PL195703B1

PL195703B1 - Zastosowanie polipeptydowego analogu peptydu pokrewnego hormonowi przytarczyc

Info

Publication number: PL195703B1
Application number: PL98339449A
Authority: PL
Inventors: Brian Henry Vickery
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1997-09-09
Filing date: 1998-09-02
Publication date: 2007-10-31
Also published as: ZA988030B; IL134719A; CN1269726A; KR100679778B1; RS49707B; HRP20000109A2; MA26545A1; HUP0004560A2; SA98190565B1; US6583114B2; KR20010023795A; HU226866B1; NO323740B1; AU9740698A; WO1999012561A3; AU752925B2; CZ2000862A3; DE69830591T2; ES2244090T3; WO1999012561A2

Abstract

1. Zastosowanie polipeptydowego analogu peptydu pokrewnego hormonowi przytarczyc (PTHrP) i jego soli, który to analog PTHrP stanowi N-koncowa skrócona postac o dlugosci 30-50 reszt aminokwasowych, przy czym reszty aminokwasowe 22-31 tego analogu PTHrP tworza amfipatyczna helise a, do wytwarzania leku do gojenia kosci i leczenia zlaman, a te amfipatyczna helise a stanowi Glu Leu Leu Glu Xaa Leu Leu Glu Lys Leu gdzie Xaa oznacza reszte aminokwasowa majaca ladunek dodatni. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydowego analogu peptydu pokrewnego hormonowi przytarczyc (PTHrP) i jego soli.

W Stanach Zjednoczonych Ameryki notuje się rocznie około 8-10 milionów złamań kości, z których ponad 1 milion wymaga hospitalizacji. Szacunkowe roczne koszty leczenia tych złamań przekraczają 20 miliardów dolarów. Chociaż ta wielkość już jest znacząca, oczekuje się, że jeszcze wzrośnie wskutek starzenia się populacji ogólnej. Pomimo tego, że wskazanych jest kilka terapii dla zapobiegania związanej z wiekiem utracie masy kostnej, mniej sposobów leczenia wskazanych jest po wystąpieniu złamania. Większość z nich wymaga miejscowego podawania leku, co jest niepożądane z powodu skomplikowanego podawania i niskiej podatności pacjentów. Dlatego też byłoby pożądane posiadanie dodatkowych sposobów ułatwiających gojenie kości i leczenie złamań.

Ostatnio doniesiono, że leczenie przerywane z zastosowaniem hormonu przytarczyc (PTH) poprawia gojenie złamań u szczurów z usuniętymi jajnikami, co wskazuje, że stosowanie PTH może być potencjalnie użyteczne w leczeniu pomenopauzalnych złamań na tle osteoporozy (H.W. Kim i in.; Transactions of the 43rd Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society, tom 22, sekcja 1, abstrakt 181-31, 9-13 lutego 1997; H.W. Kim i in.; Journal of Bone and Mineral Research, tom 11, suplement 1, strona S152, abstrakt P248 (sierpień 1996)). Inni badacze podali, że wszczepienie macierzy z aktywowanymi genami, z której zachodzi ekspresja białka morfogenetycznego kości 4 i/lub fragmentu PTH (aminokwasy 1-34) w szczurzym modelu złamania z odcinkowym ubytkiem, powoduje utworzenie nowej kości, która szybciej wypełnia przerwę w stosunku do nieleczonych zwierząt kontrolnych (Jianming Fang i in.; Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), tom 93: 5753-5758 (czerwiec 1996)). Donoszono również, że w leczeniu osteoporozy użyteczne są różne analogi PTH (opisy patentowe US nr 5556940 i 5559792). W innych sposobach leczenia złamań stosuje się ludzki czynnik płytkowy 4 (opis patentowy US nr 5622935), benzotiofeny (opis patentowy US nr 5502074) i 24,25(OH)2-witaminę D3 (opis patentowy US nr 5069905).

Peptyd pokrewny PTH (PTHrP), znany uprzednio jako czynnik odpowiedzialny za humoralną hiperkalcemię o charakterze nowotworowym, to peptyd o długości 138-174 aminokwasów (w zależności od alternatywnego wycinania/składania eksonów), który wiąże się z receptorem PTH/PTHrP. N-końcowa sekwencja PTHrP o długości 34 aminokwasów wykazuje ograniczoną homologię do sekwencji PTH, ale w niektórych przypadkach wykazuje aktywność podobną do PTH. Jednakże PTHrP ma ogólnie mniejszą siłę działania i w mniejszym stopniu niż PTH wpływa anabolicznie na kości, przy czym nie wiązano go z gojeniem złamań. Sekwencja hPTHrP (1-34) jest następująca:

Ala 1

Val

Ser

Glu

His 5

Gln

Leu

His

Asp 10

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile 15

Gln

Asp

Leu

Arg

Phe

Leu

His

Leu

Ile

Ala

Glu

20

25

30

Ile His Thr Ala (SEQ ID NO: 1)

Donoszono o kilku skróconych homologach i analogach PTHrP. Analogi, w których reszty aminokwasowe 22-31 PTHrP(1-34) zastąpiono amfipatyczną helisą a (opis patentowy US nr 5589452 i publikacja WO 97/07815) oraz pokrewne pochodne opisano jako użyteczne w leczeniu osteoporozy. (B.H. Vickery i in., J. Bone & Mineral Research, 11 (12): 1943-1951 (1996); D. Leaffer i in., Endocrinology, 136 (8): 3624-3631 (1995)). Wykazano, że monocykliczne i bicykliczne analogi PTHrP(1-34) i PTHrP(7-34) silnie wiążą się z receptorem PTH i stymulują stymulowaną przez PTH aktywność cyklazy adenylowej w komórkach osteoblastopodobnych (bądź działają antagonistycznie). (Michael Chorev i in., Biochemistry, 36: 3293-3299 (1997) i WO 96/40193).

Wynalazek dotyczy zastosowania polipeptydowego analogu peptydu pokrewnego hormonowi przytarczyc (PTHrP) i jego soli, który to analog PTHrP stanowi N-końcowa skrócona postać o długości 30-50 reszt aminokwasowych, przy czym reszty aminokwasowe 22-31 tego analogu PTHrP tworzą amfipatyczną helisę a, do wytwarzania leku do gojenia kości i leczenia złamań, a tę amfipatyczną helisę a stanowi Glu Leu Leu Glu Xaa Leu Leu Glu Lys Leu gdzie Xaa oznacza resztę aminokwasową mającą ładunek dodatni.

Korzystnie analog PTHrP podaje się donosowo.

Korzystnie ponadto miejscowo podaje się do miejsca złamania drugi czynnik powodujący gojenie kości.

W szczególnym przypadku złamanie znajduje się w kości wewnątrzbłonowej.

PL 195 703 B1

Korzystnie analog PTHrP podaje się ogólnoukładowo. Korzystnie Xaa oznacza lizynę lub histydynę. Szczególnie korzystnie analog PTHrP stanowi

Ala	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu	Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu	Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
Leu	His	Thr	Ala	nh₂	(SEQ	ID	NO: 3) lub
Ala	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu	Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu	Leu Leu Glu His	Leu	Leu	Glu	Lys
Leu	His	Thr	Ala	nh₂	(SEQ	ID	NO: 4) .

Korzystnie analog PTHrP ma co najmniej dwie reszty aminokwasowe połączone są ze sobą wiązaniem pomiędzy ich łańcuchami bocznymi.

W szczególności połączone reszty aminokwasowe znajdują się w pozycjach 13 i 17 lub w pozycjach 26 i 30.

Najkorzystniej resztę aminokwasową w pozycji 17 stanowi reszta kwasu asparaginowego. Szczególnie korzystnie analog PTHrP stanowi:

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly

I-1

Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu

Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Thr hSerlac (SEQ ID NO: 5) lub

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly

I-1

Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu

Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Thr Ala NH₂ (SEQ ID NO: 6).

