CN101600735A - 具有环状构象的截短的pth多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供PTH肽，其为截短的PTH片段PTH(1－17)的环化取代类似物，且优选保留了期望的或相似的人类PTH(1－34)的生物学活性。

Description

具有环状构象的截短的PTH多肽
发明领域
本发明涉及具有环状结构特征的肽PTH(1-17)的取代类似物，以及制备该类似物的方法及其医药用途。
发明背景
甲状旁腺激素
甲状旁腺激素(PTH)为具有84个氨基酸的肽，是人体内离子化血钙的主要调节物。(Kronenberg，H.M.等人，Handbook of ExperimentalPharmacology，Mundy，G.R.和Martin，T.J.(编)，185-201页，Springer-Verlag，Heidelberg，1993)。另外知道，全长PTH在间歇施用时促进骨的合成(Dempster，D.W.，等人，Endocr.Rev.，14：690-709，1993)。
在动物实验中已显示PTH(1-34)和PTH(1-84)有效增加骨矿物质密度和骨强度。此外，用这些PTH变体治疗骨质疏松患者能够降低新的骨质疏松性骨折的发病率(Greenspan，S.L.等人，Ann.Intern.Med.，146：326-339，2007和Neer，R.M.等人，N.Engl.J.Med.344：1434-1441，2001)。
尽管用PTH(1-84)和PTH(1-34)治疗促进骨强度和预防骨折，但是每次给药后引起的瞬时钙动员和高血钙(通常伴随恶心)限制了其耐受性。并且这些肽无法通过口服或跨粘膜(transmucally)摄入，而只能每日注射摄入。
此外，截短的PTH类似物再三地未能诱发骨合成作用(Murrills，R.J.等人，Bone 35：1263-1272，2004和Rhee，Y.等人，Yonsei Med.J.，47：214-222，2006)。一个例外是环状、但仍然相对大的C端截短的类似物Ostabolin(hPTH(1-31))(Whitfield，J.F.等人，Calcif.Tissue Int.，60：26-29，1997)。
骨质疏松症
绝经后骨质疏松症是骨骼疾病，其特征在于骨密度和强度的降低，与增高的骨折风险相关(Lane等人，Clin.Orthop.Relat.Res.，139-50，2000；Christiansen，Bone，17：513S-6S，1995)。骨质疏松性骨折最常发生在椎骨、臀部或股骨颈。由于痛苦、长期活动不便及恢复差，这些骨折严重损害了患者的生活质量。
在人体中骨是高度活跃的组织。骨由两类细胞不断重建着：再吸收骨的破骨细胞和形成骨的成骨细胞。当骨再吸收超过骨形成，就发生骨丢失，可能发展成为骨质疏松症(Seeman和Delmas，N.Engl.J.Med.354：2250-61，2006)。骨质疏松症通常在骨折发生后最先得到诊断。
绝经后雌性激素的缺乏是该疾病的最常见原因，因为雌性激素能够缩短破骨细胞的寿命。产生骨质疏松症的其他主要风险因素包括：低钙摄取、维生素D缺乏、I型糖尿病、类风湿性关节炎、长期使用药物如抗惊厥药和皮质类固醇、以及男性中的睾丸激素水平低。
PTH类似物的信号传导和骨合成活性
PTH作用于PTH/PTHrP受体(PTH1R)，其为与II类G蛋白偶联的具7次跨膜结构域的受体，并与腺苷酸环化酶/cAMP偶联(J üppner，H.等人，Science，254：1024-1026，1991)。此受体的其他信号通路已得到描述，如细胞内钙的增加、依赖和非依赖于磷脂酶C的蛋白激酶C的活化。缺失分析的研究表明PTH的N-端残基在刺激PTH1R以活化cAMP及IP3信号通路中起决定性作用。经PTH1R的信号传导似乎取决于多种参数，包括细胞类型、受体密度及其他。导致对骨的生物活性的信号传导机制仍未得到完全的阐述。人们认为通过cAMP的PTH1R cAMP信号传导对PTH类似物的骨合成作用是必要但不充分的。
因此，间歇施用全长PTH(PTH(1-84))和众所周知的全活性片段PTH(PTH(1-34))已在临床上证实了其骨合成活性(Grenspan，S.L.等人，Ann.Intern.Med.146：326-339，2007；Neer，R.M.等人，N.E.J.M.，344：1434-1441，2001)。相反的，对具有骨合成性质的更小类似物的探索则大多是不成功的。C端截短、长度至少为28个氨基酸的类似物已显示在骨质疏松症的动物模型中具有合成作用(Whitfield J.F.等人，J.BoneMiner.Res.，15：964-970，2000)。然而，进一步的截短则导致骨合成活性的完全丧失，即使其仍然保留对PTH1R的cAMP通路的激动活性(Murrills R.J.等人，Bone，35：1263-72，2004)。
尽管仅具有11个氨基酸的短类似物能够以低效力活化PTH1R(WO04/067021)，但对这些类似物的骨合成活性未有报导且不具期望。
在WO 03/009804和WO 04/093902中提出，在PTH(1-14)类似物的1和3位引入α-螺旋稳定氨基酸提高该化合物刺激cAMP累积的能力。最有效的化合物鉴定为[Ac5c1，Aib3，Gln10，Har11，Ala12，Trp14]PTH(1-14)([Ac5c1，Aib3]MPTH(1-14))。但这些类似物并未显示骨合成活性。尽管紧密相关的类似物[Aib1,3，Phe7，Nle8，Arg11，Ala12，Trp14]PTH(1-14)体外活化pTH1R，但该肽对于卵巢切除的大鼠的骨未显示任何骨合成活性(Rhee，Y.等人，Yonsei Medical Journal，47：214-222，2006)。此外，在卵巢切除的大鼠模型中，PTH(1-29)显示的骨合成活性比PTH(1-34)的效力低约20倍，而PTH(1-21)的修饰形式([Ala1,3，Nle8，Gln10，Har11，Trp14，Arg19，Tyr21]rPTH(1-21)(MPTH(1-21))则无活性(Murrills，R.J.等人，(2004)Bone，35，1263-1272)。总之，仅凭PTH1R对cAMP信号通路的体外激动活性完全无法预测体内的骨合成活性。
细胞色素P450酶系
细胞色素P450(CYP)酶系包括超过50种人同种型，其中的5种(CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4)行使了95％的经CYP酶系的药物代谢功能(P.Anzenbacher和E.Anzenbacherová，Cell.Mol.Life Sci.，58：737-47，2001)。经CYP酶系代谢和/或抑制CYP酶系的药物的共施用，能够导致药物和/或中间有毒代谢物在体内的累积，从而诱发严重的副作用。因此，FDA建议表征所有新化学实体与CYP的相互作用(guidance for industry“drug metabolism/drug interactionstudies in the drug development process：studies in vitro”U.S.Food andDrug Administration，1997年4月)。一种CYP同种型，CYP2D6，预期行使了25％的经CYP的所有药物代谢。CYP2D6抑制的潜在严重性是观察到的硫利达嗪(thioridanzine)的心脏毒性，这表明了与CYP2D6抑制相关的药物的潜在风险(Llerena A.等人，J.Phychopharmacol.，16(4)：361-4，2002)。
发明概述
广泛地说，本发明提供PTH肽，其为C端截短的PTH片段(例如PTH(1-17))环化的取代类似物，且该肽优选保留了人类PTH(1-34)期望的生物学活性。在本发明的一些实施方案中，提供的环状PTH肽为二聚体形式。可选地或另外地，本发明提供PTH类似物，其对CYP450酶的干扰低，并/或具有导致在成年脊椎动物中形成矿化骨的骨合成活性。本发明中的肽类似物相对于PTH(1-34)尺寸较小，可以应用于口、鼻或肺施用的制剂。
在本说明书通篇中，残基位置是相对于全长野生型PTH(1-17)标注的。因此，例如提及11位应诠释为指PTH(1-17)N-末端起第11位残基。在这样方面，应注意在本发明的实施方案中当16位的氨基酸为空缺时，C端的氨基酸仍然被定义为17位。
特别地，本申请涉及PTH(1-17)肽，其与野生型PTH(1-17)相比具有一个或多个取代，且与野生型PTH(1-17)和[Ac5c1，Aib3]MPTH(1-14)相比可能具有改进的性质。这些取代可能包含在任意氨基酸位置的保守取代，任选同时包含至少一个非保守氨基酸取代。特别地，本发明涉及残基A13和残基A17间的环状连接，例如在这些位置的氨基酸残基侧链之间形成的环状连接。
因此，本发明一方面涉及具有生物学活性的PTH(1-17)类似物肽，其由组成如下的式I表示：
R1-Z1-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-Leu-A16-A17-Z2-R2
其中
R1为氢、NH2、RHN、RR3N，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
A1为Ac5c、Gly、Ser、Ala或任意α-螺旋稳定残基；
A2为Val或保守取代；
A3为Aib、Ala、Ser或任意α-螺旋稳定残基；
A4为Glu或保守取代；
A5为Ile或保守取代；
A6为Gln、Glu或保守取代；
A7为Leu或Phe或保守取代；
A8为Met、Leu、Nle、Val或保守取代；
A9为His或保守取代；
A10为Gln、Glu、Asp、Ala、Val或保守取代；
A11为Har、Arg、Ala、Ile、Lys或保守取代；
A12为Ala、Arg、His或保守取代；
A13为Lys、Orn、Asp、Glu、Cys、Dab或Dpr；
A14为Trp、Phe、Leu、Arg、His或保守取代；
A16为Asn、Asp、保守取代或缺失；
A17为Lys、Orn、Glu、Cys、Asp、Dab或Dpr；以及
R2为OH、OR、NRH、NRR3或NH2，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)；以及
A13和A17由一个或多个共价键连接；以及
Z1和Z2独立的缺失或为肽序列所述肽序列为选自Ala、Leu、Met、Gln、Glu、Lys、Dab、Dpr和Orn的1-10个氨基酸单元；
或其同源二聚体、异源二聚体、或可药用的盐或其衍生物。
如本领域所熟知的，α-螺旋稳定残基包括Gly、Ser和Ala，以及非天然氨基酸残基如Ac5c、Ac6c、Abu、Nva和Aib。
另一方面，本发明提供具有生物学活性的PTH(1-17)类似物肽，其由组成如下的式II表示：
R1-Z1-A1-Val-A3-Glu-Ile-A6-A7-A8-His-A10-A11-A12-A13-A14-Leu-A16-A17-Z2-R2
其中
R1为氢、NH2、RHN、RR3N，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
A1为Ac5c、Gly、Ser、Ala或任意α-螺旋稳定残基；
A3为Aib、Ala、Ser或任意α-螺旋稳定残基；
A6为Gln或Glu；
A7为Leu或Phe；
A8为Met、Leu、Nle或Val；
A10为Gln、Glu、Asp、Ala或Val；
A11为Har、Arg、Ala、Ile或Lys；
A12为Ala、Arg或His；
A13为Lys、Orn、Asp、Glu、Cys、Dab或Dpr；
A14为Trp、Phe、Leu、Arg或His；
A16为Asn、Asp或缺失；
A17为Lys、Orn、Glu、Cys、Asp、Dab或Dpr；
R2为OH、OR、NRH、NRR3或NH2，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)；以及
A13和A17由一个或多个共价键连接，以及
Z1和Z2独立的缺失或为肽序列，所述肽序列为选自Ala、Leu、Lys、Dab、Dpr和Orn的1-10个氨基酸单元，；
或其同源二聚体、异源二聚体、或可药用的盐或其衍生物。
另一方面，本发明提供取代的PTH(1-17)类似物肽，其具有式III：
R1-Z1-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-A6-Leu-A8-His-A10-A11-Ala-A13-A14-Leu-A16-A17-Z2-R2
