RS49707B - Primena polipeptidnog analoga peptida srodnog paratireoidnom hormonu i njegovih soli za proizvodnju medikamenata za lečenje preloma kostiju - Google Patents

Abstract

Primena polipeptidnog analoga peptida srodnog paratireoidnom hormonu (PTHrP) i njihovih soli, pri čemu su amino kiseline na pozicijama 22-31 naznačenog PTHrP analoga u formi amfipatičnog α-heliksa Glu Leu Leu Glu Xaa Leu Leu Glu Lys Leu, gde je Xaa neki pozitivno naelektrisani amino kiselinski ostatak, za pripremu medikamenata za zaceljivanje kostiju i srastanje preloma. Prijava sadrži još 8 zavisnih patentnih zahteva.

Description

U Sjedinjenim američkim državama godišnje se prijavi približno 8-10 miliona preloma kostiju, od kojih više od milion zahteva bolničko lečenje. Procena troškova lečenja ovih preloma prevazilazi cifru od 20 milijardi dolara godišnje. I pored toga, očekuje se dalji trend porasta usled povećanja prosečne starosti populacije, lako postoji nekoliko terapija koju su indikovane u prevenciji oštećenja kostiju usled starenja, manji je broj terapija indikovanih u lečenju već nastalih preloma. Mnoge od ovih terapija zahtevaju lokalnu primenu, što nezadovoljavajuće, usled složenosti ovakve primene i slabe saradnje pacijenta. S toga bi bilo poželjno imati na raspolaganju dodatne postupke koji bi olakšali lečenje kostiju i zarašćivanje preloma.

Nedavno je pokazano da periodičan tretman paratireodnim hormonom (PTH) poboljšava zaraščivanje preloma kod ovarijektomisanih pacova, što ukazuje da se tretman PTH može potencijalno primenjivati u lečenju preloma usled osteoporoze kod žena u postmenopauzi (H. W. Kimet al. ;Transactions of the 43<rd>Annual Meeting on the Orthopaedic Research Societv, Vol. 22, Section 1, Abstract 181-31, Februarv 9-13, 1997; K. W. Kimetal.,Journal of Bone and Mineral Research, Vol. 11, Supplement 1, page SI 52, Abstract P248 (August 1996)). Drugi istraživači su pokazali da implantacija odgovarajućeg gena dovodi do ispoljavanje u koštanog morfogenetskog proteina -4 u matriksu i/ili da u modelu segmentnog preloma kod pacova, fragment PTH (amino-kiseline od 1-34), uslovljava formiranje nove kosti koja brže premošćuje prelom nego što je to slučaj kod netretiranih kontrola. (Jianming Fang et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Vol. 93: 5753-5758 (June 1996)). Za različite analoge PTH je takođe pokazano da se mogu primenjivati u terapiji osteoporoze (U.S. Patent Nos. 5,502,074). Ostali pristupi lečenju preloma kostiju uključuju primenu humanog faktora 4 krvnih pločica (U.S Patent No. 5,622,935), benzotiofena (U.S.

Patent 5,502,074) i 24,25(OH)2vitamin D3(U.S. Patent No. 5,069,905).

Peptid srodan PTH (PTHrP), ranije poznat kao faktor koji je odgovoran za malignu hormonalnu hiperkalcemiju, je peptid sastavljen od 138-174 amino kiseline (zavisno od alternativnog isecanja informacione RNK), i ovaj peptid se vezuje za receptor za PTH/PTHrP. Sekvenca od 34 amino kiseline na N-terminusu PTHrP pokazuje ograničenu homologiju sa odgovarajućom sekvencom PTH, ali u izvesnim slučajevima ima aktivnost sličnu PTH. Načelno govoreći, PTHrP ima slabiji efekat i manju anaboličku aktivnost u kostima od PTH i do sada nije korišćen u lečenju preloma kostiju. Sekvenca hPTHrP (1-34) je sledeća:

Postoji nekoliko skraćenih analoga i homologa PTHrP. Analozi u kojima su amino kiseline PTHrP(l-34) na pozicijama 22 - 31 zamenjene nekim amfipatičnim a-heliksom (U.S

Patent No. 5,589,452 i WO 97/07815) i neki srodni derivati, pokazali su se korisnima u lečenju osteoporoze. (B.H Vickervetal.J. Bone & Mineral Research, 11 (12): 1943-1951

(1996); D. Leafferet al.Endocrinologv, 136 (8): 3624-3631 (1995)). Pokazano je da se monociklični i biciklični analozi PTHrP (1-34) i PTHrP(7-34) snažno vezuju za receptor za PTH i stimulišu (ili antagonizuju) PTH-stimulisanu aktivnost adenilat ciklaze u ćelijama sličnim osteoblastima. (Michael Chorevetal.Biochemistry, 36: 3293-3299 (1977), i WO96/40193).

Na određeni način ovaj pronalazak obezbeđuje postupke lečenja kostiju i zarašćivanja preloma, davanjem pacijentu efektivne količine polipeptidnog analoga peptida sličnom paratireoidnom hormonu (PTHrP) i njegovih soli, dok amino kiselinski ostaci 22-31 formiraju ct-heliks, poželjno sastavljen od lipofilnih amino kiselina (Laa) poredanih na sledeći način:

ili primenu ovih jedinjenja u pripremi medikamenata za lečenje ovakvih poremećaja.

Kada se ilustrativni primeri ovog arnfipatičnog heliksa ugrade u sekvencu PTHrP, naročito u N-terminalne isečke PTHrP izolovanog iz čoveka (aminokiselinski ostaci 1-32 sve do 1-38), nastali polipeptid je efikasan u lečenju kostiju i zaraščivanju preloma. Sistemska primena je poželjan način primene.

Sledi kratak opis crteža:

Slika 1 pokazuje nedeljnu radiografsku gustinu segmentnog preloma kosti u pacovskom modelu preloma, tokom perioda od pet nedelja terapije PTHrP analozima B i C u odnosu na kontrolu. Slika pokazuje da je, nakon četki nedelje, rast kosti u prelomu kod životinja tretiranih PTHrP analozima veći nego kod kontrolnih životinja. PTHrP analozi B i C su (MAPMo)<22>"<31>Ala<19>hPTHrP(l-34) NH2, odnosno, (MAP1.1o)<22>'31His2<6>hPTHrP(l-34) NH2.