Korzystnie analog PTHrP stanowi N-końcowa skrócona postać o długości 30-50 reszt aminokwasowych, ewentualnie podstawionych w pozycjach 5, 13, 17, 19, 26, 30, 32 i/lub 34.

Szczególnie korzystnie analog PTHrP stanowi:

Ala

Val

Ser

Glu

Ile

Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

Leu

His

Thr

Ala

nh₂

(SEQ

ID

NO:

7),

Ala

Val

Ser

Glu

Ile

Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

Gin

Asp

Leu

Ala

Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

Leu

His

Thr

Ala

nh₂

(SEQ

ID

NO:

8)r

Ala

Val

Ser

Glu

Ile

Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

Gin

Asp

Leu

Ala

Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

Leu

Pro

nh₂

(SEQ

ID

NO:

9),

PL 195 703 B1

Ala

Val

Ser

Glu His Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

Gin

Asp

Leu

Arg Arg Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

Leu

His

Thr

D-Orn laktam

(SEQ ID

NO:

10) ,

Ala

Val

Ser

Glu His Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

Gin

Asp

Leu

Arg Arg Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys.

Leu

His

Thr

hSer laktam

(SEQ

ID NO: 11) lub

Ala

Val

Ser

Glu His Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

Gin

Asp

Leu

Arg Arg Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

Leu

His

Thr

hSer Thr His

Ile

Gin

nh₂

(SEQ

ID

NO:

12) .

Gdy przykładowe postacie amfipatycznej helisy wstawia się do sekwencji PTHrP, szczególnie do N-końcowych skróconych postaci ludzkiego PTHrP (reszty od 1-32 do 1-38), otrzymywane polipeptydy są skuteczne w gojeniu kości i leczeniu złamań. Korzystnym sposobem podawania jest podawanie ogólnoukładowe.

Poniżej przedstawiono bardziej szczegółowy opis wynalazku.

Jedno- i trzyliterowe skróty różnych powszechnych zasad nukleotydów oraz aminokwasów są zgodne z zaleceniami w Pure Appl. Chem. 31: 639-645 (1972) i 40: 277-290 (1974). Skróty odpowiadają L-aminokwasom, o ile nie oznaczono ich inaczej jako D lub D,L. Niektóre aminokwasy, zarówno naturalne, jak i nienaturalne, są achiralne, np. glicyna. Wszystkie sekwencje peptydów przedstawiono z aminokwasem N-końcowym po lewej stronie, a aminokwasem C-końcowym po prawej.

Należy rozumieć, że w analogach PTHrP stosowanych zgodnie z wynalazkiem mogą występować zarówno aminokwasy naturalne, jak i nienaturalne. Do przykładów nienaturalnych aminokwasów i ich skrótów należą homoseryna (hSer), lakton homoseryny (hSerlac), homocysteina (Hcy), homoarginina (hArg), homocytrulina (Hci), penicyloamina (Pen), Na-metyloarginina (N-MeArg), norleucyna (Nle), norwalina (Nval), norizoleucyna (NIle), N-metyloizoleucyna (N-Melle), fenyloglicyna (PhG), t-butyloglicyna (Tle), hydroksyprolina (Hyp), 3,4-dehydroprolina (D-Pro), piroglutamina (Pyr,Glp), ornityna (Orn), kwas 1-aminoizomasłowy (1-Aib), kwas 2-aminoizomasłowy (2-Aib), kwas 2-aminomasłowy (2-Abu), kwas 4-aminomasłowy (4-Abu), kwas 2,4-diaminomasłowy (A2bu), kwas a-aminosuberowy (Asu), albizyna (Abz), b-cykloheksyloalanina (Cha), 3-(1-naftylo)alanina (1-Nal), 3-(2-naftylo)alanina (2-Nal), cytrulina (Cit), kwas pipekolinowy (Pip), 4-chlorofenyloalanina (4-ClPhe), 4-fluorofenyloalanina (4-FPhe), sarkozyna (Sar) i kwas 1-aminopropanokarboksylowy (1-NCPC). Zarówno naturalne, jak i nienaturalne aminokwasy są dostępne w handlu od takich sprzedawców jak NovaBiochem (San Diego, CA, USA) i Bachem (Torrance, CA, USA).

Polipeptydowe analogi PTHrP opisuje się w odniesieniu do różnicy w stosunku do sekwencji natywnego hPTHrP. Wyrażenie (MAP1-10) dotyczy określonej amfipatycznej sekwencji helikalnej, przedstawionej poniżej.

Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu (SEQ IDNO: 2) sekwencja MAP dziesięciu reszt aminokwasowych.

Tak więc sekwencja przedstawiona jako (MAP1-10)^22-31hPTHrP(1-34) oznacza N-końcowe reszty 1-34 hPTHrP, z odcinkiem pomiędzy resztami 22-31 zastąpionym sekwencją MAP. W sekwencji MAP można wskazać dodatkowe warianty. Tak więc (MAP1-10)^22-31His²⁶hPTHrP(1-34) oznacza N-końcowe reszty 1-34 hPTHrP, z odcinkiem pomiędzy resztami 22-31 zastąpionym sekwencją MAP, w której w pozycji 26 znajduje się histydyna (zamiast lizyny w typowej sekwencji MAP).

Podobnie określa się dodatkowe warianty sekwencji naturalnie występującej. (MAP1-10)^22-31Pro³²hPTHrP(1-32) oznacza N-końcowe reszty 1-32 hPTHrP z sekwencją MAP w pozycjach 22-31 i proliną (zastępującą naturalnie występującą histydynę) w pozycji 32. (MAP1-10)^22-31D-Orn³⁴laktamhPTHrP(1-34) oznacza N-końcowe reszty 1-34 hPTHrP z sekwencją MAP w pozycjach 22-31 i ornityną w pozycji 34, z laktamem utworzonym między grupą aminową łańcucha bocznego ornityny a końcem karboksylowym. (MAP1-10)^22-31hSer³⁴hPTHrP(1-34)Thr His Ile Gln NH2 oznacza N-końcowe reszty 1-34 hPTHrP z sekwencją MAP w pozycjach 22-31, homoseryną w pozycji 34, dodatkową sekwencją Thr His Ile Gln w pozycjach 35-38 i końcem karboksylowym będącym pierwszorzędowym amidem.

PL 195 703 B1

Polipeptydy z cyklicznymi wiązaniami pomiędzy resztami aminokwasowymi oznacza się umieszczając dwie połączone reszty w nawiasie, który poprzedza litera „c”. Zazwyczaj wiązania pomiędzy dwiema resztami są utworzone pomiędzy grupami funkcyjnymi łańcuchów bocznych, zwykle jako wiązania amidowe lub estrowe. Tak więc (MAP_1-10)^22-31c[Lys¹³,Asp¹⁷]hPTHrP(1-34)hSer³⁴lakton oznacza N-końcowe reszty 1-34 hPTHrP z odcinkiem pomiędzy resztami 22-31 zastąpionym sekwencją MAP, aminowym łańcuchem bocznym lizyny w pozycji 13 tworzącym ugrupowanie cykliczne z karboksylowym łańcuchem bocznym asparaginianu w pozycji 17 i dodatkową homoseryną w pozycji 34 i laktonem utworzonym pomiędzy hydroksylowym łańcuchem bocznym homoseryny, a końcem karboksylowym. Podobnie (MAP1-10)^22-31c[Lys¹³,Asp¹⁷]hPTHrP(1-34) oznacza N-końcowe reszty 1-34 hPTHrP z odcinkiem pomiędzy resztami 22-31 zastąpionym sekwencją MAP i aminowym łańcuchem bocznym lizyny w pozycji 13 tworzącym ugrupowanie cykliczne z karboksylowym łańcuchem bocznym asparaginianu w pozycji 17.

