BRPI0412890B1 - Método de selecionar um anticorpo anti KIR2DL1 ou fragmento de anticorpo de ligação de antígeno - Google Patents

Método de selecionar um anticorpo anti KIR2DL1 ou fragmento de anticorpo de ligação de antígeno Download PDF

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François Romagne
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Innate Pharma
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Abstract

"método de tratar uma doença em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, composição farmacêutica, e, métodos de selecionar um composto para administração conjuntamente com um anticorpo terapêutico, e de aumentar a eficiência de um tratamento envolvendo a administração de um anticorpo terapêutico que pode ser ligado por cd16 em um indivíduo". a presente invenção refere-se, em geral, aos métodos e às composições para aumentar a eficiência de anticorpos terapêuticos. sua eficiência é intensificada por meio do aumento do mecanismo de adcc. mais particularmente, a invenção refere-se ao uso de um anticorpo terapêutico em combinação com compostos que bloqueiam um receptor inibitório ou estimulam um receptor ativador de uma célula nk com o objetivo de intensificar a eficiência do tratamento com anticorpos terapêuticos em indivíduos humanos.

Description

“MÉTODO DE SELECIONAR UM ANTICORPO ANTI KIR2DL1 OU FRAGMENTO DE ANTICORPO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO”
CAMPO DA INVENÇÃO [0001] A presente invenção refere-se, em geral, aos métodos e às composições para aumentar a eficiência de anticorpos terapêuticos. Mais particularmente, a invenção refere-se ao uso de um anticorpo terapêutico em combinação com compostos que bloqueiam um receptor inibitório ou estimulam um receptor ativador de uma células matadoras naturais, permitindo deste modo uma potencialização de citotoxicidade de célula matadora natural em indivíduos mamíferos com o objetivo de intensificar a eficiência do tratamento em indivíduos humanos, particularmente por intermédio de um aumento do mecanismo de ADCC.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [0002] Várias estratégias terapêuticas em seres humano são baseadas no uso de anticorpos terapêuticos. Estas incluem, por exemplo o uso de anticorpos terapêuticos desenvolvidos para depletarem células alvo, particularmente células doentes tais como células viralmente infectadas, células de tumor ou outras células patogênicas. Tais anticorpos são tipicamente anticorpo monoclonal, de espécies IgG, tipicamente com porções Fc de IgG1 ou de IgG3. Estes anticorpos podem ser anticorpos nativos ou recombinantes, e são muitas vezes anticorpos de camundongo humanizados (i.e. compreendendo domínios funcionais de várias espécies, tipicamente uma porção Fc de origem de primata não-humano ou humano, e com uma região variável ou região determinante de complementaridade (CDR) de origem de camundongo). Alternativamente, o anticorpo monoclonal pode ser totalmente humano por meio de imunização em camundongos transgênicos possuindo um locus Ig humano, ou obtido por intermédio de bibliotecas de cDNA derivadas de células humanas.
[0003] Um exemplo específico de tais anticorpos terapêuticos é rituximab (Mabthera®, Rituxan®), que é um anticorpo monoclonal quimérico anti-CD20
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2/57 preparado com regiões constantes κ e γ1 humanas (portanto com porção Fc de IgG1 humana) ligadas em domínios variáveis murinos conferindo especificidade para CD20. Em alguns anos pretéritos, rituximab tem modificado consideravelmente a estratégia terapêutica contra malignidades linfoproliferativas B, particularmente linfomas de não-Hodgkin (NHL). Outros exemplos de anticorpos IgG1 humanizados incluem alentuzumab (Campath-1H®), que é usado no tratamento de malignidades de célula B, e trastuzumab (Herceptin®), que é utilizado no tratamento de câncer de mama. Exemplos adicionais de anticorpos terapêuticos sob desenvolvimento são descritos na arte.
[0004] O mecanismo de ação de anticorpos terapêuticos ainda é um tema em debate. Injeção de anticorpos acarreta a depleção de células possuindo o antígeno especificamente reconhecido pelo anticorpo. Esta depleção pode ser mediada por meio de pelo menos três mecanismos: citotoxicidade celular mediada por anticorpo (ADCC), lise dependente de complemento, e inibição antitumoral direta de crescimento de tumor por meio de sinais dados via o antígeno selecionado pelo anticorpo.
[0005] Embora estes anticorpos representem uma abordagem nova e eficiente para terapia humana, particularmente para o tratamento de tumores, nem sempre exibem uma eficácia forte. Por exemplo, embora rituximab, sozinho ou em combinação com quimioterapia, tenha se mostrado efetivo no tratamento de NHL de grau tanto alto quanto baixo-intermediário, 30% a 50% dos pacientes com NHL de grau baixo não têm tido resposta clínica ao rituximab. Tem sido sugerido que o nível de expressão de CD20 sobre células de linfoma, a presença de carga tumoral alta no momento do tratamento, ou concentrações séricas baixas de rituximab podem explicar a falta de eficácia do rituximab em alguns pacientes. Contudo, os casos reais de falha de tratamento permanecem grandemente desconhecidos.
[0006] Ainda mais, o uso de anticorpos terapêuticos pode ser limitado por efeitos colaterais causados por sua administração. Por exemplo, efeitos colaterais tais como febre, dor de cabeça, náuseas, hipotensão, respiração ofegante, erupção cutânea, infecções, e várias outros podem aparecer em pacientes potencialmente limitando a
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3/57 quantidade ou freqüência possível com que os anticorpos podem ser administrados. [0007] Assim, seria muito interessante o aumento da eficácia de anticorpos terapêuticos, ou a capacidade de se alcançar eficácia terapêutica usando doses reduzidas dos antibióticos que são menos propensos a produzir efeitos colaterais. A presente invenção soluciona estas e outras necessidades.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0008] A presente invenção descreve novas abordagens para intensificar a eficácia de anticorpos terapêuticos. Sem ser limitado pela seguinte teoria, acreditase que os resultados surpreendentes alcançados usando os presentes métodos derivam de sua capacidade para intensificar o mecanismo de ADCC in vivo, quando anticorpos terapêuticos são injetados. De fato, a presente invenção proporciona composições novas e métodos novos que suplantam a dificuldade corrente relacionada com a eficácia de anticorpos terapêuticos. É mostrado na presente invenção que as células NK de um indivíduo podem ter ADCC mediada por (anticorpo monoclonal) mAb terapêutico insatisfatória por causa da falca de ativação das células NK, por exemplo, por uma inibição de receptores inibitórios sobre células NK. Preferivelmente, um aumento do mecanismo de ADCC é obtido pela administração de compostos que bloqueiam um receptor inibitório, ou estimulam um receptor ativador, sobre células matadoras naturais, promovendo deste modo uma potencialização da citotoxicidade de célula matadora natural em indivíduos mamíferos. Preferivelmente o composto é um anticorpo ou um seu fragmento.
[0009] Os citados anticorpos ou outros compostos podem reagir com um receptor inibitório de células NK, por exemplo, moléculas de receptor inibitório de matador (KIR ou NKG2A/C), ou com receptores ativadores, por exemplo NCRs tais como NKp30, NKp44, ou NKp46, sobre células NK, neutralizando deste modo a inibição das células e aumentando sua atividade de ADCC.
[0010] Mais especificamente, a invenção descreve métodos de tratamentos de um indivíduo no qual um composto, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador de uma célula NK, é co-administrado com o anticorpo terapêutico ao indivíduo. Os
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4/57 inventores demonstram aqui que a eficiência de um anticorpo terapêutico pode ser grandemente intensificada pela co-administração, por exemplo, co-injeção, de um tal composto, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, que suplanta a inibição de células NK, por exemplo pelo bloqueio do receptor inibitório ou pela estimulação de um receptor ativador de uma célula NK.
[0011] A invenção também se refere às composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo terapêutico e um composto, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador de uma célula NK. A invenção também se refere aos kits compreendendo um anticorpo terapêutico e um composto, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador de uma célula NK.
[0012] A invenção também se refere ao uso de um composto, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador de uma célula NK, para aumentar a eficiência de um tratamento com um anticorpo terapêutico, ou para aumentar ADCC em um indivíduo submetido a um tratamento com um anticorpo terapêutico.
[0013] A invenção também se refere ao uso de um composto, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador de uma célula NK, e de um anticorpo terapêutico para a preparação de uma droga para tratamento de uma doença. Mais particularmente, o tratamento da doença requer a depleção das células selecionadas, preferivelmente células doentes tais como células viralmente infectadas, células de tumor ou outras células patogênicas. Preferivelmente, a doença é uma doença de câncer, infecciosa ou imune. Mais preferivelmente, a doença é selecionada do grupo consistindo de um câncer, uma doença autoimune, uma doença inflamatória, e uma doença viral. A doença também se refere a uma rejeição de enxerto, mais particularmente rejeição de aloenxerto, e doença de enxerto versus hospedeiro (GVHD).
[0014] A presente invenção também compreende um método de reduzir a dosagem de um anticorpo terapêutico, por exemplo um anticorpo que é ligado por
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5/57 um receptor Fcy, preferivelmente CD16 (FcyRIIIa). Por exemplo, co-administração de um anticorpo terapêutico e de um composto que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador sobre células NK permitindo que uma dose menor de anticorpo terapêutico seja usada. Tais anticorpos podem ser utilizados em uma dose de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou menor do que a dose recomendada na ausência do composto.
[0015] Em adição, a invenção proporciona um método para determinar uma dose reduzida, terapeuticamente eficaz de um anticorpo terapêutico, por exemplo, um anticorpo ligado por CD16, o método compreendendo: i) co-incubar uma primeira concentração do anticorpo terapêutico com células alvo e células NK, e na ausência de um composto que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador sobre células NK; ii) co-incubar uma segunda concentração menor do anticorpo terapêutico com células alvo, com células NK, e na presença de um composto que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador sobre células NK; iii) determinar se a depleção de células alvo observada na etapa ii) é tão elevada quanto a depleção observada na etapa i). Se for observado que a etapa ii) é tão eficaz quanto a etapa i), então as concentrações relativas do composto e de anticorpo terapêutico podem ser variadas, e a depleção observada, com o propósito de identificar as condições diferentes que seriam adequadas para uso em um dado paciente, por exemplo, maximizar a depleção de célula alvo, dose diminuída de anticorpo terapêutico, ou dose diminuída de composto, dependendo das necessidades específicas do paciente.
[0016] Em um aspecto particular, a presente invenção proporciona um método de tratamento de uma doença em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo: a) administrar ao citado indivíduo um composto que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador sobre uma célula NK; e, b) administrar ao citado indivíduo um anticorpo terapêutico que pode ser ligado por CD16.
[0017] Em uma modalidade, o anticorpo terapêutico e o composto são administrados ao indivíduo simultaneamente. Em outra modalidade, o composto é
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6/57 administrado ao indivíduo dentro de uma semana, dentro de 4 dias, dentro de 3 dias ou no mesmo dia (por exemplo dentro de cerca de 24 horas) da administração do anticorpo terapêutico. Em outra modalidade, a doença é um câncer, doença infecciosa ou doença imune.
[0018] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente uma etapa adicional na qual a atividade ou o número de células NK no indivíduo é avaliada(o) antes da ou subseqüentemente à administração do composto. Em outra modalidade, a etapa adicional envolve i) obter células NK do indivíduo antes da administração; ii) incubar as células NK na presença de uma ou mais células alvo que são reconhecidas pelo anticorpo terapêutico, na presença ou ausência do composto; e iii) avaliar o efeito do composto sobre a capacidade das células NK de depletarem células alvo; no qual uma detecção de que o composto intensifica a capacidade das células NK de depletarem células alvo indica que o composto é adequado para uso no método, e que o método é apropriado para utilização com o indivíduo.
[0019] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo terapêutico, por exemplo que pode estar ligado por CD16, um composto que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador de células NK, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um kit compreendendo um anticorpo terapêutico, por exemplo que pode estar ligado por CD16, e um ou mais compostos que bloqueiam um receptor inibitório ou estimulam um receptor ativador de células NK.
[0020] Para muitos dos métodos, composições, ou kits mencionados acima, em uma modalidade o anticorpo terapêutico possui uma porção Fc de IgG1 ou de IgG3 humana. Em outra modalidade, o composto é um anticorpo ou um seu fragmento. Em outra modalidade, o anticorpo terapêutico é um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento. Em outra modalidade, o anticorpo terapêutico não está conjugado com um grupo tóxico ou radioativo. Em outra modalidade, o composto inibe um receptor inibitório de uma célula NK. Em outra modalidade, o composto estimula um receptor ativador de uma célula NK. Em outra modalidade, o composto é um anticorpo
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7/57 humano, humanizado ou quimérico, ou um seu fragmento. Em outra modalidade, os anticorpos terapêuticos ou compostos podem ser fragmentos ou derivados de anticorpo tais como, inter alia, um fragmento Fab, um fragmento Fab'2, uma CDR e um ScFv.
[0021] Em uma modalidade, o anticorpo terapêutico é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico ou um seu fragmento. Em outra modalidade, o anticorpo terapêutico é rituximab ou Campath. Em outra modalidade, o anticorpo é rituximab, e o citado anticorpo é administrado em uma dosagem menor do que 375 mg/m2 por semana. Em outra modalidade, o anticorpo é Campath, e o anticorpo é administrado em uma dosagem menor do que 90 mg/m2 por semana.
[0022] Em uma modalidade, o composto se liga em pelo menos um de receptores humanos NKG2, KIR2DL ou KIR2DL3, e inibe a inibição relacionada de citotoxicidade de célula NK mediada por NKG2, KIR2DL ou KIR2DL3. Em outra modalidade, o composto bloqueia um receptor inibitório de uma célula NK selecionado do grupo consistindo de KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, LILRB1, NKG2A, NKG2C, NKG2E e LILRB5. Em outra modalidade, o composto se liga em um determinante comum de receptores humanos KIR2DL e inibe a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por KIR2DL. Em outra modalidade, o composto se liga em um determinante comum de receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 e inibe a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. Em outra modalidade, o composto inibe a ligação de uma molécula de alelo de HLA-C possuindo um residual de Lys na posição 80 em um receptor KIR2DL1 humano, e a ligação de uma molécula de alelo de HLA-C possuindo um resíduo de Asn na posição 80 em receptores KIR2DL2 e KIR2DL3 humanos. Em outra modalidade, o composto se liga em epitopo igual ao do anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200. Em outra modalidade, o composto compete com anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200 pela ligação em um receptor KIR na superfície de uma célula NK de humano. Em outra modalidade, o composto é um anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200 ou um seu
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8/57 fragmento.