Slika 2 pokazuje relativan odnos radiografskih gustina kod presečene kosti i kod kontralateralnog femura (kontrola) u modelu segmentnog preloma kosti kod pacova, šest nedelja nakon tretmana PTHrP analozima B i C. Pacovi tretirani PTHrP analozima B i C imali su veći porast gustine kostiju nego što je to slučaj okd netretiranih pacova.

Slika 3 predstavlja radiografije visoke rezolucije oštećenja kosti u modelu segmentnog preloma kosti, nakon tretmana od šest nedelja, bilo kontrolom (3A) ili PTHrP analogom C (3B). Radiografija pokazuje da oštećenja kosti kod kontrole ne srasta, dok oštećenje tretirano PTHrP analogom C srasta.

Slike 4A i 4B pokazuju intramembranozno srastanje oštećenja kosti kod zeca, nakon tretmana sa dve različite doze PTHrP analogom D, (MAP1.10)<22>'<31>hPTHrP(l-34)NH2.

Slika 5 pokazuje brzinu srastanja kod modela kortikosteroidom indukovanog odloženog srastanja, nakon tretmana PTHrP analogom D, (MAPi_io)22 31bPTHrP(l-34)NH2.

Sledi detaljniji opis predloženog pronalaska.

Jednoslovne i troslovne skraćenice za različite uobičajene nukleotidne baze i amino kiseline preuzete su iz Pure Appl. Chem. 31: 639-645 (1972) i 40: 277-290 (1974). Skraćenice se odnose na amino kiseline u L konformaciji, ukoliko nije drugačije naznačeno, kao D ili D,L. Neke amino kiseline, kako prirodne, tako i one koje nisu izolovane iz prirodnih proteina, su akiralne, na primer glicin. Sve peptidne sekvence predstavljene su od N-teiminusa sa leve strane do C-terminusa sa desne strane.

Sve amino kiseline, kako prirodne tako i one koje ne ulaze u sastav prirodnih proteina, mogu biti prisutne u PTHrP analozima na koje se odnosi ovaj pronalazak. Primeri amino kiselina koje ne ulaze u sastav prirodnih proteina i njihove skraćenice su i homoserin (hSer), homoserin lakton (hSerlac), homocistein (Hcy), homoarginin (hArg), homocitrulin (Hci), penicilamin (Pen), Na-metUarginin (N-MeArg), norleucm (Nle), norvalin (Nval), norizoleucin (Nile), N-metilizoleucin (N-Melle), fenilgHcin (PhG), t-butilglicin (Tle), hidroksiprolin (Hyp), 3,4-dehidroprolin (A-Pro), phoglutamin (Pyr,Glp), ornitin (Orn), 1-aminoizobutirićna kiselina (1-Aib), 2-aminoizobutirična kiselina (2-Aib), 2-aminobutirčna kiselina (2-Abu), 4-arninobutirična kiselina (4-Abu), 2,4 diamkobutirična kiselina (A2bu), cc-aminosuberinska kiselina (Asu), albicin (Abz), 3-cikloheksilalanin (Cha), 3-(l-naftil)alanin (1-Nal), 3-(2-naftil)alanin (2-Nal), citrulin (Cit). Pipekolinska kiselina (Pip), 4-hlorofenilalanin (4-ClPhe), 4-fluorofenilalanhi (4-FPhe), sarkozin (Sar) i 1-aminopropankarboksilna kiselina (1-NCPC). Sve amino kiseline, prirodne i one koje ne ulaze u sastav prirodnih proteina su komercijalno dostupne kod firmi kao što su NovaBiochem (San Diego, CA, USA) i Bachem (Torrance, CA, USA).

PTHrP polipeptidni analozi su opisani sa osvrtom na varijacije u odnosu na prirodnu sekvencu hPTHiP. Predstavljanje (MAPmo) odnosi se na odgovarajuću ainfipatičnu spiralnu sekvencu predstavljenu sledećim nizom

Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu (SEQ H> NO: 2)

MAP sekvenca od deset aniino kiselinskih ostataka.

Tako, sekvenca predstavljena kao (MAPi.io)<22>"<31>hPTHrP(l-34) odnosi se na 1-34 N-terminalnu sekvencu hPTHrP, sa segmentom između pozicija 22-31 zamenjenim MAP sekvencom. Unutar MAP sekvence mogu biti naznačene dodatne varijante. Tako, (MAPi. io)<22>"<31>His<26>hPTHrP(l-34) odnosi se na (1-34) N-terminalni kraj hPTHrP, sa segmentom između pozicija 22-31, zamenjenim MAP sekvencom u kojoj se histidin nalazi na poziciji 26 (umesto lizina, koji se nalazi u standardnoj MAP sekvenci).

22 31 32 • i Ostale varijante prirodne sekvence su slično označene. (MAPi.io)""<J1>Pro"hPTHrP(l-32) odnosi se na 1-32 N-tenninahii kraj hPTHrP, sa MAP sekvencom na poziciji 22-31 i prolinom (umesto histidina) na poziciji 32. (MAPi.i0)<22>"<31>D-Orn<34>laktam hPTHrP(l-34)

odnosi se na 1-34 N-terminalnu sekvencu hPTHrP sa MAP sekvencom na pozicijama 22-31 i ornitinom na poziciji 34, sa laktamom formiranim između amino grupe bočnog lanca ornitina i karboksi terminusa. (MAPi-io)<22>'<31>hSer<34>hPTHrP(l-34)Thr His Ile Gln NH2odnosi se na 1-34 N-terminalnu sekvencu hPTHrP, sa MAP sekvencom na pozicijama 22-31, homoserinom na poziciji 34, dodatnom sekvencom Thr His Ile Gln na pozicijama 35-38 i karboksi terminusom u obliku primarnog amida.

Polipeptidi sa cikličnim vezama između amino kiselinskib ostataka su označeni tako što su dva povezana amino kiselinska ostatka navedena unutar uglaste zagrade kojoj prethodi oznaka "c". Uopšteno, veze između dve amino kiseline se formiraju između funkcionalnih grupa bočnih lanaca, najčešće kao amidna ili estarska veza. Tako se (MAPi.io)<22>~<31>c[Lys<13>, Asp17]hPTHrP(l-34)hSer34 lakton odnosi na 1-34 N-terminalni deo hPTHrP sa segmentom između pozicija 22-31 zamenjenim MAP sekvencom, sa amino kiselinom lizin na poziciji 13 u cikličnoj vezi sa karboksil bočnim lancem aspartata na poziciji 17, i dodatnim homoserinom na poziciji 34 sa laktonom forruiranhn između hidroksil grupom bočnog lanca homoserina i karboksi grupom C terminusa. Slično ovome, (MAPM0)<22>"<31>c[Lys<13>, Asp<17>]hPTHrP(l-34) označava 1-34 N-terminalni deo hPTHrP sa segmentom između pozicija 22-31 zamenjenim MAP sekvencom i amino bočnim lancem lizina na poziciji 13 ciklizovanim sa karboksi bočnim lancem aspartata na poziciji 17.