„Aminokwas hydrofilowy (Haa)” oznacza aminokwas zawierający oprócz grupy koniecznej do utworzenia wiązania peptydowego co najmniej jedną hydrofilową grupę funkcyjną, taki jak arginina, asparagina, kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, glutamina, histydyna, lizyna, seryna, treonina i ich homologi.

„Aminokwas lipofilowy (Laa)” oznacza nie mający ładunku aminokwas alifatyczny lub aromatyczny, taki jak izoleucyna, leucyna, metionina, fenyloalanina, tryptofan, tyrozyna, walina i ich homologi.

Dla celów tego wynalazku alaninę sklasyfikowano jako „amfifilową”, to jest zdolną do działania albo jako hydrofilową, albo jako lipofilowa.

„Polipeptydowy analog PTHrP” oznacza polipeptyd zawierający dopuszczalne w tej dziedzinie podstawienia, delecje lub insercje w stosunku do PTHrP, lub zasadniczo homologiczny do PTHrP, tak że analog ma podobną aktywność fizjologiczną.

„Fizjologicznie aktywny skrócony analog PTHrP” oznacza polipeptyd o sekwencji obejmującej niepełny zestaw aminokwasów występujących w PTHrP, który jednakże wywołuje podobną odpowiedź fizjologiczną. Skrócone analogi PTHrP nie muszą być w pełni homologiczne do PTHrP, aby wywoływać podobną odpowiedź fizjologiczną. Zazwyczaj skrócone analogi będą skrócone od strony końca C, a ich długość będzie pozostawać w zakresie od 30 do 40 reszt, przy czym PTHrP(1-32), PTHrP(1-34) i PTHrP(1-38) są korzystnymi, ale nie wyłącznymi przedstawicielami tej grupy. Na ogół analogi będą zawierać konserwatywne podstawienia aminokwasów, zgodne z opisanymi poniżej parametrami dopuszczalnymi w tej dziedzinie.

Określenie „zasadniczo homologiczny”, gdy odnosi się do polipeptydów, oznacza, że dany polipeptyd wykazuje co najmniej około 80% homologię, zazwyczaj około 90% homologię, a korzystnie 95% homologię do polipeptydu odniesienia. Homologię pomiędzy polipeptydami zazwyczaj określa się stosując oprogramowanie do analizy sekwencji. (Patrz np. Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705 USA).

„Amfipatyczna helisa a” odnosi się do struktury drugorzędowej wykazywanej przez niektóre polipeptydy, w których aminokwasy przybierają konfigurację a-helikalną, mającą strony polarną i niepolarną przeciwnie zorientowane wzdłuż długiej osi helisy. Fachowcy mogą projektować amfipatyczne sekwencje helikalne. Określone amfipatyczne sekwencje helikalne odpowiednie do stosowania zgodnie z wynalazkiem opisano bardziej szczegółowo np. w opisie patentowym US nr 5589452 lub publikacji WO 97/07815.

Wynalazek opiera się na stwierdzeniu, że pewne analogi PTHrP, zawierające amfipatyczną helisę a w pozycjach 22-31, są skuteczne w gojeniu kości i leczeniu złamań. Amfipatyczna helisa a składa się z aminokwasów hydrofilowych (Haa) i lipofilowych (Laa) ułożonych w sekwencji:

Haa (Laa Laa Haa Laa)2 Laa

Gdy przykładowe postacie tej amfipatycznej helisy wstawia się do sekwencji PTHrP, szczególnie do N-końcowych skróconych postaci ludzkiego PTHrP (reszty od 1-32 do 1-38), otrzymywane polipeptydy są skuteczne w gojeniu kości i leczeniu złamań. W przeciwieństwie do PTH, PTHrP lub jego analogów nie zawierających tego amfipatycznego odcinka helikalnego, analogi stosowane zgodnie z wynalazkiem nie powodują hiperkalcemii. Ponadto analogi te powodują szybszy przyrost kości w porównaniu z PTH lub PTHrP.

Należy rozumieć, że poza włączeniem amfipatycznej helisy pomiędzy pozycjami 22 a 31, w sekwencji PTHrP można dokonywać różnych podstawień, delecji i insercji aminokwasów poza tym regionem, wciąż zachowując przestrzenną strukturę polipeptydu. Reprezentatywne zmiany sekwencji

PL 195 703 B1

PTH i PTHrP z zachowaną aktywnością fizjologiczną otrzymywanych analogów ujawniono w opisach patentowych US nr 5599792, 5556940, 5607915 i 5589452 oraz publikacjach WO 91/06564, 94/02510, 95/11697, 96/40193 i 97/07815. Dodatkowe warianty, które zgodnie z oczekiwaniami fachowców będą zachowywać aktywność fizjologiczną, można tworzyć postępując zgodnie z przyjętymi w tej dziedzinie technikami modelowania struktury białek. Reprezentatywne sposoby otrzymywania takich wariantów opisali między innymi I. Ladunga i R.F. Smith, Protein Eng., 3: 187-196 (1997) oraz M.J. Thompson i R.A. Goldstein, Proteins, 1: 28-37 (1996).

Wariantami podstawionymi są te, w których z natywnej sekwencji usuwa się co najmniej jeden aminokwas i na jego miejsce w tej samej pozycji wstawia się inny aminokwas. Podstawienia mogą być pojedyncze gdy zastępuje się tylko jeden aminokwas, albo wielokrotne gdy w tej samej cząsteczce zastępuje się dwa lub większą liczbę aminokwasów. Ogólnie oczekuje się, że możliwe będą wszystkie podstawienia konserwatywne. Tak więc oczekuje się, że analog odpowiadający podstawieniu jednego aminokwasu hydrofilowego innym aminokwasem hydrofilowym, bądź aminokwasu hydrofobowego innym aminokwasem hydrofobowym, zachowa podobne właściwości gojenia złamań, jak jego prekursor. Podstawienia mogą także występować w analogach PTHrP, w których reszta C-końcowa występuje w postaci amidu. Można dokonywać dodatkowych podstawień uwzględniając aminokwasy mające ładunek, albo nie mające ładunku. Każdą z tych grup można dalej podzielić na podgrupy, w celu dalszego ułatwienia podstawień.

Aminokwasy mające ładunek

Reszty kwasowe: kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, kwas 2-aminosuberowy

Reszty zasadowe: lizyna, arginina, histydyna, ornityna

Aminokwasy pozbawione ładunku

Reszty hydrofilowe: seryna, treonina, asparagina, glutamina, metionina

Reszty alifatyczne: glicyna, alanina, walina, leucyna, norleucyna, izoleucyna

Reszty niepolarne: cysteina, homocysteina, metionina, prolina

Reszty aromatyczne: fenyloalanina, tyrozyna, tryptofan, histydyna

Alternatywnie podstawienia aminokwasów mogą opierać się na zasadzie bioizosteryzmu. Takie podstawienia bioizosteryczne zazwyczaj zmniejszają do minimum wszelkie zaburzające wpływy konformacyjne, które może tworzyć losowe podstawienie. Do identyfikacji pozycji, dla których oczekuje się, że podstawienie izosteryczne zapewni warianty zachowujące aktywność fizjologiczną, można zastosować technikę przeszukiwania alaninowego. (Patrz np. K.H. Pearce Jr., M.H. Ultsch, R.F. Kelley, A.M. de Vos i J.A. Wells, Biochemistry, 35 (32): 10300-10307 (1996) oraz B. Li, J.Y. Tom, D. Oare, R. Yen, W.J. Fairbrother, J.A. Wells i B.C. Cunningham, Science, 270: 1657-1660 (1995)). Reprezentatywne aminokwasy izosteryczne przedstawiono w tabeli poniżej.

