JPH06500555A - 病気の処置のためのペプチドの薬物 - Google Patents

病気の処置のためのペプチドの薬物

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JPH06500555A
JPH06500555A JP3515336A JP51533691A JPH06500555A JP H06500555 A JPH06500555 A JP H06500555A JP 3515336 A JP3515336 A JP 3515336A JP 51533691 A JP51533691 A JP 51533691A JP H06500555 A JPH06500555 A JP H06500555A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 病気の処置のためのペプチドの薬物 本発明は、生物学/生化学の分野でありそして、とくに抗炎症の予防剤または治 療剤として使用したとき、有用な薬物である、規定されたアミノ酸配列を有する ペプチドに関係する。
炎症性の応答の間、末梢血液の白血球は、好中球および単球から成り、内皮細胞 層に結合しそしてそれを通して移動し、そして化学走性因子に応答して基底膜を 横切り、そして感染した組織に入り、ここにおいて白血球は感染の有機体の抑制 または除去において有効である。宿主の防御系が感染に対して適切に応答すると き、炎症性の応答は、白血球が感染した区域のみに入り、結局健康な組織を損傷 しないように、緊密に抑制される。ある種の状態、とくにセプシスにおいて、白 血球の作用は緊密に抑制されず、結局酸素誘導された遊離基、ならびに好中球か らのプロテアーゼおよびホスホリパーゼの解放の結果として、広範な脈管の損傷 を引き起こし、こうして有意な細胞および組織の損傷を引き起こすことがある。
Harlan、 J、門9.1987、Act Med 5cand Su 1 ..715 : 123 ; Weiss、 S、、1989、シフ」奥1旦到 −ム且LユI工、逼世:365゜例えば、セプシス関連好中球仲介内皮の損傷は 、脈管の完全性の損失、血栓症、および組織の壊死に関係づけられてきた。
内皮細胞の好中球の損傷に導く初期の事象は、好中球の内皮細胞表面への付着で ある。有意な部分において、これは好中球を内皮細胞表面に結合させる好中球に 関連する細胞付着分子によ−り仲介される。好中球付着分子は、ICAM−1( 細胞間付着分子)と呼ぶ内皮細胞表面上の分子に結合する。今日まで、この反応 に関係すると同定された付着分子の部分的リストは、リンパ球関連抗原−1(L FA−1)、マクロファージ抗原−1(MAC−1”) 、また門0−1、OK M−1と呼ぶ、および相補的リポータ−3型、およびp、1so、95、また相 補的リポータ−4型(CR−4)およびLeuM−5である。これらの分子は集 合的にLFA−1族、白血球付着タンパク質、IeuCAM、および白血球イン テグリンと呼ばれてきている。すべての3つの分子はα−βヘテロダイマーであ る。βサブユニットは3つ分子において同一であるが、αサブユニットは異なる 。Kurzinger、に、およびSpringer、T、A、、1982、J 、of Biol、Chem、、257 : 1241 : 5anct+ez −Madrid、F、ら、1983、Lhl」1エ、158 : 1785 ;  Trowbrige、 1.S、およびOmary、、M。
B1.1981、髭値針困坦幻−278: 3039゜3つの白血球のインテグ リンは主として免疫細胞により発現される。例えば、LFA−1は事実上すべて の免疫細胞上に存在する。
Xurzinger、、に、およびSpringer、 T、A、、前掲、?l Ac−1は単球、マクロファージ、顆粒球、大きい顆粒状リンパ球、および未熟 のCD−5+BIII胞により発現される。De La Hera、 A、ら、 1988、Eur、J、ofIIlsunol、、18 : 1131. p1 50.95タンパク質はMAC−1と同一の細胞型の分布を共有するが、活性化 されたリンパ球、ならびにヘアリーセルの白血病によりさらに発現される。それ は後者の病気のマーカーである。Schwarting、 R,ら、1985、 Blood、65 : 974 ; Miller、 B。
A、ら、1985、J、of Is+s+unoL 134 : 3286゜研 究により、細胞の付着の事象において白血球のインテグリンが関係づけられた0 例えば、LFA−1は免疫細胞の抗原依存性および抗原独立性の相互作用に関係 する* Springer、 T、Ao、1987、AnnualReview  faun、5 : 223 ; Martz% E、、 1986、 Hum 、Ian+unolo 、1旦:3゜大部分のティリングはLFA−1に対して モノクローナル抗体を利用して研究され、モノクローナル抗体によるLFA−1 への結合が内皮細胞(Mentzer、 S、J、ら、1986、J、of C e11.Ph 5io1..126 : 285)、線維芽(Dustin、  N、L、ら、1986、J、of Imn+unol、137 : 245)  、表皮ケラチノサイト (Dustin、 N、L、ら、1986、J、of  Ce11.Ph 5io1..107 : 321)および肝細胞(Roos、  E、およびRoosien、、F、、1987、ムof S凪l且l旺、1m  : 553)へのTリンパ球の付着を部分的または完全に阻害することが明ら かにされた。
細胞の付着におけるMAC−1の役割は、最初に、またモノクローナル抗体を使 用して証明された。このような研究において、MMC−1はC3b1被覆された 赤血球に結合すること、そしてこのような結合はMAC−1に対するモノクロー ナル抗体により阻害されることが示された。Be1ler、 B、1.ら、19 82、J、of Ex 、Med、、156 : 1000゜さらに、MAC− 1はレイスマニア・プロマスチゴーテス(Leish+IlaniaProma stigetes)、大腸菌(E、coli)およびヒストプラズマ・カブスラ ツム()Iistoplasn+a Capsulatum) ヘのマクロファ ージの結合に関係することが示された。Mo5ser、 D、およびEdels on、 P、、 1985.ムof Immunol、、135 : 2785  ; Wright、 S、およびJong、、 M、、 1986. J。
32−二【−1−11に≧(二1≧−2.−11□キ至−5)ユ、164、:  18T6 ; Bullock、 W、および−rightA S、、1987 、 J、of E囚し1世よ、山: 195 、他の研究において、MMC−1は好 中球および単球の化学走性、ならびにガラスおよびプラスチ・7りの表面への付 着、および内皮および上皮の細胞の単層への付着に関係することが示された。
p159.95は、基質および内皮細胞への末梢血液の単球の付着、なte V elde、 A、ら、1987.7.61 : 261 、さらに、p150. 95に対して向けられたモノクローナル抗体を使用する研究は、それが接合体の 形成において細胞障害性Tリンパ球により利用されることを示した。
前述の研究、ならびに追加の研究は、白血球のインテグリンが免疫細胞の機能を 実施するための一般の付着タンパク質として機能することを示唆する。さらに、 前述の研究は3つのインテグリンのαまたはβサブユニットに対して向けられた モノクローナル抗体を使用した。大部分について、研究は普通のβサブユニット がこれらの分子の付着関係機能において主要な役割を演することを示した。最近 、ヒトLFA−1、MMC−1およびp150.95をエンコードするcflN Aクローンが単離された。 Kishimoto、 T、ら、1987、皿、4 8 : 681およびLaw、 S、に、L、ら、1987、EMBOJ、、6  : 15−919 。
前述したように、炎症は感染に対する有機体の防御の有意の部分であり、そして 脈管外の組織の損傷を引き起こすことがある。そのうえ、ある場合において、制 御されない炎症性の応答、例えば、敗血症のショックにおいて観察応答が存在し 、これは病気の病原性に寄与することがある。白血球は、少なくとも一部分、反 応性酸素の代謝物質、プロテアーゼおよびホスホリパーゼを疾患部位において解 放することによって急性虚血のショックに関連する損傷の原因であること、関係 づけられた。これは研究により支持され、これらの研究において、末梢血液のリ ンパ球を消耗した動物は心筋虚血および再潅流からの損傷の有意の減少を示す、 さらに、再潅流の損傷はMAC−1のモノクローナル抗体のinνivo投与に より最小とされる。
最後に、出血のショックおよび蘇生のウサギのモデルは、MMC−1のβサブユ ニットに対するモノクローナル抗体は肝臓および無胸骨of C11nical  Invest、、81 : 676、−緒にすると、これらの結果が示唆する ように、心筋梗塞、出血のショックを包含するある数の病気の状態、および虚血 および引き続く正常な循環血流の再確立を引き起こす事象から生ずる、組織およ び有機体の損傷の抑制において、3つの白血球のインテグリンを経る白血球の付 着をブロックする試薬は有意の治療的価値を有する。
最後に、ICAM−1、すなわち、インテグリン結合のための内皮細胞のレセプ ターは、また、ライノウィルスの結合のためのレセプターであることは注目に値 する。5tauntonSD、ら、1990、釦旦、旦:243、ライノウィル スはピコルナウィルスの1メンバーであり、そして普通の風邪の約50%のの原 因となる。5perber、 S、およびHay−dern、F、(1988)  Antimicorb、Agents Chesother、32、vol、 409 、p。
32、普通の風邪を防止する予防のアプローチは、細胞結合したICAM−1へ のライノウィルスの結合を妨害することである。事実、ICA?1−1の可溶性 の形態は有効であることが最近報告された。 Marlin、S、D、ら、19 90、Nature、 344 : 70゜1つの面において、ここにおいて表 す発明は、細胞またはヴイリオンのための適当な膜のレセプター(例えば、IC AM)を表現する細胞または組織への細胞またはヴイリオンの望ましくないを妨 害し、こうして細胞またはヴイリオンの結合から生ずる病気を防止または最小に するペプチドを記載する。
本発明の第2の面は、白血球またはヴイリオンの組織への望ましくない結合を防 止し、ならびに組織への白血球の化学誘引性を妨害し、これにより白血球または ヴイリオンの結合から生ずる&[1織に対する病気を防止または最小することに 対して、インテグリンと競争する、白血球のインテグリンのβサブユニット、C D18、の特定の領域に対する配列の相同性を有するペプチドを記載する。
本発明の第3の面は、白血球の化学走性に影響を与えないで、白血球の付着を阻 害または防止し、こうして白血球の組織への望ましくない結合を防止し、結局白 血球の結合から生ずる組織への病気を防止または最小にするペプチドの記載であ る。
本発明の第4の面は、白血球またはヴイリオンの細胞の付着および/または白血 球の化学走性を妨害するペプチドで、種々の病気に悩まされる患者を予防的また は治療的に処置する方法の記載である。
本発明の第5の面は、白血球の付着および/または化学走性を妨害するペプチド で、種々の病気、とくにライノウィルスの感染により引き起こされる病気、に悩 まされる患者を予防的または治療的に処置する方法の記載である。
本発明の第6の面は、(:D18ペプチドに対する抗体、および抗体の予防的お よび治療的適用の記載である。
本発明のなお他の面は、白血球の細胞の付着性質を阻害するペプチドの記載であ り、ここで前記ペプチドは容易には加水分解せず、こうして延長したtn vi voの循環時間を示す。
本発明のこれらおよび他の面は、下に記載する本発明を完全に考察すると明らか であろう。
第1図は、白血球のインテグリンのβサブユニットのCD18のアミノ酸配列を 示す。下線の領域は、合成しそして白血球/内皮細胞の付着アッセイにおいて活 性について試験したペプチドに相当する。
また、ある領域内のより小さいペプチドを合成し、そして活性について試験した 。各ペプチドは図面の中で数、すなわち、1〜6により表示し、そして第2の数 はペプチドの中のアミノ酸の数を意味する。こうして、1−26は26アミノ酸 をもつ領域lがらのペプチドを意味する。領域1はわずかに26アミノ酸から成 り、1−26は全体の領域にわたるペプチドを意味する。しかしながら、1−1 5は15アミノ酸から成る領域1からのペプチドを意味する。ペプチドはこの分 子のカルボキシルからアミノ末端まで番号を付されている。
表1は、内皮細胞への多形性核の白血球の付着を阻害する能力について試験した 、種々のCD18ペプチドのアミノ酸配列を示す。
表2は、10−4〜10−”Mの濃度範囲にわたる多形性核の白血球の付着への いくつかのCD18ペプチドの阻害作用を示す。4−49は10−’Mにおいて 最もを効であることが明らかである。
表3は、異なるヒトのドナーからの多形性核の白血球を使用し、そしてペプチド が種々の条件下に貯蔵した後、1o−4〜10−”Mの濃度範囲にわたる多形性 核の白血球の付着へのペプチド4−29の作用を示す。
表4は、10−4〜10− ’ Mの濃度範囲にわたる、異なるドナーからの多 形性核の白血球を使用する、多形性核の白血球の付着へのペプチド4−15の作 用を示す。
表5は、CD18ペプチド、■−26,2−24,3−29,4−29,5−2 4および6−25の化学走性阻害活性を示す。
表6は、C[118ペプチド、4−29の化学定性阻害活性を示す。
ここに記載する本発明は従来発表された研究を利用する。1例として、このよう な研究は科学論文、特許または継続中の特許出願がら成る。前および下に引用す る、これらの刊行物および出願のすべてをここに引用によって加える。
本発明はいくつかの独特の方法および組成から構成される。本発明の各面はここ で別々に説明する。
種々の病気、好ましくは白血球またはライノウィルスの面倒な付着から生ずる病 気の処置のために有用な薬物である、細胞−細胞また細胞−ヴイリオンの付着を 防止または妨害するペプチドが発見された。これらのペプチドは白血球のインテ グリン、CD18、のベータサブユニットの領域に対して相同性のアミノ酸配列 を有する。
次の5アミノ酸を組み込んだペプチドは好ましい:NH2−Trp−Arg−A sn−Val−Thr−Arg−C008次の配列を有する大きいペプチドの中 に組み込んだ上のペプチドは、より好ましい: 次の配列を有する大きいペプチドの中に組み込んだ上のペプチドは、より好まし い: NH2−De−G「y−Trp−Arg−^1n−VaJ−’r’hr−Arg −Lcu−Leu、Val−Phe−Alx−Thr−As吹|COOH 第1図は白血球のインテグリン、CD18、のベータサブユニットのアミノ酸配 列を示し、そして白血球またはヴイリオンの付着を妨害するペプチドに下線が引 かれている。詳しくは、ペプチドを競争する能力および活性化された内皮細胞へ の白血球の付着を防止する能力について試験した。さらに、白血球の化学走性を 阻害するこれらのペプチドの能力を決定した。
前述のペプチドは、この分野においてよく知られている技術、例えば、 5ci ence、 232 : 341−347 (1985)に記載されているメリ フィルド(Merrifield)の固相法により作ることができる。この手順 は商業的に入手可能な合成装置、例えば、バイオサーチ(Biosearch) 9500自動化ペプチド装置を使用することができ、ブロックしたアミノ酸の切 断はフン化水素を使用して達成し、そしてペプチドを調製用HPLCにより、ウ ォーターズ・デ/lzり・ブレブ(Waters Delta Prep)30 00計器を使用して、15〜20μmのバイダック(Vydac) C4プレブ パク(PrepPAK)で精製する。
当業者は理解するように、好ましいCD18ペプチドの正確な化学的構造をここ において示すが、その構造に対する特定の変更はある数の因子に依存して望まし いことがある。例えば、患者への投与の便利であるように、ペプチドは酸性また は塩基性の塩として、あるいは中性の形態で配合することができる。さらに、タ ンパク質の一次アミノ酸配列は、糖部分を使用する誘導化(グリコジル化)によ るか、あるいは他の補助的分子、例えば、脂質、ホスフェート、アセチル基など により、ならびにす7カリド、ポリエチレングリコール(PEG)およびポリオ キシエチレングリコール(POG) との接合により増大することができる。こ のような修飾は、上に定義した、ペプチドの活性が破壊されないかぎり、ここに おけるペプチドの定義の中に含められる。もちろん、このような修飾は、種々の アッセイにおいてタンパク質の活性を増強または減少することによって、活性に 定量的または定性的にに影響を与えることが期待される。さらに、とくに当業者 は理解するよう乙こ、in viν0の滞留時間が増加したペプチドの薬物は特 定の応用において有利であることがある。ペプチドのin vivo滞留時間は この分野において知られている方法を使用して増加することができ、そして2つ の例示的方法は実質的に非加水分解性ペプチド結合を有するペプチドを合成する か、あるいは生物適合性ポリマーに結合するか、あるいはポリマーと会合するペ プチドを合成することを包含する。ポリマーの例は、[l1brich、 K、 ら、1986、ハ材9関LCh eaa、、187 : 1131 ;およびR ihova、 B、ら、1986、J−、ogc扛限山」二頭I、工浅:221 、に記載されている。
当業者は理解するように、ここに記載するペプチドはヒトを包含する動物に、単 独でまたは他の抗炎症剤と組み合わせて投与することができるか、あるいは種々 の医薬として許容される希釈剤または担体と組み合わせることができる。このよ うなものは当業者によく知られており、そして標準の製剤学的実施に従い配合さ れる。
希釈剤の例は、生理的食塩水、または緩衝化生理的食塩水、ならびにリンゲル溶 液およびデキストロース注射液、およびデキストロース生理的食塩水および乳酸 リンゲル注射液、あるいは追加の治療剤、好ましい炎症性の状態の処置において 有効であることが知られている抗生物質または抗体を包含する。
白血球の付着はこの分野において知られているいくつかのアッセイを使用して測 定することができ、そして好ましいアッセイはChar。
ら、1985、坦土樽、65 : 473に記載されている。簡単に述べると、 このアッセイは白血球を適当な標識で標識し、白血球を内皮細胞とインキュベー ションし、そして付着する白血球の数を決定することから成る。好ましくは、細 胞はガンマ線を放射するアイソトープで標識し、そして好ましい標識はI11イ ンジウム酸化物または51クロムである。
白血球をヒトのドナーから標準の技術を使用してすることができる。一般に、こ れは適当な抗凝固剤を含有する生理学的に平衡化した塩溶液の中に血液を分離し 、そして適当な分離工程により、好ましくはフィコール−ハイバーク (F i co ] l −Hypaque)勾配で分離することから成る。汚染する赤血 球は低張溶解により除去することができる。生ずる白血球を生理学的に緩衝化し た溶液、pH7,4の中に懸濁する。好ましい生理学的に緩衝化した溶液は、カ ルシウムおよびマグネシウムを含有しないバンクの平衡化塩溶液である。
次いで、単離した白血球を、適当な時間、一般に15分間、所望の放射性同位元 素と前以て決定した濃度においてインキュベーションすることによって、標識す る。放射線標識した細胞を洗浄して、組み込まれなかった標識を除去し、次いで 適当な溶液の中に懸濁して下に記載する付着アッセイを実施する。
内皮細胞は、ある数の源から、この分野において知られているいくつかの技術に より調製することができる。好ましくは、内皮細胞はヒトの鯛の静脈から、Ch aroら、前掲、の手順を使用して得られる。一般に、内皮細胞は積の静脈の酵 素的消化により、好ましくは、Jaffe、 E、A、ら、1973、J、of  Cl1n、Invest、、52 : 2745に記載されているようにコラ ゲナーゼを使用して単離する。細胞を適当な組織培養下層、好ましくはゼラチン 被覆した表面上で増殖する。
内皮細胞は種々の組織培地の中で増殖させることができ、このような培地は適当 な補助物質、例えば、適当な濃度の胎児仔ウシ血清、および当業者が日常的に利 用している内皮細胞のために好適であると認識されている他の補助物質/添加剤 を含有する。内皮細胞は適当なプロテアーゼ、および必要に応じて金属イオンの キレート剤の希溶液の中で継代培養することができる。好ましくは、0.05〜 0.25%のトリプシンおよび0.02%のEDTAを含有する溶液を使用する 。細胞が事実内皮細胞であることを確寞にするために、細胞を免疫蛍光により因 子III抗原、すなわち、既知の内皮細胞のマーカーについて試験する。
内皮細胞への白血球の付着は次のようにして決定することができる。一般に第5 継代培養を越えた、早期の継代培養の内皮細胞を、適当な支持体上でかつ適当な 細胞培地の中で培養する。培養の支持体は、好ましくは、内皮細胞の付着をい増 強する適当な物質で前以て被覆する。いくつかのこのような物質、例えば、フィ ブロネクチン、ポリーL−リジン、ゼラチンおよびラミンが知られている。フィ ブロネクチンは好ましい。適当な培養支持体は96ウエルのマイクロタイタープ レートであり、そして適当な培地は胎児仔ウシ血清および当業者によく知られて いる、内皮細胞の増殖および維持のために有益であることが知られている他の補 助物質を含有する培地199である。前以て決定した数の標識した白血球の添加 前に、減少した量の、好ましくは1%の胎児仔ウシ血清を含有する生理学的に平 衡化した塩溶液で内皮細胞の単層を洗浄する。好ましい溶液は1%の胎児仔ウシ 血清を補充したRPMIである。
添加した白血球を含有する内皮細胞の単層を白血球の最大の付着を許すために十 分な時間インキュベーションし、そして好ましくはこれは37°Cにおいて適当 な細胞培養雰囲気中で30分間実施する。一般に、これは細胞を5%CO2,9 5%空気および95%湿度の中でアッセイの期間の間増殖およびインキュベーシ ョンすることから成る。
次に、付着しない白血球をある数のこの分野において知られている技術により除 去し、そして内皮細胞の単層に関連する放射性同位元素の量を測定することによ って、内皮細胞の単層に付着する白血球の数を決定する。基礎的結合、すなわち 、TNFで活性化しない内皮細胞への結合を考慮して、対照を実施する。
4回の反復実験で実施した典型的な実験において、アッセイは高度に信頼性があ り、平均値の10%より低い、通常5%より低い標準偏差を与える。典型的には 、結果は、付着しない細胞を除去した後、付着したままでいる内皮細胞に添加し た白血球の百分率として表す。
上のアッセイを使用して、典型的には試験すべきペプチドをある範囲の濃度、好 ましくは10−’M −10’Mにわたって添加する。ペプチドを前述したよう に合成し、凍結乾燥し、そして15〜25μmのジメチルスルホキシド中に溶解 する0次いで、この体積を適当な培地、例えば、1%の胎児仔ウシ血清を含有す る!?PM Iの中で適当に希釈して、試験すべき所望の最終濃度にする。
内皮細胞を、白血球の添加前に、1%の胎児仔ウシ血清を有するRPMI中で2  XIO’ 07mgの比活性をもつTNFの125U/mgで少なくとも4時 間活性化する。TNFは、白血球のインテグリンの結合のためのレセプターであ る内皮細胞表面上で、ICAMの発現の誘発を引き起こす。
ペプチドノ化学走性阻害性質を確証する物質および方法は、一般に、この分野に おいて知られており、そして好ましい手順はCapsoniら、1989、J、 of Ismunol、Meth、、120 : 125に記載されている。一 般に、化学走性は、白血球および化学走性物質を適当な培地の中の膜の両側に配 置することによって決定する。化学走性のアッセイの実施に好ましい装置は、コ スタ−・コーポレーション(Costar Corpo−ration) (マ サチュセンツ州ケンブリッジ)により製造されており、そしてトランス−ウェル 培養装置と呼ばれる。白血球が制限されない物質のアクセスをもたないように、 膜の大きさを選択する;むしろ、化学走性の応答が引き出される場合、白血球は フィルターに付着し、その中にかつそれを通して移動する。ある物質を阻害活性 について試験している場合、これはそれを白血球または化学走性物質と組み合わ せることによって達成することができる。
Capsoniら、前掲、の手順を次の変更を加えて使用した。白血球は、上の 付着のアッセイについて記載したように、単離しそして+1インジウムで標識す ることができる。細胞を標識後適当な細胞培地の中に約5X10’細胞/+ml で再懸濁させる。次に、所望量の細胞懸濁液を前取て決定した量の阻害活性につ いて試験すべき1または2以上のペプチドと混合し、そしてこの混合物を適当な 装置に添加する。3μmの孔の膜を24トランス−ウェル組織培養プレートの中 に配置する。細胞/阻害性ペプチド混合物を37°Cにおいて短時間の間インキ ュベーションして細胞を膜表面に対して順応させ、そして膜表面に細胞が沈降す るために十分な時間を与える。次に、細胞培地を含有するウェルの中にインサー トをセントする。この培地はチモサン活性化ヒト血清を約0.5%で含有する。
チモサンの活性化は、膜の孔を通して白血球を誘引する、補体誘導の化学走性因 子を発生する。この培地は、また、細胞培養ウェルへの添加前に、適当な時間の 間予備加温する。37゛Cにおいて30分間インキュヘーションした後、CD1 8ペプチドの存在下に膜フィルターを通して移動した白血球の数は、培地の中に 存在する1目インジウムの量を計数することによって容易に決定される。これは 、計数のためにアリコートを取り出す前に、適当な洗浄剤を適当な濃度でウェル の中の培地に添加することによって促進することができる。このようにして、試 験しているペプチドの阻害活性を決定することができる。
ライノウィルスの結合へのCD18ペプチドの作用は、Abraham、 G。
およびCo1onno、R,J、 (1984) J、Virology、51 、p、340記載され、Marlin、 S、D、ら(1990) Natur e、 vol、344 、p、70に記載されている変更を加えた、既知の方法 および材料を使用して決定することができる。簡単に述べると、この手順は、こ の分野において知られている方法により、適当な放射性同位元素を含有する培地 の中でウィルスで感染した細胞を増殖させ、そして培地からウィルスを単離する ことによって、ライノウィルスを放射線標識することから成る。ポリエチレング リコールを使用してヴイリオンを培地から沈澱させ、次いで30%のスクロース の段階的勾配でヴイリオンをベレット化することはとくに有効である。
放射線標識したヴイリオンは、細胞付着アッセイにおいて、ICAM−1を発現 する細胞を使用して、用いるすることができる。好ましい細胞は、前述したよう に調製した内皮細胞であるか、あるいは上のAbraham、、G、およびCo 1onno、、Rj、が記載するHeLa細胞である。
このアッセイは、内皮細胞への好中球の付着の培地について本質的に記載したよ うに、アッセイ混合物に適当なCD18ペプチドを添加して実施することができ る。 ICAM−1に結合しそしてヴイリオンの結合を防止するペプチドは、ペ プチドの存在下に細胞の単層に結合するヴイリオンの数を計数することによって 容易に同定されることは、確証されるであろう。
抗体、ポリクローナルまたはモノクローナルまたは組み換え体(後者は好ましく はヒト化されている)を阻害性ペプチドに対して発生させることができる。この ような抗体は白血球上に存在するCD18ペプチドへの結合のために使用され、 こうして内皮への白血球の付着を妨害または防止するであろう。
モノクローナル抗体は、Kohler、 G、およびMilstein、、C, 1975、Nature、γ56:495(これはこの分野において知られてい るように数年にわたって変更されている)に記載されている一般手順を使用して 、生成することができる。この初期研究は、ネズミリンパ球および薬物選択可能 なプラズマ細胞腫を融合してハイブリドーマ生成することを包含した。引き続い て、この技術はヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞系の生産に 適用された。後者の手順は、一般に、Abrams、 P、 1986、Met hod互」旦u!剥ユ、121 : 107に記載されているが、他の変更はこ の分野において知られている。
ネズミまたはヒトの抗体を生産するかどうかに無関係に、抗体を分泌する細胞を 融合相手と組み合わせ、そして細胞を電気融合によるか、あるいは適当な融合剤 、好ましいポリエチレングリコール、より好ましくはポリエチレングリコール1 000を使用して融合する。
後者を抗体分泌細胞および融合相手を含有する細胞ベレットに、おだやかに撹拌 しながら、短時間にわたって少量ずつ添加する。融合剤の添加後、細胞混合物を 洗浄して融合剤および細胞の破片を除去し、そして融合した細胞および融合しな い細胞から成る細胞混合物を選択的増殖培地を含有する適当な細胞培養チャンバ ーの中に接種する。1〜3週の期間後、細胞は明らかなり、そして抗体の生産に ついて同定し、そしてサブクローニングして安定なモノクローナル細胞系の入手 可能性を確実にする。
好ましい抗体はヒトモノクローナル抗体であり、これはペプチドでinνivo またはin vitro感作したリンパ球から、抗体生産性ハイブリッド細胞系 を永久分裂能化し、これにより所望の抗体の入手可能な永久的源をつくることに よって生産することができる。in viv。
の永久分裂能化の技術はこの分野においてよく知られているが、1nvitro 技術は一般にLubenSR,および門ohler、 M、、1980.旧cr obiolImmuno1..17 : 635 、Reading、 C,、 Methods in Enz +l0I0 、121(第1部):18、また はVoss、 B、 1986、顆旦ods in Enz 5olo■、12 1 : 27に記載されている。ある数のin vitro免疫化系は、ヒトB 細胞の感作のために有効であることが示された。Reading、 C,198 2、J、of Tmmunol、Methods、 53 : 261゜感作さ れたリンパ球はウィルスの感染により永久分裂能化することができる。ヒトリン パ球のために好ましいウィルスの形質転換技術は、エプスタイン−バー−ウィル スの使用を包含する。このウィルスはヒトB細胞を形質転換することができ、そ してヒトモノクローナル抗体の発生に使用されてきている。Crawford、  D、ら、1983、J、Gen、Virol、、64:697;にozbor 、 V、およびRoder、 J、 1983 、J。
釦シ几山鉄粒、↓ニア2゜ 感作されたリンパ球を永久分裂能化する他の手順は、上の2つの技術の組み合わ せ、すなわち、ウィルスの形質転換および細胞の融合から成る。好ましい組み合 わせは、抗体分泌性細胞をエプスタイン−バー−ウィルスで形質転換し、引き続 いて形質転換された細胞を適当な融合相手に融合することから成る。融合相手は マウス骨髄腫細胞系、ヘテロ骨髄腫系、またはヒト骨髄腫系、または他の永久分 裂能化された細胞系であることができる。PCT特許出Ill No、8110 0957 ; Schlomら、1980、PNAS USA、 77 : 6 841 ; Croceら、1980、Narture、 288 : 488 ゜好ましい融合相手は、マウス−ヒトヘテロ−ハイブリッドであり、より好まし くはF3B6と表示する細胞系である。
この細胞系はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(America n Type Cu1ture Co1ection)に受け入れ番号11B8 785で受託された。それは1985年4月18日に受託された。 F3B6を 発生する手順は欧州特許出願公開第174,204号に記載されている。エプス タイン−バー−ウィルスの形質転換の使用および永久分裂能の抗体生産性細胞系 の生産に通用可能な技術は、Roder、 J、ら、1986、Methods in Enz 5olo旺、121 : 104に表されている。基本的には、 この手順はエプスタイン−バー−ウィルスを適当な源、一般に感染した細胞系か ら単離し、そして標的の抗体生産性細胞をウィルスを含有する上澄み液に実験す る。細胞を洗浄し、そして適当な細胞培地の中で培養する。引き続いて、細胞培 地の中に存在するウィルス的に形質転換された細胞をエプスタイン−パー−ウィ ルス核の抗原の存在により同定し、そして形質転換された抗体生産性細胞は標準 のこの分野において知られている方法により同定することができる。
ペプチドに対する抗体は、この分野において知られているように、適当なキャリ ヤーの分子への標準のカップリング手順により生産される。好ましい手順および 組成物は、MeCorwickらに1988年8月9日に発行された米国特許第 4,762,706号に記載されている。例えば、抗体は宿主動物、例えば、ウ サギ、ラット、ヤギ、マウスなどにペプチドまたはペプチド断片で注射すること によって生産される。注射前に、ペプチドをまず適当なキャリヤー分子、好まし くはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)またはウシ血清アルブミン( BSA)に接合する。接合は好ましくはペプチド上のシスティン残基の中のスル フヒドリル基を介して達成される。ペプチドがシスティン残基を欠如する場合、 それは既知の方法を使用して付加することができる。
ヘテロ へテロ2官能性架橋試薬を使用して、キャリヤータンパク質および所望 のペプチドをカップリングすることができる。好ましいカップリング剤は1−ヒ ドロキシ−2−ニトロ−ベンゼン−4−スルホン酸ナトリウム塩のN−マレイミ ド−6−アミノカプロイルエステルであり、そしてその調製および使用はこの分 野において知られており、そして米国特許第4.762.706号に記載されて いる。
出願人が発明であると信じるものを記載してきたが、以下の実施例を本発明の例 示ために提供し、そしてこれらの実施例は本発明の範囲を限定すると解釈すべき ではない0例えば、源、型、または抗体を生産する方法の変化;異なる標識およ び/またはシグナル;異なる材料および立体配置の試験支持体;異なる免疫化法 を本発明の範囲から逸脱しないで使用することができる。
表1に示すペプチドを合成し、そしてヒト内皮細胞の単層への多形核の白血球の 付着を妨害するか、あるいはブロックする能力について試験した。これらのペプ チドは第1図に示すCD1Bの構造において下線が引かれているものに相当する 。ある領域内のより小さいペプチドを、また、合成しそして活性について試験し た。
各ペプチドは図面の中で数、すなわち、1〜6で示し、そして第2の数はそのペ プチドの中のアミノ酸の数を意味する。こうして、1−26は26アミノ酸をも つ領域1がらのペプチドを意味する。領域1は26アミノ酸のみから成るので、 1−26は全体の領域にまたがるペプチドを意味する。しかしながら、1−15 は15アミノ酸から成る領域1からのペプチドを意味する。ペプチドはその分子 のカルボキシ末端からアミノ末端へ向かった番号が付されている。
ペプチドはMerrifieldの固相法を使用して合成した。Merrif  1eld、R,B、、1963、J、of Am、Chem、Soc、、75  : 48−79 、バイオサーチ(Bio−search) 9500自動化ペ プチド装置をT−Bocアミン保護とともに使用した。切断をフッ化水素を使用 して実施し、そして生ずるペプチドを調製用高性能液体クロマトグラフィーによ りウォーターズ・デルタブレブ(Waters Deltaprep) 300 0をブレバク (PrePak) CI8カラムとともに使用して水性アセトニ トリル−トリフルオロ酢酸(TFA)移動相を用いて精製した。
l工 ペプチドを凍結乾燥しそして4°Cにおいて乾燥貯蔵した。ペプチドを活性につ いて試験するとき、それを秤量してエッペンドルフ(Eppendorf)管の 中に入れ、そして約15〜25μmのジメチルスルホキシド中に溶解し、次いで 1%の胎児仔ウシ血清を含有するRPMIから成るアッセイ培地で250μIに 希釈して、4X10−’Mの使用源溶液を得た。必要に応じて、これらの源溶液 のアリコートを取り、そして−70℃において貯蔵した。アッセイを実施する前 に、4X10−’Mの源溶液をアッセイにおいて管の中で104.10−5.1 0−6.10 ’および101Mの最終濃度に希釈した。
内皮細胞をヒト肺帯から温和なコラゲナーゼ消化により単離した。
コラゲナーゼはワーシント・コーポレーシヨン(Worthington Co rpo−ration) にュージャージイ州フリーホール)から入手し、そし て一般手順はJaffe、 E、A、ら、1973、J、of Cl1n、In vest、、52 : 2745に記載されている。コラゲナーゼ消化から得ら れた細胞をゼラチン被覆したフラスコ上で25一台のヘペスで緩衝化した培地1 99 (Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド)から成る細胞培地の 中で増殖させた。この培地に20%の胎児仔ウシ血清を補充した。また、この培 地は60μg/mlのナトリウムヘパリン(Sigma Corpora−ti on、ミ゛シリー州セントルイス)、2mMの1、−グルタミンおよび50μg /mlのウシ視床下部抽出物を含有した。ウシ組織はベル・フリーズ(PalF reeze) (アラスカ州ロウガース)から入手した)、視床下部抽出物は内 皮細胞の増殖因子として働く。細胞培地のpHは7.4であった。
内皮細胞がコンフルエンシーの到達した後、それらを0.02%のEDTAを含 有する0、25%のトリプシンの中で継代培養し、引き続いて同一溶液を使用し て二次培養した。細胞をバンクの平衡化塩溶液の中のこの混合物に室温において 約1分間暴露した。
最後に、はぼ2XIO’細胞/ウエルをマイクロタイタープレートの中に接種し た。細胞の内皮細胞の性質を、コンフルエンシーにおいて丸石の形態、およびそ れらが間接的免疫蛍光で因子VIII抗原について陽性に染色されるという事実 の両者によって確証した。後者の手順はこの分野においてよく知られており、そ してJaffe E、^9.1973、J、Cl1n−1nvest、、Sz:  2745に記載されている。
内皮細胞の単層は6、第5回の継代培養の前に、20%の胎児仔ウシ血清、25 +sMのヘペス、pH7,4、および前述の他の補助物質を含有する培地199 の中で、ポリスチレンの96ウエルの平坦を底のマイクロタイタープレート ( Cornig Corporation)上で確立した。マイクロタイタープレ ートの表面を6.4ng/醜lのヒト血漿フィブロネクチンと25℃においてに おいて30分間インキュベーションした後、内皮細胞をプレートした。
内皮細胞の培養物がコンフルエントであるとき、それらの培養物を使用した。内 皮単層をRP)’II+1%の胎児仔ウシ血清で洗浄し、そして125U/ml のTNFで活性化し、次いで標識した多形核の白血球と5X10’細胞/ウエル の最終濃度でインキュベーションした。細胞を30分間内皮細胞の単層上に沈澱 させた。
ヒト多形核の白血球は、廃人からの大人のボランティアから、抗i1固剤(10 %のヘパリン)を使用し、次いでフィコール−ハイバーク(Ficoll−Hy paque)勾配で血液を遠心分離することによって得た。
汚染する赤血球を低張溶解により除去した。残留する細胞集団は95〜98%の 多形核の白血球から成り、そしてこれらの細胞をバンクの平衡化塩溶液p[+7 .4の中に5oxio″細胞/ 閣1の濃度で懸濁させた。
多形核の白血球を■1インジウム酸化物(100u Ci/ 10”PMN)  (10aiCi/v++1 、 (Amersha* Corporation )で標識した。標識っけは室温においてバンク溶液中で15分間実施し、次いで 標識された細胞を5分間の遠心により単離し、そして残留する組み込まれなかっ た標識を除去するために、バンクの平衡化塩溶液で2回洗浄し、次いで1%の胎 児仔ウシ血清を補充したRPM+の中に懸濁させた。
前述したように、5X10’/ウエルの標識したPl’IN細胞を96ウエルの マイクロタイタープレートの中に添加した。インキュベーションを37℃におい て、11織培養インキユベーターの中で5%CO,,95%空気の雰囲気中で実 施した。
30分間インキユベーシッンした後、その間に多形核の白血球は内皮細胞の単層 に付着し、マイクロタイタープレートを充填しそして付着性の透明なプラスチッ ク(Dynatech、 Inc、、バージニア州アレキサンダー)で密閉し、 倒立させ、そして、ベックマン・インスッルメンツ・コーポレーシヨン(Bec kman In5true+ents Corp、)がら入手した、マイクロプ レートのキャリヤーを使用して遠心した。遠心分離は75×gで室温において5 分間実施した。これは非付着物を効果的に除去した。、次にプレートをブロッテ ィングして乾燥し、そして内皮細胞の単層に付着したままである多形核の白血球 の数をガンマカウンターを使用して決定した。結果を表2に示し、そしてそれら は内皮細胞の単層に付着したままである多形核の白血球の百分率として表されて いる。
表2に示すデータはいくつかの面において示唆的である。第1に、最も活性なペ プチドは4−29である。すなわち、第4のペプチドは29アミノ酸を有するC D18から誘導された。このペプチドはPMN付着付着アンシイいて有意の阻害 活性を示す、この分子は10−5〜10−bMの範囲のピーク活性を示す、第2 に、第4のペプチドの14アミノ酸のペプチドはほとんど活性を示さない、29 7−についての活性の範囲は試験した濃度にわたって変化する。
紅 TNF゛ へのPMN・ に・ る CD18ペプチドの の ・ 平均の変化% ペプチド 10−’M 10−’M 10−’M 、10−’M 10−’M有 意の数のペプチドは10−’Mにおいて活性を示したが、これより低い濃度にお いて活性をほとんどまたは全くを示さず、そしてこれらのペプチドのいずれも1 0−5〜10 ”Mの範囲にわたって4−29はど活性ではなかった。 CD1 8の第1ペプチドの26アミノ酸のペプチド1−26)は、10−4〜10−’ Mの範囲において明らかなピークをもつ阻害活性を示す、同様に、CD18の第 2 tiI域の24アミノ酸のペプチド(2−24)、および3−29は10− ’Mにおいて活性を示す、阻害活性をほとんど示さなかったペプチドはこの分子 の第5および第6の領域から誘導され、そして、それぞれ、14または24、あ るいは16または25アミノ酸を含有する。
最後に、JUN−におよび−Tペプチドは10−’Mの濃度範囲において多形核 の白血球の付着を阻害するた、ペプチド2Xは10〜4〜10− ” Mの濃度 範囲にわたって活性を有することが観察された。これらのペプチドを含有するタ ンパク質はこの分野において知られているが、あるいはAngel、 P、ら、 1988、Nature、 332 : 166に記載されている。
異なる個体からの多形核の白血球が付着アッセイにおいてペプチドの有効性にど んな作用を有するかを決定することを意図して、ペプチド4−29を使用して研 究を実施した。また、種々の貯蔵条件に対するペプチドの安定性を決定した。結 果を表IIIに示す。
ドナー100および272から単離された多形核の白血球を使用して実験におい て、ペプチドの凍結および融解がその活性に有意に影響を与えないことが示され た。そのうえ、多形核の白血球を単離したドナーに依存するペプチドの活性の有 意の変動が存在する。最後に、表IIIがまた示すように、ペプチドの活性は4 ℃において異なる時間の間貯蔵後維持される。
l主 TNF・ へのP阿Nの・ の・ の 只CD18ペプチド#−29のm−の  ・ ・水内皮細胞をIL−1で活性化した。
この領域内のより短いペプチドが活性をもつかどうかを決定することを意図して 、4−29を使用して追加の研究を実施した。4−14haはとんど活性をもた ないことが示されたので、4−15を試験し、そして結果を表4に示す。明らか なように、4−15は活性であり、活性のピークは10−4〜10−’Mの範囲 にある。アッセイにおける変動性はPMNを単離したドナーの関数として観察さ れた。
l土 封1ヱIUηに ドナー 10−’M 10−’M 10−’M平均 −58±7 −41±8  −17±2ドナー 10−’M 10−’M 10−’M平均 −24±10  −5±3 −6±2スJul工 / の0血 の へのCD18ペプチドの多形核の白血球の化学走性の応答への CD18ペプチドの阻害活性を試験するために使用した材料および方法の多くは 、実施例1に記載する付着アッセイを実施するために使用したものに類似するか 、あるいはそれらと同一である。前述したように、多形核の白血球を単離しそし て1′インジウムで標識し、そして細胞をRPM11640培地の中に5 XI O’ /mlの濃度で懸濁した。次に、75μlの細胞懸濁液および25μIの 所望濃度のCD18ペプチドを含有する培地をトランス−ウェルのインサートに 添加し、そしてこの混合物を37°Cにおいて10分間インキエベーシッンした 。
24ウェルのプレートの底のウェルに、0.6mlの0.5%のチモサン活性化 ヒト血清を含有する培地を添加した。また、この溶液を使用前に37°Cに10 分藺加温した。
次に、所望のCD18ペプチドを有する細胞懸濁液を含有するトランス−ウェル のインサートを24ウエルのプレートの中で37°Cにおいて30分間インキュ ベーションすることによって、アッセイを実施した。
引き続いて、インサートを除去し、そして60μlの10%のドデシル硫酸ナト リウム溶液を24ウエルのプレートのウェルに添加した。プレートをおだやかに 震盪しながら室温において15分間インキュベーションし、そして110μlの アリコートを取り出し、そし7て11インジウムの量をガンマカウンターで決定 した。
表5に結果を示し、これらは101〜106Mの濃度範囲にわたってペプチドに より引き起こされた移動の阻害または増強%として表されている。データは4人 の異なるヒトのドナーNo、591.593.195および499から単離され た多形核の白血球から集めた。データを見ると直ちに明らかなように、ペプチド 2−24.3−29および4−29について10−4〜10−5Mからの濃度範 囲において、化学走性の移動の顕著な阻害が存在する。最大の阻害は試験したペ プチドの濃度、ならびに多形核の白血球を単離したドナーの両者の関数である。
表エ ペプチド 591 593 195 499*データは多形核の白血球の移動の 阻害(−)または増強%として表されている。
異なる個体からの多形核の白血球を使用して観察された結果における変動のため に、最も活性なペプチド4−29の阻害作用を確証するために追加の実験を実施 した。実験は6人のドナーからの多形核の白血球を使用して実施し、ドナーのう ちの1人の195をここでおよび前の実験において使用した。さらに、実験を1 0−4〜10−7の濃度範囲にわたって実施した。このペプチドの阻害活性は確 証され、有意な活性はすべてのドナーについて観測された。活性のピークは10 −’Mであった。前の実験において診察されるように、異なるドナ−からの多形 核の白血球を使用して阻害の変動%が存在することに注意すべきである。
紅 好中球の化学走性へのCD18ペプチドの作用ペプチドの濃度 10.5%のチモサン活性化ヒト血清に応答してフィルターを通して移動した細 胞の合計の数により測定した。
1施1 への−イノウィルスの 人の 実施例1に記載するアッセイを使用し、そしてアンセイ混合物の中に変化する量 のペプチドおよび約lXl0’計数/分の標識したライノウィルスを存在させて 、ペプチド4−29を活性化内皮細胞へのライノウィルスの結合を阻害する能力 について試験した。放射線標識したライノウィルスは、Abrahas、G、お よびCo1onno、 R,J、。
生成することができる。内皮細胞を4−29と4℃において30分間予備インキ ユヘーションして、ペプチドのエンドサイト−シスを防止した。約50〜100  tt g /mlの濃度はライノウィルスの結合の約50%の阻害を提供する であろうことが決定されるであろう。
ス1」目ユ るためのCD18ペプチド 4−29 の ・CD18ペプチドは、それを医薬 として許容さる鼻の担体の中に有効量で配合することによって、普通の風邪の効 率よい防止のために適用することができる。この量は当業者により実験的に決定 されるが、一般に約50μg〜Img/wlの範囲であろう。鼻の医薬配合物は 当業者によく知られており、そしてrRemington’s Phar+ma ceuticalSciences」、第14版、1970年に詳述されている 。しかしながら、理解されるように、適当な担体の選択は所望の特定の鼻の投与 形態の性質に依存するであろう。すなわち、ペプチドは滴またはスプレーとして 使用するための鼻の溶液、鼻の懸濁液、鼻の軟膏、または鼻のゲルとして配合す るかどうかに依存し、ここでペプチド4−29は生理学的に適合性の溶液の中に 存在する。この溶液は、また、少量の乳化剤または分散剤、緩衝剤、保存剤、湿 潤剤およびゲル化剤をこの分野において知られているように含有することができ る。
鼻のスプレーの形態のペプチド4−29は、個体が風邪にかかった他の個体に暴 露される前に、あるいはその直後に、個体に適用することができる。このように して、ペプチド4−29は鼻の内皮へ結合するライノウィルスの量を防止または 大きく減少するので、感染した個体によるライノウィルスへの個体の暴露は最小 となるか、あるいは排除することができる。
本発明を特定の実施態様を参照して記載した。しかしながら、この出願は、添付 した請求の範囲の精神および範囲から逸脱しないでなすことができる変化および 変更を包含することを意図する。
ム躇ユ」 二一二 二一一−L+ : ’:: 、’、+ ”:+ =:::l: 11′ ″′士モ云七=ド::::::g=ド=じ:::::l:::lニド;ぴ==竺 =:=9閤::::::a:ゐフ:::::::::::::::に::::: ::::::::::、m::ろ=ろ、。
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all :::::l::::::::::::: j::::::に:::: :::::::::l::::::::〒1、。
手続補正書(方式) %式% 1、事件の表示 PCT/US 91106053 2、発明の名称 病気の処置のためのペプチドの薬物 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 シタスオンコロジーコーポレイション4、代理人 住所 〒105東京都港区虎ノ門−丁目8番lO号静光虎ノ門ビル 電話350 4−07215、補正命令の日付 6、補正の対象 (1)特許出願人名称変更証明書 (2)明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文7、補正の内容 (1) 別紙の通り (2)明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文の浄書(内容に変更なし) 8、添付書類の目録 (1)特許出願人名称変更証明書及び 各1通その翻訳文 (2)明細書、請求の範囲及び要約書 各1通の翻訳文 但し、(1)につきましては、平成4年8月添付のものを援用し、その写しを添 付します。
国際調査報告 lIl+ww*wmalAmla+++e*Ns Dr丁/IIζ 01/l’ 1ln(’1Pffm PCT/1W210 +s+mmw+m lI’1ML  t211 ・PI41211111flフロントページの続き (72)発明者 ムンディ、カーステンアメリカ合衆国、カリフォルニア 94 553゜マルティネツ、ヒーザーリーフ レーン

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、白血球の生物学的物質への付着を妨害する白血球βサブユニット、CD18 、インテグリンペプチド。 2、前記ペプチドが、 a)【配列があります】 b)【配列があります】 c)【配列があります】 d)【配列があります】 e)【配列があります】 f)【配列があります】 から成る群より選択される、請求の範囲第1項記載のペプチド。 3、前記ペプチドが、【配列があります】からなる、請求の範囲第2項記載のペ プチド。 4、前記ペプチドが、 【配列があります】 からなる、請求の範囲第2項記載のペプチド。 5、前記ペプチドが、 【配列があります】 からなる、請求の範囲第2項記載のペプチド。 6、前記ペプチドが、 【配列があります】 からなる、請求の範囲第2項記載のペプチド。 7、前記ペプチドが、 【配列があります】 からなる、請求の範囲第2項記載のペプチド。 8、前記ペプチドが、 【配列があります】 からなる、請求の範囲第2項記載のペプチド。 9、前記生物学的物質がICAMを有することにより特徴づけられる、請求の範 囲第1項記載のペプチド。 10、前記生物学的物質が内皮である、請求の範囲第9項記載のペプチド。 11、白血球の生物学的物質への結合を妨害するか、あるいは防止し、そして白 血球の生物学的物質への化学走性を妨害するか、あるいは防止する性質を有する 、白血球βサブユニット、CD18、インテグリンペプチド。 12、白血球の生物学的物質への付着を妨害するか、あるいは防止する白血球β サブユニット、CD18、インテグリンペプチドの1種または2種以上の有効量 を往きている被検体に投与することからなる、病気を処置する方法。 13、前記病気が炎症性の応答を含む、請求の範囲第12項記載の病気を処置す る方法。 14、前記白血球βサブユニット、CD18、インテグリンペプチドが、a)【 配列があります】 b)【配列があります】 c)【配列があります】 d)【配列があります】 e)【配列があります】 f)【配列があります】 から成る群より選択される、請求の範囲第13項記載の方法。 15、前記白血球βサブユニット、CD18、インテグリンペプチドが、【配列 があります】 からなる、請求の範囲第14項記載の病気を処置する方法。 16、前記病気はライノウイルスにより引き起こされる、請求の範囲第12項記 載の病気を処置する方法。 17、白血球βサブユニット、CD18、インテグリンペプチドに対する抗体。 18、a)【配列があります】 b)【配列があります】 c)【配列があります】 d)【配列があります】 e)【配列があります】 f)【配列があります】 から成る群より選択されるペプチドに結合する1種または2種以上の抗体の有効 量を生きている被検体に投与することからなる、病気を処置する方法。 19、【配列があります】 に結合する抗体の有効量を生きている被検体に投与することからなる、病気を処 置する方法。 20、前記病気がライノウイルスにより引き起こされる、請求の範囲第18項記 載の病気を処置する方法。 21、前記病気がライノウイルスにより引き起こされる、請求の範囲第19項記 載の病気を処置する方法。 22、HT、JUN−kまたは2Xから成る群より選択される、白血球の生物学 的物質への付着を妨害するペプチド。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007535654A (ja) * 2003-04-23 2007-12-06 ハンサ メディカル アクチボラゲット 抗連鎖球菌物質の確認方法、及び連鎖球菌感染症治療のためのその使用

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6143298A (en) * 1988-09-01 2000-11-07 Bayer Corporation Soluble truncated forms of ICAM-1
DE68929096T2 (de) 1988-09-01 2000-05-11 Bayer Ag Menschliches Rhinovirusrezeptorprotein, das die Virusinfektionsanfälligkeit hemmt
US6514936B1 (en) 1988-09-01 2003-02-04 Bayer Corporation Antiviral methods using human rhinovirus receptor (ICAM-1)
US6051231A (en) * 1988-09-01 2000-04-18 Bayer Corporation Antiviral methods and prepations
EP0468257B1 (en) * 1990-07-20 1999-09-01 Bayer Corporation Multimeric form of human rhinovirus receptor protein
US6130202A (en) * 1990-07-20 2000-10-10 Bayer Corporation Antiviral methods
US6107461A (en) * 1990-07-20 2000-08-22 Bayer Corporation Multimeric forms of human rhinovirus receptor and fragments thereof, and method of use
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
CA2119128C (en) 1992-07-16 2000-05-30 Lynn M. Rose Alleviation of symptoms associated with inflammatory disease states
US5854070A (en) * 1992-07-16 1998-12-29 Icos Corporation Murine and humanizer 23F2G antibodies and cell lines expressing said antibodies
JPH08500826A (ja) * 1992-08-21 1996-01-30 ジェネンテク,インコーポレイテッド Lfa−1仲介疾患を処置する方法
EP0762886A4 (en) * 1994-04-19 1999-03-31 Univ Kansas ICAM-1 / LFA-1 SHORT CHAIN PEPTIDES AND METHODS FOR USE THEREOF
DK0852491T3 (da) * 1995-09-29 2004-12-20 Biomarin Pharm Inc Anvendelse af heparinaser til at mindske inflammatoriske responser
US6075004A (en) 1996-04-26 2000-06-13 The University Of Kansas Peptide compositions which induce immune tolerance and methods of use
AU4815397A (en) * 1996-10-15 1998-05-11 Vanderbilt University Method of disrupting cellular adhesion
WO2000018895A1 (en) 1998-09-25 2000-04-06 The Children's Medical Center Corporation Short peptides which selectively modulate the activity of protein kinases
EP1194157A4 (en) * 1999-04-21 2002-08-14 Hisamitsu Pharmaceutical Co IMMUNOTOLERANCE INDUCING POLYPEPTIDE AND TECHNIQUES FOR USE
US6663863B2 (en) 2000-03-17 2003-12-16 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method of inhibiting stenosis and restenosis
CN1592746A (zh) * 2000-11-28 2005-03-09 杰南技术公司 Lfa-1拮抗剂化合物
EP1570270A4 (en) * 2002-11-15 2010-09-22 Univ Arizona THERAPEUTIC BIOCONJUGATES
US7314938B2 (en) 2003-11-05 2008-01-01 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of cellular adhesion
EP2444079B1 (en) 2005-05-17 2016-11-30 SARcode Bioscience Inc. Compositions and Methods for Treatment of Eye Disorders
MX2010004281A (es) 2007-10-19 2010-09-10 Sarcode Corp Composiciones y metodos para el tratamiento de la retinopatia diabetica.
US20090258069A1 (en) * 2008-04-15 2009-10-15 John Burnier Delivery of LFA-1 antagonists to the gastrointestinal system
WO2009139817A2 (en) 2008-04-15 2009-11-19 Sarcode Corporation Crystalline pharmaceutical and methods of preparation and use thereof
JP2011518155A (ja) * 2008-04-15 2011-06-23 サーコード コーポレイション 免疫関連障害の局所治療に使用するためのエアゾール化lfa−1アンタゴニスト
JP2011521896A (ja) * 2008-04-15 2011-07-28 サーコード コーポレイション 免疫関連障害に対する局部治療に使用するための局所lfa−1アンタゴニスト
WO2011050175A1 (en) 2009-10-21 2011-04-28 Sarcode Corporation Crystalline pharmaceutical and methods of preparation and use thereof
CA2879982C (en) 2012-07-25 2020-09-01 Sarcode Bioscience Inc. Lfa-1 inhibitor and polymorph thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988006592A1 (en) * 1987-02-26 1988-09-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cloning of lfa-1
US4935234A (en) * 1987-06-11 1990-06-19 Dana-Farber Cancer Institute Method of reducing tissue damage at an inflammatory site using a monoclonal antibody
US4797277A (en) * 1987-09-22 1989-01-10 Pharmacia Ab Method for reperfusion therapy
AU3149289A (en) * 1988-03-18 1989-09-21 Rockefeller University, The Method and agent for inhibiting the binding of human polymorphonuclear leukocytes to endothelium and compositions therefor
US5147637A (en) * 1988-06-07 1992-09-15 The Rockefeller University Method of inhibiting the influx of leukocytes into organs during sepsis or other trauma
CA2000048A1 (en) * 1988-10-03 1990-04-03 Edward F. Plow Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand bindin g
US5002873A (en) * 1989-03-17 1991-03-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA sequence encoding a lymphocyte adhesion receptor for high endothelium
WO1991004745A1 (en) * 1989-09-27 1991-04-18 Athena Neurosciences, Inc. Compositions for cell adhesion inhibition and methods of use

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007535654A (ja) * 2003-04-23 2007-12-06 ハンサ メディカル アクチボラゲット 抗連鎖球菌物質の確認方法、及び連鎖球菌感染症治療のためのその使用

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Publication number Publication date
AU8631991A (en) 1992-03-17
EP0546077A1 (en) 1993-06-16
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US5340800A (en) 1994-08-23
CA2090427A1 (en) 1992-02-28
WO1992003473A1 (en) 1992-03-05

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