Izraz tchidiofilne amino kiseline (Haa)" odnosi se na amino kiseline koje imaju najmanje jednu hidrofilnu funkcionalnu grupu, pored onih koje su potrebne za formiranje peptidne veze, kao što su arginin, asparagin, aspartatna kiselina, glutaminska kiselina, glutamin, histidin, lizin, serin, treonin i na njihove homologe.

Izraz "lipofUne amino kiseline (Laa)" odnosi se na nenaelektrisane, alifatične ili aromatične amino kiseline, kao što su izoleucin, leucin, metionin, fenilalanin, triptofan, tirozin, vahn i na njihove homologe.

U svrhe ovog pronalaska, alanin je svrstan u grupu "amfifiličnih", to jest, kao amino kiselina koja se može ponašati bilo kao hidrofilna ili lipofilna.

Izraz "polipetidni analog PTHrP" označava polipeptide sa svim mogućim substitucijama, delecijama ili insercijama u odnosu na PTHrP ili na suštinski homolog PTHrP koji kao analog ima sličnu fiziološku aktivnost.

Izraz "fiziološki aktivan skraćeni analog PTHrP" odnosi se na polipeptid čija sekvenca poseduje manje od punog komplementa amino kiselina zastupljenih u PTHrP, ali koji izaziva slične fiziološke odgovore kao PTHrP, Skraćeni PTHrP analozi ne moraju biti potpuni homolozi sa PTHrP kako bi izazvali iste fiziološke odgovore. Najčešće će skraćeni analozi biti isečeni na C-terminusu i imaće 30 do 40 amino kiselina, pri čemu će PTHrP (1-32), PTHrP (1-34) i PTHrP (1-38) biti najpoželjnini, ali ne i jedini predstavnici ove gTupe. Načelno, analozi će imati konzervativne substitucije amino kiselina u skladu sa izvodljivim parametrima koji su već opisani.

Izraz "suštinski homolog", kada se odnosi na polipeptid, označava polipeptid sa najmanje oko 80 % homologije, najčešće oko 90 %, a poželjno 95 % homologije u odnosu na referentni polipeptid. Homologija polipetida se najčešće određuje primenom softverskog paketa za analizu sekvence aniino kiselina, (videti, na primer, Sequence Analvsis Softvvare Package of the Genetics Computer Group, Universitv of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705 USA).

Izraz "amfipatični a-heliks" odnosi se na sekundarnu strukturu koju pokazuju neki peptidi, u kojoj amino lđseline imaju a-spiralnu konfiguraciju, sa sučeljenim polarnim i nepolarnim grupama orijentisanim paralelno dužoj osi spirale. Amfipatične spiralne sekvence mogu dizajnirati stručnjaci koji se ovim bave. Naročito poželjne amfipatične spiralne sekvence za primenu u postupku ovog pronalaska su detaljnije opisane u, na primer, U.S.

Patent No. 5,589,452 ili WO 97/07815.

Ovaj pronalazak zasnovan je na otkriću da su neki analozi PTHrP, koji sadrže amfipatični a-heliks na pozicijama 22-31, efikasni u lečenju kostiju i zarastanju preloma. Amfipatični a-heliks je sastavljen od hidrofilnih amino kiselina (Haa) i lipofilnih amino kiselina (Laa) poredanih u sledećoj sekvenci:

Kada se najilustrativniji primeri ovog amfipatičnog heliksa ugrade u PTHrP sekvencu, naročito u N-terruinalne isečke čovečjeg PTHrP (amino kiselinski ostaci 1-32 do 1-38), nastali polipetidi su efikasni u lečenju kostiju i zarastanju preloma. Za razliku od PTH, PTHrP ili njegovi analozi koji nemaju ovakav amfipatični spiralni segment, analozi ovde primenjeni, ne uzrokuju hiperkalcemiju. Uz to, ovi analozi indukuju brž rast kosti u odnosu na PTH Mi PTHrP.

Biće pokazano daje, uz ugrađivanje amfipatičnog heliksa na pozicijama između 22 i 31, moguće izvršiti različite substitucije, delecije i insercije amino kiselina u sekvencu PTHrP van navedenog regiona, uz zadržavanje trodimenzionalne strukture polipeptida. Reprezentativne varijacije PTH ili PTHrP sekvence koje zadržavaju fiziološku aktivnost rezultirajućeg analoga su zaštićene u U S Patent Nos. 5,599,792, 5,556,940, 5,607,915 i 5,589,452, i WO 91/065564, WO 94/02510, WO 95/11697, WO 96/40193 i WO 97/07815. Dodatne varijante koje se mogu predpostaviti od stručnjaka, kako bi se održala fiziološka aktivnost, moguće je dobiti na osnovu naučno prihvaćenih tehnika modeliranja strukture proteina. Representativne metode za dobijanje ovih varijanti opisane su, između ostalog od strane I. Ladunga i R.F Smitha, Protein Eng., 3: 187-196 (1997) i M.J. Thompsona i KA. Goldsteina, u Proteins, 1: 28-37 (1996).

Supstitucione varijante su one u kojima je najmanje jedna amino kiselina u nativnoj

sekvenci uklonjena i zamenjena drugom amino kiselinom na istoj poziciji. Supstitucije mogu biti pojedinačne, kod kojih je zamenjena samo jedna amino kiselina, ili višestruke, kod kojih je dve ili više amino kiselina zamenjeno u istom molekulu. Smatra se daje moguća bilo koja konzervativna substitucija. Tako će analog koji nastaje supstitucijom jedne hidrofilne amino kiseline drugom hidrofilnom amino kiselinom, ili jedne hidrofobne amino kiseline, drugom hidrofobnom amino kiselinom, verovatno zadržati slična svojstva u lečenju kostiju kao i njegov prekursor. Supstitucije takođe uključuju PTHrP analoge u kojima je C-terminalni ostatak u obliku amida. Dodatne supstitucije mogu nastati dodavanjem ili uklanjanjem naelektrisanja koje nose amino kiseline. Svaka od ovi grupa može biti podeljena na podgrupe kako bi se dalje olakšala supstitucija.