其中
R1为氢、NH2、RHN、RR3N，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
A6为Glu或Gln；
A8为Met、Leu、Nle或Val；
A10为Gln或Glu；
A11为Har或Arg；
A13为Lys、Orn、Asp、Glu、Cys、Dab或Dpr；
A14为Trp或Phe；
A16为Asn或Asp或缺失；
A17为Lys、Orn、Glu、Cys、Asp、Dab或Dpr；
R2为OH、OR、NRH、NRR3或NH2，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)；以及
A13和A17由一个或多个共价键连接，以及
Z1和Z2独立的缺失或为肽序列，所述肽序列为选自Ala、Leu、Glu、Lys、Dab、Dpr和Orn的1-10个氨基酸单元；
或其同源二聚体、异源二聚体、或可药用的盐或其衍生物。
另一方面，本发明提供具有生物学活性的PTH(1-17)类似物肽，其由组成如下的式IV表示：
R1-Z1-A1-Val-A3-Glu-Ile-A6-A7-A8-His-A10-A11-A12-A13-A14-Leu-A16-A17-Z2-R2
其中
R1为氢、NH2、RHN、RR3N，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
A1为Ac5c、Ac6c、Abu、Nva或Aib；
A3为Ac5c、Aib、Abu或Nva；
A6为Gln或Glu；
A7为Leu或Phe；
A8为Met、Leu、Val或Nle；
A10为Gln或Glu；
A11为Har或Arg；
A12为Ala或Arg；
A13为Lys、Glu、Asp或Cys；
A14为Trp或Phe；
A16为Asn、Asp或缺失；
A17为Glu、Cys、Asp或Lys；
R2为OH、OR、NRH、NRR3或NH2，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)；以及
A13和A17由一个或多个共价键连接，以及
Z1和Z2独立的缺失或为肽序列，所述肽序列为选自Ala、Leu、Lys、Dab、Dpr和Orn的1-10个氨基酸单元；
或其同源二聚体、异源二聚体、或可药用的盐或其衍生物。
另一方面，本发明提供具有生物学活性的PTH(1-17)类似物肽，其由组成如下的式V表示：
R1-Z1-A1-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-A7-A8-His-Gln-A11-A12-A13-Trp-Leu-A16-A17-Z2-R2
其中
R1为氢、NH2、RHN、RR3N，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
A1为Ac5c或Ac6c；
A7为Leu或Phe；
A8为Met、Leu或Nle；
A11为Har或Arg；
A12为Ala或Arg；
A13为Lys或Glu；
A16为Asn或缺失；
A17为Glu或Asp；
R2为OH、OR、NRH、NRR3或NH2，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)；以及
A13和A17由一个或多个共价键连接，以及
Z1和Z2独立的缺失或为肽序列，所述肽序列为选自Ala、Leu、Lys、Dab、Dpr和Orn的1-10个氨基酸单元；
或其同源二聚体、异源二聚体、或可药用的盐或其衍生物。
侧链与侧链间的成环或桥具有许多可能性，包括但不限于酰胺(内酰胺)、酯(内酯)、醚、酮或二硫化物(Synthetic Peptides，A users guide.第2版.2002.Oxford University Press.Ed.Grant，G.A)。这些可能性中的任意一种均可用于共价连接上述定义的式中的A13和A17的氨基酸残基侧链。
在特别优选的实施方案中，A13和A17间的共价键包含内酰胺桥或半胱氨酸桥。
本发明的另一实施方案中，PTH类似物以二聚体形式提供。该二聚体可能以PTH类似物的同源二聚体的形式形成，例如但不限于Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asn-Asp-NH2。
本发明的另一实施方案中，形成的二聚体是两个不同的PTH类似物的异源二聚体，例如但不限于Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asn-Asp-NH2和Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asp-NH2。
另一方面，本发明涉及取代的PTH(1-17)肽，其相对野生型人类PTH(1-17)在残基A1到A17(包含A1和A17)之间包含至少2个至达14个取代。
相对于野生型PTH，式I、II或III的肽优选在1或3位含有1或2个取代，任选地同时在其它位置，包括6、7、8、10、11、12、13、14、16或17位具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。
本发明类似物中，可能出现在6、7、8、10、11、12、13、14、16或17位且属于式I到III的残基组合的实例包括：
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：2)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()Trp-Leu-Asn-Asp()-OH(SEQ ID NO：4)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys()Trp-Leu-Asn-Asp()-OH(SEQ ID NO：5)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Asp()Trp-Leu-Asn-Lys()-NH2(SEQ ID NO：6)
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(H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asp()-NH2)2(SEQ ID NO：33)
(H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2)2(SEQ ID NO：39)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met(O)-His-Gln-Har-Ala-Lys()Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：40)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Dab()Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：41)
其中括号()表示环化位点。
本发明中的肽的保守取代被归为5组(组I到V)，列于下面的表1，其中使用了天然氨基酸的单字母缩写。
表1：按照物理化学性质分组的氨基酸的保守取代。I：中性、亲水，II：酸和酰胺，III：碱性，IV：疏水，V：芳香的、体积大的氨基酸。
  I   II   III   IV   V
  A   N   H   M   F
  S   D   R   L   Y
  T   E   K   I   W
  P   Q   V
  G   C
然而，在本发明的其他实施方案中，Z1和/或Z2可能缺失。
涵盖在式I到III范围中的特定肽序列列于表3。
最特别地，本发明特别涉及PTH类似物，其在PTH(1-17)类似物的A13和A17之间有共价键。如本文所示，与没有共价键的相似的PTH激动剂相比，PTH(1-17)类似物的A13和A17之间的共价键对所述肽的效力具有极深影响。
另一方面，本发明提供了药物治疗的方法，其包括对需要治疗的受试者施用本文定义的PTH肽。
另一方面，本发明提供了本发明的PTH肽以用于治疗。
另一方面，本发明还提供了药物组合物，其包含PTH衍生物、可药用的赋形剂和/或可药用的溶液如盐水或生理学缓冲溶液。
另一方面，本发明还提供了用于治疗以骨量降低为特征的哺乳动物疾病的方法，该方法包含对需要治疗的受试者施用对于增加骨量为有效量的具有生物学活性的PTH多肽。本发明的优选实施方案涉及疾病如骨质疏松症。骨质疏松症的类型包括但不限于老年骨质疏松症和绝经后骨质疏松症。
另一方面，本发明提供了在具有PTH-1受体的哺乳动物细胞内增加cAMP的方法，该方法包含使细胞接触足够量的本发明的多肽以增加cAMP。
此外，这些多肽类似物对治疗骨丢失患者有效。骨丢失可能由疾病引起，如骨质疏松症、糖皮质激素诱发的骨丢失，皮质醇增多症(亚临床的和临床的)、癌症、高钙血症、肾衰竭或其他肾疾病、肾移植和伴随的药理治疗、胆汁郁积性肝病、病毒性肝炎、肝移植引起的骨丢失、甲状旁腺功能亢进病、支气管哮喘(包括激素依赖性的)、血液透析引起的疾病及骨软化。
如实施例中所显示，经观察，与线性PTH(1-17)类似物相比，本发明肽的环化共价键结构的存在对帮助预防细胞色素P450酶(尤其是CYP2D6)的抑制具有优选优势。可选地或另外地，如本文所示，本发明的环化类似物在卵巢切除的(OVX)大鼠模型中提供了显著高于假手术组(sham)水平的骨矿物质密度和/或骨强度的增加，这在线性PTH(1-17)类似物中从未观察到。
因此，SEQ ID NO：19和其他半环状类似物保存了对PTH受体的活性且刺激骨形成，而对CYP2D6活性没有任何抑制作用，此事实表明，用此化合物进行延长的治疗不会影响其他经此酶代谢的药物或草药产品的药物动力学。因此，我们预期应用这一新化合物种类进行长期治疗将会伴随着提高的安全性。此外，在经常服用多种药物和草药增补物的老年人群中这一特性可能会特别的重要。由于对草药-药物的相互作用的信息所知甚少，这些相互作用常被误解为药物的耐受性差。因此，缺乏对CYP2D6活性的影响可能对与处方药的依从性具有潜在的重要性，于是可能提供更好的长期效力。
本发明的实施方案将通过举例(而非限制)及参考附图进行更详细说明。
附图的简短说明
图1：新型PTH(1-17)类似物在MC3T3-E1细胞中的代表性cAMP效能实验。细胞在磷酸二酯酶抑制剂存在下，被不同浓度的PTH肽于37℃刺激15分钟。误差棒显示了一式三份实验的标准差。
图2：新型环化单体SEQ ID NO：30和相应的共价同源二聚体SEQID NO：33在MC3T3-E1细胞中的代表性cAMP效能实验。细胞在磷酸二酯酶抑制剂存在下，被不同浓度的PTH肽于37℃刺激15分钟。误差棒显示了一式三份实验的标准差。
图3：PTH(1-17)类似物在Saos-2细胞中的cAMP效能测定。环状PTH类似物SEQ ID NO：2与含有相同α-螺旋稳定氨基酸残基的非环状类似物相比显示了显著更高的效力。误差棒标示了平均标准误差。
图4：PTH(1-17)类似物在Saos-2细胞中的cAMP效能测定。环状PTH类似物SEQ ID NO：4与含有相同α-螺旋稳定氨基酸残基的非环状PTH类似物相比显示了更高的效力。显示的数据由两次独立的具有相似最高效果的实验组合而成。误差棒标示了平均标准误差。
图5：PTH(1-17)类似物在Saos-2细胞中的cAMP效能测定。与含有或不含相同α-螺旋稳定氨基酸残基的非环状PTH类似物和环状的不含α-螺旋稳定氨基酸残基的PTH类似物相比，环状并含有α-螺旋稳定氨基酸残基的PTH类似物SEQ ID NO：34显示了明显更高的效力。测量结果经一次测量得到。
图6：DEXA扫描测定骨矿物质密度(BMD)。SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：33完全逆转了OVX动物胫骨近端(代表富含小梁骨的高度应答位点)18％的骨丢失。误差棒标示了平均标准误差。
图7：DEXA扫描测定骨矿物质密度(BMD)。与用载体处理的OVX和假手术动物相比，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：33提高了腰椎L1-L2的BMD。误差棒标示了平均标准误差。
图8：DEXA扫描测定骨矿物质密度(BMD)。经SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：33处理的动物，其BMD在所有剂量上比用载体处理的OVX动物显著增高，在高于20nmol/kg/d剂量上比假手术对照水平显著增高。误差棒标示了平均标准误差。
图9：DEXA扫描测定骨矿物质密度(BMD)。SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：33提高了股骨干(femoral shaft)(富含骨密质的位点)的BMD。与用载体处理的OVX动物相比，记录BMD增加约8％。误差棒标示了平均标准误差。
图10：骨强度测量。在压缩实验中，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：33提高了股骨头的骨强度。在所有剂量下骨强度都高于用载体处理的OVX和假手术动物。误差棒标示了平均标准误差。
图11：骨强度测量。在三点弯曲测试中，SEQ ID NO：19和SEQ IDNO：33提高了股骨的骨强度。在所有剂量下骨强度都高于用载体处理的OVX动物，在SEQ ID NO：19剂量高于20nmol/kg/d时甚至导致骨强度高于用载体处理的假手术动物。误差棒标示了平均标准误差。
发明详述
定义：
本说明书和权利要求书通篇使用了天然氨基酸的传统的单字母和三字母编码，和普遍接受的其他α-氨基酸的三字母编码，例如正亮氨酸(Nle)、高精氨酸(Har)、1-氨基环戊烷羧酸(Ac5c)、2，4-二氨基丁酸(Dab)、2，3-二氨基丙酸(Dpr)、2，5-二氨基戊酸(Orn)和α-氨基异丁酸(Aib)。
本发明的PTH类似物包含表述为带正电或负电的残基。这应当理解为，表示所指残基的侧链功能基团在生理pH(认为约7.4)下携带整体或部分正或负电荷。
应当理解单个残基无法携带部分正电荷。此术语是指在给定系统中具有相同序列的整个肽群中相关残基的平均电荷。如果所指残基的可电离侧链功能基团的pK在7.4左右2pH单位内，即在约5.4到约9.4之间，则部分正电荷将在0和1之间。
“带正电”残基的pKa优选大于约6。
“带负电”残基的pKa优选小于约8。
“带正电”残基的实例包括Lys、Arg、Har、His、Orn、Dab和Dpr。
“带负电”残基的实例包括Asp和Glu。
“中性”残基为在生理pH下基本上不携带电荷的残基。这些残基包括Gln、Asn、Ala、Gly、Ser、Thr、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val。
“芳香”残基包括His、Phe、Tyr和Trp。
本发明中的肽的保守取代被归为5组(组I到V)列于下面的表2，其中使用了天然氨基酸的单字母编码。
表2：按照物理化学性质分类的氨基酸的保守取代。I：中性、亲水的，II：酸性和酰胺，III：碱性，IV：疏水的，V：芳香的、体积大的氨基酸
  I   II   III   IV   V
  A   N   H   M   F
  S   D   R   L   Y
  T   E   K   I   W
  P   Q   V
  G   C
本发明的氨基酸残基可以是D-或L-构型，但优选具有L-构型。
作为参考，PTH分泌为84个氨基酸的肽，其序列如下：
H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-
Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-
Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu-Gly-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Al
a-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Glu
-Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asn-
Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH。
与以上定义的天然PTH相比，本发明的PTH类似物具有一个或多个氨基酸的取代、缺失、或插入。
令人吃惊地，已发现取代的PTH(1-17)类似物分子显示了对PTH受体(如PTH-1受体)持久的cAMP累积活性，并且在体外同样具有活性，如以下实施例所示。
另一方面，本发明提供了新型肽，其与PTH(1-17)和[Ac5c1，Aib3]MPTH(1-14)相比具有改进的化学和药物抗降解稳定性。
在6、8、10、11、13、14、16或17位的一个或多个位置上用Ala、Leu、Nle、Val、Ser、Glu、Asp、Lys或Arg取代修饰的[Ac5c1，Aib3]MPTH(1-14)增加了该分子的化学稳定性，可能因此提高保存期限和降低配制时的降解。
本发明的PTH类似物可能包括对其一个或多个氨基酸侧链功能基团、末端氨基或末端羧酸基团的化学修饰。化学修饰包括但不限于添加化学基团、构造新化学键和去除化学基团。氨基酸侧基的修饰包括但不限于赖氨酸ε-氨基团的酰化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧基基团的酯化，以及谷氨酰胺和天冬酰胺的脱酰胺作用。末端氨基的修饰包括但不限于脱氨基、N-低碳烷基、N-二低碳烷基和N-酰基修饰。末端羧基的修饰包括但不限于酰胺、低碳烷基酰胺、二烷基酰胺和低碳烷基酯修饰。本文优选低碳烷基为C1-C4烷基。此外，一个或多个侧基、或末端基团，可由保护基所保护，这样的保护基为具普通技术的肽化学家所知。
本文所用的“生物活性”是指PTH类似物或其衍生物的骨合成活性，该活性导致成年脊椎动物的矿物质化骨的形成，如应用OVX大鼠实验模型的实施例中所证明的。优选地，此生物活性在间歇给药方案中的适当剂量下测定。
可选地或另外地，本发明的PTH肽的其它生物活性是它们不显著抑制细胞色素P450(CYP)酶的活性。举例而言，这优选是指，与对照(仅在载体存在下的形成速度)相比，本发明的PTH肽使该活性(测定为CYP同种型特异性代谢物的形成速度)降低不高于30％，优选不高于20％。
应当理解本发明的肽还可以以盐或其他衍生物的形式提供。盐包括可药用的盐如酸加成盐和碱性盐。酸加成盐的实例包括盐酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐。碱性盐的实例包括这样的盐，其阳离子选自碱金属如钠和钾、碱土金属如钙、及铵离子+N(R3)3或(R4)，其中R3和R4独立表示任选取代的C(1-6)-烷基、任选取代的C(2-6)-链烯基、任选取代的芳香基或任选取代的杂芳香基。
其他可药用的盐的实例在《雷氏药学大全》(Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，19版，1995)和《制剂技术百科全书》(Encyclopaedia ofPharmaceutical Technology)中有所描述。
本发明的PTH类似物的其他衍生物包括配位化合物，所述配位化合物具有金属离子如Mn2+和Zn2+、酯如体内可水解的酯、游离酸或碱、水合物、前药或脂。酯可由化合物中存在的羟基或羧酸基团与适当的羧酸或醇反应配偶体，应用本领域熟知的技术形成。作为化合物的前药的衍生物在体内或体外可转换为母体化合物之一。通常，化合物的至少一种生物学活性在该化合物的前药形式中降低，且可以通过该前药转化以释放化合物或代谢产物而活化。前药的实例包括使用保护基，该保护基可被原位去除以释放活性化合物，或抑制药物的体内清除。
在本发明的某些实施方案中，Z1和Z2为1-10个氨基酸残基的肽序列，例如在2-8个范围内，特别是在3-6个氨基酸残基的范围内，例如2、3、4、5或6个氨基酸残基。通常，Z1和Z2仅存在其一，如Z1。肽序列Z的各氨基酸残基均独立地选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Orn。优选地，氨基酸残基选自Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Lys、Arg、His、Orn、Dab和Dpr，尤其是Lys。上述的氨基酸可以是D-或L-构型，但是优选上述氨基酸是L-构型。
人们相信这些肽在分子的N端和/或C端增加PTH类似物肽的可溶性和增加稳定性，例如对于蛋白酶活性的稳定性，从而导致药物动力学性质改进，如半寿期提高和聚集趋势减少。
PTH肽的实例显示于下面的表3。其中一些肽为对照，并以与本发明的肽相比较的方式提供(例如，见PTH1-34，SEQ ID NO：32)。本发明肽的优选组在表中以黑体显示。
表3：相关肽
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Asp-NH2(SEQ ID NO：1)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：2)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asn-Asn-NH2(SEQ ID NO：3)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-OH(SEQ ID NO：4)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-OH(SEQ ID NO：5)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Asp()-Trp-Leu-Asn-Lys()-NH2(SEQ ID NO：6)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Cys()-Trp-Leu-Asn-Cys()-NH2(SEQ ID NO：7)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Glu()-Trp-Leu-Asn-Lys()-NH2(SEQ ID NO：8)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Glu()-NH2(SEQ ID NO：9)
H-Ac6c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：10)
H-Abu-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：11)
H-Nva-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：12)
H-Aib-Val-Ac5c-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：13)
H-Ac5c-Val-Ac5c-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：14)
H-Ac5c-Val-Abu-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：15)
H-Ac5c-Val-Nva-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：16)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Dpr()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：17)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Glu-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：18)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：19)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Nle-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：20)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Val-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：21)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asp-Asp()-NH2(SEQ ID NO：22)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asp-Asp()-NH2(SEQ ID NO：23)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Glu-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：24)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Arg-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：25)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Phe-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：26)