[0023] Em uma modalidade, o composto se liga em um receptor selecionado do grupo consistindo de NKp30, NKp40, NKp46, e NKG2D. Em outra modalidade, o composto é derivado de ou compete com um anticorpo monoclonal selecionado do grupo consistindo de AZ20, A76, Z25, Z231, e BAB281.
[0024] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de selecionar um composto para administração conjuntamente com um anticorpo terapêutico, o citado método compreendendo: i) proporcionar um composto de teste que inibe um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador de células NK; ii) incubar o anticorpo terapêutico com células alvo especificamente reconhecidas pelo anticorpo terapêutico na presença de células NK e na presença ou ausência do composto de teste; e iii) avaliar o efeito do composto sobre a capacidade das células NK de depletarem células alvo; no qual uma detecção que o composto intensifica a capacidade das células NK para depletarem células alvo indica que o composto é adequado para uso no método.
[0025] Em uma modalidade, o composto intensifica a capacidade do anticorpo terapêutico para destruir as células alvo em 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, ou mais. Em outra modalidade, o composto é selecionado do grupo consistindo de um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um anticorpo monoclonal, um fragmento de um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, e um anticorpo humano. Em outra modalidade, as células alvo são células de câncer, células viralmente infectadas, ou células sofrendo um distúrbio autoimune. Em outra modalidade, o anticorpo terapêutico é rituximab ou CAMPATH.
[0026] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de aumentar a eficiência de um tratamento envolvendo a administração de um anticorpo terapêutico que pode ser ligado por CD16 em um indivíduo, o citado método compreendendo administrar ao citado indivíduo antes da, simultaneamente à, ou após a administração de citado anticorpo terapêutico, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que bloqueia um receptor inibitório ou
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9/57 estimula um receptor ativador de uma célula NK. Em uma modalidade, o composto aumenta a eficiência do tratamento por intensificação de ADCC em citado indivíduo. LEGENDAS DAS FIGURAS [0027] Figura 1: Anticorpo monoclonal DF200 se liga em um determinante comum de vários receptores KIR2DL humanos.
[0028] Figura 2: Reconstituição de lise com mAb (anticorpo monoclonal) antiKIR2DL sobre alvo C1R Cw4 em razão de efetor / alvo de 4/1. Anticorpo monoclonal DF200 inibe a inibição de citotoxicidade de célula NK positiva para KIR2DL1 mediada por KIR2DL (lise reconstituída) sobre células alvo positivas para Cw4.
[0029] Figura 3: Intensificação de ADCC mediada por Rituxan de um clone NK positivo para KIR2DL1 sobre linhagem celular EBV positiva para Cw4 pelo bloqueio de interação KIR/HLA. Citólise de clone NK possuindo KIR2DL1 é testada contra uma linhagem celular alvo (positiva para CD20) transformada com EBV positiva para Cw4 em várias razões de efetor/alvo (de 1 a 4) na presença de 5 qg/mL de anticorpo anti CD20 (Rituxan) e 10 qg/mL de anticorpo EB6 (anti KIR2DL1); Rituxan sozinho; EB6 sozinho; ou sem qualquer anticorpo. ADCC é elevadamente intensificado na presença de anticorpo (EB6) anti KIR2DL1.
[0030] Figura 4: Intensificação de ADCC mediada por Campath de um clone NK positivo para KIR2DL1 sobre linhagem celular EBV positiva para Cw4 pelo bloqueio de interação KIR/HLA. Citólise de clone NK possuindo KIR2DL1 é testada contra uma linhagem celular alvo (positiva para CD20) transformada com EBV positiva para Cw4 na presença de Campath e de 100 qg/mL de anticorpo EB6 (anti KIR2DL1); Campath sozinho; EB6 sozinho; ou sem qualquer anticorpo. ADCC é elevadamente intensificado na presença de anticorpo (EB6) anti KIR2DL1.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0031] A presente invenção proporciona um método para aumentar a eficiência de anticorpos terapêuticos. A invenção mais especificamente descreve que o uso de um composto, preferivelmente de um anticorpo ou de um seu fragmento, que potencializa células NK, preferivelmente pelo bloqueio de um receptor inibitório ou pela ativação de um receptor ativador de uma célula NK, pode aumentar
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10/57 significativamente a eficiência de anticorpos terapêuticos. De fato, os inventores demonstram que a eficiência de múltiplos anticorpos terapêuticos pode ser elevadamente intensificada pela co-administração de um anticorpo direcionado contra um receptor de célula NK; por exemplo, um receptor inibitório.
[0032] Portanto, a invenção refere-se a um método de tratamento de uma doença em um indivíduo em necessidade do mesmo compreendendo:
a) administrar ao citado indivíduo um composto, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador de uma célula NK; e
b) administrar ao citado indivíduo um anticorpo terapêutico.
[0033] O citado anticorpo terapêutico pode ser ligado por CD16 de células NK por meio de sua região Fc.
[0034] Preferivelmente, o citado anticorpo terapêutico possui uma porção Fc de IgG1 ou de IgG3 humana, particularmente um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento, adicionalmente preferivelmente um anticorpo humanizado, humano ou quimérico ou um seu fragmento, por exemplo rituximab.
[0035] É intencionado que os compostos, preferivelmente anticorpos ou um seu fragmento, que bloqueiam o receptor inibitório de uma célula NK possam ser administrados ao indivíduo antes, simultaneamente à ou, após a administração do anticorpo terapêutico. O modo de administração de anticorpos diferentes depende de suas biodisponibilidade e farmacocinética. Preferivelmente, o anticorpo terapêutico é administrado dentro de uma semana à administração dos compostos, preferivelmente os anticorpos ou um seu fragmento, que bloqueiam o receptor inibitório de uma célula NK, mais preferivelmente dentro de um período de 2 ou 5 dias. Preferivelmente, o anticorpo terapêutico é administrado antes ou simultaneamente com os compostos, preferivelmente anticorpos ou um seu fragmento, que bloqueiam o receptor inibitório de uma célula NK.
[0036] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método de aumentar ADCC em um indivíduo recebendo um tratamento com anticorpo terapêutico, o citado método compreendendo administrar ao citado indivíduo antes da,
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11/57 simultaneamente à ou após a administração de citado anticorpo terapêutico uma quantidade suficiente para aumentar ADCC de um composto, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK. O citado anticorpo terapêutico pode ser ligado por CD16 sobre células NK, preferivelmente por meio de sua região Fc. Preferivelmente, o citado anticorpo terapêutico possui uma porção Fc de uma IgG1 ou de uma IgG3 humana, particularmente um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento, adicionalmente preferivelmente um anticorpo humano, humanizado ou quimérico ou um seu fragmento, por exemplo rituximab.
[0037] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método de aumentar a eficiência de um tratamento com anticorpo terapêutico em um indivíduo, o citado método compreendendo administrar ao citado indivíduo antes da, simultaneamente à ou após a administração de citada anticorpo terapêutico uma quantidade de um composto, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK, suficiente para aumentar a eficiência de citado anticorpo terapêutico. O citado anticorpo terapêutico pode ser ligado por CD16 sobre células NK, preferivelmente por meio de sua região Fc. Preferivelmente, o citado anticorpo terapêutico possui uma porção Fc de uma IgG1 ou de uma IgG3 humana, particularmente um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento, adicionalmente preferivelmente um anticorpo humano, humanizado ou quimérico ou um seu fragmento, por exemplo rituximab.
DEFINIÇÕES [0038] Como aqui usados, os seguintes termos possuem os significados atribuídos aos mesmos a não ser que sejam especificados de outro modo.
[0039] Como aqui usado, células NK refere-se a uma subpopulação de linfócitos que está envolvida em imunidade não-convencional. As células NK podem ser identificadas em virtude de certas características e propriedades biológicas, tais como a expressão de antígenos de superfície específicos incluindo CD16, CD56 e/ou CD57, a ausência de complexo TCR alfa/beta ou gama/delta sobre a superfície celular, a capacidade de se ligar em e de matar células que falham em expressar
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12/57 auto-antígenos MHC/HLA pela ativação de enzimas citolíticas específicas, a capacidade de matar células tumorais ou outras células doentias que expressam um ligante para receptores ativadores de NK, a capacidade de liberar moléculas de proteína chamadas de citocinas que estimulam ou inibem a resposta imune. Qualquer uma destas características e atividades pode ser usada para identificar células NK, usando métodos conhecidos na arte.
[0040] O termo anticorpo, como aqui usado, refere-se aos anticorpos monoclonais e policlonais. Dependendo do tipo de domínio constante nas cadeias pesadas, anticorpos são alocados em uma de cinco classes maiores: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. Várias destas são adicionalmente divididas em subclasses ou isótipos, tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, e semelhantes. Uma unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) exemplar compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par possuindo uma cadeia leve (cerca de 25 kDa) e uma cadeia pesada (cerca de 50-70 kDa). A terminação-N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 110 a 110 ou mais aminoácidos que é primariamente responsável pelo reconhecimento de antígeno. Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) referemse às cadeias leve e pesada respectivamente. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de imunoglobulinas são chamados de alfa, delta, epsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de subunidade e as configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidas. IgG e/ou IgM são as classes preferidas de anticorpos empregados nesta invenção, com IgG sendo particularmente preferida, porque são os anticorpos mais comuns na situação fisiológica e porque são mais facilmente preparados em um ambiente de laboratório e porque as IgGs são especificamente reconhecidas pelos receptores Fc gama. Preferivelmente o anticorpo desta invenção é um anticorpo monoclonal. Particularmente preferidos são os anticorpos humanizados, quiméricos, humanos, ou diferentemente-humanoadequados.
[0041] Dentro do contexto desta invenção, o termo anticorpo ou anticorpos
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13/57 terapêutico(s) designa mais especificamente qualquer anticorpo que funciona para depletar células alvo em um paciente. Em particular, os anticorpos terapêuticos especificamente se ligam em antígenos presentes sobre a superfície de células alvo, por exemplo antígenos específicos de tumor presentes predominantemente ou exclusivamente sobre células de tumor. Preferivelmente, os anticorpos terapêuticos incluem porções Fc humanas, ou são capazes de interagir com receptores Fc humanos. Os anticorpos terapêuticos podem selecionar células por qualquer meio, por exemplo ADCC ou diferentemente, e podem estar nus, i.e. sem grupos conjugados, ou podem estar conjugados com compostos tais como toxinas ou marcadores radioativos.
[0042] O termo especificamente se liga em significa que um anticorpo pode ser ligar preferivelmente em um ensaio de ligação competitiva no parceiro de ligação, por exemplo um receptor NK ativador tal como NKp30, NKp44, ou NKp46, ou um receptor Fc gama humano, como avaliado usando quer formas recombinantes das proteínas, epitopos das mesmas, quer proteínas nativas presentes sobre a superfície de células alvo relevantes ou NK isoladas. Ensaios de ligação competitiva e outros métodos para determinar ligação específica são adicionalmente descritos abaixo e são bem conhecidos na arte.
[0043] Um anticorpo humano-adequado refere-se a qualquer anticorpo, anticorpo derivado, ou fragmento de anticorpo que pode ser seguramente usado em humanos, por exemplo, em métodos terapêuticos aqui descritos. Anticorpos humanos-adequados incluem todos os tipos de anticorpos humanizados, quiméricos, ou totalmente humanos, ou quaisquer anticorpos nos quais pelo menos uma porção dos anticorpos é derivada de humanos ou diferentemente modificada de modo a evitar a resposta imune que é provocada quando anticorpos nativos não-humanos são usados.
[0044] Fragmento imunogênico, significa aqui qualquer fragmento peptídico ou polipeptídico que é capaz de gerar uma resposta imune tal como (i) a geração de anticorpos ligando o citado fragmento e/ou ligando qualquer forma da molécula compreendendo o citado fragmento, incluindo o receptor ligado em membrana e
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14/57 mutantes derivados do mesmo, (ii) a estimulação de uma resposta de célula T envolvendo células T reagindo ao complexo bimolecular compreendendo qualquer molécula de MHC e um peptídeo derivado de citado fragmento, (iii) a ligação de veículos transfectados tais como bacteriófagos ou bactérias expressando genes codificadores de imunoglobulinas de mamífero. Alternativamente, um fragmento imunogênico também se refere a qualquer construção capaz de gerar uma resposta imune como definida acima, tal como um fragmento peptídico conjugado em uma proteína carreadora por copulação covalente, um construto de polipeptídeo recombinante quimérico compreendendo o citado fragmento peptídico em sua seqüência de aminoácidos, e especificamente inclui células transfectadas com um cDNA cuja seqüência compreende uma porção codificadora de citado fragmento.
[0045] Para os propósitos da presente invenção, um anticorpo humanizado refere-se a um anticorpo no qual a região de molde variável e constante de uma ou mais imunoglobulinas humanas está fusionada na região de ligação, por exemplo a CDR, de uma imunoglobulina de animal. Tais anticorpos humanizados são projetados para manter a especificidade de ligação do anticorpo não-humano do qual as regiões de ligação são derivadas, contudo para evitar uma reação imune contra o anticorpo não-humano.
[0046] Um anticorpo quimérico é uma molécula de anticorpo na qual (a) a região constante, ou uma sua porção, é alterada, substituída ou trocada de modo que o sítio de ligação de antígeno (região variável) seja ligado em uma região constante de uma classe, função efetora e/ou espécie alterada ou diferente, ou de uma molécula inteiramente diferente que confere propriedades novas ao anticorpo quimérico, por exemplo, uma enzima, uma toxina, um hormônio, um fator de crescimento, uma droga, etc.; ou (b) a região variável, ou uma sua porção, é alterada substituída ou trocada com uma região variável possuindo especificidade para antígeno diferente ou alterada. Em modalidades preferidas, da presente invenção, o anticorpo quimérico contudo mantém a região Fc da imunoglobulina, preferivelmente uma região Fc humana, permitindo deste modo interações com receptores Fc humanos sobre a superfície de células alvo.
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15/57 [0047] Dentro do contexto desta invenção, células NK potencializadas, ativas, ou ativadas designam células NK biologicamente ativas, mais particularmente células NK possuindo a capacidade de lisar células alvo. Por exemplo, uma célula NK ativa é capaz de matar células que expressam um ligante-receptor ativador NK e falham em expressar auto-antígenos MHC/HLA (células KIR-incompatíveis). Exemplos de células alvo adequadas para uso em ensaios de matança redirecionada são células P815 e K562, mas qualquer um de numerosos tipos celulares pode ser utilizado e são bem conhecidos na arte (veja, por exemplo, Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1129-1136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 2065-2072; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188: 953-960; Neri et al. (2001) Clin. Diag. Lab. Immun. 8:1131-1135). Células potencializadas, ativas, ou ativadas também podem ser identificadas por qualquer outra propriedade ou atividade conhecida na arte como associada com atividade NK, tal como produção de citocina (por exemplo IFN-γ e TNF-α) aumenta em níveis de cálcio intracelular livre. Para os propósitos da presente invenção, células NK potencializadas, ativas, ou ativadas referem-se particularmente às células NK in vivo que não são inibidas via estimulação de um receptor inibitório, ou nas quais tal inibição tem sido suplantada, por exemplo, via estimulação de um receptor ativador.
[0048] Como aqui usado, o termo receptor NK ativador refere-se a qualquer molécula sobre a superfície de células NK que, quando estimulado, causa um aumento mensurável em qualquer propriedade ou atividade conhecida na arte como associada com a atividade NK, tal como produção de citocina (por exemplo IFN-γ e TNF-a) aumenta em níveis de cálcio intracelular livre, a capacidade de selecionar células em um ensaio de matança redirecionada como descrito, por exemplo alhures no presente relatório descritivo, ou a capacidade de estimular a proliferação de células NK. O termo receptor NK ativador inclui mas não é limitado a MKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, IL-12R, IL-15R, IL-18R e IL-21R. O termo receptor NK ativador como aqui usado exclui o receptor IL-2 (IL-2R). Métodos de determinar se uma célula NK é ativa ou está se proliferando ou não são descritos com mais detalhe abaixo e são bem conhecidos na arte.
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16/57 [0049] Como aqui usado, o termo receptor NK inibidor ou inibitório refere-se a qualquer molécula sobre a superfície de células NK que, quando estimulada, causa uma diminuição mensurável em qualquer propriedade ou atividade conhecida na arte como associada com a atividade NK, tal como produção de citocina (por exemplo IFN-γ e TNF-α) aumenta em níveis de cálcio intracelular livre, ou a capacidade de lisar células alvo em um ensaio de matança redirecionada como descrito, por exemplo alhures no presente relatório descritivo. Exemplos de tais receptores incluem KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, LILRB1, NKG2A, NKG2C, NKG2E e LILRB5. Métodos de determinar se uma célula NK é ativa ou não são descritos com mais detalha abaixo e são bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na arte.
[0050] Na presente invenção, o termo bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativados de uma célula NK refere-se à capacidade de certos compostos, preferivelmente anticorpos, fragmentos ou derivados dos mesmos, de preferivelmente diretamente interagir com pelo menos um receptor de célula NK ativador ou inibitório, por exemplo KIR, NKG2A/C, NKp30, NKp44, NKp46 e outros aqui listados, e quer neutralizar sinais inibitórios do receptor (no caso de receptores inibitórios) quer estimular a sinalização do receptor (no caso de receptores ativadores. Com receptores inibitórios, preferivelmente o composto, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, é capaz de bloquear a interação entre HLA e o receptor. Quando o composto é um anticorpo, os anticorpos podem ser policlonais ou, preferivelmente, monoclonais. Podem ser produzidos por hibridomas ou por células recombinantes engenhadas para expressarem os domínios constantes e variáveis desejados. Os anticorpos podem ser anticorpos de cadeia única ou outros derivados de anticorpo retendo a especificidade para antígeno e a região de dobradiça inferior ou uma sua variante tal como um fragmento Fab, um fragmento Fab'2, uma CDR e um ScFv. Estes podem ser anticorpos policlonais, anticorpos recombinantes, anticorpos humanizados, ou suas variantes.
[0051] Dentro do contexto desta invenção um determinante comum designa um determinante ou epitopo que é compartilhado por vários membros de um grupo de
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17/57 receptores relacionados, por exemplo, o grupo de receptores KIR2DL humanos. O determinante ou epitopo pode representar um fragmento de peptídeo ou um epitopo conformacional compartilhado pelos citados membros. Em uma modalidade específica, o determinante comum compreende um epitopo reconhecido por anticorpo monoclonal DF200, NKVSF1 ou EB6.
[0052] Dentro do contexto desta invenção, o termo anticorpo que se liga em um determinante comum designa um anticorpo que se liga no citado determinante com especificidade e/ou afinidade, por exemplo, que essencialmente não se liga com afinidade alta ou com especificidade em outros motivos ou determinantes ou estruturas não relacionados na superfície de células NK de humanos. Mais particularmente, a ligação de um anticorpo monoclonal de acordo com esta invenção no citado determinante pode ser discriminada da ligação do citado anticorpo em outro epitopo ou determinante.
[0053] Compostos, preferivelmente anticorpos, capazes de se ligarem em receptores inibitórios de célula NK e de prevenirem sua estimulação são portanto compostos neutralizadores ou inibitórios, preferivelmente anticorpos, no sentido de que bloqueiam, pelo menos parcialmente, a rota de sinalização inibitória mediada por um receptor inibitório de células NK, i.e. receptores KIR ou NKG2A/C. Mais importante, esta atividade inibitória pode ser mostrada com respeito a vários tipos de receptores KIR ou NKG2A/C, de modo que estes compostos, preferivelmente anticorpos, podem ser usados em vários indivíduos com eficácia alta.
[0054] O termo recombinante quando usado com referência, por exemplo, a uma célula, ou um ácido nucleico, uma proteína, ou um vetor, indica que a célula, o ácido nucleico, a proteína ou o vetor, tem sido modificada(o) pela introdução de um ácido nucleico heterólogo ou de uma proteína heteróloga ou pela alteração de uma proteína nativa ou um ácido nucleico nativo, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Portanto, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são diferentemente anormalmente expressados, sub-expressados ou não-expressados.
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18/57 [0055] Dentro do contexto da presente invenção, um indivíduo ou paciente inclui qualquer indivíduo ou paciente mamífero, mais particularmente um indivíduo ou paciente humano.
ANTICORPOS TERAPÊUTICOS [0056] A presente invenção lida com o uso de compostos potencializadores de célula NK conjuntamente com anticorpos terapêuticos. Qualquer um de uma grande variedade de anticorpos terapêuticos pode ser utilizado na presente invenção. Essencialmente, qualquer anticorpo terapêutico, seja nu seja conjugado com um radiomarcador, uma toxina, ou outro grupo, quer de comprimento total quer um fragmento; quer um anticorpo verdadeiro quer um derivado modificado de um anticorpo, pode ser empregado. Preferivelmente, os métodos são usados para intensificar a eficácia das terapias nas quais a atividade de célula NK desempenha um papel - não necessariamente exclusivo - na eficácia de anticorpos terapêuticos administrados, e também preferivelmente os anticorpos ou fragmentos naturalmente incluirão, ou serão modificados para incluírem, uma região Fc humana ou outro domínio que permite o reconhecimento específico do anticorpo por receptores Fc humanos, por exemplo receptores Fc gama.
[0057] Os presentes compostos podem ser usados para intensificar a capacidade de anticorpos terapêuticos para depletar células alvo que expressam um antígeno que é especificamente reconhecido pelos anticorpos terapêuticos. Conseqüentemente, qualquer doença ou condição que seja causada ou exacerbada pelo menos em parte pelas células que podem ser selecionadas por um anticorpo terapêutico pode ser tratada usando os métodos aqui descritos. Exemplos específico de células alvo incluem células de tumor, células infectadas por vírus, células alogênicas, células imunocompetentes patológicas (por exemplo linfócitos B, linfócitos T, células apresentando antígeno, etc.) envolvidas em alergias, doenças autoimunes, reações alogênicas, etc. ou até mesmo células saudáveis (por exemplo, células endoteliais em uma estratégia terapêutica não-angiogênica). Mais preferivelmente células alvo dentro do contexto desta invenção são células de tumor e células infectadas por vírus. Os anticorpos terapêuticos podem, por exemplo,
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19/57 mediar um efeito citotóxico ou lise celular, particularmente por citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC).
[0058] ADCC requer receptores de leucócito para a porção Fc de IgG (FcyR), cuja função é ligar os antígenos IgG-sensibilizados em células citotóxicas possuindo FcyR e disparar um maquinário de ativação celular. Portanto, o anticorpo terapêutico é capaz de formar um complexo imune. Por exemplo, um complexo imune pode ser um alvo de tumor coberto por anticorpos terapêuticos. Mais particularmente, o anticorpo pode ser ligado apenas por CD16, preferivelmente por meio de sua região Fc. Determinação de se um anticorpo terapêutico se liga em um receptor Fcy tal como CD16 pode ser avaliada por qualquer maneira adequada, por exemplo pela determinação da ligação em um polipeptídeo de CD16 ou seu fragmento produzido, opcionalmente imobilizado sobre um suporte, ou por exemplo pela determinação da ligação do anticorpo terapêutico em uma célula que, como sabido ou suspeito, expressa CD16.
[0059] Os anticorpos terapêuticos podem ser policlonais ou, preferivelmente, monoclonais. Podem ser produzidos por hibridomas ou por células recombinantes engenhadas para expressarem os domínios constante ou variável desejados. Os anticorpos podem ser anticorpos de cadeia única ou outros derivados de anticorpo retendo a especificidade para antígeno e a região de dobradiça inferior ou uma sua variante. Estes podem ser anticorpos polifuncionais, anticorpos recombinantes, anticorpos humanizados, seus fragmentos ou suas variantes. O citado fragmento ou um derivado do mesmo é preferivelmente selecionado de um fragmento Fab, um fragmento Fab'2, uma CDR e um ScFv. Preferivelmente um fragmento é um fragmento de ligação de antígeno. Os anticorpos terapêuticos que compreendem um fragmento de anticorpo também podem incluir mas não são limitados aos anticorpos biespecíficos; um exemplo de anticorpo biespecífico adequado compreende uma região de ligação de antígeno específica para CD16 e uma região de ligação de antígeno específica para um antígeno de tumor. Outros formatos de anticorpo compreendendo fragmentos incluem derivados de anticorpo biespecífico recombinante combinando as regiões de ligação de dois anticorpos diferentes em
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20/57 uma cadeia de polipeptídeo única, também referida como BiTETM (Kufer P. et al. TRENDS in Biotechnology 204; 22(5): 238-244; e Baeuerle et al. Current Opinion on Molecular Therapeutics 2003; 5(4): 413-419, cujas descrições são aqui incorporadas como referências.
[0060] Anticorpos terapêuticos são geralmente específicos para antígenos de superfície, por exemplo, antígenos de membrana. Anticorpos terapêuticos mais preferidos são específicos para antígenos de tumor (por exemplo, moléculas especificamente expressadas por células de tumor), tais como CD20, CD52, ErbB2 (ou HER2/(Numeração EU)), CD33, CD22, CD25, MUC-1, CEA, KDR, aVB3, etc., particularmente antígenos de linfoma (por exemplo CD20). Os anticorpos terapêuticos possuem preferivelmente porção Fc de IgG1 ou de IgG3 de primata humano ou de humano, com maior preferência de IgG1 de humano.
[0061] Em uma modalidade, os anticorpos incluirão modificações em sua porção Fc que intensificam a interação do anticorpo com células NK durante ADCC. Tais anticorpos terapêuticos modificados (anticorpos alterados) em geral compreendem modificações preferivelmente, na região Fc que modifica a afinidade de ligação do anticorpo em um ou mais FcyR. Métodos para modificar anticorpos com ligação modificada em um ou mais FcyR são conhecidos na arte, veja, por exemplo, Publicações PCT de Números WO 2004/016750 (Pedido de Patente Internacional PCT/US2003/025399), WO 99/158572, WO 99/151642, WO 98/123289, WO 89/107142, WO 88/107089, e Patentes U.S. 5.843.597 e 5.642.821, cada uma das quais é aqui incorporada em sua totalidade como referência.
[0062] Anticorpos terapêuticos aqui identificados, tal como D2E7 (Cambridge Antibody Technology Group, plc (Cambridge, UK) / BASF (Ludwigshafen, Alemanha)) usados para tratar artrite reumatóide, ou Infliximab (Centocor, Inc., Malvern, PA; usado para tratar doença de Crohn e artrite reumatóide), ou os anticorpos descritos no Pedido de Patente Internacional PCR/US2003/025399 (que é aqui incorporado em sua totalidade como referência) podem ser modificados como ensinado nos pedidos acima e abaixo identificados e usados para o tratamento de doenças para as quais tais anticorpos são topicamente utilizados. Em algumas
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21/57 modalidades, a invenção proporciona anticorpos alterados que têm afinidade alterada, afinidade quer maior quer menor, por um FcyR ativador, por exemplo, FcyRIII. Em certas modalidades, anticorpos alterados possuindo afinidade maior por FcyR são proporcionados. Preferivelmente, tais modificações também possuem uma função efetora mediada por Fc alterada.
[0063] Modificações que afetam a função efetora mediada por Fc são bem conhecidas na arte (veja por exemplo Patente U.S. 5.619.351, que é aqui incorporada em sua totalidade como referência). Os aminoácidos que podem ser modificados incluem mas não são limitados a prolina 329, prolina 331, e lisina 322. Prolina 329 e/ou 331 e lisina 322 podem ser, preferivelmente, substituídas por alanina, contudo, substituição por outro aminoácido também é contemplada. Veja Publicação Internacional WO 00/142072 e Patente U.S. 6.194.551, que são aqui incorporadas em sua totalidade como referências.
[0064] Assim, modificação da região Fc pode compreender uma ou mais alterações nos aminoácidos encontrados na região Fc de anticorpo. Tais alterações podem resultar em um anticorpo com função efetora mediada por anticorpo alterada, uma ligação alterada em outros receptores Fc (por exemplo, receptores de ativação de Fc), uma atividade de ADCC alterada, uma atividade de ligação Clq alterada, uma atividade de citotoxicidade dependente de complemento alterada, ou qualquer combinação das mesmas.
[0065] Em uma modalidade, o anticorpo é especificamente reconhecido por um receptor Fc gama tal como FCGR3A (também chamado de CD16, FCGR3, Receptor III de Fc de Imunoglobulina G; IGFR3, Receptor para Fragmento Fc de IgG, IIIa de Afinidade Baixa; veja, por exemplo OMIM 146740), FCGR2A (também chamado de CD32, CDw32, Receptor para Fragmento Fc de IgG, IIa de Afinidade Baixa, FCG2, Receptor II de Fc de Imunoglobulina G; veja, por exemplo OMIM 146790); FCGR2B (também chamado de CD32, Receptor para Fragmento Fc de IgG, IIb de Afinidade baixa; FCGR2B, FC-Gama-RIIB; veja, por exemplo OMIM 604590), FCG1RA (também chamado de CD64; Receptor para Fragmento Fc de IgG, Ia de Afinidade Alta; IGFR1; veja, por exemplo, OMIM 146760); Fragmento FCGR1 de IgG, Ic de
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Afinidade Alta, receptor IC de Fc de Imunoglobulina G, IGFRC; veja, por exemplo, OMIM 601503); ou FCGR1B (também chamado de CD64, Receptor para Fragmento Fc de IgG, Ib de Afinidade alta; Receptor IB de Fc de Imunoglobulina G,; IGFRB; veja, por exemplo, OMIM 601502).
[0066] Exemplos típicos de anticorpos terapêuticos desta invenção são rituximab, alentuzumab e trastuzumab. Tais anticorpos podem ser utilizados de acordo com protocolos clínicos que têm sido autorizados para uso em indivíduos humanos. Exemplos específicos adicionais de anticorpos terapêuticos incluem, por exemplo, epratuzumab, basiliximab, daclizumab, cetuximab, labetuzumab, sevirumab, tuvurimab, palivizumab, infliximab, omalizumab, efalizumab, natalizumab, clenoliximab, etc. Opcionalmente, quando um composto que estimula um receptor ativador de uma célula NK for uma citocina, o anticorpo terapêutico será um anticorpo diferente de rituximab ou herceptina, ou opcionalmente diferente de um anticorpo anti-CD20 ou anti-HER2/neu. Outros exemplos de anticorpos terapêuticos preferidos para uso de acordo com a invenção incluem anticorpos anti-ferritina (Publicação de Patente U.S. 2002/0106324), anticorpos anti-p140 e anti-sc5 (WO 02/50122), e anticorpos anti-KIR (receptor inibitório de célula matadora) (os receptores KIR são descritos em Carrington e Norman, The MR Gene Cluster, May 3, 2003, disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books), as descrições de cada uma das referências acima sendo aqui incorporadas como referências. Outros exemplos de anticorpos terapêuticos são listados na seguinte tabela, qualquer um dos quais (e outros) pode ser usado nos presentes métodos. Será reconhecido que, independente de estar ou não listado na tabela seguinte ou descrito alhures no presente relatório descritivo, qualquer anticorpo que pode depletar células alvo, preferivelmente por ADCC, pode se beneficiar dos presentes métodos, e que a seguinte Tabela 1 não é exaustiva, nem com respeito aos anticorpos listados nela, nem com respeito aos alvos ou às indicações dos anticorpos que são listados.
Tabela 1: Anticorpos terapêuticos
Especificidade de Ab DCI Nome Comercial Indicações Típicas
Anti-CD20 rituximab MabThera®, NHL B
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Rituxan®
Anti-CD20 Zevalin NHL
Anti-CD20 Bexocar NHL
Anti-CD52 alentuzum ab CAMPATH-1H® CLL, aloenxerto
Anti-CD33 SMART-M195 AML
Anti-CD33 ZamylIM Leucemia mielóide aguda
Anti-antígeno HLA-DR SMART-ID 10 NHL
Anti-HLA-DR RemitogenIM NHL B
Anti-CD22 epratuzum ab LymphoCideIM MHL B
Anti-HER2 MDX-210 Câncer de próstata e outros cânceres
Anti-erbB2 (HER-2/neu) trastuzum ab Herceptin®, Câncer de mama metastático
Anti-CA1l25 OvaRex Câncer de ovário
Anti-MUC I TriAb Câncer de mama metastático
Anti-MUC 1 BravaRex Cânceres metastáticos
Anti-antígeno PEM Theragyn, Therex Câncer de ovário, Câncer de mama
Anti-CD44 bivatuzum ab Câncer de pescoço e cabeça
Anti-gp72 MAb, idiotípico 105AD7 Câncer colorretal
Anti-EpCAM AntiEpCAM; MT201 IS-IL2 Câncer
Anti-VEGF MAbVEGF Câncer colorretal, NSCLC metastático
Anti-CD 18 AMD Fab Degeneração macular relacionada com idade
Anti-CD 18 Anti-CD 18 Infarto do miocárdio
Anti- receptor VEGF IMC-1cl I Câncer colorretal
anti-nuC242 nuC242DMI Câncer colorretal, gástrico e pancreático
Anti-EGFR MAb425 Câncer
Anti-EGFR ABX-EGF Câncer
Anti-EGFR (HER-1, erbB1) cetuximab Cânceres colorretal e ENT
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Anti-MUC-1 Therex® Cânceres epitelial e de mama
Anti-CEA CEAVac Câncer colorretal
Anti-CEA labetuzum ab CEA-CideIM Iumores sólidos
Anti-aV133 Vitaxin Leiomiossarcoma, câncer colorretal e outros cânceres (anti- angiogênicos)
Anti-KDR (VEGFR2) Cânceres (anti- angiogênicos)
anti-proteína de fusão VRS palivizuma b Synagis® Doenças virais
Idem NumaxIM Idem
CMV sevirumab Protovir Infecção por CMV
HBs tuvirumab Ostav irIM Hepatite B
Anti-CD25 basilixima b Simulect® Prevenção/tratamento de rejeição de aloenxerto
Anti-CD25 daclizuma b Zénapax® Prevenção/tratamento de rejeição de aloenxerto
anti-TNF-a, infliximab RemicadeIM Doença de Crohn, artrite reumatóide
anti-CD80 IDEC-114 Psoríase
anti-IgE E-26 Asma alérgica e rinite
anti-IgE omalizuma b XolairIM Asma
anti-IgE Rhu-mAb E25 Alergia/asma
anti-integrina aL (CD11 a, LFA-1) efalizumab XanelimIM Psoríase
Anti-integrina beta 2 LDP-01 Derrame cerebral, rejeição de aloenxerto
anti-integrina aL (CD11a, LFA-1) antiCD11a Psoríase
anti-CD4 keliximab siplizumab MEDI-507 GVHD, Psoríase
Anti-CD4 OKT4A Rejeição de aloenxerto
Anti-CD3 OKT3 Rejeição de aloenxerto
Anti-CD3 SMARTaCD3 Doença autoimune, rejeição de aloenxerto, Psoríase
Anti-CD64 anemia
anti-CD147 GvHD
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anti-integrina «4 (α4β1-α4β7) natalizuma b Antegren® Esclerose múltipla, Crohn
Anti-integrina P7 Crohn, Colite ulcerativa
Alfa 4 beta 7 LDP-02 Colite ulcerativa
Anti-HLA-DR10 beta Oncolym NHL
Anti-CD3 Nuvion Malignidades de célula T
Anti-GD2 gangliosídeo Trigem Melanoma metastático e câncer pulmonar de célula pequena
Anti-antígeno SK- 1 Carcinoma colorretal e pancreático
anti-CD4* clenolixim ab
anti-IL-8 ABX-IL8 Psoríase
Anti-VLA-4 Antegren MS
Anti-CD40L Antova SLE, rejeição de aloenxerto
Anti-CD40L IDEC-131 MS, SLE
Anti-selectina E CDP850 Psoríase
Anti-CD11/CD18 Hu23F2G MS, derrame cerebral
Anti-ICAM-3 ICM3 Psoríase
Anti-CBL ABX-CBL GVHD
Anti-CD 147
Anti-CD23 IDEC-152 Asma, alergias
Anti-CD25 Simulect Rejeição de aloenxerto
Anti-T1-ACY ACY-110 Câncer de mama
Anti-TTS TTS-CD2 Câncer renal, pancreático
Anti-TAG72 AR54 Câncer de pulmão, de ovário, de mama
Anti-CA 19.9 GivaRex Câncer colorretal, pancreático, gástrico
Anti-PSA ProstaRex Câncer de próstata
Anti-HMFG1 R1550 Câncer gástrico, de mama
pentumom ab Theragyn Câncer gástrico, Câncer de ovário
Anti-hCG CTP-16, CTP- 21 Cânceres múltiplos
Anti colágeno de tipos I-V HU177; HUIV26; XL313 Cânceres múltiplos
Anti-CD46 Crucell/J&J Cânceres múltiplos
Anti-17A-1 Edrecolom Panorex Câncer colorretal
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ab
Anti-HM1.24 ARM Mieloma múltiplo
Anti-CD38 Anti-CD38 Mieloma múltiplo
Anti-Receptor IL15 HuMax linfoma Linfoma
Anti-IL6 B-E8 Linfoma
Anti-TRAIL-R1 TRM-1 Cânceres múltiplos
Anti-VEGF2 Cânceres múltiplos
Anti-BlyS Lymphost at Cânceres múltiplos
Anti-SCLC, CEA e DTPA Pentacea Câncer de pulmão
Anti-CD52 CAMPAT H Leucemia, Linfoma
Anti-antígeno Y de Lewis IGN311 Cânceres epiteliais
Anti-caderina VE E4G10 Cânceres múltiplos
Anti-CD56 BB 10901, huN901D C1 Câncer colorretal, câncer de pulmão
Antimertansina/mucin a Cantuzum ab Câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer pancreático
Anti-AFP AFP-cide Câncer de fígado
Anti-CSAp Mu-9 Câncer colorretal
Anti-CD30 MDX-060 Melanoma, doença de Hodgkins
Anti-PSMA MDX-070 Câncer de próstata
Anti-CD 15 MDX-11 Leucemia
Anti-TAG72 MDX-020 Câncer colorretal
Anti-CD19,CD3 bispecífico MT103 Linfoma
Anti-antígeno mesotelina SS1-PE3 8 Câncer de ovário e de cérebro, mesotelioma
Anti-DNA e histona Cotara Cânceres colorretal, pancreático, sarcoma, câncer de cérebro e outros cânceres
Anti-integrina a5B1 Anti-a5 B1 Cânceres múltiplos
Anti-p97 SGN17/19 Melanoma
Anti-CD5 Genimune Leucemia, Linfoma
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COMPOSTOS REGULADORES DE ATIVIDADE DE CÉLULA NK [0067] A atividade de célula NK é regulada por um mecanismo complexo quantidade efetiva envolve ambos os sinais estimulantes e inibitórios. Conseqüentemente, a terapia mediada por célula NK efetiva pode ser realizada tanto por uma estimulação destas células quanto por uma neutralização de sinais inibitórios. Será reconhecido que qualquer composto que possua o efeito de bloquear, inibir, ou diferentemente infra-regular um receptor inibitório de uma célula NK, ou de ativar, estimular, ou diferentemente promover a atividade ou a expressão de um receptor ativador de uma célula NK, pode ser usado. Isto inclui compostos tais como citocinas, bem como moléculas pequenas, polipeptídeos, e anticorpos que podem se ligar em receptores de célula NK e diretamente inibi-las ou estimulá-las. Também será reconhecido que o mecanismo pelo qual os receptores são bloqueados ou estimulados não é crítico para as vantagens proporcionadas pela invenção. Por exemplo, os compostos podem aumentar a expressão de um receptor ativador, ou inibir a expressão de um receptor inibitório, os compostos podem prevenir a interação entre um ligante e um receptor inibitório ou intensificar a interação entre um ligante e um receptor ativador, ou os compostos podem se ligar diretamente nos receptores e inibi-los (no caso de receptores inibitórios) ou ativá-los (no caso de receptores ativadores). O parâmetro crítico é o efeito de que os compostos têm sobre a capacidade de anticorpos terapêuticos para depletar suas células alvo in vivo.
[0068] Qualquer receptor inibitório sobre a superfície de uma célula NK pode ser selecionado pelos presentes compostos. Células NK são negativamente reguladas por receptores inibitórios específicos para complexo de histocompatibilidade maior (MHC) de classe I (Kãrre et al., 1986, Õhlén et al., 1989; cujas descrições são aqui incorporadas como referências). Estes receptores específicos se ligam em determinantes polimórficos de moléculas de complexo de histocompatibilidade maior (MHC) de classe I ou HLA e inibem lise de célula matadora natural (NK). Em humanos, uma família de receptores chamada de receptores Ig-semelhantes de célula matadora (KIRs) reconhecem grupos de alelos de HLA de classe I.
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28/57 [0069] Há vários grupos de receptores KIR, incluindo KIR2DL, KIR2DS, KIR3DL e KIR3DS. Receptores KIR possuindo dois domínios de Ig (KIR2D) identificam alótipos de HLA-C: KIR2DL2 (anteriormente chamado de p58.1) ou o produto de gene proximamente relacionado KIR2DL3 reconhece um epitopo compartilhado por alótipos de HLA-C de grupo 2 (Cw1, 3, 7, e 8), enquanto que KIR2DL1 (p58.2) reconhece um epitopo compartilhado por alótipos de HLA-C de grupo 1 (Cw2, 4, 5, e 6). O reconhecimento por KIR2DL1 é ditado pela presença de um resíduo de Lys na posição 80 de alelos de HLA-C. O reconhecimento de KIR2DL2 e de KIR2DL3 é ditado pela presença de um resíduo de Asn na posição 80. O importante é que a grande maioria de alelos de HLA-C possui um resíduo quer de Asn quer de Lys na posição 80. Um KIR com três domínios de Ig, KIR3DL1 (p70), reconhece um epitopo compartilhado pelos alelos de HLA-Bw4. Finalmente, um homodímero de moléculas com três domínios de Ig KIR3DL2 (p140) reconhece HLA-A3 e -A11.
[0070] Embora KIRs e outros receptores inibitórios de classe I (Moretta et al., 1997; Valiante et al., 1997; Lanier, 1998; cujas descrições são aqui incorporadas como referências) possam ser co-expressados por células NK, em qualquer repertório NK de indivíduo, há células que expressam um único KIR e portanto, as células NK correspondentes são bloqueadas apenas pelas células expressando um grupo de alelos específicos de classe I. Conseqüentemente, como descrito infra, quando receptores inibitórios forem selecionados, os presentes métodos muitas vezes envolverão a administração de compostos que selecionam receptores inibitórios múltiplos, garantindo deste modo um efeito de base ampla que alcança uma variedade máxima de células NK.
[0071] Em certas modalidades, o composto, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, bloqueia um receptor inibitório de uma célula NK, neutralizando o sinal inibitório de pelo menos um receptor inibitório selecionado do grupo consistindo de KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR3DL1, KIR3DL2, NKG2A e NKG2C. Mais preferivelmente, o composto, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, bloqueia um receptor inibitório de uma célula NK, neutralizando o sinal inibitório de pelo menos um receptor inibitório selecionado do grupo consistindo de KIR2DL2,
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KIR2DL3 e/ou KIR2DL1.
[0072] A invenção também contempla o uso de uma combinação de vários compostos, preferivelmente anticorpos ou um seu fragmento, que bloqueiam receptores inibitórios diferentes de células NK. Preferivelmente, compostos, preferivelmente anticorpos ou um seu fragmento, que bloqueiam receptores inibitórios diferentes de células NK são específicos de um receptor inibitório selecionado de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, NKG2A e NKG2C e são capazes de inibir a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por KIR e/ou por NKG2A/C. Por exemplo, os compostos que bloqueiam receptores inibitórios de células NK podem compreende um anticorpo possuindo uma especificidade para KIR2DL1 e um outro possuindo uma especificidade para KIR2DL2 e/ou KIR2DL3. Mais preferivelmente, a combinação de compostos que bloqueiam receptores inibitórios de células NK é capaz de inibir a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. Em outras modalidades, um coquetel de um ou mais compostos selecionadores de um ou mais receptores inibitórios, bem como de um ou mais compostos selecionadores de um ou mais receptores ativadores, será administrado.
[0073] Por exemplo, tem sido mostrado que anticorpos monoclonais específicos para KIR2DL1 bloqueiam os alelos de KIR2DL1 Cw4 (ou semelhantes) (Moretta et al., 1993; cuja descrição é aqui incorporada como referência). Em um outro exemplo, também tem sido descrito que anticorpos monoclonais contra KIR2DL2/3 bloqueiam os alelos de KIR2DL2/3 HLACw3 (ou semelhantes) (Moretta et al., 1993). Tem sido mostrado que anticorpos anti NKG2A bloqueiam a interação inibitória entre NKG2A e HLA-E.
[0074] Opcionalmente, o anticorpo pode ser selecionado do grupo consistindo de GL183 (KIR2DL2, L3, disponível na Immunotech, França e Beckton Dickinson, USA); EB6 (KIR2DL1, disponível na Immunotech, França e Beckton Dickinson, USA); AZ138 (KIR3DL1, disponível com Moretta et al., Univ. Genova, Itália); Q66 (KIR3DL2, disponível na Immunotech, França), Z270 (NKG2A, disponível na Immunotech, França); P25 (NKG2A/C, disponível com Moretta et al., Univ. Genova,
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Itália); e DX9, Z27 (KIR3DL1, disponível na Immunotech, França e Beckton Dickinson, USA).
[0075] Em aspecto preferido, a invenção usa anticorpos monoclonais, bem como seus fragmentos e derivados, no qual o citado anticorpo, fragmento ou derivado reage cruzadamente com vários receptores KIR ou NKG2A/C na superfície de células NK e neutraliza seus sinais inibitórios.
[0076] Em uma modalidade, a invenção usa um anticorpo monoclonal que se liga em um determinante comum de receptores KIR2DL humanos e inibe a rota inibitória correspondente. Preferivelmente, a invenção usa um anticorpo monoclonal que se liga em receptores KIR2DL1 e KIR2DL2/3 na superfície de células NK de humano e inibe a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por KIR2DL1 e KIR2DL2/3. O anticorpo especificamente inibe a ligação de moléculas de HLA-c in vivo. Devido ao fato de KIR2DL1 e KIR2DL3 (ou KIR2DL2/3) serem suficientes para cobrir a maioria dos alótipos de HLA-C, alótipos de HLA-C de grupo 1 e alótipos de HLA-C de grupo 2 respectivamente, tais anticorpos podem ser usados para aumentar a eficiência de um anticorpo terapêutico na maiorias de indivíduos humanos, tipicamente em cerca de 90% dos indivíduos humanos ou mais. Em uma tal modalidade, qualquer um dos anticorpos descritos no Pedido de Patente PCT de Número PCT/FR04/01720 de 1 de julho de 2004, intitulado Compositions and methods for regulating NK cell ativity podem ser usados de acordo com a invenção, cuja descrição é aqui incorporada como referência.
[0077] Em um objetivo específico desta invenção, o anticorpo que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK é um anticorpo monoclonal, no qual o citado anticorpo se liga em um determinante comum de receptores KIR2DL de humano e inibe a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por KIR2DL. O anticorpo mais especificamente se liga em epitopo igual ao do anticorpo monoclonal DF200 ou NKVSF1 produzido por hibridoma b20 e NKVSF1 respectivamente e/ou compete com anticorpo monoclonal DF200 ou NKVSF1 produzido por hibridoma DF200 ou NKVSF1 respectivamente, para se ligar em um receptor KI na superfície de uma célula NK de humano. Como discutido, exemplos de anticorpos, ensaios funcionais e
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31/57 ensaios para determinar se os anticorpos competem pela ligação com os citados anticorpos são descritos no Pedido de Patente PCT de Número PCT/FR 04/01702.
[0078] Em uma modalidade específica, o anticorpo monoclonal é anticorpo monoclonal DF200 produzido por hibridoma DF200. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal é EB6, ou anticorpo que se liga em epitopo igual ao do anticorpo monoclonal EB6, ou compete pela ligação com o anticorpo monoclonal EB6. Em outras modalidades, o anticorpo é um fragmento ou derivado de qualquer um dos anticorpos DF200 ou EB6. O hibridoma produtor de anticorpo DF200 tem estado depositado na coleção de culturas CNCM, como Número de Identificação DF200, Número de registro CNCM I-3224, registrado aos 10 de junho de 2004, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724, Paris Cedex, 15, França. O anticorpo NKVSF1 está disponível em Serotec (Cergy Sainte-Christophe, França), Número de referência de catálogo MCA2243.
[0079] Em outra modalidade da presente invenção, o composto usado para intensificar a eficácia de anticorpos terapêuticos estimula um receptor ativador de uma célula NK. Qualquer receptor ativador pode ser usado, por exemplo NKp30 ('por exemplo, veja PCT WO 01/36630, cuja descrição é aqui incorporada em sua totalidade como referência), NKp44 (veja, por exemplo, Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187:2065-2072, cuja descrição é aqui incorporada em sua totalidade como referência), NKp46 (veja, por exemplo, Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186:11291136; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188:953-960; cujas descrições são aqui incorporadas em suas totalidades como referências), NKG2D (veja, por exemplo, OMIM 602893), IL-12R, IL-15R, IL-18R, IL-21R, ou um receptor KIR ativador, por exemplo um receptor KIR2DS4 receptor (Carrington e Norman, The KIR Gene Cluster, May 3, 2003, disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books), ou qualquer outro receptor presente sobre uma fração substancial de células NK, e cuja ativação acarreta a ativação ou a proliferação de célula, preferivelmente até mesmo se a célula tiver sido inibida via um receptor inibitório tal como um receptor KIR inibitório. O composto pode ser qualquer entidade molecular, incluindo polipeptídeo, moléculas
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32/57 pequenas, e anticorpos. Compostos exemplares incluem quaisquer ligantes, incluindo ligantes naturais, recombinantes ou sintéticos, que interagem com receptores ativadores. Por exemplo, um composto que estimula um receptor ativador de uma célula NK pode ser uma citocina tal como IL-12 que interage com o receptor de IL-12 (IL-12R), IL-15 que interage com o receptor IL-15 (IL-15R), IL-18 que interage com o receptor IL-18 (IL-18R), IL-21 que interage com o receptor IL-21 (IL21R). Tais compostos são conhecidos de por exemplo IL-12 (Research Diagnostics, NJ, DI-212), IL-15 (Research Diagnostics, NJ, RDI-215), IL-21 (Asano et al., FEBS Lett. 2002;528:70-6). Preferivelmente, um composto que estimula um receptor ativador de uma célula NK é um composto diferente de IL-2. Outros compostos exemplares que estimulam um receptor ativador de uma célula NK incluem anticorpos que se ligam em um receptor de célula NK selecionado do grupo consistindo de N430, NKp44, NKp46, NKG2D, KIR2DS4 e outros receptores ativadores KIR.
[0080] Em certas modalidades preferidas, o receptor ativador é um Receptor de Citotoxicidade Natural (NCR) encontrado sobre células NK, preferivelmente o NCR selecionado do grupo consistindo de NKp30, NKp44 ou NKp46, e o composto que estimula um receptor ativador é, se liga em epitopo igual ao de, ou compete pela ligação com qualquer um dos anticorpos monoclonais selecionados do grupo consistindo de AZ20, A76, Z25, Z231, e BAB281.
[0081] A ligação de qualquer composto em qualquer um dos receptores de célula NK aqui descritos pode ser detectada usando qualquer um de uma variedade de métodos padrão. Por exemplo, ensaios do tipo ELISA colorimétricos podem ser usados, do mesmo modo ensaios de imunoprecipitação e radioimunoensaios. Ensaios de competição podem ser empregados, por exemplo para comparar a ligação de um composto de teste em um composto que, como se sabe, se liga em um receptor de célula NK, no qual os compostos de controle (por exemplo, BAB281, que especificamente se liga em NKp46) e os compostos de teste são misturados (ou pré-adsorvidos) e aplicados em uma amostra contendo a proteína contendo epitopo, por exemplo, NKp46 no caso de BAB281. Protocolos baseados em ELISAs,
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33/57 radioimunoensaios, Western blotting e o uso de BIACORE são adequados para utilização em tais estudos de competição simples e são bem conhecidos na arte.
[0082] Inibição de inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por KIR ou NKG2A/C, ou estimulação de ativação de células NK mediada por NKp30, NKp44, NKp46, ou NKG2D podem ser avaliadas por vários ensaios ou testes, tais como ligação, citotoxicidade, ou outros ensaios moleculares ou celulares.
[0083] Em uma variante específica, a atividade inibitória é ilustrada pela capacidade de o citado composto, preferivelmente um anticorpo, reconstituir a lise de clones NK positivos para KIR ou para NKG2A/C, respectivamente, sobre alvos positivos para HLA-C ou para HLA-E. Em outra modalidade específica, o composto, preferivelmente um anticorpo, é definido como inibindo a ligação de moléculas de HLA-C em receptores KIR2DL1 e KIR2DL3 (ou proximamente relacionado KIR2DL2), adicionalmente preferivelmente como sua capacidade para alterar a ligação de uma molécula de HLA selecionada de Cw1, Cw3, Cw7, e Cw8 (ou de uma molécula de HLA-c possuindo um resíduo de na posição 80) em KIR2DL2/3; e a ligação de uma molécula de HLA-C selecionada de Cw2, Cw4, Cw5 e Cw6 (ou de uma molécula de HLA-c possuindo um resíduo de Lys na posição 80) em KIR2DL1.
[0084] A atividade inibitória ou potencializadora de um composto desta invenção, preferivelmente um anticorpo, pode ser avaliada em qualquer um de numerosos modos, por exemplo, por seu efeito sobre cálcio livre intracelular como descrito, por exemplo em Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186:1129-1136, cuja descrição é aqui incorporada como referência. A atividade de célula NK também pode ser avaliada usando um ensaio de citotoxicidade baseado em célula, por exemplo, medição da liberação de cromo, tal como avaliação da capacidade do anticorpo de estimular células NK para matar células alvo tais como células P815, K562, ou células de tumor apropriadas como descritas em Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 11291136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 2065-2072; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188: 953-960; Neri et al. (2001) Clin. Diag. Lab. Immun. 8:1131-1135); Pende et al. (1999) J. Exp. Med. 190: 1505-1516), cujas descrições inteiras são aqui incorporadas como referências. Ensaios de citotoxicidade adequados também são
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34/57 proporcionados na seção de exemplos do presente relatório descritivo. Em uma modalidade preferida, os anticorpos causam aumento de pelo menos 10% em citotoxicidade de NK, preferivelmente um aumento de pelo menos 40% ou 50% em citotoxicidade de NK, ou mais preferivelmente um aumento de pelo menos 70% em citotoxicidade de NK.
[0085] A atividade de célula NK também pode ser endereçada usando ensaio de liberação de citocina, no qual células NK são incubadas com o anticorpo para estimular a produção de citocina das células (por exemplo a produção de IFN-γ e TNF-α). Em um protocolo exemplar, a produção de IFN-γ a partir de PBMC é avaliada por coloração de superfície celular e intracitoplásmica e análise por citometria de fluxo após 4 dias em cultura. Em resumo, Brefeldina A (Sigma Aldrich) é adicionada em uma concentração final de 5 g/mL durante as últimas 4 horas de cultura. As células são então incubadas com mAb anti-CD3 e anti-CD56 antes da permeabilização (IntraPrepTM; Beckman Coulter) e coloração com PE-anti-IFN-γ ou PE-IgG1 (Pharmingen). Produção de GM-CSF e produção de IFN-γ a partir de células NK policlonais ativadas são medidas em sobrenadantes usando g ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN; IFN-γ: OptE1A set, Pharmingen).
[0086] Em uma modalidade preferida, a capacidade do anticorpo de ativar as células NK de humano é avaliada, no qual uma capacidade para ativar células NK de humano pelo menos também de células NK de não-humano indica que os compostos são adequados para uso na presente invenção. Em particular, pode ser avaliada a capacidade do composto para intensificar a capacidade de anticorpos terapêuticos de direcionar a depleção de células alvo adequadas por células NK in vitro ou in vivo.
[0087] Os compostos desta invenção, preferivelmente anticorpos, podem exibir atividade inibitória ou estimulante parcial, por exemplo parcialmente reduzir a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por KIR2DL, ou parcialmente ativar uma célula NK por meio de qualquer nível de estimulação de NCRs ou outros receptores. Compostos mais preferidos são capazes de inibir (ou estimular, no caso
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35/57 de receptores ativadores) pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 30%, 40% ou 50% ou mais da atividade de célula NK, por exemplo, conforme medida em um ensaio de toxicidade celular, em comparação com células na ausência do composto. Também preferido, o composto pode proporcionar um aumento de depleção de células alvo em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, ou mais em relação ao nível de depleção na ausência do composto. Alternativamente, os compostos preferidos desta invenção, preferivelmente anticorpos, são capazes de induzir a lise de população de células alvo autólogas ou compatíveis com HLA ou combinadas, i.e., população de células que não seriam efetivamente lisadas por células NK na ausência de citado anticorpo. Conseqüentemente, compostos desta invenção também podem ser definidos como facilitadores de atividade de célula NK in vivo.
[0088] A invenção também contempla modalidades nas quais compostos que estimulam receptores ativadores, ou, preferivelmente, bloqueiam o receptor inibitório de uma célula NK, são fragmentos de um tal anticorpo monoclonal possuindo substancialmente a mesma especificidade para antígeno, incluindo, sem limitação um fragmento Fab, um fragmento Fab'2, uma CDR e um ScFv. Ainda mais, o anticorpo monoclonal pode ser humanizado, humano, ou quimérico (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou funcionalizado). Embora anticorpos estimulantes de receptores ativadores também possam ser fragmentos, são preferivelmente de comprimento total. Derivados, por exemplo com seqüências modificadas ou com grupos funcionais heterólogos conjugados ou outros compostos, podem ser utilizados para qualquer um dos anticorpos aqui descritos.
[0089] Os anticorpos que bloqueiam o receptor inibitório ou estimulam o receptor ativador de uma célula NK de acordo com a invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas conhecidas na arte. Tipicamente, são produzidos por imunização de um animal não-humano com um imunógeno compreendendo um polipeptídeo KIR, NKG2A/C, NCR (por exemplo NKp30, NKp44, NKp46), ou NKG2D, ou fragmento imunógeno de qualquer um dos polipeptídeos, e coleção de células de baço (para produzir hibridomas por fusão com linhagens celulares apropriadas).
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Métodos de produzir anticorpos monoclonais de várias espécies são bem conhecidos na arte (veja, por exemplo Harlow et al., Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986; cujas descrições são aqui incorporadas como referências). Mais especificamente, estes métodos compreendem imunização de um animal não-humano com o antígeno, seguido por uma recuperação de células de baço que são então fusionadas com células imortalizadas, tais como células de mieloma. Os hibridomas resultantes produzem anticorpos monoclonais e podem ser selecionados por diluições limitantes para isolar clones individuais. Anticorpos também podem ser produzidos pela seleção de bibliotecas combinatórias de imunoglobulinas, como descrito por exemplo em Ward et al. (1989); cuja descrição é aqui incorporada como referência.
[0090] Anticorpos preferidos que bloqueiam o receptor inibitório ou estimulam um receptor ativador de uma célula NK de acordo com a invenção são preparados por imunização com um imunógeno compreendendo um receptor ativador ou inibidor de célula NK, por exemplo um polipeptídeo KIR2DL, com maior preferência um polipeptídeo KIR2DL de humano. O polipeptídeo KIR2DL pode compreender a seqüência de comprimento total de um polipeptídeo KIR2DL de humano, ou um fragmento ou derivado do mesmo, tipicamente um fragmento imunógeno, i.e. uma porção do polipeptídeo compreendendo um epitopo, preferivelmente um epitopo de célula B ou T. Tais fragmentos tipicamente contêm pelo menos 7 aminoácidos consecutivos de seqüência de polipeptídeo madura, ainda mais preferivelmente pelo menos 10 aminoácidos consecutivos da mesma. São essencialmente derivados de domínio extra-celular do receptor. Em uma modalidade preferidas, o imunógeno compreende um polipeptídeo KIR2DL, NCR de humano de tipo selvagem, ou outro polipeptídeo em uma membrana lipídica, tipicamente na superfície de uma célula. Em uma modalidade específica, o imunógeno compreende células NK intactas, particularmente células NK de humano intactas, opcionalmente tratadas ou lisadas.
[0091] Embora os anticorpos terapêuticos possam possuir regiões Fc modificadas se modo a intensificar sua ligação por receptores tal como CD16, em
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37/57 certas modalidades os anticorpos potencializadores de célula NK possuirão regiões Fc alteradas de modo a reduzir sua afinidade por receptores Fc, reduzindo deste modo a possibilidade de que as células NK ligadas pelos anticorpos sejam elas mesmas ligadas e lisadas.
[0092] Anticorpos que bloqueiam os receptores KIR2DL de células NK podem ser produzidos por métodos compreendendo: i) imunizar um animal não-humano com um imunógeno compreendendo um polipeptídeo KIR2DL; ii) preparar anticorpos monoclonais de citado animal imunizado, no qual os citados anticorpos monoclonais se ligam em citado polipeptídeo KIR2DL; iii) selecionar os anticorpos monoclonais da etapa ii) que reagem cruzadamente com pelo menos dois sorotipos diferentes de polipeptídeos KIR2DL; e iv) selecionar anticorpos monoclonais de (c) que inibem a inibição de células NK mediada por KIR2DL.
[0093] A ordem das etapas (iii) e (iv) pode ser mudada. Opcionalmente, o método pode compreender adicionalmente etapas adicionais de preparar fragmentos ou derivados de anticorpo monoclonal, como descrito abaixo.
[0094] Em uma outra variante, o método compreende: i) selecionar, de uma biblioteca ou de um repertório, um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento ou derivado que reage cruzadamente com pelo menos dois sorotipos diferentes de polipeptídeos KIR2DL; e selecionar um anticorpo da etapa i) que inibe a inibição de células NK mediada por KIR2DL.
[0095] Será reconhecido que qualquer um destes métodos pode ser usado para selecionar quaisquer anticorpos ou fragmentos de anticorpo que são específicos para qualquer grupo de receptores (inibitórios ou ativadores) de célula NK compartilhando um ou mais epitopos. Por exemplo, métodos semelhantes podem ser utilizados para a preparação de anticorpos que bloqueiam um receptor KIR3DL ou um receptor NKG2A/C de células NK, ou estimula um receptor ativador de células NK.
[0096] Na modalidade preferida, os animais não-humanos empregados nestes métodos, ou usados na produção de quaisquer anticorpos aqui descritos, é um mamífero, tal como um roedor (por exemplo, camundongo, rato, etc.), bovino,
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38/57 porcino, cavalo, coelho, cabra, ovelha etc.
[0097] Também, qualquer um dos anticorpos aqui descritos pode ser geneticamente modificado ou engenhado para ser adequado para humano, por exemplo anticorpos humanizados, quiméricos, ou humanos. Métodos para humanizar anticorpos são bem conhecidos na arte. Em geral, um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção possui um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos no mesmo a partir de um anticorpo original Estes resíduos de aminoácido de murino ou de não-humano são muitas vezes referidos como resíduos importados, que são tipicamente obtidos de um domínio variável importado. Humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321: 522; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534 (1988)). Em alguns casos, tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (Cabilly et al., Patente U.S. 4.816.567), nos quais substancialmente menos do que um domínio variável de humano intacto tem sido substituído pela seqüência correspondente do anticorpo original. Na prática, anticorpos humanizados de acordo com esta invenção são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos no anticorpo original.
[0098] Outro método de preparar anticorpos monoclonais humanizados é o uso de XenoMouse® (Abenix, Fremont, CA) como o camundongo empregado para imunização. Um XenoMouse é um hospedeiro murino que tem tido seus genes de imunoglobulina substituídos por genes de imunoglobulina de humano funcionais. Assim, anticorpos produzidos por este camundongo ou em hibridomas preparados a partir de célula B deste camundongo, já estão humanizados. O XenoMouse está descrito na Patente U.S. 6.162.963, que é aqui incorporada em sua totalidade como referência. Um método análogo pode ser realizado usando um HuMAb-MouseTM (Medarex).
[0099] Anticorpos humanos também podem ser produzidos de acordo com várias outras técnicas, tais como pelo uso, de imunização, de outros animais transgênicos
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39/57 que têm sido engenhados para expressarem um repertório de anticorpos humanos (Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255), ou pela seleção de repertórios de anticorpos usando métodos de exibição de fago. Tais técnicas são conhecidas por aquelas pessoas experientes na arte e podem ser implementadas partindo de anticorpos monoclonais como descritos no presente pedido.
[0100] Os anticorpos da presente invenção também podem ser derivados de anticorpos quiméricos (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às seqüências correspondentes no anticorpo original, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade bilógica desejada (Cabilly et al., supra; Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 6851).
[0101] Também será reconhecido que quando o composto que bloqueia o receptor inibitório de uma célula NK ou estimula um receptor ativador de uma célula NK for um anticorpo, tal anticorpo poderá ser policlonal ou, preferivelmente, monoclonal. O anticorpo pode ser produzido por um hibridoma ou por uma célula recombinante engenhada para expressar os domínios constantes e variáveis desejados. O anticorpo pode ser um anticorpo de cadeia única ou outro derivado de anticorpo retendo a especificidade para antígeno e a região de dobradiça inferior ou uma sua variante. O anticorpo pode ser um anticorpo polifuncional, anticorpo recombinante, anticorpo humanizado, ou um seu fragmento ou derivado. O citado fragmento ou um derivado do mesmo é preferivelmente selecionado de um fragmento Fab, um fragmento Fab'2, uma CDR ou um ScFc. Preferivelmente um fragmento é um fragmento ligante de antígeno. Um anticorpo que compreende um fragmento de anticorpo também pode incluir mas não se limita aos anticorpos biespecíficos. Um exemplo é um anticorpo biespecífico compreendendo uma região ligante de antígeno específica para um receptor ativador e uma região ligante de antígeno específica para um antígeno de tumor (veja Publicação PCR Número WO 01/71005, cujas descrições são aqui incorporadas como referências).
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COMPOSIÇÃO E ADMINISTRAÇÃO [0102] A invenção refere-se a uma composição compreendendo pelo menos um composto, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, que bloqueia o receptor inibitório ou estimula um receptor ativador de uma célula NK, e um anticorpo terapêutico, ao uso de citada composição para aumentar a eficiência do anticorpo terapêutico, para aumentar ADCC em um indivíduo tratado com um anticorpo terapêutico, ou para tratar um indivíduo possuindo uma doença, mais particularmente uma doença requerendo a depleção das células alvo, preferivelmente células doentes tais como células viralmente infectadas, células de tumor ou outras células patogênicas. Preferivelmente, a doença é selecionada do grupo consistindo de um câncer, uma doença autoimune, uma doença inflamatória, uma doença viral. A doença também se refere a uma rejeição de enxerto, mais particularmente à rejeição de aloenxerto, e doença de hospedeiro versus enxerto (GVHD).
[0103] Mais particularmente, o tratamento da doença requer a depleção das células alvo, preferivelmente de células doentias tais como células viralmente infectadas, células de tumor ou outras células patogênicas. Preferivelmente, a doença é um câncer, uma doença infecciosa ou uma doença imune. Mais preferivelmente, a doença é selecionada do grupo consistindo de um câncer, uma doença autoimune, uma doença inflamatória, uma doença viral. A doença também se refere a uma rejeição de enxerto, mais particularmente à rejeição de aloenxerto, e doença de hospedeiro versus enxerto (GVHD).
[0104] Citadas doenças incluem proliferação neoplásica de células hematopoiéticas. Opcionalmente, as citadas doenças são selecionadas do grupo consistindo de leucemia linfoblástica, leucemia mielógena aguda ou crônica, linfoma de Hodgkin, linfoma de não-Hodgkin, síndrome mielodisplásica, mieloma múltiplo, e leucemia linfocítica crônica. As citadas doenças também incluem cânceres ENT, cânceres colorretais, câncer de mama, câncer epitelial. As citadas doenças incluem infecção por CMV, e hepatite B. As citadas doenças incluem doença de Crohn, artrite reumatóide, asma, psoríase, esclerose múltipla ou diabetes. Em particular,
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41/57 qualquer doença listada na tabela proporcionada supra pode ser tratada.
[0105] O citado anticorpo terapêutico pode ser ligado por CD16, preferivelmente por meio de sua região Fc. Preferivelmente, o citado anticorpo terapêutico possui uma porção Fc de IgG1 ou de IgG3, particularmente um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento, adicionalmente preferivelmente um anticorpo humano, humanizado ou quimérico ou um seu fragmento, por exemplo rituximab.
[0106] O citado composto, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, que bloqueia o receptor inibitório ou estimula um receptor ativador de uma célula NK se liga em pelo menos um dos receptores humanos KIR, NKG2A/C, NCR, ou NKG2D, e quer inibe a inibição relacionada de citotoxicidade de célula NK mediada por KIR2DL, KIR3DL e/ou NKG2A/C, quer estimula a ativação de citotoxicidade de célula NK mediada por NCR ou NKD2D relacionado. Em uma modalidade preferida, um receptor humano KIR2DL é usado, por exemplo um receptor selecionado do grupo consistindo de receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, ou um receptor humano KIR3DL é utilizado, por exemplo um receptor selecionado do grupo consistindo de KIR3DL1 e KIR3DL2.
[0107] Em uma modalidade preferida, o composto potencializador de célula NK se liga em pelo menos um dos receptores humanos KIR2DL e inibe a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por KIR2DL. Preferivelmente, o receptor humano KIR2DL é selecionado do grupo consistindo de receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3. Em uma modalidade preferida, o composto, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, se liga em um determinante comum de receptores humanos KIR2DL e inibe a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por KIR2DL. Mais preferivelmente, o citado composto, preferivelmente um anticorpo, se liga em um determinante comum de receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 e inibe a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3. Em uma modalidade particular, o citado composto, preferivelmente um anticorpo, inibe a ligação de uma molécula de alelo de HLA-C possuindo um resíduo de Lys na posição 80 em um receptor humano KIR2DL1, e a ligação de uma molécula de alelo de HLA-C possuindo um resíduo de Asn na
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42/57 posição 80 em receptores humanos KIR2DL2 e KIR2DL3. Em uma outra modalidade particular, este anticorpo se liga em epitopo igual ao do anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200. Opcionalmente, este anticorpo compete com o anticorpo monoclonal cd200 produzido pelo hibridoma DF200 pela ligação em um receptor KIR na superfície de uma célula NK de humano. Em uma modalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo monoclonal DF200 produzido pelo hibridoma DF200. Em outra modalidade, o anticorpo é, compete com, ou se liga em epitopo igual ao do anticorpo monoclonal DF200.
[0108] A composição de acordo com a presente invenção pode compreender uma combinação de vários compostos, preferivelmente anticorpo ou um seu fragmento, que bloqueiam receptores inibitórios diferentes de células NK, e/ou estimulam um ou mais receptores ativadores de células NK. Preferivelmente, os compostos, preferivelmente anticorpos ou um seu fragmento, que bloqueiam receptores inibitórios de células NK são específicos de um receptor inibitório selecionado de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, NKG2A e NKG2C, e são capazes de inibir a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por KIR ou NKG2A/C. Mais preferivelmente, a combinação de compostos neutralizadores é capaz de inibir a inibição de citotoxicidade de célula NK mediada por KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. Pela provisão de uma combinação de compostos, um número máximo de receptores inibitórios diferentes será bloqueado em um número máximo de pacientes. Também, podem ser usadas as combinações de compostos que estimulam compostos ativadores diferentes (ou, como com os receptores inibitórios, se ligam em epitopos diferentes dentro de um único receptor), por exemplo compostos que juntos acarretam a ativação de qualquer combinação de dois ou mais receptores selecionados do grupo consistindo de NKp30, NKp44, NKp46, e NKG2D. Também, podem ser usadas as combinações compreendendo um ou mais compostos que bloqueiam um receptor inibitório, e um ou mais compostos que estimulam um receptor ativador. Como descrito abaixo, em uma modalidade preferida, uma amostra de células NK pode ser obtida de um paciente antes da aplicação nos presentes métodos, e pode ser avaliada a responsividade
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43/57 das células NK às diferentes combinações de compostos, por exemplo na presença de células alvo e do anticorpo terapêutico.
[0109] Composições desta invenção podem compreender qualquer excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável, tipicamente tampão, soluções isotônicas, suspensão aquosa, opcionalmente suplementadas com agentes estabilizadores, conservantes, etc. Formulações típicas incluem uma solução salina e, opcionalmente, uma molécula estabilizadora ou protetora, tal como uma proteína de peso molecular alto (por exemplo, albumina de soro humano).
[0110] Kits também são proporcionados compreendendo qualquer combinação de um ou mais anticorpos terapêuticos, um ou mais compostos potencializadores de célula NK, e, preferivelmente, instruções para seu uso.
[0111] De acordo com os métodos e as composições da presente invenção, compostos, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, que bloqueiam um receptor inibitório ou estimulam um receptor ativador de uma célula NK e anticorpos terapêuticos são administrados em uma quantidade eficiente ou terapeuticamente eficaz.
[0112] A quantidade eficiente de anticorpos terapêuticos administrada ao recipiente pode estar entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 20 mg/kg. A quantidade eficiente de anticorpo depende contudo da forma do anticorpo (Ig inteira, ou fragmentos), da afinidade do mAb e dos parâmetros farmacocinéticos que têm que ser determinados para cada um dos anticorpos específicos.
[0113] A quantidade eficiente de anticorpos, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, que bloqueiam o receptor inibitório ou estimulam um receptor ativador de uma célula NK administrada ao recipiente pode estar entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 20 mg/kg. A quantidade eficiente de anticorpo depende contudo da forma do anticorpo (Ig inteira, ou fragmentos), da afinidade do mAb e dos parâmetros farmacocinéticos que têm que ser determinados para cada um dos anticorpos específicos.
[0114] Em uma modalidade importante da invenção, o uso dos presentes compostos pode permitir que eficácia terapêutica seja alcançada com doses
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44/57 reduzidas de anticorpos terapêuticos. O uso (por exemplo, dosagem, regime de administração) de anticorpos terapêuticos pode ser limitado por efeitos colaterais, por exemplo, no caso de rituximab, febre, dores de cabeça, respiração difícil, queda na pressão sanguínea, e outros. Conseqüentemente, enquanto que em muitos pacientes uma dose padrão dos anticorpos terapêuticos será administrada conjuntamente com os compostos potencializadores de célula NK aqui descritos (i.e, a dose recomendada na ausência de quaisquer outros compostos), intensificando deste modo a eficácia da dose padrão em pacientes necessitando de eficácia terapêutica ainda maior, em outros pacientes, por exemplo, aqueles severamente afetados por efeitos colaterais, a administração dos presentes compostos permitirá que eficácia terapêutica seja alcançada em uma dose reduzida de anticorpos terapêuticos, evitando-se deste modo os efeitos colaterais. Na prática, um médico experiente será capaz de determinar a dose ideal e o regime de administração do anticorpo terapêutico e do composto potencializador de célula NK para um dado paciente, por exemplo a estratégia terapêutica que será mais apropriada em vista das necessidades específicas e da condição total do paciente. Numerosas referências estão disponíveis para guiar a determinação de dosagens apropriadas, para ambos os anticorpos terapêuticos e os compostos potencializadores de célula NK, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, por Gennaro (2003), ISBN: 0781750253; Goodman e Gilmans The Pharmacological Basis of Therapeutics, por Hardman, Limbird & Gilman (2001), ISBN: 0071354697; Rawlins E. A., editor, Bentley's Textbook of Pharmaceutics, London: Bailliere, Tindall and Cox, (1977); e outras.
[0115] Em uma modalidade, um médico pode gradualmente diminuir a quantidade do anticorpo terapêutico dada conjuntamente com a administração de qualquer um dos presentes compostos potencializadores de célula NK; em termos quer de dosagem quer de freqüência de administração; e monitorar a eficácia do anticorpo terapêutico; por exemplo monitorar a atividade de célula NK; monitorar a presença de células alvo no paciente, monitorar várias indicações clínicas, ou por qualquer outro meio, em vista dos resultados de monitoração, ajustar as
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45/57 concentrações relativas ou os modos de administração dos anticorpos terapêuticos e/ou de composto potencializador de NK para otimizar a eficácia terapêutica e limitar os efeitos colaterais.
[0116] Em outro conjunto de modalidades, células NK serão obtidas do paciente antes da administração do anticorpo terapêutico e dos compostos potencializadores de célula NK (e, se apropriado, durante o tratamento), e avaliadas para determinar o composto ideal ou o grupo de compostos ideal a ser usado para eficácia máxima. Por exemplo, a identidade dos receptores inibitórios ou ativadores presentes sobre as células NK pode ser determinada, e os compostos administrados que especificamente selecionam os receptores mais proeminentes. Alternativamente, as células NK obtidas podem ser incubadas com o anticorpo terapêutico e células alvo, e a capacidade de um ou mais compostos de intensificar a depleção de células alvo pode ser avaliada. Podem ser então selecionados para uso nos presentes métodos de tratamento, na importando quais, um ou mais compostos mais efetivos na intensificação da depleção in vitro.
[0117] Doses adequadas de compostos e/ou de anticorpos terapêuticos também podem ser geralmente determinadas in vitro ou em modelos animais, por exemplo in vitro pela incubação de várias concentrações de um anticorpo terapêutico na presença de células alvo, células NK (preferivelmente células NK de humano), opcionalmente outras células imunes, e variando as concentrações de um ou mais compostos potencializadores de célula NK, e avaliando a extensão ou a taxa de depleção de célula alvo sob as várias condições, usando ensaios padrão (por exemplo, como descritos na seção de exemplos). Alternativamente, podem ser avaliadas doses variadas dos anticorpos terapêuticos podem ser dadas aos modelos animais para doenças tratáveis com os anticorpos (por exemplo um modelo animal de NHL no caso de rituximab), juntamente com doses variadas dos compostos aqui descritos, e a eficácia dos anticorpos (por exemplo conforme determinada por qualquer critério ou ensaio molecular, celular ou clínico adequado) no tratamento de animais.
[0118] A composição de acordo com a presente invenção pode ser injetada
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46/57 diretamente em um indivíduo, tipicamente por rota intravenosa, intraperitoneal, intraarterial, intramuscular ou transdermal. Tem sido mostrado que vários anticorpos monoclonais são eficientes em situações clínicas, tais como Rituxan (Rituximab) ou Xolair (Omalizumab), e regimes de administração semelhantes (i.e., formulações e/ou doses e/ou protocolos de administração) podem ser usados com a composição desta invenção.
[0119] Ainda mais, as composições desta invenção adicionalmente podem compreender ou podem ser usadas em combinação com outros agentes ativos ou programas terapêuticos tais como quimioterapia ou outras imunoterapias, quer simultânea quer seqüencialmente.
[0120] Em certo exemplo preferido, o método da invenção compreende adicionalmente uma ou mais várias injeções de dois ou mais compostos que bloqueiam um receptor inibitório ou estimulam um receptor ativador de uma célula NK. Assim, estes dois ou mais compostos podem ser usados em combinação. Isto pode servir para causar um aumento ainda maior de ADCC e de eficácia de anticorpos terapêuticos, e/ou pode servir para reduzir a dosagem de um composto específico que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador de uma célula NK. Por exemplo, compostos tais como uma IL-2 são, como sabido, tóxicos em doses aumentadas. A invenção portanto preferivelmente proporciona um método de tratamento de uma doença em um indivíduo em necessidade do mesmo compreendendo: a) administrar ao citado indivíduo pelo menos dois compostos, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador de uma célula NK; e b) administrar ao citado indivíduo um anticorpo terapêutico. Por exemplo, um regime preferido é aquele no qual os citados dois compostos são (i) um primeiro composto selecionado do grupo consistindo de um anticorpo que estimula um receptor NCR ou NKG2D ou um receptor ativador KIR, e um anticorpo que bloqueia um receptor inibitório KIR ou NKG2A, e (ii) um segundo compostos selecionado do grupo consistindo de IL-12, IL15, IL-18 e IL-21. A invenção portanto adicionalmente proporciona um método de tratamento de uma doença em um indivíduo em necessidade do mesmo
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47/57 compreendendo: a) administrar ao citado indivíduo um composto de acordo com a invenção, preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento, que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador de uma célula NK; e b) administrar ao citado indivíduo um anticorpo terapêutico; e (c) administrar ao citado indivíduo IL-2. IL-2 está disponível na Research Diagnostics, NJ, RDI-202, ou Chiron Corp. (Emeryville, CA).
[0121] A citocina pode ser administrada de acordo com qualquer método de administração adequado, e pode ser administrada antes, simultaneamente e/ou após a administração do composto que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador de uma célula NK, e antes, simultaneamente, e/ou após a administração de anticorpo terapêutico. Em um exemplo típico, a citocina é administrada diariamente por um período de 5-10 dias, a(s) citocinas) sendo primeiro injetada(s) no mesmo dia que a primeira injeção de composto que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor ativador de uma célula NK. O citado método preferivelmente compreende uma ou duas injeções por dia de citocina(s) pela rota subcutânea.
[0122] A dosagem de citocina será escolhida dependendo da condição do paciente a ser tratado. Em exemplos preferidos, uma dose relativamente baixa de citocina pode ser usada. Por exemplo, uma dose efetiva de uma citocina é tipicamente menor do que 1 milhão de unidades por metro quadrado por dia de citocina(s), quando a composição farmacêutica contendo citocina for usada para injeção subcutânea diária. Em um exemplo preferido, IL-2 é injetada subcutaneamente em doses diárias abaixo de 1 milhão de unidades / m2 por 5 a 10 dias. Outros detalhes de uso de citocinas são descritos na Publicação de Patente Internacional PCT/EP/0314716 e no Pedido de Patente U.S. 60/435.344 intitulado Pharmaceutical compositions having an effect on the proliferation of NK cells and a method using the same, cujas descrições são aqui incorporadas como referências.
[0123] Também será reconhecido que aos anticorpos terapêuticos e os composto potencializadores de célula NK podem ser co-administrados, por exemplo, co-injetados, ou podem ser administrados simultaneamente mas em formulações
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48/57 diferentes, ou podem ser independentemente administrados, por exemplo o composto é administrado horas, dias, ou semanas antes da ou após a administração do composto.
[0124] Outros aspectos e vantagens desta invenção são descritos na seguinte seção experimental, que deve ser considerada ilustrativa e não limitante do escopo deste pedido.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Geração de um anticorpo pan KIR2DL [0125] Purificação de PBLs e geração de linhagens celulares NK clonais ou policlonais [0126] PBLs foram derivados de doadores saudáveis por gradientes de Ficoll Hypaque e depleção de células aderentes em plástico. Para se obterem células NK enriquecidas, PBLs foram incubados com mAbs anti CD3, anti CD4 e anti HLA-DR (30 minutos a 4oC), seguido por glóbulos magnéticos de cabra anti camundongo (Dynal) (30 minutos a 4oC) e seleção imunomagnética por métodos conhecidos na arte (Pende et al. 1999). Células negativas para CD3, negativas para CD4, negativas para DR são cultivadas sobre células alimentadoras irradiadas e 100 U/mL de Interleucina 2 (Proleukin, Chiron Corporation) e 1.5 ng/mL de Fitoemaglutinina A (Gibco BRL) para se obterem populações de células NK policlonais. As células NK são clonadas por diluição limitante e clones de células NK são caracterizados por citometria de fluxo para expressão de receptores de superfície celular.
[0127] Os seguintes clones foram usados neste estudo:
[0128] CP11, CN5 e CN505 são clones positivos para KIR2DL1 e são corados por anticorpos EB6 ou XA-141. CN12 e CP502 são clones positivos para KIR2DL3 e são corados por anticorpo GL183.
ANÁLISE DE CITOMETRIA DE FLUXO [0129] mABs usados foram produzidos em laboratório JT3A (IgG2a, anti CD3), EB6 e HL183 (IgG1 anti KIR2DL1 e KIR2DL3 respectivamente), XA-141 IgM anti KIR2DL1 (mesma especificidade comparado com EB6, anti CD4 (HP2.6) anti DR (D1.12, Ig2a). Em vez de JT3A, HP2.6, e DR1.12, mAbs comercialmente disponíveis
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49/57 de mesmas especificidades podem ser usados por exemplo de Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA. EB6 e GL183 estão comercialmente disponíveis em Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA. CA-141 não está comercialmente disponível mas EB6 pode ser usado para controlar a reconstituição de lise como descrito em (Moretta et al., 1993).
CITOMETRIA DE FLUXO [0130] Células foram coradas com os anticorpos apropriados (30 minutos a 4oC) seguido por anticorpos policlonais conjugados com PE ou FITC anti camundongo (Southern Biotechnology Associates Inc.). Amostras foram analisadas por análise de citofluorométrica em uma aparelhagem FACSAN (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
EXPERIMENTOS DE CITOTOXICIDADE [0131] A atividade citolítica de clones NK foi avaliada por um ensaio de liberação de 51Cr padrão de 4 horas no qual as células NK efetoras foram testadas sobre linhagens celulares positivas para Cw3 ou Cw4 conhecidas por sua sensibilidade à lise por célula NK. Todos os alvos são usados em 5.000 células por cavidade em placa de microtitulação e a razão de efetor para alvo é indicada nas figuras (normalmente 4 efetores por célula alvo). O ensaio de citolítico é realizado com ou sem sobrenadante de anticorpos monoclonais indicados em uma diluição de 1/2. O procedimento é essencialmente igual ao descrito em (Moretta et al., 1993).
GERAÇÃO DE NOVOS MABS [0132] mAbs têm sido gerados por imunização de camundongos Balb C de 5 semanas de idade com linhagens de célula NK monoclonal ou policlonal ativadas como descrito em (Moretta et al., 1990; cuja descrição é aqui incorporada como referência). Após fusões de células diferentes, os mAbs foram primeiro selecionados para sua capacidade de reagir cruzadamente com clones e linhagens celulares NK positivos para EB6 e GL183. Anticorpos monoclonais positivos forma adicionalmente selecionados para sua capacidade de reconstituir lise por clones NK positivos para EB6 ou positivos para GL183 de alvos positivos para Cw4 ou Cw3 respectivamente.
[0133] DF200, um novo anticorpo monoclonal contra um determinante comum de
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50/57 receptores NK humanos KIR2DL [0134] Foi verificado que um dos anticorpos monoclonais, o DF200 mAb, reage com vários membros da família KIR incluindo KIR2DL1, KIR2DL2/3. Com respeito à coloração de células NK com DF200mAb ambas as células KIR2DL1+ e KIR2DL2/3+ foram brilhantemente coradas (figura 1).
[0135] Clones NK expressando um ou outro (ou até mesmo ambos) destes receptores inibitórios específicos para HLA de classe I foram usados como células efetoras contra células alvo expressando um ou mais alelos de HLA-C. Como esperado, clones NK KIR2DL+ mostraram pouca, se alguma, atividade citolítica contra células alvo expressando HLA-Cw4 e clones NK e KIR2DL3+ mostraram pouca ou nenhuma atividade sobre alvos positivos para Cw3. Contudo, na presença de DF200mAb (usado para mascarar seus receptores KIR2DL) clones NK se tornaram incapazes de reconhecer seus ligantes HLA-C e mostraram atividade citolítica forte sobre alvos Cw3 ou Cw4.
[0136] Por exemplo, a linhagem celular C1R (linhagem celular EBV CW4+, ATCC no. CRL 1993) não foi morta pelos clones NK KIR2DL1+ (CN5/CN505), mas a inibição pôde ser efetivamente revertida pelo uso quer de DF200 quer de mAb anti KIR2DL1. Por outro lado clones NK expressando o fenótipo KIR2DL2/3+ KIR2DL1(CN12) eficientemente mataram C1R e esta matança não foi afetada por DF200mAb (figura 2). Resultados semelhantes podem ser obtidos com clones NK positivo para KIR2DL2 ou para KIR2DL3 sobre alvos positivos para Cw3.
[0137] Análise por Biacore de interações de DF200 mAb/KIR2DL1 e DF200mAb/KIR2DL3
MATERIAIS E MÉTODOS [0138] Produção e purificação de proteínas recombinantes. As proteínas recombinantes KIR2DL1 e KIR2DL3 foram produzidas em E. coli. cDNAs codificadores de domínio extracelular inteiro de KIR2DL1 e de KIR2DL3 foram amplificados por PCR a partir de vetor pCDM8 clone 47.11 (Biassoni et al., 1993; cuja descrição é aqui incorporada como referência) e de vetor RSVS(gpt)183 clone 6 (Wagtman et al., 1995; cuja descrição é aqui incorporada como referência)
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51/57 respectivamente, usando os seguintes iniciadores:
[0139] Senso: 5'GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3' [0140] Anti-senso: 5'-CCCAAGCTTGGGTTATGTGACAGAAACAAGCAGTGG-3' [0141] Foram clonados em vetor de expressão pML1 em matriz com uma seqüência codificadora de sinal de biotinilação (Saulquin et al., 2003; cuja descrição é aqui incorporada como referência).
[0142] Expressão de proteína foi realizada em cepa bacteriana BL21(DE3) (Invitrogen). As bactérias transfectadas foram crescidas para OD60o=0,6 a 37oC em meio suplementado com ampicilina (100 úg/mL) e expressão foi induzida por IPTG 1 mM.
[0143] Proteínas foram recuperadas dos corpos de inclusão sob condições desnaturantes (uréia 8 M). Redobramento das proteínas recombinantes foi realizado em tampão Tris 20 mM, pH 7,8, NaCl 150 mM contendo L-arginina (400 mM, Sigma) e β-mercapto-etanol (1 mM) na temperatura ambiente (RT), por diminuição da concentração de uréia em uma diálise de seis etapas (uréia 4, 3, 2, 1, 0,5 e 0 M, respectivamente). Glutationa reduzida e oxidada (5 mM e 0,5 mM, respectivamente, Sigma) foram adicionadas durante as etapas de diálise com uréia 0,5 M e 0 M. Finalmente, as proteínas foram dialisadas extensivamente contra tampão Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM. Proteínas, redobradas, solúveis foram concentradas e então purificadas em uma coluna de exclusão de tamanho Superdex 200 (Pharmacia; AKTA system).
[0144] Análise por Biacore. Medições de ressonância de plasmon de superfície foram realizadas em uma aparelhagem Biacore (Biacore). Em todos os experimentos de Biacore tampão HBS suplementado com 0,05% de tensoativo P20 serviu como tampão de corrida.
[0145] Imobilização de proteína. Proteínas recombinantes KIR2DL1 e KIR2DL3 produzidas como descrito acima foram imobilizadas covalentemente em grupos carboxila na camada de dextrana sobre um Sensor Chip CM5 (Biacore). A superfície do Sensor Chip foi ativada com EDC/NHS (cloridrato de (N-etil-N'-(3-dimetil-amino
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52/57 propil)-carbodiimida e N-hidróxi-succinimida, Biacore). Proteínas, em tampão de copulação (acetato 10 mM, pH 4,5) foram injetadas. Desativação dos grupos ativados restantes foi realizada usando etanol-amina 100 mM pH 8 (Biacore).
[0146] Medições de afinidade. Para medições cinéticas, várias concentrações de anticorpo solúvel (10-7 a 4 x 10-10 M) foram aplicadas na amostra imobilizada. Medições foram realizadas em uma vazão de fluxo contínuo de 20 μL/min. Para cada ciclo, a superfície do Sensor Chip foi regenerada por injeção de 5 μL de NaOH 10 mM, pH 11. O programa BIAlogue Kinetics Evaluation (BIAevaluation 3.1, Biacore) foi usado para análise dos dados.
Resultados [0147] Análise por BIAcore de ligação de DF200 mAb em KIR2DL1 e em KIR2DL3 imobilizadas.
Proteína KD (10-9 M)
KIR2DL1 10,9 ± 3,8
KIR2DL3 2,0 ± 1,9
KD: constante de dissociação [0148] O analito solúvel (40 μL em concentrações variadas) foi injetado em uma vazão de fluxo de 20 μL/min em tampão HBS, sobre camadas de dextrano contendo 500 ou 540 unidades de refletância (RU), e 1.000 ou 700 RU de KIR2DL1 e de KIR2DL3, respectivamente. Dados são representativos de 6 experimentos independentes.
Exemplo 2: Intensificação de ADCC pelo uso de uma combinação de Rituxan e mAb anti KIR [0149] Preparação de clones NK de humano. Células mononucleares sanguíneas depletadas em células T por seleção imunomagnética anti-CD3 negativa (Miltenyi) são plaqueadas sob condições de diluição limitante, ativadas com fitoemaglutinina (PHA) (Biochrom KG, Berlim, Alemanha), e cultivadas com interleucina (IL)-2 (Chiron B. V., Amsterdam, Países-Baixos) e células alimentadoras irradiadas. Eficiências de clonagem são equivalentes em todos os doadores e variam entre 1 em 5 e 1 em 10 células NK plaqueadas. Células NK clonadas são
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53/57 selecionadas para alorreatividade por citotoxicidade de liberação de 51Cr padrão contra linhagem celular linfoblastóide B transformada com vírus Epstein-Barr de tipo HLA conhecido em uma razão de efetor para alvo de 10:1. Clones exibindo > 30% de lise foram classificados como alorreativos. Em geral, clones exibiram quer < 5% quer > 40% de lise.
[0150] Intensificação de ADCC mediada por Rituxan por um clone de célula NK positivo para KIR2DL1 [0151] A atividade citolítica de clone NK é avaliada por um ensaio de liberação de 51Cr padrão, no qual as células NK efetoras foram testadas sobre linhagens celulares EBV positivas para Cw4 ou Cw3 (positivas para CD20), conhecidas por sua sensibilidade à lise por célula NK. Todos os alvos são usados em 5.000 células por cavidade em placa de microtitulação e a razão de efetor (clone de célula NK) para alvo é indicada na figura 3. Em certos experimentos, o anticorpo terapêutico quimérico rituximab anti CD20 (Rituxan, Idec) é adicionado a 5 μg/mL na mistura de efetor/alvo. Em certos experimentos o anticorpo EB6 (anti KIR2DL1) a 10 μg/mL é adicionado na mistura de efetor/alvo.
[0152] Este experimento mostrou que Ritoxan sozinho essencialmente não medeia ADCC pelo clone NK positivo para KIR2DL1 sobre alvo positivo para Cw4. ADCC de clone positivo para KIR2DL1 é elevadamente intensificado na presença de anticorpo anti KIR2DL1.
Exemplo 3 [0153] Intensificação de ADCC mediada por Campath por um clone de célula NK positivo para KIR2DL1 [0154] Em um experimento semelhante àquele descrito no Exemplo 2, blastócitos PHA Cw4+ autólogos foram incubados na presença de células NK mais aluntuzumab (Campath, Berlex), e anticorpo EB6 (a 100 μς/πΐ), ou Campath e EB6. Os resultados, mostrados na figura 4, mostram que a presença de EB6 intensifica dramaticamente a capacidade das células NK de depletarem as células autólogas: aproximadamente 4% das células alvo foram lisadas na presença de Campath sozinho, enquanto que mais do que 30% das células foram lisadas na presença de
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Campath mais EB6.
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[0167] Ward et al. (Nature) 341 (1989) 544.
[0168] Todas publicações e pedidos de patente citados neste relatório descritivo são aqui incorporados como referências em suas totalidades como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse individual e especificamente indicado para ser incorporado como referência.
[0169] Embora a invenção acima tenha sido descrita com algum detalhe por meio de ilustração e de exemplo para os propósitos de clareza de entendimento, será prontamente evidente para uma pessoa experiente na arte à luz dos ensinamentos desta invenção que certas mudanças e modificações podem ser feitas na mesma sem se desviarem do espírito e do escopo das reivindicações apendidas.
[0170] Qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as suas possíveis variações está incluída na invenção a não ser que seja aqui indicado de outra maneira ou claramente diferentemente contradito pelo contexto.
[0171] Os termos um e uma e o e a e referências semelhantes como aqui usados no contexto da descrição da invenção são para serem entendidos como
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56/57 cobrindo tanto o singular quanto o plural a não ser que seja aqui diferentemente indicado ou claramente contradito pelo contexto.
[0172] Recitação de faixas de valores aqui é meramente intencionada para servir como um método estenográfico de referência individual a cada valor separado caindo dentro da faixa, a não ser que seja aqui diferentemente indicado, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se ele fosse aqui individualmente recitado. A não ser que seja indicado de outro modo, todos os valores exatos aqui proporcionados são representativos de valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os valores exatos exemplares proporcionados com respeito a um fator ou a uma medida particular podem ser considerados também proporcionando uma medição aproximada correspondente, modificada por cerca de, onde apropriado).
[0173] Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada a não ser que seja indicado de outra maneira ou diferentemente claramente contradito pelo contexto.
[0174] O uso de qualquer um dos ou de todos os exemplos, ou de linguagem exemplar (por exemplo, tal como) aqui proporcionados, é intencionado meramente para iluminar melhor a invenção e não põe uma limitação sobre o escopo da invenção a não ser que seja indicado de outro modo. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser entendida como indicando que qualquer elemento é essencial para a prática da invenção a não ser que na mesma medida seja explicitamente enunciado.
[0175] A citação e a incorporação de documentos de patente aqui são feitas apenas por conveniência e não refletem qualquer visão de validade, patenteabilidade e/ou executoriedade de tais documentos de patente.
[0176] A descrição aqui de qualquer aspecto ou modalidade da invenção usado termos tais como compreendendo, possuindo, incluindo ou contendo com referência a um elemento ou elementos é intencionada para proporcionar suporte para um aspecto ou uma modalidade semelhante da invenção que consiste de, consiste essencialmente de, ou substancialmente compreende aquele elemento
Petição 870180125090, de 03/09/2018, pág. 69/73
57/57 particular ou aqueles elementos particulares, a não ser que seja enunciado de outro modo ou seja claramente contradito pelo contexto (por exemplo, uma composição aqui descrita como compreendendo um elemento particular deve ser entendida como também descrevendo uma composição consistindo daquele elemento, a não ser que seja enunciado de outro modo ou seja claramente contradito pelo contexto). [0177] Esta invenção inclui todas as modificações e todos os equivalentes do tema recitado nos aspectos ou nas reivindicações aqui apresentados(as) na extensão máxima permitida pela lei aplicável.

Claims (6)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método de selecionar um anticorpo anti KIR2DL ou fragmento de anticorpo de ligação de antígeno que em combinação com um anticorpo terapêutico potencializa o ADCC gerado pelo anticorpo terapêutico contra células alvo, caracterizado pelo fato de que o método compreende:
    i) proporcionar um anticorpo anti KIR2DL ou fragmento de anticorpo de ligação de antígeno que se liga à KIR2DL1 e KIR2DL2/3 e inibe KIR2DL1- e/ou inibição mediada por KIR2DL2/3 de citotoxicidade de célula NK;
    ii) prover um anticorpo terapêutico que pode se ligar pelo CD16 através de sua região Fc, que se liga a um antígeno terapêutico em uma célula alvo, e que depleta dita célula alvo através de ADCC, em que o anticorpo terapêutico tem porções Fc de IgG1 ou de IgG3 de primata não-humano ou humano;
    iii) incubar dito anticorpo terapêutico com dita células alvo especificamente reconhecidas pelo dito anticorpo terapêutico na presença de células NK e na presença ou ausência do dito anticorpo anti KIR2DL ou fragmento de anticorpo de ligação de antígeno;
    iv) avaliar o efeito do dito anticorpo anti KIR2DL ou fragmento de anticorpo de ligação de antígeno na capacidade das ditas células NK de depletarem as ditas células alvo, em que a avaliação compreende comparar o percentual de lise das células alvo na presença de dito anticorpo terapêutico sozinho ou dito anticorpo anti KIR2DL ou fragmento de anticorpo de ligação de antígeno sozinho para o percentual de lise das células alvo na presença de dito anticorpo terapêutico e dito anticorpo anti KIR2DL ou fragmento de anticorpo de ligação de antígeno em combinação; e
    v) selecionar uma combinação de anticorpo anti-KIR2DL ou fragmento de anticorpo de ligação de antígeno e um anticorpo terapêutico para uso como uma combinação terapêutica, em que dita combinação de anticorpo intensifica a capacidade das ditas células NK para depletarem as ditas células alvo via ADCC comparado a qualquer anticorpo sozinho.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de
    Petição 870180167371, de 24/12/2018, pág. 17/21
    2/2 que dito anticorpo anti-KIR2DL ou fragmento de anticorpo de ligação de antígeno intensifica a capacidade do citado anticorpo terapêutico de destruir as citadas células alvo em 30%.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo anti-KIR2DL ou fragmento de anticorpo de ligação de antígeno intensifica a capacidade do dito anticorpo terapêutico de destruir as ditas células alvo em 50%.
  4. 4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo anti-KIR2DL ou fragmento de anticorpo de ligação de antígeno é selecionado do grupo consistindo de um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo humano, e um fragmento de ligação de antígeno de qualquer um dos citados.
  5. 5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as ditas células alvo são células de câncer, células viralmente infectadas, ou células sofrendo um distúrbio autoimune.
  6. 6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo terapêutico é rituximab ou alentuzumab.
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