Naelektrisane amino kiseline

Kiseli ostaci: aspartatna kiselina, glutaminska kiselina, 2-amino suberinska kiselina

Bazni ostaci: lizin, arginin, histidin, ornitin

Nenaelektrisane amino kiseline

Hidrofilni ostaci: serin, treonin, asparagin, glutamin, metionin

Alifatični ostaci: glicin, alanin, valin, leucin, norleucin, izoleucin

Nepolarni ostaci: cistein, homocistein, metionin, prolin

Aromatični ostaci: fenilalanin, tirozin, triptofan, histidin

S druge strane, supstitucije amino kiselina mogu se zasnivati na principu bioizosterizma. Ovakve bioizosterične supstitucije najčešće umanjuju efekte poremećaja konformacije koji mogu nastati uvođenjem nasumičnih susptitucija. Metodom skeniranja alanina moguće je odrediti pozicije na kojima bi izosteiična substutucija dala varijantu sa nepromenjenom fiziološkom aktivnošću, (videti, na primer: K.H. Pierce Jr., M.H. Ultsch, R.F. Kelley, A.M. de Vos i J.A. VVells, Biochemistrv, 35 (32): 10300-10307 (1996) i B. Li, J.Y. Tom, D. Oare, R. Yen, W.J. Fairbrother, J.A. Wells i B.C. Curmingham, Science, 270: 1657-1660 (1995)). Reprezentativne izosterične amino kiseline prikazane su u narednoj tebeli:

Delecione varijante su one kod kojih je iz nativne sekvence uklonjena jedna ili više amino kiselina. Najčešće će delecione varijante imati jednu ili dve amino kiseline uklonjene iz određenog regiona molekula. Verovatno je da će delecije biti načinjene na krajevima sekvence, naročito na karboksi kraju molekula. Tako, iako su poželjni PTHrP (1-34) fragmenti, sekvence koje su dodatno skraćene na karboksi kraju takođe pokazuju efekte u zaceljivanju kosti.

Insercione ili aditivne varijante su one koje sadrže amino kiselinu ugrađenu neposredno pored amino kiseline na određenoj poziciji u nativnoj sekvenci. Neposredno pored amino kiseline, znači vezano za bilo a-karboksi ili a-amino grupu amino kiseline. Adicione ili insercione varijante će najverovatnije biti načinjene na krajevima sekvence, opet najčešće na karboksi kraju molekula.

Od svih navedenih modifikacija nativne sekvence, najpoželjnije su supstitucije i adicije i delecije na karboksi kraju molekula.

Polipeptidni PTHrP analozi koji se primenjuju u lečenju kostiju, kao što je to ovde opisano, uopšteno su opisani delom u U.S. Patent No. 5,589,452 i WO 97/07815. Dodatni analozi uključuju ciklične analoge N-terminalnog hPTHrP(l-32), hPTHrP(l-34) i hPTHrP(l-38), koji sadrže MAP sekvencu između pozicija 22 i 31 i opcionalno, sadrže amino kiseline na pozicijama 13 ili 17 i/ili 26 i 30 povezane preko svojih bočnih funkcionalnih grupa. Biće jasno stručnjaku da mnoge supstitucije na pozicijama 13 i 17 omogućavaju ciklizaciju između ostataka na ove dve pozicije.

PTHrP analozi bilo koje vrste sisara, na primer, čovečji, goveđi, svinjski ili zečji analozi mogu se primeniti u svrhe ovog pronalaska, iako je poželjno da to bude PTHrP humanog porekla. Stručnjak u ovoj oblasti će uočiti da su supstitucione, delecione i insercione varijante poželjnih primera pobrojanih ispod, u skladu sa već opisanim prihvaćenim principima , takođe predmet ovog pronalaska.

Poželjni primeri ovog pronalaska obuhvataju primenu analoga hPTHrP(l-34) sa MAP sekvencom na pozicijama 22-31, naročito onih koji sadrže pozitivno naelektrisanu amino kiselinu na poziciji 26, na primer lizin ili histidin. Specifični primeri unutar ove klase su:

Ostali poželjni primeri obuhvataju primenu analoga hPTHrP(l-34) sa MAP sekvencom na pozicijama 22-31 i sa mono- ili bicikličnom substrukturom nastalom ciklizacijom između funkcionalnih grupa aruino kiselina bočnih lanaca, naročito između ostataka na pozicijama 13 i 17 ili između ostataka 26 i 30. Funkcionalne grupe bočnih lanaca su najčešće amino, hidroksi ili karboksi grupe, a ciklizacija se obavlja putem formiranja amidne ili estarske veze. Amino kiselinski ostaci sa amino grupom na bočnom lancu uključuju li^ ti i omitin. Ostaci sa karboksi grupom na bočnom lancu uključuju aspartatnu kiselinu i glutaminsku kiselinu. Specifični primeri unutar ove klase su:

Ostali PTHrP analozi koji se mogu primeniti u ovom pronalasku su N-terminalne sekvence od 30 do 50 ostataka, poželjno od 1-32, 1-33, 1-34, 1-35, 1-36, 1-37 i 1-38, koje sadrže MAP sekvencu na pozicijama 22-31 i opcionalno sadrže jednu ili više supstitucija na pozicijama 5, 13, 17, 19, 26, 30, 32 ili 34. Specifični primeri unutar ove klase obuhvataju:

Načelno, svi polipeptidi koji su suštinski homologi ovde opisanim specifičnim primerima mogu se primeniti u postupku pronalaska. Obično će polipeptidi u ovom pronalasku imati najmanje oko 50 %, poželjno u većini oko 80 % ili više, još poželjnije oko 90 %, i najpoželjnije preko 95 % homologije sa ovde opisanim specifičnim primerom. Dužina polipeptidne sekvence koja pokazuje homologiju biće najmanje oko 20 arnino kiselina, obično najmanje oko 24 ostatka, najčešće oko 30 ostataka, a poželjno između 32 i 40 ostataka.

Jedinjenja primenjana u ovom pronalasku moguće je dobiti primenom metoda opisanih u U.S. patent No. 5,589,452 i WO 96/40193 i WO 97/07815. Ova jedinjenja se načelno dobijaju metodom sinteze u čvrstoj fazi, u rastvoru ili primenom rekombinantnih metoda koje obuhvataju kloniranje i ekspresiju gena koji kodira željeni polipeptid, a sve su dobro poznate ekspertu iz ove oblasti. Sinteza u čvrstoj fazi je poželjan metod za skraćene PTHrP analoge dužine do 40 amino kiselina. Analozi sa ciklizovanim bočnim lancima načelno se dobijaju skupljanjem kompletno zaštićenog polipeptida na smolu, uklanjanjem zaštitnih grupa i izazivanjem cikizacije odgovarajućim kuplujućim agensom, kao što je benzotriazol-l-il-oksitris(pirohdino)fosfonium heksafluorofosfat (PyBOP) neposredno pre otpuštanja polipeptida sa smole.

Opisani postupak lečenja može biti primenjen u lečenju preloma kostiju i hirurških presecanja (osteotomija), uključujući kako srasle, tako i prelome koje nisu srasli. Tipovi preloma kosti koje je moguće lečiti postupkom ovog pronalaska obuhvataju traumatske prelome i prelome kostiju nastale usled osteoporoze, na primer, prelome kuka, vrata butne kosti, ručnog zgloba, kičmenih pršljenova, kičme, rebra, grudne kosti, grkljana i traheje, radijusa/lakatne kosti, podkolenice, čašice, ključne kosti, karlice, ramena, noge, prstiju na ruci i nogama, kosti Uca i gležnja. Ostale primene obuhvataju olakšavanje fuzije zglobova, na primer, fuziju pršljenova, gležnja i stopala, lakta, kuka i hrskavice kukova, kolena i ramena. Terapija analozima PTHrP, kako je ovde opisano, je takođe indikovana u kombinaciji sa artroplastičnim procedurama (uključujući revizuju artroplastija) kuka, kolena, ramena/lakta itd. Zarastanje kostiju je moguće poboljšati i u nekim hirurškim zahvatima, kao što su kranio-i maksilofacijalna hirurgija, dentalna hirargija i odstranjenja otoka stopala. Pokazano je da PTHrP analozi ubrzavaju endohondrijalno zaceljivanje kosti (Primeri 1 i 2) koje se odvija formiranjem hrskavičavog kalusa, kao i intramembranozno srastanje kosti (Primer 3), koja ne zahteva prolazno formiranje kalusa. Intramembranozno srastanje kosti je naročito primenljivo u slučajevima u kojima je srastanje preloma odloženo, na primer, kod dijabetičara, pušača, starih i anemičnih pacijenata i kod pacijenata koji su pod terapijom kortikosteroidima (naročito pod hroničnom terapijom glukokortikoidima), hroničnom NSAID ili imunosupresivnom terapijom.

Specifična doza PTHrP analoga potrebna da olakša srastanje kosti u skladu sa ovim pronalaskom zavisiće od ozbiljnosti stanja, načina primene i drugih srodnih faktora o kojima će odluku doneti nadležni lekar. Najčešće će doza varirati između 0.0li 10 u.g/kg telesne težine na dan, poželjno od 0.1 do 0.5 ug/kg telesne težine na dan. Za osobu težine 50 kg dnevna doza aktivne supstance je oko 0.5 do 100 ug, poželjno od oko 5 do oko 10 ug. Ova doza biće primenjena u konvencionalnoj farmaceutskoj smeši kroz jednokratnu ili višekratnu primenu, ili putem kontrolisanog oslobađanja, onda kada je potrebno postići najjače efekte. Primena će trajati sve dok je to medicinski indikovano, zavisno od ozbiljnosti povrede, što može potrajati od nekoliko nedelja do nekoliko meseci.

Za razliku od većine sada dostupnih postupaka lečenja preloma, PTHrP analozi se mogu primenjivati sistemski. Reprezentativni režim primene uključuje oralnu, parenteralnu (uključujući potkožnu, intramuskulamu i intravensku), rektalnu, usnu (uključujući sublingvalnu), transdermalnu, pulmonalnu i intranasalnu. Tipični pulmonalni i respiratorni načini primene opisani su u U.S. Patent No. 5,607,915. Nazalna primena PTHrP analoga opisana je u WO 97/078155. U terapijski postupak ovog pronalaska uključena je i sistemska primena PTHrP analoga, zajedno sa lokalnim primenom drugog agensa koji deluje na zaceljivanje kostiju. Reprezentativni agensi za ovakvu lokalnu primenu obuhvataju koštane morfogenetske proteine (BMP-2 i BMP-7), osteogenetske proteine (OP-1), faktore rasta, kao što su TGF-pi, i citokine, kao što je IFN-p. Najčešće se ovi agensi primenjuju lokalno u različitim nosačima, kao što su hidroksiapatit i/ili kalcijum karbonat i amilopektin. Sistemska primen PTHrP analoga može biti kombinovana sa drugim metodama lečenja kostiju, kao što su mehanička i biofizička stimulacija, na primer, električna ili ultrazvučna.

PTHrP analozi će najčešće biti primenjeni u farmaceutskom sastavu u smeši sa farmaceutski prihvatljivim, neškodljivim nosačem. Kao što je pomenuto, ovakve smeše moguće je pripremiti za parenteralnu primenu (podkožnu, intramuskulamu ili intravensku), naročito u obliku tečnih rastvora ili suspenzija; za oralnu ili usnu primenu, naročito u obliku tableta ili kapsula; za intranazalnu primenu, naročito u formi praha, kapi ili aerosola: i za rektalnu ili transdermalnu primenu.

Tečne smeše za pareneterahnu primenu mogu kao nosač sadržati sterilnu vodu ili slanu vodu, alkilen glikole, kao što je propilen glikol, zatim polialkilen glikoL kao što je polietilen glikol, ulja prirodnog porekla, hidrogenovane naftalene i slično. Moguće je primeniti blago kisele pufere u opsegu pH vrednosti između 4 i 6. Pogodni puferi su acetatni, askorbatni i citratni, u koncentracijama od oko 5 mM do oko 50 mM. Za oralnu primenu, smeše mogu biti obogaćene dodavanjem žučnih soli ili acilkamitina. Smeše za nazalnu primenu mogu biti u čvstom stanju i sadržavati inertni nosač, na primer, laktozu ili dekstran, ili mogu biti u obliku tečnih ili uljanih rastvora i primenjivati se kao kapljice ili sprej. Neke nazalne smeše sadrže suve praškove pogodne za konvencionalne inhalatore praška (DPI), tečne rastvore ili suspenzije pogodne za pakovanje u obliku spreja i smeše pogodne za punjenje doznih inhalatora (MDI). Za usnu primenu uobičajeni nosači obuhvataju šećere, kalcijum stearat, magnezijum stearat, preželatinizirani škrob i slično.