Aminokwas	Aminokwas izosteryczny
1	2
Ala	Ser, Gly
Glu	Gln, Asp
Gln	Asn, Glu
Asp	Asn, Glu
Asn	Ala, Asp
Leu	Met, Ile
Gly	Pro, Ala
Lys	Met, Arg
Ser	Thr, Ala
Val	Ile, Thr
Arg	Lys, Met, Asn

PL 195 703 B1 cd. tabeli

1	2
Thr	Ser, Val
Pro	Gly
Ile	Met, Leu, Val
Met	Ile, Leu
Phe	Tyr
Tyr	Phe
Cys	Ser, Ala
Trp	Phe
His	Asn, Gln

Wariantami delecyjnymi są te, w których z sekwencji natywnej usunięto jeden lub większą liczbę aminokwasów. Zazwyczaj w wariantach delecyjnych będą usunięte jeden lub dwa aminokwasy w określonym regionie cząsteczki. Prawdopodobnie delecji będzie dokonywać się na końcach sekwencji, szczególnie na końcu karboksylowym. Tak więc chociaż korzystne są fragmenty PTHrP(1-34), sekwencje o dodatkowo skróconym końcu karboksylowym także wywierają działanie gojące kości.

Wariantami insercyjnymi lub addycyjnymi są te z aminokwasem wstawionym w bezpośrednim sąsiedztwie z aminokwasem w określonej pozycji w natywnej sekwencji. Bezpośrednie sąsiedztwo z aminokwasem oznacza połączenie albo z grupą a-karboksylową, albo z grupą a-aminową aminokwasu. Również warianty addycyjne lub insercyjne będzie prawdopodobnie tworzyć się na końcach sekwencji, także najprawdopodobniej na końcu karboksylowym.

Wśród wyżej wymienionych modyfikacji sekwencji natywnej korzystne są podstawienia oraz addycje i delecje na końcu karboksylowym.

Polipeptydowe analogi PTHrP, które są użyteczne w leczeniu złamań, jak opisano w niniejszym opisie, częściowo opisano ogólnie w opisie patentowym US nr 5589452 i publikacji WO 97/07815. Dodatkowe analogi stanowią cykliczne analogi N-końcowych hPTHrP(1-32), hPTHrP(1-34) i hPTHrP(1-38) zawierające sekwencję MAP pomiędzy pozycjami 22 i 31 oraz ewentualnie zawierające reszty w pozycjach 13 i 17 i/lub 26 i 30 połączone poprzez ich grupy funkcyjne łańcuchów bocznych. Fachowiec weźmie pod uwagę, że w pozycjach 13 i 17 można dokonywać różnych podstawień, które mogą umożliwić cyklizację pomiędzy tymi dwiema pozycjami.

Zgodnie z wynalazkiem można stosować analogi PTHrP jakiegokolwiek gatunku ssaka, np. człowieka, bydła, świni lub królika, przy czym korzystny jest PTHrP człowieka. Fachowiec weźmie pod uwagę, że można również stosować warianty podstawieniowe, delecyjne i insercyjne według podanych poniżej korzystnych rozwiązań, zgodne z opisanymi powyżej zasadami dopuszczalnymi w tej dziedzinie.

Korzystnie stosuje się analogi hPTHrP(1-34) z sekwencją MAP w pozycjach 22-31, szczególnie te zawierające w pozycji 26 aminokwas mający ładunek dodatni, np. lizynę lub histydynę. Konkretne postacie wtej grupie to: (MAP1-10)^22-31hPTHrP(1-34)NH2

Ala Val Ser Glu His Gln Leu	Leu	His	Asp	Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu	Leu	Leu	Glu	Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
Leu His Thr Ala NH2 (SEQ ID NO: 3) i
(MAP1-10)^22-31His²⁶hPTHrP(1-34)NH2
Ala Val Ser Glu His Gln Leu	Leu	His	Asp	Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
Gln Asp Leu Arg Arg Arg Glu	Leu	Leu	Glu	His	Leu	Leu	Glu	Lys

Leu His Thr Ala NH2 (SEQ ID NO: 4).

Korzystnie stosuje się również analogi hPTHrP(1-34) z sekwencją MAP w pozycjach 22-31 i dodatkowo zawierające mono- i bicykliczną substrukturę utworzoną przez cyklizację między grupami funkcyjnymi bocznych łańcuchów reszt aminokwasowych, szczególnie pomiędzy resztami 13 i 17 lub

PL 195 703 B1 pomiędzy resztami 26 i 30. Zazwyczaj grupami funkcyjnymi łańcuchów bocznych są grupy aminowe, hydroksylowe lub karboksylowe, a cyklizacja polega na utworzeniu wiązania amidowego lub estrowego. Reszty z aminową grupą funkcyjną w łańcuchu bocznym pochodzą od lizyny i ornityny. Reszty z karboksylową grupą funkcyjną w łańcuchu bocznym pochodzą od kwasu asparaginowego i kwasu glutaminowego. Konkretne postacie w tej grupie to:

(MAPi-io)^22-31c[Lys¹³,Asp¹⁷]hPTHrP(1-34)hSer³⁴lakton (ΜΑΡχ_₁₀)22-31_c[Lys¹³,Asp¹⁷]hPTHrP(1-34)hSer³⁴lakton

Ala	Val	Ser	Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly
1 Lys	Ser	Ile	-1 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu
Glu	Lys	Leu	Leu Glu Lys Leu His Thr hSerlac (SEQ ID NO: 5) i
(MAP₁_₁₀)22-	'³¹c[Lys¹³,Asp¹⁷]hPTHrP(1-34)NH₂
Ala	Val	Ser	Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly
1 Lys	Ser	Ile	1 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu
Glu	Lys	Leu	Leu Glu Lys Leu His Thr Ala NH₂ (SEQ ID NO:6).

Innymi analogami hPTHrP stosowanymi zgodnie z wynalazkiem są sekwencje N-końcowe obejmujące od 30 do 50 reszt, korzystnie reszty 1-32, 1-33, 1-34, 1-35, 1-36, 1-37 i 1-38, zawierające w pozycjach 22-31 sekwencję MAP i ewentualnie zawierające jedno lub większą liczbę podstawień w pozycji 5, 1 3, 17, 19, 26, 30, 32 lub 34. Konkretne postacie w tej grupie to:

(MAP1-10)^22-31lle⁵hPTHrP(1-34)NH2

Ala

Val

Ser

Glu

Ile

Gin

Leu Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu Leu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

Leu

His

Thr

Ala

nh₂

SEQ

ID NO: 7)

Z

(ΜΑΡχ_χ₀)22-

-³¹ai

a¹⁹hPTHrP(1-34)NH₂

Ala

Val

Ser

Glu

Ile

Gin

Leu Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

Gin

Asp

Leu

Ala

Arg

Glu Leu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

Leu

His

Thr

Ala

nh₂

(SEQ

ID NO: 8) ,

(ΜΑΡχ_χ₀)^22-3lpro³²hPTHrP(1-32)NH₂

Ala	Val	Ser	Glu Ile	Gin Leu Leu	His	Asp	Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
Gin	Asp	Leu	Ala Arg	Arg Glu Leu	Leu	Glu	Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
Leu	Pro	nh₂	(SEQ ID	NO: 9),
(ΜΑΡχ_χ₀)22	'³¹D-Orn²⁴laktamhPTHrP(1-:	34)
Ala	Val	Ser	Glu His	Gin Leu Leu	His	Asp	Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
Gin	Asp	Leu	Arg Arg	Arg Glu Leu	Leu	Glu	Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
Leu	His	Thr	D-Orn laktam (SEQ ID	NO:	10) ,

(ΜΑΡχ_χ₀)^22-31hPTHrP(1-34)A2bu³⁴laktam

Ala

Val

Ser

Glu

His

Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

Leu

His

Thr

A2bu

laktam

(SEQ

ID NO: :

11) oraz

(ΜΑΡχ_₁₀)²²-

³¹hS<

er^{3 4}

PTHrP(1-

34)THIQ NH₂

Ala

Val

Ser

Glu

His

Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

Leu

His

Thr

hSer

Thr

His

Ile

Gin

nh₂

(SEQ

ID

NO:

12) .

