa处的蛋白质种类和在～31kDa处的另一个更低分子量的条带，这最初暗示掺入病毒粒子中的E1糖蛋白也作为双重带进行迁移(图3A)。然而，在两次独立的实验之间，在阴性对照(空)中，该更低分子量的条带与非特异性条带共迁移，从而仅该更高分子量的条带可能代表E1。掺入病毒粒子中的E1糖蛋白(～33kDa)也比细胞内种类(～30kDa)迁移得慢，这反映了在通过分泌途径进行运输的过程中在一个或两个E1糖基化位点处的额外的糖修饰，如先前所观察到的。此外，掺入病毒粒子中的包含独个HVR2和“igVR”缺失的E2糖蛋白不能以可检测的水平共沉淀E1，这表明这些可变区在功能性E1E2异二聚体的形成中是直接或间接需要的。
E1E2-介导的向Huh7细胞中的进入
已显示，功能性非共价缔合的E1E2异二聚体的形成对于E1E2-介导的向Huh-7细胞中的进入是至关重要的。为了研究各个可变区在病毒进入中的作用，将单一缺失构建体用于产生E1E2-假型HIV-1颗粒以感染Huh7细胞，如先前所描述的。如所预期的，HVR1con缺失由于其阻碍E2糖蛋白向假型HIV-1病毒粒子中的掺入而使进入完全丧失，如上所观察到的(图4)。类似地，HVR2和“igVR”缺失由于破坏了功能性E1E2异二聚体复合物而对于进入而言是不能胜任的。然而，HVR1缺失也使进入完全丧失，尽管其保留了野生型的异二聚化水平和E1E2糖蛋白向HIV-1病毒粒子中的掺入，这暗示该区域可能在E1E2-介导的病毒进入中具有直接作用。
CD81-LEL结合
先前已证明，仅E2糖蛋白足以介导与CD81受体的结合，因而尽管展示出异二聚化和/或病毒进入的丧失，仍然就它们结合CD81的大细胞外环(LEL残基113-201)的能力来对细胞内的和掺入病毒粒子中的突变型E2糖蛋白进行检查。这包括将细胞和病毒裂解物应用于固相CD81MBP-LEL(残基113-201)结合测定法，如先前所描述的。将该数据对从各载体表达的单体E2的量(如用构象依赖性抗-E2单克隆抗体H53沉淀出的和在非还原性条件下通过SDS-PAGE观察到的)进行标准化；图1D(细胞内的)和3A(掺入病毒粒子中的)。所有细胞内的包含单一可变区缺失的E2糖蛋白前体展示出野生型水平的CD81-LEL结合，除了显示结合完全丧失的HVR1con外(图5A)。这表明，所插入的Gly-Ser-Ser-Gly连接体基序在缺失了HVR1、HVR2和“igVR”的E2糖蛋白内提供了足够的柔韧性，从而形成E2 CD81-结合位点，并且暗示，这些独个的可变区在该功能中不是必需的。还表明，细胞内的缺少与HVR1相邻的保守区的E2糖蛋白前体(HVR1con)不能形成CD81-LEL结合位点，尽管其保持了被H53所识别的构象依赖性表位。细胞内形式的HVR2和“igVR”缺失都展示出与野生型相比较而言最大CD81-LEL结合的额外增加(图5A)，尽管它们不展示总结合曲线的显著偏移，从而需要另外的独立实验来确定这些可变区是否调控CD81-LEL结合。
如所预期的，掺入病毒粒子中的包含HVR1con缺失的E2糖蛋白不能介导CD81-LEL结合，这反映了其减少的向E1E2-假型HIV-1颗粒中的掺入以及上述的细胞内数据(图5B)。相反地，掺入病毒粒子中的包含HVR1、HVR2和“igVR”缺失的E 2糖蛋白都保留了至少野生型水平的CD81-LEL结合，这表明这些突变型E2糖蛋白即使在成熟后仍保留CD81-结合位点。有趣地，掺入病毒粒子中的包含HVR1缺失的E2糖蛋白显示出与野生型相比较而言最大CD81-LEL结合的额外增加，并且展示出总结合曲线的大约4倍的增加(图5B)。这暗示，HVR1在掺入病毒粒子中的E2糖蛋白内负调节CD81-LEL结合，尽管不是该功能所必需的。观察到该效应在包含相同缺失的细胞内E2糖蛋白前体中不存在(图5A)反映了在通过分泌途径的糖蛋白成熟过程中发生的在E1E2折叠和CD81-结合位点方面的变化，如先前所观察到的。
2.延长的连接体对于E1E2糖蛋白结构和功能的影响
细胞内E1E2前体的折叠和异二聚化
为了增强包含各个可变区缺失的E2糖蛋白的折叠，通过重新引入几个从原始构建体上删除的靠近保守半胱氨酸的残基来延长Gly-Ser-Ser-Gly连接体。值得注意的是，该系列的经修饰的缺失构建体由于该区域的高度可变的性质而不具有HVR1对应物。通过脉冲追踪代谢性标记法(pulse-chase metabolic-labelling)和免疫沉淀法，就E1和E2糖蛋白在293T细胞中的表达和异二聚化来分析这些构建体。
使用抗-E1E2多克隆抗体(779)来进行的免疫沉淀检测出，对于每种延长的连接体缺失构建体发生了E1(～30kDa)和E2(～70kDa)糖蛋白的表达和从多蛋白上的切割(图6A)。多蛋白切割在HVR2link和“igVR link”构建体中表现出略低的效率，这暗示这些缺失可能影响多蛋白的加工。延长的连接体并不恢复被从原始构建体中删除的糖基化位点，因而突变型E 2糖蛋白再次展示出由于这些聚糖的不存在而赋予的可变地比野生型更低的分子量(kDa)：HVR1conlink＜HVR2link和“igVR link”＜WT。然而，需要对这些E 2糖蛋白进行去糖基化以验证如表2中所预测的它们的主链分子量。
抗-E1单克隆抗体(A4)对于所有延长的连接体构建体均检测出E1双重带(～30kDa和～27kDa)的存在(图6B)。E1在非还原性条件下不能共沉淀野生型E2糖蛋白，然而其在还原性条件下共沉淀突变型和野生型E2，这再次反映了A4抗体对于非共价缔合的E1的低敏感性。使用非构象依赖性抗-E2单克隆抗体(A11)来进行的沉淀对于每种延长的连接体构建体均检测出野生型E2糖蛋白表达，尽管只有HVR1conlink缺失共沉淀可检测的量的E1(图6C)。对于每种延长的连接体构建体，构象依赖性单克隆抗体(H53)也沉淀野生型水平的细胞内E2糖蛋白，这表明这些突变体保留了对于呈现该构象依赖性表位而言所需的天然E2糖蛋白的固有折叠性质(图6D)。此外，延长的“igVR”连接体恢复了野生型水平的与E1的共沉淀，这暗示该额外的连接体区域对于非共价缔合的E1E2异二聚体的细胞内装配而言是直接或间接需要的。然而，值得注意的是，对于延长的HVR2连接体构建体没有观察到该效应。
E1E2糖蛋白的成熟和向假型HIV-1颗粒中的掺入
为了检查延长的连接体是否改变E1E2糖蛋白的突变和病毒粒子掺入，将经修饰的单一缺失引入E1E2-假型HIV-1颗粒，然后裂解并用构象依赖性抗-E2单克隆抗体(H53)和来自被HIV-1感染的个体的IgG(IgG14)进行免疫沉淀，如先前所描述的。
使用IgG14来进行的免疫沉淀表明，所述经修饰的单一缺失构建体中没有一个影响HIV-1结构蛋白的加工和病毒粒子掺入(图7B)。使用H53来进行的沉淀再次检测出对于成熟的掺入病毒粒子中的E2糖蛋白而言典型的弥散性分了量条带(～70-90kDa)(图7A)。掺入病毒粒子中的突变型E2糖蛋白还展示出由于丢失了一个或两个糖基化位点而赋予的比野生型种类略微更低的分子量(kDa)，如对于细胞内数据所描述的。使用H53来进行的沉淀再次证明了包含HVR1conlink缺失的E2糖蛋白的减少的病毒粒子掺入，尽管重新引入了4个在原始HVR1con缺失构建体中不存在的靠近保守半胱氨酸的残基。HVR2link缺失显示出野生型水平的被掺入假型HIV-1颗粒中的E 2糖蛋白，然而仍然不能共沉淀可检测的量的E1(映证了细胞内数据)。相反地，掺入病毒粒子中的包含延长的“igVR”连接体的E2糖蛋白共沉淀野生型水平的E1，这暗示该区域在功能性E1E2异二聚体的形成中是直接或间接需要的。
E1E2-介导的向Huh7细胞中的进入
为了检查这些延长的连接体是否赋予E1E2-介导的向Huh-7细胞中的进入，将这些经修饰的单一缺失构建体用于产生E1E2-假型HIV-1颗粒以感染Huh7细胞，如先前所描述的。如所预期的，HVR1conlink和HVR2link缺失构建体中的延长的连接体不恢复任何进入活性，这分别与所观察到的这些突变型E2糖蛋白不能掺入病毒粒子中或异二聚化相一致(图8)。然而，掺入病毒粒子中的包含延长的“igVR”连接体的E2糖蛋白显示出与阴性对照(空)相比较而言显著的进入活性的回复(～8倍)，这与其恢复的与E1的异二聚化相一致。然而，值得注意的是，“igVR link”仍然展示出与野生型相比较而言减少的进入活性(～10倍)。
CD81-LEL结合
为了检测细胞内的或掺入病毒粒子中的包含这些延长的连接体的E2糖蛋白是否改变CD81-LEL结合，将细胞和病毒裂解物应用于固相CD81 MBP-LEL(残基113-201)结合测定法，如先前所描述的。将该数据对从各载体表达的单体E2的量(如用H53沉淀出的和在非还原性条件下通过SDS-PAGE观察到的)进行标准化；图6D(细胞内的)和7A(掺入病毒粒子中的)。延长的连接体似乎不改变包含HVR2link或“igVRlink”的细胞内E2糖蛋白的CD81-LEL结合能力，因为它们仍然显示出野生型水平或甚至比原始HVR2和“igVR”缺失构建体所展示的结合略微增加的结合(图9A)。值得注意的是，细胞内的包含HVR1conlink缺失的E2糖蛋白显示出与阴性对照(空)相比较而言在CD81-LEL结合方面的略微恢复，这暗示被重新引入该构建体中的靠近保守半胱氨酸的残基可直接或间接地促成CD81-结合位点的形成。然而，掺入病毒粒子中的包含HVR1conlink缺失的E2糖蛋白甚至丧失了该降低的CD81-LEL结合能力(图9B)，这与其阻碍向HIV-1病毒粒子中的掺入相一致。掺入病毒粒子中的包含HVR2link和“igVR link”缺失构建体的E2糖蛋白在病毒裂解物中保持了CD81-LEL结合，但在两次独立的测定(图9B和9C)之间，在它们的相对CD81-LEL结合能力方面产生了不一致的结果，因而需要第三次独立的测定来验证这些结果。
3.多重可变区缺失对于E1E2糖蛋白结构和功能的影响
细胞内E1E2前体的折叠和异二聚化
尽管丧失与E1的异二聚化和/或病毒进入，但上述发现表明，HVR1、HVR2和“igVR”可独个地从细胞内的和掺入病毒粒子中的E2糖蛋白中删除，而不破坏其被构象依赖性单克隆抗体H53所识别的固有折叠性质以及与CD81受体的大细胞外环(LEL)的结合。为了进一步表征这些可变区和描绘保守的E2核心结构域，将多重缺失引入E1E2多蛋白中并且通过脉冲追踪代谢性标记法和免疫沉淀法在293T细胞中进行分析。使用抗-E1E2多克隆抗体(779)来进行的沉淀显示出，对于所述多重可变区缺失构建体中的每一种发生了E1(～30kDa)和E2(～70kDa)糖蛋白的有效表达和从多蛋白上的切割(图10A)。这些突变型E2糖蛋白还比野生型种类迁移得快，这相应于在每种HVR2和/或“igVR”缺失中丢失了糖基化位点：HVR1+2+igVR和HVR2+igVR＜HVR1+2和HVR1+igVR＜WT。然而，需要对这些糖蛋白进行去糖基化以确认如表3中所预测的它们的主链分子量。抗-E1单克隆抗体(A4)再次检测出对于所述可变区缺失构建体中的每一种存在E1双重带(～30kDa和～27kDa)(图10B)。E1在还原性条件下与野生型和突变型E2糖蛋白共沉淀，这证明形成了共价连接的E1E2异二聚体。在非还原性条件下不能检测出野生型E1E2异二聚体再次映证了A4对于非共价缔合的E1糖蛋白的低敏感性。
相反地，非构象依赖性抗-E2单克隆抗体(A11)在还原性或非还原性条件下没有检测出共沉淀E1的包含这些多重可变区缺失的E2糖蛋白，尽管对于这些缺失构建体中的每一种证明了野生型水平的细胞内E2糖蛋白表达(图10C)。构象依赖性抗-E2单克隆抗体H53还沉淀野生型水平的突变型E2糖蛋白(图10D)。这表明，所插入的Gly-Ser-Ser-Gly连接体基序在这些突变型E2糖蛋白内提供了足够的柔韧性，从而呈现该构象依赖性表位，尽管引入了多重可变区缺失(图10D)。这些突变型E2糖蛋白还显示丧失了与E1的异二聚化，这与在E1E2异二聚体的装配中所需的HVR2和/或“igVR”不存在相一致，如上所观察到的。
E1E2糖蛋白的成熟和向假型HIV-1颗粒中的掺入
为了检查所述多重可变区缺失是否改变E1E2糖蛋白的成熟，将这些缺失引入E1E2-假型HIV-1颗粒中，并在使用构象依赖性抗-E2单克隆抗体H53和来自被HIV-1感染的个体的IgG(IgG14)进行免疫沉淀之前将其裂解，如先前所描述的。