Kod smeša za nazalnu primenu, apsorpciju kroz mukoznu membranu nosa moguće je poboljšati deterdžentskim kiselinama, kao što su na primer, dezoksmolinska kiselina, henodezoskmolinska kiselina, deMdroholinska kiselina, glikodezoksiholinska kiselina, ciklodekstrini i slično, u količinama u opsegu između oko 0.2 i 15 težinskih procenata, poželjno između 0.5 i 4 težinska procenta, najpogodnije u količini od oko 2 težinska procenta.

Primenu jedinjenja koje su predmet ovog pronalaska osobama tokom dužeg vremenskog perioda, na primer, perioda od jedne nedelje do jedne godine, moguće je postići jednokratnom primenom sistema za kontrolisano oslobađanje koji sadrži dovoljnu količinu aktivne supstance za odgovarajući period vremena. Moguće je primeniti različite sisteme za kontrolisano oslobađanje, kao što su monolitičke mikrokapsule ili mikrokapsule tipa rezervoara, implante, osmotičke pumpe, vezikule, micele, lipozome, transdermalne flastere, jontoforetske sprave i druge forme dozera koji omogućavaju injektovanje. Dodatna karakteristika nekih sistema za kontrolisano oslobađanje je mogućnost određivanja lokacije na kojoj će aktivni sastojak biti primenjen, što može biti značaja za neke vrste poremećaje.

PRIMERI

Lečenje segmentnog preloma primenom PTHrP analo<g>a

Modifikacija eksperimentalnog modela presečene butne kosti pacova pokazala je da PTHrP analozi olakšavaju zaceljivanje kosti i zarastanje preloma. (T.A. Einhornet al.J. Bone Joint, 66: 274-279(1984)).

Mužjaci pacova soja Sprague-Dawley težine oko 300 g hranjeni su preparatom Laboratory Rodent Diet 5001 (PMI Feeds, St. Louis, MO, USA) i imali su slobodan pristup vodi. 12 sati pre operacije sve životinje primale su samo vodu. Životinje su anestezirane pre operacije D? injekcijom ketamina (80 mg/kg) i ksilazina (5 mg/kg). Jednokratna doza prokain penicilina data je intramuskularno, kako bi se sprečila infekcija.

Bočnim pristupom butnoj kosti, prethodno izbušena polietilenska pločica visoke gustine fiksirana je duž anteriornog korteksa butne kostu. Pokosnica butne kosti je tokom ovog postavljanja u velikoj meri skinuta. Segmentno oštećenje nekritične dužine od 1 mm načinjeno je u srednjem delu tela butne kosti. Rana je zatvorena najlonom i luomiranim nitnama.

Nakon operacije, životinje su stavljene u kaveze u kojima su imale 48-osmo časovni pristup hrani. Životinje su posmatrane najmanje jednom dnevno, a one koje su pokazivale znake bolesti bile su pregledane i data im je odgovarajuća terapija, ukoliko je bilo potrebno.

Pacovi su podeljeni u grupe, kao što je to pokazano u Tabeli 1, a od prvog postoperativnog dana potkožno su primili bilo kontrolni nosač (slana voda) ili PTHrP analog, kao što je to ovde opisano. Radiografske analize vršene su jednom nedeljno. Životinje su žrtvovane posle 6 nedelja, nakon čega su radiografski upoređivane.

Sedirane životinje postavljene su u ležeći položaj sa zadnjim ekstremitetima okrenutim ka spolja. Svake nedelje, počev od prve postoperativne nedelje, načinjene su serijske radiografije svake butne kosti (presečene i kontralateralne butne kosti). Senka aluminijumskog modela poznate gustine uključena je u svaku radiografiju radi kalibracije. Svaka radiografija postavljena je na translurninescentnu ploču, nakon čega je radiografija snimljena uz pomoć DCS 420 digitalne Kodak kamere. Dobijene slike prebačene su u Gateway 2000 IBM kompatibilni kompjuter i digitalizovane su primenom analizatorskog programskog paketa (Sigma Scan©). Ocrtane su konture oštećenja i izmerene su srednje vrednosti relativne gustine u oblasti preloma u odnosu na kontrolne životinje. Slika 1 pokazuje povećanje koštane gustine kod tretiranih životinja u odnosu na kontrolne životinje u nedeljnim intervalima tokom prvih pet nedelja tretmana. Prosečna gustina presečene kosti upoređena je sa prosečnom gustinom kontralateralne butne kosti za svaku nedelju snimanja. Slika 2 pokazuje relativan odnos radiografskih gustina nakon šest nedelja. Upoređivanje gustina kosti pokazuje da PTHrP analozi imaju efekat u zaceljivanju kosti. Nakon žrtvovanja (6 nedelja) izvršena je disekcija burnih kosti (eksperimentalne i kontralateralne) od mekog tkiva. Načinjene su radiografije butne kosti visoke rezolucije iz bočnog plana. Prelom se smatra zaceljenim onda kada postoji kontinuitet butne kosti na više od 25 % dijametra poprečnog preseka oštećenja. Poređenje burnih kosti tretiranih životinja sa kontrolnim životinjama pokazalo je da PTHrP analozi ubrzavaju zaceljivanje kosti i srastanje preloma. Slika 3 pokazuje reprezentativne radiografije kontrolnih (SI. 1A) i tretiranih životinja (SI. 1B).

PRIMER 2

Zaceljivanje kosti u modelu zatvorenog preloma primenom PTHrP analoga

Primenjeni model zatvorenog preloma je Bonnarens/Einhomov model. (F. Bonnarens i T.A. Eunhom, J. Orthopaedic Research, 2: 97-101 (1984)). Korišćeni eksperimentalni

pacovi opisani su u Primeru 1. U ovom modelu, intramedulami štap postavljenje retrogradno kroz distalni deo butne kosti medijalnim parapatelarnim pristupom. Artrotomija je zatvorena neresorbilnim šavom, a intramedulami štap ostavljen je na mestu. Potom je načinjen zatvoren

transverzalni prelom uz pomoć, za tu svrhu napravljene stege sa tri tačke oslonca. Životinje su praćene, a radiografske analize su načinjene kao u primeru 1. U ovom modelu preloma, PTHrP analozi ubrzali su zaceljivanje kosti i srastanje preloma u odnosu na kontrolne životinje.

PRIMER 3

Intramembranozno zaceljivanje kosti primenom PTHrP analoga

Zečevi su anestezirani i podvrgnuti operaciji kojom su načinjena četiri površinska oštećenja, po jedan na distalnom delu obe butne kosti i po jedan na proksimalnom delu tibie (cevanice). Posteriomi lateralni operativni rez dužine oko 3 cm načinjen je kako bi se oslobodile distalne lateralne butne kondile. Kost, proksimalno prema kolenskom zglobu je oslobođena i na njoj je izbušena 5-milimetarska rupa, uz stalno hlađenje vrha svrdla kvašenjem. Rana je isprana slanom vodom. Duboko tkivo je zatvoreno uzastopnim 3-0 hromiranim šavovima, zatim zatvaranjem subtikularnog sloja uzastopnim najlonskim šavovima i sa tri do četiri isprekidane kopče od nerđajućeg čelika. Drugi rez dužine 3 cm napravljen je preko medijalne proksimalne cevanice, a rupa od 5 mm probušena je na proksimalnoj medijalnoj cevanici. Rana je zatvorena kao što je već opisano. Celokupna procedura ponovljena je na kontralateralnom ekstremitetu.

Pripremljeni su štok rastvori PTHrP analoga C, (MAP1.io)<22>"<31>His<26>hPTHrP(l-34) NH2, i PTHrP analoga D, (MAPM0)<22>"<31>hPTHrP(l-34) NH2koncentracije 800 ug/ml, sterilnom filtracijom kroz 0.22 um filtre, a neposredno pre primene ovi rastvori su razblaženi nosačem do koncentracije od 20 ug/ml ili 100 ug/ml. Nosač je sadržao 30 mg/ml manitola, 30 mg/ml saharoze, 0.12 mg/rnl Tween™ 80, 0.17 mg/ml sirćetne kiseline i 2.33 mg/ml natrijum acetat trihidrata. PTHrP analozi u dozama 2 ug/kg/dan ili 10 ug/kg/dan primenjeni su dnevno putem subkutane injekcije hirurški tretiranim životinjama.

Životinje su radiografisane jednom nedeljno tokom trajanja ispitivanja. Denzitometrijska merenja su izvršena primenom transluruinacionog skenera i komjuterskog programskog paketa MetaMorph™ (Universal Imaging, West Chester, PA). 10. i 21. postperativnog dana urađene su radiografije donjih ekstremiteta rotiranih na spolja i prema

unutra. Životinje su žrtvovane 30. postoperativnog dana. Na kraju ispitivanja, životinje su eutanazirane visokom dozom pentobarbitala, tkiva su odvojena od kosti, a leve i desne butne kosti i cevanice su radiografski i histološki analizirane.

Kod životinje koje su tretirane PTHrP analozima C i D uočeno je brže intramembranozno formiranje kosti u poređenju sa životinjama koje su tretirane nosačem. Rezultati efekta PTHrP analog D na burnu kost i cevanicu prikazani su na Slici 4A, odnosno 4B. 21. dana ruje bilo kompletnog zaceljenja oštećenja ni butne kosti ni cevanice kod kontrolnih životinja, dok je 40 % oštećenja butne kosti i cevanica bilo zaceljeno u grupi koja je tretirana nižom dozom analoga. U istoj vremenskoj tački, kod životinja tretiranih višom dozom uočeno je zarastanje 75 % oštećenja cevanice i 50 % oštećenja butne kosti. Nakon žrtvovanja radiografske analize uzoraka potvrdile su povećanje zaceljenja kod PTHrP tretiranih životinja, pri čemu je više od 85 % cevanica, u grupi životinja tretiranih višom dozom, bilo ispunjeno mineralnim tkivom, dok je kod kontrolnih životinja manje od 10 % oštećenja cevanica bilo ispunjeno mineralnim tkivom (p < 0.01). Slično ovome, značajno veći procenat mineralizacije u predelu oštećenja uočen je kod butnih kosti tretiranih PTHrP analogom nego kod butnih kosti kontrolnih životinja (p < 0.01).

PRIMER 4

Ubrzano zaceljivanje u modelu preloma lakatne kosti

Cilj ovog eksperimenta bio je da se pokaže da PTHrP analozi mogu povećati biomehaničku jačinu (I Deo) i kinetiku zaceljenja (II Deo) u kontekstu sistemske terapije kortikosteroidima u modelu hirurškog presecanja kosti kod zeca.

U svim eksperimentima korišćeni su odrasli mužjaci zeca soja New Zealand White. U I Delu, 10 zečeva podeljeno je u dve jednake grupe, dok je u II Delu, 20 zečeva podeljeno u dve jednake grupe. Kod svakog zeca načinjena su bilateralna oštećenja lakatne kosti nekritične veličine (1 mm). Dva meseca pre operacije sve do šeste postoperativne nedelje, sve životinje primale su dnevno jednu potkožnu injekciju prednisona (0.15 mg/kg) rastvorenog u sterilnoj vodi ili injekciju sterilne slane vode (kontrolna grupa). Počev od prvog postoperativnog dana, životinje eksperimentalne grupe primale su dnevnu potkožnu injekciju PTHrP analoga D (0.01 mg/kg), dokje kontrolna grupa primala injekcije obične slane vode. U I Delu životinje su žrtvovane šeste nedelje nakon izvršenog hirurškog preloma. U II Delu životinje su žrtvovane kada je radiografski uočeno bilateralno srastanje oštećenja ili, u slučajevima kada do srastanja nije došlo, desete postoperativne nedelje.