PL 195 703 B1

Ogólnie użyteczne są wszystkie polipeptydy zasadniczo homologiczne do konkretnych postaci ujawnionych w tym opisie. Zwykle polipeptydy stosowane zgodnie z wynalazkiem będą wykazywać co najmniej około 50%, korzystnie ponad 80%, korzystniej ponad 90%, a najkorzystniej co najmniej około 95% homologię do konkretnych postaci ujawnionych w tym opisie. Długość sekwencji polipeptydowych porównywanych pod względem homologii będzie na ogół wynosiła co najmniej około 20 aminokwasów, zwykle co najmniej około 24 reszt, zazwyczaj co najmniej około 30 reszt, a korzystnie od 32 do 40 reszt.

Związki stosowane zgodnie z wynalazkiem można wytwarzać sposobami opisanymi w opisie patentowym US nr 5589452 oraz publikacjach WO 96/40193 i 97/07815. Związki te zazwyczaj wytwarza się drogą syntezy na fazie stałej, syntezy w roztworze lub metodami rekombinacyjnymi, które polegają na klonowaniu i ekspresji genu kodującego żądany polipeptyd, przy czym wszystkie te sposoby są znane fachowcom w tej dziedzinie. W przypadku wytwarzania skróconych analogów PTHrP, o długości czterdziestu lub mniej aminokwasów, korzystna jest synteza na fazie stałej. Analogi z łańcuchami bocznymi tworzącymi ugrupowanie cykliczne zazwyczaj wytwarza się przez przyłączenie pełnego, zablokowanego polipeptydu do żywicy, usunięcie grup blokujących oraz, bezpośrednio przed uwolnieniem polipeptydu z żywicy, przeprowadzenie cyklizacji z użyciem odpowiedniego odczynnika sprzęgającego, takiego jak heksafluorofosforan benzotriazol-1-ilooksytris(pirolidyno)-fosfoniowy (PyBOP).

Leki zawierające analog PTHrP można stosować do leczenia złamań i przecięć kości, w tym zarówno złamań ze zrostem, jak i nie zrośniętych. Do rodzajów złamań, które można leczyć, należą zarówno złamania urazowe, jak i związane z osteoporozą, np. złamania kości biodrowej, szyjki kości udowej, nadgarstka, kręgów, kręgosłupa, żeber, mostka, krtani i tchawicy, kości promieniowej/kości łokciowej, kości piszczelowej, rzepki, obojczyka, miednicy, kości ramiennej, goleni, palców rąk i nóg, kości twarzy i kostki. Inne przypadki obejmują ułatwienie zrastania stawów, np. zrastania kręgosłupa, kostki i stopy, stawu łokciowego, stawu biodrowego oraz artrodezy stawu biodrowego, kolanowego i barkowego. Leczenie z zastosowaniem analogów PTHrP jest również wskazane w połączeniu z operacjami plastycznymi (w tym z ponownymi operacjami plastycznymi) stawów biodrowego, kolanowego, barkowego/łokciowego itp. Gojenie kości można także wzmacniać przy innych zabiegach chirurgicznych, takich jak chirurgia czaszki i szczękowa, stomatologia i usunięcie kaletki stawu śródstopnopaliczkowego. Wykazano, że analogi PTHrP przyspieszają gojenie zarówno kości endochondralnych (przykłady 1 i 2), które przebiega poprzez tworzenie kostniny chrzęstnej, jak i kości wewnątrzbłonowej (przykład 3), które nie wymaga tworzenia pośredniej kostniny. Gojenie kości wewnątrzbłonowej jest szczególnie użyteczne w przypadkach gdy gojenie złamania jest opóźnione, np. u pacjentów z cukrzycą, palaczy, osób starszych, pacjentów z anemią oraz pacjentów leczonych kortykosteroidami (szczególnie leczonych długotrwale glukokortykoidami), długotrwale leczonych niesteroidowymi lekami przeciwzapalnymi lub poddawanych terapii immunosupresyjnej.

Określona dawka analogu PTHrP wymagana do ułatwiania gojenia złamania będzie zależeć od ciężkości stanu, drogi podawania i podobnych czynników, o których będzie decydować lekarz prowadzący. Zazwyczaj dawka będzie wynosić w zakresie od około 0,01 do 10 mg/kg masy ciała na dzień, korzystnie około 0,1 - 0,5 mg/kg masy ciała na dzień. Dzienna dawka substancji czynnej w przypadku osoby o masie 50 kg wynosi około 0,5 -100 mg, korzystnie około 5-10 mg. Dawkę tą można podawać w postaci typowego środka farmaceutycznego przez pojedyncze podanie, przez wielokrotne podawanie lub z kontrolowanym uwalnianiem, jak jest potrzebne dla uzyskania najlepszych wyników. Dawkowanie należy kontynuować tak długo, jak jest to wskazane ze względów medycznych, co może trwać od kilku tygodni do kilku miesięcy, w zależności od ciężkości uszkodzenia.

W przeciwieństwie do większości obecnie dostępnych sposobów leczenia złamań, analogi PTHrP można podawać ogólnoukładowo. Reprezentatywne tryby podawania to podawanie doustne, pozajelitowe (w tym podawanie podskórne, domięśniowe i dożylne), doodbytnicze, podpoliczkowe (w tym podjęzykowe), przezskórne, dopłucne i donosowe. Typowe układy podawania dopłucnego i poprzez drogi oddechowe opisano w opisie patentowym US nr 5607915. Podawanie donosowe analogów PTHrP opisano w WO 97/07815. Leczenie może polegać także na ogólnoukładowym podawaniu analogów PTHrP łącznie z miejscowym podawaniem innego czynnika gojącego kość. Reprezentatywne środki do takiego podawania miejscowego stanowią białka morfogenetyczne kości (BMP-2 i BMP-7), białka kościotwórcze (OP-1), czynniki wzrostowe, takie jak TGF-b 1, oraz cytokiny, takie jak IFN-b. Zazwyczaj czynniki te podaje się miejscowo w różnych nośnikach, takich jak hydroksyapatyt i/lub węglan wapnia oraz amylopektyna. Ogólnoukładowe podawanie analogów PTHrP można także

PL 195 703 B1 łączyć z alternatywnymi sposobami leczenia złamań, takimi jak stymulacja mechaniczna lub biofizyczna, np. elektryczna lub ultradźwiękowa.

Analogi PTHrP zazwyczaj będzie podawać się w postaci środków farmaceutycznych w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym, nietoksycznym nośnikiem. Jak wspomniano powyżej, można wytwarzać takie środki do podawania pozajelitowego (podskórnego, domięśniowego, dożylnego), zwłaszcza w postaci ciekłych roztworów lub zawiesin; do podawania doustnego lub podpoliczkowego, zwłaszcza w postaci tabletek lub kapsułek; do podawania donosowego, zwłaszcza w postaci proszków, kropli do nosa lub aerozoli oraz do podawania doodbytniczego lub przezskórnego.

Płynne preparaty do podawania pozajelitowego mogą zawierać jako zaróbki jałową wodę lub wodny roztwór soli, glikole alkilenowe, takie jak glikol propylenowy, poliglikole alkilenowe, takie jak poliglikol etylenowy, oleje pochodzenia roślinnego, uwodornione naftaleny i podobne substancje. Mogą one zawierać lekko kwaśne bufory o pH około 4-6. Do odpowiednich buforów należą octan, askorbinian i cytrynian w zakresie stężeń około 5-50 mM. Preparaty do podawania doustnego można wzmacniać przez dodawanie soli żółciowych lub acylokarnityn. Preparaty do podawania donosowego mogą mieć postać stałą i mogą zawierać zarobki, np. laktozę lub dekstran, albo mogą stanowić wodne lub olejowe roztwory do stosowania w postaci kropli do nosa lub dozowanych płynów do rozpylania. Szczególne preparaty donosowe stanowią suche proszki odpowiednie do zwykłych inhalatorów proszkowych (DPI), ciekłe roztwory i zawiesiny odpowiednie do nebulizacji oraz preparaty z propelentem odpowiednie do stosowania w inhalatorach dozujących (MDI). Typowe zaróbki w preparatach do podawania podpoliczkowego stanowią cukry, stearynian wapnia, stearynian magnezu, wstępnie zżelowaną skrobię i podobne substancje.

W przypadku postaci do podawania donosowego, wchłanianie przez błonę śluzową nosa można wzmacniać stosując kwasy powierzchniowo czynne, takie jak np. kwas glikocholowy, kwas cholowy, kwas taurocholowy, kwas etocholowy, kwas deoksycholowy, kwas chenodeoksycholowy, kwas dehydrocholowy, kwas glikodeoksycholowy, cyklodekstryny itp., w ilości od około 0,2 do 15% wagowych, korzystnie od około 0,5 do 4% wagowych, a najkorzystniej około 2% wagowych.

Podawanie osobnikowi opisanych tu związków w ciągu dłuższych okresów, np. w ciągu od jednego tygodnia do jednego roku, można realizować przez jednokrotne podanie układu o kontrolowanym uwalnianiu, zawierającego wystarczającą ilość substancji czynnej dla pożądanego okresu uwalniania. W tym celu można wykorzystać różne układy o kontrolowanym uwalnianiu, takie jak mikrokapsulki jednolite lub komorowe, implanty depot, pompy osmotyczne, pęcherzyki, micele, liposomy, plastry transdermalne, wkładki jontoforetyczne i alternatywne postacie dawkowane do iniekcji. Możliwość lokalizacji w miejscu, do którego pożądane jest podawanie substancji czynnej, jest dodatkową zaletą niektórych układów o kontrolowanym uwalnianiu, która może okazać się korzystna w leczeniu niektórych zaburzeń.

Poniżej podano krótki opis rysunków.

Figura 1 przedstawia cotygodniową gęstość radiograficzną odcinkowego ubytku kości w szczurzym modelu złamania w ciągu przebiegu pięciotygodniowego leczenia analogami B lub C PTHrP w stosunku do kontroli. Wykazuje ona, że po czterech tygodniach przyrost kości w ubytkach u zwierząt leczonych analogami PTHrP był wyższy niż u zwierząt kontrolnych. Analogami B i C PTHrP są odpowiednio (MAP1-10)^22-31Ala¹⁹hPTHrP(1-34)NH2 i (MAP1-10)^22-31His²⁶hPTHrP(1-34)NH2.

Figura 2 przedstawia stosunek gęstości radiograficznej kości z ubytkiem odcinkowym do kontralateralnej kości udowej (kontrola) w szczurzym modelu złamania z ubytkiem odcinkowym po sześciu tygodniach leczenia substancją kontrolną lub analogami B bądź C analogu PTHrP. Szczury leczone analogami B i C PTHrP miały zwiększoną gęstość kości w stosunku do szczurów leczonych substancją kontrolną.

Figura 3 przedstawia radiogramy ubytków kości o wysokiej rozdzielczości w szczurzym modelu złamania z ubytkiem odcinkowym dla szczurów po leczeniu w ciągu sześciu tygodni albo substancją kontrolną (3A), albo analogiem C PTHrP (3B). Radiogram wykazuje, że kontrolny ubytek pozostał niezrośnięty, podczas gdy ubytek leczony analogiem C PTHrP zagoił się.

Figury 4A i 4B przedstawiają gojenie wewnątrzbłonowego ubytku kości u królików po leczeniu analogiem D PTHrP, (MAP1-10)^22-31hPTHrP(1-34)NH2 w dwóch różnych dawkach.

Figura 5 przedstawia szybkość tworzenia zrostu uzyskiwaną w modelu złamania z zahamowa22-31 niem gojenia indukowanym kortykosteroidem z zastosowaniem analogu D PTHrP, (MAP1-10)^22-31hPTHrP(1-34)NH2.

PL 195 703 B1

Przykłady Przykłady referencyjne Preparat w postaci tabletek

Następujące składniki dokładnie miesza się i mieszaninę sprasowuje się z wytworzeniem pojedynczych naciętych tabletek.

Składnik	Ilość na tabletkę, mg
substancja czynna	400
skrobia kukurydziana	50
sól sodowa kroskarmelozy	25
laktoza	120
stearynian magnezu	5

Preparat w postaci kapsułek

Następujące składniki dokładnie miesza się i mieszaniną napełnia się twarde kapsułki żelatynowe.

Składnik	Ilość na kapsułkę, mg
substancja czynna	200
laktoza, wysuszona rozpyłowo	148
stearynian magnezu	2
Preparat w postaci zawiesiny
Następujące składniki miesza się z wytworzeniem zawiesiny do podawania doustnego.
Składnik	Ilość
substancja czynna	1,0 g
kwas fumarowy	0,5 g
chlorek sodu	2,0 g
metyloparaben	0,15 g
propyloparaben	0,05 g
cukier granulowany	25,5 g
sorbitol (70% roztwór)	12,85 g
Veegum K (Vanderbilt Co.)	1,0 g
substancja smakowo-zapachowa	0,035 ml
barwniki	0,5 mg
woda destylowana	tyle ile trzeba do 100 ml
Preparat do iniekcji
Następujące składniki miesza się z wytworzeniem preparatu do iniekcji.
Składnik	Ilość
substancja czynna	0,2 g
bufor z octanu sodu, 0,4 M	2,0 ml
HCl (1N) lub NaOH (1N)	do odpowiedniego pH
woda (destylowana, jałowa)	tyle ile trzeba do 20 ml
Preparatdonosowy
Następujące składniki miesza się z wytworzeniem zawiesiny do podawania donosowego
Składnik	Ilość, mg/ml
analog PTHrP	20
kwas cytrynowy	0,2
cytrynian sodu	2,6
chlorek benzalkoniowy	0,2
sorbitol	35
taurocholan lub glikocholan sodowy	10

PL 195 703 B1

P r zyk ł a d 1

Leczenie ubytków złamania odcinkowego analogami PTHrP

W celu wykazania, że analogi PTHrP ułatwiają gojenie kości i leczenie złamania, zastosowano modyfikację szczurzego modelu odcinkowego ubytku kości udowej. (T.A. Einhorn i in., J. Bone Joint, 66: 274-279 (1984)).

Dorosłe samce szczurów rasy Sprague-Dawley, ważące około 300 g, utrzymywano na Laboratory Rodent Diet 5001 (PMI Feeds, St. Louis, MO, USA) i wodzie ad libitum. Wszystkie szczury na 12 godzin przed operacją otrzymywały tylko wodę. Zwierzęta usypiano przed operacją przez dootrzewnową iniekcję ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg). Zapobiegawczo przeciw infekcji domięśniowo podawano pojedynczą dawkę penicyliny prokainowej.

Stosowano boczne dojście do kości udowej i wzdłuż przedniej kory kości udowej umieszczano uprzednio wydrążoną płytkę z polietylenu o wysokiej gęstości. Podczas tego umieszczania na dużym obszarze usuwano okostną kości udowej. W środkowej części trzonu kości udowej tworzono odcinkowy ubytek o niekrytycznej wielkości 1 mm. Ranę zamykano nylonowymi i chromowymi szwami.

Po operacji szczury umieszczono w klatkach, po 48 godzinach od operacji zapewniając im dostęp do suchej karmy. Zwierzęta kontrolowano co najmniej raz dziennie, a te przejawiające jakiekolwiek oznaki chorobowe badano i, jeśli to konieczne, poddawano odpowiedniemu leczeniu.

Szczury podzielono na grupy, jak przedstawiono w tabeli 1 i poczynając od pierwszego dnia po operacji, codziennie podskórnie podawano im albo nośnik kontrolny (wodny roztwór soli), albo analog PTHrP. Co tydzień wykonywano analizy radiograficzne. Zwierzęta uśmiercono po 6 tygodniach i porównano radiograficznie.

Szczury poddane działaniu środka uspakajającego umieszczano w pozycji na brzuchu z kończynami tylnymi do zewnątrz. Co tydzień wykonywano kolejne radiogramy każdej kości udowych (badanej kości udowej i kości udowej kontralateralnej), począwszy od 1 tygodnia po operacji. W celu kalibracji, do każdego radiogramu dołączano aluminiowe urządzenie fantomowe o znanych wartościach gęstości. Każdy radiogram umieszczano na podświetlanym stoliku i robiono zdjęcie stosując cyfrową kamerę Kodak DCS 420. Obrazy te następnie przenoszono na komputer zgodny z IBM, Gateway 2000, i przeprowadzano w postać cyfrową stosując oprogramowanie do analizy obrazów (Sigma Scan^©). Wyznaczano obrys ubytku i mierzono średnią gęstość obszaru przecięcia kości u zwierząt leczonych w stosunku do zwierząt kontrolnych. Na fig. 1 przedstawiono wzrost gęstości kości w obszarze przecięcia kości u zwierząt leczonych w stosunku do zwierząt kontrolnych w tygodniowych odstępach w ciągu pierwszych pięciu tygodni leczenia. Każdy cotygodniowy odczyt średniej gęstości w obszarze przecięcia kości porównano także ze średnią gęstością kontralateralnej kości udowej. Na fig. 2 przedstawiono stosunek gęstości radiograficznej po sześciu tygodniach. Porównanie tych gęstości kości wykazało, że analogi PTHrP wykazują działanie gojące kości. Po uśmierceniu zwierząt (6 tygodni), kości udowe (doświadczalną i kontralateralną) oddzielono od tkanek miękkich. Wykonano drobnoziarniste radiogramy kości udowych w płaszczyźnie bocznej. Przeciętą kość uważano za zrośniętą, gdy występowała ciągłość kostna kości udowej w ponad 25% średnicy przekroju poprzecznego ubytku. Porównanie kości udowych zwierząt leczonych w stosunku do zwierząt kontrolnych wykazało, że analogi PTHrP przyspieszały gojenie kości i leczenie złamania. Na fig. 3 przedstawiono reprezentatywny radiogram zwierząt kontrolnych (fig. 1A) i leczonych (fig. 1B).

Tabel a 1

Grupa	Związek	Podawanie	Liczba zwierząt	Uśmiercenie
1	kontrola	podskórne	10	sześć tygodni
2	analog B PTHrP	podskórne	10	sześć tygodni
3	analog C PTHrP	podskórne	10	sześć tygodni

P r zyk ł a d 2

Gojenie kości w modelu ubytku złamania zamkniętego z użyciem analogów PTHrP Zastosowanym modelem złamania zamkniętego jest model Bonnarensa/Einhorna (F. Bonnarens i T.A. Einhorn, J. Orthopaedic Research, 2: 97-101 (1984)). Stosowano takie szczury jak w przykładzie 1. W tym modelu wewnątrzszpikowy pręt umieszcza się wstecznie przez dystalną część kości udowej stosując dojście przez przyśrodkowy obszar okołorzepkowy. Następnie nacięcie stawu zamyPL 195 703 B1 ka się za pomocą niewchłanialnego szwu i na miejscu pozostawia się wewnątrzszpikowy pręt. Następnie tworzy się poprzeczne złamanie zamknięte stosując wykonane na zamówienie urządzenie ściskające w trzech punktach. Zwierzęta monitoruje się i analizę radiograficzną prowadzi się jak w przykładzie 1. Wmodelu tym analogi PTHrP przyspieszały gojenie kości i leczenie złamania u zwierzątleczonychwstosunku do zwierząt kontrolnych.

Przykład 3

Wewnątrzbłonowe gojenie kości z użyciem analogów PTHrP

Króliki poddawano znieczuleniu ogólnemu i zabiegowi chirurgicznemu w celu utworzenia czterech ubytków powierzchniowych, po jednym na każdej z dystalnych części kości udowych i każdej z proksymalnych kości piszczelowych. W celu ekspozycji dystalno-bocznego kłykcia kości udowej dokonano tylno-bocznego chirurgicznego nacięcia mierzącego około 3 cm. Kość proksymalnie do stawu kolanowego wyeksponowano podokostnowo i wywiercono otwóro średnicy 5 mm, utrzymując wiertło zimne przez stałe płukanie. Ranę przemywano izotonicznym roztworem soli. Tkankę głęboką zamknięto stałym szwem 3-0, a następnie zamknięto warstwę śródskórną szwem nylonowym 3-0 i od trzech do czterech szwów węzełkowych ze stali nierdzewnej. Drugiego nacięcia o długości około 3 cm dokonano ponad przyśrodkową proksymalną częścią kości piszczelowej i wywiercono otwór o średnicy 5 mm w proksymalnej przyśrodkowej części kości piszczelowej. Ranę zamknięto jak opisano uprzednio. Całą procedurę powtórzono na kończynie kontralateralnej.

Roztwory podstawowe analogu C PTHrP, (MAP1-10)^22-31His²⁶hPTHrP(1-34)NH2, oraz analogu D PTHRP, (MAP1-10)^22-31hpTHrP(1-34)NH2, o stężeniu 800 mg/ml, przygotowano przez jałowe sączenie przez sączek o średnicy porów 0,22 mm i rozcieńczano w nośniku albo do stężenia 20 mg/ml, albo stężenia 100 mg/ml bezpośrednio przed podaniem. Skład nośnika był następujący: 30 mg/ml mannitolu, 30 mg/ml sacharozy, 0,12 mg/ml Tween™ 80, 0,17 mg/ml kwasu octowego i 2,33 mg/ml trihydratu octanu sodu. Analogi PTHrP podawano zwierzętom po zabiegach chirurgicznych codziennie w dawce albo 2 mg/kg/dzień, albo 10 mg/kg/dzień, przez iniekcję podskórną.

Zwierzęta prześwietlano promieniami X co tydzień podczas trwania badań. Pomiarów densytometrycznych dokonywano stosując skaner ze światłem przechodzącym i oprogramowanie MetaMorph™ (Universal Imaging, West Chester, PA). Radiogramy kończyn dolnych wykonywano w rotacji do wewnątrz i na zewnątrz w 10 i 21 dniu po operacji. Zwierzęta uśmiercano 30 dnia po operacji. Po zakończeniu badań zwierzęta poddano eutanazji przez przedawkowanie pentobarbitalu, z lewej i prawej kości udowej oraz kości piszczelowych pobrano tkankę i analizowano przez prześwietlanie promienami X i analizę histologiczną.

Zwierzęta leczone analogami C i D PTHrP wykazywały przyspieszone wewnątrzbłonowe tworzenie kości w stosunku do zwierząt leczonych podłożem. Wyniki dla analogu D PTHrP przedstawiono na fig. 4A i 4B, odpowiednio dla kości udowej i piszczelowej. Do dnia 21nie wystąpiło pełne zagojenie ubytków ani kości udowej, ani piszczelowej u zwierząt kontrolnych, podczas gdy 40% ubytków kości udowej i piszczelowej uległo zagojeniu w grupie otrzymującej niską dawkę. W tym samym punkcie czasowym, w grupie otrzymującej wysoką dawkę zagoiło się 75% ubytków kości piszczelowych i 50% ubytków kości udowych. Po uśmierceniu zwierząt, analiza radiograficzna próbek potwierdziła wzmocnienie gojenia u zwierząt leczonych analogami PTHrP, z ubytków kości piszczelowych zwierząt, które otrzymywały wysokie dawki ponad 85% wypełniło się zmineralizowaną tkanką, podczas gdy w grupie kontrolnej mniej niż 10% ubytków kości piszczelowych było wypełnionych zmineralizowaną tkanką w momencie uśmiercenia (p < 0,01). Podobnie, występował znacząco wyższy procent wypełnienia ubytków w kościach udowych leczonych PTHrP, niż ubytków w kościach udowych kontrolnych (p < 0,01).