IgG14沉淀表明，所述多重可变区缺失中没有一个影响HIV-1结构蛋白的加工和病毒粒子掺入(图11B)。使用H53来进行的免疫沉淀再次将E2检测出为对于成熟的掺入病毒粒子中的E2糖蛋白而言典型的弥散性条带(～70-90kDa)(图11A)，并且证明包含多重可变区缺失的E2糖蛋白以野生型水平掺入HIV-1病毒粒子中。这些突变型E2糖蛋白还略微比野生型种类迁移得快，这反映了HVR2和/或“igVR”缺失内的一个或两个糖基化位点的丢失，如对于细胞内数据所描述的。这暗示，掺入病毒粒子中的包含多重可变区缺失的E2糖蛋白即使在成熟后仍然保留构象依赖性H53表位。再一次地，这些突变型E2糖蛋白中没有一个共沉淀可检测的量的E1，如在细胞内数据中所观察到的。
E1E2-介导的向Huh7细胞中的进入
如所预期的，包含多重可变区缺失的E1E2-假型HIV-1颗粒对于进入Huh7细胞而言是不能胜任的(图12)。
CD81-LEL结合
尽管丧失了异二聚化和E1E2-介导的病毒进入，但通过将细胞和病毒裂解物应用于固相CD81 MBP-LEL(残基113-201)结合测定法，就它们结合CD81-LEL的能力来检查细胞内的和掺入病毒粒子中的包含多重可变区缺失的E 2糖蛋白，如先前所描述的。将该数据对从各载体表达的单体E2的量(如用H53沉淀出的和在非还原性条件下通过SDS-PAGE观察到的)进行标准化；图10D(细胞内的)和11A(来源于病毒粒子的)。
细胞内的包含多重可变区缺失的E2糖蛋白全都显示出野生型水平的CD81-LEL结合(图13A)。这表明，Gly-Ser-Ser-Gly连接体基序在这些突变型E2糖蛋白内提供了足够的柔韧性，从而形成前体CD81受体-结合位点。此外，包含HVR2和“igVR”双重缺失的E2糖蛋白(pE1E2Δ23)在两次独立实验之间显示出最大CD81结合的进一步增强。这与在独个HVR2和“igVR”突变体中所观察到的该相同效应相一致，尽管类似地，总结合曲线未增加，从而需要另外的独立测定来确定该效应的统计学显著性。
掺入病毒粒子中的包含多重可变区缺失的E2糖蛋白都保持CD81-LEL结合(图13B)，这再次表明所插入的连接体基序在这些糖蛋白内提供了足够的柔韧性，从而即使在成熟后仍呈现CD81-结合位点。这再次暗示，HVR1、HVR2和“igVR”不是该功能所必需的，这映证了细胞内数据和对于独个可变区缺失所获得的数据。重要的是，这证明，包含三重可变区缺失的E2糖蛋白包括了在CD81-LEL结合中所需的所有结构和功能决定子，从而构成了最小E2核心结构域。这些来源于病毒粒子的包含双重和三重可变区缺失的E2糖蛋白还分别显示出与野生型相比较而言略微减少或增加的最大CD81-LEL结合活性，尽管再次地，这些突变体中没有一个展示出总结合曲线的显著增加。
4.可变区在E2受体结合结构域(E2 RBD 661myc )的结构和功能中的作用
折叠和分泌
上述结果证明，所有三个可变区的同时缺失不会破坏被构象依赖性单克隆抗体H 53所识别的E2糖蛋白的固有折叠或者与CD81-LEL的结合，这强有力地暗示该构建体构成了E2核心结构域。然而，在全长E2糖蛋白的情况下，跨膜区和近膜区两者的存在使得难以结晶出该核心E2结构。因此，将单一和多重可变区缺失均引入可溶性的且易于高水平表达的E 2受体结合结构域(E2 RBD661myc)中。在293T细胞内代谢性地标记包含单一和多重可变区缺失的E2 RBD661myc糖蛋白，并且通过使用构象依赖性抗-E2单克隆抗体(H53)进行免疫沉淀来分析细胞内的和分泌的蛋白。
对于所有单一和多重缺失构建体，H53沉淀出野生型水平的细胞内E2 RBD661myc(～50kDa)，这表明这些突变型糖蛋白中的每一种均得到了有效表达(图14A)。这些细胞内E2 RBD661myc糖蛋白还展示出可变地比野生型更低的分子量，这与位于被删除的区域中的糖基化位点的丢失相一致，如在全长E1E2异二聚体的情况下所观察到的。然而，需要对这些截短的糖蛋白进行去糖基化以确认如表4中所预测的它们的分子量。此外，H53沉淀出相应于分泌形式的E2 RBD661mycy的弥散性分子量条带(～55-65kDa)(图14B)，这反映了在通过分泌途径进行运输的过程中获得的各种复合类型和杂合类型的糖修饰。所有含有单一和多重可变区缺失的E2 RBD661myc糖蛋白显示被有效地分泌，并且再次展现出可变的分子量(kDa)，如对于细胞内数据所描述的。这些结果一起证实，可以独个地和组合地从E2 RBD661myc中删除可变区，并且保持细胞内的和分泌的受体结合结构域的固有折叠，如通过构象依赖性抗-E2单克隆抗体H53所检测的。
CD81-LEL结合
为了确定含有单一和多重可变区缺失的E2受体结合结构域是否结合CD81-LEL，将细胞内的和分泌的E2 RBD661myc裂解物应用于固相CD81MBP-LEL(残基113-201)结合测定法，如先前所描述的。将该数据对从各载体表达的单体E2的量(如用H53沉淀出的和通过SDS-PAGE观察到的)进行标准化；图14A(细胞内的)和14B(分泌的)。
细胞内和分泌形式的含有单一可变区缺失的E2 RBD661myc显示出CD81-LEL结合，尽管，如在全长E2糖蛋白的情况下所观察到的，HVR1con缺失使CD81-LEL结合完全丧失(图15A和15B)。分泌形式的含有单一HVR1缺失的E2糖蛋白还展示出与野生型相比较而言CD81-LEL结合的额外增强，这与对于成熟的来源于病毒粒子的形式的全长E2糖蛋白所获得的数据相一致。重要的是，细胞内和分泌形式的包含三重可变区缺失的E2 RBD661myc(HVR1+2+igVR)保持了野生型水平的CD81-LEL结合(图16A和16B)，这证实了该糖蛋白种类包括所有结构和功能性CD81-结合决定子，从而构成最小或接近最小的E2核心受体结合结构域。
5.带有同时的HVR缺失的E2 RBD 661 与细胞表面表达的全长CD81的结合
测定分泌的具有多重HVR缺失的E2 RBD661蛋白结合细胞表面表达的全长CD81的能力。用编码人CD81的载体转染CHO-K1细胞。在转染后48小时，将细胞置于冰上，并向细胞中加入等量的E2。4小时后，使用经放射性碘化的MAb 9E10来检测所结合的E2，并定量所结合的E2的量。结果(图17)显示，野生型和缺失了ΔHVR2+igVR的E2 RBD661以相似的水平结合全长CD81。相反地，ΔHVR1+2-E2 RBD661与CD81的结合显著降低(p＝0.038)；构建体E2Δ123-myc中igVR的进一步缺失恢复了野生型CD81结合活性(p＝0.11)。这些数据表明，所述3个可变区可以同时缺失而不破坏E2的CD81结合能力。有趣的是，从E2 RBD661上同时删除HVR1和HVR2导致降低的CD81结合，然而该缺陷通过进一步删除igVR而得到矫正。
6.带有同时的HVR缺失的E2 RBD 661 被人构象敏感型单克隆抗体识别的 能力
用35S-Met/Cys对野生型E2-myc和E2Δ123-myc进行放射性标记，并且用一组人构象敏感型单克隆抗体来进行免疫沉淀(Keck等人，2004)，并通过非还原性SDS-PAGE进行分析。该组构象依赖性Mab对于代表三个不同的免疫原性结构域E2-A、B和C的构象表位来说是特异的(Keck等人，2004)。E2Δ123-myc蛋白显示出与野生型E2-myc蛋白类似的免疫原特性谱(图18)，这表明缺少所有三个可变区的E2-myc保留了对于E2的这三个不同的结构和功能结构域而言特异的构象表位。该数据与先前由Keck等人公布的数据(所述数据也证明HVR1不参与这些结构域)(Keck等人，2004)相一致。该数据将这些观察结果扩展至暗示HVR2和igVR也不参与这些结构域。
7.讨论
在本研究的过程中，将两个公认的E2可变区(HVR1和HVR2)以及新的可变区“igVR”独个地删除，以进一步研究这些区域在E1E2生物合成、异二聚化、CD81结合和病毒进入方面的作用。所有包含这些可变区缺失的E2糖蛋白显示出保持了被构象依赖性单克隆抗体H53所识别的野生型糖蛋白的固有折叠。进一步显示，HVR2和“igVR”是异聚化所必需的，并且所有三个可变区在病毒进入中在CD81结合之前的阶段或CD81结合之后的阶段中是所必需的。还证明，所述独个可变区中没有一个是CD81结合所必需的，并且可以从E2糖蛋白中同时删除所有三个可变区，而仍保留CD81结合性质。
包膜糖蛋白E1和E2在HCV基因组中展示出最大的遗传异质性，特别是在高变区1(HVR1)(其是位于E2糖蛋白N-末端的高度可变的～27个氨基酸的序列)中。此外，已证明，HVR1(多蛋白残基387-408)的缺失导致E1E2-介导的进入的丧失，尽管其保持了野生型水平的E1E2的异二聚化和向假型HIV-1颗粒中的掺入，这暗示该区域在病毒进入中具有直接作用。然而，还已显示，在功能性E1E2异二聚体或E2受体结合结构域(E2 RBD661myc)的情况下，HVR1不是CD81-LEL结合所必需的，这表明HVR1在病毒进入中参与另一个CD81结合之前的阶段或CD81结合之后的阶段。这与报导了HVR1(多蛋白残基384-410)的缺失消除E2与SR-B1受体的结合的先前研究相一致，这暗示该区域可能是对于在病毒进入中的必不可少的SR-B1接触而言所必需的。
然而，本发现与几个其他研究相矛盾，所述其他研究已证明缺少HVR1的HCV假型颗粒(HCVpp)介导向Huh7细胞中的进入，尽管以减少的水平，这与该区域在病毒进入中的必不可少的作用不一致。还已报道，在高密度脂蛋白(HDL)(其为SR-B1的天然配体)存在下所观察到的HCVpp感染性的增强在删除HVR1后丧失。这暗示，HVR1有助于感染性，而并非是该功能所必不可少的，尽管该效应是否归因于HCV颗粒与HDL的结合仍未确定。此外，最近的研究已发现，HVR1内的所有保守的碱性残基的取代显著减少HCVpp进入，尽管未发现这些残基参与CD81-LEL结合或者与SR-B1结合的HDL增强相关。因此，HVR1在病毒进入中的确切作用仍不清楚。
还已显示，HVR1的缺失显著增强CD81结合(大约4倍)，这与先前的研究一致。这暗示，HVR1负调节E2糖蛋白内的保守CD81-结合位点的可接近性，尽管不是该功能所必需的。这与最近鉴定出位于HVR1和HVR2之间的保守CD81-结合决定子“G436WLAGLFY”相一致。此外，已证明，广泛中和性抗体AP33识别与HVR1直接相邻的保守表位(多蛋白残基412-423)，并且抑制CD81和E 2糖蛋白的一系列表现形式之间的相互作用。还已显示，延伸HVR 1缺失至包括保守的I411残基使CD81结合降低而非增强，这进一步使该区域牵涉于该功能中。类似地，已证明，延伸HVR1缺失至包括该相邻的保守区(HVR1con，多蛋白残基387-428)破坏了在CD81-结合位点的形成中至关重要的E2糖蛋白的折叠和成熟。此外，已证明，位于该保守区内的残基W420也参与CD81结合。
这些与HVR1相邻的高度保守的区域的定位暗示，该高度可变区执行下列双重功能：介导细胞进入，和调节这些保守区对宿主免疫系统的可接近性以逃避被广泛中和性抗体例如AP33所识别。事实上，先前的研究已发现，HVR1的缺失导致包膜糖蛋白复合物对于中和性抗体和血清的敏感性增加。因此，已提出HVR1形成了在E2糖蛋白的保守核心结构域外部的暴露于溶剂的亚结构域，这与其在受体结合中的调节作用和其对免疫显性应答的引发相一致。为了进一步表征该所提及的保守核心结构域，还删除了其余的E2可变区HVR2和“igVR”。如对于HVR1缺失所观察到的，缺乏独个HVR2和“igVR”区域的E2糖蛋白均保持通过构象依赖性单克隆抗体H53检测出的野生型糖蛋白的固有折叠性质。
然而，有趣的是，HVR2和“igVR”都显示为是异二聚化所需的，因此，这些区域的缺失显示出完全丧失了E1E2-介导的向Huh7细胞中的进入。这暗示，E2糖蛋白中的这些区域参与直接的异二聚体接触，或备选地，调节对于该功能而言间接需要的别构效应。因此，为了进一步研究这些区域的作用，将几个靠近保守半胱氨酸的残基重新引入HVR2和“igVR”缺失构建体中，以延长它们的连接体基序，从而增强E2糖蛋白折叠。发现“igVR”连接体的延伸恢复了野生型水平的与E1的异二聚化和显著水平的E1E2-介导的进入(～8倍)，尽管对于HVR2未观察到该效应。该发现可能反映了长度相对较短的“igVR”缺失，其中从该区域中丢失的五个甘氨酸残基中的两个通过引入Gly-Ser-Ser-Gly连接体基序而进一步得到补偿，从而导致该区域内只有5个氨基酸的总缺失。“igVR”连接体在异二聚化中的作用也与其在基因型那所观察到的保守性相一致。值得注意的是，延长的“igVR”连接体构建体仍然展示出与野生型相比而言进入活性的减少(～10倍)，这可能是由于在该区域内保守的N-联糖基化位点不存在(先前已观察到其减少HCVpp进入)引起的。
此外，已证明，包含HVR2或“igVR”缺失的E2糖蛋白保持野生型水平的CD81结合，这表明，这些区域，如在HVR1中观察到的，在该功能中不是必需的。先前的研究已显示，靶向HVR2的单克隆抗体抑制E2糖蛋白与CD81的结合，并且提出，该区域形成CD81-结合决定子，尽管基于本发现，这些抗体更可能产生位阻效应，所述位阻效应遮蔽与该区域相邻的G436WLAGLFY CD81-结合决定子。因此，尽管丧失了异二聚化和/或病毒进入，但HVR1、HVR2和“igVR”全都可以独个地从E2糖蛋白上删除而不破坏其固有的折叠性质，并且事实上，已进一步显示，所有三个可变区可以同时删除而保持CD81结合。这强有力地支持了这样的假设，即这些可变区形成了E2核心结构域外部的暴露于溶剂的亚结构域，其包含对于结合确认的HCV受体CD81而言所需的保守的结构和功能决定子。
有趣的是，还观察到，包含HVR1缺失以及HVR2或“igVR”缺失的E2糖蛋白不展示出对于独个HVR1缺失所观察到的CD81-LEL结合的显著增强。先前的研究已证明，以组合的方式用来自不同亚型的相应序列对HVR1和HVR2进行取代导致获得对于独个HVR1或HVR2取代未观察到的增加或降低的CD81结合(取决于所引入的和主链的链)。总之，该数据暗示，在这些区域之间发生分子内相互作用以调节CD81结合，以及它们可能采取固有地柔韧的结构以接纳这些接触。这通过最近鉴定出直接位于HVR1和HVR2之间的保守CD81-结合决定子G436WLAGLFY443以及由HVR1和在更低程度上由HVR2引发的免疫显性应答而得到支持，这与它们的位置(作为可在细胞附着中执行调节功能的暴露于表面的亚结构域)相一致。对于HVR1和“igVR”双重缺失所观察到的该相同效应暗示，“igVR”区域还可促成这些合作式相互作用。
解释该数据的一个假设提出，可变区形成柔韧的暴露于溶剂的亚结构域，所述亚结构域使得E2糖蛋白能够在‘开放’和‘关闭’构象之间移动，前者通过暴露位于核心E2结构域内的保守CD81-结合决定子而对于CD81结合来说是更为胜任的，如在该研究中所描述的。事实上，先前在CD81结合后观察到E2糖蛋白内的构象变化。此外，已显示，非中和抗体与E2糖蛋白的结合降低了其对于中和抗体的易感性，并且与这样的模型相一致，在所述模型中，非中和抗体抑制这些表面暴露的可变区的柔韧性，从而阻断了与位于E2核心结构域内的保守表位的接近。因此，这暗示，经修饰的E2核心结构域代表了用于引发针对E2糖蛋白内的保守表位(包括CD81-结合决定子)的中和抗体的具有前景的疫苗候选物，所述表位被这些表面暴露的可变区遮蔽，所述可变区可在HCV复制期间用作在糖蛋白复合物表面上的免疫学诱饵。
所观察到的含有HVR2和“igVR”缺失的E2糖蛋白的异二聚化的丧失暗示，在这些糖蛋白内发生了可以不被单种构象依赖性单克隆抗体H53所识别的构象变化。因此，获得先前已用于鉴定E2糖蛋白内的所述三个主要免疫原性区域的一组构象依赖性抗体，以用于检查由这些可变区介导的在糖蛋白结构和功能中的更微妙的改变。结果显示，在E2RBD661myc的情况下，针对结构域A、B和C的单克隆抗体保持野生型水平的对于同时缺失了所有三个可变区的RBD的反应性。这进一步暗示，E2Δ123-mycΔ123RBD构建体保持了天然E2 RBD的固有核心结构域折叠性质。
8.材料和方法
可变区缺失突变体的构建
载体
为了将E2可变区缺失引入E1E2异二聚体中，获得基于HCV的表达载体pE1E2H77c(Drummer等人，2003)。pE1E2H77c载体包含来自全长pCV-H77c(基因型1a)感染性克隆(Yanagi等人，1997)的DNA序列，其编码所描述的E1E2多蛋白残基165-746(Drummer等人，2003)。为了确保有效的ER靶向和糖蛋白切割，该序列包括位于未成熟核心蛋白的C-末端的E1信号肽以及全长E1和E2多蛋白序列(图19)。将该DNA片段克隆入pCDNA4HisMax载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的主链中，所述载体包含翻译增强子序列和巨细胞病毒(CMV)启动子以用于在哺乳动物系统中进行表达。其还包含用于在细菌细胞中进行选择的氨苄青霉素抗性基因。
使用引物5’-CCGCCACCATGGGAGTGGAGGGCTGC-3’和5’-GGCTTAGTACACGGAGCTGTTCCG-3’，通过PCR从pcDM8-TAPA-1(Levy等人，1998)30)中扩增出CD81开放阅读框。使用HindIII和XbaI(以粗体显示)将PCR产物克隆入pcDNA3中，从而产生质粒pcDNA3-CD81。
为了使得能够表征可溶性E 2受体结合结构域(E2 RBD661)内的可变区，还获得了基于HCV的表达载体pE2661(Drummer等人，2002)。pE2661载体包含编码所描述的HCV多蛋白残基384-661的pCV-H77c DNA序列(Drummer等人，2006)2002)。该序列编码显示出保持CD81和SR-B1受体结合的E2糖蛋白的独立折叠亚结构域(Pileri等人，1998，Scarselli等人，2002，Puleri等人，1998)。将该DNA产物在组织纤溶酶原激活物(tpa)前导序列的C-末端处克隆入pCDNA3载体(Invitrogen)主链中，所述前导序列被设计用于确保在E1不存在下(E2-myc)E2 RBD661的有效的ER靶向和信号切割。该载体还包含用于在哺乳动物细胞中进行表达的CMV启动子和有助于在细菌细胞中进行选择的氨苄青霉素抗性基因。
重叠延伸PCR
重叠延伸PCR是有助于删除DNA的大区段的两步骤策略(图20)(Horton等人，1989)。在第一轮中，将pE1E2H77c用作模板以将独个可变区缺失引入全长E1E2多蛋白中。该步骤需要两个寡核苷酸对(Geneworks，Ann Arbor，MI，USA)；每一对包含负责扩增可变区的上游(5′)或下游(3′)序列的一个外部引物和一个内部引物。内部寡核苷酸引物被设计用于引入Gly-Ser-Ser-Gly连接体以及与相应的5′或3′片段互补的短重叠序列(表5)。一旦产生后，通过琼脂糖凝胶电泳来分离这些第一轮5′和3′PCR产物，并进行纯化，然后添加至第二轮PCR反应中。第二轮通过它们的重叠且互补的序列使得5′和3′片段能够退火，从而形成用于通过相关外部引物进行延伸和扩增的模板。所述外部引物还包含唯一的EcoR1/XbaI限制性内切核酸酶位点以帮助克隆回模板载体中。
E1E2可变区缺失构建体
将重叠延伸PCR策略用于产生表5中所概括的和图20中所显示的单一可变区缺失。值得注意的是，设计了两种备选的HVR1缺失构建体，HVR1和HVR1con，以用于进一步研究该区域。HVR1缺失缺少多蛋白残基387和408之间的高变区段，而HVR1con将该缺失延伸至包括邻近区域，直至E2中的第一个保守半胱氨酸残基(多蛋白残基387-428)，所述半胱氨酸残基原本计划用于将该N一末端区域锚定至该糖蛋白的其余部分。HVR1的前三个氨基酸(E384TH)也被保留在这些构建体中以确保在糖蛋白生物合成过程中E1和E2之间的有效切割。HVR2和“igVR”缺失分别包括多蛋白残基460-485和570-580。
为了增强E2糖蛋白折叠，使用重叠延伸PCR来产生第二系列的经修饰的单一可变区缺失构建体(图21)。该策略使用一组经修饰的内部寡核苷酸引物，以便通过重新引入几个从原始构建体中删除的靠近保守半胱氨酸的残基(如表2中所概括的和图21中所显示的)来延伸Gly-Ser-Ser-Gly连接体基序。值得注意的是，该经修饰的ΔHVRlinkE1E2系列由于没有任何位于该区域内的保守残基而缺少HVR1缺失构建体。
为了描绘最小E2核心结构域，将多重HVR1、HVR2和“igVR”缺失引入E1E2糖蛋白的背景中，如图19中所显示的。再次，使用重叠延伸PCR产生这些多重缺失构建体，但利用相关的单一或双重可变区缺失构建体而非野生型pE1E2H77c载体作为模板，如表3中所概括的。
E2RBD 661myc 可变区缺失构建体(E2-myc)
为了表征在可溶性E2受体结合结构域(E2RBD661myc)的背景中的单一和多重可变区缺失，将标准PCR用于从全长E1E2构建体中扩增多蛋白残基384至661，所述全长E1E2构建体包含表4中所概括的和图22中所显示的单一或多重可变区缺失。所述寡核苷酸引物被设计用于引入C-末端myc表位标签和唯一的NheI/XbaI限制性内切核酸酶位点以帮助将这些PCR产物克隆入pE2661载体中。
在表6中所概括的条件下，使用Expand High Fidelity PCR系统(Invitrogen)，在Biometra Thermocycler(Biometra，Goettingen，Germany)中进行所有PCR反应。
琼脂糖凝胶电泳
使用含有TAE(0.001M EDTA和0.04M Tris-乙酸盐)的Bio-Rad电泳槽(gel tank)(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)，通过琼脂糖凝胶电泳来分离DNA产物。使用溴化乙锭(0.5μg/mL)来调配在TAE中的1％(w/v)DNA级别的琼脂糖，以使得在紫外光下能够显现DNA(Sambrook和Russel，2001)。以20％(v/v)使用Orange G凝胶上样染料(1％(w/v)Orange G(Sigma，St Louis，MO，USA)，50％(v/v)甘油)来调配DNA样品。琼脂糖凝胶于100V，23mA进行电泳30至40分钟，并使用Gel DOC系统(Bio-Rad)，依据1kb Plus DNA标准参照物(Invitrogen)来确认和定量DNA片段大小。然后按照厂商说明书，使用Mo Bio PCR Clean-up试剂盒(Mo Bio，Carlsbad，CA，USA)从PCR反应体系中或者使用Mo Bio Gel-Spin试剂盒(Mo Bio)从琼脂糖凝胶中纯化出经确认的DNA产物。
DNA的限制性内切核酸酶消化
按照厂商说明书(New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)，使用New England Biolab限制性内切核酸酶来消化所有DNA。使用虾碱性磷酸酶(Invitrogen)于37℃对任何经消化的载体进行去磷酸化30分钟，以减少自我退火。
质粒构建体的连接和转化
使用T4DNA连接酶系统(Invitrogen)，以大约4∶1的比例将经消化的插入片段和载体DNA连接在一起，并于4℃温育16小时。使用乙酸钠沉淀方法(3M乙酸钠(pH 5)和100％乙醇)(Sambrook和Russel，2001)来分离DNA连接产物，并在无菌蒸馏水中重悬浮1小时。使用1mm电穿孔杯池(cuvette)(BTX，Holliston，MA，USA)和Gene PulserElectroporator(BioRad)(设置为2.0V，200Ω和25μF)将连接产物转化入20uL的电穿孔-感受态DH10B大肠杆菌细胞(New EnglandBiolabs)中。然后，将经电处理的DH10B细胞转移入Luria Bertani培养基(LB)(1％(w/v)胰蛋白胨、0.5％(w/v)酵母提取物、0.5％(w/v)NaCl)中以在37℃下恢复1小时。然后，将细胞涂板在含有50ug/mL氨苄青霉素的LB-琼脂平板(LB，5％(w/v)琼脂)上，并于37℃温育16小时以选择经转化的细胞(Sambrook和Russel，2001)。
菌落PCR
为了快速筛选包含所期望的DNA插入片段的经转化的菌落，从每个LB-琼脂平板上选择大约20个菌落用于菌落PCR(Sambrook和Russel，2001)。在表6中指定的条件下，在Biometra Thermocycler(Biometra)中，使用Taq聚合酶系统(Invitrogen)和合适的外部引物来进行菌落PCR。通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定包含阳性插入片段的菌落，如上面所描述的。
质粒DNA的小规模制备
然后，按照厂商说明书，利用Mo Bio Mini-prep试剂盒(Mo Bio)，使用碱裂解法从阳性菌落中小规模制备质粒DNA。通过限制性内切核酸酶消化和琼脂糖凝胶电泳来确认插入片段，如上面所描述的。
DNA测序
按照Micromon Reaction Set-Up方案(Micromon，Victoria，Australia)，使用相关的测序引物和PRISM BigDye Terminator Mix(版本3.1)(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)来确认所有质粒DNA插入片段的序列。在表6中所概括的条件下在BiometraThermocycler(Biometra)中进行所有测序反应，并按照MicromonReaction Clean-Up方案(Micromon)来制备所得的DNA。在Micromon测序实验室中，在3730S Genetic Analyser(Applied Biosystems)中进行序列分析。
质粒DNA的大规模制备和定量
然后按照厂商说明书，使用基于碱裂解法的Qiagen Midi-prep试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)，以更大的规模从经确认的克隆中分离质粒DNA。使用苯酚-氯仿(1∶1)来纯化这些大规模质粒DNA制剂，并以10000xg离心3分钟以获得含有DNA的上相，并且使用氯仿(50％(v/v))进行重复。使用乙酸钠(10％(v/v))和2.5倍体积的100％乙醇在70℃下浓缩经纯化的DNA 30分钟。于10000xg进行15分钟来使DNA形成粒状沉淀，随后在70％沉淀法中洗涤两次，并重悬浮在100uL TE中。于260nm处使用光度适应计(Biophotometer)(Eppendorf，Hamburg，Germany)来测定所有DNA浓度。
在该研究期间，所有细菌工作均使用设置于37℃的轨道式摇动器(Ratek Instruments，Victoria，Australia)或培养箱(Memmet，Schwabach，Germany)。
生物化学和功能测定法
细胞培养
将来自人成纤维细胞系的293T人胚肾细胞(HEK 293T)用于本研究以确保高的转染率和获得良好水平的细胞蛋白质表达。人肝脏肝细胞是HCV的初级靶细胞(primary target cell)，因而在本研究中将人肝细胞癌细胞系Huh 7用作模型肝细胞系统。此外，已证明Huh7细胞系支持亚基因组HCV复制子，高度许可HCVpp进入，并且可以支持在细胞培养物上生长的HCV(HCVcc)，这暗示其包含对于体内HCV向性而言所需的所有细胞因子(ZhongBartosch等人，2005，Wakita等人，20052003a，Lindenbach等人，2005b，Lohmann等人，1999，LindenbachWakita等人，2005a，Zhong等人，2005，Bartosch等人，2003a)。
将所有细胞维持于DMF10之中：Dulbecco极限必需培养基(Invitrogen)、10％(v/v)热灭活的胎牛血清(Invitrogen)、2mML-谷氨酰胺(GE Healthcare，Bukinghamshire，UK)、1M HEPES缓冲液(Invitrogen)、庆大霉素(GE Healthcare)和2ug/mL米诺环素盐酸盐(Sigma)。每3至4天将细胞于75cm2或150cm2Falcon瓶(BectonDickenson，Franklin Lakes，NJ，USA)中进行传代培养，其中使用在PBS-EDTA(磷酸缓冲盐水(PBS)-乙二胺四乙酸(EDTA))中的0.025％(v/v)胰蛋白酶来脱离单层。在Thermo Direct Heat CO2培养箱(Thermo，Waltham，MA，USA)中于37℃和5％CO2下培养所有细胞。在本研究过程中，使用FuGene6转染试剂(Roche)将所有载体转染入接种在6-孔培养板(Nalge Nunc，Rochester，NY，USA)中的HEK 293T细胞中，如先前所描述的(Drummer等人，2003)。
抗体
非构象的抗-E1单克隆抗体A4和非构象的抗-E2单克隆抗体A11由Jean Dubuisson和Harry Greenberg博士(Dubuisson等人，1994)赠予。构象依赖性抗-E2单克隆抗体H53也由Jean Dubuisson博士(Deleersnyder等人，1997)赠予。获得了从被HCV基因型1a感染的个体的血浆中纯化出的抗-E1E2多克隆抗体779(Drummer和Poumbourios，未公布的)。还获得了来自被HIV-1感染的个体的免疫球蛋白G(IgG14)和抗-myc单克隆抗体9E10(Drummer等人，2002，Drummer等人，2003)。从Steven Foung博士(Keck等人，2004)处获得对于代表E2的三个不同免疫原性结构域A、B和C的构象表位而言特异的一组构象依赖性人Mab。
E1E2假型HIV-1颗粒进入测定法
通过逆转录病毒或慢病毒核心颗粒来进行的功能性HCV包膜糖蛋白的掺入和展示(称为假型包装(pseudotyping))提供了用于表征突变型E1E2糖蛋白的相对快速和简单的方法，而无需将这些突变引入全长HCV基因组(Drummer等人，2003，Bartosch等人，2003b)2003a，Drummer等人，2003)。该策略涉及E1E2表达载体和逆转录病毒或慢病毒表达载体的共转染，所述逆转录病毒或慢病毒表达载体缺少其天然的包膜基因并且包含报告构建体(图23)。由于病毒核心蛋白在细胞内装配，因此它们通过从质膜中出芽而获得包膜，并且掺入存在于细胞表面上的HCV包膜糖蛋白以代替它们的天然包膜复合物。这些E1E2-假型颗粒(HCVpp)可进行单轮由E1E2介导的感染和复制，这可通过测量在感染的细胞内报告基因的活性来进行定量。在本研究过程中，将人免疫缺陷病毒(HIV-1)萤火虫萤光素酶载体，HIV-1 NL4-3.LUC.R-E-(He和Landau等人，1995)，用于产生用于感染Huh-7细胞的E1E2-假型病毒，如先前所描述的(Drummer等人，2003)。
将293T细胞以350000个细胞/孔接种在6-孔培养板(Nalge Nunc)中，并用1ug的NL4-3.LUC.R-E-和1ug的pE1E2H77c(野生型)、pΔHVRE1E2或空pCDNA4HisMax载体(阴性对照)进行共转染。在三天温育后，收集含有E1E2-假型HIV-1颗粒的组织培养液，并使用0.45um的无菌注射器式过滤器(Sartorius，Goettingen Germany)进行过滤。然后，以三次重复，将经过滤的产物用于感染以30000个细胞/孔接种在48-孔培养板(Nalge Nunc)中的Huh-7细胞。在37℃下温育4小时后，除去接种物(innoculum)，并在使用细胞培养物裂解试剂(Promega，Madison，WI，USA)进行裂解之前，将细胞于DMF10中进一步培养3天。除去细胞碎片以使细胞裂解物变得澄清，然后将其转染入白色96-孔平板(BMG Labtech，Offenburg，Germany)中以便使用Steady-Glo萤光素酶试剂系统(Promega)和装配有发光光学器件的Fluostar(BMGLabtech)来分析萤光素酶活性。从三次重复的感染中计算出平均萤光素酶活性(相对光单位)，并因而计算出的标准偏差。
放射性免疫沉淀法(RIP)
放射性标记
为了分析可变区在细胞内E1E2生物合成中的作用，用2ug的pE1E2(野生型)、含有一个或多个可变区缺失的pE1E2或空pCDNA4载体(阴性对照)来转染以500000个细胞/孔接种在6-孔培养板(Nalge Nunc)中的293T细胞。在转染后24小时，在缺乏L-半胱氨酸和L-甲硫氨酸的DMF10(DMEM(MP Biomedicals)、10％(v/v)热灭活的胎牛血清(Invitrogen)和2mM L-谷氨酰胺(GE Healthcare))中，使用150μCi反式-35S-标记/孔(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)于37℃对细胞进行脉冲追踪代谢性标记30分钟。然后，细胞在37℃下在DMF10中追踪4小时，随后在PBS中进行洗涤并在RIP裂解缓冲液(0.6M KCl、0.05M Tris pH 7.4、1mM EDTA、0.02％叠氮化钠、1％TritonX-100)中进行裂解。通过在经冷却的台式离心机(Heraeus，Hanau，Germany)中于4℃离心10分钟来除去任何剩余的细胞碎片以使细胞裂解物变得澄清。
为了富集掺入假型HIV-1颗粒中的成熟E1E2异二聚体，使用1ug的pNL4-3.LUC.R-E-加上1ug的pE1E2(野生型)、含有一个或多个可变区缺失的pE1E2或空pCDNA4载体(阴性对照)来转染以350000个细胞/孔接种在6-孔培养板中的293T细胞。在转染后24小时，在缺乏L-半胱氨酸和L-甲硫氨酸的DMF10中，使用75μCi反式-35S-标记/孔(Santa Cruz Biotechnology)于37℃对细胞进行谢性标记16小时。然后，收集组织培养液，并通过Minisart 0.2um注射器式过滤器(Sartorius)进行过滤，然后使用Beckman L-90超速离心机(SW41rotor，Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA)以25000xg在4℃下进行蔗糖梯度(在PBS中的25％蔗糖(v/v))离心2小时以富集病毒粒子。移出上清液，然后在RIP裂解缓冲液中裂解病毒粒子。
为了表征可变区在E2受体结合结构域(E2 RBD661myc)的背景中的作用，使用2ug的E2-myc(野生型)、含有一个或多个可变区缺失的E2-myc或空pCDNA3载体(阴性对照)来转染以350000个细胞/孔接种在6-孔培养板(Nalge Nunc)中的经代谢性标记的293T细胞。在转染后6小时，使用75μCi反式-35S-标记/孔(Santa Cruz Biotechnology)于37℃对细胞进行脉冲追踪代谢性标记1小时，并且在OptiMEM血清减少的培养基(Invitrogen)中追踪16小时以积累经分泌的蛋白质。然后，收集该组织培养液，并在RIP裂解缓冲液中进行裂解，随后通过于4℃以10,000xg离心来进行澄清。细胞单层也在PBS中进行洗涤，在RIP裂解缓冲液中进行裂解，并进行澄清，如上面所描述的。
免疫沉淀
将放射性免疫沉淀法用作用于分析蛋白质表达的构象敏感型策略。在4℃下，在相关抗体存在下，用偶联至BSA(Sigma)的Sepharose(GE Healthcare)对所有上述的蛋白质制备物进行预清除16小时。于8000xg进行10分钟来使BSA-Sepharose形成粒状沉淀，以除去任何非特异性的蛋白质种类。然后，在室温下使用在RIP裂解缓冲液中的30％(v/v)G蛋白质Sepharose(GE Healthcare)来使含有抗体-结合的蛋白质的上清液沉淀1小时，并如上所述通过离心来进行分离，随后在RIP洗涤缓冲液(0.5M NaCl、0.05M Tris pH 7.4、1mM EDTA、0.02％叠氮化钠和1％Triton-X 100)中洗涤3次和在PBS中洗涤一次。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白质分离和分析
将所有免疫沉淀物重悬浮在样品上样缓冲液(0.5M Tris pH 6.8、5％(v/v)SDS、10％(v/v)甘油、0.05％(w/v)溴酚蓝)中。在还原性条件(+3％(v/v)β-巯基乙醇)或非还原性条件(无β-巯基乙醇)下使细胞内裂解物进行走样，以在先前观察到的大量细胞内共价连接的E1E2聚集体内鉴定出非共价缔合的E1E2种类(Dubuisson等人，1994)。在非还原性条件下使在病毒裂解物中的经代谢性标记的掺入病毒粒子中的E1E2进行走样，而在还原性条件下使HIV-1结构蛋白进行走样。将所有样品在100℃下变性5分钟，然后使用Miniprotean IISDS-PAGE系统(BioRad)，依据预染色的宽范围蛋白质标准参照物(BioRad)，在10-15％SDS-PAGE聚丙烯酰胺梯度凝胶上进行分离(除了在7.5-15％梯度上进行分离的IgG14样品外)。在1×电极缓冲液(0.2MTris-HCl和2M甘氨酸)中，于100V，23mA进行电泳1.5小时。然后，将SDS-PAGE凝胶浸没在10％(v/v)乙酸和10％(v/v)甲醇中以固定样品，随后使用真空平板凝胶干燥器(Hoefer Scientific，San Francisco，CA，USA)于80℃进行干燥。使用35S-反式标记(Santa CruzBiotechnology)来标示所述宽范围标准参照物的位置，然后使用FLA-2000磷光成像仪和软件(Fuji Film，Tokyo，Japan)来进行蛋白质分析和定量。
