JP2002542200A - 免疫寛容を誘発するｄ型ポリペプチドおよびその使用方法 - Google Patents
免疫寛容を誘発するｄ型ポリペプチドおよびその使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
インテグリン関連疾患の抑制に有用な方法および組成物が提供される。本組成物は、インテグリンがその関連結合ポリペプチドと結合するのを抑制する、１つまたは２つ以上のＤ−アミノ酸をもつポリペプチドを含有する。本組成物はレトロインバーソポリペプチドを含む。
Description
【０００１】 本発明は、白血球機能付随抗原（ＬＦＡ−１）および細胞間接着分子（ＩＣＡ
Ｍ−１）の結合を抑制するＤ−アミノ酸を有するポリペプチドに関する。これら
のＤ型ポリペプチドは、移植器官の拒絶、アレルギーおよび自己免疫疾患の治療
に用いることができる。
Ｍ−１）の結合を抑制するＤ−アミノ酸を有するポリペプチドに関する。これら
のＤ型ポリペプチドは、移植器官の拒絶、アレルギーおよび自己免疫疾患の治療
に用いることができる。
【０００２】
多くの自己免疫疾患は、生物体のＴ細胞が“自己”の蛋白質を認識しこれと反
応するときに発生する。この認識は、Ｔ細胞表面の特定の蛋白質が対応する自己
蛋白質と結合するときに生じる。このタイプの反応は、慢性関節リューマチ、イ
ンスリン依存性糖尿病、多発性硬化症および同種異系移植片拒絶のような自己免
疫疾患を生じる。
応するときに発生する。この認識は、Ｔ細胞表面の特定の蛋白質が対応する自己
蛋白質と結合するときに生じる。このタイプの反応は、慢性関節リューマチ、イ
ンスリン依存性糖尿病、多発性硬化症および同種異系移植片拒絶のような自己免
疫疾患を生じる。
【０００３】 抗原に対する免疫反応の開始は、Ｔ細胞の小サブセットと抗原との相互作用、
それに続くそれらＴ細胞クローンの活性化と増殖を必要とする。完全なＴ細胞活
性化には２つのシグナルが必要である：（１）Ｔ細胞レセプターと適切なＭＨＣ
抗原複合体との相互作用により生じる第一のシグナル、および（２）接着分子に
よって提供される第二のシグナル。前記第二のシグナルは、接着レセプター、Ｌ
ＦＡ−１（ＣＤ１１ａおよびＣＤ１８）とその対応レセプターの１つ（例えばＩ
ＣＡＭ−１（ＣＤ５４)）との結合によって提供される（Staunton et al., Cell
61: 243-254 (1990)）。第二のシグナルが遮断されるならば、抗原特異的Ｔ細
胞はアポトーシスによって死滅するか、または細胞性アネルギー状態に入るよう
に誘導される。ＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体によ
る前記相互作用の遮断は、心臓の同種異系移植を受けたマウスの生存期間の延長
をもたらす（Isobe et al., Science 255: Ｉ125-Ｉ127 (1992)）。
それに続くそれらＴ細胞クローンの活性化と増殖を必要とする。完全なＴ細胞活
性化には２つのシグナルが必要である：（１）Ｔ細胞レセプターと適切なＭＨＣ
抗原複合体との相互作用により生じる第一のシグナル、および（２）接着分子に
よって提供される第二のシグナル。前記第二のシグナルは、接着レセプター、Ｌ
ＦＡ−１（ＣＤ１１ａおよびＣＤ１８）とその対応レセプターの１つ（例えばＩ
ＣＡＭ−１（ＣＤ５４)）との結合によって提供される（Staunton et al., Cell
61: 243-254 (1990)）。第二のシグナルが遮断されるならば、抗原特異的Ｔ細
胞はアポトーシスによって死滅するか、または細胞性アネルギー状態に入るよう
に誘導される。ＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体によ
る前記相互作用の遮断は、心臓の同種異系移植を受けたマウスの生存期間の延長
をもたらす（Isobe et al., Science 255: Ｉ125-Ｉ127 (1992)）。
【０００４】
本発明は、細胞接着分子（例えばＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１）と配列相同
性を有するＤアミノ酸ポリペプチドは、特定の接着レセプターとその対応レセプ
ターまたはリガンドとの間の相互作用を抑制することができるという発展性のあ
る発見をもとにしている。
性を有するＤアミノ酸ポリペプチドは、特定の接着レセプターとその対応レセプ
ターまたはリガンドとの間の相互作用を抑制することができるという発展性のあ
る発見をもとにしている。
【０００５】 例えば、ＬＦＡ−１またはＩＣＡＭ−１のいずれかと相同性をもつＤアミノ酸
ポリペプチドはそれぞれＩＣＡＭ−１またはＬＡＦ−１と結合することができ、
これらＤ型ポリペプチドはＩＣＡＭ−１およびＬＡＦ−１との間の望ましくない
相互作用を抑制するために用いることができる。
ポリペプチドはそれぞれＩＣＡＭ−１またはＬＡＦ−１と結合することができ、
これらＤ型ポリペプチドはＩＣＡＭ−１およびＬＡＦ−１との間の望ましくない
相互作用を抑制するために用いることができる。
【０００６】 第一の実施態様では、本発明は、少なくとも１つのＤアミノ酸を有し、配列番
号：６に示す配列をもつポリペプチドを提供する。本実施態様の別の特徴では、
本ポリペプチドの全アミノ酸がＤアミノ酸である。 別の実施態様では、ＩＣＡＭ−１およびＬＡＦ−１を含むサンプルを、少なく
とも１つのＤアミノ酸を有しさらに配列番号：６に示す配列をもつポリペプチド
と接触させることによってＩＣＡＭ−１およびＬＡＦ−１の相互作用を抑制する
方法が提供される。本実施態様の別の特徴では、本ポリペプチドの全アミノ酸が
Ｄアミノ酸である。
号：６に示す配列をもつポリペプチドを提供する。本実施態様の別の特徴では、
本ポリペプチドの全アミノ酸がＤアミノ酸である。 別の実施態様では、ＩＣＡＭ−１およびＬＡＦ−１を含むサンプルを、少なく
とも１つのＤアミノ酸を有しさらに配列番号：６に示す配列をもつポリペプチド
と接触させることによってＩＣＡＭ−１およびＬＡＦ−１の相互作用を抑制する
方法が提供される。本実施態様の別の特徴では、本ポリペプチドの全アミノ酸が
Ｄアミノ酸である。
【０００７】 さらに別の実施態様では、本発明は、１つまたは２つ以上のＤアミノ酸を含み
配列番号：６に示す配列をもつポリペプチドの抑制惹起量を患者と接触させるこ
とによって、インテグリン関連疾患を抑制する方法を提供する。本実施態様の別
の特徴では、このインテグリン関連疾患は、アレルギー、自己免疫疾患、移植片
拒絶から成る群から選ばれ、さらに自己免疫疾患は、慢性関節リューマチ、イン
スリン依存性糖尿病および多発性硬化症から成る群から選ばれる。前記患者は任
意の哺乳動物であるが、好ましくは人である。前記接触はin vivoでもex vivoで
もよい。
配列番号：６に示す配列をもつポリペプチドの抑制惹起量を患者と接触させるこ
とによって、インテグリン関連疾患を抑制する方法を提供する。本実施態様の別
の特徴では、このインテグリン関連疾患は、アレルギー、自己免疫疾患、移植片
拒絶から成る群から選ばれ、さらに自己免疫疾患は、慢性関節リューマチ、イン
スリン依存性糖尿病および多発性硬化症から成る群から選ばれる。前記患者は任
意の哺乳動物であるが、好ましくは人である。前記接触はin vivoでもex vivoで
もよい。
【０００８】 さらに別の実施態様では、ＬＡＦ−１の結合部位に由来し、１つまたは２つ以
上のＤアミノ酸を含む配列を有し、さらに配列番号：６に示す配列をもつポリペ
プチドを含む治療用組成物が提供される。 本発明の１つまたは２つ以上の実施態様の詳細は添付の図面および下記で説明
する。本発明の他の特徴、目的および利点は下記の説明、図面および特許請求の
範囲から明らかとなろう。
上のＤアミノ酸を含む配列を有し、さらに配列番号：６に示す配列をもつポリペ
プチドを含む治療用組成物が提供される。 本発明の１つまたは２つ以上の実施態様の詳細は添付の図面および下記で説明
する。本発明の他の特徴、目的および利点は下記の説明、図面および特許請求の
範囲から明らかとなろう。
【０００９】
本発明は１つまたは２つ以上のＤ型アミノ酸を含み、インテグリンとそれに対
応するインテグリン結合蛋白質との結合を抑制するポリペプチドを提供する。例
えば、ＬＦＡ−１（ＣＤ１８）のβサブユニットに由来する本発明のＤ型ポリペ
プチドはＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１の相互作用を妨げる。
応するインテグリン結合蛋白質との結合を抑制するポリペプチドを提供する。例
えば、ＬＦＡ−１（ＣＤ１８）のβサブユニットに由来する本発明のＤ型ポリペ
プチドはＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１の相互作用を妨げる。
【００１０】 本明細書で用いられる、“ポリペプチド”または“ペプチド”とは２つ以上の
アミノ酸のポリマーを意味する。本発明のポリペプチドにはその機能的フラグメ
ントが含まれる。本明細書で用いられる“機能的フラグメント”または“機能的
に同等”とは、ここで述べる本発明のポリペプチド（すなわち配列番号：１−６
）と実質的に類似するin vivoおよびin vitro活性を示すことができるポリペプ
チドを指す。前記活性は、抗原性、免疫原性の他に生物学的活性を含む（ただし
これらに限定されない）基準のいずれかによって判定される。生物学的活性には
、抗原性、相互作用防止能力、結合能力の他に本発明のポリペプチドの活性に付
随する他の活性が含まれる。
アミノ酸のポリマーを意味する。本発明のポリペプチドにはその機能的フラグメ
ントが含まれる。本明細書で用いられる“機能的フラグメント”または“機能的
に同等”とは、ここで述べる本発明のポリペプチド（すなわち配列番号：１−６
）と実質的に類似するin vivoおよびin vitro活性を示すことができるポリペプ
チドを指す。前記活性は、抗原性、免疫原性の他に生物学的活性を含む（ただし
これらに限定されない）基準のいずれかによって判定される。生物学的活性には
、抗原性、相互作用防止能力、結合能力の他に本発明のポリペプチドの活性に付
随する他の活性が含まれる。
【００１１】 本発明のポリペプチド配列は、配列番号：１−６の配列と機能的に同等である
アミノ酸配列をもつ化合物を含むことが意図されている。例えば、保存的変化を
もたらす天然のアミノ酸を用いるか、または類似または同等な機能をもつポリペ
プチドをもたらす非天然もしくは合成アミノ酸を用いるアミノ酸置換を実施する
ことができることは当業者の知るところである。そのようなアミノ酸には、リジ
ン、ホモアルギニン、Ｎ−メチルアルギニン、またはアルギニンと機能的に同等
なこれらアミノ酸の模擬体が含まれる。本明細書で用いられる、“模擬体”とは
類似の機能特性または生物学的活性をもつアミノ酸またはアミノ酸類似体を意味
する。そのような特性には親水性、疎水性、荷電、側鎖およびｐＨが含まれる。
さらに、“アミノ酸”という用語には、例えば天然に存在するアミノ酸の他に天
然には存在しないアミノ酸並びにイミノ酸、類似体および模擬体が含まれる。ま
た別に規定されないかぎり、（Ｌ）−アミノ酸および（Ｄ）−アミノ酸の両方が
本定義および本発明に包含されることは当業者には理解されよう。例えば、ポリ
ペプチドの安定性向上のために１つまたは２つ以上の（Ｄ）−アミノ酸を含むこ
とが望ましい。
アミノ酸配列をもつ化合物を含むことが意図されている。例えば、保存的変化を
もたらす天然のアミノ酸を用いるか、または類似または同等な機能をもつポリペ
プチドをもたらす非天然もしくは合成アミノ酸を用いるアミノ酸置換を実施する
ことができることは当業者の知るところである。そのようなアミノ酸には、リジ
ン、ホモアルギニン、Ｎ−メチルアルギニン、またはアルギニンと機能的に同等
なこれらアミノ酸の模擬体が含まれる。本明細書で用いられる、“模擬体”とは
類似の機能特性または生物学的活性をもつアミノ酸またはアミノ酸類似体を意味
する。そのような特性には親水性、疎水性、荷電、側鎖およびｐＨが含まれる。
さらに、“アミノ酸”という用語には、例えば天然に存在するアミノ酸の他に天
然には存在しないアミノ酸並びにイミノ酸、類似体および模擬体が含まれる。ま
た別に規定されないかぎり、（Ｌ）−アミノ酸および（Ｄ）−アミノ酸の両方が
本定義および本発明に包含されることは当業者には理解されよう。例えば、ポリ
ペプチドの安定性向上のために１つまたは２つ以上の（Ｄ）−アミノ酸を含むこ
とが望ましい。
【００１２】 さらに、機能的に同等なポリペプチドである蛋白質またはポリペプチドを含む
ことができる。そのような同等物は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に
アミノ酸残基の欠失、付加または置換を含むことができる（しかしながらそのよ
うな欠失、付加または置換はサイレント変化で、したがって機能的に同等な生成
物を生じる）。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、
親水性および／または両親媒性特性における類似性に基づいて実施できる。
ことができる。そのような同等物は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に
アミノ酸残基の欠失、付加または置換を含むことができる（しかしながらそのよ
うな欠失、付加または置換はサイレント変化で、したがって機能的に同等な生成
物を生じる）。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、
親水性および／または両親媒性特性における類似性に基づいて実施できる。
【００１３】 例えば非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バ
リン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれ
、プラナー中性アミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロ
シン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれ、陽性荷電（塩基性）アミノ酸に
はアルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれ、陰性荷電（酸性）アミノ酸に
はアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
リン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれ
、プラナー中性アミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロ
シン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれ、陽性荷電（塩基性）アミノ酸に
はアルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれ、陰性荷電（酸性）アミノ酸に
はアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００１４】 本発明の有用な改変は、例えば安定性の向上または抗原性の低下を付与するよ
うな改変である。例えば、１つまたは２つ以上のＤ−アミノ酸の取り込み、また
はリジンの置換もしくは欠失は、安定性を高めポリペプチドの抗原性を改変する
ことができる。例えば、本発明のポリペプチドに１つまたは２つ以上のＤ−アミ
ノ酸を取り込ませることによってその安定性が高められる。Ｄ−アミノ酸は、当
技術分野で周知のようにエンドプロテアーゼによる分解からペプチドを保護する
ことによって安定性の向上を付与する（Partridge, Peptide Drug Delivery to
the Brain, Raven Press, New York, pp247, 1991)。このような改変は安定性を
高め、したがって配列番号：１−６のペプチドの生体利用性を高めるが、インテ
グリンレセプターとの相互作用を抑制する活性には影響を与えない。
うな改変である。例えば、１つまたは２つ以上のＤ−アミノ酸の取り込み、また
はリジンの置換もしくは欠失は、安定性を高めポリペプチドの抗原性を改変する
ことができる。例えば、本発明のポリペプチドに１つまたは２つ以上のＤ−アミ
ノ酸を取り込ませることによってその安定性が高められる。Ｄ−アミノ酸は、当
技術分野で周知のようにエンドプロテアーゼによる分解からペプチドを保護する
ことによって安定性の向上を付与する（Partridge, Peptide Drug Delivery to
the Brain, Raven Press, New York, pp247, 1991)。このような改変は安定性を
高め、したがって配列番号：１−６のペプチドの生体利用性を高めるが、インテ
グリンレセプターとの相互作用を抑制する活性には影響を与えない。
【００１５】 本明細書で用いられる、“レトロインバーソ”とは１つまたは２つ以上のアミ
ノ酸におけるアミノ−カルボキシ逆転および光学対掌体的変化（すなわち左旋性
（Ｌ）から右旋性（Ｄ）への変化）を意味する。本発明のポリペプチドは、例え
ばアミノ酸配列のアミノ−カルボキシ逆転、１つまたは２つ以上のＤ−アミノ酸
を含有するアミノ−カルボキシ逆転、および１つまたは２つ以上のＤ−アミノ酸
を含有する非逆転配列を包含する。安定であり生物活性を保持しているレトロイ
ンバーソペプチド模擬体は、Brugidou et al.（Biochem. Biophys. Res. Comm.
214(2): 685-693(1995)）およびChorev et al.（Trends Biotechnol. 13(10): 4
38-445(1995)）の報告のように作製できる。レトロインバーソペプチドの全体構
造の特色は、元のＬ−ペプチドのそれと類似する。しかしながら、これら２つの
分子は固有のキラル二次構造エレメントを共有するので概ね鏡像である。ペプチ
ド結合の反転およびキラリティーの逆転を基にした主要鎖のペプチド模擬体はペ
プチドおよび蛋白質について重要な構造変化を示し、バイオテクノロジーで極め
て重要である。例えば、Ｄ−ＨＩＶプロテアーゼ二量体は全てがＤの基質のみを
切断し、全てがＤのヘキサペプチドオピオイドは腹腔内投与に続いて痛覚脱失を
もたらすことができる（Chorev et al. Trends Biotechnol. 13(10): 438-445(1
995)）。抗原性および免疫原性は代謝的に安定な抗原、例えば天然の抗原性ペプ
チドのうちの全てがＤの異性体およびレトロインバーソ異性体によって達成され
る。いくつかのインテグリンおよびインテグリン結合ペプチド模擬体が下記実施
例で提供される。
ノ酸におけるアミノ−カルボキシ逆転および光学対掌体的変化（すなわち左旋性
（Ｌ）から右旋性（Ｄ）への変化）を意味する。本発明のポリペプチドは、例え
ばアミノ酸配列のアミノ−カルボキシ逆転、１つまたは２つ以上のＤ−アミノ酸
を含有するアミノ−カルボキシ逆転、および１つまたは２つ以上のＤ−アミノ酸
を含有する非逆転配列を包含する。安定であり生物活性を保持しているレトロイ
ンバーソペプチド模擬体は、Brugidou et al.（Biochem. Biophys. Res. Comm.
214(2): 685-693(1995)）およびChorev et al.（Trends Biotechnol. 13(10): 4
38-445(1995)）の報告のように作製できる。レトロインバーソペプチドの全体構
造の特色は、元のＬ−ペプチドのそれと類似する。しかしながら、これら２つの
分子は固有のキラル二次構造エレメントを共有するので概ね鏡像である。ペプチ
ド結合の反転およびキラリティーの逆転を基にした主要鎖のペプチド模擬体はペ
プチドおよび蛋白質について重要な構造変化を示し、バイオテクノロジーで極め
て重要である。例えば、Ｄ−ＨＩＶプロテアーゼ二量体は全てがＤの基質のみを
切断し、全てがＤのヘキサペプチドオピオイドは腹腔内投与に続いて痛覚脱失を
もたらすことができる（Chorev et al. Trends Biotechnol. 13(10): 438-445(1
995)）。抗原性および免疫原性は代謝的に安定な抗原、例えば天然の抗原性ペプ
チドのうちの全てがＤの異性体およびレトロインバーソ異性体によって達成され
る。いくつかのインテグリンおよびインテグリン結合ペプチド模擬体が下記実施
例で提供される。
【００１６】 本発明のポリペプチドは通常の自動ペプチド合成により製造可能で、下記実施
例で述べるように活性について当業者でスクリーニングできる。そのような自動
合成装置は当技術分野で一般的で、例えばアプライド＝バイオシステム社（Appl
ied Biosystems, Inc.）のモデル４３１Ａを含む。自動合成装置を用いる場合の
技術については以下の成書を参照されたい：Steward & Yound, In Solid Phases
Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chemical Co., Rockford, IL. (1984）(
この文献は参照によって本明細書に組み入れられる）。本発明のインテグリン関
連ペプチドは、化学合成、例えばMerrifield et al.（J. Am. Chem. Soc. 85: 2
149 (1964)）の固相ペプチド合成法によって製造できる。当技術分野で周知の標
準的な溶液法もまた、本発明で有用なペプチドを合成するために用いることがで
きる（例えば以下を参照されたい：Bodanszky, Principles of Peptide Synthes
is, Springer-Verlag, Berlin, 1984；およびBodanszky, Peptide Chemistry, S
pringer-Verlag, Berlin, 1993）。
例で述べるように活性について当業者でスクリーニングできる。そのような自動
合成装置は当技術分野で一般的で、例えばアプライド＝バイオシステム社（Appl
ied Biosystems, Inc.）のモデル４３１Ａを含む。自動合成装置を用いる場合の
技術については以下の成書を参照されたい：Steward & Yound, In Solid Phases
Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chemical Co., Rockford, IL. (1984）(
この文献は参照によって本明細書に組み入れられる）。本発明のインテグリン関
連ペプチドは、化学合成、例えばMerrifield et al.（J. Am. Chem. Soc. 85: 2
149 (1964)）の固相ペプチド合成法によって製造できる。当技術分野で周知の標
準的な溶液法もまた、本発明で有用なペプチドを合成するために用いることがで
きる（例えば以下を参照されたい：Bodanszky, Principles of Peptide Synthes
is, Springer-Verlag, Berlin, 1984；およびBodanszky, Peptide Chemistry, S
pringer-Verlag, Berlin, 1993）。
【００１７】 新しく合成されたペプチドは、例えば高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)
によって精製することが可能で、さらに例えば質量分析計またはアミノ酸配列分
析によって性状を調べることができる。化学合成ペプチドは、アプライド＝バイ
オシステムモデル４３０ペプチド合成装置で製造元の供給する自動化固相プロト
コルを用いて調製できる。続いてペプチドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）を用いてバイダック（Vydac）Ｃ４カラムで９５％を越える純度に精製で
きる。ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学反応またはＢｏｃ化学反応のいずれかを用いる
多様な技術によって工業的に合成できることは当業者には理解されよう。インテ
グリンまたはインテグリン結合蛋白質、例えばＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１に
由来する類似の活性ペプチドもまた本発明の範囲内に包含され、同様に製造およ
びスクリーニングすることができる。
によって精製することが可能で、さらに例えば質量分析計またはアミノ酸配列分
析によって性状を調べることができる。化学合成ペプチドは、アプライド＝バイ
オシステムモデル４３０ペプチド合成装置で製造元の供給する自動化固相プロト
コルを用いて調製できる。続いてペプチドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）を用いてバイダック（Vydac）Ｃ４カラムで９５％を越える純度に精製で
きる。ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学反応またはＢｏｃ化学反応のいずれかを用いる
多様な技術によって工業的に合成できることは当業者には理解されよう。インテ
グリンまたはインテグリン結合蛋白質、例えばＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１に
由来する類似の活性ペプチドもまた本発明の範囲内に包含され、同様に製造およ
びスクリーニングすることができる。
【００１８】 インテグリン内の任意の接触部位およびその対応するインテグリン結合蛋白質
が本発明の範囲内に包含されることは理解されよう。例えば、ＬＦＡ−１および
ＩＣＡＭ−１内の接触部位を用いて下記実施例で述べるポリペプチドを得ること
ができる。本発明のポリペプチドは、インテグリンとインテグリン結合蛋白質と
の間の接触部位を特定することによって得られる。接触部位のアミノ酸配列がい
ったん特定されたら、例えばＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはＤ−およびＬ−
アミノ酸の組み合わせを用いてポリペプチドの配列が提供される。所望する場合
は、このポリペプチドをさらにアッセイし、その生物学的活性、例えばインテグ
リン結合阻止能力を例えば混合リンパ球反応、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）
実験または器官移植実験を用いて測定できる。
が本発明の範囲内に包含されることは理解されよう。例えば、ＬＦＡ−１および
ＩＣＡＭ−１内の接触部位を用いて下記実施例で述べるポリペプチドを得ること
ができる。本発明のポリペプチドは、インテグリンとインテグリン結合蛋白質と
の間の接触部位を特定することによって得られる。接触部位のアミノ酸配列がい
ったん特定されたら、例えばＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはＤ−およびＬ−
アミノ酸の組み合わせを用いてポリペプチドの配列が提供される。所望する場合
は、このポリペプチドをさらにアッセイし、その生物学的活性、例えばインテグ
リン結合阻止能力を例えば混合リンパ球反応、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）
実験または器官移植実験を用いて測定できる。
【００１９】 当業者には接触部位の特定方法が多数知られている。例えば、蛋白質内の接触
部位を特定する標準的な３つの方法を本明細書で述べる。これら３つの方法は全
て、蛋白質をコードする遺伝子のクローニングを必要としその配列を知ることが
要求される。複数のそのような配列が当技術分野で報告されている。
部位を特定する標準的な３つの方法を本明細書で述べる。これら３つの方法は全
て、蛋白質をコードする遺伝子のクローニングを必要としその配列を知ることが
要求される。複数のそのような配列が当技術分野で報告されている。
【００２０】 方法の１つは以前に文献に報告されている（Stanley et al., EMBO 13: 1790-
1798(1994)）(この文献は参照により本明細書に組み入れられる）。この方法で
は、第一または第二の蛋白質のドメインは、蛋白質をコードする遺伝子から対応
するセグメントを欠失させることによって除去される。前記改変遺伝子は細菌で
発現され、改変蛋白質を生じる。続いて前記改変蛋白を他方の蛋白質との結合能
力についてアッセイする。改変蛋白質が他方の蛋白質と結合しない場合は、接触
部位が除去されている。これにより接触部位の位置が決定される。
1798(1994)）(この文献は参照により本明細書に組み入れられる）。この方法で
は、第一または第二の蛋白質のドメインは、蛋白質をコードする遺伝子から対応
するセグメントを欠失させることによって除去される。前記改変遺伝子は細菌で
発現され、改変蛋白質を生じる。続いて前記改変蛋白を他方の蛋白質との結合能
力についてアッセイする。改変蛋白質が他方の蛋白質と結合しない場合は、接触
部位が除去されている。これにより接触部位の位置が決定される。
【００２１】 接触部位の位置が上記のように決定されたら、もう１つの方法が用いられる。
この方法は、どのアミノ酸が蛋白質結合に必要であるかを正確に特定するために
、蛋白質の遺伝子の位置特異的変異誘発を必要とする。接触部位内のただ１つの
アミノ酸を変化させるために特定のヌクレオチドが改変される。続いて、このよ
うにして作製した改変蛋白質を上記のように相補的または対応蛋白質との結合能
力についてアッセイする。これによって前記特定のアミノ酸の重要性が推定され
る。位置特異的変異誘発は日常的であり広く用いられている技術であることは当
業者に理解されている。実際、多くの位置特異的変異誘発キットが市販されてい
る。そのようなキットの１つは、クロンテック＝ラボラトリーズ（Clontech Lab
oratories, Palo Alto, CA）が販売する“Transformer Site Directed Mutagene
sis Kit”である。
この方法は、どのアミノ酸が蛋白質結合に必要であるかを正確に特定するために
、蛋白質の遺伝子の位置特異的変異誘発を必要とする。接触部位内のただ１つの
アミノ酸を変化させるために特定のヌクレオチドが改変される。続いて、このよ
うにして作製した改変蛋白質を上記のように相補的または対応蛋白質との結合能
力についてアッセイする。これによって前記特定のアミノ酸の重要性が推定され
る。位置特異的変異誘発は日常的であり広く用いられている技術であることは当
業者に理解されている。実際、多くの位置特異的変異誘発キットが市販されてい
る。そのようなキットの１つは、クロンテック＝ラボラトリーズ（Clontech Lab
oratories, Palo Alto, CA）が販売する“Transformer Site Directed Mutagene
sis Kit”である。
【００２２】 さらに別の方法は“酵母蛋白質複合体検出システム”である。この方法は市販
のキットを用いて実施できる。そのようなキットの１つは、クロンテック＝ラボ
ラトリーズ（Clontech Laboratories, Palo Alto, CA）が販売する“マッチメー
カー（MATCHMAKER）蛋白質複合体検出システム”である。この方法では、第一の
蛋白質のドメインをプラスミド（プラスミドＡ）にサブクローニングし融合蛋白
質として酵母で発現させる。この融合蛋白質は、前記第一の蛋白質のドメインに
付加された酵母の転写因子のドメインを含んでいる。第二の蛋白質の遺伝子もま
たプラスミド（プラスミドＢ）にサブクローニングされ、融合蛋白質として酵母
で発現される。この場合は、融合蛋白質は酵母の転写因子の異なるドメインを含
んでいる。第一の蛋白質と第二の蛋白質のドメインが酵母内で結合した場合、機
能を有する転写因子が、プラスミドＡおよびＢによってコードされる転写因子ド
メインから形成される。このハイブリッド転写因子はレポーター遺伝子の発現を
もたらす。したがって、レポーター遺伝子の発現は第一および第二の蛋白質のド
メインが蛋白質ＡおよびＢの接触部位を含んでいることを示している。
のキットを用いて実施できる。そのようなキットの１つは、クロンテック＝ラボ
ラトリーズ（Clontech Laboratories, Palo Alto, CA）が販売する“マッチメー
カー（MATCHMAKER）蛋白質複合体検出システム”である。この方法では、第一の
蛋白質のドメインをプラスミド（プラスミドＡ）にサブクローニングし融合蛋白
質として酵母で発現させる。この融合蛋白質は、前記第一の蛋白質のドメインに
付加された酵母の転写因子のドメインを含んでいる。第二の蛋白質の遺伝子もま
たプラスミド（プラスミドＢ）にサブクローニングされ、融合蛋白質として酵母
で発現される。この場合は、融合蛋白質は酵母の転写因子の異なるドメインを含
んでいる。第一の蛋白質と第二の蛋白質のドメインが酵母内で結合した場合、機
能を有する転写因子が、プラスミドＡおよびＢによってコードされる転写因子ド
メインから形成される。このハイブリッド転写因子はレポーター遺伝子の発現を
もたらす。したがって、レポーター遺伝子の発現は第一および第二の蛋白質のド
メインが蛋白質ＡおよびＢの接触部位を含んでいることを示している。
【００２３】 本発明のポリペプチドは当業者によく知られているいずれの方法を用いてもア
ッセイできる。例えば、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを用いることがで
きる。ＭＬＲはin vivoでの活性の良好な予測手段で、抑制性ポリペプチドの選
別を促進する。これは、ＭＬＲは生物学的な情報の読みだし、すなわち増殖誘発
を伴う細胞の相互作用を測定するからである。したがって、ＭＬＲは同種異系Ｔ
細胞反応の直接測定手段である。さらにまた、ＭＬＲは骨髄移植に関与する事象
の直接的モデルで、器官移植および自己免疫疾患（例えば慢性関節リューマチ、
インスリン依存性糖尿病および多発性硬化症）の治療におけるＤ−アミノ酸ポリ
ペプチドの生物学的有効性を間接的に予測する。ＭＬＲの詳細なプロトコルは下
記の実施例で述べる。
ッセイできる。例えば、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを用いることがで
きる。ＭＬＲはin vivoでの活性の良好な予測手段で、抑制性ポリペプチドの選
別を促進する。これは、ＭＬＲは生物学的な情報の読みだし、すなわち増殖誘発
を伴う細胞の相互作用を測定するからである。したがって、ＭＬＲは同種異系Ｔ
細胞反応の直接測定手段である。さらにまた、ＭＬＲは骨髄移植に関与する事象
の直接的モデルで、器官移植および自己免疫疾患（例えば慢性関節リューマチ、
インスリン依存性糖尿病および多発性硬化症）の治療におけるＤ−アミノ酸ポリ
ペプチドの生物学的有効性を間接的に予測する。ＭＬＲの詳細なプロトコルは下
記の実施例で述べる。
【００２４】 本発明の実施態様の１つでは、ＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１の不連続ドメイ
ン（これらは２つの蛋白質の接触部位であると考えられている）がスクリーニン
グにより選別された。ＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１の配列は知られている。こ
れらの接触部位で見出された配列を基にしたポリペプチドは標準的な技術を用い
て合成され市販されている。これらポリペプチドのいくつかは環状化されている
。ＭＬＲアッセイは、ＬＦＡ−１またはＩＣＡＭ−１に由来する、Ｄ−アミノ酸
から成るポリペプチドは生物学的機能（例えば細胞増殖抑制能力）保持している
か否かを決定するために実施された。
ン（これらは２つの蛋白質の接触部位であると考えられている）がスクリーニン
グにより選別された。ＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１の配列は知られている。こ
れらの接触部位で見出された配列を基にしたポリペプチドは標準的な技術を用い
て合成され市販されている。これらポリペプチドのいくつかは環状化されている
。ＭＬＲアッセイは、ＬＦＡ−１またはＩＣＡＭ−１に由来する、Ｄ−アミノ酸
から成るポリペプチドは生物学的機能（例えば細胞増殖抑制能力）保持している
か否かを決定するために実施された。
【００２５】 そのようなＤ−型ポリペプチドの１つ（Ｄ−ＬＢＥＬ、配列番号：６）はＭＬ
ＲアッセイでＴ細胞増殖の抑制に極めて有効であった。本明細書で述べるin vit
ro実験の結果によって移植器官の拒絶、アレルギーおよび自己免疫疾患のような
症状の治療におけるそのようなＤ型ポリペプチドの有効性が予想できることは当
業者には理解されよう。
ＲアッセイでＴ細胞増殖の抑制に極めて有効であった。本明細書で述べるin vit
ro実験の結果によって移植器官の拒絶、アレルギーおよび自己免疫疾患のような
症状の治療におけるそのようなＤ型ポリペプチドの有効性が予想できることは当
業者には理解されよう。
【００２６】 本明細書で用いられる、活性を“抑制する”ということは、測定可能な量で活
性を低下させること、例えば少なくとも３０％またはそれより大きい低下を意味
する。抑制される可能性がある活性が複数存在する場合（例えばレセプターとそ
のリガンドとの結合の阻止および二次メッセンジャー活性の開始の遮断）、本発
明の範囲に包含されるためには任意の１つの活性の低下で十分である（他方の活
性の低下を伴っても伴わなくてもよい）。
性を低下させること、例えば少なくとも３０％またはそれより大きい低下を意味
する。抑制される可能性がある活性が複数存在する場合（例えばレセプターとそ
のリガンドとの結合の阻止および二次メッセンジャー活性の開始の遮断）、本発
明の範囲に包含されるためには任意の１つの活性の低下で十分である（他方の活
性の低下を伴っても伴わなくてもよい）。
【００２７】 本発明は、インテグリン関連疾患をもつ患者を治療する方法を提供する。“イ
ンテグリン関連”とは、インテグリン分子とそのリガンドとの相互作用、例えば
ＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１との相互作用を必要とする任意の疾患を指す。そのよ
うなインテグリン関連疾患には、例えばアレルギー、自己免疫疾患、同種異系移
植片拒絶および移植拒絶が含まれる。いくつかの自己免疫疾患の例には慢性関節
リューマチ、インスリン依存性糖尿病および多発性硬化症が含まれる。したがっ
て、インテグリン関連疾患がインテグリンとそのリガンドとの相互作用を伴う場
合は、本発明のポリペプチドは、インテグリンとそのリガンドとの相互作用に影
響を与えることによって前記疾患を調節または抑制することができる。
ンテグリン関連”とは、インテグリン分子とそのリガンドとの相互作用、例えば
ＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１との相互作用を必要とする任意の疾患を指す。そのよ
うなインテグリン関連疾患には、例えばアレルギー、自己免疫疾患、同種異系移
植片拒絶および移植拒絶が含まれる。いくつかの自己免疫疾患の例には慢性関節
リューマチ、インスリン依存性糖尿病および多発性硬化症が含まれる。したがっ
て、インテグリン関連疾患がインテグリンとそのリガンドとの相互作用を伴う場
合は、本発明のポリペプチドは、インテグリンとそのリガンドとの相互作用に影
響を与えることによって前記疾患を調節または抑制することができる。
【００２８】 本発明のポリペプチド配列はインテグリン関連疾患を効果的に抑制し治療する
ことができる。本発明のポリペプチドはサンプル、細胞または患者にin vivoで
送達させることができる。典型的には、前記患者は哺乳動物、より典型的には人
である。ポリペプチド配列とそのリガンドとの結合を用いて、細胞の結合、増殖
またはインテグリン関連疾患を抑制することができる。さらにまた、前記ポリペ
プチド配列を他の薬剤と併用してもよい。この併用治療は前記配列または薬剤単
独よりも有効であることを証明できる。
ことができる。本発明のポリペプチドはサンプル、細胞または患者にin vivoで
送達させることができる。典型的には、前記患者は哺乳動物、より典型的には人
である。ポリペプチド配列とそのリガンドとの結合を用いて、細胞の結合、増殖
またはインテグリン関連疾患を抑制することができる。さらにまた、前記ポリペ
プチド配列を他の薬剤と併用してもよい。この併用治療は前記配列または薬剤単
独よりも有効であることを証明できる。
【００２９】 本発明の方法にしたがって標的細胞、サンプル、組織または患者を前記ポリペ
プチド配列に対して感受性にさせるためには、ポリペプチド配列で治療される細
胞、組織または患者との接触を促進させる条件下で前記配列に細胞を暴露しなけ
ればならない。in vitro治療は、多数の方法によって達成できる。これには、例
えば細胞または組織とポリペプチド配列とを適切な栄養媒体中でインテグリン仲
介相互作用の抑制に適した時間、単にインキュベーションすることが含まれる。
プチド配列に対して感受性にさせるためには、ポリペプチド配列で治療される細
胞、組織または患者との接触を促進させる条件下で前記配列に細胞を暴露しなけ
ればならない。in vitro治療は、多数の方法によって達成できる。これには、例
えば細胞または組織とポリペプチド配列とを適切な栄養媒体中でインテグリン仲
介相互作用の抑制に適した時間、単にインキュベーションすることが含まれる。
【００３０】 本発明のポリペプチド配列は単独で送達されるか、または例えば化学療法剤、
ＲＧＤ−ペプチド、リボザイム、またはアンチセンス分子のような他の薬剤と一
緒に送達できる。さらに、本発明のポリペプチド配列は、インテグリン関連疾患
を治療するために外科手術の間、その後、または外科手術の一部として送達でき
る。
ＲＧＤ−ペプチド、リボザイム、またはアンチセンス分子のような他の薬剤と一
緒に送達できる。さらに、本発明のポリペプチド配列は、インテグリン関連疾患
を治療するために外科手術の間、その後、または外科手術の一部として送達でき
る。
【００３１】 さらに、本発明のポリペプチド配列は、細胞または組織を患者から採取し、こ
れらの細胞または組織を前記配列で処置し、続いてこれら処置細胞または組織を
患者に戻すことによってex vivoで投与できる。そのような処置は器官移植術で
有用であることを証明できる。
れらの細胞または組織を前記配列で処置し、続いてこれら処置細胞または組織を
患者に戻すことによってex vivoで投与できる。そのような処置は器官移植術で
有用であることを証明できる。
【００３２】 本明細書で述べる多くの方法がin vivoまたはex vivoで実施可能である。本発
明のポリペプチド配列は、インテグリン関連疾患をもつ患者にin vivo治療を提
供するために投与できる。そのような治療は、場合によってはex vivoまたはin
vivoで治療的に有効な量のＤ型ポリペプチド配列を投与することによって達成で
きる。“治療的に有効”という用語は、インテグリン仲介相互作用を有益な程度
に抑圧または抑制するために十分な量で投与されるポリペプチド配列の量を指す
。
明のポリペプチド配列は、インテグリン関連疾患をもつ患者にin vivo治療を提
供するために投与できる。そのような治療は、場合によってはex vivoまたはin
vivoで治療的に有効な量のＤ型ポリペプチド配列を投与することによって達成で
きる。“治療的に有効”という用語は、インテグリン仲介相互作用を有益な程度
に抑圧または抑制するために十分な量で投与されるポリペプチド配列の量を指す
。
【００３３】 本発明のポリペプチド配列（Ｄ型ポリペプチドを含む）は、任意の許容し得る
様式（経口、注射、埋め込み物、経鼻などを含む）で患者に投与できる。経口投
与は、本発明のポリペプチド配列を錠剤、分散液、埋め込み物、溶液、乳液、カ
プセル、散剤、シロップ、水性組成物などとして投与することを含む。経鼻投与
は、本発明の組成物をスプレー、溶液などとして投与することを含む。注射およ
び埋め込み物が、投与に有益なタイミングおよび投薬レベルの正確な制御が可能
であるので好ましく、注射がもっとも好ましい。ポリペプチド配列は非経口的に
投与できる。
様式（経口、注射、埋め込み物、経鼻などを含む）で患者に投与できる。経口投
与は、本発明のポリペプチド配列を錠剤、分散液、埋め込み物、溶液、乳液、カ
プセル、散剤、シロップ、水性組成物などとして投与することを含む。経鼻投与
は、本発明の組成物をスプレー、溶液などとして投与することを含む。注射およ
び埋め込み物が、投与に有益なタイミングおよび投薬レベルの正確な制御が可能
であるので好ましく、注射がもっとも好ましい。ポリペプチド配列は非経口的に
投与できる。
【００３４】 本発明の方法で有用な治療用薬剤は、注射または長時間の緩徐な灌流によって
非経口的に投与できる。投与は静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内または経皮
的である。
非経口的に投与できる。投与は静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内または経皮
的である。
【００３５】 非経口投与のための調製物には滅菌水性もしくは非水性溶液、分散液および乳
液が含まれる。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル、植物油（例えばオリーブ油）、および注射用有機エステル（例えばオレイン
酸エチル）である。水性担体には水、アルコール系／水性溶液、乳液もしくは分
散液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）である。非経口用ビヒクルには塩化ナ
トリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム
、乳酸リンゲル静脈用ビヒクル（液体および栄養補液を含む）、電解質補液（リ
ンゲルデキストロースを主剤にするもの）などが含まれる。保存料および他の添
加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどもまた含むこ
とができる。
液が含まれる。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル、植物油（例えばオリーブ油）、および注射用有機エステル（例えばオレイン
酸エチル）である。水性担体には水、アルコール系／水性溶液、乳液もしくは分
散液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）である。非経口用ビヒクルには塩化ナ
トリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム
、乳酸リンゲル静脈用ビヒクル（液体および栄養補液を含む）、電解質補液（リ
ンゲルデキストロースを主剤にするもの）などが含まれる。保存料および他の添
加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどもまた含むこ
とができる。
【００３６】 本発明のポリペプチド配列、製剤または組成物の実際の投与量は、個体の大き
さおよび健康状態を含む多くの要因に左右されるが、適切な投与量を決定するた
めに当業者は以下の文献を用いることがでる（B. Spilker, Guide to Clinical
Studies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd., New York, 198
4, pp.7-13, 54-60; B. Spiker, Guide to Clinical Trials, Raven Press, Ltd
., New York, 1991, pp.93-101; C. Craig & R. Stitzel, eds., Modern Pharma
cology, d. ed., Little, Brown and Co., Boston, 1986, pp.127-33; T. Sleig
ht, ed., Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pha
rmacology and Therapeutics, 3d ed., Williams and Wilkins, Baltimore, 198
7, pp.50-56; R. Tallarida, R. Raffa & P. McGonigle, Principles in Genera
l Pharmacology, Springer-Verlag, New York, 1988, pp.18-20）。本発明のポ
リペプチド配列は、単位剤形として都合よく投与でき、例えば下記成書（Reming
ton's Pharmaceutical Sciences, Mack Pub. Co., Easton, PA, 1990）に記載さ
れている医薬分野で周知のいずれの方法を用いても製造できる。
さおよび健康状態を含む多くの要因に左右されるが、適切な投与量を決定するた
めに当業者は以下の文献を用いることがでる（B. Spilker, Guide to Clinical
Studies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd., New York, 198
4, pp.7-13, 54-60; B. Spiker, Guide to Clinical Trials, Raven Press, Ltd
., New York, 1991, pp.93-101; C. Craig & R. Stitzel, eds., Modern Pharma
cology, d. ed., Little, Brown and Co., Boston, 1986, pp.127-33; T. Sleig
ht, ed., Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pha
rmacology and Therapeutics, 3d ed., Williams and Wilkins, Baltimore, 198
7, pp.50-56; R. Tallarida, R. Raffa & P. McGonigle, Principles in Genera
l Pharmacology, Springer-Verlag, New York, 1988, pp.18-20）。本発明のポ
リペプチド配列は、単位剤形として都合よく投与でき、例えば下記成書（Reming
ton's Pharmaceutical Sciences, Mack Pub. Co., Easton, PA, 1990）に記載さ
れている医薬分野で周知のいずれの方法を用いても製造できる。
【００３７】 生理学的および医薬的に許容できる賦形剤および担体は当業者には周知である
。本明細書で用いられる“生理学的または医薬的に許容できる担体”とは、本発
明のポリペプチド配列がその中で安定で使用時に生体利用性を保持している実質
的に無毒な投与用担体を意味する。例えば、本発明のポリペプチド配列は通常の
態様で液体中に溶解、分散されるか、または媒体中で乳化されて液体調製物を生
成することができる。さらに半固形（ゲル）または固形担体とともに混合してペ
ースト、軟膏、クリーム、ローションなどを生成してもよい。
。本明細書で用いられる“生理学的または医薬的に許容できる担体”とは、本発
明のポリペプチド配列がその中で安定で使用時に生体利用性を保持している実質
的に無毒な投与用担体を意味する。例えば、本発明のポリペプチド配列は通常の
態様で液体中に溶解、分散されるか、または媒体中で乳化されて液体調製物を生
成することができる。さらに半固形（ゲル）または固形担体とともに混合してペ
ースト、軟膏、クリーム、ローションなどを生成してもよい。
【００３８】 適切な担体には、水、ワセリン（VASELINE (登録商標)）、鉱油、鉱物油、植
物油、動物性油、有機および無機ワックス（例えば微晶質、パラフィンおよびオ
ゾケライトワックス）、天然ポリマー（例えばキサンタン、ゼラチン、セルロー
ス、アラビアゴム）、合成ポリマー（例えば下記に論述するもの）、アルコール
、ポリオール、水などが含まれる。水混和性担体組成物（実質的に水に混和でき
る）を用いてもよい。そのような水に混和可能な担体組成物は上記で説明した１
つまたは２つ以上の成分により作られるものを含むことができるが、さらにまた
持続性または徐放性担体（水分含有性、水に分散性または水溶性組成物を含む）
、例えばリポソーム、マイクロスポンジ、マイクロスフェアまたはマイクロカプ
セル、水性軟膏、油中水型もしくは水中油型乳液またはゲルを含むことができる
。
物油、動物性油、有機および無機ワックス（例えば微晶質、パラフィンおよびオ
ゾケライトワックス）、天然ポリマー（例えばキサンタン、ゼラチン、セルロー
ス、アラビアゴム）、合成ポリマー（例えば下記に論述するもの）、アルコール
、ポリオール、水などが含まれる。水混和性担体組成物（実質的に水に混和でき
る）を用いてもよい。そのような水に混和可能な担体組成物は上記で説明した１
つまたは２つ以上の成分により作られるものを含むことができるが、さらにまた
持続性または徐放性担体（水分含有性、水に分散性または水溶性組成物を含む）
、例えばリポソーム、マイクロスポンジ、マイクロスフェアまたはマイクロカプ
セル、水性軟膏、油中水型もしくは水中油型乳液またはゲルを含むことができる
。
【００３９】 前記担体は持続放出または徐放性担体を含むことができる。本担体は、インテ
グリンまたはインテグリン結合分子に向かって特異的に誘導されるポリペプチド
配列を持続放出または徐放放出させ、ポリペプチド配列の投与頻度を１回または
２回以上少なくし、および／または投与量を減少させ、取り扱いの容易さ、およ
び効果の延長または遅発化を提供することができる任意の物質である。本担体は
、診断もしくは治療領域の環境に暴露されたとき、または本発明のポリペプチド
を遊離させるために前記配列を担体に添加した程度に対応した拡散または放出に
よってポリペプチド配列を放出することができる。そのような担体を非限定的に
例示すれば、上記で述べたリポソーム、マイクロスポンジ、マイクロスフェア、
遺伝子活性化マトリックス、または天然もしくは合成ポリマーなどが含まれる。
湿潤な環境での持続性または徐放性放出のために適した担体の例には、ゼラチン
、アラビアゴム、キサンタンポリマーが含まれる。添加の程度に応じて放出され
る例にはリグニンポリマーなどが含まれる。脂肪性またはロウ状環境で放出され
る例には熱可塑性または可撓性熱硬化性樹脂またはエラストマーが含まれる。熱
可塑性樹脂には例えばポリビニルハライド、ポリビニルエステル、ポリビニリデ
ンハライドおよびハロゲン化ポリオレフィンが含まれ、エラストマーには例えば
ブラシリエンシス（brasiliensis）、ポリジエンおよびハロゲン化天然および合
成ゴムが含まれ、可撓性熱硬化性樹脂は例えばポリウレタン、エポキシ樹脂など
である。持続性または徐放性放出担体はリポソーム、マイクロスポンジ、マイク
ロスフェアまたはゲルでもよい。注射用ｐＨ平衡緩衝水溶液を用いてもよい。し
かしながら、好ましい担体は投与態様により変動する。通常は投与組成物は、組
成物の総重量に対して重量で約０.０００１％から約９０％のポリペプチド配列
を含む。 以下の実施例は説明のためであり、本発明の全体的範囲を限定しようとするも
のではない。
グリンまたはインテグリン結合分子に向かって特異的に誘導されるポリペプチド
配列を持続放出または徐放放出させ、ポリペプチド配列の投与頻度を１回または
２回以上少なくし、および／または投与量を減少させ、取り扱いの容易さ、およ
び効果の延長または遅発化を提供することができる任意の物質である。本担体は
、診断もしくは治療領域の環境に暴露されたとき、または本発明のポリペプチド
を遊離させるために前記配列を担体に添加した程度に対応した拡散または放出に
よってポリペプチド配列を放出することができる。そのような担体を非限定的に
例示すれば、上記で述べたリポソーム、マイクロスポンジ、マイクロスフェア、
遺伝子活性化マトリックス、または天然もしくは合成ポリマーなどが含まれる。
湿潤な環境での持続性または徐放性放出のために適した担体の例には、ゼラチン
、アラビアゴム、キサンタンポリマーが含まれる。添加の程度に応じて放出され
る例にはリグニンポリマーなどが含まれる。脂肪性またはロウ状環境で放出され
る例には熱可塑性または可撓性熱硬化性樹脂またはエラストマーが含まれる。熱
可塑性樹脂には例えばポリビニルハライド、ポリビニルエステル、ポリビニリデ
ンハライドおよびハロゲン化ポリオレフィンが含まれ、エラストマーには例えば
ブラシリエンシス（brasiliensis）、ポリジエンおよびハロゲン化天然および合
成ゴムが含まれ、可撓性熱硬化性樹脂は例えばポリウレタン、エポキシ樹脂など
である。持続性または徐放性放出担体はリポソーム、マイクロスポンジ、マイク
ロスフェアまたはゲルでもよい。注射用ｐＨ平衡緩衝水溶液を用いてもよい。し
かしながら、好ましい担体は投与態様により変動する。通常は投与組成物は、組
成物の総重量に対して重量で約０.０００１％から約９０％のポリペプチド配列
を含む。 以下の実施例は説明のためであり、本発明の全体的範囲を限定しようとするも
のではない。
【００４０】 実施例１ ポリペプチドはゲノシス＝バイオテクノロジーズ社（Genosys Biotechnologie
s, Inc.）またはマルチプル＝ペプチド＝システムで合成された。ペプチド合成
は一般に、 Ｆｍｏｃ化学反応を用いて標準相プロトコルにしたがって実施した。
配列内にペニシラミン残基（Pen）およびカルボキシ末端にシステインをもつ直
鎖状ペプチドを、２％のフェリシアン化カリウム水溶液を希釈ペプチド溶液に一
滴ずつ添加することによって末端残基間にジスルフィド結合を形成して環状化し
た。
s, Inc.）またはマルチプル＝ペプチド＝システムで合成された。ペプチド合成
は一般に、 Ｆｍｏｃ化学反応を用いて標準相プロトコルにしたがって実施した。
配列内にペニシラミン残基（Pen）およびカルボキシ末端にシステインをもつ直
鎖状ペプチドを、２％のフェリシアン化カリウム水溶液を希釈ペプチド溶液に一
滴ずつ添加することによって末端残基間にジスルフィド結合を形成して環状化し
た。
【００４１】 下記表１は、個々の配列番号に対応する本発明のポリペプチド構築物を示して
いる。
いる。
【表１】
【００４２】 実施例２ 混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を本ポリペプチドについて実施し、これらポリペ
プチドが所望の生物学的活性をもつか否かを調べた。関与するＴ細胞の生物学的
有効性をいずれのＤ型ポリペプチドが抑制するかを示すために、ＭＬＲアッセイ
を本発明の一定のポリペプチドを用いて実施した。表２は使用した種々のポリペ
プチドの有効性を示す。
プチドが所望の生物学的活性をもつか否かを調べた。関与するＴ細胞の生物学的
有効性をいずれのＤ型ポリペプチドが抑制するかを示すために、ＭＬＲアッセイ
を本発明の一定のポリペプチドを用いて実施した。表２は使用した種々のポリペ
プチドの有効性を示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】 一方向ＭＬＲは以前に報告されていた（Kruisbeek et al., Current Protocol
s in Immunology, Proliferative Assays for T-Cell Function, 3.12.1-3.12.1
4 (1991）(この文献は参照により本明細書に組み入れられる)）。具体的には、
ヒトの扁桃腺Ｔ細胞を２−４×１０6細胞／mlの濃度で細胞培養液（ＲＰＭＩ）
に懸濁しレスポンダーとして使用した。刺激細胞はヒト単核細胞で、これは末梢
血の１回目のフィコール分離（バッフィーコート）から単離し、培養液（ＲＰＭ
Ｉ）で２−４×１０6細胞／mlの濃度で懸濁した。刺激細胞は、γ１３７Ｃｓ源
から３０００−５０００radのイオン化照射による処置で使用前に不活化させた
。各細胞懸濁液１００μｌを、下記に示すように種々の濃度の被検ポリペプチド
の存在下または不存在下で９６穴（ウェル）プレートの各ウェルに加えた。細胞
の増殖は、７２時間後に３Ｈ−チミジンを各ウェルに添加し（１μＣｉ／ウェル
、６７Ｃｉ／mmol）、６時間インキュベーションすることによって調べた。細胞
をＰＨＤセルハーベスター（Cambridge Technology, Inc., Watertown, MA）で
採集し、取り込まれた３Ｈを液体シンチレーションカウンター（Packard Instru
ment, Inc., Donner's Grove, IL)で計測した。
s in Immunology, Proliferative Assays for T-Cell Function, 3.12.1-3.12.1
4 (1991）(この文献は参照により本明細書に組み入れられる)）。具体的には、
ヒトの扁桃腺Ｔ細胞を２−４×１０6細胞／mlの濃度で細胞培養液（ＲＰＭＩ）
に懸濁しレスポンダーとして使用した。刺激細胞はヒト単核細胞で、これは末梢
血の１回目のフィコール分離（バッフィーコート）から単離し、培養液（ＲＰＭ
Ｉ）で２−４×１０6細胞／mlの濃度で懸濁した。刺激細胞は、γ１３７Ｃｓ源
から３０００−５０００radのイオン化照射による処置で使用前に不活化させた
。各細胞懸濁液１００μｌを、下記に示すように種々の濃度の被検ポリペプチド
の存在下または不存在下で９６穴（ウェル）プレートの各ウェルに加えた。細胞
の増殖は、７２時間後に３Ｈ−チミジンを各ウェルに添加し（１μＣｉ／ウェル
、６７Ｃｉ／mmol）、６時間インキュベーションすることによって調べた。細胞
をＰＨＤセルハーベスター（Cambridge Technology, Inc., Watertown, MA）で
採集し、取り込まれた３Ｈを液体シンチレーションカウンター（Packard Instru
ment, Inc., Donner's Grove, IL)で計測した。
【００４５】 図２および３では、Ｙ軸の値は、レスポンダーの増殖の平均百分率±ＳＥであ
る。“２ｓ”は照射バッフィーコート細胞を示し、“２ｒ”は扁桃腺に由来する
Ｔリンパ球を示す。“２ｓ２ｒ”は未処置混合リンパ球サンプルを示し、これは
陽性コントロールである（点線で示されている）。抗ＣＤ１１ａ抗体（Pharming
en, 抗ヒトＣＤ１１ａ）による増殖抑制は、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１相互作用
の抑制についてのコントロールとして用いた。これらのポリペプチドはヒトＬＦ
Ａ−１β（ＣＤ１８）サブユニットに由来する。本実験でテストしたポリペプチ
ドの配列は表１に示されている。
る。“２ｓ”は照射バッフィーコート細胞を示し、“２ｒ”は扁桃腺に由来する
Ｔリンパ球を示す。“２ｓ２ｒ”は未処置混合リンパ球サンプルを示し、これは
陽性コントロールである（点線で示されている）。抗ＣＤ１１ａ抗体（Pharming
en, 抗ヒトＣＤ１１ａ）による増殖抑制は、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１相互作用
の抑制についてのコントロールとして用いた。これらのポリペプチドはヒトＬＦ
Ａ−１β（ＣＤ１８）サブユニットに由来する。本実験でテストしたポリペプチ
ドの配列は表１に示されている。
【００４６】 図２を参照して、ＭＬＲアッセイは、ＬＢＥポリペプチド（配列番号：１）、
ＬＢＥの環状フラグメント、すなわちｃＬＢＥＣ（配列番号：２）およびｃＬＢ
ＥＬ（配列番号：３）の存在下で実施した。各々単独のポリペプチドを５０、１
５０、２５０、３５０、５００および７５０μMでテストした。ＬＢＥの最高濃
度で、レスポンダーＴ細胞の増殖は３０％抑制された。他方、ＬＢＥの環状フラ
グメントはより有効であった。
ＬＢＥの環状フラグメント、すなわちｃＬＢＥＣ（配列番号：２）およびｃＬＢ
ＥＬ（配列番号：３）の存在下で実施した。各々単独のポリペプチドを５０、１
５０、２５０、３５０、５００および７５０μMでテストした。ＬＢＥの最高濃
度で、レスポンダーＴ細胞の増殖は３０％抑制された。他方、ＬＢＥの環状フラ
グメントはより有効であった。
【００４７】 図３に示すように、ＭＬＲをＤアミノ酸を用いて合成したＤ型ポリペプチド、
すなわちＤ−ＬＢＥＲ（配列番号：４）、Ｄ−ＬＢＥＣ（配列番号：５）および
Ｄ−ＬＢＥＬ（配列番号：６）の１２５、２５０、および５００μM存在下で実
施した。Ｄ型ＬＢＥＣ（Ｃ−ＬＢＥＣ、配列番号：４）はＴ細胞の増殖を抑制す
るというその生物学的機能を喪失した。予想したように、Ｄ−ＬＢＥＣ（配列番
号：５）は本実験で全く抑制作用を示さなかった。対照的に、ＬＢＥＬのＤ型ポ
リペプチド、すなわちＤ−ＬＢＥＬ（配列番号：６）は驚くべき抑制効果を示し
、これはＬＢＥまたはｃＬＢＥＬよりもはるかに有効であった。
すなわちＤ−ＬＢＥＲ（配列番号：４）、Ｄ−ＬＢＥＣ（配列番号：５）および
Ｄ−ＬＢＥＬ（配列番号：６）の１２５、２５０、および５００μM存在下で実
施した。Ｄ型ＬＢＥＣ（Ｃ−ＬＢＥＣ、配列番号：４）はＴ細胞の増殖を抑制す
るというその生物学的機能を喪失した。予想したように、Ｄ−ＬＢＥＣ（配列番
号：５）は本実験で全く抑制作用を示さなかった。対照的に、ＬＢＥＬのＤ型ポ
リペプチド、すなわちＤ−ＬＢＥＬ（配列番号：６）は驚くべき抑制効果を示し
、これはＬＢＥまたはｃＬＢＥＬよりもはるかに有効であった。
【００４８】 一般に、Ｄアミノ酸は、生物学的な条件下では天然のＬアミノ酸から成るポリ
ペプチドよりも安定で免疫原性も少ない。これらのデータは、Ｄ型ポリペプチド
（Ｄ−ＬＢＥＬ）はＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用の抑制で用いることがで
きる最良の候補ポリペプチドの１つであることを示唆している。さらにまた、本
ポリペプチドは、免疫寛容を成立させることによって望ましくないＩＣＡＭ−１
／ＬＦＡ−１相互作用によって惹起される疾患（自己免疫疾患、例えば慢性関節
リューマチ、多発性硬化症、アレルギー、移植器官の拒絶、および当業者の知る
他の疾患が含まれる）の治療に使用できる。
ペプチドよりも安定で免疫原性も少ない。これらのデータは、Ｄ型ポリペプチド
（Ｄ−ＬＢＥＬ）はＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用の抑制で用いることがで
きる最良の候補ポリペプチドの１つであることを示唆している。さらにまた、本
ポリペプチドは、免疫寛容を成立させることによって望ましくないＩＣＡＭ−１
／ＬＦＡ−１相互作用によって惹起される疾患（自己免疫疾患、例えば慢性関節
リューマチ、多発性硬化症、アレルギー、移植器官の拒絶、および当業者の知る
他の疾患が含まれる）の治療に使用できる。
【００４９】 本発明について多数の実施態様を記載してきたが、それにもかかわらず、本発
明の範囲を超えることなく種々の改変を実施することが可能なことは当業者には
理解されよう。したがって他の実施態様も以下の請求の範囲内に包含される。
明の範囲を超えることなく種々の改変を実施することが可能なことは当業者には
理解されよう。したがって他の実施態様も以下の請求の範囲内に包含される。
【配列表】
【図１】 ＬＦＡ−１（ＣＤ１８）のβ−サブユニットに由来するＬ型ポリペプチド（Ｌ
ＢＥ（配列番号：１）、ｃＬＢＥＣ（配列番号：２）、ｃＬＢＥＬ（配列番号：
３)）およびＤ型ポリペプチド（Ｄ−ＬＢＥＲ（配列番号４）、Ｄ−ＬＢＥＣ（
配列番号：５）およびＤ−ＬＢＥＬ（配列番号：６）を示す模式図である。
ＢＥ（配列番号：１）、ｃＬＢＥＣ（配列番号：２）、ｃＬＢＥＬ（配列番号：
３)）およびＤ型ポリペプチド（Ｄ−ＬＢＥＲ（配列番号４）、Ｄ−ＬＢＥＣ（
配列番号：５）およびＤ−ＬＢＥＬ（配列番号：６）を示す模式図である。
【図２】 混合リンパ球反応アッセイにおけるレスポンダー細胞の増殖を示す棒グラフで
、そのような増殖に対する抗ヒトＣＤ１１ａ抗体、本発明のＬＢＥ（配列番号：
１）、ｃＬＢＥＣ（配列番号：２）、ｃＬＢＥＬ（配列番号：３）の抑制効果を
示している。
、そのような増殖に対する抗ヒトＣＤ１１ａ抗体、本発明のＬＢＥ（配列番号：
１）、ｃＬＢＥＣ（配列番号：２）、ｃＬＢＥＬ（配列番号：３）の抑制効果を
示している。
【図３】 混合リンパ球反応アッセイにおけるレスポンダー細胞の増殖を示す棒グラフで
、そのような増殖に対する抗ヒトＣＤ１１ａ抗体、本発明のＤ−ＬＢＥＲ（配列
番号：４）、Ｄ−ＬＢＥＣ（配列番号：５）およびＤ−ＬＢＥＬ（配列番号：６
）の抑制効果を示している。
、そのような増殖に対する抗ヒトＣＤ１１ａ抗体、本発明のＤ−ＬＢＥＲ（配列
番号：４）、Ｄ−ＬＢＥＣ（配列番号：５）およびＤ−ＬＢＥＬ（配列番号：６
）の抑制効果を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ Ａ６１Ｐ 37/02 37/02 37/06 37/06 37/08 37/08 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 スティーヴン・ベネディクト アメリカ合衆国カンザス州66045．ローレ ンス．ホーワースホール7035．ユニヴァー シティ・オブ・カンザス．デパートメン ト・オブ・モレキュラー・バイオサイエン セズ (72)発明者 マーシア・チャン アメリカ合衆国カンザス州66045．ローレ ンス．ホーワースホール7035．ザ・ユニヴ ァーシティ・オブ・カンザス (72)発明者 テルーナ・シーアハーン アメリカ合衆国カンザス州66045．ローレ ンス．ホーワースホール7035．ザ・ユニヴ ァーシティ・オブ・カンザス (72)発明者 スコット・ティベッツ アメリカ合衆国カンザス州66045．ローレ ンス．ホーワースホール7035．ザ・ユニヴ ァーシティ・オブ・カンザス Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA01 BA09 BA17 BA23 CA59 DC50 NA14 ZA152 ZA162 ZA962 ZB072 ZB082 ZB132 ZB152 ZC352 4H045 AA10 AA20 AA30 BA01 BA15 EA22 FA33 FA44
Claims (12)
- 【請求項１】 少なくとも１つのＤ−アミノ酸を含むポリペプチドであって
、配列番号：６に示す配列を有するポリペプチド。 - 【請求項２】 アミノ酸の全てがＤ−アミノ酸である請求項１のポリペプチ
ド。 - 【請求項３】 ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１を含むサンプルを、少なくと
も１つのＤ−アミノ酸を含み、配列番号：６に示す配列を有するポリペプチドと
接触させることを含む、ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との相互作用を抑制する方法
。 - 【請求項４】 ポリペプチドが全てＤ−アミノ酸を有する請求項３の方法。
- 【請求項５】 抑制効果を示す量の、１つまたは２つ以上のＤ−アミノ酸を
含む配列を有し、配列番号：６に示す配列を有するポリペプチドと患者とを接触
させることを含むインテグリン関連疾患を抑制する方法。 - 【請求項６】 インテグリン関連疾患がアレルギー、自己免疫疾患および移
植片拒絶から成る群から選ばれる請求項５の方法。 - 【請求項７】 自己免疫疾患が慢性関節リューマチ、インスリン依存性糖尿
病および多発性硬化症から成る群から選ばれる請求項６の方法。 - 【請求項８】 患者が哺乳動物である請求項５の方法。
- 【請求項９】 哺乳動物がヒトである請求項８の方法。
- 【請求項１０】 接触がin vivoまたはex vivoで実施される請求項５の方法
。 - 【請求項１１】 ＬＦＡ−１結合部位に由来し、１つまたは２つ以上のＤ−
アミノ酸を含む配列を有し、さらに配列番号：６に示す配列を有するポリペプチ
ドを含む治療用組成物。 - 【請求項１２】 さらに医薬的に許容できる担体を含む請求項１１の治療用
組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13043299P | 1999-04-21 | 1999-04-21 | |
| US60/130,432 | 1999-04-21 | ||
| PCT/US2000/010720 WO2000062791A1 (en) | 1999-04-21 | 2000-04-20 | D-form polypeptide which induces immune tolerance and methods of use |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002542200A true JP2002542200A (ja) | 2002-12-10 |
Family
ID=22444665
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000611927A Pending JP2002542200A (ja) | 1999-04-21 | 2000-04-20 | 免疫寛容を誘発するｄ型ポリペプチドおよびその使用方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1194157A4 (ja) |
| JP (1) | JP2002542200A (ja) |
| CA (1) | CA2368839A1 (ja) |
| WO (1) | WO2000062791A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022513490A (ja) * | 2018-12-16 | 2022-02-08 | フィジーン、エルエルシー | 遺伝子編集線維芽細胞の治療的使用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1575991A4 (en) | 2002-07-03 | 2008-03-19 | Bio Science International Inc | AROMATIC PEPTIDES CONTAINING D-AMINO ACIDS AND METHOD OF ADMINISTRATION |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5192746A (en) | 1990-07-09 | 1993-03-09 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Cyclic cell adhesion modulation compounds |
| JPH06500555A (ja) | 1990-08-27 | 1994-01-20 | カイロン コーポレイション | 病気の処置のためのペプチドの薬物 |
| CA2188287A1 (en) * | 1994-04-19 | 1995-10-26 | Stephen Benedict | Icam-1/lfa-1 short-chain peptides and method of using same |
| US5821329A (en) | 1996-06-06 | 1998-10-13 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Cyclic peptide inhibitors of β1 and β2 integrin-mediated adhesion |
| CA2234723A1 (en) * | 1995-10-10 | 1997-04-17 | Gryphon Sciences | Generating d-peptides: methods and compositions |
| WO1997041149A1 (en) * | 1996-04-26 | 1997-11-06 | The University Of Kansas | Peptide compositions which induce immune tolerance and methods of use |
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2000
- 2000-04-20 CA CA002368839A patent/CA2368839A1/en not_active Abandoned
- 2000-04-20 WO PCT/US2000/010720 patent/WO2000062791A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-04-20 US US09/553,979 patent/US6599506B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-20 JP JP2000611927A patent/JP2002542200A/ja active Pending
- 2000-04-20 EP EP00926208A patent/EP1194157A4/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022513490A (ja) * | 2018-12-16 | 2022-02-08 | フィジーン、エルエルシー | 遺伝子編集線維芽細胞の治療的使用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6599506B1 (en) | 2003-07-29 |
| CA2368839A1 (en) | 2000-10-26 |
| EP1194157A4 (en) | 2002-08-14 |
| EP1194157A1 (en) | 2002-04-10 |
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