KR20090096506A - 환형 구조를 갖는 절두형 ｐｔｈ 펩티드 - Google Patents

환형 구조를 갖는 절두형 ｐｔｈ 펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 절두형 PTH 단편 PTH(1-17)의 환형 치환 동족체이고 바람직하게는 인간 PTH(1-34)의 요망되거나 유사한 생물학적 활성을 보유하는 PTH 펩티드를 제공한다.

Description

환형 구조를 갖는 절두형 ＰＴＨ 펩티드{TRUNCATED PTH PEPTIDES WITH A CYCLIC CONFORMATION}
본 발명은 환형 구조 특징을 갖는 펩티드 PTH(1-17)의 치환 동족체, 상기 동족체의 제조 방법 및 이의 의료적 용도에 관한 것이다.
부갑상선 호르몬
부갑상선 호르몬 (PTH), 84 아미노산 펩티드는 인체 중 이온화된 혈액 칼슘의 주요 조절체이다(Kronenberg, H. M., et al., In Handbook of Experimental Pharmacology, Mundy, G. R., and Martin, T. J., (eds), pp. 185-201, Springer-Verlag, Heidelberg, 1993). 또한, 전체 길이 PTH는 간헐적으로 투여되는 경우에 뼈에 동화작용성이다는 것은 공지되어 있다(Dempster, D. W., et al., Endocr. Rev., 14: 690-709, 1993).
PTH(1-34) 및 PTH(1-84)는 동물 연구에서 골밀도 및 골강도를 효과적으로 증가시키는 것으로 나타났다. 더욱이, 이러한 PTH 변이체에 의한 골다공증 환자의 치료는 새로운 골다공 골절의 발병률을 감소시킨다(Greenspan, S. L. et al., Ann. Intern. Med., 146: 326-339, 2007 and Neer,R.M. et al. N. Engl. J. Med. 344: 1434-1441, 2001).
PTH(1-84) 및 PTH(1-34)에 의한 치료가 골강화를 촉진하고 골절을 예방하지만, 각각의 투여 후 구역질과 일반적으로 관련된 칼슘의 일과성 동원 및 고칼슘혈증에 의해 내약성이 제한된다. 더욱이, 이러한 펩티드는 경구로 또는 경점막으로 이용될 수 없으며, 매일 주사되어야 한다.
또한, 단축형 PTH 동족체는 뼈에 동화작용 효과를 유도하는 데 반복적으로 실패한다(Murrills,R. J. et al., Bone 35: 1263-1272, 2004 and Rhee,Y. et al., Yonsei Med. J., 47: 214-222, 2006). 환형이지만 여전히 상대적으로 큰 C 말단 절두형 동족체인 오스타볼린 (hPTH(1-31))은 예외이다(Whitfield, J. F. et al., Calcif . Tissue Int., 60: 26-29, 1997).
골다공증
폐경후 골다공증은 골절 위험성 증가와 관련되는, 골 밀도 및 강도의 감소를 특징으로 하는 골격 장애이다(Lane et.al., Clin. Orthop. Relat. Res., 139-50, 2000; Christiansen, Bone, 17: 513S-6S, 1995). 골다공 골절은 척추골, 힙(hip) 또는 고관절에서 가장 빈번히 발생한다. 이러한 골절은 통증, 장기 지속적인 부동성 및 빈약한 회복으로 인해 환자의 삶의 질에 심각한 손상을 준다.
뼈는 인체에서 매우 활성인 조직이다. 뼈는 2가지 유형의 세포: 뼈 재흡수 용골세포 및 뼈 형성 골아세포에 의해 연속적으로 리모델링된다. 골 재흡수가 골 형성을 초과하는 경우, 골다공증으로 발전할 수 있는 골 손실이 발생한다(Seeman and Delmas, N. Engl. J. Med. 354: 2250-61, 2006). 골다공증은 빈번히 골절이 발생하는 경우에 처음 진단된다.
폐경후 에스트로겐 결핍은 에스트로겐이 용골세포 수명 상의 중단을 유발시키기 때문에 상기 질환의 가장 일반적인 원인이다. 골다공증 발달의 다른 주요 임험 인자로는 낮은 칼슘 섭취, 비타민 D 결핍, 1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 약제, 예컨대 경련 방지제 및 코르티코스테로이드 및 남성에서의 낮은 수준의 테스토스테론을 들 수 있다.
PTH 동족체의 신호 전달 및 골 동화작용
PTH는 아데닐릴 시클라제/cAMP에 커플링하는 Ⅱ형 G 단백질 커플링된 7개의 트랜스 멤브레인 도메인 수용체인, PTH/PTHrP 수용체 (PTH1R)에 작용한다(Jueppner, H. et al., Science, 254:1024-1026, 1991). 이러한 수용체의 또다른 신호 전달 경로, 예컨대 세포내 칼슘, 단백질 키나제 C의 포스폴리파제 C 의존성 및 비의존성 활성의 상승이 기술되어 있다. 결손 분석 연구는 PTH의 아미노 말단 잔기가 PTH1R를 자극시켜 cAMP 및 IP3 신호 전달 경로를 활성화시키는 데 중요한 역할을 한다는 것을 나타내었다. PTH1R을 통한 신호 전달은 세포 유형, 수용체 밀도 등을 비롯한 다양한 파라미터에 의존하는 것으로 보인다. 뼈의 생물학적 활성을 유도하는 신호 전달 메카니즘은 아직 완전히 밝혀지지 않았다. cAMP를 통한 PTH1R c-AMP 신호 전달은 뼈 상의 PTH 동족체의 동화작용 효과에 대해서 필요성이 있으나 충분하지는 않은 것으로 생각된다.
따라서, 전체 길이 PTH (PTH(1-84)) 및 공지된 전체 활성 단편 PTH(1-34)는 간헐적으로 투여되고, 뼈 상에 임상적으로 확인되는 동화작용 활성을 보유한 다(Grenspan, S.L. et al., Ann. Intern. Med. 146:326-339, 2007; Neer, R. M., et al., N.E.J.M., 344: 1434-1441, 2001). 반대로, 골 동화작용 특성을 갖는 보다 작은 동족체에 대한 연구는 크게 실패하였다. 28 이상의 아미노산 길이를 갖는 C 말단 절두형 동족체는 골다공증의 동물 모델에서 동화작용성을 나타내었다(Whitfield J. F. et al., J. Bone Miner. Res., 15: 964 -970, 2000). 그러나, 추가 절두은 PTH1R의 cAMP 경로의 작동제 활성이 유지되는 경우에도 골 동화작용 활성의 완전한 손실을 유도하였다(Murrills R. J. et al., Bone, 35: 1263-72, 2004).
11만큼 적은 아미노산으로 구성된 짧은 동족체가 효능이 적은 PTH1R을 활성화시킬 수 있지만, 이러한 동족체의 골 동화작용 활성은 보고된 바 없으며, 기대되지 않는다.
WO 03/009804 및 WO 04/093902에서, PTH(1-14) 동족체의 1번 및 3번 위치에서의 α-나선 안정화 아미노산의 도입은 화합물의 cAMP 축적을 자극하는 성능을 향상시키는 것으로 제안되었다. 확인되는 가장 효능 있는 화합물로는 [Ac5c1, Aib3, Gln10, Har11, Ala12, Trp14] PTH(1-14) ([Ac5c1, Aib3] MPTH(1-14))가 있다. 그러나, 이러한 화합물들의 골 동화작용 활성은 나타나지 않았다. 그러나, 펩티드가 생체 내에서 PTH1R을 활성화시키지만 밀접하게 관련된 동족체 [Aib1,3, Phe7, Nle8, Arg11, Ala12, Trp14] PTH(1-14)는 난소절제된 래트의 골 상의 임의의 골 동화작용 활성을 나타내지 않았다(Rhee, Y. et al., Yonsei Medical Journal, 47: 214-222, 2005). 더욱이, PTH(1-29)의 골 동화작용 활성은 난소절제된 래트 모델에서 PTH(1-34)보다 대략 20배 적은 효능을 나타내는 반면에, PTH(1-21)의 개질된 형태 ([Ala1,3, Nle8, Gln10, Har11, Trp14, Arg13, Tyr21] rPTH(1-21) (MPTH(1-21))는 비활성이다(Murrills, R.J. et al., (2004) Bone, 35, 1263-1272). 결론적으로, 실험관 내 PTH1R의 cAMP 신호 전달 경로 상의 작동제 활성만이 생체 내 골 동화작용 활성에 대해 전혀 예측가능한 것이 아니다.
시토크롬 P450 효소계
시토크롬 P450 (CYP) 효소계는 CYP 시스템에 의해 물질대사되는 약물의 95%의 물질대사의 원인이되는 5개(CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 및 CYP3A4)의 50개 이상의 인간 동형(isoform)으로 구성된다(P. Anzenbacher and E. Anzenbacherova, Cell. Mol. Life Sci., 58: 737-47, 2001). CYP 시스템에 의해 물질대사되고, 및/또는 이를 억제하는 약물의 공동투여는 체내에 약물 및/또는 중간생성물 독성 대사산물을 축적하여 심각한 부작용을 유발시킬 수 있다. 따라서, FDA는 모든 신규한 화학적 실체의 CYP 상호작용의 특성화를 권고한다(guidance for industry "drug metabolism/drug interaction studies in the drug development process: studies in vitro" U.S. Food and Drug Administration, April 1997). CYP 동형 중 하나인 CYP2D6는 모든 CYP 대사된 약물의 25%의 물질대사에 대한 원인인 것으로 예상된다. CYP2D6 억제의 심각한 잠재성은 티오리단진의 확인된 심장독 성이며, 이는 CYP2D6와 관련된 약물의 잠재적인 위험성을 나타낸다(Llerena A. et al., J. Phychopharmacol., 16(4): 361-4, 2002).
발명의 개요
넓게는, 본 발명은 C 말단 절두형 PTH 단편, 예를 들어 PTH(1-17)의 환형 치환 동족체이고, 바람직하게는 인간 PTH(1-34)의 소정의 생물학적 활성을 유지하는 PTH 펩티드를 제공한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 환형 PTH 펩티드는 이량체의 형태로 제공된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명은 성체 척추 동물에서의 회골 형성을 유도하는 CYP450 효소 및/또는 골 동화작용 활성의 간섭이 적은 PTH 동족체를 제공한다. PTH(1-34)에 비하면 본 발명의 상대적으로 작은 크기의 펩티드 동족체는 경구, 경비 또는 폐 투여를 위한 제형에 사용될 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 잔기 위치는 전체 길이의 야생형 PTH(1-17)와 관련하여 넘버링된다. 따라서, 예를 들어 11번 위치에 대한 언급은 PTH(1-17)의 N-말단으로부터의 제11 잔기의 언급으로서 간주되어야 한다. 이와 관련하여, 16번 위치에서 아미노산이 없는 본 발명의 실시양태에서, C 말단 아미노산은 여전히 17번 위치로서 정의됨이 주지되어야 한다.
특히, 본 원은 야생형 PTH(1-17)에 대해서 1 이상의 치환을 보유하고, 야생형 PTH(1-17) 및 [Ac5c1, Aib3] MPTH(1-14)에 비해 향상된 특성을 보유할 수 있는 PTH(1-17) 펩티드에 관한 것이다. 상기 치환은 1 이상의 비보존적 아미노산 치환을 임의로 동반하는 임의의 아미노산 위치에서의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 특 히, 본 발명은 잔기 A13 및 잔기 A17 사이의 환형 결합, 예를 들어 상기 위치에서의 아미노산 잔기의 측쇄들 사이에 형성된 환형 결합에 관한 것이다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 하기로 구성되는 화학식 (I)으로 표시되는 생물학적 활성 PTH(1-17) 동족체 펩티드, 또는 이의 동종이량체, 이종이량체 또는 화학적으로 허용가능한 염 또는 유도체에 관한 것이다:
R1-Z1-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-Leu-A16-A17-Z2-R2
상기 식 중,
R1은 수소, NH2, RHN, RR3N이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸을 의미하고;
A1은 Ac5c, Gly, Ser, Ala 또는 임의의 알파-나선 안정화 잔기이며;
A2는 Val 또는 보존적 치환이고;
A3는 Aib, Ala, Ser 또는 임의의 알파-나선 안정화 잔기이며;
A4는 Glu 또는 보존적 치환이고;
A5는 Ile 또는 보존적 치환이며;
A6는 Gln, Glu 또는 보존적 치환이고;
A7은 Leu 또는 Phe 또는 보존적 치환이며;
A8은 Met, Leu, Nle, Val 또는 보존적 치환이고;
A9은 His 또는 보존적 치환이며;
A1O은 Gln, Glu, Asp, Ala, Val 또는 보존적 치환이고;
A11은 Har, Arg, Ala, Ile, Lys 또는 보존적 치환이며;
A12는 Ala, Arg, His 또는 보존적 치환이고;
A13는 Lys, Orn, Asp, Glu, Cys, Dab 또는 Dpr이며;
A14는 Trp, Phe, Leu, Arg, His 또는 보존적 치환이고;
A16은 Asn, Asp, 보존적 치환 또는 부재이며;
A17은 Lys, Orn, Glu, Cys, Asp, Dab 또는 Dpr이고;
R2는 OH, OR, NRH, NRR3 또는 NH2이며, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸)을 나타내고;
A13 및 A17은 1 이상의 공유 결합에 의해 결합되며;
Z1 및 Z2는 독립적으로 부재이거나, Ala, Leu, Met, Gln, Glu, Lys, Dab, Dpr 및 Orn로 구성된 군으로부터 선택되는 1-10 아미노산 단위의 펩티드 서열이다.
당업계에 공지된 바와 같이, 알파-나선 안정화 잔기로는 Gly, Ser 및 Ala뿐만 아니라, 비천연 아미노산 잔기, 예컨대 Ac5c, Ac6c, Abu, Nva 및 Aib를 들 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 하기로 구성된 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 생물학적 활성 PTH(1-17) 동족체 펩티드, 또는 이의 동종이량체, 이종이량체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체를 제공한다:
R1-Z1-A1-Val-A3-Glu-Ile-A6-A7-A8-His-A1O-A11-A12-A13-A14-Leu-A16-A17- Z2-R2
상기 식 중,
R1은 수소, NH2, RHN, RR3N이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸을 나타내며;
A1은 Ac5c, Gly, Ser, Ala 또는 임의의 알파-나선 안정화 잔기이고;
A3는 Aib, Ala, Ser 또는 임의의 알파-나선 안정화 잔기이며;
A6는 Gln 또는 Glu이고;
A7은 Leu 또는 Phe이며;
A8은 Met, Leu, Nle 또는 Val이고;
A1O은 Gln, Glu, Asp, Ala 또는 Val이며;
A11은 Har, Arg, Ala, Ile 또는 LyS이고;
A12는 Ala, Arg 또는 His이며;
A13은 Lys, Orn, Asp, Glu, Cys, Dab 또는 Dpr이고;
A14은 Trp, Phe, Leu, Arg 또는 His이며;
A16은 Asn, Asp 또는 부재이고;
A17은 Lys, Orn, Glu, Cys, Asp, Dab 또는 Dpr이며;
R2는 OH, OR, NRH, NRR3 또는 NH2이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸)을 나타내며;
A13 및 A17은 1 이상의 공유 결합에 의해 결합되고;
Z1 및 Z2는 독립적으로 부재이거나, Ala, Leu, Lys, Dab, Dpr 및 Orn로 구성된 군으로부터 선택된 1-10 아미노산 단위의 펩티드 서열이다.
추가 양태에서, 본 발명은 화학식 (Ⅲ)을 갖는 치환된 PTH(1-17) 동족체 펩티드, 또는 이의 동종이량체, 이종이량체 또는 허용가능한 염 또는 유도체를 제공한다:
R1-Z1-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-A6-Leu-A8-His-A10-A11-Ala-A13-A14-Leu-A16-A17-Z2-R2
상기 식 중,
R1은 수소, NH2, RHN, RR3N이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸을 나타내며;
A6는 Glu 또는 Gln이고;
A8은 Met, Leu, Nle 또는 Val이며;
A10은 Gln 또는 Glu이고;
A11은 Har 또는 Arg이며;
A13은 Lys, Orn, Asp, Glu, Cys, Dab 또는 Dpr이고;
A14은 Trp 또는 Phe이며;
A16은 Asn, Asp 또는 부재이고;
A17은 Lys, Orn, Glu, Cys, Asp, Dab 또는 Dpr이며;
R2는 OH, OR, NRH, NRR3 또는 NH2이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸)을 나타내며;
A13 및 A17은 1 이상의 공유 결합에 의해 결합되고;
Z1 및 Z2는 독립적으로 부재이거나, Ala, Leu, Glu, Lys, Dab, Dpr 및 Orn으로 구성된 군으로부터 선택되는 1-10 아미노산 단위의 펩티드 서열이다.
추가 양태에서, 본 발명은 하기로 구성된 화학식 (Ⅳ)로 표시되는 생물학적 활성 PTH(1-17) 동족체 펩티드, 또는 이의 동종이량체, 이종이량체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체를 제공한다:
R1-Z1-A1-Val-A3-Glu-Ile-A6-A7-A8-His-A10-A11-A12-A13-A14-Leu~A16-A17-Z2-R2
상기 식 중,
R1은 수소, NH2, RHN, RR3N이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸을 나타내며;
A1은 Ac5c, Ac6c, Abu, Nva 또는 Aib이고;
A3는 Ac5c, Aib, Abu 또는 Nva이며;
A6는 Gln 또는 Glu이고;
A7은 Leu 또는 Phe이며;
A8은 Met, Leu, Val 또는 Nle이고;
A1O은 Gln 또는 Glu이며;
A11은 Har 또는 Arg이고;
A12는 Ala 또는 Arg이며;
A13은 Lys, Glu, Asp 또는 Cys이고;
A14은 Trp 또는 Phe이며;
Al6은 Asn, Asp 또는 부재이고;
A17은 Glu, Cys, Asp 또는 Lys이며;
R2는 OH, OR, NRH, NRR3 또는 NH2이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸)을 나타내며;
A13 및 A17은 1 이상의 공유 결합에 의해 결합되고;
Z1 및 Z2는 독립적으로 부재이거나, Ala, Leu, Lys, Dab, Dpr 및 Orn로 구성된 군으로부터 선택되는 1-10 아미노산 단위의 펩티드 서열이다.
추가 양태에서, 본 발명은 하기로 구성되는 화학식 (V)로 표시되는 생물학적 활성 PTH(1-17) 동족체 펩티드, 또는 이의 동종이량체, 이종이량체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체를 제공한다:
R1-Z1-A1-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-A7-A8-His-Gln-A11-A12-A13-Trp-Leu-A16-A17-Z2-R2
상기 식 중,
R1은 수소, NH2, RHN, RR3N이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸을 나타내며;
A1은 Ac5c 또는 Ac6c이고;
A7은 Leu 또는 Phe이며;
A8은 Met, Leu 또는 Nle이고;
A11은 Har 또는 Arg이며;
A12은 Ala 또는 Arg이고;
A13은 Lys 또는 Glu이며;
A16은 Asn 또는 부재이고;
A17은 Glu 또는 Asp이며;
R2는 OH, OR, NRH, NRR3 또는 NH2이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸)을 나타내며;
A13 및 A17은 1 이상의 공유 결합에 의해 결합되고;
Z1 및 Z2는 독립적으로 부재이거나, Ala, Leu, Lys, Dab, Dpr 및 Orn로 구성된 군으로부터 선택되는 1-10 아미노산 단위의 펩티드 서열이다.
측쇄 대 측쇄 고리화 또는 가교, 예컨대 비한정적으로 아미드(락탐), 에스테르(락톤), 에테르, 케톤 또는 디설파이드에 대한 많은 가능물들이 있다(Synthetic Peptides, A users guide. 2nd ed. 2002. Oxford University Press. Ed. Grant, G.A). 이러한 가능물들 중 임의의 것을 사용하여 상기 정의된 식에서의 A13 및 A17 아미노산 잔기의 측쇄에 공유 결합할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, A13 및 A17 간의 공유 결합은 락탐 가교 또는 시스테인 가교를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, PTH 동족체는 이량체의 형태로 제공된다. 이러한 이량체는 PTH 동족체, 예컨대 비한정적으로 Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asn-Asp-NH2의 동족이량체로서 형성될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 형성되는 이량체는 2개의 상이한 PTH 동족체, 예컨대 비한정적으로 Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asn-Asp-NH2 및 Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asp-NH2의 이종이량체이다.
추가 양태에서, 본 발명은 잔기 A1 내지 A17(A1 및 A17 포함)에서 야생형 인간 PTH(1-17)에 대한 2 이상 내지 14 이하의 치환을 포함하는, 치환 PTH(1-17) 펩티드에 관한 것이다.
화학식 (I), (Ⅱ) 또는 (Ⅲ)의 펩티드는 임의로 야생형 PTH에 대한, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 16 또는 17 번 위치를 비롯한 추가 위치에서의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환과 함께, 1번 또는 3번 위치에서의 1 또는 2개의 치환을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 동족체에 존재할 수 있고 화학식 (I)∼(Ⅲ) 내에 포함되는 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 16 또는 17 번 위치에서의 잔기 조합의 예로는 하기가 있다:
Figure 112009041057268-PCT00001
Figure 112009041057268-PCT00002
여기서, 괄호 ( )는 고리화 부분을 나타낸다.
본 발명의 펩티드의 보존적 치환은 하기 표 1(여기서, 천연 아미노산에 대한 하나의 문자 코드를 사용함)에서 도시되는 바와 같이 I∼Ⅴ의 5개의 군으로 그룹화하였다:
물리화학적 특성으로 그룹화된 아미노산의 보존적 치환 I: 천연 친수성, Ⅱ: 산 및 아미드, Ⅲ: 염기성, Ⅳ: 소수성, V: 방향족 벌크 아미노산
I Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
A N H M F
S D R L Y
T E K I W
P Q V
G C
그러나, 본 발명의 또다른 실시양태에서, Z1 및/또는 Z2는 부재일 수 있다.
화학식 (I)∼(Ⅲ)의 범위 내에 포함되는 특정 펩티드 서열은 표 3에서 언급하게 된다.
더욱 특히는, 본 발명은 특히 PTH(1-17) 동족체의 A13 및 A17 사이에 공유 결합이 존재하는 PTH(1-17) 동족체에 관한 것이다. 본 원에서 도시되는 바와 같이, PTH(1-17) 동족체의 A13 및 A17 사이의 공유 결합은 공유 결합이 없는 유사한 PTH 작동제에 비해 상기 펩티드의 효능에 깊은 영향을 준다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 원에서 정의된 바와 같은 PTH 펩티드를 치료가 필요한 대상체에 투여하는 것을 포함하는 의료적 치료 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 요법에서 사용하기 위한 본 발명의 PTH 펩티드를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 또한 PTH 유도체 및 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 약학적으로 허용가능한 용액, 예컨대 염수 또는 생리학적 완충액을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 또한 골질량 감소를 특징으로 하는 포유류 병태의 치료 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 생물학적 활성 PTH 폴리펩티드의 골질량 증가 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 골다공증과 같은 병태이기 쉽다. 상기 유형의 골다공증으로는 비한정적으로 노년 골다공증 및 폐경기 골다공증이 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 PTH-1 수용체를 갖는 포유류 세포에서의 cAMP 증가 방법으로서, 본 발명의 폴리펩티드의 충분량과 상기 세포를 접촉시켜 cAMP를 증가시키는 방법을 제공한다.
추가로, 상기 폴리펩티드 동족체는 골손실이 있는 환자를 치료하는 데 유용하다. 골손실은 골다공증과 같은 병태, 글루코코르티코이드 유도성 골손실, 고코르티솔혈증(준임상적 및 임상적 둘 모두), 암, 고칼슘혈증, 신부전 또는 기타 신장 장애, 신장 이식 및 수반하는 약리학적 치료, 담즙정체성 간 질환, 바이러스성 간염, 간 이식에 의한 골손실, 부갑상선항진 질환, 기관지 천식(호르몬 의존성 포함), 혈액투석으로 인한 장애 및 골연화증으로부터 발생할 수 있다.
실시예에서 도시되는 바와 같이, 본 발명의 펩티드의 환형 공유 결합된 구조가 존재한다는 것은 선형 PTH(1-17) 동족체에 의해 관찰되는 시토크롬 P450 효소, 특히 CYP2D6의 억제를 방지하는 데 일조한다는 장점을 보유한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 원에서 도시되는 바와 같이, 본 발명의 고리화된 동족체는 겉보기 수준에 비해 난소절제(OVX) 래트 모델에서 골밀도 및/또는 골강도를 상당히 증가시키며, 이는 선형 PTH(1-17) 동족체에 의해 앞서 확인되지 않았다.
따라서, 서열 번호 19 및 기타 반환형 동족체가 PTH 수용체 상의 보존된 활성을 보유하고 CYP2D6 활성 상의 억제 효과의 부재 하에 골형성을 촉진한다는 사실은 상기 화합물에 의한 연장 치료가 상기 효소에 의해 대사된 기타 약물 또는 약초 생성물의 약동학에 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명자는 이러한 신규한 부류의 화합물에 의한 장기간 치료가 안정성 상승과 연관될 것으로 예상한다. 더욱이, 다수의 약물 및 약초 보조제를 빈번히 취하는 노령 개체군에서, 이러한 특징은 특히 중요할 수 있다. 초목-약물 상호작용에 대한 이용 정보가 거의 없기 때문에, 이들은 빈번히 내약성이 불량한 약물로서 오해된다. 따라서, CYP2D6 활성 효과의 부재는 전술한 약물에 대한 순응성에 있어서 잠재적으로 중요할 수 있으며, 결과적으로 보다 우수한 장기적인 효과를 제공할 수 있다.
본 발명의 실시양태는 첨부된 도면을 참조하여 한정이 아닌 예로서 더욱 자세하게 기술되게 된다.
도면의 간단한 설명
도 1: 신규한 PTH(1-17) 동족체에 의한 MC3T3-E1 세포 상의 대표적인 cAMP 효과 실험. 세포는 펩티드의 농도를 변화시키면서 포스포디에스테라제 억제제의 존재 하에 37℃에서 15 분 동안 자극시켰다. 에러 바(Error bar)는 3개의 표준 편차를 나타낸다.
도 2: 신규한 환형 단량체 서열 번호 30 및 상응하는 공유 결합 동종이량체 서열 번호 33에 의한 MC3T3-E1 세포 상의 대표적인 cAMP 효과 실험. 세포를 포스포디에스테라제 억제제의 존재 하에 37℃에서 15 분 동안 PTH 펩티드의 농도를 변화시키면서 자극하였다.
도 3: Saos-2 세포 상에서의 PTH(1-17) 동족체에 의한 cAMP 효과 분석. 환형 PTH 동족체 서열 번호 2는 동일한 α-나선 안정화 아미노산 잔기를 함유하는 비환형 동족체보다 현저히 높은 효능을 나타내었다. 에러 바는 평균의 표준 오차를 의미한다.
도 4: Saos-2 세포 상에서의 PTH(1-17) 동족체에 의한 cAMP 효능 분석. 환형 PTH 동족체 서열 번호 4는 동일한 α-나선 안정화 아미노산 잔기를 함유하는 비환형 동족체보다 높은 효능을 나타내었다. 도시된 데이타는 동일한 최대 효과를 갖는 2개의 분리 실험으로부터 조합하였다. 에러 바는 평균의 표준 오차를 의미한다.
도 5: Saos-2 상에서의 PTH(1-17) 동족체에 의한 cAMP 효과 분석. α-헥릭스 안정화 아미노산을 또한 함유하는 환형 PTH 동족체 서열 번호 34는 동일한 α-나선 안정화 아미노산 잔기가 있거나 없는 비환형 동족체 및 α-나선 안정화 아미노산이 결여된 환형 동족체보다 현저하게 높은 효능을 나타내었다. 단일 측정으로서 측정을 실시하였다.
도 6: DEXA 스캐닝에 의한 골밀도(BMD)의 측정. 지주골에서 풍분한 높은 반응성 부위를 나타내는 OVX 동물의 경골 근위부에서의 18% 골손실은 서열 번호 19 및 서열 번호 33에 의해 완전히 반전되었다. 에러 바는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 7: DEXA 스캐닝에 의한 골밀도(BMD)의 측정. 비히클 처리된 OVX 및 겉보기 동물에서의 BMD에 비해, 요추 L1-L2에서의 BMD가 서열 번호 19 및 서열 번호 33에 의해 향상되었다. 에러 바는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 8: DEXA 스캐닝에 의한 골밀도(BMD)의 측정. 서열 번호 19 및 서열 번호 33 처리된 동물에서의 BMD는 모든 투약에서 비히클 처리된 OVX 동물에 비해 상당히 증가하였고, 20 nmol/kg/일보다 높은 투약량에서 겉보기 대조군 수준보다 상당히 증가하였다. 에러 바는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 9: DEXA 스캐닝에 의한 골밀도(BMD)의 측정. 피층골이 풍부한 부위인 대퇴골체에서의 BMD는 서열 번호 19 및 서열 번호 33에 의해 향상되었다. 비히클 처리된 OVX 동물에 비해 BMD의 약 8% 증가가 주지되었다. 에러 바는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 10: 골강도 측정. 압축 시험에서의 대퇴골두의 골강도는 서열 번호 19 및 서열 번호 33에 의해 향상되었다. 골강도는 모든 투약량에서 비히클 처리된 OVX 및 겉보기 동물에서 보다 높았다. 에러 바는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 11: 골강도 측정. 3점 휨 시험에서의 대퇴골의 강도는 서열 번호 19 및 서열 번호 33에 의해 향상되었다. 골강도는 모든 투약량에서 비히클 처리된 OVX 동물에서 보다 높았으며, 20 nmol/kg/일보다 높은 서열 번호 19의 투약량은 비히클 처리된 겉보기 동물에 비해 증가된 강도는 유도하였다. 에러 바는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
정의:
설명 및 청구의 범위 전반에 걸쳐, 천연 아미노산에 대한 통상의 1자 및 3자 코드가 사용되며, 뿐만 아니라 기타 α-아미노산, 예컨대 노르루신 (Nle), 호모아르기닌 (Har), 1-아미노시클로펜탄카르복실산 (Ac5c), 2,4-디아미노부티르산 (Dab), 2,3-디아미노프로피온산 (Dpr), 2,5-디아미노펜타논산 (Orn) 및 α-아미노 이소부탄산 (Aib)에 대한 일반적으로 허용가능한 3자 코드가 사용된다.
본 발명의 PTH 동족체는 양성 또는 음성으로 하전되는 것으로 기술되는 잔기를 함유한다. 이는 해당 잔기의 측쇄 작용기가, 대락 7.4인 것을 생각되는 생리학적 pH에서 전부 또는 일부의 양전하 또는 음전하를 이송하는 것으로 이해되어야 한다.
단일 잔기는 부분적인 양전하를 이송할 수 없다는 것이 이해되게 된다. 이러한 용어는 대신 소정 시스템에서 동일한 서열을 갖는 펩티드의 전체 개체에 걸친 관련 잔기 상의 평균 전하를 의미한다. 이는 해당 잔기의 이온성 측쇄 작용기의 pK가 7.4의 약 2 pH 단위 내, 즉, 약 5.4 ∼ 약 9.4에 있는 경우에 0∼1에 있게 된다.
'양으로 하전된' 잔기의 pKa는 약 6 이상인 것인 바람직하다. '음으로 하전된' 잔기의 pKa는 약 8 이하인 것이 바람직하다. '양으로 하전된' 잔기의 예로는 Lys, Arg, Har, His, Orn, Dab 및 Dpr을 들 수 있다.
'음으로 하전된' 잔기의 예로는 Asp 및 Glu를 들 수 있다.
'중성' 잔기는 생리학적 pH에서 실질적으로 전하를 이송하지 않는 잔기이다. 이들로는 Gln, Asn, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val을 들 수 있다.
'방향족' 잔기로는 His, Phe, Tyr 및 Trp를 들 수 있다.
본 발명의 펩티드의 보존적 치환은 천연 아미노산에 대한 1자 코드가 사용되는, 하기 표 2에서 도시되는 바와 같은 I∼Ⅴ의 5개의 군으로 그룹화된다:
물리화학적 특성에 의해 그룹화된 아미노산의 보존적 치환. I: 중성, 친수성, Ⅱ: 산 및 아미드, Ⅲ: 염기성, Ⅳ: 소수성, Ⅴ: 방향족 벌크 아미노산
I Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
A N H M F
S D R L Y
T E K I W
P Q V
G C
본 발명의 아미노산 잔기는 D 또는 L 배열을 가질 수 있으나, 이들은 L 배열을 갖는 것이 바람직하다. 참조로서, PTH는 하기 서열 H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu-Gly-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Glu-Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asn-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH을 갖는 84 아미노산 펩티드로서 분비된다.
본 발명의 PTH 동족체는 상기 정의된 바와 같은 천연 PTH에 비해 1 이상의 아미노산 치환, 삭제 또는 첨가를 가진다.
놀랍게도, 치환된 PTH(1-17) 동족체 분자는, 하기 실시양태에서 예시되는 바와 같이 또한 생체 내에서 활성인 PTH 수용체, 예컨대 PTH-1 수용체에 대해 cAMP 축적 억제된 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
또다른 양태에서, 본 발명은 PTH(1-17) 및 [Ac5c1, Aib3] MPTH(1-14)에 비해 분해에 대한 향상된 화학적 및 약학적 안정성 둘 모두를 보유하는 신규한 펩티드를 제공한다.
6, 8, 10, 11, 13, 14, 16 또는 17 번 위치 중 1 이상에서 [Ac5c1, Aib3] MPTH(1-14)의 Ala, Leu, Nle, Val, Ser, Glu, Asp, Lys 또는 Arg에 의한 치환으로써의 개질은 분자의 화학적 안정성을 증가시키며, 따라서 저장 수명을 증가시키고 제형화 중 분해를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 동족체는 이의 아미노산 측쇄 작용기, 말단 아미노기 또는 말단 카르복실산기 중 1 이상의 화학적 개질을 포함할 수 있다. 화학적 개질은, 비한정적으로 화학적 부분의 첨가, 새로운 결합의 생성 및 화학적 부분의 제거를 포함한다. 아미노산 측기의 개질로는 비한정적으로 리신 엡실론-아미노 기의 아실화, 아르기닌, 히스티딘 또는 리신의 N-알킬화, 글루탐산 또는 아스파르트산 카르복실산기의 에스테르화, 및 글루타민 또는 아스파라긴의 탈아미드화를 들 수 있다. 말단 아미노의 개질로는 비한정적으로 데스-아미노, N-저급 알킬, N-디-저급 알킬 및 N-아실 개질을 들 수 있다. 말단 카르복실기의 개질로는 비한정적으로 아미드, 저급 알킬 아미드, 디알킬 아미드 및 저급 알킬 에스테르 개질을 들 수 있다. 여기서 저급 알킬은 C1-C4 알킬인 것이 바람직하다. 더욱이, 1 이상의 측기 또는 말단기는 당업계의 펩티드 화학자에게 공지된 보호기에 의해 보호될 수 있다.
본 원에서 사용되는 바와 같이, '생물학적 활성'이란 PTH 동족체 또는 이의 유도체의 골 동화작용 활성을 의미하며, 이는 OVX 래트 실험 모델을 사용한 실시예에서 확인되는 바와 같이 성체 척추 동물에서의 회골 형성을 유도한다. 이러한 생물학적 활성은 간헐적 투여 처방 계획으로 적절한 투약량에서 결정되는 것이 바람직하다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 PTH 펩티드의 추가적인 생물학적 활성은 이들이 시토크롬 P450(CYP) 효소의 활성을 상당히 억제하지 않는다는 것이다. 예를 들어, 바람직하게는 CYP 동형 특이성 대사산물의 형성 속도로서 측정되는 활성은 대조군, 예를 들어 비히클 단독 존재 하의 형성 속도에 비해 본 발명의 PTH 펩티드에 의해 30% 이하, 바람직하게는 20% 이하 감소된다는 것을 의미한다.
본 발명의 펩티드는 또한 염 또는 다른 유도체의 형태로 제공될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 염, 예컨대 산 부가 염, 염기성 염을 들 수 있다. 산 부가염의 예로는 염산염, 시트르산 염 및 아세트산 염을 들 수 있다. 염기성 염의 예로는 양이온이 알칼리 금속, 에컨대 나트륨 및 칼륨, 알칼리 토금속, 예컨대 칼슘 및 암모늄 이온 +N (R3)3 또는 (R4)(여기서, R3 및 R4는 독립적으로 임의로 치환된 C(1-6)-알킬 임의로 치환된 C(2-6)-알케닐, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 헤테로아릴을 의미함)으로부터 선택되는 염을 들 수 있다.
약학적으로 허용가능한 염의 또다른 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19th Edition, 1995] 및 문헌[the Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology]에 기술되어 있다.
본 발명의 PTH 동족체의 또다른 유도체로는 Mn2+ 및 Zn2+와 같은 금속 이온과의 배위 착물, 에스테르, 예컨대 생체 내 가수분해성 에스테르, 유리 산 또는 염기, 수화물, 프로드러그 또는 지질을 들 수 있다. 에스테르는 화합물 내에 존재하는 히드록실 또는 카르복실산 기, 및 적절한 카르복실산 또는 알콜 반응 파트너 사이에서 당업자에게 공지된 기법을 이용하여 형성할 수 있다. 상기 화합물의 프로드러그로서 작용하는 유도체는 생체 내 또는 시험관 내에서 모화합물 중 하나로 전환가능하다. 전형적으로, 화합물의 생물학적 활성 중 1 이상이 화합물의 프로드러그 형태에서 감소할 수 있으며, 상기 프로드러그의 전환에 의해 활성화되어 상기 화합물을 또는 이의 대사산물을 방출할 수 있다. 프로드러그의 예는 계 내 방출 활성 화합물에서 제거되거나 생체 내 약물의 클리어런스를 억제하는 작용을 할 수 있는 보호기의 사용을 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, Z1 및 Z2는 1∼10 아미노산 잔기, 2∼8, 특히 3∼6 범위의 아미노산 잔기, 예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 6 아미노산 잔기의 펩티드 서열이다. 전형적으로, Z1 및 Z2 중 하나, 예컨대 Z1만이 존재한다. 펩티드 서열 Z 중 아미노산 잔기 각각은 독립적으로 Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Orn로부터 선택된다. 바람직하게는 아미노산 잔기는 Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Lys, Arg, His, Orn, Dab 및 Dpr, 특히 Lys로부터 선택된다. 전술한 아미노산은 D 또는 L 배열을 가질 수 있으나, 바람직하게는 전술한 아미노산은 L 배열을 가진다.
분자의 N 및/또는 C 말단에서의 이러한 펩티드는 PTH 동족체 펩티드의 가용성을 증가시키고 안정성, 예를 들어 프로테아제 활성에 대한 안정성을 증가시켜 향상된 약동학적 특성, 예컨대 증가된 반감기 및 감소된 응집 경향을 유도하는 것으로 생각된다.
PTH 펩티드의 예는 하기 표 3에 도시되어 있다. 일부 펩티드는 대조군이며 본 발명의 펩티드와의 비교로 제공된다(예를 들어, PTH1-34, 서열 번호 32 참조). 본 발명의 펩티드의 바람직한 군은 하기 표에서 굵은 문구로 나타내었다.
관련 펩티드
Figure 112009041057268-PCT00003
Figure 112009041057268-PCT00004
Figure 112009041057268-PCT00005
여기서, 괄호 ()는 고리화 부분을 나타냄.
전술한 바와 같이, 본 발명은 특히 PTH(1-17) 동족체의 A13 및 A17 사이에 공유 결합이 존재하는 PTH 동족체에 관한 것이다. 상기 공유 결합에 의한 펩티드의 수득한 환형 구조는 공유 결합이 없는 유사 PTH 작동제에 비해 시험관 내에서의 상기 펩티드의 효능에 대해 이로운 효과를 보유한다. 특히, 더욱 중요하게는, 고리화된 동족체는, 28 보다 짧은 아미노산의 선형 PTH 동족체에서 앞서 나타나지 않은 효과인, 난소절제된 래트 모델에서의 골밀도 및 골강도 증가를 나타내었다.
본 발명자는 또한 상기 공유 결합이 또한 선형 PTH(1-17) 및 PTH(1-14) 동족체와에서 나타난 바와 같이 시토크롬 P450 2D6의 억제를 방지한다는 것으로 생각한다.
본 원에서 사용되는 바와 같이, 용어 공유 결합은 그 단어의 의미 변화 없이 용어 고리화, 링크, 결합 또는 가교로 대체될 수 있다.
측쇄 대 측쇄 고리화, 예컨대 비한정적으로 아미드 (락탐), 에스테르 (락톤), 에테르, 케톤 또는 디설파이드에 대한 많은 가능성들이 있다(Synthetic Peptides, A users guide. 2. ed. 2002. Oxford University Press. Ed. Grant, G.A).
A13 및 A17 간의 공유 결합은 락탐 가교 또는 시스테인 가교를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 락탐 결합은 하기를 포함한다:
Figure 112009041057268-PCT00006
본 발명의 또다른 양태에서, Lysl3 및 Aspl7 간의 락탐 결합은 하기와 같은 과정을 포함한다:
Figure 112009041057268-PCT00007
또다른 양태에서, 본 발명은 2개의 PTH 동족체 간의 이량체의 형성에 관한 것이다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 형성된 이량체는 동일한 PTH 동족체, 예컨대 하기 반응식에 도시된 바와 같은 Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asn-Asp-NH2 (서열 번호 39)의 동족이량체이다:
Figure 112009041057268-PCT00008
본 발명의 추가 실시양태에서, 형성된 이량체는 2개의 상이한 PTH 동족체, 예컨대 하기 반응식에 도시되는 바와 같은 Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asn-Asp-NH2 및 Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asp-NH2의 이종이량체이다:
Figure 112009041057268-PCT00009
공유 결합에 의해 제공되는 펩티드의 환형 구조는 선형 PTH(1-17) 동족체에 의해 도시되는 바와 같이 시토크롬 P450 2DS의 억제를 예방한다. 더욱이, 고리화된 동족체는 본 원에서 PTH(1-34)에서와 동등할 만큼 난소절제된 래트 모데에서 골밀도 및 골강도를 증가시키는 것으로 나타나며, 이러한 결과는 선형 PTH(1-17) 동족체에 대해서는 앞서 도시되지 않았다. 따라서, 서열 번호 19 및 기타 반환형 동족체가 PTH 수용체 상에서 보존된 활성을 보유하고 CYP2D6 활성 상의 임의의 억제 효과 없이 골 형성을 촉진시킨다는 사실은 상기 화합물에 의한 장기 치료가 상기 효소에 의해 물질대사되는 다른 약물 또는 초목 생성물의 약동학에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명자는 상기 신규한 부류의 화합물에 의한 장기 치료가 안정성 상승과 연관될 것으로 예상한다. 더욱이, 다중 약물 및 초목 보충물을 빈번히 섭취하는 노령 개체군에서, 이러한 특징은 특히 중요할 수 있다. 초목-약물 상호작용 상의 정보가 거의 없기 때문에, 상기 약물의 내약성이 빈약한 것으로 빈번히 오해된다. 따라서, CYP2D6 활성의 효과 부재는 전술한 약물과의 상용성에서 잠재적으로 중요할 수 있으며, 이는 결과적으로 보다 우수한 장기적인 효과를 유도할 수 있다.
의학적 징후
본 원의 PTH 동족체는 비한정적으로 하기와 같은 병태의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다:
골다공증, 예컨대 원발성 골다공증, 내분비 골다공증 (갑상선기능항진증, 부갑상선기능항진증, 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 말단비대증, 1형 당뇨병, 부신기능부전), 골다공증의 유전성 및 선천성 형태 (골형성 부전증, 호모시스틴요증, 멘케스 증후군(Menkes' syndrome), 및 릴리 데이 증후군(Riley-Day syndrome)), 영양 및 위장 장애, 혈액학적 장애/종양 (다발성 골수종, 림프종 및 백혈병, 혈우병, 지중해빈혈), 고정으로 인한 골다공증, 만성 폐쇄성 폐질환 또는 류마티즘학적 장애 (류마티스 관절염, 강직성 척추염),
골손실에 이르게 되는, 골수염, 또는 뼈 내 감염성 손상,
고체 종양으로부터 유발되는 고칼슘혈증 (유방, 폐 및 신장) 및 혈액학적 종양 (다발성 골수종, 림프종 및 백혈병), 특발성 고칼슘혈증, 및 갑상선기능항진증 및 신장 기능 장애와 연관된 고칼슘혈증,
스테로이드 투여에 의해 유발되고 소장 및 대장의 장애 및 만성 간 및 신장 질환과 관련되는 수술 후 연골증,
외상성 손상과 연련된 골괴사증, 또는 골세포사, 또는 고셰 질환(Gaucher's disease), 겸상적혈구빈혈(sickle cell anaemia), 전신 홍반성 루프스 및 기타 병태와 연관된 비외상성 괴사,
치주 골손실,
골용해성 전이,
골절 치유, 및
과증식성 피부 장애, 예컨대 건선.
바람직한 징후로는 골다공증, 예컨대 원발성 골다공증, 내분비 골다공증 (갑상선기능항진증, 부갑상선기능항진증, 쿠싱 증후군 및 말단비대증), 골다공증의 유전성 및 선천성 형태 (골형성 부전증, 호모시스틴요증, 멘케스 증후군 및 릴리 데이 증후군), 팔다리 고정으로 인한 골다공증이 있다.
약학 조성물 및 투여:
본 발명의 PTH 동족체, 또는 이의 염 또는 유도체는 저장 및 투여용으로 제조되는 약학 조성물로서 제형화되며, 이는 약학적으로 허용가능한 담체에 본 발명의 PTH 펩티드 또는 이의 염 또는 유도체의 치료적 유효량을 포함한다.
PTH 동족체 또는 이의 염이 투여되는 대상체에서의 골질량을 회복하는 데 유효한 양으로 존재하는 약학 조성물을 제공하는 것은 본 발명 내에 존재한다.
의료 업계에서의 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 펩티드 또는 약학 조성물의 '치료적 유효량'이란 연령, 체중 및 치료되는 포유류 종류, 사용되는 특정 화합물, 특정 투여 방식 및 소정의 효과 및 치료적 징후에 따라 다르게 된다. 상기 양을 결정하기 위한 상기 요인들 및 이들의 관계는 의료 업계에서 공지되어 있기 때문에, 본 원에서 요망되는 소정의 결과를 달성하는 데 필요한 양은 당업자의 범위 내에 있게 된다.
본 원에서 사용되는 바와 같이, '치료적 유효량'은 소정의 병태 또는 병리의 증상을 감소시키고, 바람직하게는 그 병태 또는 병리를 갖는 개개에서의 생리학적 반응을 정상화하는 양이다. 증상 감소 또는 생리학적 반응의 정상화는 당업계에서 일반적인 방법을 이용하여 결정할 수 있으며, 소정의 병태 및 병리에 의해 변할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물의 투여는 낮은 투약량 수준에서 실시하며, 투약량 수준은 소정의 생리학적 효과가 달성될 때까지 증가시킨다. 이는 치료적 유효량을 정의하게 된다. 단독 또는 약학 조성물의 일부로서의 본 발명의 펩티드에 있어서, 상기 투약량은 약 0.5 ug/kg/일 또는 1 ug/kg/일 내지 약 1000.0 ug/kg/일일 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 펩티드의 유효량은 약 5.0 ug/kg/일 내지 약 500.0 ug/kg일이며, 더욱더 바람직하게는 상기 펩티드의 유효량은 약 10.0 ug/kg/일 내지 약 400.0 ug/kg/일이다.
치료적 용도에 있어서, 선택된 PTH 동족체는 약학적으로 허용되고 선택된 투여 경로에 의해 펩티드를 전달하는 데 적절한 담체에 의해 제형화된다. 본 발명의 목적을 위해, 경구, 직장, 비경 또는 하부 호흡(폐) 경로가 바람직하다. 이들은 소위 비주사형 경로이다. 본 발명에서 사용되는 특정 화합물은 또한 말초 비경구 경로, 예컨대 정맥내, 근육내, 피하 및 복막내 투여 경로에 의한 투여에 적합할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 PTH 동족체, 또는 이의 염 또는 유도체, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 적합한 약학적으로 허용가능한 담체로는 펩티드계 약물과 함께 통상적으로 사용되는 것, 예컨대 희석제, 부형제 등이 있다. 치료적 용도를 위한 약학적으로 허용가능한 담체는 약학 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19th Edition, 1995]에 기술되어 있다.
pH 완충제는 히스티딘 또는 아세트산나트륨일 수 있다. 보존제, 안정화제, 염료 및 향미제가 약학 조성물에 제공될 수 있다. 예를 들어, 페놀 나트륨 벤조에이트, 소르브산, 및 p-히드록시벤조산의 에스테르를 보존제로서 첨가할 수 있다. 또한, 항산화제 및 현탁제, 예컨대 SDS, 아스코르브산, 메티오닌, 카르복실 메틸 셀룰로스, EDTA, 폴리에틸렌 글리콜 및 Tween을 사용할 수 있다.
또다른 실시양태에서, PTH 펩티드 동족체의 약학적으로 허용가능한 산 부가 염이 제공된다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 투여를 위한 정제, 캡슐 또는 엘릭시르; 직장 투여를 위한 좌약; 주사 투약을 위한 멸균액 및 현탁액; 경비 또는 폐 투입을 위한 흡입용 제형; 등으로서 제형화되고 사용될 수 있다.
투약량 및 투여 방법은 최적의 효과를 달성하기 위해 조절될 수 있으나, 의료 업계의 당업자가 인정하게 되는 인자, 예컨대 체중, 식이 요법, 병용하는 약제 또는 기타 인자에 따라 다르게 된다.
투여 경로가 비주사형 경로, 예컨대 경구, 직장, 경비 또는 폐인 경우, 약학 조성물은 통상의 형태로 제조할 수 있다. 경구 투여는 액체 제형 또는 정제 또는 캡슐로 존재할 수 있다. 직장 투여는 좌약으로서 존재할 수 있다. 경비 및 폐 투여는 액체 또는 분말로서 존재할 수 있다.
투여가 매일 비경구, 예컨대 피하인 경우, 주사형 약학 조성물을 사용 직전 재구성에 적합한 수용액 또는 현탁액 동결건조된 고체 형태 또는 주사 전의 액체 중 현탁액 또는 에멀션의 통상의 형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제로는, 예를 들어 물, 염수, 덱스트로스, 만니톨, 락토스, 레시틴, 알부민, 글루탐산나트륨 및 시스테인 염산염이 있다. 또한, 필요한 경우, 주사형 약학 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 흡수 강화 제제(예를 들어, 리포솜)를 이용할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 화합물은, 예를 들어 종합 비경구 영양 요법 상의 환자를 위한 액체 영향 보충물로서 사용되는 경우의 주입에 의한, 또는 예를 들어 피하, 복막내 또는 정맥내 주사에 의한 투여를 위해 제형화되며, 따라서 멸균 및 무발열원 형태의 수용액으로서 사용되고, 임의로 생리학적 내성의 pH로 완충된다. 근육내 투여용 제형은 식물 오일, 예를 들어 카놀라유, 옥수수유 또는 대두유 중의 용액 또는 현탁액을 주성분으로 할 수 있다. 이러한 오일 주성분 제형은 항산화제, 예를 들어 BHA(부틸화 히드록시아니솔) 및 BHT(부틸화 히드록시톨루엔)에 의해 안정화될 수 있다.
따라서, 본 발명의 펩티드 화합물은 비히클, 예컨대 증류수 또는 염수, 인산 완충 염수, 5% 덱스트로스 용액 또는 오일로 투여될 수 있다. PTH 동족체의 가용성은, 필요한 경우 가용성 증대제, 예컨대 세제 및 유화제를 혼입하여 증대시킬 수 있다.
수성 담체 또는 비히클은 소정의 작용 부위로의 이의 서방출을 위해, 주사 부위 또는 부근에 PTH 동족체를 침착시키는 작용을 하는 상당량의 젤라틴을 갖는 주사물로서 사용하기 위해 보충할 수 있다. 대안적인 겔화제, 예컨대 히알루론산이 또한 침착제로서 유용할 수 있다.
PTH 동족체는, 단위 투약량 또는 다중 투약량으로 펩티드의 약리학적 유효량을 함유하는 살균 충전 바이알 또는 앰플의 형태로 사용될 수 있다. 상기 바이알 또는 앰플은 투여 준비 제형으로서 PTH 동족체 및 소정의 담체를 함유할 수 있다. 대안적으로, 상기 바이알 또는 앰플은 적합한 담체, 예컨대 멸균수 또는 인산 완충 염수에서의 재구성에 적합한 형태, 예컨대 동결건조된 형태로 PTH 펩티드를 함유할 수 있다.
환자 치료에 가장 적합한 치료적 투약량 및 투여 계획은 물론 치료하려는 질환 또는 병태, 및 환자 체중 및 기타 파라미터에 따라 다르게 된다. 임의의 특정 이론에 얽힘을 바람 없이, μg/kg 범위의 투약량 및 단기 또는 장기 지속 시간 또는 치료의 빈도가 치료적으로 유용한 결과는 생성할 수 있는 것으로 예상된다. 일부 양태에서, 치료적 투여 계획은 시초 치료의 중단 후 발생하는 조직 퇴화를 예방하는 데 적절한 유지 투약량의 투여를 포함할 수 있다. 인간 용도에 가장 적합한 투약량 크기 및 투여 계획은 본 발명에 의해 수득한 결과를 지침할 수 있으며, 적절히 고안된 임상 실험에서 확인될 수 있다.
효과적인 투약량 및 치료 프로토콜은 실험실 동물에서 적은 투약량으로 시작한 후, 효과를 모니터링하면서 상기 투약량을 증가시키며, 또한 투여 계획을 조직적으로 변경하는 통상의 방법에 의해 측정할 수 있다. 소정의 대상체를 위한 최적의 투약량을 결정하는 경우에 임상의는 수많은 인자를 고려할 수 있다. 이러한 고려는 당업자에게 공지되어 있다.
펩티드 합성:
PTH 동족체는, 예를 들어 고체상 또는 액체상 펩티드 합성에 의해 펩티드를 합성하고 이와 같이 수득한 합성 펩티드를 회수하는 것을 포함하는 방법을 비롯한 다수의 방법으로 합성할 수 있다. 바람직한 일반적인 절차는 하기 기술되어 있다. 그러나, 고체상 펩티드 합성의 더욱 자세한 설명은 WO 98/11125에서 확인된다.
장치 및 합성 전략
펩티드는, N-α-아미노 보호기 및 측쇄 작용기에 대한 적합한 일반적인 보호기로서 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc)을 사용하여 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에서 회분식으로 합성하였다.
용매
아세토니트릴 (HPLC 등급, Sigma-Aldrich, 독일 소재) 및 NMP (N-메틸피롤리돈, Univar Europe, 덴마크 소재)를 정제 없이 직접 사용하였다.
아미노산
Fmoc 보호된 아미노산을 적합한 측쇄 보호된 형태로 어드밴스드 켐테크(Advanced ChemTech, 미국 켄터키주 소재), 또는 플루카(Fluka, 독일 소재)로부터 구입하였다. 비천연 아미노산 1-(Fmoc-아미노)-시클로펜탄-1-카르복실산 (Ac5c), Fmoc-아미노이소부티르산 (Aib), Fmoc-Homoarg(pmc)-OH (Har)를 바켐(Bachem, 독일 소재)으로부터 구입한 Fmoc-Lys(A10e)-OH와 함께 존재하였다. Fmoc-Asp(OAll)-OH를 플루카(독일 소재)로부터 수득하였다.
커플링 시약
커플링 시약 디이소프로필카르보디이미드 (DIG)는 플루카(독일 소재)로부터 구입하였다.
고체 지지체
펩티드를 TentaGel S Ram 수지 0.23 mmol/g (랍 폴리메레(Rapp polymere), 독일 소재) 상에서 합성하였다.
촉매 및 기타 시약
디이소프로필에틸아민 (DIEA)을 퍼스펙티브 바이오시스템(Perspective Biosystem, 잉글랜드 소재)로부터, 피페리딘 및 피리딘을 리델-데 하엔(Riedel-de Haen, 독일 프랑크푸르트 소재)으로부터 구입하였다. 에탄디티올을 알드리히/플루카(Aldrich/Fluka, 독일 소재)로부터, 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt) 및 트리이소프로필실란 (TIS)을 플루카(독일 소재)로부터 구입하였다. O- (7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU)를 켐펩(ChemPep, 미국 마이애미 소재)으로부터 수득하였다. N-메틸모르폴린을 랜캐스터(Lancaster, 잉글랜드 소재)로부터 구입하였다. 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBop)를 어드밴스드 켐테크(미국 켄터키주 소재)로부터 수득하고, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐을 알드리히(독일 소재)로부터 수득하였다.
커플링 절차
NMP 중 DIC에 의해 적절한 N-α-보호된 아미노산 및 HOBt로부터 제조된 계 내 발생된 OBt 에스테르로서, 또는 NMP 중 DIEA에 의해 적절한 N-α-보호된 아미노산 및 HATU로부터 제조된 계 내 발생된 OAt 에스테르로서 아미노산을 커플링하였다.
N-α-아미노 보호기(Fmoc)의 탈보호
Fmoc 기의 탈보호를 NMP 중 20% 피페리딘(1 x 5 및 1 x 10 분)에 의해 처리한 후, NMP(5 x 15 ml, 각 5 분)로 세척함으로써 실시하였다.
OBt-에스테르의 커플링
3 당량의 N-α-아미노 보호된 아미노산을 3 당량의 HOBt 및 3 당량의 DIC와 함께 NMP에 용해시킨 후, 수지에 첨가하였다.
OAt-에스테르의 커플링
3 당량의 N-α-아미노 보호된 아미노산을 3 당량의 HATU 및 3 당량의 DIEA와 함께 NMP에 용해시킨 후, 수지에 첨가하였다.
산에 의한 수지로부터의 펩티드의 분열
펩티드를 92/1/2.5/2.5 % v/v 트리플루오로아세트산 (TFA, 리델-데 한, 독일 프랑크푸르트 소재)/TIS/물/에탄디티올에 의해 실온에서 2 시간 동안 처리하여 수지로부터 분열시켰다. 여과된 수지를 95% TFA-물에 의해 세척하고, 여과물 및 세척물을 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 에테르에 의해 침전시키고 아세트산-물로부터 냉동 건조시켰다. 미정제 생성물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석하고 질량 분석(MS)에 의해 확인하였다.
TentaGel 수지 (PEG-PS) 상에서의 회분식 펩티드 분석
TentaGel S Ram 수지 (Ig, 0.23 mmol/g)를 여과용 폴리프로필렌 필터가 구비된 폴리에틸렌 용기에 투입하였다. 상기 수지를 NMP (15 ml)에서 팽창시키고, NMP 중 20% 피페리딘으로 처리하여 링커 TentaGel S RAM 상의 초기 Fmoc 기를 제거하였다. 상기 수지를 드레인 처리하고 NMP에 의해 세척하였다. 서열에 따른 아미노산을 전술한 바와 같은 예비형성된 Fmoc-보호된 OBt 또는 OAt 에스테르 (3 당량)으로서 커플링시켰다. 상기 커플링을 달리 명시되지 않는 한 2 시간 동안 계속하였다. 상기 수지를 드레인 처리하고 NMP (5 x 15 ml, 각 5 분)에 의해 세척하여 과량의 시약을 제거하였다. 마지막 Fmoc 보호기의 탈보호 이전에, 락탐 가교를 우선 D(OAll) 및 K(A10c)의 탈보호 이후, 전술한 바와 같은 고리화에 의해 상기 수지 상에서 실시하였다. 합성, 고리화 및 Fmoc 탈보호 완료 후, 펩티드 수지를 NMP (3 x 15 ml, 각 5 분), 에탄올 (3 x 15 ml, 각 1 분) 및 최종적으로 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각 1 분)에 의해 세척하고 진공 건조시켰다. 펩티드를 전술한 바와 같이 수지로부터 분열시키고 미정제 펩티드 생성물을 분석하고 하기와 같이 정제하였다.
OAll 및 A10e의 탈보호
5 당량의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐을 N2 흐름 하에 2 분 동안 92.5/5/2.5 부피/부피% 클로로포름/아세트산/N-메틸모르폴린으로 구성된 용액에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 한 말단에 플러그되어 있고 폴리프로필렌 필터가 구비된 폴리에틸렌 용기에 투입된 펩티딜수지에 이송하고, N2 스트림 하의 실온에서 2 시간 동안 반응이 일어나도록 하였다. 이후 상기 수지를 드레인 처리하고 무색이 될 때까지 전술한 용액으로 세척하였다. 이후, 수지를 NMP 중 0.5% DIEA (3 x 5 분)으로 세척하고, 최종적으로 NMP (3 x 5 분)으로 세척하였다.
Lys 및 Asp 측쇄의 고리화
비보호된 D 및 K를 갖는 펩티딜 수지가 NMP 중 PyBop, HoBt 및 DIEA (각각 3 당량)의 용액과 밤새 반응하도록 하였다. 상기 수지를 드레인 처리하고, 새로운 부분의 반응 혼합물을 2 시간 동안 첨가하였다. 최종적으로, 수지를 드레인 처리하고 NMP에 의해 세척하였다.
HPLC 조건
HP 1100 쿼터내리 펌프, HP 1100 오토샘플러, HP 1100 컬럼 온도조절장치 및 HP 1100 다중 파장 검출기로 구성된 휴렛 팩커드 HP 1100 HPLC를 이용하여 구배 HPLC 분석을 실시하였다. LC 소프트웨어 (rev. A.06.01)에 대한 휴렛 팩커드 켐스테이션을 장치 제어 및 데이타 수집을 위해 사용하였다. 하기 칼럼 및 HPLC 완충 시스템을 이용하였다:
칼럼: LiChrospher 60, 4 x 25Omm, 10-15 μm
완충액: A: MQV 중 0.1% TFA; B: 0.085% TFA, 10% MQV, 90% MeCN.
구배: 0∼1.5 분 0% B
15∼25 분 0∼50% B
25∼30 분 50∼100% B
30∼35 분 100% B
35∼40 분 100∼0% B
40∼45 분 0% B
흐름 1, ml/분, 오븐 온도 40℃, UV 검출: l = 215 nm.
미정제 펩티드의 HPLC 정제
미정제 펩티드 생성물은 정제된 PerSeptive Biosystems VISION Workstation이었다. VISION 3.0 소프트웨어를 장치 제어 및 데이타 수집을 위해 사용하였다. 하기 칼럼 및 HPLC 완충 시스템을 이용하였다:
칼럼: VYDAC, C-18, 5 x 250 mm, 10∼15 μm
완충 시스템: 완충액: A: MQV 중 0.1% TFA; B: 0.085% TFA, 10% MQV, 90% MeCN.
구배: 47 분에 걸쳐 5% B ∼ 50% B
흐름: 35 ml/분, UV 검출: l = 215 nm 및 280 nm.
질량 분석
펩티드를 수퍼 구배 메탄올 (Labscan, 아일랜드 더블린 소재), 밀리-Q 물 (Millipore, 메사추세츠주 베드포드 소재) 및 포름산 (Merck, 독일 담슈타트 소재) (50:50:0.1 v/v/v)에 용해시켜 1∼10 mg/ml의 농도를 산출하였다. 펩티드 용액 (20 μl)을 +/- 0.1 m/z 정확도의 LCT 질량 분석기 (Micromass, 영국 맨체스터 소재)를 이용하여 ESI-TOF-MS에 의한 양극성 모드에서 분석하였다.
실시예 1:
화학 합성
TentaGel S Ram 상의 H-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys()Trp-Leu-Asn-Asp()-NH2의 펩티드 합성 (괄호는 측쇄 고리화 부분을 나타냄).
Dry TentaGel S Ram (0.23 mmol/g, 1.2 g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 구비된 폴리에틸렌 용기에 투입하고 N-말단 Ac5c의 커플링이 종결될 때까지 "TentaGel 수지 상의 회분식 펩티드 합성" 하에 기술된 바와 같이 처리하였다. 3개의 N-말단 아미노산을 3 당량의 HATU 및 DIEA (2 x 2 시)를 사용하여 OAt-에스테르로서 커플링하고, 다른 모든 아미노산을 전술한 바와 같이 OBt-에스테르로서 커플링하였다. 마지막 아미노산의 커플링 후, 수지를 드레인 처리하고 NMP에 의해 세척하며, Allyl 및 A10e를 'Allyl 및 A10e의 탈보호' 하에서 기술된 바와 같이 탈보호하고, 펩티드를 'Lys 및 Asp 측쇄에 의한 고리화' 하에서 기술된 바와 같이 고리화하였다. 고리화 후, 마지막 N-말단 Fmoc 기를 탈보호하고, 수지를 NMP, EtOH 및 에테르에 의해 세척하며, 진공 건조시켰다. 펩티드를 전술한 바와 같이 수지로부터 분열시켰다. 미정제 생성물을 HPLC 및 MS에 의해 분석하고, 순도는 24%인 것을 발견하 였으며, 펩티드의 존재를 MS에 의해 확인하였다(실측치 MH+ 2071.13, 이론치 MH+ 2071.11). 미정제 생성물의 산출량 259 mg. 펩티드를 전술한 바와 같이 96%로 정제하였다.
이량체 합성
서열 번호 30 Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-Leu-Asn-Asp-NH2의 동족이량체 합성의 예:
TentaGel S Ram 수지 상에서 이량체를 합성하고, 아미노산을 하기 순서로 커플링하였다: D(OAll)-Asn-Leu-Trp-Lys-(Dde-Lys(Fmoc))-(Fmoc-Asp-NH2)-Asn-Leu-Trp-(Dde-Lys(Fmoc))-Ala-Har-Gln-His-Met-Leu-Gln-Ile-Glu-Aib-Val-Ac5c. 제2 Dde-Lys (Fmoc)의 커플링 후, Asp 및 Lys 간의 고리화를 단량체 펩티드 합성에 대한 설명에 따라 실시하였다. 이후, Lys 상의 Dde 보호기는, NMP 중 2% 히드라진 (3 x 5 분)에서 펩티딜 수지를 교반하여 제거하였다. 이어서, 하기 아미노산은 K 상의 자유 아미노기에 6 당량으로 커플링하였다. 수지로부터의 펩티드의 분열 및 동종이량체의 추가 가공은 단량체 펩티드 분석에 대해 기술한 바와 같이 실시하였다.
실시예 2
MC3T3-E1 cAMP 효능 분석에서의 PTH 동족체의 시험관 내 시험
물질 및 방법
MC3T3-E1 서브클론 4 (무기화) (MC3T3-E1) 세포 (ATCC CR1-2593)를 37℃에서 95% 공기/5% CO2의 습윤 분위기 하에서 α-MEM(Invitrogen #32571)/10% 소 태야 혈정 + 페니실린/스트렙토마이신에서 성장시켰다.
펩티드를 인산 완충 염수에 용해시키고, 또한 0.1% 알칼리 처리된 카세인 (ATC) (Livesey and Donald, Clin. Chim. Acta 1982, 123: 193-8.) 및 1OO μM 이소부틸-메틸-크산틴 (IBMX, Sigma 15879)을 함유하는 티로드 완충액 (TB, Sigma, T2145)에 추가로 희석시켰다.
[125I]cAMP FlashPlate® 분석 (cat. no. # SMPlOO 1A, Perkin Elmer Life Sciences)을 이용하여 cAMP 농도를 측정하였다.
MC3T3-E1 세포를 96-미세적정 플레이트에서 10,000 세포/웰로 시딩하고, 효과 분석 전에 밤새 성장시켰다. 분석 당일에, 성장 배지를 흡입에 의해 조심히 제거하였다. 세포를 200 μl TB/0.1% ATC에 의해 1 회 세척하였다. 완충액을 lOOμl 반응 혼합물 (± 시험 펩티드, +100 μM IBMX)로 교체하고, 37℃에서 13 분 동안 항온 처리하였다. 빙냉 0.5 M HCl 25 μl을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 하기에서 세포를 얼음 상에서 60 분 동안 항온 처리하였다. 75 μl 아세테이트 완충액을 96-웰 cAMP 플래쉬플레이트 중 각각의 웰에 첨가하였다. 산 세포 추출물 25 μl 및 [125I]cAMP 용액 100 μl을 동일한 플래쉬플레이트에 첨가하였다. 플래쉬플레이트를 4℃에서 밤새 항온 처리하고, 흡입에 의해 비우며, 탑카운터에서 카운팅하였다.
연구 설계
모두 투약량에서 측정을 3회 실시하였다. 표준은 각 실험에서, 바람직하게는 각각의 플레이트에서 1회, 2회 또는 3회 측정으로서 포함된다.
농도 수준 및 군
효과는 10 pM ∼ 10 μM 범위의 농도에서 평가하였다.
데이타 분석 및 통계
농도 의존성 cAMP 반응은 GraphPad Prism vers. 4로 전송하고, 변환 및 플롯 처리하였다. 곡선을 S자 투약량 반응 곡선 비선형 피트(fit) Y = 바닥치 + (정상치-바닥치) / (1+10^((LogEC50-X)))(여기서, X는 농도의 로그이고, Y는 반응치임)에 대한 함수로 피팅하였다. Y는 바닥치에서 시작해서 정상치로 가는 S자 형태이다. pEC50 및 cAMP의 최대 유도된 농도를 평가하였다. 전체 통계 편차는 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 분석하였다. 피셔의 최소 유의성 시험을 이용하여 사후 비교를 실시하였다. 결과는 p가 0.05 이하인 경우에 유의한 것으로 고려하였다.
결과
MC3T3-E1 세포를 PCR에 의해 분석하고 PTH 수용체 1에 대한 mRNA를 나타내는 것으로 보여졌다(데이타 미기재). 양성 참조 화합물 PTH(I-34)은 상기 세포계에서 강한 cAMP 반응을 유도하였다. 몇몇 펩티드를 cAMP 효과 분석에서 비교하였다(표 4).
동족이량체 서열 번호 33을 포함하는 MC3T3-E1 분석에서 시험된 펩티드
Figure 112009041057268-PCT00010
괄호는 고리화 부위를 나타낸다.
환형 PTH(1-17) 동족체 및 대조군 펩티드의 효능 및 최대 효과를 표 5에 나타내었다.
MC3T3-E1 cAMP 효과 분석에서의 신규한 PTH 동족체의 pEC50 및 최대 효과치+SEM. 상기 값은 PTH(1-34)와 비교하였다. *: p<0.05 (피셔 LSD 시험); n = 측정수
Figure 112009041057268-PCT00011
모든 시험된 펩티드는 PTH 수용체 cAMP 신호전달 상에서 완전 작동제였다(표 5). 이의 투약량 반응 곡선은 단순 S자 곡선(1에 근접하는 힐 계수(Hill coefficient))에 의해 피팅할 수 있었다. 모든 데이타는 분석 내에 포함되는데, 즉, 아웃라이어(outlier)가 제거되지 않았다.
서열 번호 32는 EC50 값이 약 1 nM인 cAMP를 유도하였으며, 이는 유사한 분석 시스템 상의 공개 리포트와 일치한다(Rhee et. al., Yonsei Med. J,. 47: 214-22, 2006; Murrills et . al . , Bone, 35: 1263-72, 2004.)
서열 번호 2는 MC-3T3-E1 세포 상에서 시험된 새로운 짧은 PTH 동족체들 중에서 가장 효능있는 환형 PTH(1-17) 동족체였다. 서열 번호 2는 PTH(1-34)에 상당하는 EC50를 가지고, 이는 서열 번호 31, 서열 번호 3 및 서열 번호 42 보다 더욱 상당히 효능있으며, 이는 작동제 활성에 대한 고리화의 중요성을 확인시켰다(도 1; 표 5).
C 말단에서 염 가교를 형성할 수 있는 아미노산의 동일한 K13/D17 조합을 함유하는 서열 번호 2의 선형 변이체인 서열 번호 42는 서열 번호 2보다 6배 약한 작동제였다.
염 가교 형성능이 없는 서열 번호 42 변이체인 선형 동족체 서열 번호 3는 서열 번호 2보다 2∼3배 약했다.
특히, 서열 번호 30의 공유 이량체인 서열 번호 33는 서열 번호 2와 유사한 효능을 달성하며 서열 번호 30보다 8배 강한 작동제로 변하였다(도 2; 표 5).
결론
본 발명자는 유사 골아 세포계에서 완전 작용제 반응을 발휘하는 4개의 신규한 짧은 펩티드 PTH 수용체 1 모방체를 확인하였다. 이들 중, 17-량체 고리화된 분자 서열 번호 2 및 이량체 서열 번호 30은 PTH(1-34)와 유사한 EC50가 약 1 nM인 가장 효능이 있는 화합물이었다. K13-D17 고리화는 선형 동족체 서열 번호 42 및 서열 번호 3의 2∼6배 낮은 효능에 의해 설명되는 바와 같이, 증가된 효능과 관련이 있다.
실시예 3:
Saos-2 세포에서의 cAMP 효능 분석
연구 설계
Murrills R.J. 등(Bone 35: 1263-72, 2004)으로부터 변경과 함께 프로토콜을 적용하였다. 펩티드를 포스페이트 완충된 염수에 용해시키고, 0.1% BSA를 함유하는 티로드 완충액(TB, Sigma-Aldrich) 및 100 μM 이소부틸-메틸-크산틴(IBMX, Sigma-Aldrich)에 추가로 희석시켰다. Saos-2 세포를 96-마이크로적정 플레이트에 50,000 세포/웰로 시딩하고, 효과 분석 전 2 일 동안 성장시켰다. 분석 당일에, 성장 배지를 흡입에 의해 주의하여 제거하였다. 세포를 200 μl TB/0.1% BSA에 의해 1 회 세척하였다. 완충액을 lOO μl 반응 혼합물 (± 시험 펩티드)로 대체하고, 37℃에서 15 분 동안 항온 처리하였다. 빙냉 0.5 M HCl 25 μl를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 세포를 하기에서 얼음 상에서 60 분 동안 항온 처리하였다. pH 6.2의 아세테이트 완충액 75 μl를 96 웰 cAMP 플래쉬플레이트 (Perkin-Elmer)의 각 웰에 첨가하였다. 산 세포 추출물 25 μl 및 [125I]cAMP 용액 100 μl를 동일한 플래쉬플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플래쉬플레이트를 4℃에 밤새 항온 처리하고, 흡입에 의해 비우며, 탑카운터(팩커드)에서 카운트하였다.
측정을 모든 투약량에서 1회 또는 3회로 실시하였다. Z-인자 측정은 1회 특정이 시험된 펩티드의 효능을 예측하는 데 충분한 정확도를 보유한다는 것을 나타내었다. 표준은 각실험에서, 바람직하게는 각각의 플레이트에서 1회, 2회 또는 3회 측정으로서 포함된다.
효능은 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 1OnM, 100 nM, 1 μM 및 10 μM, 또는 0.1 nM, 1 nM, 3 nM, 1O nM, 30 nM, 100 nM 및 1 μM의 농도(효능 및 힐 계수의 동시 측정을 위한 좁은 투약량 범위)에서 평가하였다.
데이타 분석 및 통계
농도 의존성 cAMP 반응은 GraphPad Prism vers. 4(GraphPad Software)로 전송하고, 변환 및 플롯 처리하였다. 1 μM보다 큰 효능을 나타내는 환형 PTH(1-17) 동족체는 전형적으로 1 보다 상당히 높은 힐 계수를 보유하였다. 따라서, 4개 파라미터의 로지스틱 방정식을 EC50 값을 측정하는 데 사용하였다. 곡선을 S자 투약량 반응 곡선(가변성 기울기) 비선형 피트(fit) Y = 바닥치 + (정상치-바닥치) / (1+10^((LogEC50-X)*힐슬로프))(여기서, X는 농도의 로그이고, Y는 반응치임)에 대한 함수로 피팅하였다. Y는 바닥치에서 시작해서 정상치로 가는 S자 형태이다. pEC50, 힐 계수 및 cAMP의 최대 유도된 농도(Emax)를 평가하였다.
전체 통계 편차는 일원 분산분석을 이용하여 Statistica(Statsoft)에 의해 분석하였다. 피셔의 최소 유의성 시험을 이용하여 사후 비교를 실시하였다. 결과는 p가 0.05 이하인 경우에 유의한 것으로 고려하였다.
결과
Saos-2 세포에서의 cAMP 효과 분석
환형 PTH(1-17) 동족체 및 대조 펩티드의 효능 및 효과의 요약을 표 6에 나타내었다.
환형의 구조적으로 안정한 PTH(1-17) 동족체 서열 번호 2는 Saos-2 세포에서의 cAMP 효과 분석에서 이의 모체인 선형 PTH(1-17) 동족체 서열 번호 42 또는 선형 PTH(1-14) 동족체 서열 번호 31보다 상당히 높은 효능을 보유하였다(도 3).
유사하게는, 환형의 구조적으로 안정한 PTH(1-17) 동족체 서열 번호 4가 Saos-2 세포에서의 cAMP 효과 분석에서 이의 모체인 선형 PTH(1-17) 동족체 서열 번호 38보다 명백히 높은 효능을 보유하였다(도 4).
더욱이, 환형의 구조적으로 안정한 PTH(1-17) 동족체 서열 번호 34는 Saos-2 세포에서의 cAMP 효과 분석에서 이의 모체인 선형 PTH(1-17) 동족체 서열 번호 1, 천연 선형 PTH(1-17) 서열 번호 37, 또는 1번 및 3번 위치에서 α-나선 안정화된 아미노산을 함유하거나(서열 번호 35) 또는 아미노산 13 및 17의 측쇄들 간의 공유 결합을 함유하는(서열 번호 36) 각각 천연 PTH(1-17)의 동족체보다 상당히 높은 효능을 보유한다(도 5).
해당 선형 및 환형 PTH(1-17) 동족체의 효능 및 효과. pEC50: 수용체의 반 최대 활성에서의 펩티드 농도의 음성 로그(log); SEM: 평균의 표준 오차; Emax: 대조군 (서열 번호 32)으로의 상대 효과; N: 독립 측정수; n.a.: 적용 불가. 서열 번호의 접미어는 시험되는 염을 나타낸다(A: 아세테이트; T: 트리플루오로아세테이트; C: 클로라이드)
Figure 112009041057268-PCT00012
결론
3개의 경우(서열 번호 2, 4, 34)에서, α-나선 안정화된 비천연 아미노산뿐만 아니라, 아미노산 13 및 17의 측쇄들 간의 고리화를 함유하는 PTH(1-17) 동족체는 Saos-2 PTH1R 상에서 선형 모체 동족체, 또는 α-나선 안정화 또는 N-말단 α-나선의 안정화 없는 고리화를 함유하는 천연 PTH(1-17) 펩티드보다 증가된 효능을 나타내었다. 이러한 결과는 안정화된 N-말단 α-나선와 함께 존재하는 경우의, 시험관 내 작용제 효능 상의 아미노산 13∼17 고리화의 일반적인 양성 효과를 나타낸다.
쥐 골아세포 상의 실험과 비교하여, 서열 번호 32는 3개의 인자에 의해 감소하였다. 3개의 특별히 시험된 샘플에서, PTH(1-17)의 α-나선 안정화된 환형 동족체(서열 번호: 2, 4; 34)는 천연 PTH(1-17) 펩티드 및 이의 선형 및/또는 비 α-나선 안정화된 대응물에 비해, Saos-2 PTH1R 상에서 증가된 효능을 나타내었다. 따라서, 아미노산 측쇄 13 및 17 간의 공유 결합의 도입은 PTH(1-17) 동족체의 효능을 더욱 증가시켰다.
실시예 4
QVX 래트 모델에서의 생체 내 시험
난소절제된(OVX) 래트를 사용하여 생체 내 골감소증/골다공증 상의 PTH 동족체의 효능을 시험할 수 있었다. 골감소증은 OVX 후 14 일 만큼 빨리 검출하고, 이후 100 일 동안 증가시킨 후, 안정화시킬 수 있다(Wronski TJ et al . , Calcif. Tissue Int., 43(3): 179-183, 1988). OVX 래트 모델은 골다공증에 대한 모델로서 관공서 및 산업체 둘 모두에 의해 '골드 스탠다드'로 고려된다(Peter C, Rodan GA. Preclinical safety profile of alendronate. Int J Clin Pract Suppl 1999; 101:3-8, and Stewart AF, Cain RL, Burr DB, Jacob D, Turner CH, Hock JM).
연구 설계
동물
178 마리의 암컷 피셔 래트를 실험을 위해 사용하였다. 초기에, 상기 동물들은 6 am에서의 광으로 12:12 시간 광/암 사이클(light/dark cycle)을 따르는 제어 조건(20℃, 55∼85% 습도) 하의 Macrolon 유형의 3개 케이지(2 래트/케이지)에 수용하였다. 상기 동물에 임의로 표준 Altromin No. 1324 규정식(Chr. Petersen, Ringsted, Denmark)을 공급하였다. 상기 동물들이 자유롭게 물을 마시도록 하였다(pH 3로 시트르산이 첨가된 가정용 품질의 수돗물). 봉입 시, 상기 동물은 6 개월령이었다.
수술 및 분류
OVX 전 주에, 상기 동물을 OVX(140 마리 동물) 또는 겉보기 수술(38 마리 동물)을 거치게 되는 2가지 군으로 체중에 따라 분류하였다. 래트를 Hypnorm-Dormicum로 마취시키고, 정중선 개복술을 통해 난소 절제를 실시하였다. 겉보기 수술된 동물을 정중선 개복술 처리하고, 난소를 노출시켰지만 제거하지 않았다(겉보기). 이러한 군은 연령 균일한 비골다공성 대조군으로서 역할하였다. 동물 확인을 위해 마이크로칩을 수술 중에 각각의 래트에 이식하였다.
수출후 통증을 경감시키기 위해, 모든 래트를 수술 후 3 일 동안 부프레노르핀(20 mg/100 g s.c. b.i.d.) 및 멜록시캄(0.1 mg/100 g s.c. 1일 1회)으로 처리하였다. 모든 래트가 6 일 동안 단독 회복되도록 한 후, 둘둘씩 케이지에 투입하였다.
처리 시작 전에 골감소증을 발달시키기 위해, 약리학적 처리 없이 7 주(전처리 기간) 동안 수용하였다. 전처리 기간 종료 시, 겉보기 및 OVX 수술된 래트를 체중에 따라 분류하고, 각각 13∼20 마리의 동물로 나누었다(표 7). 이 시점에서, 한 OVX 군(N=20) 및 한 겉보기 군(N=20)을 희생시켰다. 상기 대조군을 골밀도(BMD)의 기조 수준으로 설정하였다. 또한, 골 표지자, 골강도, 골조직 형태 측정 및 μCT 스캔의 추후 가능한 분석을 위해 샘플을 보관하였다.
추후 6 주 동안에, 한 겉보기 군 및 한 OVX 군을 비히클 투여 처리하였다(4OmM 아세트산나트륨, 45mM 히스티딘 and 3.9% 만니톨, pH 5.5, 300 mOsm/kg). 5개의 OVX 군을 환형 PTH(1-17) 동족체 서열 번호 19의 투약량을 증가시키면서 처리하였다. 또다른 OVX 군을 서열 번호 33로 처리하였다(표 7). 모든 약물을 s.c. 주사로서 제공되었다. 처리 6 주 후에, 동물을 희생시켰다. DEXA 스캔에 의한 BMD 분석을 위해 척추, 경골 및 대퇴골을 수집하고, 골 샘플을 추후 골강도 측정을 위하여 보관하였다.
투약량 수준 및 군
연구 군 (N/군) 수술 물질 투약량 (nmol/kg s.c.)
군 1 (N=17) 겉보기 비히클 -
군 2 (N=18) OVX 비히클 -
군 3 (N=18) OVX 서열 번호 19 20
군 4 (N=18) OVX 서열 번호 19 40
군 5 (N=18) OVX 서열 번호 19 80
군 6 (N=18) OVX 서열 번호 19 160
군 7 (N=18) OVX 서열 번호 19 320
군 8 (N=13) OVX 서열 번호 33 5
군 9 (N=20) OVX 투약 시작 시 희생 -
군 10 (N=20) 겉보기 -
생존기 중 데이타 수집
전처리 기간 중에, 동물 체중을 주 2회 기록하였다. GEDACO 데이타 수집 시스템을 전처리 기간 중에 모든 생체 내 데이타 수집을 위해 사용하였다. 투약 기간 중에, 체중을 매일 기록하였다. GEDACO 데이타 수집 시스템을 처리 기간 동안 모든 생체 내 데이타 수집을 위해 사용하였다. 경과 기록을 매일 유지하여 데이타베이스에 기록되지 않은 임의의 부정적인 사건을 기술하였다.
생체 해부
희생 전 10 일에, 모든 동물에 테트라시클린 (20 mg/kg i.p.)을 투여하고, 희생 전 2 일에 칼세인 (15 mg/kg i.p.)을 투여하였다. 화합물 치료 개시 전주 동안, OVX 동물의 한 군 및 겉보기 동물의 한 군을 희생하였다(군 9∼10). 투약 기간 종결 시, 나머지 동물을 희생하였다.
요추(L4-L5-L6-S1), 좌측 대퇴골 및 경골을 수집하고, 세척하며, 관 내에 염수 습윤화된 거즈로 팽킹 처리하고, 추후 생체 외 골강도 측정을 위해 -20℃에 저장하였다. 우측 대퇴골 및 경골뿐만 아니라 요추 (T13-L1-L2-L3) 및 미추골 (S2-S3-C1-C2-C3)을 수집하고, 세척하며, 골밀도 (BMD)의 분석 및 추후 가능한 골조직 형태 측정 및 μCT 스캔을 위해 70% 에탄올에 저장하였다.
DEXA에 의한 골밀도의 측정
생체 외 BMD 측정을 1.5%의 정밀도를 갖는 Lunar Piximus Ⅱ 농도계 (GE 헬스케어, 영국 챌폰트 세인트 자일 소재)를 이용해 연구 종결 시에 실시하였다. 장치의 보정을 알루미늄/루사이트 팬톰에 의해 실시하였다.
경골, 대퇴부 및 요추 (L1-L2) 및 천골/미골 (S3-C1) 척수 단편을 이미징 포지셔닝 트레이 상에 위치시키고 4회 스캔 처리하였다. 모든 시편을 정확한 비교를 위해 유사한 방향으로 위치시켰다. 장치에 제공되는 Piximus 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 스캔 상에서 관심 영역(ROI)을 생성하였다. ROI를 성장 플레이트 하의 경골 근위부(2 mm 섹션), 대퇴골두, 대퇴골체(3분할 중 중간) 및 요추의 2개의 척추체(흉추 제외)로서 정의하였다.
골강도 측정
압축 장치 (Lloyd Instruments, 영국 페어햄 소재) 상에서 골강도 측정을 실시하였다. 주문된 홀더의 도움으로 뼈를 위치시켜 최대 재현성을 달성하였다. 골절에 대한 최대력을 측정하였다.
데이타 분석 및 통계
군들 중 전체 비교는 일원 분류된 데이타(BMD)에 대한 일원 분산분석을 이용하여 실시하였다. 군들 중 개별 분석을 위해, 피셔의 최소 유의성 시험을 이용하여 사후 분석을 실시하였다. 편차는 5% 수준에서 유의적인 것으로 고려하였다. 모든 데이타를 평균 ± SEM으로 나타내었다.
결과
OVX 연구
골밀도를 피층골(대퇴골체) 및 주된 소주골(경골 근위부, 퇴태골두, 요추)을 나타내는 다양한 부위에서 평가하였다. 조사되는 부위와 상관 없이, α-나선 안정화된 환형 PTH(1-17) 동족체 서열 번호 19에 의해 처리한 실험군은 20∼320 nmol/kg/일의 투약량에서, 비히클 처리된 난소절제 래트보다 골밀도가 상당히 높았다(도 6∼9). 20 nmol/kg/일보다 큰 투약량에서, 서열 번호 19의 골 동화작용 효과는 비히클 처리된 겉보기 수술 래트에서보다 높은 골밀도를 유도하였다(도 6∼9).
동종이량체 서열 번호 33는 또한 시험된 모든 부위에서 5 nmol/kg/일의 투약량에서 비히클 처리된 난소절제 래트에 비해 골밀도를 상당히 증가시켰다(도 6∼9).
또한, 대퇴골체 영역(피층골) 및 대퇴골두 영역(소주골)에서 대퇴골의 골강도는 서열 번호 19 및 서열 번호 33에 의해 처리된 군 중 비히클 처리된 OVX 군에서 관찰되는 수준에 비해 상당히 증가하였다(도 10 및 11). 20 nmol/kg/일보다 큰 투약량으로 서열 번호 19에 의해 처리되는 군에서, 골강도는 비히클 처리된 겉보기 수술 군의 수준에 비해 상당히 증가하였다(도 10 및 11).
결론
α-나선 안정화 비천연 아미노산뿐만 아니라 아미노산 13 및 17의 측쇄 사이의 고리화를 함유하는 한 PTH(1-17) 동족체 (서열 번호 19)는 지층골 및 소주골에서의 골 동화작용 활성을 나타내었다. 이러한 동화작용 활성은 최저 투약량(20 nmol/kg/일)에서 적어도 골밀도의 정상화를 유도하나, 보다 높은 투약량에 의해 대조군 동물에서 관찰되는 것보다 상당히 높은 수치로 증가될 수 있다. 따라서, 서열 번호 19는 지금까지 동화작용 활성에 의해 증명된 바에 의하면 최단 PTH 동족체이다. 대조적으로, 골 동화작용 활성은 비천연 α-나선 안정화 아미노산을 함유하고 환형 구조 형성능이 없는 PTH(1-14) 동족체에서는 부재한 반면에, 상기 PTH 동족체는 본 PTH(1-17) 동족체 (서열 번호 19)와 유사한 효능을 갖는 PTH1R의 수용체의 cAMP 경로를 활성화시켰다(Rhee, Y. et al., (2006) Yonsei Medical Journal, 47, 214-222).
이량체 PTH(1-17) 동족체(서열 번호 33)가 또한 효과적이고, 5 nmol/kg/일의 투약량에서 비히클 처리된 OVX 군에 비해 골밀도 및 골강도를 상당히 증가시켰다. 따라서, 짧은 PTH 동족체의 본 설계는 골 손실과 연관된 질환, 예컨대 폐경후 골다공증의 치료에 유용할 수 있는 새로운 부류의 골 동화작용 PTH 동족체를 유도하였다.
실시예 5
CYP2D6 억제의 시험관 내 시험:
방법 및 물질
CYP2D6 억제 분석에 사용되는 모든 화학물 및 시약은 표 8에 나타내었다. 시험 화합물의 저장 용액(1 mM)은 50% 이소프로판올 또는 20% DMSO에서 제조하였다. 풀링된 인간 간 마이크로솜(HLM, 최종 농도 0.05 mg 단백질/mL)을 포스페이트 완충액(0.1 M 인산칼륨, pH 7.4), CYP2D6 기질 (덱스트로메트로르판, 5 μM 최종 농도) 및 시험 화합물 (10 μM), 퀴니딘 (0.5 μM) 또는 비히클 (0.2% DMSO 또는 0.5% 이소프로판올)과 혼합하였다. 상기 혼합물을 37℃에서 5 분 동안 예비 항온 처리한 후, NADPH 재생성 혼합물 (최종 농도: 1.25 mM NADP+, 3.3 mM 글루코스-6-포스페이트, 3.3 mM MgCL2 및 0.4 U/mL 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제)의 반응 첨가를 개시하였다. 5 분 후에, 0.25 부피 정지 시약(94% 아세토니트릴, 6% 아세트산)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 각각의 실험을 2회 또는 3회 실시하였다.
CYP2D6 생성물 (덱스트로르판)의 정량은 LC/MS/MS에 의해 실시하였다. 10.000 g에서 5 분 동안 원심 분리한 후, 상청액 40 μL를 C8 RP-HPLC 칼럼 (XterraMS, C8, 2.5 μM, 50 x 2.1 mm) 상에 주사하였다. 유속 0.15 ml/분을 적용하여 4 분에 걸쳐 0.1% 포름산 중 0∼90% 아세토니트릴의 선형 구배에 의해 덱스트로르판을 용리시켰다. 반응 혼합물 중 덱스트로르판의 농도는 외부 보정 곡선을 이용하여 MS/MS 전환의 피크 면적(m/z 258.1>199)으로부터 추정하였다(표 8).
CYP2D6 억제 분석에 사용되는 화학물 및 시약
화학물/시약 생성물 # 공급자
아세토니트릴 덱스트로메토르판 히드로브로마이드 모노히드레이트 덱스트로르판 타르트레이트 퀴니딘 A3485 D1053 D0127 Q3625 Sigma-Aldrich
인산칼륨, 1염기성 0240 J.T.Baker
NADPH 재생성 시스템 A NADPH 재생성 시스템 B 풀링된 인간 간 마이크로솜 451220 451200 452161 BD Biosciences
메탄올 이소프로판올 C26C11X C19C11X LAB-SCAN
DMSO 41650 Fluca
저항 > 18 MΩ 및 총 유기 탄소 < 7 ppb로 정제된 물 Millipore
아세트산 100% 포름산 98∼100% 1.00056 1.00264 Merck
데이타 분석
HLM 중 CYP2D6 활성을 대사산물 형성 속도로서 계산하였다:
ν(pmol/분/mg) = [대사산물] / (t x [단백질])
여기서, ν는 형성 속도이고, [대사산물]은 시간(t, 분)에서의 검출된 덱스트로르판의 농도(pmol/mL)이고, [단백질]은 반응 혼합물의 단백질 농도(mg/mL)이다. CYP2D6 활성 상의 시험 화합물의 영향은 비히클로 항온 처리 시 측정되는 활성의 %로서 계산하였다. CYP2D6 억제제 (퀴니딘)의 효과는 각 회분식 분석 내의 억제 제어로서 포함된다. 비히클 대조군의 70% 미만으로의 CYP2D6 활성 감소는 유의적인 것으로 고려되었다.
결과
선형 절두형 PTH 화합물은 비히클에 의해 항온 처리될 시에 관찰되는 활성에 대해서 22∼57%로 CYP2D6 활성을 감소시켰다(서열 번호 31, 42, 3, 37, 1 및 35, 표 9). 분자 내 고리화가 아미노산 13번 및 17번 위치 사이에서 도입되는 경우, CYP2DS 상의 억제 효과는 상당히 감소되었다. 즉, 서열 번호 42 (선형, 29%) 대 서열 번호 2 (환형, 67%), 및 서열 번호 1 (선형, 57%) 대 서열 번호 34 (환형, 107%). 이로운 효과는 Lys → Asp, Cys → Cys, Glu → Lys 또는 Lys → Glu 간의 고리화가 모두 CYP2D6 활성을 증대시키는 것으로 확인된 바와 같이 특정 아미노산 사이의 고리화와 연관되지 않았다(표 9).
농도 10 μM에서의 다양한 화합물의 항온 처리 시 CYP2D6 매개된 덱스트로르판의 형성 속도 상의 분자내 고리화 상의 영향. ()는 분자내 측쇄 고리화를 의미함.
Figure 112009041057268-PCT00013
분자내 고리화가 특정 아미노산 치환과 동반되는 경우 상조 효과가 확인되었다. Glu에 의한 Gln6의, Leu, Nle 또는 Val에 의한 Met8의, Glu에 의한 Gln10의 치환, 또는 C-말단 탈아미드화는 CYP2D6의 억제를 완전히 제거하였다(표 10).
농도 10 μM에서의 다양한 화합물의 항온 처리 시 CYP2D6 매개된 덱스트로르판의 형성 속도 상의 단일 아미노산 치환 상의 영향. ()는 분자내 측쇄 고리화를 의미함.
Figure 112009041057268-PCT00014
결론
선형 절두된 PTH 동족체는 분자내 고리화가 아미노산 13번 및 17번 위치 사이에 도입되는 경우에 CYP2D6를 억제하는 것으로 확인되었으며, 이러한 억제는 현저히 감소되었다. 상기 억제는 특정 아미노산의 6번, 8번, 10번에서의 치환, 및 C-말단 개질에 의해 더욱 감소될 수 있었다.
본 발명은 전술한 예시적 실시양태와 연관되어 기술되었지만, 많은 동등한 수정예 및 변경예가 본 개시를 제공하는 경우에 당업자에게 명백하게 된다. 따라서, 언급된 본 발명의 예시적 실시양태는 예시적인 것이며 비한정적인 것으로 고려된다. 본 원에서 인용된 모든 문헌은 특히 참조 인용되었다.

Claims (18)

  1. 하기로 구성된 화학식 (I)으로 표시되는 생물학적 활성 PTH(1-17) 동족체 펩티드, 또는 이의 동종이량체, 이종이량체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체:
    R1-Z1-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-Leu-A16-A17-Z2-R2
    상기 식 중,
    R1은 수소, NH2, RHN, RR3N이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸을 의미하고;
    A1은 Ac5c, Gly, Ser, Ala 또는 임의의 알파-나선 안정화 잔기이며;
    A2는 Val 또는 보존적 치환이고;
    A3는 Aib, Ala, Ser 또는 임의의 알파-나선 안정화 잔기이며;
    A4는 Gln, Glu 또는 보존적 치환이고;
    A5는 Ile 또는 보존적 치환이며;
    A6는 Gln, Glu 또는 보존적 치환이고;
    A7은 Leu 또는 Phe 또는 보존적 치환이며;
    A8은 Met, Leu, Nle, Val 또는 보존적 치환이고;
    A9은 His 또는 보존적 치환이며;
    A1O은 Gln, Glu, Asp, Ala, Val 또는 보존적 치환이고;
    A11은 Har, Arg, Ala, Ile, Lys 또는 보존적 치환이며;
    A12는 Ala, Arg, His 또는 보존적 치환이고;
    A13는 Lys, Orn, Asp, Glu, Cys, Dab 또는 Dpr이며;
    A14는 Trp, Phe, Leu, Arg, His 또는 보존적 치환이고;
    A16은 Asn, Asp, 보존적 치환 또는 부재이며;
    A17은 Lys, Orn, Glu, Cys, Asp, Dab 또는 Dpr이고;
    R2는 OH, OR, NRH, NRR3 또는 NH2이며, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸)을 나타내고;
    A13 및 A17은 1 이상의 공유 결합에 의해 결합되며;
    Z1 및 Z2는 독립적으로 부재이거나, Ala, Leu, Met, Gln, Glu, Lys, Dab, Dpr 및 Orn로 구성된 군으로부터 선택되는 1-10 아미노산 단위의 펩티드 서열이다.
  2. 하기로 구성된 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 생물학적 활성 PTH(1-17) 동족체 펩티드, 또는 이의 동종이량체, 이종이량체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체:
    R1-Z1-A1-Val-A3-Glu-Ile-A6-A7-A8-His-A1O-A11-A12-A13-A14-Leu-A16-A17-Z2-R2
    상기 식 중,
    R1은 수소, NH2, RHN, RR3N이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸을 나타내며;
    A1은 Ac5c, Gly, Ser, Ala 또는 임의의 알파-나선 안정화 잔기이고;
    A3는 Aib, Ala, Ser 또는 임의의 알파-나선 안정화 잔기이며;
    A6는 Gln 또는 Glu이고;
    A7은 Leu 또는 Phe이며;
    A8은 Met, Leu, Nle 또는 Val이고;
    A1O은 Gln, Glu, Asp, Ala 또는 Val이며;
    A11은 Har, Arg, Ala, Ile 또는 LyS이고;
    A12는 Ala, Arg 또는 His이며;
    A13은 Lys, Orn, Asp, Glu, Cys, Dab 또는 Dpr이고;
    A14은 Trp, Phe, Leu, Arg 또는 His이며;
    A16은 Asn, Asp 또는 부재이고;
    A17은 Lys, Orn, Glu, Cys, Asp, Dab 또는 Dpr이며;
    R2는 OH, OR, NRH, NRR3 또는 NH2이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸)을 나타내며;
    A13 및 A17은 1 이상의 공유 결합에 의해 결합되고;
    Z1 및 Z2는 독립적으로 부재이거나, Ala, Leu, Lys, Dab, Dpr 및 Orn로 구성 된 군으로부터 선택된 1-10 아미노산 단위의 펩티드 서열이다.
  3. 하기로 구성된 화학식 (Ⅲ)로 표시되는 생물학적 활성 PTH(1-17) 동족체 펩티드, 또는 이의 동종이량체, 이종이량체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체:
    R1-Z1-Ac5c-Val-Aib-Glu-Ile-A6-Leu-A8-His-A10-All-Ala-A13-A14-Leu-A16-A17-Z2-R2
    상기 식 중,
    R1은 수소, NH2, RHN, RR3N이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸을 나타내며;
    A6는 Glu 또는 Gln이고;
    A8은 Met, Leu, Nle 또는 Val이며;
    A10은 Gln 또는 Glu이고;
    A11은 Har 또는 Arg이며;
    A13은 Lys, Orn, Asp, Glu, Cys, Dab 또는 Dpr이고;
    A14은 Trp 또는 Phe이며;
    A16은 Asn, Asp 또는 부재이고;
    A17은 Lys, Orn, Glu, Cys, Asp, Dab 또는 Dpr이며;
    R2는 OH, OR, NRH, NRR3 또는 NH2이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸)을 나타내며;
    A13 및 A17은 공유 결합에 의해 결합되고;
    Z1 및 Z2는 독립적으로 부재이거나, Ala, Leu, Lys, Dab, Dpr 및 Orn으로 구성된 군으로부터 선택되는 1-10 아미노산 단위의 펩티드 서열이다.
  4. 하기로 구성된 화학식 (Ⅳ)로 표시되는 생물학적 활성 PTH(1-17) 동족체 펩티드, 또는 이의 동종이량체, 이종이량체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체:
    R1-Z1-A1-Val-A3-Glu-Ile-A6-A7-A8-His-A10-A11-A12-A13-A14-Leu-A16-A17-Z2-R2
    상기 식 중,
    R1은 수소, NH2, RHN, RR3N이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸을 나타내며;
    A1은 Ac5c, Ac6c, Abu, Nva 또는 Aib이고;
    A3는 Ac5c, Aib, Abu 또는 Nva이며;
    A6는 Gln 또는 Glu이고;
    A7은 Leu 또는 Phe이며;
    A8은 Met, Leu, Val 또는 Nle이고;
    A10은 Gln 또는 Glu이며;
    A11은 Har 또는 Arg이고;
    A12는 Ala 또는 Arg이며;
    A13은 Lys, Glu, Asp 또는 Cys이고;
    A14은 Trp 또는 Phe이며;
    Al6은 Asn, Asp 또는 부재이고;
    A17은 Glu, Cys, Asp 또는 Lys이며;
    R2는 OH, OR, NRH, NRR3 또는 NH2이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸)을 나타내며;
    A13 및 A17은 1 이상의 공유 결합에 의해 결합되고;
    Z1 및 Z2는 독립적으로 부재이거나, Ala, Leu, Lys, Dab, Dpr 및 Orn로 구성된 군으로부터 선택되는 1-10 아미노산 단위의 펩티드 서열이다.
  5. 하기로 구성된 화학식 (V)로 표시되는 생물학적 활성 PTH(1-17) 동족체 펩티드, 또는 이의 동종이량체, 이종이량체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체:
    R1-Z1-A1-Val-Aib-Glu-Ile-Gln-A7-A8-His-Gln-A11-A12-A13-Trp-Leu-A16-A17-Z2-R2
    상기 식 중,
    R1은 수소, NH2, RHN, RR3N이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸을 나타내며;
    A1은 Ac5c 또는 Ac6c이고;
    A7은 Leu 또는 Phe이며;
    A8은 Met, Leu 또는 Nle이고;
    A11은 Har 또는 Arg이며;
    A12은 Ala 또는 Arg이고;
    A13은 Lys 또는 Glu이며;
    A16은 Asn 또는 부재이고;
    A17은 Glu 또는 Asp이며;
    R2는 OH, OR, NRH, NRR3 또는 NH2이고, 여기서 R 및 R3 각각은 독립적으로 C1-4 알킬 (예를 들어, 메틸)을 나타내며;
    A13 및 A17은 1 이상의 공유 결합에 의해 결합되고;
    Z1 및 Z2는 독립적으로 부재이거나, Ala, Leu, Lys, Dab, Dpr 및 Orn로 구성된 군으로부터 선택되는 1-10 아미노산 단위의 펩티드 서열이다.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 13번 및 17번 위치에서의 아미노 산 잔기들 간의 1 이상의 공유 결합은 락탐 가교 또는 시스테인 가교를 포함하는 것인 PTH(1-17) 동족체 펩티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 13번 및 17번 위치 사이의 공유 결합은 락탐 가교인 것인 PTH(1-17) 동족체 펩티드.
  8. 제6항에 있어서, 상기 1 이상의 공유 결합은 두개의 PTH 동족체 간에 형성되는 것인 PTH(1-17) 동족체 펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 잔기 A1 내지 A17(A1 및 A17 포함)에서 야생형 인간 PTH(1-17)에 대한 2 내지 14개의 치환을 포함하는 것인 PTH(1-17) 동족체 펩티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 임의로 야생형 PTH에 대한 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 16 또는 17 번 위치를 비롯한 추가 위치에서의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환과 함께, 1번 또는 3번 위치에서의 1 또는 2개의 치환을 포함하는 것인 PTH(1-17) 동족체 펩티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 임의로 야생형 PTH에 대한 11, 12, 13, 14, 16 또는 17 번 위치를 비롯한 1 이상의 추가 위치에서의 치환과 함께, 1번 내지 10번 위치에서의 치환을 포함하는 것인 PTH(1-17) 동족체 펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 13번 위치에서 Asp, Lys, Orn, Glu 또는 Cys에 의한 치환, 및/또는 17번 위치에서 Lys, Asp, Orn, Glu 또는 Cys에 의한 치환을 포함하는 것인 PTH(1-17) 동족체 펩티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 13번 및 17번 위치의 아미노산들 사이에서 고리화되고 하기 잔기들 조합 중 하나를 포함하는 것인 PTH(1-17) 동족체 펩티드, 이의 N-말단 아세틸화 형태, 이의 C-말단 산 형태, 이의 동종이량체 또는 이종이량체 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 유도체:
    Figure 112009041057268-PCT00015
    Figure 112009041057268-PCT00016
  14. 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 PTH 동족체 펩티드.
  15. 골질량 증가를 위한 약제의 제조에서의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 PTH 동족체 펩티드의 용도.
  16. 제15항에 있어서, 골다공증, 예컨대 원발성 골다공증, 내분비 골다공증 (갑상선기능항진증, 부갑상선기능항진증, 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 말단비대증, 1형 당뇨병, 부신기능부전), 골다공증의 유전성 및 선천성 형태 (골형성 부전증, 호모시스틴요증, 멘케스 증후군(Menkes' syndrome), 및 릴리 데이 증후군(Riley-Day syndrome)), 영양 및 위장 장애, 혈액학적 장애/종양 (다발성 골수종, 림프종 및 백혈병, 혈우병, 지중해빈혈), 고정으로 인한 골다공증, 만성 폐쇄성 폐질환 또는 류마티즘학적 장애 (류마티스 관절염, 강직성 척추염)의 치료를 위한 약제의 제조에서의 PTH 동족체 펩티드의 용도.
  17. 원발성 골다공증 또는 내분비 골다공증의 치료를 위한 약제의 제조에서의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 PTH 동족체 펩티드의 용도.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 PTH 동족체 펩티드를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약학 조성물.
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