固相CD81-LEL结合测定法
已证明，CD81的大细胞外环足以介导E2糖蛋白结合(Pileri等人，1998，Petracca等人，2000，Pileri等人，1998)，并且包含形成E2相互作用位点的所有残基和包含形成E2相互作用位点的所有残基(Drummer等人，2002)。因此，为了快速筛选可变区缺失突变体中的CD81-LEL结合能力，我们使用了固相结合测定法，所述固相结合测定法是使用由连接至CD81大细胞外环残基113-201的麦芽糖结合蛋白(MBP)组成的嵌合体(MBP-LEL)来构筑的，如先前所描述的(Drummer等人，2002)。
简而言之，用在PBS中的5ug/mL二聚体CD81 MBP-LEL来包被96-孔maxisorb酶联免疫吸附平板(Nalge Nunc)，并且在4℃下温育16小时。除去MBP-LEL，然后使用BSA10PBS(在PBS中的10mg/mL BSA(Sigma))于37℃封闭2小时以减少非特异性结合。然后，将平板在PBST(在PBS中的0.05％Tween-20(Sigma))中洗涤4次，随后以在BSA5PBST(在PBST中的5mg/mL BSA)中的12个2倍系列稀释添加所有蛋白质裂解物制剂。将平板在室温下温育2小时，再次洗涤，并用构象依赖性抗-E2单克隆抗体H53(在BSA5PBST中的1∶1000稀释物)来就结合的E2进行探测1小时。在PBST中进一步洗涤后，使用兔抗小鼠免疫球蛋白-辣根过氧化物酶缀合物(DAKO)(在BSA5PBS/Tween中的1∶1000稀释物)来检测抗体-结合的E2复合物，并按照厂商说明书，使用四甲基联苯胺底物(Sigma)来进行显色。在Fluostar(BMG technologies)上于450nm处读取所得的吸光度值(光密度)，并减去在620nm处的背景。然后，将该数据针对在前面的部分中通过构象依赖性抗体H53检测出的、经可视化的且经定量的单体E2进行标准化。
E2-myc-CD81细胞表面结合测定法
将CHO-K1细胞以1.25×105个细胞/孔接种在12-孔培养板中，并在24小时后用2μg pcDNA3-CD81进行转染。在转染后48小时，将经CD81转染的CHO-K1细胞在冰上冷却，并且与野生型或含有可变区缺失的E2-myc蛋白在BSA10PBS中的系列稀释物一起在冰上温育4小时。然后，将细胞在BSA10PBS中洗涤两次，随后与125I-MAb 9E10(106cpm)(其已在冰上用107个CHO-K1细胞预清除2小时)一起温育1小时。在用BSA10PBS再洗涤4次后，将细胞在PBS中的1％SDS之中进行裂解，并在Packard Auto-Gamma计数器中进行计数。
实施例2
1.使用一组从被HCV感染的个体获得的血清探测出的E2-myc和E2 Δ123-myc的抗原结构
将一组从被HCV感染的个体获得的血清用于通过免疫沉淀法来比较经生物合成性标记的E2-myc和E2Δ123-myc的总体抗原特性谱。如先前所描述的(Grollo等人，2006)，就针对H77c E1E2假型逆转录病毒颗粒的中和抗体的存在来筛选血清，观察到0至1,600的50％中和滴度(图24，下图)。E2-myc的抗体反应性模式(图24，上图)几乎与E2Δ123-myc的抗体反应性模式(图24，中图)相同，这表明这两种蛋白质的总的抗原结构是类似的。
2.E2-myc野生型和变体蛋白的CD81结合性质
检查了分泌的E2-myc蛋白与HCV细胞受体CD81的大细胞外环(LEL)相互作用的能力。在该测定中，在采用融合至CD81的大细胞外环(残基113-201；“CD81-LEL”)的固相麦芽糖结合蛋白的ELISA中，使用构象依赖性E2单克隆抗体(H53)来检测CD81-E2-myc结合。含有一个或多个可变区缺失的E2-myc蛋白展示出野生型水平的CD81-LEL结合，这再次表明E2的总体折叠并没有可检测地受到所述缺失的影响(图25A、B)。相反地，未观察到在包含LEL结合位点突变(L441M)的E2L441M-myc蛋白和CD81-LEL之间的结合，这证实了该结合测定法的特异性(图25A)。
3.E2-myc野生型和变体蛋白与在CHO-K1细胞中表达的全长CD81的相 互作用的能力
如先前所描述的(Drummer等人，2002)，使用用全长CD81表达载体转染的CHO-K1细胞，通过细胞表面结合测定法来测定E2-myc蛋白与全长CD81受体相互作用的能力。对分泌的E2-myc野生型和变体蛋白进行系列稀释，并与用CD81转染的CHO-K1细胞一起在冰上进行温育。在洗涤后，通过使用125I-标记的针对C-末端c-myc表位标签的单克隆抗体9E10来检测结合的E2-myc蛋白。通过包含L441M CD81结合位点突变的E2 L441M-myc不与用野生型CD81转染的CHO-K1细胞结合来证实该测定法的特异性(图26A)。
图26A和B中所显示的结果表明：E2-myc、E2Δ23-myc、E2Δ13-myc和E2Δ123-myc具有类似的CD81结合性质，然而HVR1+HVR2的缺失(E2Δ12-myc)引起相比于E2Δ23-myc的结合而言在CD81结合方面大约50％的减少(p＜0.035)。相反地，E2Δ13-myc(其展示出与E2-myc相同的结合曲线)和E2Δ123-myc的CD81结合能力没有显著差异(p＝0.62)，这表明当HVR1和HVR2不存在于E2Δ12-myc中时，igVR的存在削弱了CD81结合功能。尽管HVR1、HVR2和igVR不是E2 RBD661的核心折叠性质所必需的，但是这些数据指向igVR与HVR1和HVR2中之一或两者之间的功能性相互作用，从而正确地形成CD81结合位点或所述CD81结合位点变成对于受体是完全可接近的。
尽管在图25A和25B中对于经单一和多重缺失的E2-myc构建体没有检测到在与重组CD81-LEL结合方面的变化，但在图26A和26B中观察到在与表面表达的CD81结合方面的差异，这可能反映了当以分离形式和以天然四跨膜蛋白形式表达时，在LEL结构中的微妙差异。
4.材料和方法
中和测定法
如下测定免疫人血清和对照人血清中和单轮由HCV糖蛋白-假型HIV-1萤光素酶报告病毒引起的感染的能力。通过用pE1E2和pNL4.3LUCR-E-质粒共转染HEK-293T单层(350,000个细胞/6-孔培养板的孔)来制备HCV糖蛋白-假型HIV-1萤光素酶报告病毒(Drummer等人，2003)。于37℃在含有5％CO2的潮湿气氛中温育3天后，通过0.45μm无菌注射器式过滤器(Sartorius)来过滤培养物上清液。将热灭活的免疫和对照人血清的系列稀释物与HCV糖蛋白-假型HIV-1萤光素酶报告病毒一起预温育(1小时)，然后将添加至一式四份的在48-孔培养板中的Huh7细胞单层。在4小时的温育(37℃，5％CO2)后，用PBS洗涤细胞，并更换新鲜培养基。在额外的3天温育(37℃，于5％CO2中)后，裂解细胞，通过离心来澄清裂解物，然后在装配有发光光学器件的Fluostar(BMG)中就萤光素酶活性(Promega)来进行测定。将各个血清的中和滴度测定为相比于仅用培养基预温育的HCV糖蛋白-假型HIV-1萤光素酶报告病毒而言产生50％中和的血清稀释度。
放射性免疫沉淀法
使用Fugene 6(Roche)，用E2-myc表达载体来转染以500,000个细胞/孔接种在6-孔培养板中的293T细胞。在转染后24小时，在缺乏L-半胱氨酸和L-甲硫氨酸的DMF10(DMEM[MP Biomedicals]、10％(v/v)热灭活的胎牛血清[Invitrogen]和2mM L-谷氨酰胺[GE Healthcare])中，使用150μCi反式-35S-标记/孔(Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，CA，USA)对细胞进行标记。在收获细胞上清液后，将经标记的分泌的蛋白质调整至0.6M KCl、0.05M Tris pH 7.4、1mM EDTA、0.02％叠氮化钠、1％Triton X-100，并且在相关抗体存在下，用偶联至BSA(Sigma)的CNBr-活化的Sepharose(GE Healthcare)于4℃预清除16小时。然后，使用30％(v/v)G蛋白Sepharose(GE Healthcare)来免疫沉淀在经澄清的上清液中的抗体-抗原复合物，随后在RIP洗涤缓冲液(0.5M NaCl、0.05M Tris pH 7.4、1mM EDTA、0.02％叠氮化钠和1％Triton-X 100)中洗涤3次和在PBS中洗涤1次。使免疫沉淀出的蛋白质经历在非还原性条件下于10-15％聚丙烯酰胺梯度凝胶中的SDS-PAGE，并且通过在磷光成像仪中进行扫描来可视化。
E2-myc蛋白的瞬时表达
使用Fugene 6(Roche)，用E2-myc表达载体来转染HEK 293T细胞(350,000个细胞/6-孔培养板的孔)。在转染后8小时，用Optimem(Invitrogen)置换转染培养基，并将细胞于37℃在含有5％CO2的潮湿气氛中温育3天。通过0.45-μm-孔径大小的过滤器来澄清组织培养液，然后在Centricon YM30浓缩器(Amersham)中浓缩大约10倍。
重组CD81大细胞外环(CD81-LEL)结合性质
使用固相酶免疫测定法来检查E2-myc蛋白与HCV细胞受体CD81相互作用的能力。在4℃下用PBS中的5μg/ml融合至CD81的重组大细胞外环(残基113-201)的麦芽糖结合蛋白来包被酶免疫测定法平板(Nunc)过夜。除去包被溶液，在室温下用在PBS中的牛血清白蛋白(10mg/ml)(BSA10PBS)来封闭未被占据的位点1小时。用含有0.05％Tween 20的PBS(PBST)洗涤平板4次。将分泌的E 2-myc蛋白在50μl含有5mg/ml牛血清白蛋白的PBS(BSA5PBST)中进行系列稀释，并温育2小时。使用E2特异性单克隆抗体，随后使用偶联至辣根过氧化物酶的兔抗小鼠免疫球蛋白(Dako)来检测结合的E2-myc蛋白。平板用四甲基联苯胺盐酸盐底物来进行显色，并通过加入1M HCl来终止。在Fluostar平板阅读器(BMG technologies)中于450nm处测量吸光度值，并减去在620nm处的背景。
CD81结合性质
将CHO-K1细胞以1.25×105个细胞/孔接种在12-孔培养板中，并在24小时后用2μg pcDNA3-CD81进行转染。在转染后48小时，将经CD81转染的CHO-K1细胞在冰上冷却，并且与野生型E2-myc或含有可变区缺失的E2-myc蛋白在BSA10PBS中的系列稀释物一起在冰上温育4小时。然后，将细胞在BSA10PBS中洗涤两次，随后与125I-MAb 9E10(106cpm)(其已在冰上用107个CHO-K1细胞预清除2小时)一起温育1小时。在用BSA10PBS再洗涤4次后，将细胞在PBS中的1％SDS之中进行裂解，并在Packard Auto-Gamma计数器中进行计数。
实施例3
1.纯化的E2-his野生型和变体蛋白的SDS-PAGE分析
在还原性条件下通过SDS-PAGE来估计E2-his野生型和变体蛋白的纯度。图27显示了关于每种纯化的蛋白质种类的单个条带。每种种类的迁移与被删除的可变区的数目相一致。例如，缺少3个可变区的E2Δ123-his展示出最快的迁移。蛋白质条带的弥散性质与E2的糖基化相一致。
2.纯化的E2-his蛋白的蓝非变性PAGE
使用蓝非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(blue native polyacrylamidegel electrophoresis)来分析纯化的E2-his野生型和变体蛋白的寡聚化状态。图28显示了关于每种E2-his蛋白的两个主要条带，其在分子量方面相应于单体和二聚体。
3.E2-his蛋白的免疫检测
在Western印迹法中通过非构象依赖性E2特异性单克隆抗体(H52)来检测纯化的E2-his野生型和变体蛋白。对于每种E2-his蛋白变体，揭示出以所预期的分子量进行迁移的主要蛋白质种类(图29)。
4.E2-his野生型和变体蛋白的CD81结合性质
检查了纯化的E2-his蛋白与HCV细胞受体CD81的大细胞外环(LEL)相互作用的能力。在该测定中，在采用融合至CD81的大细胞外环(残基113-201；“CD81-LEL”)的固相麦芽糖结合蛋白的ELISA中，使用构象依赖性E2单克隆抗体(H53)来检测CD81-E2-his结合。含有一个或多个可变区缺失的E2-his蛋白展示出野生型水平的CD81-LEL结合，这表明E2的总体折叠并没有可检测地受到所述缺失的影响(图30A)。相反地，未观察到在E2-his蛋白和包含E2结合位点突变(F186S)的CDg1-LEL之间的结合，这证实了该结合测定法的特异性(图30B)。
5.在用E2-his蛋白变体进行2次免疫接种后获得的小鼠血清针对同源 E2-his抗原的免疫反应性
通过ELISA来检查在用E2-his野生型和变体蛋白进行2次免疫接种后获得的小鼠血清针对固相“同源抗原”(即用于对特定小鼠组进行免疫接种的抗原)的免疫反应性。在每一只经疫苗接种的动物中显示了相当大的针对同源固相抗原的抗体结合活性(图31)。相反地，在仅用佐剂进行疫苗接种的小鼠中，以及在来自各疫苗接种组的在免疫接种之前(预放血(prebleed))获得的两个代表性对照血清中，均没有检测到针对固相E2-his蛋白的抗体反应性(数据未显示)，这证实接受E2-his蛋白的动物引发了对于所述免疫原特异的抗体。
6.在用E2-his蛋白变体进行2次免疫接种后获得的小鼠血清针对 E2-his和E2Δ123-his抗原的免疫反应性
在ELISA中，将在来自各疫苗接种组的免疫血清中的抗体与固相E2-his(包含所述3个可变区)结合的能力与针对固相E2Δ123-his(缺少所述3个可变区)的抗体反应性相比较。对于所有免疫接种组(除了仅使用佐剂的组之外；数据未显示)，都观察到相当大的针对固相E2-his(图32A)和E2Δ123-his(图32B)的结合滴度。
进行对于各个不同免疫接种组而获得的抗体结合滴度的成对统计学分析，以确定在结合滴度方面的表观差异(apparent difference)是否显著。表7表明，对于E2-his免疫接种组而计算出的针对固相E2-his的抗体滴度与其他免疫接种组没有显著差异(p＞0.06)。然而，在E2Δ1-his免疫接种组与E2Δ13-his、E2Δ23-his和E2Δ123-his之间观察到针对固相E 2-h i s的抗体反应性的统计学上显著的差异(p≤0.04)。
各个不同免疫接种组的针对固相E2Δ123-his的抗体结合滴度的成对统计学分析揭示出，与E2-his免疫接种组相比较，E2Δ123-his免疫接种组的抗体反应性高度显著地增加(p＝0.003，表8)。观察到E2Δ1-his、E2Δ3-his和E2Δ12-his免疫接种组对于E2-his而言的抗体反应性的统计学上显著的增加，还观察到E2Δ1-his相对于E2Δ2-his免疫接种组而言的抗体反应性的统计学上显著的增加(p≤0.04)。
7.在用E2-his蛋白变体进行3次免疫接种后获得的小鼠血清针对同源 E2-his抗原的免疫反应性
通过ELISA来检查在用E2-his野生型和变体蛋白进行3次免疫接种后获得的小鼠血清针对固相“同源抗原”(即用于对特定小鼠组进行免疫接种的抗原)的免疫反应性。在每一只经疫苗接种的动物中显示了相当大的针对同源固相抗原的抗体结合活性(图33)，但在来自各疫苗接种组的在免疫接种之前(预放血)获得的两个代表性对照血清中没有显示出针对同源固相抗原的抗体结合活性(数据未显示)。此外，在仅用佐剂进行疫苗接种的小鼠中没有检测到针对固相E2-his蛋白的抗体反应性(数据未显示)，这证实接受E2-his蛋白的动物引发了对于所述免疫原特异的抗体。
8.在用E2-his蛋白变体进行3次免疫接种后获得的小鼠血清针对 E2-his和E2Δ123-his抗原的免疫反应性
在ELISA中，将在来自各疫苗接种组的免疫血清中的抗体与固相E2-his(包含所述3个可变区)结合的能力与针对固相E2Δ123-his(缺少所述3个可变区)的抗体反应性相比较。对于所有免疫接种组(除了仅使用佐剂的组之外，数据未显示)，都观察到相当大的针对固相E2-his(图34A)和E2Δ123-his(图34B)的结合滴度。
进行对于各个不同免疫接种组而获得的抗体结合滴度的成对统计学比较，以确定在结合滴度方面的表观差异是否显著。与在第二次免疫接种后获得的数据相反，表9表明，对于E2-his免疫接种组而计算出的针对固相E2-his的抗体滴度显著高于7个其他免疫接种组中的6个(p＝0.003至0.04)，除了E2Δ123-his外(p＝0.11)。
各个不同免疫接种组的针对固相E2Δ123-his的抗体结合滴度的成对统计学分析揭示出，与E2-his免疫接种组相比较，E2Δ123-his免疫接种组的抗体反应性高度显著地增加(p＝0.0007，表10)。还观察到E2-his与E2Δ3-his、E2Δ12-his和E2Δ23-his免疫接种组之间的统计学上显著的差异，并且还观察到E2Δ1-his与E2Δ3-his、E2Δ12-his、E2Δ23-his和E2Δ123-his免疫接种组之间的统计学上显著的差异(p＝0.009至0.022)。
最后，将对于各免疫接种组而获得的针对固相野生型E2-his抗原(即，包含HVR1、HVR2和IgVR)的平均结合滴度与针对固相E2Δ123-his抗原(即，缺少HVR1、HVR2和igVR并且表现出保守的糖蛋白核心)的结合滴度相比较。进行该分析以精确测定所述免疫原引发与E2RBD的保守核心具有反应性的抗体的相对能力。表11显示了，对于由E2-his免疫原(～4.4倍的减少；p＝0.0009)和E2Δ1-his免疫原(～2倍的减少；p＝0.005)所引发的抗血清，针对固相E2Δ123-his抗原的抗体滴度比针对固相E2-his抗原的抗体滴度显著更低。
9.在用E2-his蛋白变体进行3次免疫接种后获得的小鼠血清针对固相 Con1 E2 RBD -his和JFH1 E2 RBD -myc抗原的免疫反应性
通过在ELISA中将免疫血清与固相Con1 E2RBD-his(基因型1b)和JFH1 E2RBD-myc(基因型2a)抗原的免疫反应性相比较，来测定来源于基因型1a H77c分离株的E2-his野生型和变体蛋白引发跨基因型(cross-genotype)反应性抗体的能力。对于所有免疫接种组(除了仅使用佐剂的组之外，数据未显示)，都观察到相当大的针对固相Con1E2RBD-his(图35A)和JFH1 E2RBD-myc(图35B)的结合滴度。
各个不同免疫接种组的针对固相Con1 E2RBD-his的抗体结合滴度的成对统计学分析揭示出，与E2-his免疫接种组相比较，E2Δ2-his、E2Δ3-his、E2Δ12-his和E2Δ123-his免疫接种组具有显著更高的结合滴度(p＜0.05，表12)。在E2Δ123-his免疫接种组中所引发的Con1 E2RBD-his-结合滴度也显著高于由E2Δ1-his和E2Δ23-his所引发的Con1 E2RBD-his-结合滴度(p＜0.05)。
相反地，各个不同免疫接种组的针对固相JFH1 E2RBD-myc的抗体结合滴度的类似的成对统计学分析揭示出在组之间不存在显著不同的结合滴度(表13)。尽管缺乏显著性，但上面所观察到的趋势在这些分析中也是明显的。
10.中和
测定了免疫小鼠血清和对照小鼠血清中和单轮由同源H77c株系E1E2-假型HIV-1萤光素酶报告病毒引起的感染的能力。将热灭活的免疫小鼠血清和对照小鼠血清的系列5倍稀释物与E1E2-假型HIV-1萤光素酶报告病毒一起预温育(1小时)，然后与Huh7细胞单层一起温育4小时。用PBS洗涤细胞，加入新鲜的培养基，并且在额外的3天温育(37℃，于5％CO2中)后，裂解细胞并就萤光素酶活性来对其进行分析测定。图36显示各个血清的80％中和滴度，其被测定为相比于仅用培养基预温育的HCV糖蛋白-假型HIV-1萤光素酶报告病毒而言产生80％中和的血清稀释度。至少80％的用E2-his、E2Δ123-his和E2Δ23-his进行免疫接种的小鼠产生针对E1E2-HIV-1假型的中和抗体，其平均80％中和滴度分别为908、413和140。相反地，至少80％的用E2Δ1-his或仅佐剂进行免疫接种的小鼠缺乏80％-中和活性，其平均80％中和滴度分别为7和26(表14)。
11.讨论
包含所述3个可变区中的一个或多个缺失的E2-his蛋白能够引发对于同源抗原具有反应性的抗体。通过将免疫血清与包含3个可变区的完整野生型E2-his蛋白反应的能力和与E2Δ123-his蛋白(其代表了缺少所有3个可变区但保持了CD81结合的核心E2折叠单元)反应的能力相比较来检查该抗体应答的特异性。该分析揭示，用E2-his蛋白或缺少HVR1的E2(E2Δ1-his)进行免疫接种的小鼠引发显著更少的与E2的核心结构域具有反应性的抗体。相反地，在用缺少HVR1和2的E2-his蛋白(E2Δ12-his)、缺少HVR1和igVR的E2-his蛋白(E2Δ13-His)、缺少HVR2和igVR的E2-his蛋白(E2Δ23-his)或缺少所有三个可变区的E2-his蛋白(E2Δ123-his)进行免疫接种的小鼠中所引发的抗体类似地与野生型E2-his和E2Δ123-his抗原进行反应。这暗示，HVR2和igVR可能阻碍抗体接近存在于E2的处于下面的保守核心结构域中的表位。为了检测这种假设，合成了代表来自基因型1b(Con1)和基因型2a(JF-H1)的异源HCV分离株的E2RBD构建体。在第3次疫苗接种后获得的小鼠血清对于这些异源E2RBD构建体的免疫反应性揭示出，用E2Δ123-his、E2Δ12-his、E2Δ3-his、E2Δ2-his进行免疫接种的小鼠引发了显著更高水平的针对存在于基因型1b分离株Con1中的表位的交叉反应性抗体。尽管也引发了针对基因型2a分离株JF-H1的E2RBD的交叉反应性抗体，但免疫原组之间的结合滴度的差异在统计学上是不显著的，虽然观察到与上述相类似的趋势。这些数据暗示，至少一个可变区(优选HVR2和/或igVR)的缺失可提高E2-his蛋白引发具有更广泛中和能力的交叉反应性抗体的能力。
使用HCV E1E2假型逆转录病毒颗粒来检查免疫血清中和同源病毒的能力。数据显示，用E2Δ123-his或E2Δ23-his进行疫苗接种的小鼠具有相比于仅缺少HVR1的E2-His而言平均为其～59和20倍的中和抗体滴度(分别地，p＝0.11和0.002)。先前已显示，HVR1为E1E2糖蛋白复合物的免疫显性区域。仅缺失HVR1区域可能导致重要的类型特异性免疫显性表位的去除。然而，在缺失了HVR1的构建体中HVR2和/或igVR区域的存在可掩蔽处于下面的隐藏的中和表位。因此，由野生型E2-his蛋白所引发的抗体应答可能主要针对HVR1区域而不是保守的核心。这一点部分地反映在下列方面：(i)较低水平的与E2核心结构域具有反应性的抗体(图34B)，和(ii)较低水平的交叉反应性抗体(图35A)。
这些数据综合在一起暗示，HVR2和/或igVR区域的缺失对于不缺少任何可变区的或仅缺少HVR1的E2 RBD构建体的使用是显著的提高。缺少至少HVR2和/或igVR以及可能所有3个可变区的E2 RBD蛋白将可能引发能够交叉中和基因型内的不同HCV株系的抗体以及引发跨基因型中和。缺少一个或多个可变区的E2 RBD蛋白对于用于预防或治疗HCV感染的治疗性或预防性疫苗接种策略而言可以是有用的工具。此外，这些缺失了可变区的E2 RBD构建体还可用于引发中和HCV的针对保守E2核心区域的抗体的新型特异性，以用于治疗性和预防性用途。
12.材料和方法
野生型和变体HCV E2-his cDNA的构建以及所编码的蛋白质在哺乳动物 细胞中的分泌表达
编码HCV E2-his变体的cDNA表达质粒的产生
由Geneart AG(Regensburg，Germany)构建编码野生型E2蛋白片段(残基384-661；株系H77c)的合成基因。以符合读框的方式将人胰蛋白酶原信号肽(MNPLLILTFVAAALA)附加至野生型E2成熟蛋白的N-末端，以帮助成熟多肽分泌至表达培养基中。正好在N-末端之前处引入Kozak序列以增加翻译起始，并且以符合读框的方式添加(His)6序列以使得能够随后通过固定化金属亲和层析来纯化分泌的蛋白质。在C-末端处的His-标签之后添加两个终止密码子以确保有效的翻译终止。该构建体称为E2-his。调整E2-his cDNA的密码子使用以适应于智人(Homo sapiens)基因的密码子偏倚性。在cDNA的5′末端引入Nhe I限制位点和在3′末端引入Xho I限制位点，以便将Geneart cDNA连接入经Nhe I-Xho I消化的pcDNA 3.1(Invitrogen)中。
按照厂商说明书使用Accuprime PfxDNA聚合酶(Invitrogen)以及使用表15中所显示的引物，采用标准PCR诱变程序来构建编码E2-his成熟蛋白的7个变体(其中所述可变区中的一个或多个被连接体序列取代)的cDNA。用于构建E2-his的cDNA的引物的组合显示在表16中。
具体的PCR参数如下：在95℃下变性2分钟，然后进行18个循环(95℃15秒，64℃30秒，和68℃2分钟)，最后在68℃下温育2分钟。
将Geneart野生型E2-his cDNA用作用于所有E2-his变体cDNA的PCR模板。采用多个片段的连续重叠PCR来构建每种缺失变体。一旦每种cDNA完成，就用Nhe I和Xho I对其进行消化，并将其连接入pcDNA3.1中。使用Qiagen Maxi试剂盒来进行质粒DNA的大规模制备。所有质粒构建体的核苷酸序列通过使用Big Dye Terminator v3.1 CycleSequencing和Applied Biosystems自动测序仪测定两条链的序列来进行验证。
成熟的野生型和变体E2蛋白的序列如下：
E2-his成熟蛋白
ETHVTGGNAGRTTAGLVGLLTPGAKQNIQLINTNGSWHINSTALNCNESLNTGWLAGLFYQHKFNSSGCPERLASCRRLTDFAQGWGPISYANGSGLDERPYCWHYPPRPCGIVPAKSVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRSGAPTYSWGANDTDVFVLNNTRPPLGNWFGCTWMNSTGFTKVCGAPPCVIGGVGNNTLLCPTDCFRKHPEATYSRCGSGPWITPRCMVDYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGVEHRLEAACNWTRGERCDLEDRDRSE
E2Δ1-his成熟蛋白
ETHQNIQLINTNGSWHINSTALNCNESLNTGWLAGLFYQHKFNSSGCPERLASCRRLTDFAQGWGPISYANGSGLDERPYCWHYPPRPCGIVPAKSVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRSGAPTYSWGANDTDVFVLNNTRPPLGNWFGCTWMNSTGFTKVCGAPPCVIGGVGNNTLLCPTDCFRKHPEATYSRCGSGPWITPRCMVDYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGVEHRLEAACNWTRGERCDLEDRDRSE
E2Δ2-his成熟蛋白
ETHVTGGNAGRTTAGLVGLLTPGAKQNIQLINTNGSWHINSTALNCNESLNTGWLAGLFYQHKFNSSGCPERLASCGSSGCWHYPPRPCGIVPAKSVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRSGAPTYSWGANDTDVFVLNNTRPPLGNWFGCTWMNSTGFTKVCGAPPCVIGGVGNNTLLCPTDCFRKHPEATYSRCGSGPWITPRCMVDYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGVEHRLEAACNWTRGERCDLEDRDRSE
E2Δ3-his成熟蛋白
ETHVTGGNAGRTTAGLVGLLTPGAKQNIQLINTNGSWHINSTALNCNESLNTGWLAGLFYQHKFNSSGCPERLASCRRLTDFAQGWGPISYANGSGLDERPYCWHYPPRPCGIVPAKSVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRSGAPTYSWGANDTDVFVLNNTRPPLGNWFGCTWMNSTGFTKVCGAPPCGSSGCPTDCFRKHPEATYSRCGSGPWITPRCMVDYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGVEHRLEAACNWTRGERCDLEDRDRSE
E2Δ12-his成熟蛋白
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E2Δ13-his成熟蛋白
ETHQNIQLINTNGSWHINSTALNCNESLNTGWLAGLFYQHKFNSSGCPERLASCRRLTDFAQGWGPISYANGSGLDERPYCWHYPPRPCGIVPAKSVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRSGAPTYSWGANDTDVFVLNNTRPPLGNWFGCTWMNSTGFTKVCGAPPCGSSGCPTDCFRKHPEATYSRCGSGPWITPRCMVDYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGVEHRLEAACNWTRGERCDLEDRDRSE
E2Δ23-his成熟蛋白
ETHVTGGNAGRTTAGLVGLLTPGAKQNIQLINTNGSWHINSTALNCNESLNTGWLAGLFYQHKFNSSGCPERLASCGSSGCWHYPPRPCGIVPAKSVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRSGAPTYSWGANDTDVFVLNNTRPPLGNWFGCTWMNSTGFTKVCGAPPCGSSGCPTDCFRKHPEATYSRCGSGPWITPRCMVDYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGVEHRLEAACNWTRGERCDLEDRDRSE
E2Δ123-his成熟蛋白
ETHQNIQLINTNGSWHINSTALNCNESLNTGWLAGLFYQHKFNSSGCPERLASCGSSGCWHYPPRPCGIVPAKSVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRSGAPTYSWGANDTDVFVLNNTRPPLGNWFGCTWMNSTGFTKVCGAPPCGSSGCPTDCFRKHPEATYSRCGSGPWITPRCMVDYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGVEHRLEAACNWTRGERCDLEDRDRSE
细胞培养
在补充有青霉素/链霉素/两性霉素B(Invitrogen)的FreeStyleTM表达培养基(Invitrogen)中培养FreeStyleTM293-F细胞(Invitrogen)。于37℃在具有8％CO2气氛的潮湿培养箱中维持所有细胞。
瞬时蛋白质表达
通过按照厂商说明书用基于pcDNA3.1的表达质粒和293fectin转染试剂(Invitrogen)进行转染，而在FreeStyleTM293-F细胞中进行每种E2-his蛋白的瞬时表达。以1×106个活细胞/ml的终浓度转染总体积为180ml的细胞，并在37℃的具有8％CO2气氛的潮湿培养箱中，在以150rpm旋转的轨道式摇动器(IKA)上，在无菌摇瓶(Corning)中温育5天。在转染后24小时，向细胞培养物补充以胰蛋白胨N1(Organotechnie，France)至0.5％v/v的终浓度。通常，在转染后5天收获细胞培养物。通过下列方式来检查蛋白质表达：使用4-20％Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶对细胞培养物上清液的样品进行电泳，并通过用考马斯蓝试剂染色来使蛋白质可视化。关于蛋白质的纯化，通过以2500rpm进行离心来收集细胞培养物上清液，然后在进行层析之前使其通过0.45μM过滤器(Nalgene)。
所表达的野生型和变体HCV E2-his蛋白的纯化
在过滤后，将细胞培养物上清液经历使用镍Sepharose的固定化金属亲和层析(IMAC)，以纯化野生型和变体E2-his蛋白。
纯化程序描述如下：
1.缓冲液：
Ni-MAC缓冲液A
50mM NaH2PO4 pH 8.0
300mM NaCl
10mM咪唑
Ni-MAC缓冲液B(洗脱)
50mM NaH2PO4 pH 8.0
300mM NaCl
500mM咪唑
2.方案：
1.在4-8℃下进行工序2至6
2.用5倍体积的ddH2O洗涤在10ml Poly-Prep柱(Bio-Rad)中的1ml Ni Sepharose 6 Fast Flow树脂(GE Healthcare)。
3.用10ml Ni-MAC缓冲液A平衡所述柱。
4.将样品加载到所述柱上，并且收集漏出液(break-through)(B/T)。
5.用10ml Ni-MAC缓冲液A洗涤所述柱。
6.用5ml Ni-MAC缓冲液B(洗脱)洗脱蛋白质并收集1ml的级分。
7.使用96-孔平板形式的Bradford测定法和用考马斯染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶来鉴定峰级分。
8.汇集峰级分，并于4℃在1X PBS中透析过夜。
9.在透析后，使用96-孔平板形式的Bradfor测定法和用于标准曲线的1mg/ml BSA来测定蛋白质浓度。
Con1 E2 RBD -his和JFH1 E2 RBD -myc cDNA的构建以及所编码的蛋白质在哺 乳动物细胞中的分泌表达
编码Con1 E2 RBD -his和JFH1 E2 RBD -myc的cDNA表达载体的产生
使用Expand-Hifi聚合酶(Roche)和表17中所示的引物通过PCR来制备编码Con1 E2(HCV Con1多蛋白残基384至661；Genbank登录号AJ238799)和JFH1 E2(HCV JFH1多蛋白残基384至665；Genbank登录号AB047369)的cDNA。正向引物编码用于以符合读框的方式掺入在cDNA的5′末端处的NheI限制位点。反向引物编码用于以符合读框的方式分别添加至Con1和JFH1 cDNA的3′末端处的(His)6和c-myc表位，并且对于这两种情况，后面均跟随有TAG翻译终止密码子和XbaI限制位点。具体的PCR参数如下：在95℃下变性5分钟，然后进行30个循环(92℃ 1分钟，55℃ 1分钟，和72℃ 2分钟)，最后在72℃下温育10分钟。将cDNA克隆至载体pcDNA3中的组织纤溶酶原激活物信号肽的下游，以促进所表达的蛋白质的分泌。所克隆的cDNA的核苷酸序列通过使用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing和Applied Biosystems自动测序仪来验证。
Con1 E2 RBD -his和JFH1 E2 RBD -myc的瞬时表达
使用Fugene 6(Roche)，用Con1 E2RBD-his和JFH1 E2RBD-myc表达载体来转染HEK 293T细胞(350,000个细胞/6-孔培养板的孔)。在转染后8小时，用Optimem(Invitrogen)置换转染培养基，并将细胞于37℃在含有5％CO2的潮湿气氛中温育3天。通过以1500rpm离心10分钟并随后经过0.45-μm-孔径大小的注射器式过滤器进行过滤，来澄清组织培养液。
野生型和变体E2-his蛋白的生物化学和功能分析
蓝非变性PAGE
使用蓝非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN-PAGE)来分析经纯化的E2-his蛋白的寡聚化状态。将10μg每种蛋白质加入至10μl增溶缓冲液(solubilization buffer)和1.5μl样品缓冲液中，并加载到含有4％堆积胶的5-15％梯度分离胶上。在4℃下以100伏对所述凝胶进行电泳直至染料前沿进入堆积胶。然后，将电压增加至200伏直至染料前沿迁移至凝胶的底部。在上层储槽(upperreservoir)中使用含有0.01％Serva G的1×阴极缓冲液进行电泳1.5小时，随后在无Serva G的1×阴极缓冲液中电泳1-1.5小时。下层储槽(lower reservoir)装有1×阳极缓冲液。在电泳后，使凝胶脱色过夜，并在Odyssey扫描仪中于680nm处进行扫描。
用于BN-PAGE的溶液如下：
聚丙烯酰胺凝胶：
  4％堆积胶   5％分离胶   15％分离胶
  40％丙烯酰胺   0.299ml   0.262ml   0.787ml
  3×凝胶缓冲液   1ml   0.7m l   0.7ml
  75％甘油   0.14ml   0.62m l
  水   1.72ml   0.978ml   0
  TEMED   6μl   2μl   2μl
  5％过硫酸铵   32μl   11μl   11μl
其他溶液：
3×凝胶缓冲液。150mM BisTris-HCl，5M 6-氨基己酸，pH 7.0
10×阴极缓冲液。0.5M Tricine，150mM Bis Tris
5×阳极缓冲液。0.25M BisTris-HCl，DH 7.0
2×BisTris ACA。200mM BisTris-HCl，1M 6-氨基-己酸，pH 7.0
样品缓冲液。50mg ServaG，500μl 2×BisTrisACA，400μl 75％蔗糖和100μl水
增溶缓冲液。0.5M 6-氨基-己酸，20mM BisTris，2mM EDTA，pH7.0，1％Triton X-100，10％甘油
脱色液。10％乙酸，10％甲醇，80％水
E2-his蛋白的免疫检测
将纯化的E2-his蛋白的样品经历还原性SDS-PAGE，然后电泳转移至硝酸纤维素膜。使用非构象依赖性E2特异性单克隆抗体，随后使用偶联至Alexa fluor 680nm的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Invitrogen)来检测E2-his蛋白。在Odyssey检测系统中扫描免疫印迹。
CD81结合性质
使用固相酶免疫测定法来检查E2-his蛋白与HCV细胞受体CD81相互作用的能力。在4℃下用PBS中的5μg/ml融合至CD81的重组大细胞外环(残基113-201)的麦芽糖结合蛋白来包被酶免疫测定法平板(NuncMaxisorb)过夜。除去包被溶液，在室温下用在PBS中的牛血清白蛋白(10mg/ml)(BSA10PBS)来封闭未被占据的位点1小时。用含有0.05％Tween 20的PBS(PBST)洗涤平板4次。将50ng E2-his蛋白在50μl含有5mg/ml牛血清白蛋白的PBS(BSA5PBST)中进行系列稀释，并温育2小时。使用E2特异性单克隆抗体，随后使用偶联至辣根过氧化物酶的兔抗小鼠免疫球蛋白(Dako)来检测结合的E2-his蛋白。平板用四甲基联苯胺盐酸盐底物来进行显色，并通过加入1M HCl来终止。在Fluostar平板阅读器(BMG technologies)中于450nm处测量吸光度值，并减去在620nm处的背景。
野生型和变体E2-his蛋白在小鼠中的免疫原性
免疫接种方案
使用与ISCOMATRIX佐剂(Pearse和Drane，2005)一起进行配制的纯化的E2-his野生型和变体蛋白来免疫接种7-8周龄的雌性Balb/c小鼠，每组10只小鼠(表18)。每一小鼠剂量在0.1ml体积中含有10μg特定蛋白质和5μg ISCOMATRIX佐剂。以三周的间隔对小鼠进行皮下给药3次，并且在第一次给药前1天和在第二和第三次给药后1周进行采血。
酶联免疫吸附测定法(ELISA)
在ELISA中就抗-E2抗体的存在情况来检查免疫小鼠血清。使用雪花莲(GNA)凝集素在96孔Maxisorb微量滴定板(Nunc)上捕获E2-his、Con1 E2RBD-myc或JFH1 E2RBD-myc蛋白。在4℃下用PBS中的5μg/ml GNA凝集素来包被平板过夜。在室温下用100μl BSA10PBS来封闭未被占据的位点1小时。在用PBST洗涤平板4次后，将E2蛋白施加到50μlBSA5PBST中，并在室温下温育1小时。在用PBST洗涤平板4次后，将小鼠血清的系列稀释物施加到50μl体积的BSA5PBST中，并在室温下温育1小时。使用偶联至辣根过氧化物酶的兔抗小鼠免疫球蛋白来检测结合的免疫球蛋白，并且用四甲基联苯胺盐酸盐底物来进行显色，并通过加入1M HCl来终止。将Fluostar平板阅读器(BMG technologies)用于测量450nm处的吸光度和620nm处的背景。从所述吸光度中减去背景，从而产生结合曲线。
中和测定法
如下测定免疫小鼠血清和对照小鼠血清中和单轮由HCV糖蛋白-假型HIV-1萤光素酶报告病毒引起的感染的能力。通过用pE1E2和pNL4.3LUCR-E-质粒共转染HEK-293T单层(350,000个细胞/6-孔培养板的孔)来制备HCV糖蛋白-假型HIV-1萤光素酶报告病毒(Drummer等人，2003)。于37℃在含有5％CO2的潮湿气氛中温育3天后，通过0.45μm无菌注射器式过滤器(Sartorius)来过滤培养物上清液。将热灭活的免疫和对照小鼠血清的系列5倍稀释物与HCV糖蛋白-假型HIV-1萤光素酶报告病毒一起预温育(1小时)，然后将添加至一式四份的在48-孔培养板中的Huh7细胞单层。在4小时的温育(37℃，5％CO2)后，用PBS洗涤细胞，并更换培养基。在额外的3天温育(37℃，于5％CO2中)后，裂解细胞，通过离心来澄清裂解物，然后在装配有发光光学器件的Fluostar(BMG)中就萤光素酶活性(Promega)来进行测定。将各个血清的中和滴度测定为相比于仅用培养基预温育的HCV糖蛋白-假型HIV-1萤光素酶报告病毒而言产生80％中和的血清稀释度。
表7.在第2次疫苗接种后获得的与固相E2-his抗原具有反应性的抗体滴度的成对统计学比较。使用Student′s t检验来计算p值。
免疫原组
表8.在第2次疫苗接种后获得的与固相E2Δ123-his蛋白抗原具有反应性的抗体滴度的成对统计学比较。
使用Student′s t检验来计算p值。
免疫原组
表9.在第3次疫苗接种后获得的与固相E2-his蛋白抗原具有反应性的抗体滴度的成对统计学比较。
使用Student′s t检验来计算p值，其中假定不等方差。
免疫原组
表10.在第3次疫苗接种后获得的与固相E2Δ123-his蛋白抗原具有反应性的抗体滴度的成对统计学比较。
使用Student′s t检验来计算p值，其中假定不等方差。
免疫原
表11.在第3次疫苗接种后获得的针对E2-his抗原和E2Δ123-his抗原的相对抗体滴度的统计学比较。
使用Studen t′s t检验来计算p值，其中假定不等方差。
免疫原
表12.在第3次疫苗接种后获得的与固相Con1 E2RBD-his蛋白抗原具有反应性的抗体滴度的成对统计学比较。
使用Studen t′s t检验来计算p值，其中假定不等方差。
  E2-his   E2Δ1-his   E2Δ2-his   E2Δ3-his   E2Δ12-his   E2Δ13-his   E2Δ23-his   E2Δ123-his
  E2-his
  E2Δ1-his   0.526
  E2Δ2-his   0.0453   0.072
  E2Δ3-his   0.043   0.061   0.883
  E2Δ12-his   0.0123   0.091   0.926   0.797
  E2Δ13-his   0.185   0.343   0.847   0.756   0.888
  E2Δ23-his   0.173   0.568   0.284   0.238   0.217   0.534
  E2Δ123-his   0.0123   0.028   0.259   0.325   0.197   0.251   0.0499
表13.在第3次疫苗接种后获得的与固相JFH1 E2RBD-myc蛋白抗原具有反应性的抗体滴度的成对统计学比较。
使用Student′s t检验来计算p值，其中假定不等方差。
  E2-his   E2Δ1-his   E2Δ2-his   E2Δ3-his   E2Δ12-his   E2Δ13-his   E2Δ23-his   E2Δ123-his
  E2-his
  E2Δ1-his   0.609
  E2Δ2-his   0.148   0.511
  E2Δ3-his   0.159   0.253   0.371
  E2Δ12-his   0.305   0.549   0.861   0.48
  E2Δ13-his   0.392   0.624   0.916   0.484   0.970
  E2Δ23-his   0.123   0.287   0.492   0.652   0.705   0.702
  E2Δ123-his   0.058   0.084   0.117   0.406   0.154   0.156   0.209
表14.平均80％中和抗体滴度和统计学比较。
使用Studen t′s t检验来计算p值，其中假定不等方差。
免疫原组
表15.用于制备E2-his蛋白变体DNA序列的引物。
  引物名称 引物序列
  HCV-1 5′TATAGCTAGCGCCACCATGAACCCCCTGC 3′
  HCV-2 5′CTGGATGTTCTGGTGGGTCTCGGCCAG 3′
  HCV-3 5′GCCGAGACCCACCAGAACATCCAGCTG 3′
  HCV-4 5′CGCTGCTGCCGCAGGAGGCGAG 3′
  HCV-4a 5′GTAGTGCCAGCAGCCGCTGCTGCCGCAGGAGGCGAGCCTCTCGGG3′
  HCV-5 5′GGCAGCAGCGGCTGCTGGCACTAC 3
  HCV-5a 5′CTCGCCTCCTGCGGCAGCAGCGGCTGCTGGCACTACCCCCCCAGA3′
  HCV-6a 5′GTCGGTGGGGCAGCCGCTGCTGCCGCAGGGAGGGGCGCCACACAC3′
  HCV-7a 5′GCCCCTCCCTGCGGCAGCAGCGGCTGCCCCACCGACTGCTTTAGG3′
  HCV-8 5′TCTGCTCGAGTTATCAGTGGTGATGGTGGTGG 3′
  HCV-11 5′CTCTCGTTGCAGTTCAGGGCGGTGCTG 3′
  HCV-12 5′CAGCACCGCCCTGAACTGCAACGAGAG 3′
表16.用于制备E2-his蛋白变体DNA序列的引物组合。
  E2蛋白   引物组合
  E2Δ1-his   HCV-1 HCV-3   HCV-8
  E2Δ2-his   HCV-1 HCV-11  HCV-12  HCV-8
  E2Δ3-his   HCV-1 HCV-6a  HCV-7a  HCV-8
  E2Δ12-his   HCV-1 HCV-2   HCV-3   HCV-4   HCV-5
  E2Δ13-his   HCV-1 HCV-6a  HCV-7a  HCV-8
  E2Δ23-his   HCV-1 HCV-5a  HCV-4A  HCV-6A  HCV-7A  HCV-8
  E2Δ123-his   HCV-1 HCV-6a  HCV-7a  HCV-8
表18.使用与ISCOMATRIX佐剂抗原一起进行配制的E2-his野生型和变体蛋白来对小鼠进行免疫接种。
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Claims (11)

1.经修饰的丙型肝炎病毒(HCV)E2糖蛋白，其包含包括HVR1、HVR2和igVR可变区的HCV-E2受体结合结构域(RBD)，其中igVR可变区被删除。
2.权利要求1的经修饰的糖蛋白，其中HVR1可变区被删除。
3.权利要求1的经修饰的糖蛋白，其中HVR2可变区被删除。
4.权利要求2的经修饰的糖蛋白，其中HVR2可变区被删除。
5.权利要求1至4中任一项的经修饰的糖蛋白，其中所述糖蛋白与HCV受体CD81结合。
6.组合物，其包含权利要求1至5中任一项的经修饰的HCV E2糖蛋白和药学上可接受的载体或稀释剂。
7.权利要求6的组合物，其进一步包含佐剂。
8.权利要求1至5中任一项的经修饰的HCV E2糖蛋白在制备用于在患者中引发免疫应答的药物中的用途。
9.权利要求1至5中任一项的经修饰的HCV E2糖蛋白在制备用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染的药物中的用途。
10.用于在患者中引发免疫应答的试剂，所述试剂包含权利要求1至5中任一项的经修饰的HCV E2糖蛋白。
11.用于在患者中预防性或治疗性地治疗HCV感染的试剂，所述试剂包含权利要求1至5中任一项的经修饰的HCV E2糖蛋白。
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