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H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Arg-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：28)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Glu-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：29)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asp()-NH2(SEQ ID NO：30)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-NH2(SEQ ID NO：31)
H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu
-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH(SEQ ID NO：32)(PTH(1-34))
(H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asp()-NH2)2(SEQ ID NO：33)
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H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met(O)-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：40)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Dab()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：41)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asn-Asp-NH2(SEQ ID NO：42)
其中括号()代表环化位点。
如上所述，本发明特别涉及PTH类似物，其中在PTH(1-17)类似物的A13和A17之间有共价键。与不具有共价键的类似PTH激动剂相比，由所述共价键得到的肽的环状构象在体外对所述肽的效力具有益影响。特别且更重要的是，环化的类似物在卵巢切除的大鼠模型中已显示增强骨矿物质密度和骨强度，该效应在少于28个氢基酸的线性PTH类似物中从未显示。
本发明的发明人还相信该共价键还能防止使用线性PTH(1-17)和PTH(1-14)类似物时所观察到的对细胞色素P4502D6的抑制。
本文所用的术语共价键在不改变语义的情况下可以被取代为术语环化、连接、键或桥。
侧链与侧链的环化存在多种可能性，包括但不限于酰胺(内酰胺)、酯(内酯)、醚、酮或二硫化物(Synthetic Peptides，A users guide.2版，2002.Oxford University Press.Ed.Grant，G.A)。
A13和A17间的共价键包含了内酰胺桥或半胱氨酸桥。
在本发明的优选实施方案中，内酰胺键包含
Figure A20078005102200281
在本发明的另一方面，Lys13和Asp17间的内酰胺键包含这样的反应，其中：
Figure A20078005102200282
另一方面，本发明涉及在两个PTH类似物之间形成二聚体。
在本发明的一个实施方案中，形成的二聚体为相同的PTH类似物的同源二聚体，如Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asn-Asp-NH2(SEQ ID NO：39)，如以下示意图所示：
Figure A20078005102200291
在本发明的另一个实施方案中，二聚体由两种不同PTH类似物的异源二聚体形成，所述PTH类似物如Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asn-Asp-NH2和Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asp-NH2，如以下示意图所示：
Figure A20078005102200301
肽的由共价键形成的环状构象还能防止在线性PTH(1-17)类似物中所观察到的对细胞色素P4502D6的抑制。此外，在此显示环状类似物在卵巢切除的大鼠模型中增加骨矿物质密度和骨强度，其程度与PTH(1-34)相当，这样的结果在线性PTH(1-17)类似物中从未显示。因此，SEQ ID NO：19和其他半环状PTH(1-17)类似物保存了对PTH受体的活性并刺激骨形成，且对CYP2D6活性没有抑制作用，这样的事实表明，用此化合物进行延长治疗不会影响其他药物或由此酶代谢的草药产物的药物动力学。
因此，我们预期应用这一新化合物种类进行长期治疗将会伴随着提高的安全性。此外，在经常服用多种药物和草药增补物的老年人群中这一特性可能会特别的重要。由于对草药-药物的相互作用的信息所知甚少，这些相互作用常被误解为药物的耐受性差。因此，缺乏对CYP2D6活性的影响可能对与处方药的依从性具有潜在的重要性，反而可能产生更好的长期效力。
医学适应症
本发明的PTH类似物可用于但不限于预防或治疗如下疾病：
骨质疏松症、如原发性骨质疏松症、内分泌性骨质疏松症(甲状腺功能亢进、甲状旁腺功能亢进、库欣综合征、肢端肥大症、1型糖尿病、肾上腺机能不全)、遗传性和先天性的骨质疏松症(成骨不全、高胱氨酸尿症、门克斯综合征和赖-戴综合征)、营养和肠胃疾病、血液疾病/恶性肿瘤(多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病、血友病、地中海贫血)、由于固定、慢性阻塞性肺疾病或风湿疾病(类风湿性关节炎、强直性脊柱炎)引起的骨质疏松症。
骨髓炎或感染性骨病变导致骨丢失。
实体瘤(乳房、肺和肾)和血液恶性肿瘤(多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病)导致的高血钙、特发性高血钙、及与甲状腺功能亢进和肾功能疾病相关的高血钙。
手术后的骨质减少，由施用类固醇诱发，与小肠和大肠疾病及慢性肝和肾疾病相关。
骨坏死或骨细胞死亡，其与外伤性损伤或非外伤性坏死相关，后者与跟戈谢病、镰状细胞贫血、系统性红斑狼疮和其他疾病相关。
牙周的骨丢失。
溶骨性转移。
骨折愈合，及
过度增生性皮肤疾病如牛皮癣。
优选的适应症为骨质疏松症，包括原发性骨质疏松症、内分泌性骨质疏松症(甲状腺功能亢进、甲状旁腺功能亢进、库欣综合征和肢端肥大症)、遗传性和先天性的骨质疏松症(成骨不全、高胱氨酸尿症、门克斯综合征、和赖-戴综合征)、以及由骨端固定引起的骨质疏松症。
药物组合物和施用：
本发明的PTH类似物、或盐或其衍生物，可配制为用于储存或施用的药物组合物，其包含处于可药用载体中的治疗有效量的本发明的PTH类似物、或盐或其衍生物。
本发明中提供了药物组合物，其中PTH类似物或其盐以使接受施用的受试者恢复骨量的有效量存在。
对医学领域技术人员显而易见的，本发明的肽或药物组合物的“治疗有效量”将依据年龄、体重和治疗的哺乳动物种类、使用的具体化合物，具体的施用方式、期望的效果和治疗适应症而变化。因为这些因素及其与确定此剂量的关系为医学领域所熟知，所以本文所述的对治疗有效剂量水平和达到期望结果所必需的量的确定，均在技术人员的所知范围内。
本文使用的“治疗有效量”是在具有疾病或病理的个体中，减轻给定疾病或病理的症状的量，优选其使生理学反应正常化。症状的减轻或生理学反应的正常化可用本领域的常规方法测定，且可以随给定疾病或病理而变化。
在本发明的一个实施方案中，本发明的化合物或药物组合物从较低的剂量水平开始施用，逐渐增加剂量水平直到达到预期的生理效果。这可以定义治疗有效剂量。对于单独或作为药物组合物的一部分使用本发明的肽，这样的剂量可为从约0.5ug/kg/天或1ug/kg/天到约1000.0ug/kg/天之间，更优选的，肽的有效量为约5.0ug/kg/天到约500.0ug/kg/天，仍更优选的，肽的有效量为约10.0ug/kg/天到约400.0ug/kg/天。
为治疗使用，选定的PTH类似物和载体共同配制，所述载体可药用且适于以选定的施用途径递送肽。为了本发明的目的，优选口服、直肠、鼻或下呼吸道(肺)途径。这些是所谓的非注射途径。本发明使用的某些化合物可能还可适用于周边的肠胃外途径的施用，包括静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内途径施用。本药物组合物包含本发明的PTH类似物、或盐或其衍生物和可药用的载体。适当的可药用载体为传统上与基于肽的药物共同使用的载体，如稀释剂、赋形剂等。用于治疗使用的可药用载体在药物领域为熟知，例如在《雷氏药学大全》(Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，19版，1995)中所述。
pH缓冲剂可为组氨酸或乙酸钠。在药物组合物中可提供防腐剂、稳定剂、染料甚至调味剂。例如苯酚苯甲酸钠(phenol sodium benzoate)、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯可作为防腐剂添加。此外，可使用抗氧化剂和悬浮剂，例如SDS、抗坏血酸、甲硫氨酸、羧甲基纤维素、EDTA、聚乙二醇和吐温。
在另一实施方案中，提供了PTH肽类似物的可药用的酸加成盐。
本发明的药物组合物可被配制为片剂、胶囊或酏剂用于口服施用；栓剂用于直肠施用；无菌溶液和悬剂用于注射施用；可吸入制剂用于鼻腔或肺部施用等。
施用的剂量和方法可调整以达到最佳功效，但将取决于医学领域技术人员会识别的因素如体重、饮食、同时用药和其他因素。
当施用途径为非注射途径，如口服、直肠、鼻腔或肺部，该药物组合物可被制备为传统形式。口服施用可为液体制剂或为片剂或胶囊。直肠施用可为栓剂。鼻腔和肺部施用可为液体或粉剂。
当肠胃外施用时，如每日皮下施用，注射用药物组合物可被制备为传统形式，如冻干的固体形式(适于用前立即重构或于注射前在液体中悬浮)的水性溶液或悬液、或制成乳剂。适用的赋形剂为例如水、盐水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸钠和盐酸半胱氨酸。此外，如果期望，注射用药物组合物可包含少量的无毒辅助物质，如湿润剂或pH缓冲剂。可以使用提高吸收的制剂(例如脂质体)。
在本发明的一个实施方案中，配制化合物用于通过注入(例如作为液体营养补充用于进行肠胃外全面营养治疗的患者)或注射(如皮下、腹膜内或静脉内)施用；并相应的以无菌和无热原形式、且任选缓冲至生理学可容忍的pH的水性溶液使用。用于肌肉内施用的制剂可基于处于植物油(如低芥酸菜子油、玉米油或大豆油)中的溶液或悬液。这些基于油的制剂可用抗氧化剂稳定，例如BHA(丁基化羟基苯甲醚(butylatedhydroxianisole))和BHT(丁化羟基甲苯)。
因此，本发明化合物可在如蒸馏水或盐水、磷酸缓冲盐溶液、5％葡萄糖或油等媒介中施用。如果期望，可通过加入可溶性增强物如去污剂和乳化剂来增加PTH类似物的可溶性。
用于注射的水性载体或媒介可补充一些明胶，其用于在注射位点或附近贮存PTH类似物，使其缓慢释放到期望的作用位点。可选的胶凝剂如透明质酸也可用作贮存剂。
PTH类似物可以以无菌装填的小瓶或安瓿形式使用，其中包含药物有效量的肽(单位剂量或多次剂量)。小瓶或安瓿可包含PTH类似物和期望的载体，作为可立即施用的制剂。可选地，小瓶或安瓿可包含以一定形式存在的PTH肽，如冻干形式，其适于在适当的载体如无菌水或磷酸缓冲盐溶液中重构。
最适宜于患者治疗的治疗剂量和方案当然将随待治疗的疾病或病症而变化，并根据患者的体重和其他参数而定。不希望受任何理论限制，可以期望μg/kg范围内的剂量、较短或较长的治疗延续时间或频率可产生治疗上有效的结果。在某些实例中，治疗方案可包括施用适当的维持剂量，以预防最初的治疗停止后发生的组织退化。本发明取得的结果可用于指导最适宜于人用的剂量尺度和剂量方案，并可在适当设计的临床试验中进行证实。
有效剂量和治疗方案可经传统方式确定，在实验动物中以低剂量开始，而后增加剂量，同时监测效果，并系统地改变剂量方案。当对给定受试者确定最佳剂量时，临床医生可考虑许多的因素。这些考虑的因素均为技术人员已知。
肽合成：
PTH类似物可经许多途径合成，包括例如，包含通过固相或液相肽合成和回收所得肽来合成肽的方法。优选的一般程序如下所述。然而更详细的固相肽合成的描述可见WO 98/11125。
仪器和合成策略
肽在装备有聚丙烯过滤器的聚乙烯容器中分批合成以备过滤，使用9-芴甲氧羰基(Fmoc)作为N-α-氨基保护基和适合的常用侧链功能基团的保护基。
溶剂
乙腈(HPLC级，Sigma-Aldrich，Germany)和NMP(N-甲基吡咯烷酮，Univar Europe，Denmark)不经纯化直接使用。
氨基酸
Fmoc保护的氨基酸购自Advanced ChemTech(Kentucky，USA)或Fluka(Germany)，以适当的侧链保护形式存在。非天然氨基酸1-(Fmoc-氨基)-环戊烷-1-羧酸(Ac5c)、Fmoc-氨基异丁酸(Aib)、Fmoc-高精氨酸(pmc)-OH(Har)和Fmoc-Lys(Aloc)-OH一起购自Bachem(Germany)。Fmoc-Asp(OAll)-OH获自Fluka(Germany)。
偶联剂
偶联剂二异丙基碳二亚胺(DIC)购自Fluka(Germany)。
固相支持物
肽于TentaGel S Ram树脂0,23mmol/g(Rapp polymere，Germany)上合成。
催化剂和其他试剂
二异丙基乙胺(DIEA)购自Perspective Biosystem(England)，哌啶和吡啶购自Riedel-de
Figure A20078005102200351
(Frankfurt，Germany)。乙二硫醇购自Aldrich/Fluka(Germany)，1-羟基苯并三唑(HOBt)和三异丙基硅烷(TIS)购自Fluka(Germany)。O-(7-氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate)(HATU)购自ChemPep(Miami，USA)。N-甲基吗啉购自Lancaster(England)。六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBop)购自Advanced ChemTech(Kentucky，USA)，四(三苯基膦)钯购自Aldrich(Germany)。
偶联方法
氨基酸作为由适合的N-α-保护的氨基酸和HOBt通过DIC在NMP中原位生成的OBt酯偶联，或作为由适合的N-α-保护的氨基酸和HATU通过DIEA在NMP中原位生成的OAt酯偶联。
N-α-氨基保护基(Fmoc)的脱保护
Fmoc基团的脱保护是通过用处于NMP中的20％哌啶处理(1×5和1×10分钟)，之后用NMP清洗(5×15ml，每次5分钟)完成。
OBt酯的偶联
3当量N-α-氨基保护氨基酸与3当量HOBt和3当量DIC共同溶解于NMP中，再加入树脂中。
OAt酯的偶联
3当量N-α-氨基保护氨基酸与3当量HATU和3当量DIEA共同溶解于NMP中，再加入树脂中。
用酸将肽从树脂上裂解
肽经92/1/2.5/2.5％(v/v)的三氟乙酸(TFA，Riedel-de
Figure A20078005102200361
Frankfurt，Germany)/TIS/水/乙二硫醇室温处理2小时从树脂上裂解。过滤过的树脂用95％TFA-水洗涤，滤液和洗涤液在减压下蒸发。残渣用乙醚沉淀，并在乙酸-水中冻干。粗制品用高效液相色谱(HPLC)分析并用质谱分析法(MS)鉴定。
TentaGel树脂(PEG-PS)上的分批肽合成
将TentaGel S Ram树脂(1g，0.23mmol/g)置于装备有聚丙烯滤器的聚乙烯容器中以备过滤。树脂在NMP(15ml)中膨胀，用处于NMP中的20％哌啶处理以去除TentaGel S Ram接头上的初始Fmoc基团。排空树脂并用NMP洗涤。根据序列，氨基酸如上所述以预制的Fmoc-保护的OBt或OAt酯(3当量)的形式偶联。除非另有说明，偶联持续2小时。排空树脂并用NMP(5×15ml，每次5分钟)洗涤以去除过量的试剂。在脱保护最后的Fmoc保护基前，在树脂上按如下步骤预先生成内酰胺桥：首先脱保护D(OAll)和K(Aloc)，然后依下述环化。在完成合成、环化和Fmoc脱保护后，肽-树脂用NMP(3×15ml，每次5分钟)、乙醇(3×15ml，每次1分钟)和二乙醚(3×15ml，每次1分钟)洗涤，真空干燥。肽依上述从树脂上裂解，粗制的肽产物依下述分析和纯化。
OAll和Aloc的脱保护
5当量四(三苯基膦)钯悬浮于包含92.5/5/2.5％(v/v)的氯仿/乙酸/N-甲基吗啉溶液中，通N2气流2分钟。将悬浮液转移至置于聚乙烯容器中的肽基树脂中，所述聚乙烯容器一端接插头并装备聚丙烯滤器，反应可在N2气流中于室温进行2小时。之后排空树脂并用上述溶液洗涤直到变为无色。此后，用含0.5％DIEA的NMP(3×5分钟)洗涤树脂，最后用NMP(3×5分钟)洗涤。
用Lys和Asp侧链进行环化
含未经保护的D和K的肽基树脂可与含PyBop、HoBt和DIEA(各3当量)的NMP溶液反应过夜。排空树脂并加入一份新鲜的反应混合物，历时2小时。最后排空树脂并用NMP洗涤。
HPLC条件
用Hewlett Packard HP 1100 HPLC系统进行梯度HPLC分析，该系统包含HP1100四元泵、HP 1100自动进样器、HP 1100柱恒温器和HP 1100多波长检测器。使用用于LC的Hewlett Packard Chemstation软件(A.06.01修订版本)进行仪器控制和数据采集。使用了以下柱和HPLC缓冲系统：
柱：LiChrospher 60，4×250mm，10-15μm
缓冲液：A：含0.1％TFA的MQV；B：0.085％TFA、10％MQV、90％MeCN。
梯度：0-1.5分钟0％B
      1.5-25分钟0-50％B
      25-30分钟50-100％B
      30-35分钟100％B
      35-40分钟100-0％B
      40-45分钟0％B
流速1ml/分钟，烘箱温度40℃，紫外检测：l＝215nm。
粗制肽的HPLC纯化
粗制肽产物由PerSeptive Biosystems VISION Workstation纯化。使用VISION 3.0软件进行仪器控制和数据采集。使用了以下柱和HPLC缓冲系统：
柱：VYDAC，C-18，5×250mm，10-15μm
缓冲系统：缓冲液：A：含0.1％TFA的MQV；B：0.085％TFA、10％MQV、90％MeCN。
梯度：5％B-50％B，历时47分钟。
流速35ml/分钟，紫外检测：l＝215nm和280nm。
质谱分析法
肽溶解于超梯度甲醇(Labscan，Dublin，Ireland)，milli-Q水(Millipore，Bedford，MA)和甲酸(Merck，Damstadt，Germany)(50∶50∶0.1 v/v/v)中以获得1到10mg/ml之间的浓度。使用LCT质谱仪(Micromass，Manchester，UK)以正极性模式通过ESI-TOF-MS分析肽溶液(20μl)，精确度为+/-0.1m/z。
实施例
实施例1
化学合成
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(括号代表侧链环化位点)在TentaGel S Ram上的肽合成。
将干的TentaGel S Ram(0.23mmol/g，1.2g)置于装备有聚丙烯滤器的聚乙烯容器中以备过滤，按照上文“TentaGel树脂上的分批肽合成”中所述处理，直至完成N-末端Ac5c的偶联。N-末端的3个氨基酸以OAt酯的形式使用3当量的HATU和DIEA(2×2h)进行偶联，其他所有氨基酸以如上述OBt酯的形式进行偶联。在最后的氨基酸偶联完成后，排空树脂，用NMP洗涤，按照上文“OAll和Aloc的脱保护”所述使Allyl和Aloc脱保护，按照上文“用Lys和Asp侧链进行环化”所述对肽进行环化。环化后将最后的N-末端Fmoc基团脱保护，用NMP、EtOH和醚洗涤树脂，真空干燥。依上述从树脂上裂解肽。粗制产物用HPLC和MS分析，发现纯度为24％，肽的同一性经MS确认(测定为MH+2071.13，计算为MH+2071.11)。粗制产物产量为259mg。肽依上述纯化至96％。
二聚体的合成
SEQ ID NO：30的Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asn-Asp-NH2的同源二聚体合成实例：
二聚体在TentaGel S Ram树脂上合成，氨基酸以下列顺序偶联：D(OAll)-Asn-Leu-Trp-Lys-(Dde-Lys(Fmoc))-(Fmoc-Asp-NH2)-Asn-Leu-Trp-(Dde-Lys(Fmoc))-Ala-Har-Gln-His-Met-Leu-Gln-Ile-Glu-Aib-Val-Ac5c。在第二个Dde-Lys(Fmoc)偶联后，根据单体肽合成中的描述进行Asp和Lys间的环化。之后，通过将肽基树脂在含2％肼的NMP中搅拌(3×5分钟)去除Lys上的Dde保护基。其后的氨基酸(6当量)再偶联至K的游离氨基。肽从树脂上的裂解和对同源二聚体的进一步处理依单体肽合成中所述进行。
实施例2
用MC3T3-E1 cAMP效力测定法体外测试PTH类似物
材料与方法
MC3T3-E1亚克隆4(矿化)(MC3T3-E1)细胞(ATCC CRL-2593)在α-MEM(Invitrogen #32571)/10％胎牛血清+青霉素/链霉素中，于95％空气/5％CO2的湿润空气中在37℃生长。
将肽溶于磷酸缓冲盐溶液并进一步稀释于包含0.1％碱处理的酪蛋白(ATC)(Livesey和Donald，Clin.Chim.Acta 1982，123：193-8)和100μM异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX，Sigma I5879)的蒂罗德缓冲液(Tyrode’s buffer)(TB，Sigma，T2145)中。
cAMP浓度使用[125I]cAMP
Figure A20078005102200391
测定法(目录号#SMP1001A，Perkin Elmer Life Sciences)测定。
在效力测定前，MC3T3-E1细胞以10,000细胞/孔的密度接种于96-微量滴定板中并生长过夜。分析当天，小心的吸去生长培养基。用200μlTB/0.1％ATC洗涤细胞一次。用100μl反应混合物取代缓冲液(±测试肽，+100μM IBMX)，在37℃孵育13分钟。加入25μl冰冷的0.5M HCl终止反应。之后将细胞冰上孵育60分钟。在96孔cAMP FlashPlate的各孔中加入75μl醋酸缓冲液。将25μl的酸细胞提取物和100μl[125I]cAMP溶液加入到同一FlashPlate中。FlashPlate于4℃孵育过夜，吸空并用TopCounter计数。
研究设计
测定在所有剂量上以一式三份进行。每次实验中，优选在每块板中包含一式一份、两份或三份的标准物测定。
浓度水平和组
在10pM到10μM的浓度范围评估效力。
数据分析和统计
将浓度依赖的cAMP反应导入GraphPad Prism第4版，转换并绘图。用S型剂量反应曲线函数进行曲线拟合，非线性拟合为Y＝底部+(顶点-底部)/(1+10^((LogEC50-X)))，其中X为浓度的对数，Y为反应。Y从底部(Bottom)到顶点(Top)为S型。评估pEC50和最大可诱导cAMP浓度。总体统计差异分析使用单向方差分析(one-way ANOVA)进行。用费雪最小显著差异法(Fisher’s Least Significance Test)进行事后比较(post-hoc comparison)。当p低于0.05时认为结果为显著。
结果
MC3T3-E1细胞经PCR分析显示表达PTH受体1的mRNA(数据未显示)。阳性参照化合物PTH(1-34)在此细胞系中诱导强烈的cAMP反应。在cAMP效力测定中比较了若干肽(表4)。
表4：在MC3T3-E1测定中测试的肽，包括同源二聚体SEQ ID NO 33。
  SEQ ID   序列
  31   H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-NH2
  30   H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asp()-NH2
  33   二聚体H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asp()-NH2
  2   H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2
  42   H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asn-Asp-NH2
  3   H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asn-Asn-NH2
  32   H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH
括号代表环化位点
表5显示了环状PTH(1-17)类似物和对照肽的效力和最大效能。
表5：新型PTH类似物在MC3T3-E1cAMP效能测定中的pEC50和最大效能值±SEM。数值与PTH(1-34)比较。*：p＜0.05(费雪LSD检验)；n＝测定次数。
  SEQ ID pEC50±SEM   Emax±SEM[pmol/孔]   n15
  2   9.0±0.2   4.9±0.8   4
  42   8.2±0.2*   5.7±1.0   4
  3   8.6±0.1*   5.5±0.9   4
  32   9.1±0.1   4.4±0.4   4
  31   8.4±0.1*   4.5±1.0   320
  30   8.0±0.1*   5.0±0.2   4
  33   8.9±0.1   5.0±0.3   4
所有检测的肽均为PTH受体cAMP信号传导的完全激动剂(表5)。它们的剂量反应曲线可用简单的S型曲线拟合(希尔系数(Hill coefficient)接近1)。分析涵盖了所有数据，即无异常值被去除。
SEQ ID NO：32诱导cAMP的EC50值约为1nM，和已发表的类似试验系统的报导一致(Rhee等人，Yonsei Med.J，.47：214-22，2006；Murrills等人，Bone，35：1263-72，2004)。
在用MC-3T3-E1细胞检测的新的短PTH类似物中，SEQ ID NO：2是最有效的环状PTH(1-17)类似物。SEQ ID NO：2的EC50与PTH(1-34)相当，并显著地比SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：42更有效，证实了环化对激动剂活性的重要性(图1；表5)。
SEQ ID NO：42是SEQ ID NO：2的线性变体，其包含同样的K13/D17氨基酸组合，可在C端形成盐桥，其激动剂活性比SEQ ID NO：2弱6倍。
线性类似物SEQ ID NO：3为SEQ ID NO：42的变体，不具有形成盐桥能力，其活性比SEQ ID NO：2弱2到3倍。
值得注意地，SEQ ID NO：33是SEQ ID NO：30的共价二聚体，它变成了比SEQ ID NO：30强8倍的激动剂，达到和SEQ ID NO：2相似的效力(图2；表5)。
结论
我们鉴定了4个新的短PTH肽受体1的模拟肽，其能够在成骨细胞样的细胞系中产生完全激动剂反应。在这之中，17个氨基酸的环化分子SEQID NO：2和二聚的SEQ ID NO：30是最有效的化合物，EC50约1nM，与PTH(1-34)相似。如线性类似物SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：3低了2到6倍的效力所说明的，K13-D17的环化与效力提高相关。
实施例3
Saos-2细胞中的cAMP效能测定
研究设计
方案来自Murrills R.J.等人(Bone 35：1263-72，2004)，经过修改以适应本测定。肽溶解于磷酸缓冲盐溶液中，并进一步稀释于包含0.1％BSA和100μM异丁基-甲基-黄嘌呤(IBMX，Sigma-Aldrich)的蒂罗德缓冲液(TB，Sigma-Aldrich)中。在效力测定前，以50000细胞/孔将Saos-2细胞接种于96-微量滴定板中并生长2天。分析当天，小心地吸去生长培养基。用200μl TB/0.1％BSA洗涤细胞一次。用100μl反应混合物(±试验肽)取代缓冲液，在37℃孵育15分钟。加入25μl冰冷的0.5MHCl终止反应。之后将细胞冰上孵育60分钟。在96孔cAMPFlashPlate(Perkin-Elmer)各孔中加入75μl pH6.2的醋酸缓冲液。将25μl的酸细胞提取物和100μl[125I]cAMP溶液加入同一FlashPlate的各孔中。FlashPlate于4℃孵育过夜，吸空并用TopCounter(Packard)计数。
在所有剂量上测定1次或以一式三份进行。Z因子测定显示，单次测量具有足够程度的准确度来预测检测肽的效力。每次实验中，优选在每块板中包含一式一份、两份或三份的标准物测定。
在0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nM、1μM和10μM，或0.1nM、1nM、3nM、10nM、30nM、100nM和1μM(窄剂量范围用于同时测定效力和希尔系数)的浓度评估效力。
数据分析和统计
将浓度依赖的cAMP反应导入GraphPad Prism第4版，转换和绘图。显示效力高于1μM的环状PTH(1-17)类似物通常具有显著高于1的希尔系数。因此，用4参数逻辑方程测定EC50值。用S型剂量反应曲线(斜率可变)函数进行曲线拟合，非线性拟合为Y＝底部+(顶点-底部)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))，其中X为浓度的对数，Y为反应。Y从底部开始到顶点为S型。评估了pEC50、希尔系数和最大可诱导cAMP浓度(Emax)。
总体统计差异分析使用Statistica(Statsoft)用单向方差分析进行。用费雪最小显著差异法进行事后比较。当p低于0.05时认为结果为显著。
结果
Saos-2细胞中的cAMP效能测定
环状PTH(1-17)类似物和对照肽的效力和效能概括显示于表6。
在Saos-2细胞中的cAMP效能测定中，环状、结构稳定的PTH(1-17)类似物SEQ ID NO：2的效力显著高于其母体线性PTH(1-17)类似物SEQID NO：42或线性PTH(1-14).类似物SEQ ID NO：31(图3)。
相似地，在Saos-2细胞中的cAMP效能测定中，环状、结构稳定的PTH(1-17)类似物SEQ ID NO：4的效力明显高于其母体线性PTH(1-17)类似物SEQ ID NO：38(图4)。
此外，在Saos-2细胞中的cAMP效能测定中，环状、结构稳定的PTH(1-17)类似物SEQ ID NO：34的效力分别显著高于：其母体线性PTH(1-17)类似物SEQ ID NO：1、天然线性PTH(1-17)SEQ ID NO：37、或天然PTH(1-17)类似物(其在1和3位含有α-螺旋稳定氨基酸(SEQID NO：35)，或在氨基酸13和17的侧链之间具有共价键(SEQ ID NO：36))(图5)。
表6：相关的线性和环状PTH(1-17)类似物的效力和效能。pEC50：受体半最大活化时的肽浓度的负对数；SEM：平均标准误差；Emax：对于对照(SEQ ID NO：32)的相对效应；N：独立测定的次数；n.a.：不适用的。SEQ ID NO的后缀表示测试的盐(A：醋酸盐；T：三氟醋酸盐；C：氯化盐)。
  SEQ ID NO   pEC50±SEM   Emax±SEM   N
  1T   无活性   n.a.   1
  2A   8.20±0.06   0.99±0.03   5
  2T   8.18±0.03   0.70±0.09   10
  2C   8.18±0.04   0.94±0.03   8
  3T   8.04±0.07   1.06±0.06   8
  4T   7.42±0.04   1.11±0.03   2
  5T   7.14±0.00   1.16±0.12   2
  6T   6.9   1.5   1
  7T   7.3   1.2   1
  8T   7.94±0.05   1.07±0.02   2
  9T   7.85±0.17   1.03±0.03   2
  SEQ ID NO   pEC50±SEM   Emax±SEM   N
  1T   无活性   n.a.   1
  2A   8.20±0.06   0.99±0.03   5
  10T   7.90±0.07   1.08±0.06   3
  11T   7.17±0.03   1.04±0.05   2
  12T   6.99±0.08   1.04±0.03   2
  13T   7.27±0.07   0.96±0.03   3
  14T   7.45±0.10   1.03±0.05   3
  15T   7.22±0.07   1.04±0.03   3
  16T   6.92±0.04   1.03±0.04   2
  17T   6.11±0.08   1.25±0.05   2
  18T   7.29±0.20   1.24±0.29   2
  19A/T   7.99±0.03   1.05±0.04   16
  20T   8.10±0.05   0.97±0.04   3
  21T   6.82±0.34   1.40±0.27   2
  22T   7.13±0.05   1.08±0.04   2
  23T   7.48±0.07   1.16±0.08   6
  24T   6.9   1.4   1
  25T   8.05±0.06   1.04±0.03   8
  26T   7.90±0.14   1.08±0.09   8
  27T   7.91±0.05   0.92±0.06   3
  28T   8.27±0.16   0.95±0.06   3
  29T   6.95±0.06   1.27±0.20   2
  30T   7.09±0.06   1.04±0.05   3
  31T   7.66±0.05   1.07±0.04   8
  32T   8.61±0.02   1.00±0.09   21
  33T   7.88±0.06   1.10±0.04   9
  SEQ ID NO   pEC50±SEM   Emax±SEM   N
  1T   无活性   n.a.   1
  2A   8.20±0.06   0.99±0.03   5
  34T   6.67±0.03   1.12±0.09   2
  35T   5.09±0.01   1.20±0.01   2
  36T   无活性   n.a.   1
  37T   无活性   n.a.   1
  38T   7.0   1.2   1
  39T   8.30±0.03   0.95±0.05   6
  40T   6.9   1.1   1
  41T   7.19±0.11   0.99±0.02   3
  42T   7.68±0.08   1.03±0.07   8
结论
在3种情况中(SEQ ID NO：2、4、34)，与线性母体类似物或天然PTH(1-17)肽(该天然PTH(1-17)肽包含α-螺旋稳定的、或包含环化而没有对N-末端的α-螺旋进行稳定)相比，包含α-螺旋稳定的非天然氨基酸且在氨基酸13和17侧链间环化的PTH(1-17)类似物对于Saos-2 PTH1R显示了增强的效力。这些结果强烈显示了当与稳定的N-末端α-螺旋同时存在时，氨基酸13到17的环化对激动剂的体外效力的一般性正面作用。
相比于鼠的成骨细胞中的实验，SEQ ID NO：32的效力降低了3倍。在3个特定检测的例子中，α-螺旋稳定的环状PTH(1-17)类似物(SEQ ID：2、4、34)与天然PTH(1-17)肽相比，及与其线性和/或非α-螺旋稳定的对应物相比，对Saos-2 PTH1R上显示了增强的效力。因此，氨基酸13和17侧链间的共价键的引入进一步增强了PTH(1-17)类似物的效力。
实施例4
OVX大鼠模型的体内测试
卵巢切除的(OVX)大鼠可用于测试PTH类似物在体内对骨质减少/骨质疏松症的影响。缺乏卵巢激素使OVX大鼠产生骨质减少。骨质减少最早可于OVX 14天后被检测到，在之后100天内增强然后稳定下来(Wronski TJ等人，Calcif.Tissue Int.，43(3)：179-183，1988)。作为骨质疏松症的模型，OVX大鼠模型被权威界和工业界公认为“黄金标准”(Peter C，Rodan GA.Preclinical safety profile of alendronate.Int JClin Pract Suppl 1999；101：3-8，和Stewart AF，Cain RL，Burr DB，Jacob D，Turner CH，Hock JM)。
研究设计
动物
实验使用了178只雌性Fisher大鼠。最初，动物饲养于Macrolon 3型笼子(2只大鼠/笼)，处于受控条件(20℃，55-85％湿度)，遵照12∶12小时光/暗循环，灯照开始于6am。动物随意进食标准Altromin第1324号饮食(Chr.Petersen，Ringsted，Denmark)。动物可随意饮用水(驯养质量的自来水，添加柠檬酸至pH≈3)。加入实验时动物为6个月大。
手术和分组(stratification)
OVX前一周，动物按照体重分为2组，接受OVX(140只动物)或假手术(38只动物)。大鼠用枸橼酸芬太尼-多美康(Hypnorm-Dormicum)麻醉，通过中线剖腹术进行卵巢切除。假手术动物接受了中线切腹术，卵巢暴露但未切除(假手术)。这组作为年龄匹配的非骨质疏松对照组。手术中每只大鼠体内被植入一个微芯片，以便于动物的识别。
为减轻术后的疼痛，所有大鼠均在术后用丁丙诺啡(20mg/100g，皮下，一日两次)和美洛昔康(0.1mg/100g，皮下，一日一次)处理3天。所有大鼠均允许有6天的单独恢复，然后两两置入笼中。
为使骨质减少在处理前产生，动物不经药物处理饲养7周(预处理期)。在预处理期结束时，假手术和OVX手术的大鼠按照体重分组，分为6组，每组13-20只动物(表7)。这时，一个OVX组(N＝20)和一个假手术组(N＝20)被处死。这些对照组确定了骨矿物质密度(BMD)的基线水平。此外，贮存样品被以用于可能以后进行的对骨标记、骨强度、组织形态测定和μCT扫描的分析。
之后6周，一个假手术组和一个OVX组接受载体施用(40mM乙酸钠、45mM组氨酸和3.9％甘露醇，pH 5.5，300mOsm/kg)。5个OVX组用渐增剂量的环状PTH(1-17)类似物SEQ ID NO：19处理。另一OVX组用SEQ ID NO：33处理(表7)。所有药物均以皮下注射方式施予。处理6周后动物被处死。收集脊柱、胫骨和股骨进行DEXA扫描来分析BMD，贮存骨样品以用于以后的骨强度测量。
表7.剂量水平和分组
Figure A20078005102200481
生存时期内的数据收集
在预处理期过程中，动物体重每周记录2次。用GEDACO数据收集系统进行预处理期中的所有体内数据收集。给药期间每天记录体重。用GEDACO数据收集系统进行处理期过程中的所有体内数据收集。每天记日志，描述数据库中未记录的任何不良事件。
活体解剖
处死之前的第10天，所有动物均接受施用四环素(20mg/kg腹膜内)，并在处死前的第2天接受施用钙黄绿素(15mg/kg腹膜内)。在开始用化合物处理之前的一周中，处死一组OVX动物和一组假手术动物(组9-10)。在给药期结束时，处死剩下的动物。
收集腰椎(L4-L5-L6-S1)、左股骨和胫骨，洗净，包裹于盐水湿润的纱巾中置于管内，贮存于-20℃用于以后的离体骨强度测量。收集右股骨和胫骨、及腰椎(T13-L1-L2-L3)和尾椎(S2-S3-C1-C2-C3)，洗净，贮存于70％乙醇中用于骨矿物质密度(BMD)分析和可能以后进行的的组织形态测定和/或μCT扫描。
DEXA测定骨矿物质密度
离体BMD的测量在研究结束时进行，使用Lunar Piximus II光密度计(GE Healthcare，Chalfont St.Giles，UK)，精密度为1.5％。仪器的校准使用铝/有机玻璃模型。
胫骨、股骨和腰骨(L1-L2)和骶部/尾部(S3-C1)脊柱碎片置于成像定位盘，扫描4次。所有样品均用相似的方向放置以作正确比较。使用仪器提供的Piximus图像分析软件在扫描中生成目的区域(ROI)。ROI定义为生长面下的胫骨近端(2mm区域(section))、股骨头、股骨干(中间1/3)和腰部脊柱的两节椎体(不含背棘)。
骨强度的测量
用压迫器进行骨强度测量(Lloyd Instruments，Fareham，UK)。使用定制的持器帮助骨定位，以达到最大的重复性。测量了导致骨折的最大力。
数据分析和统计
用针对单向分类数据(BMD)的单向方差分析进行组间的总体比较。对于组间的个体比较，用费雪最小显著差异法进行事后分析。在5％水平上认为差异显著。所有数据均表示为平均值±平均标准误差。
结果
OVX研究
在代表骨密质(股骨干)和主要小梁骨(胫骨近端、股骨头、腰椎)的不同位点评估骨矿物质密度。在20nmol/kg/d到320nmol/kg/d的剂量，无论在哪个测量位点，用具有α-螺旋稳定的环状PTH(1-17)类似物SEQ ID NO：19处理的实验组所得到的骨矿物质密度均显著高于载体处理的卵巢切除大鼠(图6-9)。在高于20nmol/kg/d的剂量，SEQ ID NO：19的骨合成作用甚至导致(实验组的)骨矿物质密度比用载体处理的假手术大鼠还高(图6-9)。
在5nmol/kg/d的剂量，在所有测试位点上，同源二聚体SEQ ID NO：33也导致骨矿物质密度比用载体处理的卵巢切除大鼠显著增高(图6-9)。
此外，在用SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：33处理的组中，股骨在股骨干区域(骨密质)和股骨头区域(小梁骨)的骨强度比在载体处理的OVX组中观察到的水平显著增高(图10和11)。用SEQ ID NO：19处理的组在剂量高于20nmol/kg/d时，其骨强度显著高于用载体处理的假手术组的水平(图10和11)。
结论
包含α-螺旋稳定的非天然氨基酸且在氨基酸13和17侧链间环化的一个PTH(1-17)类似物(SEQ ID NO：19)在骨密质和小梁骨中显示骨合成活性。该骨合成活性在最低剂量(20nmol/kg/d)至少可以使骨矿物质密度正常化，但在更高剂量上可以使其增高至显著高于在对照动物中观察到的值。因此，SEQ ID NO：19是证实有骨合成活性的至今最短PTH类似物。相反，包含非天然α-螺旋稳定氨基酸、不具有形成环化结构的能力的PTH(1-14)类似物则缺乏骨合成活性，尽管此PTH类似物以与我们的PTH(1-17)类似物(SEQ ID NO：19)相似的效力活化PTH1R受体的cAMP途径(Rhee，Y.等人，(2006)Yonsei Medical Journal，47，214-222)。
与用载体处理的OVX组相比，在5nmol/kg/d的剂量，二聚的PTH(1-17)类似物(SEQ ID NO：33)也有效，且显著增高骨矿物质密度和骨强度。因此，我们的短PTH类似物设计带来了新的骨合成PTH类似物种类，可能对治疗与骨丢失相关的疾病如绝经后骨质疏松症有用处。
实施例5
CYP2D6抑制的体外测试
方法和材料
所有用于CYP2D6抑制测定的化学药品和试剂列于表8。测试化合物(1mM)的储存溶液配制于50％异丙醇或20％DMSO中。合并的人肝微粒体(HLM，终浓度0.05mg蛋白质/mL)与下列物质混合：磷酸缓冲液(0.1M磷酸钾，pH7.4)、CYP2D6底物(右甲吗喃，5μM终浓度)和测试化合物(10μM)、奎尼丁(0.5μM)或载体(0.2％DMSO或0.5％异丙醇)。反应开始前将混合物于37℃预孵育5分钟，加入NADPH再生混合物(终浓度：1.25mM NADP+，3.3mM葡萄糖-6-磷酸、3.3mMMgCL2和0.4U/mL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)起始反应。5分钟后加入0.25体积的终止试剂(94％乙腈，6％乙酸)停止反应。各实验以一式两份或三份进行
用LC/MS/MS定量CYP2D6产物(右啡烷)。10,000g离心5分钟后，将40μL上清注入C8RP-HPLC柱(XterraMS，C8，2.5μM，50×2.1mm)。右啡烷用处于0.1％甲酸中的0到90％线性梯度的乙腈洗脱4分钟，使用0.15ml/分钟流速。反应混合物中的右啡烷浓度通过MS/MS跃迁(transition)(m/z 258.1＞199)的峰面积计算，使用外部校准曲线(表8)。
表8：用于CYP2D6抑制测定的化学药品和试剂
Figure A20078005102200511
Figure A20078005102200521
数据分析
HLM中的CYP2D6活性以代谢产物形成速率计算：
其中，v是形成速率，[代谢产物]是在一定时间(t，分钟)时检测到的右啡烷的浓度(pmol/mL)，[蛋白质]是反应混合物中的蛋白质浓度(mg/mL)。测试化合物对CYP2D6活性的影响以占与载体孵育时测量的CYP2D6活性的百分比来计算。CYP2D6抑制剂(奎尼丁)的效果作为抑制对照包含于每批分析中。CYP2D6活性降低到少于载体对照的70％时认为是显著的。
结果
线性截短的PTH化合物使CYP2D6活性降低至与载体孵育时所观察到活性的22-57％(SEQ ID NO 31、42、3、37、1和35，表9)。当在氨基酸位置13和17间引入分子内的环化时，对CYP2D6的抑制作用明显降低。即SEQ ID NO：42(线性，29％)对比SEQ ID NO：2(环状，67％)，和SEQID NO：1(线性，57％)对比SEQ ID NO：34(环状，107％)。环化的有益效果不与特定氨基酸间的环化相联系，因为发现Lys→Asp、Cys→Cys、Glu→Lys或Lys→Glu间的环化均能够改进CYP2D6的活性(表9)。
表9：与浓度为10μM的不同化合物孵育时，分子内环化对CYP2D6介导的右啡烷形成速度的影响。()表示分子内侧链的环化。
Figure A20078005102200523
Figure A20078005102200531
发现当分子内环化和特定氨基酸取代组合出现时有协同效应。Gln6取代为Glu，Met8取代为Leu、Nle或Val，Gln10取代为Glu或C端脱酰胺完全消除对CYP2D6的抑制(表10)。
表10：与浓度为10μM的不同化合物孵育时，单氨基酸取代对CYP2D6介导的右啡烷形成速度的影响。()表示分子内侧链的环化。
Figure A20078005102200532
结论
发现线性截短的PTH类似物抑制CYP2D6，当在氨基酸位置13和17间引入分子内环化时，该抑制效应明显降低。该抑制可进一步被位置6、8、10的特定氨基酸取代和C端修饰降低。
尽管本发明结合上述示例性实施方案进行描述，但本公开对本领域技术人员来说，很多等同的修饰和变化是显而易见的。因此，应认为本发明阐述的示例性实施方案是说明性的而非限制性的。所有本文引用的文献都明确地引用作为参考。

Claims (18)

1.具有生物学活性的PTH(1-17)类似物肽，其由组成如下的式I表示：
R1-Z1-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-Leu-A16-A17-Z2-R2
其中
R1为氢、NH2、RHN、RR3N，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
A1为Ac5c、Gly、Ser、Ala或任意α-螺旋稳定残基；
A2为Val或保守取代；
A3为Aib、Ala、Ser或任意α-螺旋稳定残基；
A4为Gln、Glu或保守取代；
A5为Ile或保守取代；
A6为Gln、Glu或保守取代；
A7为Leu或Phe或保守取代；
A8为Met、Leu、Nle、Val或保守取代；
A9为His或保守取代；
A10为Gln、Glu、Asp、Ala、Val或保守取代；
A11为Har、Arg、Ala、Ile、Lys或保守取代；
A12为Ala、Arg、His或保守取代；
A13为Lys、Orn、Asp、Glu、Cys、Dab或Dpr；
A14为Trp、Phe、Leu、Arg、His或保守取代；
A16为Asn、Asp，保守取代或缺失；
A17为Lys、Orn、Glu、Cys、Asp、Dab或Dpr；以及
R2为OH、OR、NRH、NRR3或NH2，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)；以及
A13和A17由一个或多个共价键连接，以及
Z1和Z2独立的缺失或是肽序列，所述肽序列为选自Ala、Leu、Met、Gln、Glu、Lys、Dab、Dpr和Orn的1-10个氨基酸单元；
或其同源二聚体、异源二聚体、或可药用的盐或其衍生物。
2.具有生物学活性的PTH(1-17)类似物肽，其由组成如下的式II表示：
R1-Z1-A1-Val-A3-Glu-Ile-A6-A7-A8-His-A10-A11-A12-A13-A14-Leu-A16-A17-Z2-R2
其中
R1为氢、NH2、RHN、RR3N，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
A1为Ac5c、Gly、Ser、Ala或任意α-螺旋稳定残基；
A3为Aib、Ala、Ser或任意α-螺旋稳定残基；
A6为Gln或Glu；
A7为Leu或Phe；
A8为Met、Leu、Nle或Val；
A10为Gln、Glu、Asp、Ala或Val；
A11为Har、Arg、Ala、Ile或Lys；
A12为Ala、Arg或His；
A13为Lys、Orn、Asp、Glu、Cys、Dab或Dpr；
A14为Trp、Phe、Leu、Arg或His；
A16为Asn、Asp或缺失；
A17为Lys、Orn、Glu、Cys、Asp、Dab或Dpr；
R2为OH、OR、NRH、NRR3或NH2，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)；以及
A13和A17由一个或多个共价键连接；以及
Z1和Z2独立的缺失或为肽序列，所述肽序列为选自Ala、Leu、Lys、Dab、Dpr和Orn的1-10个氨基酸单元；
或其同源二聚体、异源二聚体、或可药用的盐或其衍生物。
3.具有生物学活性的PTH(1-17)类似物肽，其由组成如下的式III表示：
R1-Z1-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-A6-Leu-A8-His-A10-A11-Ala-A13--A14-Leu-A16-A17-Z2-R2
其中
R1为氢、NH2、RHN、RR3N，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
A6为Glu或Gln；
A8为Met、Leu、Nle或Val；
A10为Gln或Glu；
A11为Har或Arg；
A13为Lys、Orn、Asp、Glu、Cys、Dab或Dpr；
A14为Trp或Phe，
A16为Asn、Asp或缺失；
A17为Lys、Orn、Glu、Cys、Asp、Dab或Dpr；
R2为OH、OR、NRH、NRR3或NH2，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)；以及
A13和A17由共价键连接，以及
Z1和Z2独立的缺失或为肽序列，所述肽序列为选自Ala、Leu、Lys、Dab、Dpr和Orn的1-10个氨基酸单元；
或其同源二聚体、异源二聚体、或可药用的盐或其衍生物。
4.具有生物学活性的PTH(1-17)类似物肽，其由组成如下的式IV表示：
R1-Z1-A1-Val-A3-Glu-Ile-A6-A7-A8-His-A10-A11-A12-A13-A14-Leu-A16-A17-Z2-R2
其中
R1为氢、NH2、RHN、RR3N，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
A1为Ac5c、Ac6c、Abu、Nva或Aib；
A3为Ac5c、Aib、Abu或Nva；
A6为Gln或Glu；
A7为Leu或Phe；
A8为Met、Leu、Val或Nle；
A10为Gln或Glu；
A11为Har或Arg；
A12为Ala或Arg；
A13为Lys、Glu、Asp或Cys；
A14为Trp或Phe；
A16为Asn、Asp或缺失；
A17为Glu、Cys、Asp或Lys；
R2为OH、OR、NRH、NRR3或NH2，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)；以及
A13和A17由一个或多个共价键连接，以及
Z1和Z2独立的缺失或为肽序列，所述肽序列为选自Ala、Leu、Lys、Dab、Dpr和Orn的1-10个氨基酸单元，；
或其同源二聚体、异源二聚体、或可药用的盐或其衍生物。
5.具有生物学活性的PTH(1-17)类似物肽，其由组成如下的式V表示：
R1-Z1-A1-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-A7-A8-His-Gln-A11-A12-A13-Trp-Leu-A16-A17-Z2-R2
其中
R1为氢、NH2、RHN、RR3N，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
A1为Ac5c或Ac6c；
A7为Leu或Phe；
A8为Met、Leu或Nle；
A11为Har或Arg；
A12为Ala或Arg；
A13为Lys或Glu；
A16为Asn或缺失；
A17为Glu或Asp；
R2为OH、OR、NRH、NRR3或NH2，其中R和R3各自独立代表C1-4烷基(例如甲基)；以及
A13和A17由一个或多个共价键连接，以及
Z1和Z2独立的缺失或为肽序列，所述肽序列为选自Ala、Leu、Lys、Dab、Dpr和Orn的1-10个氨基酸单元；
或其同源二聚体、异源二聚体、或可药用的盐或其衍生物。
6.根据权利要求1到5任一项的PTH(1-17)类似物肽，其中在13位和17位的氨基酸残基之间的一个或多个共价键包含内酰胺桥或半胱氨酸桥。
7.根据权利要求6的PTH(1-17)类似物肽，其中13和17位之间的共价键是内酰胺桥。
8.根据权利要求6的PTH(1-17)类似物肽，其中所述一个或多个共价键在2个PTH类似物间形成。
9.根据前述权利要求任一项的PTH(1-17)类似物肽，其与野生型人类PTH(1-17)相比，在A1到A17、包括A1和A17的残基之中包含2到14个取代。
10.根据前述权利要求任一项的PTH(1-17)类似物肽，其与野生型PTH相比，在1或3位包含1或2个取代，任选地同时在其他位置，包括6、7、8、10、11、12、13、14、16或17位，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。
11.根据前述权利要求任一项的PTH(1-17)类似物肽，其与野生型PTH相比，在1到10位包含取代，任选地同时在一个或多个其他位置，包括11、12、13、14、16或17位具有取代。
12.根据前述权利要求任一项的PTH(1-17)类似物肽，其包含13位取代为Asp、Lys、Orn、Glu或Cys，和/或17位取代为Lys、Asp、Orn、Glu或Cys。
13.根据权利要求1到12中任一项的PTH(1-17)类似物肽，其包含以下残基组合之一：
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：2)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Glu()Trp-Leu-Asn-Lys()-NH2(SEQ ID NO：8)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()Trp-Leu-Asn-Glu()-NH2(SEQ ID NO：9)
H-Ac6c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys()Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：10)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys()Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：19)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Nle-His-Gln-Har-Ala-Lys()Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：20)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Arg-Ala-Lys()Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：25)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()Phe-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：26)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Phe-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys()Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：27)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Arg-Lys()Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2(SEQ ID NO：28)
H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()Trp-Leu-Asp()-NH2(SEQ ID NO：30)
(H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asp()-NH2)2(SEQ ID NO：33)
(H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()-Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2)2(SEQ ID NO：39)
和13和17位的氨基酸之间的环化、其N端乙酰化形式、其C端酸形式，其同源二聚体或异源二聚体或可药用的盐和其衍生物。
14.根据权利要求1到13任一项的用于治疗的PTH类似物肽。
15.根据权利要求1到13任一项的PTH类似物肽在制备用于增加骨量的药物中的用途。
16.根据权利要求15的PTH类似物肽在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的用途，骨质疏松症如原发性骨质疏松症、内分泌性骨质疏松症(甲状腺功能亢进、甲状旁腺功能亢进、库欣综合征、肢端肥大症、1型糖尿病、肾上腺机能不全)、遗传性和先天性的骨质疏松症(成骨不全、高胱氨酸尿症、门克斯综合征和赖-戴综合征)、营养和肠胃疾病、血液疾病/恶性肿瘤(多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病、血友病、地中海贫血)、由于固定、慢性阻塞性肺疾病或风湿疾病(类风湿性关节炎、强直性脊柱炎)引起的骨质疏松症。
17.根据权利要求1到13任一项的PTH类似物肽在制备用于治疗原发性骨质疏松症或内分泌性骨质疏松症的药物中的用途。
18.药物组合物，其包含根据权利要求1到13任一项的PTH类似物肽和可药用的载体。
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