U oba eksperimentalna seta radiološka jačina i površina zaceljenja analizirane su svake druge nedelje počevši od druge (I Deo) ili četvrte (U Deo) postoperativne nedelje. Načinjene su serijske radiografije prednjih ekstremiteta, digitalizovane su, a površina kosti kvantifikovana je primenom analizatorskog programskog paketa (Sigma Scan Pro). Određivanje mineralnog sastava novoformirane kosti na mestima preloma i nastanka kalusa vršeno je primenom fotodenzitometrije. Nakon žrtvovanja načinjene su faxitron radiografije visoke rezolucije anteroposteriomog i lateralnog plana oba ekstremiteta, što je omogućilo ispitivanje dimenzija i veličina kalusa.

Rezultati - (I Deo)

Devet od deset ekstremiteta životinja tretiranih PTHrP D analogom sraslo je u toku šest nedelja, dokje u grupi kontrolnih životinja taj broj bio samo dva od deset. Ovi rezultati prikazani su na Slici 5. U šestoj nedelji i anteroposteriomi i lateralno snimljeni faksitroni tretiranih životinja pokazali su značajno veći intenzitet na mestu preloma u poređenju sa kontrolnim životinjama. Slično, intenzitet proksimalne i distalne diafize lakatne kosti bio je značajno veći kod tretiranih ekstremiteta. Intenzitet spoljašnjih kalusa takođe je bio veći kod ekstremiteta tretiranih životinja. Biomehanički, torziona jačina tretiranih ekstremiteta značajno je veća nego kod kontrola tretiranih nosačem, kako u pogledu krutosti, tako i u pogledu maksimalne torzije.

Rezultati (11 Deo)

U četvrtoj nedelji ekstremiteti tretiranih životinja imali su veći radiografski intenzitet od kontrolnih ekstremiteta, kako na mestu preloma (p< 0.01), tako ina spoljašnjimkalusima i dijafizama lakatne kosti. Ukupna površina kalusa tretiranih ekstremiteta bila je veća (p< 0.05), a postojao je i treud smanjenja veličine mesta preloma. U šestoj nedelji,in vivoradiografija pokazala je trend povećanja intenziteta na mestu preloma kod tretiranih ekstremiteta u poređenju sa kontrolnim ekstremitetima, iako nisu uočene razlike u pogledu intenziteta i površine kalusa. Radiografski, svi ekstremiteti tretirani PTHrP analogom smatrani su sraslima i sve ove životinje žrtvovane su u šestoj postoperativnoj nedelji. U osmoj nedelji radiografija je pokazala da su još četiri ekstremiteta (2 životinje) srasla i ove su životinje žrtvovane. Preostale životinje žrtvovane su u desetoj nedelji, s obzirom da radografija nije pokazala napredak u srastanju u odnosu na prethodne četiri nedelje, pa su ovi ekstremiteti smatrani nesraslima. Ekstremiteti tretirani PTHrP analogom imali su veći radiografski intenzitet na mestu preloma (p< 0.05), kao i lakatne dijafize i površinu kalusa. Površina preloma bila je značajno manja kod ekstremiteta tretiranih PTHrP analogom nego kod kontrolnih ekstremiteta. To znači da u modelu kortikosteroidima indukovanog odloženog srastanja, tretman PTHrP analogom rezultira kompletnim srastanjem kosti u toku 6 nedelja, dok u kontrolnoj grupi, 75 % netretiranih ekstremiteta ne pokazuje tendenciju srastanja posle deset nedelja.

Prilog br. 3

Poređenje ( MAP). iq) 22~ 31hPTHrP analoga iz predmetnog pronalaska sa goveđim PTH i

hPTHrP u studiji kontinualne infuzije

Pre početka istraživanja mlade adultne ženke pacova (stare tri meseca) lažno su operisane ili su im uklonjeni jajnici (ovarijektomisane).

Sedamnaestog dana nakon lažne operacije/ovarijektomije, životinjama je u nučalnom regionu potkožno implantirana Alzet osmotska mini-pumpa (Model 2001),

koja je sadržala rastvarač (koji se sastoji od 30 mg /ml manitola, 30 mg/l saharoze, 0.12 mg/ml Tween 80, 0.17 mg/ml sirćetne kiseline, 2.33 mg/ml natrijum acetat trihidrata u vodi) ili rastvarač plus jedinjenje koje se isporučuje u dozi od 40 ug/kg/dan. Svakih 6-7 dana životinjama su implantirane sveže napunjene pumpe, tako da su životinje primile ukupno 3 pumpe tokom 20 dana tretmana.

Tokom ovog tretmana uzorkovani su krv i serum životinja za određivanje nivoa kalcijuma primenom standardnih metoda.

Pacovi koji su tretirani goveđim PTH uginuli su pre 18 dana tretmana. Nivo kalcijuma u serumu ovih životinja pre uginuća bio je 13.92. Pacovi tretirani sa hPTHrP preživeli su tretman i nivo kalcijuma u serumu ovih životinja bio je 10.26.

Naredni (MAPi.|0)<22>"<31>hPTHrP analozi preživeli su tretmaljen i imali su navedene nivoe kalcijuma u serumu na 17/18:

Claims (9)

1. Primena polipeptidnog analoga peptida srodnog paratireoidnom hormonu (PTHrP) i njegovih soli, pri čemu su amino kiseline na pozicijama 22 - 31 naznačenog PTHrP analoga u formi amfipatičnog cc-heliksa Glu Leu Leu Glu Xaa Leu Leu Glu Lys Leu, gde je Xaa neki pozitivno naelektrisani amino kiselinski ostatak, za pripremu medikamenata za zaceljivanje kostiju i srastanje preloma.

2. Primena iz zahteva 1, naznačena time što je Xaa lizin ili histidin.

3. Primena iz zahteva 2, naznačena time što je PTHrP analog:

4. Primena iz zahteva 1, naznačena time što PTHrP analog poseduje najmanje dve amino kiseline međusobno povezane svojim bočnim lancima.

5. Primena iz zahteva 4, naznačena time što se međusobno povezane amino kiseline nalaze na pozicijama 13 i 17 ili na pozicijama 26 i 30.

6. Primena iz zahteva 5, naznačena time što je amino kiselina na poziciji 17, aspartatna kiselina.

7. Primena iz zahteva 6, naznačena time što su PTHrP analozi: ili

8. Primena iz zahteva 1, naznačena time što je PTHrP analog neki N-terminalni odsečak od oko 30 do 50 amino kiselinskih ostataka, sa opciono supstituisanim amino kiselinama na pozicijama 5, 13, 17, 19, 26, 30, 32 i/ili 34.

9. Primena iz zahteva 8, naznačena time što je PTHrP analog: