CN115340592A

CN115340592A - 一种活性肽及其相关用途

Info

Publication number: CN115340592A
Application number: CN202111064688.6A
Authority: CN
Inventors: 李钧翔; 傅晓蕾; 徐�明; 夏春鑫; 康思宁; 陆益
Original assignee: Hemei Biotechnology Zhejiang Co ltd
Current assignee: Hemei Biotechnology Zhejiang Co ltd; Yunnan Beitani Biotechnology Group Co ltd
Priority date: 2021-09-09
Filing date: 2021-09-09
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2041-09-09
Also published as: CN115340592B; WO2023035632A1; EP4400508A1

Abstract

本申请涉及皮肤修复与改善领域，具体涉及一种活性肽及其相关用途，本发明获得的活性肽具有缓解衰老，抗氧化、抗炎性等优点，并能够有效的缓解由于紫外线照射带来的皮肤损伤。

Description

一种活性肽及其相关用途

技术领域

本申请涉及皮肤修复与改善领域，具体涉及一种活性肽及其相关用途。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类来源于发育早期中胚层的多能干细胞，是目前研究最多、最重要的成体干细胞之一。MSCs广泛存在于全身多种组织中，并可在体外培养扩增，可在特定条件下分化为包括神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞在内的多种细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。与其他来源的MSCs相比，来源于脐带的MSCs具有采集方便、无伦理争议、免疫原性低、自我更新快、倍增速度稳定和增殖能力强等特点。因此，脐带MSCs适合用于临床研究和应用，是细胞治疗和再生医学的首选。

根据www.ClinicalTrials.gov网站统计的数据表明，截至2018年 10月,全球已注册705项基于MSCs的临床试验,80％以上的临床试验处于临床Ⅰ期和Ⅱ期,15％左右处于临床Ⅲ期阶段。目前的实验结果表明：MSCs用于多种疾病的治疗是安全和有效的,这些疾病类型包括移植物抗宿主病、脊髓损伤、自身免疫性疾病、心血管疾病、骨及软骨损伤修复、克罗恩病、糖尿病及其并发症等。目前,全球已有 11种间充质干细胞药物获批用于上述疾病的临床治疗；然而,MSCs 在疾病治疗过程中发挥作用的机制尚不明确,仍需深入的研究和探索。

大量的证据表明，间充质干细胞(MSC)可以通过旁分泌或自分泌发挥治疗作用，其疗效与血管生成、免疫调节及细胞凋亡有关。 MSC分泌组即MSC所分泌的生物活性分子的总和，包括细胞因子、趋化因子和生长因子等多种活性成分，对损伤组织的修复、再生及功能恢复等许多生理过程具有调控作用。在创伤治疗领域，基于MSC 分泌组研制的制剂极有可能成为替代MSC治疗的新疗法，具有广阔的发展前景(王强等，间充质干细胞分泌组:创伤愈合的替代疗法，中国生物工程杂志2017,Vol.37Issue(4):104-109)，然而目前基于间充质干细胞(MSC)分泌肽的研究仍处于比较初级的阶段，目前的研发成果难以满足消费者的多样化需求。此外，目前关于MSC分泌组正式用于临床之前，还需要更多的体内实验和体外实验，获得商业化前景更好的生物活性肽。

然而，自然界及肌体内发现的活性肽存在某些缺陷，比如肽段比较长导致其在体内不稳定，并且纯化工艺和合成工艺复杂，规模化生产成本高，透皮性差，因此，为了进一步提高成药性和提升商业化价值，需要对相关活性肽进行结构改造。

本发明的发明人基于上述思路，在研发获得一个LQ-17活性肽的基础上，经过结构改造又获得EQ-9活性肽。其活性与LQ-17相当，但是由于属于截断体，生产成本可以进一步降低，取得了预料不到的技术效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物活性多肽及其制备方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面，提供一种生物活性多肽，其氨基酸序列符合以下通式：

R1-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-AA₆-AA₇-AA₈-AA₉

其中，

AA₁选自E、D或是键

AA₂选自S、T或是键

AA₃选自E、D、K

AA₄选自T、A、S、I

AA₅选自R、K、E

AA₆选自I、L、A

AA₇选自L、I、V

AA₈选自L、I、V

AA₉选自Q、E、D或是键

R1选自由H、乙酰基、叔丁酰基、己酰基、2-甲基己酮基、环己烷羧基、辛酰基、癸酰基、月桂酰、肉豆蔻酰、棕榈酰、硬脂酰、油酰基和亚油酰基组成的组。

在一些技术方案中，所述符合上述通式的生物活性多肽，其中 AA₅为R、AA₆为I、AA₇为L、AA₈为L。

在一些实施例中，所述生物活性多肽氨基酸序列选自 ESETRILLQ、ESETKILLQ、DSDAKILIQ、DSDAKLLIQ、ETDTRILVE 、ESEARIILE、DSESKLVID、ESETEAVLQ、ESKIRILLQ、ETRILL、 SETRIL组成的组。

本发明第二方面，提供了所述生物活性多肽的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，更直接通过化学合成制备。

本发明第三方面，提供了所述生物活性多肽在制备具有抗炎功能的食品、保健品、药物或化妆品中的应用。

本发明第四方面，提供了所述生物活性多肽在制备具有抗衰老功能的食品、保健品或药物中的应用。

本发明第五方面，提供了所述生物活性多肽在制备具有抗氧化功能的食品、保健品或药物中的应用。

本发明第六方面，提供了一种产品，包括所述生物活性多肽或其衍生物；所述生物活性多肽的衍生物，是指在生物活性多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物，同时不影响其生物学活性。

本发明的第七方面，提供了一种包括美容上或药学上有效量的至少一种根据前述的活性肽以及至少一种赋形剂或美容上或药学上可接受的佐剂的药物组合物。

在一些实施方案中，所述药物组合物的剂型包括膏霜、乳液、水剂、凝胶、油剂、粉剂、泥类、蜡基类、贴类、膜类或冻干类。

在一些实施方案中，所述赋形剂包括：羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚乙烯醇、葡聚糖、氨、乳酸、柠檬酸、吡咯烷酮羧酸、甘油、尿素、山梨糖醇、氨基酸、羊毛脂、矿脂。

在一些实施方案中，所述佐剂包括：增溶剂，增稠剂，胶凝剂，柔软剂，抗氧化剂，悬浮剂，稳定剂，发泡剂，调味剂，表面活性剂，水，离子或非离子乳化剂，填料，螯合剂，螯合剂，防腐剂，维生素，阻滞剂，润湿剂，精油，染料，颜料。

此外，本发明的活性肽还可与常用于口服组合物或食品补充物的赋形剂和佐剂配制，诸如且不限于食品工业中常用的脂肪成分、水性成分、保湿剂、防腐剂、调质剂、调味剂、香料、抗氧化剂和着色剂。

本发明的第八方面，本申请的生物活性肽可与另外成分联用，所述另外成分包括但不限于：抗氧化剂、反应性羰基物类清除剂、抗糖化剂、抗组织胺剂、抗病毒剂、抗寄生剂、乳化剂、润肤剂、防皱剂和/或抗老化剂等。

发明人对结构为R1-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-AA₆-AA₇-AA₈-AA₉的生物活性肽的功能进行了广泛研究，开展了大量实验，并确定对其生物学活性起重要作用的结构域，最终获得活性好、生产成本低、稳定性好的具有显著抗衰老、抗氧化以及抗炎症反应多重功效的生物活性肽。

附图说明：

图1：鸡胚安全性实验

图2：细胞活率测定实验

图3：保护细胞免受UVA损伤能力检测实验(细胞活率指标)

图4：保护细胞免受UVA损伤能力检测实验(I型胶原蛋白含量指标)

图5：保护细胞免受UVA损伤能力检测实验(胞内ATP含量指标)

图6：UVA损伤修复能力检测实验(细胞活率指标)

图7：UVA损伤修复能力检测实验(MMP-9蛋白含量指标)

图8：改构后的生物活性肽UVA损伤修复实验

实施例：

定义

尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。

本申请涉及的氨基酸在此用标准三字母或单字母缩写表示。

本申请相关多肽的获得采用以下流程：

以MSC分泌组为实验材料，通过LC-MS液相色谱质谱联用仪筛选分子量小于30kDa的多肽，结合核糖体图谱技术筛选获得近千种生物活性肽，再根据基于机器学习和生物物理的蛋白质- 肽相互作用预测方法(HSM PPI prediction)进一步筛选获得 LQ-17，并在其基础上进行截断获得截短体VQ-13、EQ-9、LT-12，具体序列如下：

表1：LQ-17截短体

No.	name	sequence
			1	LQ-17	LSDQVPDTESETRILLQ
2	VQ-13	VPDTESETRILLQ
			3	EQ-9	ESETRILLQ
4	LT-12	LSDQVPDTESET

实施例1：安全性研究-鸡胚试验

该实验参照化妆品眼刺激性腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验 (SN/T 2329-2009)相关标准和步骤进行，实验结果采用刺激评分法(IS)，结果为：IS＝0.35,无刺激性。具体评价标准如下：

表2：

刺激评分	刺激性分类
		IS＜1	无刺激性
1≤IS＜5	轻刺激性
		5≤IS＜9	中度刺激性
IS≥10	强刺激性/腐蚀性

实验结果表明：使用剂量高达500ppm的EQ-9没有安全问题，具体参见图1。

实施例2：细胞活力检测实验

HaCaT细胞复苏传代，镜检细胞状态良好后，收集细胞，调整细胞浓度为0.5-1.0*10⁵个/mL，按照100μL/孔进行96孔铺板。培养箱培养(37℃，5％CO₂)至细胞融合度约80％后添加一定浓度的受试物，孵育24h。移去上清液，使用CCK8检测试剂盒测定细胞活率。具体结果参见图2。EQ-9促进细胞存活的能力明显强于LQ-17。

实施例3：保护细胞免受UVA损伤能力检测实验

人包皮成纤维细胞HFF细胞及永生化人角质形成细胞 HaCaT细胞复苏传代，镜检细胞状态良好后，收集细胞，按照 2.0-2.5*10⁴个/孔细胞密度加入96孔板。培养箱培养24h(37℃， 5％CO₂)，弃去培养基，加入含有一定浓度受试物的培养基，用一定计量的UVA诱导，控制照射总量相同且介于5-15J/cm²。弃去上清，加入含有一定受试物的培养基，培养24h后使用相应试剂盒测定细胞活率、胶原蛋白含量和ATP含量(具体参见图 3-图5)。结果表明：

1.LQ-17和EQ-9可显著地提高细胞在紫外刺激条件下的存活率。

2.LQ-17和EQ-9显著地提高了紫外刺激条件下受试细胞外I 型胶原蛋白的含量。

3.紫外刺激条件下，仅EQ-9能够显著增加细胞内ATP含量。

实施例4：UVA损伤修复能力测试实验

人包皮成纤维细胞HFF细胞复苏传代，镜检细胞状态良好后，收集细胞，按照2.0-2.5*10⁴个/孔细胞密度加入96孔板。培养箱培养24h(37℃，5％CO₂)，弃去培养基，加入新鲜培养基，用一定计量的UVA诱导，控制照射总量为5J/cm²。弃去上清，加入含有一定受试物的培养基，培养24h后使用相应试剂盒测定细胞活率。

实验结果表明(参见图6)：EQ-9和LQ-17可以修复UVA引起的损伤，增加细胞活力。

实施例5：MMP-9表达的定量检测实验

人包皮成纤维细胞HFF细胞复苏传代，镜检细胞状态良好后，收集细胞，按照2.0-2.5*10⁴个/孔细胞密度加入96孔板。培养箱培养24h(37℃，5％CO₂)，弃去培养基，加入新鲜培养基，用一定计量的UVA诱导，控制照射总量为5J/cm²。弃去上清，加入含有一定受试物的培养基，培养24h后收集细胞培养基，在4℃下1000g离心10min，使用相应试剂盒测定MMP-9蛋白含量。

实验结果表明(参见图7)：EQ-9和LQ-17可显着降低紫外损伤后细胞的MMP-9表达量(MMP-9属于基质金属蛋白酶家族，可降解细胞外胶原蛋白)。

综合以上实验结果表明：EQ-9生物活性肽是一种很有前途的抗衰老成分，安全性好，在促进细胞生长、保护细胞免受UVA 损伤以及增加胶原蛋白I的产生方面的作用与LQ-17效果相当，在UVA刺激后增加细胞内ATP含量方面，EQ-9显著优于 LQ-17；EQ-9生物活性肽长度比LQ-17短，却与其具有相同或更优的活性，生产成本更低，具有巨大的商业潜力。相比之下，其他截短体诸如：VQ-13、LT-12综合效果较差。

实施例6：EQ-9肽改造与生物活性研究

发明人针对EQ-9进行了详尽的结构和功能研究，通过改构获得以下活性肽。

表3：改构衍生肽汇总

No.	Name	Sequence
			1	LQ-17	LSDQVPDTESETRILLQ
2	EQ-9	ESETRILLQ
			3	EQ-9-1	ESETKILLQ
4	DQ-9	DSDAKILIQ
			5	DQ-9-2	DSDAKLLIQ
6	EE-9-1	ETDTRILVE
			7	EE-9-2	ESEARIILE
8	DD-9	DSESKLVID
			9	EQ-9-2	ESETEAVLQ
10	EQ-9-3	ESKIRILLQ
			11	EL-6	ETRILL
12	SL-6	SETRIL

将上述改构后的生物活性肽进行UVA损伤修复实验(实验步骤同实施例3)，结果如图8。

LQ-17截短实验结果显示，相较于VQ-13和EQ-9，LT-12 几乎完全失去了活性，表明被截去的RILLQ对于活性有重要影响。对EQ-9进一步截短后发现，EL-6保留了较好的生物活性，而SL-6则表现出活性的丧失，进一步证明RILL区域的重要性。对EQ-9进行不同的点突变后，其生物活性都受到了一定程度的影响。比较EQ-9和EQ-9-1，将R突变为K后，多肽活性出现下降。比较EQ-9和EQ-9-2，将RIL突变为EAV后，多肽活性完全丢失，甚至表现出抑制效果。由此可见，发明人通过功能性实验验证了EQ-9生物活性肽的核心功能域，结合其他的具有生物学功能的LQ-17截短体，综合判断以EQ-9效果最佳。

序列表

<110> 禾美生物科技（浙江）有限公司

<120> 一种活性肽及其相关用途

<130> 1

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 1

Glu Ser Glu Thr Arg Ile Leu Leu Gln

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 2

Glu Ser Glu Thr Lys Ile Leu Leu Gln

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 3

Asp Ser Asp Ala Lys Ile Leu Ile Gln

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 4

Asp Ser Asp Ala Lys Leu Leu Ile Gln

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 5

Glu Thr Asp Thr Arg Ile Leu Val Glu

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 6

Glu Ser Glu Ala Arg Ile Ile Leu Glu

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 7

Asp Ser Glu Ser Lys Leu Val Ile Asp

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 8

Glu Ser Glu Thr Glu Ala Val Leu Gln

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 9

Glu Ser Lys Ile Arg Ile Leu Leu Gln

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 10

Glu Thr Arg Ile Leu Leu

1 5

<210> 11

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 11

Ser Glu Thr Arg Ile Leu

1 5

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 12

Leu Ser Asp Gln Val Pro Asp Thr Glu Ser Glu Thr Arg Ile Leu Leu

1 5 10 15

Gln

<210> 13

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 13

Val Pro Asp Thr Glu Ser Glu Thr Arg Ile Leu Leu Gln

1 5 10

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(未知)

<400> 14

Leu Ser Asp Gln Val Pro Asp Thr Glu Ser Glu Thr

1 5 10

Claims

1.一种生物活性多肽，其氨基酸序列符合以下通式：

R1-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-AA₆-AA₇-AA₈-AA₉

其中，

AA₁选自E、D或是键

AA₂选自S、T或是键

AA₃选自E、D、K

AA₄选自T、A、S、I

AA₅选自R、K、E

AA₆选自I、L、A

AA₇选自L、I、V

AA₈选自L、I、V

AA₉选自Q、E、D或是键

2.权利要求1所述的生物活性肽，其中AA₅为R、AA₆为I、AA₇为L、AA₈为L。

3.权利要求1所述的生物活性肽，其氨基酸序列选自ESETRILLQ、ESETKILLQ、DSDAKILIQ、DSDAKLLIQ、ETDTRILVE、ESEARIILE、DSESKLVID、ESETEAVLQ、ESKIRILLQ、ETRILL、SETRIL组成的组。

4.权利要求1-3任一项所述的分泌肽在制备抗衰老功能的食品、化妆品、保健品或药物中的应用。

5.权利要求1-3任一项所述的分泌肽在制备抗紫外损伤功能的食品、化妆品、保健品或药物中的应用。

6.权利要求1-3任一项所述的分泌肽在制备抗炎功能的食品、化妆品、保健品或药物中的应用。

7.一种合成权利要求1-3任一项所述多肽的衍生物，其所述衍生物为在权利要求1-3所述多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物，同时不影响其生物学活性。

8.一种药物组合物，其含有权利要求1-3所述的生物活性肽、权利要求6所述的生物活性肽衍生物，以及至少一种赋形剂或美容上或药学上可接受的佐剂。

9.权利要求8所述的药物组合物，所述赋形剂包括：羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚乙烯醇、葡聚糖、氨、乳酸、柠檬酸、吡咯烷酮羧酸、甘油、尿素、山梨糖醇、氨基酸、羊毛脂、矿脂。

10.权利要求8所述的药物组合物，所述佐剂包括：增溶剂，增稠剂，胶凝剂，柔软剂，抗氧化剂，悬浮剂，稳定剂，发泡剂，调味剂，表面活性剂，水，离子或非离子乳化剂，填料，螯合剂，螯合剂，防腐剂，维生素，阻滞剂，润湿剂，精油，染料，颜料。