Pr zykł ad 4

Wzmocnione gojenie kości w modelu przecięcia kości łokciowej

Celem tego doświadczenia było wykazanie, że analogi PTHrP mogą zwiększać wytrzymałość biomechaniczną (część I) i kinetykę gojenia (część II) w warunkach ogólnoukładowej terapii kortykosteroidami w modelu przecięcia kości królika.

We wszystkich doświadczeniach stosowano dorosłe samce królików rasy nowozelandzkiej białej. W części I dziesięć królików podzielono na dwie równe grupy, a w części II równo podzielono dwadzieścia królików. U każdego królika utworzono dwustronnie ubytki niekrytycznej wielkości (1mm). Od dwóch miesięcy przed zabiegiem chirurgicznym do sześciu tygodni po operacji wszystkie króliki otrzymywały codziennie podskórne iniekcje albo prednizonu (0,15 mg/kg) w jałowej wodzie (grupa doświadczalna), albo jałowym roztworze soli (grupa kontrolna). Począwszy od pierwszego dnia po operacji, grupie doświadczalnej podawano codziennie podskórne iniekcje analogu D PTHrP

PL 195 703 B1 (0,01 mg/kg), podczas gdy grupa kontrolna otrzymywała iniekcje izotonicznego roztworu soli. W części I zwierzęta uśmiercono po sześciu tygodniach od przecięcia kości. W części II zwierzęta uśmiercono po uzyskaniu dwustronnego zrośnięcia stwierdzonego radiograficznie, względnie po dziesięciu tygodniach od operacji, w przypadkach braku zrośnięcia.

W obu seriach doświadczeń co tydzień analizowano intensywność radiologiczną i powierzchnię gojenia, począwszy od dwóch tygodni (część I) lub czterech tygodni (część II) od operacji. Wykonano i przeprowadzono w postać cyfrową kolejne radiogramy kończyn przednich i powierzchnię kości oceniano ilościowo stosując oprogramowanie do analizy obrazów (Sigma Scan Pro). Do ilościowego określenia zawartości substancji mineralnych w nowo tworzonej kości w miejscach przecięcia kości i tworzenia kostniny stosowano fotodensytometrię. Po uśmierceniu wykonano radiogramy faksytronowe o wysokiej rozdzielczości obu kończyn w płaszczyznach przednio-tylnej i bocznej, umożliwiając analizę rozmiarów i wielkości kostniny złamania.

Wyniki (część I)

Dziewięć z dziesięciu kończyn leczonych analogiem D PTHrP zrosło się w ciągu sześciu tygodni, podczas gdy u zwierząt kontrolnych, którym podawano nośnik, zrosły się tylko dwie kończyny z dziesięciu. Wyniki te przedstawiono na fig. 5. Po sześciu tygodniach zarówno przednio-tylne, jak i boczne radiogramy faksytronowe ujawniły znacząco wyższą intensywność w miejscach przecięcia kości kończyn leczonych w stosunku do kontrolnych. Podobnie, intensywność zarówno w trzonach proksymalnych, jak i dystalnych kości łokciowej, była znacząco wyższa w przypadku kończyn leczonych. Bocznie, intensywność kostnin zewnętrznych również była wyższa dla leczonych kończyn. Biomechanicznie, wytrzymałość na skręcanie leczonych kończyn była znacząco wyższa niż kontrolnych kończyn traktowanych zaróbką, zarówno pod względem sztywności, jak i momentu obrotowego.

Wyniki (część II)

Po czterech tygodniach leczone kończyny wykazywały wyższą intensywność radiograficzną, niż kończyny kontrolne w miejscu przecięcia kości (p < 0,01), jak również w zewnętrznych kostninach i trzonach kości łokciowych. Łączna powierzchnia kostniny leczonych kończyn była wyższa (p < 0,05), oraz występowała tendencja wskazująca, że zmniejszała się wielkość miejsca przecięcia kości. Po sześciu tygodniach radiografia in vivo wykazała tendencję wzrostu intensywności w miejscu przecięcia kości kończyn leczonych w porównaniu z kończynami kontrolnymi, chociaż nie zaobserwowano żadnych różnic intensywności lub powierzchni kostniny. Radiograficznie, wszystkie kończyny leczone analogiem PTHrP uznano za zrośnięte i wszystkie te zwierzęta uśmiercono po sześciu tygodniach. Po ośmiu tygodniach cztery dodatkowe kończyny (dwa zwierzęta) zrosły się radiograficznie i zwierzęta zostały uśmiercone. Po dziesięciu tygodniach uśmiercono pozostałe zwierzęta, ponieważ ich kończyny nie wykazywały radiograficznego postępu w kierunku gojenia w stosunku do poprzedzającego okresu czterech tygodni i sklasyfikowano je zatem jako niezrośnięte. Kończyny leczone analogiem PTHrP wykazywały wyższą intensywność radiograficzną w miejscu przecięcia kości (p < 0,05), jak również trzonach kości łokciowej i większą powierzchnię kostniny. Powierzchnia przecięcia była znacząco mniejsza w kończynach leczonych analogiem PTHrP, niż w kończynach kontrolnych traktowanych podłożem. Tak więc w tym modelu indukowanego kortykosteroidem opóźnionego gojenia, wynikiem leczenia PTHrP była pełna liczba zrostów po sześciu tygodniach, podczas gdy 75% nietraktowanych kończyn nie wykazywało tendencji do zrastania po dziesięciu tygodniach.

Claims

1. Zastosowanie polipeptydowego analogu peptydu pokrewnego hormonowi przytarczyc (PTHrP) i jego soli, który to analog PTHrP stanowi N-końcowa skrócona postać o długości 30-50 reszt aminokwasowych, przy czym reszty aminokwasowe 22-31 tego analogu PTHrP tworzą amfipatyczną helisę a, do wytwarzania leku do gojenia kości i leczenia złamań, a tę amfipatyczną helisę a stanowi Glu Leu Leu Glu Xaa Leu Leu Glu Lys Leu gdzie Xaa oznacza resztę aminokwasową mającą ładunek dodatni.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że analog PTHrP podaje się donosowo.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że ponadto miejscowo podaje się do miejsca złamania drugi czynnik powodujący gojenie kości.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że złamanie znajduje się w kości wewnątrzbłonowej.

PL 195 703 B1

5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że analog PTHrP podaje się ogólnoukładowo.

6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że Xaa oznacza lizynę lub histydynę.

7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że analog PTHrP stanowi Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Thr Ala nh₂ (SEQ ID NO: 3) lub Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu His Leu Leu Glu Lys Leu His Thr Ala nh₂ (SEQ ID NO: 4) .

8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że analog PTHrP ma co najmniej dwie reszty aminokwasowe połączone są ze sobą wiązaniem pomiędzy ich łańcuchami bocznymi.

9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że połączone reszty aminokwasowe znajdują się w pozycjach 13 i 17 lubw pozycjach 26i 30.

10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że resztę aminokwasową w pozycji 17 stanowi reszta kwasu asparaginowego.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że analog PTHrP stanowi:

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly

Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu

Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Thr hSerlac (SEQ ID NO: 5) lub

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly

Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu

Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Thr Ala NH₂ (SEQ ID NO: 6).

12. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienne tym, że analog PTHrP stanowi N-końcowa skrócona postać o długości 30-50 reszt aminokwasowych, ewentualnie podstawionych w pozycjach 5, 13, 17, 19, 26, 30,32 i/lub 34.

13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że analog PTHrP stanowi: