CN107667173A - 改变微生物种群和改善微生物群 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于抑制细菌种群生长或用于改变细菌混合种群中第一和第二细菌亚群的相对比例的方法、用途、系统、阵列、工程化核苷酸序列和载体。本发明例如对于处理比如用于环境、医疗、食品和饮料应用的微生物是特别有用的。本发明尤其涉及控制工业或家用系统中的基底或流体的微生物影响的腐蚀(MIC)或生物污损的方法。

Description

改变微生物种群和改善微生物群
发明领域
本发明涉及抑制细菌种群生长、改变细菌混合种群中第一和第二种细菌亚群的相对比例的方法；为此目的的核酸阵列和包含阵列的载体。本发明涉及用于修饰宿主细胞核酸的工程化系统、这样系统的组分及这些在工业和医药方面的应用。本发明例如对于处理比如环境、食品和饮料应用方面的微生物是特别有用的。本发明尤其涉及控制工业或家用系统的基底或流体的微生物影响的腐蚀(MIC)或生物污损的方法。本发明还涉及用于这些方法的处理液和载体。在实施方案中，这些方法使用阵列的水平转移。本发明还提供为此目的由可动遗传元件(MGEs)包含的阵列和包含这些阵列的载体。
发明背景
发现抑制细菌种群生长和改变混合物的不同细菌种类的相对比例在广泛的工业和背景中，例如用于处理水道、饮用水或在其它环境背景中具有用途。还发现在人和非人动物(例如牲畜)中改变细菌，用于减少致病性感染或重新平衡肠道或口腔微生物群方面具有用途。最近，人们有兴趣分析人类肠道细菌在不同体重或肥胖情况下的相对比例，或者研究比如克罗恩病等疾病情况下可能的细菌影响。
虽然细菌对噬菌体的先天性免疫机制比比皆是，一种广泛记录的细菌适应性免疫系统为CRISPR/Cas系统。工程化的CRISPR/Cas系统已用于精确修饰从细菌到动物和植物细胞范围内各类原核和真核细胞中的核酸(例如参见Jiang W等(2013))。原核生物(比如细菌和古生菌)编码适应性免疫系统，称为CRISPR/Cas (成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR相关的)，以提供抵御移动的入侵者，比如病毒(例如细菌噬菌体)和质粒。参照Seed等(2013)，其说明了细菌噬菌体(或噬菌体)是地球上最丰富的生物实体，并估计超过其细菌猎物的10倍。噬菌体捕食的不断威胁已导致广泛范围的细菌免疫机制的进化，这转而导致不同的噬菌体免疫逃避策略的进化，导致一个动态的共进化军备竞赛。
宿主免疫是基于入侵者DNA序列在记忆位点(CRISPR阵列)中的结合、自该位点形成引导RNAs及位于邻近的前间区序列邻近基序(PAM)的同源入侵者DNA (前间区)的降解。参见例如WO2010/075424。宿主CRISPR阵列包含各种元素：紧邻一个或多个重复区-间隔区-重复区单元的5’的前导区(包括启动子)，其中重复区相同和间隔区不同。通过自入侵的病毒或质粒核酸采集间隔序列，宿主防御系统能将新的间隔区结合到CRISPR阵列(每个间隔区侧翼为重复区)，以起到记忆作用来应对病毒或质粒的未来入侵。已经观察到，新近采集的间隔区往往在前导区之后被直接插入到宿主阵列中。
参照Heler等(2014)，其说明CRISPR位点及其相关基因(Cas)赋予细菌和古生菌对噬菌体和其它入侵的遗传元件以适应性免疫。任何免疫系统的基本要求是建立既往感染记忆的能力，以便更有效地应对复发性感染。CRISPR-Cas免疫系统的适应性特征依赖于其记忆入侵分子的DNA序列并将其以“间隔区”的形式整合在CRISPR阵列的重复序列之间的能力。间隔区转录产生一种小的反义RNA，后者被RNA引导的Cas核酸酶用于裂解入侵的核酸，以保护细胞免受感染。采集新的间隔区使得CRISPR-Cas免疫系统能够快速适应新的威胁，并因此称为“适应”(即载体序列间隔区采集)。
Seed等(2013)报道了事件的一个显著转折，其中一种噬菌体编码的CRISPR/Cas系统被用于抵抗细菌宿主的噬菌体抑制的染色体岛。噬菌体的成功裂解性感染据报道依赖于CRISPR间隔区与靶染色体岛之间的序列同一性。在没有这种靶向的情况下，噬菌体编码的CRISPR/Cas系统能够采集新间隔区以快速进化，并确保染色体岛的有效靶向以恢复噬菌体复制。Bondy-Denomy等(2012)描述了早期观察到的介导CRISPR/Cas系统的抑制作用的基因实例。在感染铜绿假单胞菌的细菌噬菌体的基因组发现了5种不同的“抗-CRISPR”基因。噬菌体的抗-CRISPR基因的突变使其无法感染具有功能性CRISPR/Cas系统的细菌，并且对CRISPR/Cas靶向的噬菌体的基因组增加同一基因使其能够逃避CRISPR/Cas系统。
不成熟的RNAs自CRISPR阵列转录，并随后成熟形成crRNAs。一些CRISPR/Cas系统还包含编码反式激活RNAs (tracrRNAs)的序列，其能够在不成熟的crRNAs中杂交于重复区以形成pre-crRNAs，借以进一步加工产生成熟的，或crRNAs。cRNAs的结构根据CRISPR/Cas系统包含的类型(I、II或III型)而不同。
CRISPR相关(cas)基因通常与CRISPR阵列相关。广泛的比较基因组学已经鉴定了许多不同的cas基因；40种细菌和古细菌基因组的初步分析表明，可能有45个cas基因家族，只有两种基因(cas1和cas2)普遍存在。cas1和cas2被认为对把新间隔区采集到阵列中是必不可少的，因此在对来自噬菌体或质粒的入侵者核酸出现抗性的机制方面是重要的。Nuñez等(2015)据报道证实了cas1-cas2复合物为催化间隔区DNA采集的最小元件(machinery)，并且其显然说明CRISPR重复区在提供用于cas1-cas2介导的适应性免疫的序列和结构特异性方面的重要性。
CRISPR/Cas系统还包括表达核酸酶(例如Cas9)的序列，这种核酸酶用于切割入侵者核苷酸序列的入侵者核酸相邻的同源识别基序(PAMs)。核酸酶的PAM识别对Cas核酸酶的每一种类型为特异性的。入侵者序列的PAMs可能位于紧邻前间区序列的3’，核酸酶一般切割PAM上游(5’)的3-4个核苷酸。PAM序列的保守性在CRISPR-Cas系统之间不同，并且从进化的角度来看似乎与cas1和前导序列有关。Fineran等(2014)观察到，入侵者可通过在前间区或其邻近PAM的区域(“种子区”)制造点突变，在大肠杆菌K12中逃避I-E型CRISPR-Cas免疫，但是通过在涉及采集的正反馈过程整合新的间隔区(“引发”)，宿主快速恢复免疫功能。迄今为止，在许多I型和II型系统中PAM被充分表征，并且在前间区的突变效应已被记录下来(参见Fineran等(2014)的参考文献5、14、23、46、47)。Fineran等(2014)得出结论，他们的结果证实了PAM和种子序列的关键作用，与先前的工作一致。
Semenova等(2011)研究了种子序列的作用，并且得出结论，在大肠杆菌亚型CRISPR/Cas系统的情况下，crRNA匹配的要求对紧随PAM的种子区是严格的。他们观察到，通过减少crRNA引导的级联复合物对前间区DNA的结合亲合力，种子区的突变废除CRISPR/Cas介导的免疫。
对3种主要类型的适应性免疫中每一种的CRISPR免疫阶段如下：
(1) 采集通过经Cas1和Cas2识别入侵的DNA并裂解前间区开始；
(2) 前间区序列连接至邻近前导序列的同向重复区；和
(3) 单链延伸修复CRISPR并复制同向重复区。
在3种主要类型CRISPR系统的每一种中crRNA加工和干扰阶段发生不同。初级CRISPR转录物由Cas裂解以产生crRNAs。在I型系统中，Cas6e/Cas6f在同向重复区中由发夹环形成的ssRNA和dsRNA的接合点裂解。II型系统使用反式激活(tracr) RNA形成dsRNA，其由Cas9和RNaseIII裂解。III型系统使用Cas6同系物，其在同向重复区中裂解不需要发夹环。在II型和III型系统中，在5’或3’末端进行二次修剪，以产生成熟的crRNAs。成熟的crRNAs与Cas蛋白缔合形成干扰复合物。在I型和II型系统中，crRNA和PAM之间的碱基配对引起入侵DNA的降解。III型系统不需要PAM成功降解，并且在III-A型系统中碱基配对发生在crRNA和mRNA而不是由III-B型系统靶向的DNA之间。
发明陈述
本发明的第一构造
发明者确信他们已首次证实了在微生物群(人类、动物或环境微生物群)中自然共存的混合菌群中的一种特定菌株的种群生长的抑制作用，其具有一个或多个以下特征：
种群生长抑制作用通过
•靶向野生型细胞；
•利用野生型内源性Cas核酸酶活性；
•靶向必需和抗生素抗性基因；
•其中靶标为野生型序列。
发明者已在混合细菌种群证实了这一点，其具有以下特征：
•靶向人类微生物群(比如肠道微生物群)种类的混合种群的细菌生长抑制作用；
•其中种群包含3个不同的种类；
•包括选择性杀伤这些种类中的一种和保留其它种类的细胞；
•在与系统发育密切相关的其它种类(其保留这种抑制作用)存在下靶向细胞生长抑制作用；
•在包括靶标厚壁菌门种类和非厚壁菌门种类的混合种群中靶向细胞生长抑制作用；
•靶向特定的厚壁菌门菌株的细胞生长抑制作用，同时保留混合种群中不同的厚壁菌门种类；
•靶向特定的革兰氏阳性菌菌株的细胞生长抑制作用，同时保留混合种群中不同的革兰氏阳性菌种类；
•靶向致病性(人体内)细菌种类，同时保留共栖的人类肠道细菌种类；
•靶向致病性细菌种类，同时保留益生的人类肠道细菌种类；
•靶向表面上的混合细菌种群的细胞生长抑制作用；
•单独或与多种其它细菌种类联合混合时获得特定细菌种类至少10倍的生长抑制作用；和
•获得特定细菌种类的两种不同菌株的至少10倍的生长抑制作用。
在野生型细胞利用内源性Cas活性的能力对于在生物体(例如人和动物)原位治疗宿主细胞感染和处理环境是非常有用的。采用本发明也可解决野生型(即非工程化或预操控的)细菌种群比如人、动物或植物微生物群的处理。在混合种群影响选择性生长抑制作用的能力对于解决细菌种群比如人、动物或植物微生物群，或者对于解决环境微生物群是有用的。该特征也可用于产生药物(例如用于给予人或动物受试者用于本文公开的任何治疗或预防的细菌细胞移植物；或用于产生包含本发明的细菌种群产物的除草剂或杀虫剂组合物)，其中选择性杀伤可用于选择性地改变混合种群的不同细菌比例，以产生为药物、除草剂或杀虫剂的改变的细菌种群；或者由此产生药物、除草剂或杀虫剂。例如，药物可鼻内移植给人或动物接受者，以影响这种治疗或预防。
在以下样例中，解决了固体表面细菌种群(革兰氏阳性厚壁菌门种群)的生长抑制作用。获得了>10倍的种群生长抑制作用。靶向针对抗生素抗性基因。本发明将用于抑制抗生素抗性细菌的生长，其中靶标序列是抗生素抗性基因的序列。在一个实例中，同时给予工程化核苷酸序列与抗生素可能是有效的。这可在人或动物受试者提供宿主细胞感染的更完整治疗或预防和/或使得减少用于给予人或动物的治疗有效的抗生素剂量。考虑到人们越来越担心过量给予抗生素和在人和动物群体出现耐药性，这是有用的。本发明还发现以下活体外和体外应用：用于处理工业或医用流体、表面、装置或容器(例如食物、消费品、化妆品、个人健康护理产品、石油或石油生产)；或者用于处理水道、水、饮料、食品或化妆品，其中宿主细胞由流体、表面、装置、容器、水道、水、饮料、食品或化妆品包含。本发明还在控制腐蚀、生物膜和生物污损方面发现具有用途。第一种构造因此提供以下概念：
宿主修饰(HM) CRISPR/Cas系统用于改变细菌混合种群中第一和第二细菌亚群的相对比例的用途，第二细菌包含宿主细胞，对每一种宿主细胞系统包含以下(i)-(iv)的组分：
(i) 至少一种编码Cas核酸酶的核酸序列；
(ii) 一种宿主细胞靶标序列和包含间隔序列(HM-间隔区)与编码HM-crRNA的重复区的工程化宿主修饰(HM) CRISPR阵列，HM-crRNA包含杂交于宿主细胞靶标序列，以把所述Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列的序列；
(iii) 一种任选的tracrRNA序列或表达tracrRNA序列的DNA序列；
(iv) 其中所述系统组分在宿主细胞与至少一种转化宿主细胞的核酸载体之间分割(split)，HM-crRNA借以把Cas引导至靶标以修饰宿主细胞内的宿主CRISPR/Cas系统；和
其中靶标序列被Cas修饰，借以杀伤宿主细胞或减少宿主细胞生长。
一种用于权利要求1，用于修饰细菌宿主细胞的靶核苷酸序列的宿主修饰(HM)CRISPR/Cas系统，系统包含以下(i)-(iv)的组分：
(i) 至少一种编码Cas核酸酶的核酸序列；
(ii) 一种宿主细胞靶标序列和包含间隔序列(HM-间隔区)与编码HM-crRNA的重复区的工程化宿主修饰(HM) CRISPR阵列，HM-crRNA包含能够杂交于宿主靶标序列，以把所述Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列的序列；
(iii) 一种任选的tracrRNA序列或用于表达tracrRNA序列的DNA序列；
(iv) 其中所述系统组分在宿主细胞与至少一种可转化宿主细胞的核酸载体之间分割(split)，HM-crRNA借以把Cas引导至靶标以修饰宿主细胞内的宿主CRISPR/Cas系统。
这通过本文样例举例说明，其中我们在混合和非混合细胞种群展示了选择性的宿主细胞生长抑制作用达至少10倍。混合种群模拟在人类微生物群发现的种类和菌株的联合。
细菌宿主细胞种群的野生型内源性Cas核酸酶活性抑制种群生长的用途，其中每一种宿主细胞具有含有野生型Cas核酸酶活性的内源性CRISPR/Cas系统，用途包括转化种群的宿主细胞，其中每一种转化的宿主细胞用工程化核苷酸序列转化，用于提供宿主细胞内的宿主修饰(HM) cRNA或引导RNA (gRNA)，HM-cRNA或gRNA包含能够杂交于宿主细胞靶前间区序列的序列，以把内源性Cas引导至靶标，其中cRNA或gRNA与具有所述野生型核酸酶活性的宿主细胞的内源性Cas核酸酶同源，并且之后的种群宿主细胞生长的转化受到抑制。
宿主修饰(HM) CRISPR/Cas系统用于杀伤或减少细菌宿主细胞生长的用途(任选地用途为依据以上紧接的前述段落的用途)，对每一种宿主细胞系统包含以下(i)-(iv)的组分：
(i) 至少一种编码Cas核酸酶的核酸序列；
(ii) 一种包含间隔序列(HM-间隔区)和编码HM-crRNA的重复区的工程化宿主修饰(HM) CRISPR阵列，HM-crRNA包含杂交于宿主细胞靶标序列，以把所述Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列的序列；
(iii) 一种任选的tracrRNA序列或表达tracrRNA序列的DNA序列；
(iv) 其中所述系统组分在宿主细胞与至少一种转化宿主细胞的核酸载体之间分割(split)，HM-crRNA借以把Cas引导至靶标，以修饰宿主细胞内的靶标序列；
其中Cas核酸酶对宿主细胞为内源性的；并且其中靶标序列被Cas修饰，借以杀伤宿主细胞或减少宿主细胞生长。
因此，HM-cRNA能够杂交于宿主细胞靶标序列，以把所述Cas引导至宿主细胞内的靶表以修饰靶标序列。
在一个备选方案中，HM-crRNA和tracrRNA由单链引导RNA (gRNA)包含。
通过利用内源性Cas核酸酶，本发明的实施方案采用内源性Cas核酸酶活性(即不需要之前的宿主细胞基因修饰来激活或增强核酸酶活性)。因此，在一个实例中，Cas核酸酶被宿主细胞的野生型基因编码。在一个实例中，核酸酶是活性的，以至于不需使宿主细胞内的内源性Cas核酸酶(或Cas核酸酶基因)阻遏物失活即实现细胞杀伤或生长抑制。因此，本发明不需之前的操控即可解决野生型细菌种群带来有效的Cas介导的细胞杀伤或生长下降。因此，当种群在其野生环境(比如水道或者由人类或动物微生物组包含)下时，种群可暴露于cRNA。
在一个实例中，第一种细菌为拟杆菌门(例如拟杆菌属)细胞。在一个实例中，第二种细菌为厚壁菌门细胞。方法例如用于改变肠道微生物种群的比例(例如活体外或体内)，其例如用于治疗或预防体重增加或肥胖症(例如其中第一种细菌为厚壁菌门细胞)。
第一构造也提供：一种改变包含所述亚群的细菌混合种群中第一和第二种细菌亚群的相对比例的方法，其中第一细菌为噬菌体感染的宿主细胞(例如拟杆菌门细胞)和第二细菌(或者不是拟杆菌门细胞)不被所述噬菌体感染，方法包括使混合种群与多种载体以一个或更多个步骤联合，用于把载体核酸引入到宿主细胞中，并使混合种群中的细菌生长，其中所述第一和第二细菌的相对比例被改变；
其中每一种载体包含工程化噬菌体修饰(PM) CRISPR阵列，用于引入到噬菌体感染的宿主细胞，以修饰细胞内所述噬菌体的靶核苷酸序列，
(a) 其中PM-CRISPR阵列包含一个或多个用于表达PM-crRNA的序列和用于在噬菌体感染的宿主细胞序列转录的启动子；和
(b) 其中PM-crRNA能够杂交于噬菌体靶标序列，以引导感染的宿主细胞内的Cas (例如Cas核酸酶)以修饰靶标序列。
在第二构造中，本发明提供：
一种用于修饰宿主细胞的靶核苷酸序列的宿主修饰(HM) CRISPR/Cas系统(例如用于第一构造)，系统包含以下(i)-(iv)的组分：
(i) 至少一种编码Cas核酸酶的核酸序列；
(ii) 一种包含间隔序列(HM-间隔区)和编码HM-crRNA的重复区的工程化宿主修饰(HM) CRISPR阵列，HM-crRNA包含能够杂交于宿主靶标序列，以把所述Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列的序列；
(iii) 一种任选的tracrRNA序列或用于表达tracrRNA序列的DNA序列；
(iv) 其中所述系统组分在宿主细胞与至少一种可转化宿主细胞的核酸载体之间分割(split)，HM-crRNA借以把Cas引导至靶标以修饰宿主细胞内的靶标序列；
其中任选地组分(i)对宿主细胞为内源性的。
第二构造还提供：一种用于第一构造，用于修饰所述噬菌体的基因组的方法的工程化噬菌体-修饰(PM) CRISPR阵列，
(a) 其中PM-CRISPR阵列包含一个或多个用于表达PM-crRNA的序列和用于在噬菌体感染的宿主细胞序列转录的启动子；和
(b) 其中PM-crRNA能够杂交于噬菌体基因组靶标序列，以在感染的宿主细胞内引导Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列。
在一个实例中，噬菌体为拟杆菌门(例如拟杆菌属)噬菌体，例如crAssphage。
在一个实例中，阵列包含CRISPR重复区，其具有宿主细胞CRISPR/Cas系统功能。这有益于增加阵列对细菌混合体中所期望细胞的选择性。这也简化了阵列和含有本发明阵列的载体的产生，因为其可能不必包括编码对宿主细胞内阵列功能需要的一种或多种Cas蛋白(和/或tracrRNA)的庞大核苷酸序列。在一个备选方案中，阵列提供同源Cas9编码序列和任选地同源tracrRNA编码序列。
在第三构造中，本发明提供：
一种包含内源性CRISPR/Cas系统，用于修饰细菌宿主细胞的工程化核酸载体，载体
(a) 包含用于表达多种不同crRNAs (例如单链引导RNAs，即gRNAs)，用于本发明CRISPR/Cas系统或用途的核酸序列；和
(b) 缺乏编码Cas核酸酶的核酸序列，
其中第一所述crRNAs能够杂交于所述宿主细胞内的第一核酸序列；和第二所述crRNAs能够杂交于所述宿主细胞内的第二核酸序列，其中所述第二序列不同于所述第一序列；和
(c) 第一序列由抗生素抗性基因(或其RNA)包含，和第二序列由抗生素抗性基因(或其RNA)包含；任选地其中这些基因是不同的；
(d) 第一序列由抗生素抗性基因(或其RNA)包含，和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含；
(e) 第一序列由必需基因(或其RNA)包含，和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含；或者
(f) 第一序列由致病基因(或其RNA)包含，和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含。
第三构造还提供：一种用于本发明方法的核酸载体(例如质粒、噬菌体或噬菌粒)，载体包含本发明的CRISPR阵列。
在第四构造中，本发明提供：
一种包含用于在宿主细胞修饰宿主细菌细胞(例如致病性细菌细胞，比如以上描述的细菌细胞)基因组或病毒(例如噬菌体)基因组的靶标序列的工程化CRISPR阵列的核酸载体(例如质粒、病毒、噬菌体或噬菌粒)，
(a) 其中CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA (例如作为gRNA提供)的序列和用于在宿主细胞序列转录的启动子；
(b) 其中crRNA能够杂交于靶标序列，以在宿主细胞内引导Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列；
(c) 其中阵列由转座子包含，其能够在不同种类的第一和第二细菌细胞之间水平转移。
在第五构造中，本发明提供：
一种包含或由可动遗传元件(MGE) (其中MGE包含转移起始位点(oriT))和用于在宿主细胞修饰宿主细胞(例如致病性细菌细胞)基因组或病毒(例如前噬菌体)基因组的靶标序列的CRISPR阵列组成的工程化CRISPR核酸载体，
(a) 其中CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的序列和用于在宿主细胞序列转录的启动子；
(b) 其中crRNA能够杂交于靶标序列，以在宿主细胞内引导Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列；
(c) 其中载体能够在以下之间转移：(i) 第一宿主细胞的第一和第二核酸位置之间，其中每一个位置为染色体或质粒上的位置，并且靶标序列由宿主细胞包含，或(ii) 第一和第二宿主细胞之间，其中靶标序列由第一和/或第二宿主细胞包含。
在第六构造中，本发明提供：
一种控制工业或家用系统中基底的微生物影响的腐蚀(MIC)或生物污损的方法，其中基底的表面与介导基底的MIC或生物污损的第一微生物种类的第一宿主细胞种群接触，方法包括
(i) 使种群与多种能够转化或转导细胞的载体接触，每一种载体包含CRISPR阵列，CRISPR阵列借以被引入到宿主细胞中，其中
(a) 每一种CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的核苷酸序列和用于在宿主细胞序列转录的启动子；和
(b) 每一个crRNA能够杂交于宿主细胞的靶标序列，以在宿主细胞内引导Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列(例如切割靶标序列)；靶标序列为介导宿主细胞生存能力的基因序列；和
(ii) 使得所述cRNAs在宿主细胞中于Cas存在下进行表达，从而修饰宿主细胞内的靶标序列，导致宿主细胞生存能力减小并控制所述基底的MIC或生物污损。
在另一个实施方案中提供：
一种控制由原油、天然气或石化产品回收、加工、储存或运输设备包含的基底微生物影响的腐蚀(MIC)或生物污损的方法，其中基底的表面与第一宿主细胞种群接触，其中第一宿主细胞为介导基底的MIC或生物污损的第一种类的硫或硫酸盐还原菌(SRB)、胞外聚合物产生菌(EPSB)、产酸菌(APB)、硫或硫化物氧化菌(SOB)、铁氧化菌(IOB)、锰氧化菌(MOB)、产氨菌(AmPB)或产乙酸菌(AcPB)，其中表面和细胞种群与选自海水、淡水、压裂液或井中液体的液体接触，方法包括：
(i) 通过混合液体与多种能够转化或转导第一宿主细胞的载体，使细胞种群与载体接触，每一种载体包含CRISPR阵列，CRISPR阵列借以被引入到宿主细胞中，其中
(a) 每一种CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的序列和用于在宿主细胞序列转录的启动子；
(b) 每一个crRNA能够杂交于宿主细胞的靶标序列，以在宿主细胞内引导Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列(例如切割靶标序列)；靶标序列为用于介导宿主细胞生存能力的基因序列；
(c) 其中每一种(a)的序列包含用于在第一宿主细胞表达和产生相应crRNA的序列R1-S1-R1’，其中R1为第一CRISPR重复区，R1’为第二CRISPR重复区，和R1或R1’为任选的；和S1为第一CRISPR间隔区，其包含或由与所述第一宿主细胞的靶标序列具有80%或更多同一性的核苷酸序列组成；和
(ii) 使得所述cRNAs在宿主细胞中于Cas存在下进行表达，从而在宿主细胞内修饰靶标序列，导致宿主细胞生存能力减小并控制所述基底的MIC或生物污损。
其它实施方案提供：
一种用于方法的载体，其中第一细胞为硫酸盐还原菌(SRB)细胞，例如脱硫弧菌属或脱硫肠状菌属细胞，载体包含一种或多种用于靶向SRB的CRISPR阵列，其中每一种阵列如在(a)-(c)中那样定义。
在另一个实施方案中提供：一种控制工业或家用系统流体的微生物污损的方法，其中流体包含介导所述生物污损的第一微生物种类的第一宿主细胞种群，方法包括
(i) 使种群与多种能够转化或转导细胞的载体接触，每一种载体包含CRISPR阵列，CRISPR阵列借以被引入到宿主细胞中，其中
(a) 每一种CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的核苷酸序列和用于在宿主细胞序列转录的启动子；和
(b) 每一个crRNA能够杂交于宿主细胞的靶标序列，以在宿主细胞内引导Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列(例如切割靶标序列)；靶标序列为用于介导宿主细胞生存能力的基因序列；和
(ii) 使得所述cRNAs在宿主细胞中于Cas存在下进行表达，从而在宿主细胞内修饰靶标序列，导致宿主细胞生存能力减小并控制所述生物污损。
例如提供：一种控制船舶或船只压载水的细菌生物污损的方法，其中水包含介导所述生物污损的第一微生物种类的第一宿主细胞种群，方法包括
(i) 使种群与多种能够转化或转导细胞的载体接触，每一种载体包含CRISPR阵列，CRISPR阵列借以被引入到宿主细胞中，其中
(a) 每一种CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的序列和用于在宿主细胞序列转录的启动子；和
(b) 每一个crRNA能够杂交于宿主细胞的靶标序列，以引导宿主细胞内的Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列(例如切割靶标序列)；靶标序列为介导宿主细胞生存能力的基因序列；和
(ii) 使得所述cRNAs在宿主细胞中于Cas存在下进行表达，从而在宿主细胞内修饰靶标序列，导致宿主细胞生存能力减小并控制所述生物污损。
其它实施方案提供：包含CRISPR阵列的压载海水(例如海水或集装箱中的海水样品)，其中压载水通过方法得到或可得到。包含压载海水的船舶、船只、海运集装箱或钻井平台。一种用于方法的载体，其中第一细胞为霍乱(例如弧菌属，例如O1或O139)、大肠杆菌或肠球菌种类细胞，载体包含一种或多种用于靶向细胞的CRISPR阵列，其中每一种阵列如在方法的(a)和(b)中定义的那样。
本发明还提供适合用于该第六构造或用于其它应用比如用于医疗用途或者用于食品或饮料处理的载体和CRISPR阵列。为此提供：一种包含用于引入到细菌宿主细胞的CRISPR阵列的载体，其中细菌能够经水传播，其中
(a) CRISPR阵列包含用于表达crRNA的序列和用于在所述宿主细胞序列转录的启动子；
(b) crRNA能够杂交于宿主细胞靶标序列，以在宿主细胞内引导Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列(例如切割靶标序列)；靶标序列为用于介导宿主细胞生存能力的核苷酸序列；
(c) 其中(a)的序列包含用于表达和产生crRNA的序列R1-S1-R1’，其中R1为第一CRISPR重复区，R1’为第二CRISPR重复区，和R1或R1’为任选的；和S1为第一CRISPR间隔区，其包含或由与宿主细胞靶标序列具有80%或更多同一性的核苷酸序列组成。
还提供：一种包含多种这样载体的水或食品处理组合物。一种用于在人治疗或预防细菌感染(例如霍乱弧菌感染)的药物，药物包含多种这样的载体。本发明还提供细菌种群、组合物、食品和饮料。例如食品或饮料为乳制品。
在第七构造中，本发明提供：
在第一方面：
一种修饰编码第一Cas的可表达基因的方法，方法包括：
(a) 在自所述基因表达的第一Cas存在下使引导RNA (gRNA1)与Cas基因联合；和
(b) 使得gRNA1杂交于所述Cas基因的序列(例如启动子或其第一Cas编码DNA序列)，并把第一Cas引导至基因，Cas借以修饰Cas基因。
例如用于方法的第一核酸载体或载体的联合，其中
(a) 第一载体或所述联合的载体包含编码引导RNA (gRNA1，例如单链gRNA)的可表达核苷酸序列，引导RNA与预定的前间区序列(PS1)互补，用于引导第一Cas在第一位点(CS1)修饰PS1，其中PS1为与第一Cas同源的邻接PAM (P1)；或者可表达序列编码与tracrRNA一起形成gRNA1的crRNA；和
(b) PS1和P1为可表达的第一Cas编码基因的序列，并且PS1能够在CS1被第一Cas修饰。
本发明的这些方面对于例如在细胞或体外调控Cas活性是有用的。本发明涉及靶向Cas编码基因以限制Cas活性，这对于Cas的暂时调控是有利的。本发明也可用于其中增加Cas活性严格性为合乎需要的环境下，例如在修饰细胞基因组时减少Cas切割脱靶的机会。例如在修饰人类、动物或植物细胞应用时，例如对于细胞或组织或者包含细胞的生物体的基因疗法或基因靶向的脱靶效应应最大限度地减小或者避免。例如，当采用Cas修饰在人类细胞(例如iPS细胞)进行期望的改变时(其被给予患者用于基因疗法或者用于在人治疗或预防疾病或病症)，需要非常高的严格性。本公开提供这些应用作为本发明方法和产物的部分。
本发明也解决载体，特别是病毒载体中插入能力有限的问题。
因此，本发明的第八构造提供：
一种包含编码CRISPR/Cas系统组分的多于1.4kb外源性DNA序列的核酸载体，其中序列包含用于在宿主细胞(任何一种本文细胞，例如人类、动物或者细菌或古细菌宿主细胞)表达一种或多种HM-或PM-crRNAs或gRNAs的工程化阵列或工程化序列(任选地如本文描述的那样)，其中阵列或工程化序列不包含编码Cas核酸酶，与cRNA(s)或gRNA(s)同源的核苷酸序列；任选地其中至少2、3或4种cRNAs或gRNAs由外源性DNA编码。
一种包含多于1.4kb或多于4.2kb外源性DNA序列的核酸载体，其中外源性DNA编码CRISPR/Cas系统的一种或多种组分，并且包含用于在宿主细胞表达一种或多种HM-crRNAs或gRNAs的工程化阵列或序列(例如本文描述的任何这种工程化阵列或序列)，其中外源性序列没有编码Cas核酸酶，与cRNA(s)或gRNA(s)同源的核苷酸序列；任选地其中至少2种不同的cRNAs或gRNAs由外源性DNA编码。
本文在任何构造中，例如cRNA(s)由一种或多种单链引导RNAs (gRNAs)提供，并且在这种情况下“CRISPR阵列”可指一种或多种编码所述gRNA(s)的可表达核苷酸序列。因此，序列能够在用于在细胞内表达gRNA(s)的宿主细胞内表达。
本发明主要就细菌而言进行描述，但是其也可进行必要的变更适用于古生菌。
关于一种本文构造的任何特征，在一个实例中与本发明的不同构造联合，在本文的一项或多项权利要求中可能包含这样的联合。
附图简述
图1：木糖诱导系统。
图2：ST1-CRISPR阵列。
图3：在该项工作中使用的菌株在TH-琼脂上进行斑点检测。所有菌株在37℃下，于TH-琼脂上生长20小时。对大肠杆菌、乳酸乳球菌和变形链球菌一式两份，和对嗜热链球菌的两个菌株一式三份，对过夜培养物连续稀释，以计数各菌落。
图4：嗜热链球菌、变形链球菌、乳酸乳球菌和大肠杆菌在不同培养条件下的选择性生长。四环素不能用于使嗜热链球菌LMD-9选择性生长。然而，3g l-1的PEA被证明使嗜热链球菌LMD-9选择性生长，同时限制大肠杆菌的生长。
图5：基于野生型巨大芽胞杆菌操纵子(左侧)构建两种木糖诱导盒(中间，右侧)。(Xie等，2013)
图6：表征含质粒pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha的嗜热链球菌LMD-9的木糖诱导盒。随着木糖的量增加可观察到明显的荧光反应。
图7：以pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA设计CRISPR阵列。阵列含有2个在诱导型木糖启动子下靶向嗜热链球菌基因和在强组成型启动子P3A下靶向tracrRNA的间隔序列。
图8：嗜热链球菌LMD-9用质粒pBAV1KT5-XylR-mCherry-P ldha+XylA (左侧)和用pBAV1KT5-XylR-CRISPR-P XylA (右侧)的转化效率。
图9：木糖诱导型CRISPR装置的图解视图。在木糖诱导时，靶向嗜热链球菌LMD-9基因组的polIII和tetA两者的CRISPR阵列被表达。与组成型表达的tracrRNA一起，与Cas9形成复合物。该复合物在嗜热链球菌LMD-9基因组的tetA和polIII基因中引入双链断裂，导致细胞生存能力有限。
图10：嗜热链球菌DSM 20617(T)用质粒pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PXylA (左侧)或pBAV1KT5-XylR-CRISPR-Pldha+XylA (右侧)的生长抑制作用。无诱导的(上图)和诱导的(下图)。温育63H后拍摄照片。左下角为菌落计数(上面一行：>1000，>1000，底下一行：336,113)。
图11：嗜热链球菌、乳酸乳球菌和大肠杆菌的16S序列的最大似然系统发生树。
图12：显示含有pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA或pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA质粒的大肠杆菌、乳酸乳球菌和嗜热链球菌共同培养中的选择性嗜热链球菌生长抑制作用。在含有pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA或pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA质粒的大肠杆菌之间没有观察到生长差异(中间一列)。然而，嗜热链球菌(在用2.5 gl-1 PEA补充的TH琼脂上选择性生长，最后一列)显示正如我们预期的那样，在pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA (强)或pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA +XylA (弱)质粒之间转化效率降低。我们因此证实了细胞混合群中靶嗜热链球菌亚群的选择性生长抑制作用。左下角为菌落计数(上面一行：>1000，>1000，68，底下一行：>1000，>1000，32)。
详述
抑制微生物种群生长和改变微生物比例
本发明涉及用于抑制细菌种群生长或改变细菌混合种群中第一和第二种细菌亚群的相对比例，例如改变人类或动物微生物组，比如改变人类微生物群中拟杆菌门(例如拟杆菌属)、厚壁菌门和/或革兰氏阳性或阴性菌的比例的方法、用途、系统、阵列、cRNAs、gRNAs和载体。参见例如本文描述的第一-第三构造。本发明例如涉及修饰宿主细菌细胞例如拟杆菌门细胞或厚壁菌门细胞的一种或多种靶核苷酸序列。
已有多项研究指出，两种主要肠道门类(拟杆菌门和厚壁菌门)的相应水平与人类和无菌小鼠两者的肥胖有关。研究的作者推断碳水化合物代谢是重要因素。他们观察到肥胖个体的微生物群为厚壁菌门的细菌富集更多，和拟杆菌门富集较少，并且他们推测这种细菌混合体在自给定的饮食获取能量方面比精瘦个体的微生物群(其比例相反)更有效。在一些研究中，他们发现当肥胖个体减肥，并且进一步当肥胖小鼠的微生物群转移到无菌小鼠时，拟杆菌门的相对丰度增加，这些小鼠比接受精瘦小鼠微生物群的对照组获得更多脂肪。参见例如，Turnbaugh, P.J., R.E. Ley, M.A. Mahowald, V. Magrini, E.R.Mardis, and J.I. Gordon. 2006,“An obesity-associated gut microbiome withincreased capacity for energy harvest (肥胖相关的肠道微生物组能量收获能力增加)”, Nature 444:1027-1131。
概念
本发明提供以下涉及宿主细胞靶标的概念：
1. 宿主修饰(HM) CRISPR/Cas系统用于杀伤或减少细菌宿主细胞的生长的用途，对每一种宿主细胞，系统包含以下(i)-(iv)的组分：
(i) 至少一种编码Cas核酸酶的核酸序列；
(ii) 一种包含间隔序列(HM-间隔区)和编码HM-crRNA的重复区的工程化宿主修饰(HM) CRISPR阵列，HM-crRNA包含杂交于宿主细胞靶序列，以把所述Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列的序列；
(iii) 一种任选的tracrRNA序列或表达tracrRNA序列的DNA序列；
(iv) 其中所述系统组分在宿主细胞与至少一种转化宿主细胞的核酸载体之间分割(split)，HM-crRNA借以把Cas引导至靶标，以修饰宿主细胞内的靶标序列；
其中Cas核酸酶对宿主细胞为内源性的；并且其中靶标序列被Cas修饰，借以杀伤宿主细胞或者减少宿主细胞生长。
概念1或者提供：
宿主修饰(HM) CRISPR/Cas系统用于改变细菌混合种群中第一和第二种细菌亚群的相对比例的用途，第二细菌包含宿主细胞，对每一种宿主细胞，系统包含以下(i)-(iv)的组分：
(i) 至少一种编码Cas核酸酶的核酸序列；
(ii) 一种包含间隔序列(HM-间隔区)和编码HM-crRNA的重复区的工程化宿主修饰(HM) CRISPR阵列，HM-crRNA包含杂交于宿主细胞靶序列，以把所述Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列的序列；
(iii) 一种任选的tracrRNA序列或表达tracrRNA序列的DNA序列；
(iv) 其中所述系统组分在宿主细胞与至少一种转化宿主细胞的核酸载体之间分割(split)，HM-crRNA借以把Cas引导至靶标，以修饰宿主细胞内的靶标序列；
其中任选地Cas核酸酶对宿主细胞为内源性的；和
其中靶标序列被Cas修饰，借以杀伤宿主细胞或者减少宿主细胞生长。
概念1还提供：一种改变细菌混合种群中第一和第二细菌亚群的相对比例的方法，第二细菌包含宿主细胞，并且方法包括使混合种群与宿主修饰(HM) CRISPR/Cas系统联合，借以杀伤第二细菌宿主细胞或者减少所述细胞生长，从而改变所述比例，
其中对每一种宿主细胞，系统包含以下(i)-(iv)的组分：
(i) 至少一种编码Cas核酸酶的核酸序列；
(ii) 一种包含间隔序列(HM-间隔区)和编码HM-crRNA的重复区的工程化宿主修饰(HM) CRISPR阵列，HM-crRNA包含杂交于宿主细胞靶序列，以把所述Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列的序列；
(iii) 一种任选的tracrRNA序列或表达tracrRNA序列的DNA序列；
(iv) 其中所述系统组分在宿主细胞与至少一种转化宿主细胞的核酸载体之间分割(split)，HM-crRNA借以把Cas引导至靶标，以修饰宿主细胞内的靶标序列；
其中任选地Cas核酸酶对宿主细胞为内源性的；和
其中靶标序列被Cas修饰，借以杀伤宿主细胞或者减少宿主细胞生长。
概念1还提供：
宿主修饰(HM) CRISPR/Cas系统用于改变细菌混合种群中第一和第二细菌亚群的相对比例的用途，第二细菌包含多种宿主细胞，每一种包含靶前间区序列，对每一种宿主细胞，系统包含以上定义的组分(ii)和(iii)，系统进一步包含至少一种编码Cas核酸酶的核酸序列；其中所述组分(ii)和所述Cas编码序列由至少一种转化宿主细胞的核酸载体包含，HM-crRNA借以通过(i)把Cas引导至靶标以修饰宿主细胞内的靶标序列进行编码。
其中Cas核酸酶对宿主细胞为内源性的；和其中靶标序列被Cas修饰，借以杀伤宿主细胞或者减少宿主细胞生长。
在一个实施方案中，第一细菌的生长不受抑制；或者所述宿主细胞的生长抑制作用为第一细胞生长抑制作用的至少2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、50x、100x或1000x。生长抑制作用可作为抑制作用倍数或作为抑制作用百分数计算(如本文描述的那样)。在另一个实例中，抑制作用以培养样品用分光光度计测量，其中在预定的crRNA/gRNA处理周期开始和结束时测定光吸收(例如在OD600) (当通过倍数或百分数测定抑制作用时参见这样周期的描述)。在一个实例中，宿主细胞样品的吸光度增加(比较预定周期开始时的吸光度与所述周期结束时的吸光度)少于对照组样品(其没有暴露于所述cRNA或gRNA)，例如前者的增加比后者低至少10、100、1000、10000或100000倍(例如作为OD600测定)。在一个实例中，在每一个样品的中期指数生长阶段(例如预定周期开始后6-7小时)进行生长抑制作用测定(即预定周期结束)。
在一个实例中，宿主细胞由生物体或环境所包含的微生物种群(例如水道微生物群、水微生物群、人类或动物肠道微生物群、人类或动物口腔微生物群、人类或动物阴道微生物群、人类或动物皮肤或毛发微生物群或者人类或动物腋窝微生物群)包含，种群包含与生物体或环境共生或共栖的第一细菌和包含所述宿主细胞的第二细菌，其中宿主细胞对生物体或环境是有害的(例如致病性的)。在一个实施方案中，种群为活体外的。
第一细菌亚群与第二细菌亚群的比例增加。
概念1还提供如以下进一步描述的那样用于抑制宿主细胞生长的用途。
2. 一种用于修饰宿主细胞的靶核苷酸序列(例如用于概念1的用途)的宿主修饰(HM) CRISPR/Cas系统，系统包含以下(i)-(iv)的组分：
(i) 至少一种编码Cas核酸酶的核酸序列；
(ii) 一种包含间隔序列(HM-间隔区)和编码HM-crRNA的重复区的工程化宿主修饰(HM) CRISPR阵列，HM-crRNA包含能够杂交于宿主靶标序列，以把所述Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列的序列；
(iii) 一种任选的tracrRNA序列或表达tracrRNA序列的DNA序列；
(iv) 其中所述系统组分在宿主细胞与至少一种可转化宿主细胞的核酸载体之间分割(split)，HM-crRNA借以把Cas引导至靶标，以修饰宿主细胞内的靶标序列；
其中任选地组分(i)对宿主细胞为内源性的。
在一个备选方案中，HM-crRNA和tracrRNA由单链引导RNA (gRNA)包含。
通过利用内源性Cas核酸酶，本发明的实施方案利用内源性Cas核酸酶活性(即不需要之前的宿主细胞基因修饰来激活或增强核酸酶活性)。因此，在一个实例中，Cas核酸酶被宿主细胞的野生型基因编码。在一个实例中，核酸酶是活性的，以至于不需抑制宿主细胞内的内源性Cas核酸酶(或Cas核酸酶基因)阻遏物即实现细胞杀伤或生长下降。因此，本发明不需之前的操控即可解决野生型细菌种群带来有效的Cas介导的细胞杀伤或生长下降。因此，当种群在其野生环境(比如水道或者由人类或动物微生物包含)下，种群可暴露于cRNA。
在一个实例中，第二细菌为拟杆菌门(例如拟杆菌属)细胞。在一个实例中，第二细菌为厚壁菌门细胞。用途、系统或方法例如用于改变肠道微生物种群(例如活体外或体内)的比例，其例如用于治疗或预防体重增加或肥胖症(例如其中第二细菌为厚壁菌门细胞)。
在一个实例中，用途、方法、系统、载体、工程化核苷酸序列、cRNA或gRNA用于人类或非人动物的治疗性或预防性的微生物群(包括混合种群)再平衡，例如用于治疗或预防肥胖症、糖尿病、炎症性肠病(IBD) 、胃肠道病症或口腔病症。
在一个实例中，本文涉及的微生物群为人类或动物微生物组(例如肠道、阴道、头皮、腋窝、皮肤血流、喉咙或口腔微生物组)的微生物群。
在一个实例中，本文涉及的微生物群为腋窝微生物群，并且用途、方法、系统、载体、工程化核苷酸序列、cRNA或gRNA用于预防或减少人的体味。
在一个实例中，宿主细胞种群或混合种群由供人类消费的饮料或水(例如水道或饮用水)含有(harboured)。
在一个实例中，用途、方法、系统、载体、工程化核苷酸序列、cRNA或gRNA用于减少致病性感染或者用于肠道或口腔微生物群再平衡，例如用于在人或动物治疗或预防肥胖症或疾病。例如，用途、方法、系统、载体、工程化核苷酸序列、cRNA或gRNA用于敲落肠道微生物群中的难辨梭状芽胞杆菌。
在一个实例中，第一细菌为拟杆菌属细菌和第二细菌为厚壁菌门或病原菌例如肠道细菌。在一个实例中，宿主细胞或第二细菌为例如选自链球菌属(例如嗜热链球菌和/或化脓性链球菌)、芽孢杆菌属、乳杆菌属、李斯特氏菌属、梭菌属、太阳杆菌属和葡萄球菌属细胞的厚壁菌门细胞。在一个实例中，混合种群含有拟杆菌属和耐甲硝哒唑(MTZ)的难辨梭状芽胞杆菌菌株630亚群，其中宿主细胞包含所述难辨梭状芽胞杆菌细胞。
在一个实例中，宿主细胞种群、混合种群或系统由用于给予人或非人动物的组合物(例如饮料、漱口水或食品)包含，用于其肠道或口腔微生物群栖居和再平衡。
在一个实例中，用途或方法、或系统、载体、工程化核苷酸序列、cRNA或gRNA的产物用于经黏膜、肠道、口腔、鼻内、直肠内、阴道内、眼或颊给予来给予人或非人动物。
在任何一种本文构造的实例中，混合种群(在与阵列、gRNA、crRNA或工程化序列联合之前)为人或动物受试者的微生物群，例如肠道或本文公开的任何其它微生物群或本文公开的任何微生物组的微生物群的样品。在一个实例中，在这种情况下，本发明用途的产物为用于如本文公开的人或动物受试者的治疗或疗法的修饰的微生物种群。
3. 概念2的系统，其中载体或多种载体缺乏Cas (例如Cas9)核酸酶编码序列。
4. 任何一项前述概念的用途、方法或系统，其中每一种宿主细胞属于人类微生物群中发现的菌株或种类，任选地其中宿主细胞与不同菌株或种类的细胞混合，其中不同细胞为肠杆菌科或为益生的、与人类共栖或共生(例如在人类肠道)的细菌。在一个实例中，宿主细胞为厚壁菌门例如链球菌属细胞。
5. 用于改变混合细菌种群(例如在人类，比如在人类微生物群)中拟杆菌门(例如拟杆菌属)细菌比例的任何一项前述概念的用途、方法或系统。
6. 用于增加拟杆菌门相对于厚壁菌门的相对比例的概念5的用途、方法或系统。
7. 任何一项前述概念的用途、方法或系统，其中所述Cas核酸酶由细胞的内源性II型CRISPR/Cas系统提供。
8. 任何一项前述概念的用途、方法或系统，其中组分(iii)对宿主细胞为内源性的。
9. 任何一项前述概念的用途、方法或系统，其中靶标序列由宿主细胞的抗生素抗性基因、致病基因或必需基因包含。
10. 任何一项前述概念的用途、方法或系统，阵列由抗生素组合物包含，其中阵列与抗生素组合。
11. 任何一项前述概念的用途、方法或系统，其中可选择地，HM-crRNA和tracrRNA由例如由载体提供的单链引导RNA (gRNA)包含。
12. 任何一项前述概念的用途、方法或系统，其中宿主细胞包含具有编码感兴趣的HM-序列的游离端(HM-DNA)的脱氧核糖核酸链和/或其中系统包含编码HM-DNA的序列，其中HM-DNA包含分别与用于把HM-DNA插入到宿主基因组(例如插入到染色体或游离基因位点)的靶标序列中或其侧翼的一个或多个序列同源的一个或多个序列同源。
13. 一种用于修饰包含内源性CRISPR/Cas系统的细菌宿主细胞的工程化核酸载体，载体
(a) 包含用于表达用于任何一项前述概念的CRISPR/Cas系统、方法或用途的多种不同crRNAs (例如gRNAs)的核酸序列；和
(b) 任选地缺乏编码Cas核酸酶的核酸序列，
其中第一所述crRNAs能够杂交于所述宿主细胞内的第一核酸序列；和第二所述crRNAs能够杂交于所述宿主细胞内的第二核酸序列，其中所述第二序列不同于所述第一序列；和
(c) 第一序列由抗生素抗性基因(或其RNA)包含和第二序列由抗生素抗性基因(或其RNA)包含；任选地其中这些基因是不同的；
(d) 第一序列由抗生素抗性基因(或其RNA)包含和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含；
(e) 第一序列由必需基因(或其RNA)包含和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含；或者
(f) 第一序列由致病基因(或其RNA)包含和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含。
14. 包含一种或多种Cas的宿主细胞内的概念13的载体，所述Cas对载体编码的cRNA (例如单链引导RNA)为可操纵的。
15. 任何一项前述概念的用途、方法、系统或载体，其中HM-CRISPR阵列包含相同间隔区的多个拷贝。
16. 任何一项前述概念的用途、方法、系统或载体，其中载体包含多种HM-CRISPR阵列。
17. 任何一项前述概念的用途、方法、系统或载体，其中每一种载体为质粒、粘粒、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒或前噬菌体。
18. 任何一项前述概念的用途、方法、系统或载体，其中系统或载体包含编码crRNAs (例如gRNAs)的核酸序列的2、3或多个拷贝，其中拷贝包含用于靶向宿主细胞序列(例如致病、抗性或必需基因序列)的相同间隔序列。
19. 概念18的用途、方法、系统或载体，其中拷贝在两个或更多个载体CRISPR阵列之间之间分割(split)。
20. 一种包含在任何一项前述概念中列举的系统或载体的细菌宿主细胞。
21. 概念2-20中任何一项的与抗生素(例如β-内酰胺类抗生素)联合的系统、载体或细胞。
22. 任何一项前述概念的用途、方法、系统、载体或细胞，其中这种或每一种宿主细胞为葡萄球菌属、链球菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、李斯特氏菌属、大肠杆菌、脱硫弧菌属或梭菌属宿主细胞。在一个实例中，这种或每一种宿主细胞为厚壁菌门细胞，例如葡萄球菌属、链球菌属、李斯特氏菌属或梭菌属细胞。
在一个实例中，每一种CRISPR阵列包含用于在宿主细胞中表达和产生相应crRNA(例如由单链引导RNA包含)的序列R1-S1-R1’， (i) 其中R1为第一CRISPR重复区，R1’为第二CRISPR重复区，和R1或R1’为任选的；和(ii) S1为第一CRISPR间隔区，其包含或由与所述靶标序列具有95%或更多同一性的核苷酸序列组成。
在一个实例中，R1和R1’分别与第二宿主细胞种类的CRISPR阵列的第一和第二重复序列具有至少95%同一性。在一个实例中，R1和R1’分别与所述种类，例如所述种类的所述宿主细胞的CRISPR阵列的第一(5’-most)和第二(紧邻第一重复区的3’的重复区)重复序列具有至少95% (例如96、97、98、99或100%)同一性。在一个实例中，R1和R1’具有II型Cas9核酸酶(例如嗜热链球菌、化脓性链球菌或金黄色葡萄球菌Cas9)修饰所述宿主细胞内的靶标的功能。
一种本发明的备选概念1用途提供以下，如经实验样例证实的那样：
细菌宿主细胞种群抑制种群生长的野生型内源性Cas核酸酶活性的用途，其中每一种宿主细胞具有含有野生型Cas核酸酶活性的内源性CRISPR/Cas系统，用途包括转化种群的宿主细胞，其中每一种转化的宿主细胞用工程化核苷酸序列转化，用于提供宿主细胞内的宿主修饰(HM) cRNA或引导RNA (gRNA)，HM-cRNA或gRNA包含能够杂交于宿主细胞靶前间区序列的序列，以把内源性Cas引导至靶标，其中cRNA或gRNA与具有所述野生型核酸酶活性的宿主细胞的内源性Cas核酸酶同源，并且之后种群宿主细胞生长的转化受到抑制。
在以下样例中，解决了固体表面细菌种群(革兰氏阳性厚壁菌门)的抑制作用。实现了>10倍的宿主细胞种群生长抑制作用。靶向针对抗生素抗性基因和必需基因。本发明将用于抑制抗生素抗性细菌的生长，其中靶标序列是抗生素抗性基因的序列。在一个实例中，同时给予工程化核苷酸序列与抗生素可能是有效的。这可在人或动物受试者提供宿主细胞感染的更完整治疗或预防和/或使得减少用于给予人或动物的治疗有效的抗生素剂量。考虑到人们越来越担心抗生素的过量给予并在人和动物群体出现耐药性，这是有用的。
在其中本发明用于在人或动物受试者治疗或预防由如本文公开的微生物群介导或引起的疾病或病症的实施方案中，证明本发明抑制表面宿主细胞生长的能力是重要和合乎需要的。这种微生物群一般地与受试者的组织(例如肠道、口腔、肺、腋窝、眼、阴道、肛门、耳、鼻或喉组织)接触，并因此我们相信证实了支撑这种用途的抑制表面微生物群细菌种类(以链球菌属为例)生长的活性。
在一个实例中，利用野生型宿主细胞内源性Cas9或cfp1活性。工程化核苷酸序列不能与外源性Cas核酸酶编码序列联合。
在一个实例中，宿主细胞为野生型(例如非工程化的)细菌细胞。在另一个实例中，宿主细胞为工程化的(比如染色体引入外源性核苷酸序列或修饰内源性核苷酸序列，例如在宿主细胞的染色体或质粒上)，和其中宿主细胞包含具有野生型Cas核酸酶活性的内源性CRISPR/Cas系统，其对crRNA或gRNA为可操纵的。在一个实例中，在所述转化后所述宿主细胞的细菌菌落形成受到抑制。在一个实例中，在所述转化后宿主细胞的增殖受到抑制。在一个实例中，在所述转化后宿主细胞被杀伤。
所谓“与…同源”打算意欲内源性Cas对crRNA或gRNA序列被引导至宿主细胞内的靶标是可操纵的。技术人员(skilled addressee)应理解，这样的Cas引导通常为细菌细胞中CRISPR/Cas活性的特征，例如具有内源性活性野生型CRISPR/Cas系统的细菌细胞中野生型CRISPR/Cas活性。
所谓“野生型”Cas活性打算意欲(就像对技术人员(skilled addressee)显而易见的那样)内源性Cas不是工程化Cas，或者细胞尚未工程化以对内源性Cas活性消除阻遏。这与其中Cas核酸酶活性被天然阻遏的某些细菌形成对比(即没有野生型Cas核酸酶活性或者对本发明没有任何用处，其相反适用于原位处理野生型宿主细胞，例如当可利用内源性Cas活性影响细胞种群生长抑制作用时)。
在一个实例中，宿主细胞种群生长的抑制作用与未暴露于所述工程化核苷酸序列的所述宿主细胞的生长相比较为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。例如，生长抑制作用通过以下表明，即与第二宿主细胞样品(单独或以混合细菌种群存在)的细菌菌落数相比较，第一宿主细胞样品(单独或以混合细菌种群存在)的菌落数低至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，其中第一细胞已用所述工程化核苷酸序列转化，但是第二样品没有暴露于所述工程化核苷酸序列。在一个实施方案中，在第一样品已暴露于工程化序列后12、24、36或48小时测定菌落计数。在一个实施方案中，菌落在固体琼脂上体外(例如陪替氏培养皿中)生长。因此，应该理解，生长抑制作用可通过包含靶标序列的细胞或种群生长的减少(与未处理即对照组样品生长相比较<100%生长)来表明，或者可完全消除这种生长。在一个实例中，宿主细胞种群的生长减少至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或95%，即经预定的时间段(例如与宿主细胞内cRNA或gRNA联合后24小时后48小时)，即宿主细胞种群的生长比没有暴露于所述cRNA或gRNA，但除此之外已在相同条件下保持所述预定的持续时间段的对照组宿主细胞种群的生长低至少这样的百分比。在一个实例中，通过比较所述时间段结束时(例如在对照组样品的中期指数生长阶段时)每一个种群样品中的菌落数，测定生长的百分比减少。例如，在时间为零时使受试种群暴露于crRNA或gRNA后，取受试和对照组种群的样品，并把每一个样品铺展在琼脂平板上，且在相同条件下温育所述预定的时间。在这段时间结束时，计数每个样本的菌落数和百分数差(即受试组菌落数除以对照组菌落数，并然后乘以100，然后自100减去该结果，得到生长百分比减少)。通过受试组菌落数除以对照组菌落数计算倍数差异。
因此可通过种群中宿主细胞数增殖的减少显示种群生长的抑制作用。这可能是由于细胞被核酸酶和/或由于宿主细胞增殖(分裂和/或细胞生长)通过靶前间区序列上核酸酶的作用下调而杀伤。在如本文公开的治疗或预防的一个实施方案中，人或动物受试者的宿主细胞负担减少，要治疗(例如减少或消除)或预防(即受试者出现疾病或病症的风险)的疾病或病症借以被减少或消除。
本发明用于靶向在环境(例如在水或水道、冷却或加热设备)中自然发现、由饮料和食品(或用于制造、加工或储存这些的设备)包含的野生型细菌种群，或者由人类或动物微生物群包含的野生型细菌种群。因此，本发明在宿主细胞预修饰使其接受杀伤或生长抑制作用不可能或不合需要的情况下(例如当期望原位治疗肠道或受试者其它部位的微生物群时)发现具有用途。在另一种应用中，本发明发现用于活体外产生用于给予人或动物受试者治疗或预防由宿主细胞引起或介导的疾病或病症的药物的用途，其中药物包含修饰的混合细菌种群(例如得自一个或多个人类供体的粪便或肠道微生物群)，其为本发明用途或方法的产物，其中种群包含不同于宿主细胞种类或菌株的种类或菌株的细菌亚群。前者亚群细胞不包含靶标，并因此不被用途或方法修饰。因此，例如，方法可用于减少混合种群中特定厚壁菌门亚群的比例和增加(spare)拟杆菌门，例如用于产生治疗或预防本文公开的代谢性或者GI病症或疾病的药物。这样，本发明可提供修饰的细菌移植物(例如修饰的粪便移植物)药物，用于这种用途或用于在人或动物的所述治疗或预防。例如，方法可用于体外修饰一种或多种微生物群，以产生用于给予人或动物用于医疗用途(例如治疗或预防代谢性病症(例如肥胖症或糖尿病)或胃肠道病症(例如本文提及的任何这样的病症)或癌症(例如胃肠道癌症))或用于化妆品或个人卫生用途(例如用于人类局部使用，例如用于通过局部用于人的腋窝或人的其它相关部位减少腋窝或其它身体气味)的修饰的细菌收集液(collection)。在另一个实例中，阵列、crRNA、gRNA或工程化核苷酸序列被给予人或动物，并且宿主细胞由人或动物含有，例如由人或动物的微生物群(比如肠道微生物群或本文公开的任何其它类型的微生物群)含有。这样，由宿主细胞介导或引起的疾病或病症可得到治疗或预防。在一个实例中，转化在体外实施，并且任选地阵列、crRNA、gRNA或工程化核苷酸序列由电穿孔进入宿主细胞的核酸包含。在一个实例中，核酸为RNA (例如gRNA的拷贝)。在另一个实例中，核酸为编码crRNA或gRNA用于其在宿主细胞内表达的DNA。
因此，在一个实例中，本发明提供一种工程化核苷酸序列，用于在由人或动物受试者的微生物群包含的野生型细菌宿主细胞种群提供宿主细胞修饰(HM) cRNA或引导RNA(gRNA)，用于治疗或预防由受试者的微生物群宿主细胞介导或引起的疾病或病症，cRNA或gRNA包含能够杂交于宿主细胞靶前间区序列，用于把Cas引导至靶标的序列，其中cRNA或gRNA与具有野生型核酸酶活性的内源性宿主细胞Cas核酸酶同源，其中以下种群宿主细胞生长的转化受到抑制，并且疾病或病症得到治疗或预防。
在一个实例中，工程化核苷酸序列包含如本文定义的HM-CRISPR阵列。在一个实例中，工程化核苷酸序列编码单链引导RNA。在一个实例中，工程化核苷酸序列为引导RNA (例如单链引导RNA)或crRNA。在一个实例中，工程化序列由能够感染宿主细胞的细菌噬菌体包含，其中转化包括宿主细胞被细菌噬菌体转导。细菌噬菌体可为如本文描述的细菌噬菌体。在一个实例中，工程化核苷酸序列由能够转化宿主细胞的质粒(例如接合质粒)包含。质粒可为如本文描述的质粒。在一个实例中，工程化核苷酸序列由能够转移至宿主细胞和/或在宿主细胞之间转移的转座子包含。转座子可为如本文描述的转座子。
本发明的任何用途或方法可包括用核酸载体转化宿主细胞，用于在细胞中产生cRNA或gRNA。例如，包含工程化核苷酸序列的载体或核酸口服、静脉内、局部、眼、鼻内，经吸入、经直肠给予、耳内、经阴道给予或经本文公开的任何其它给予途径或以其它方式给予包含混合细菌种群的人或动物(例如作为人类或动物微生物群的部分)，其中给予用载体或核酸转化宿主细胞。
在一个实例中，宿主细胞种群为活体外的。在一个实例中，混合种群由人或动物受试者包含，并且受试者的宿主细胞感染得到治疗或预防。
在一个实例中，第一和第二细菌由其中细菌共生的微生物菌群包含。在一个实例中，菌群为人类或动物微生物群；在一个实例中菌群由人类或动物包含(例如其中用途、系统、工程化序列、载体或细胞用于治疗人或动物菌群的宿主细胞引起的感染，例如，其中宿主细胞在人或动物介导或引起抗生素抗性或有害的疾病或病症)。用于以下样例的种类(大肠杆菌、乳酸乳球菌和嗜热链球菌)为在人类和动物肠道微生物群共生共存的菌株。实例也解决混合革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌种群中的靶向。另外，实例解决厚壁菌门(嗜热链球菌)种群和肠杆菌科(大肠杆菌)种群，其两者发现于人类微生物群。肠杆菌科的其它实例为沙门氏菌属、鼠疫耶尔森氏菌、克雷伯氏菌属、志贺氏菌属、变形杆菌属、肠杆菌科、沙雷氏菌属和枸橼酸杆菌属。
在一个实例中，方法、用途、工程化化核苷酸序列、阵列、crRNA、gRNA、载体或系统用于治疗人类肠道微生物种群的宿主细胞感染，任选地种群也包含为人类共栖肠道细菌和/或肠杆菌科的第一细菌，例如，其中宿主细胞和共栖细胞(第一和第二细菌)在人类肠道微生物群中共生。
在一个实例中，用途或系统用于改变包含拟杆菌门细菌和其它细菌的混合细菌种群中的拟杆菌门细菌的比例。例如，用于增加种群中拟杆菌门相对于一种、两种或所有厚壁菌门(例如相对于链球菌属)的相对比例。在这种情况下，宿主细胞可为包含靶标的厚壁菌门细胞。在一个实例中，种群为由人或动物受试者包含的微生物群的细菌种群，并且方法、用途、工程化核苷酸序列、阵列、载体或系统用于(i) 在受试者治疗由所述宿主细胞包含的(例如由混合种群包含的)感染；(ii) 在受试者治疗或预防由所述宿主细胞介导的病症或疾病；(iii) 减少由所述宿主细胞引起或介导的人的体味；或者(iv) 人类的个人卫生处理。在一个实例中，本发明的工程化核苷酸序列、阵列、crRNA、gRNA或载体用于这样的本发明系统或用途。
在一个实例中，病症或疾病为代谢性或胃肠道疾病或病症，例如肥胖症、炎症性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、克罗恩病或溃疡性结肠炎。在一个实例中，病症或疾病为癌症，例如实体瘤或胃肠道(GI)癌症(例如胃癌)、肝癌或前列腺癌。在一个实例中，病症为抗性或对抗生素(例如本文公开的任何抗生素)的反应减少。
在一个实例中，细胞包含内源性RNase III，其对组分(ii)在细胞中产生所述HM-crRNA为可操纵的。在一个备选方案中，一种或多种载体包含编码这种RNase III，用于在宿主细胞内表达RNase III的核苷酸序列。
在一个实例中，必需基因(包含靶标)编码细胞的DNA聚合酶。这在以下举例说明。
在一个实例中，用途、系统、载体或细胞、阵列、cRNA或gRNA包含能够杂交于宿主细胞靶前间区序列的序列，其邻近NGG、NAG、NGA、NGC、NGGNG、NNGRRT或NNAGAAW前间区序列邻近基序(PAM)，例如，AAAGAAA或TAAGAAA PAM (这些序列被写成5’-3’)。在一个实施方案中，PAM紧邻前间区序列的3’末端。在一个实例中，Cas为金黄色葡萄球菌、嗜热链球菌或化脓性链球菌Cas。在一个实例中，Cas为Cpf1和/或PAM为TTN或CTA。
在一个实例中，工程化核苷酸序列、cRNA、gRNA或阵列与抗生素联合，例如，其中靶标由抗生素抗性基因包含，其中抗生素为所述药物。在一个实施方案中，宿主细胞对抗生素敏感。例如，对使用消除宿主细胞(例如在包含种群的人或制造容器/设备中)存在的感染的抗生素敏感性可能不足，但是抗生素可抑制或减少宿主细胞亚群的大小或生长，同时采用本发明的Cas修饰(例如靶标切割)影响进一步杀伤或抑制生长。
本发明提供用途、系统、阵列、cRNA、gRNA、工程化核苷酸序列、载体或细胞，用于在人或动物受试者所述宿主细胞感染的抗生素(第一抗生素)治疗方法，其中抗生素抗性基因(对第一抗生素抗性的)为通过宿主细胞内的系统或载体靶向Cas，其中方法包括给予受试者系统、阵列、cRNA、gRNA、工程化核苷酸序列、载体或细胞和抗生素。基因被下调，即宿主细胞内基因编码的蛋白产物的表达减少或消除，抗生素抗性借以被下调。感染在受试者体内被减少或预防。在一个实例中，抗生素与系统、阵列、cRNA、gRNA、工程化核苷酸序列、载体或细胞同时给予；在另一个实例中，给予是依序的(例如抗生素在系统、阵列、cRNA、gRNA、工程化核苷酸序列、载体或细胞之前)。本发明的特征对在受试者增强抗生素治疗可为有用的，例如，当抗生素单独给予对治疗这样的宿主细胞感染不是充分有效时。抗生素可为本文公开的任何抗生素，例如四环素。
在一个实例中，每一种工程化核苷酸序列或载体包含所述CRISPR阵列或编码所述crRNA或gRNA的序列，并且进一步包含抗生素抗性基因(例如卡那霉素抗性)，其中HM-crRNA或gRNA不靶向抗生素抗性基因。在一个实例中，靶标序列由宿主细胞的抗生素抗性基因包含，其中抗生素不同于第一抗生素(例如卡那霉素)。这样，系统、工程化序列或载体能靶向没有靶向其自身的宿主。通过使宿主细胞暴露于第一抗生素，可通过正选择压力促进其中的工程化序列或载体保留，因为含有第一抗生素抗性基因的细胞在第一抗生素存在下具有生存优势(当宿主细胞未被工程化序列或载体转化时，它们对第一抗生素没有抗性)。因此，一个实例提供：包括使宿主细胞或混合种群暴露于所述抗生素(例如卡那霉素)和所述工程化序列或载体，用于促进crRNA或gRNA编码序列保持在宿主细胞内；或者本发明的系统、工程化序列、阵列或载体与所述抗生素联合的本发明用途。
在一个实例中，编码cRNA或gRNA或组分(ii)的序列为在宿主细胞种类可操纵的组成型启动子(例如强启动子)或诱导型启动子下。在一个实例中，组分(iii)为在宿主细胞种类可操纵的组成型启动子或诱导型启动子下。
在一个实例中，这种或每一种宿主细胞为革兰氏阳性菌细胞。在另一个实例中，这种或每一种宿主细胞为革兰氏阳性菌细胞。
在一个实例中，方法、用途、系统、工程化序列或载体用于治疗人类肠道微生物种群的宿主细胞感染，任选地种群包含人类共栖肠道细菌(即与人类共栖的肠道细菌)。
在方法、用途、系统、阵列、cRNA、gRNA、工程化序列或载体的一个实例中，宿主细胞由人或动物受试者包含的混合细菌种群包含，并且方法、用途、系统、阵列、cRNA、gRNA、工程化序列或载体用于(i) 在受试者用混合种群包含的所述宿主细胞治疗感染；(ii) 在受试者治疗或预防所述宿主细胞介导的病症或疾病；(iii) 减少所述宿主细胞引起或介导的人的体味；或(iv) 人类的个人卫生处理。
在方法、用途、系统、阵列、cRNA、gRNA、工程化序列或载体的一个实例中，用于体外处理工业或医用流体、固体表面、装置或容器(例如用于食品、消费品、化妆品、个人健康护理产品、石油或石油生产)；或者用于处理水道、水、饮料、食品或化妆品，其中宿主细胞由流体、表面、装置、容器、水道、水、饮料、食品或化妆品包含或在其上。
本发明还提供：一种可通过任何一个本文概念的用途或方法得到的活体外细菌混合种群。
在一个实例中，用途或方法的混合种群或产物处于用于医疗或营养用途的容器中。例如，容器为灭菌容器，例如，吸入器或连接于注射器或IV针头。
在一个实例中，用途或方法的产物种群用于给予人或动物以栖居其微生物组。
本发明提供：一种包含用途或方法的种群产物的用于人或非人动物消费的食品或饮料。
在此，在任何一种构造、概念或方面的一个实例中，拟杆菌属为选自以下的种类：粪便拟杆菌、多毛拟杆菌、解纤维素拟杆菌、coprocola拟杆菌、嗜粪拟杆菌、coprosuis拟杆菌、狄氏拟杆菌、多雷拟杆菌、埃氏拟杆菌、faecis拟杆菌、finegoldii拟杆菌、fluxus拟杆菌、脆弱拟杆菌、肠道拟杆菌、产黑素拟杆菌、nordii拟杆菌、oleiciplenus拟杆菌、口腔拟杆菌、卵形拟杆菌、嗜果胶拟杆菌、蓝斑拟杆菌、粪便拟杆菌、多形拟杆菌、单形拟杆菌、普通拟杆菌和木糖降解拟杆菌。例如，拟杆菌属为多形拟杆菌，例如其中宿主细胞或混合种群为活体外或体外肠道微生物种群。在一个实例中，宿主细胞、第一或第二细菌亚群包含多种不同的拟杆菌属种类、或多种类杆菌属种类(例如包含多形拟杆菌和脆弱拟杆菌)、或类杆菌属和普雷沃菌属种类。在此，在一个实例中，普雷沃菌属为选自bergensis普雷沃菌、二路普雷沃尔菌、颊普雷沃菌、口颊普雷沃菌、粪便普雷沃菌、产黑色普雷沃菌、口部普雷沃菌、栖瘤胃普雷沃菌、谭氏普雷沃菌、timonensis普雷沃菌和真口腔普雷沃菌的种类。在一个备选方案中，宿主细胞、第一或第二细菌为厚壁菌门细胞。在一个实例中，宿主细胞、第一或第二亚群包含或由一种或多种选自以下的厚壁菌门组成：厌氧棍状菌属、厌氧醋菌属、醋香肠菌属、醋弧菌属、厌氧球菌属、厌氧细杆菌属、厌氧弯曲菌属、Anaerostipes、Anaerovorax、丁酸弧菌属、梭菌属、粪球菌属、脱卤素杆菌属、小杆菌属、多利菌属(Dorea)、肠球菌属、产乙醇杆菌属、栖粪杆菌属、梭形杆菌属、Gracilibacter、Guggenheimella、Hespellia、毛形杆菌属、毛螺菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、巨单胞菌属、Moryella、光冈菌属、Oribacterium、产醋杆菌属、帕匹杆菌属、丙酸螺菌属、假丁酸弧菌属、假支杆菌属、罗氏菌属、瘤胃球菌属、八叠球菌属、清野氏菌属、Shuttleworthia、孢杆菌属(Sporobacter)、生孢杆菌属、链球菌属、罕见小球菌属、互营球菌属、耐热芽孢杆菌属、图利杆菌属和魏斯氏菌属。在一个实例中，宿主细胞或者第一或第二亚群由梭菌属细胞组成(和任选地其它亚群由拟杆菌属(例如多形类杆菌属)细胞组成)。在一个实例中，宿主细胞或者第一或第二亚群由肠球菌属细胞组成(和任选地其它亚群由拟杆菌属(例如多形拟杆菌属)细胞组成)。在一个实例中，宿主细胞或者第一或第二亚群由瘤胃球菌属细胞组成(和任选地其它亚群由拟杆菌属(例如多形拟杆菌)细胞组成)。在一个实例中，宿主细胞或者第一或第二亚群由链球菌细胞组成(和任选地其它亚群由拟杆菌属(例如多形拟杆菌)细胞组成)。在一个实例中，宿主细胞或者第一或第二亚群由栖粪杆菌属细胞组成(和任选地其它亚群由拟杆菌属于(例如多形拟杆菌)细胞组成)。例如，栖粪杆菌属为普雷沃氏粪杆菌(例如A2-165、L2-6、M21/2或SL3/3)。
在一个实例中，宿主细胞或者第一或第二亚群包含或由一种或多种选自以下的厚壁菌门组成：厌氧棍状菌属、厌氧醋菌属、醋香肠菌属、醋弧菌属、厌氧球菌属、厌氧细杆菌属、厌氧弯曲菌属、Anaerostipes、Anaerovorax、丁酸弧菌属、梭菌属、粪球菌属、脱卤素杆菌属、小杆菌属、多利菌属(Dorea)、肠球菌属、产乙醇杆菌属、栖粪杆菌属、梭形杆菌属、Gracilibacter、Guggenheimella、Hespellia、毛形杆菌属、毛螺菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、巨单胞菌属、Moryella、光冈菌属、Oribacterium、产醋杆菌属、帕匹杆菌属、丙酸螺菌属、假丁酸弧菌属、假支杆菌属、罗氏菌属、瘤胃球菌属、八叠球菌属、清野氏菌属、Shuttleworthia、孢杆菌属(Sporobacter)、生孢杆菌属、链球菌属、罕见小球菌属、互营球菌属、耐热芽孢杆菌属、图利杆菌属和魏斯氏菌属。在一个实例中，宿主细胞或者第一或第二亚群由梭菌属(例如难辨梭状芽孢杆菌)细胞组成(和任选地其它亚群由拟杆菌属(例如多形拟杆菌)细胞组成)。在一个实例中，宿主细胞或者第一或第二亚群由肠球菌属细胞组成(和任选地其它亚群由拟杆菌属(例如多形拟杆菌)细胞组成)。在一个实例中，宿主细胞或者第一或第二亚群由瘤胃球菌属细胞组成(和任选地其它亚群由拟杆菌属(例如多形拟杆菌)细胞组成)。在一个实例中，宿主细胞或者第一或第二亚群由链球菌属细胞组成(和任选地其它亚群由拟杆菌属(例如多形拟杆菌)和/或肠杆菌科(例如大肠杆菌)细胞组成)。在一个实例中，宿主细胞或者第一或第二亚群由栖粪杆菌属细胞组成(和任选地其它亚群由拟杆菌属(例如多形拟杆菌)细胞组成)。在一个实例中，宿主细胞或者第一或第二亚群由链球菌属细胞(任选地嗜热链球菌和/或化脓性链球菌细胞)组成和其它亚群由拟杆菌属(例如多形拟杆菌)和/或肠杆菌科(例如大肠杆菌)细胞组成。
在一个实施方案中，本发明的用途或方法的种群产物用于经粘膜、肠道、口服、鼻内、直肠内、阴道内、眼或颊给予来给予人或非人动物。
任选地，宿主细胞或者第一或第二亚群细菌为脆弱拟杆菌细菌和种群由水含有。
包含本发明的阵列、系统、工程化序列、载体或gRNA的合适饮料为例如益生菌饮料，例如一种适合的养乐多(商标)、Actimel (商标)、Kevita (商标)、Activia (商标)、Jarrow (商标)或类似的供人消费的饮料。
噬菌体序列靶标
在本发明的方面，靶标序列为感染宿主细菌细胞的噬菌体序列。如通过本发明实现的期望的噬菌体基因组修饰，不仅涉及噬菌体杀伤或敲落，而且相反可为宿主细胞内期望的噬菌体基因或调控元件激活(例如当噬菌体表达与宿主细胞生存能力或增殖增加有关的期望的蛋白或其它产物时)。或者，修饰可为诱导型噬菌体基因表达调控，例如利用靶向噬菌体靶标位点的本发明诱导型Cas。在一个实施方案中，本发明提供通过在宿主细胞内用Cas核酸酶切割来修饰噬菌体靶标位点。由于各种原因这可为有用的，例如：
A. 使靶标位点突变以激活或使其失活(例如用于基因敲落或使抗宿主基因失活；或者用于在噬菌体靶标被整合到宿主染色体时杀伤宿主细胞)；
B. 删除靶标序列或包含靶标序列的更大序列(例如当本发明用于第一和第二PM-crRNAs时，其靶向噬菌体基因组中的间隔位点，其中每一个位点的切割导致在切割之间的噬菌体核酸删除)；
C. 将期望的PM-DNA序列插入到宿主细胞基因组中(例如通过在宿主核酸中提供一种或多种PM-crNA引导的切割，用于期望的PM-DNA的同源重组插入)。
本发明提供以下方面：
1. 一种改变包含所述亚群的细菌混合种群中第一和第二细菌亚群的相对比例的方法，其中第一细菌为宿主细胞(例如拟杆菌门宿主细胞) (其中第一细菌任选地被噬菌体感染和第二细菌未被所述噬菌体(或不被拟杆菌门)感染)，方法包括使混合的种群与多种载体以一个或多个步骤联合，用于把载体核酸(例如其含PM的转座子)引入到宿主细胞中，并使混合种群中的细菌生长，其中所述第一和第二细菌的相对比例被改变；
其中每一种载体包含工程化噬菌体修饰(PM) CRISPR阵列，用于引入到宿主细胞内修饰细胞内的靶核苷酸序列(例如所述噬菌体的)，
(a) 其中PM-CRISPR阵列包含一个或多个分别用于表达PM-crRNA的序列和用于宿主细胞内序列转录的启动子；和
(b) 其中PM-crRNA能够杂交于靶标序列，以引导宿主细胞内的Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列。
通过靶向噬菌体序列以使噬菌体生存能力、传播或感染性需要的基因失活，在一方面，本发明提供具有积极的选择性优势，可促进其被噬菌体感染的宿主细胞摄取和保留的阵列。当宿主细胞被杀伤或生长减少时，种群中第一与第二细菌的相对比例减少。本发明提供这样的产物种群，例如用作用于在人或动物受试者治疗或预防疾病或病症(减小风险)的药物，其中药物被给予受试者。疾病或病症可为本文公开的任何疾病或病症。在一个实例中，单链引导RNA (gRNA)在宿主细胞内表达，以提供crRNA，并且每一种载体包含编码这样的gRNA的可表达的工程化核苷酸序列。
在采用PM-阵列的一个实例中，靶标序列为多形拟杆菌序列。任选地靶标序列不由脆弱拟杆菌包含。例如当修饰切割或者使得靶标序列非功能性，借以在没有靶向脆弱拟杆菌下增加多形拟杆菌宿主细胞的比例，例如其中混合种群为本文描述的肠道微生物种群时这是有用的。脆弱拟杆菌在一些情况下与脓肿有关，并且因此该实例减少这种情况的风险，同时使本发明的比例改变(多形拟杆菌细胞比例增加)，这例如对于肠道微生物群再平衡，例如用于治疗或预防肥胖或糖尿病或炎症性肠病(IBD)是有用的。
启动子(或HM-或PM-阵列)在宿主细胞内为可操纵的。在一个实例中，启动子为病毒或噬菌体启动子，例如T7启动子。在另一个实例中，启动子为细菌启动子(例如宿主细胞种类的启动子)。
2. 方面1的方法，其中第一细菌为拟杆菌属(例如多形拟杆菌或脆弱拟杆菌)、另枝菌属、产碱杆菌属、副拟杆菌属、坦纳菌属、木聚糖茵属和/或普雷沃菌属细菌。
3. 方面1或2的方法，其中第二细菌为厚壁菌门细菌(例如当第一细菌为拟杆菌门或拟杆菌属时)。
4. 任何一个前述方面的方法，其中第一细菌亚群与第二细菌亚群的比例增加，即在实施所述方法之后大于之前。
5. 方面4的方法，其中混合种群由用于给予人或非人动物栖居和再平衡其肠道或口腔微生物群的组合物(例如饮料、漱口水或食品)包含，例如，其中混合种群是在人或非人动物体外或体内。方面1、2或3的方法，其中第一细菌亚群与第二细菌亚群的比例降低，即在实施所述方法之后小于之前。
6. 方面6的方法，其中混合种群由供人类消费的饮料或水(例如水道或饮用水)包含。
7. 任何一个前述方面的方法，其中每一种载体为质粒、噬菌体(例如包装的噬菌体)或噬菌粒。
8. 方面8的方法，其中每一种载体为噬菌体(例如包装的噬菌体)，并且通过噬菌体载体核酸转导进入宿主细胞，即通过用噬菌体载体感染宿主细胞，把载体核酸转导进入宿主细胞内。在一个实例中，噬菌体包含一种或多种如本文描述的转座子。
9. 方面8的方法，其中每一种载体为质粒，并且载体核酸通过自包含载体的细菌转化或水平质粒转移引入到宿主细胞。在一个实例中，质粒包含一种或多种如本文描述的转座子。在一个实例中，包含载体的细菌为非-拟杆菌门或非-拟杆菌属种类。
另外或者，包含载体的细菌为非-厚壁菌门种类。在一个实例中，包含载体的细菌为一种或多种选自以下种类的细菌：乳酸杆菌属种类(例如嗜酸菌(例如La-5、La-14或NCFM)、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、高加索乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳酸链球菌、罗伊氏乳杆菌或干酪乳杆菌例如代田菌)、双歧杆菌属种类(例如两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌或婴儿双岐杆菌)、嗜热链球菌和屎肠球菌。例如，细菌为嗜酸乳杆菌或乳酸乳杆菌细菌。
10. 一种用于任何一个前述方面修饰所述拟杆菌门噬菌体基因组的方法的工程化拟杆菌门噬菌体修饰(PM) CRISPR阵列。
(a) 其中PM-CRISPR阵列包含一个或多个用于表达PM-crRNA的序列和用于在拟杆菌门噬菌体感染的宿主细胞序列转录的启动子；和
(b) 其中PM-crRNA能够杂交于拟杆菌门噬菌体基因组靶标序列，以在感染的宿主细胞内引导Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列。
11. 一种用于方面1-10中任何一个的方法的核酸载体(例如质粒、噬菌体或噬菌粒)，载体包含方面11的PM-CRISPR阵列。
在本发明的一般实施方案中，或者对方面12提供：
一种包含用于修饰宿主细菌细胞(例如致病性细菌细胞，比如以上描述的)的基因组或宿主细胞内病毒(例如噬菌体)的基因组的靶标序列的工程化HM-CRISPR阵列的核酸载体(例如质粒、病毒、噬菌体或噬菌粒)，
(a) 其中CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的序列和用于在宿主细胞内序列转录的启动子；和
(b) 其中crRNA能够杂交于靶标序列，以引导宿主细胞内的Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列。
启动子在宿主细胞内为可操纵的。在一个实例中，启动子为病毒或噬菌体启动子，例如T7启动子。在另一个实例中，启动子为细菌启动子(例如宿主细胞种类的启动子)。
在一个实例中，阵列由本文描述的转座子包含。在一个实例中，阵列由本文描述的载体细菌包含。在一个实例中，提供多种用于靶向噬菌体或宿主细胞的一种或多种靶核苷酸序列的阵列，其中多种阵列由细菌细胞，例如本文描述的载体、第一受体或第二受体细胞包含。在一个实例中，载体细胞由本文描述的饮料(例如供人类消费的益生菌饮料)或食品包含。在一个实例中，阵列或载体细菌被给予人或非人动物用于治疗或预防人或动物的感染，例如其中宿主细胞为致病性的。在一个实例中，阵列或载体细菌被给予人或非人动物的肠道，用于治疗或预防人或动物的肥胖症、糖尿病或炎症性肠病(IBD)。
12. 方面11或12的阵列或载体，其中阵列或载体由细菌细胞，例如供人或非人动物消费的益生菌细胞包含。
13. 任何一个前述方面的方法、阵列或载体，其中载体由第三细菌种群(例如本文描述的载体细菌)包含，用于与混合种群的所述联合或者用于与混合种群联合，载体核酸借以通过转化(例如通过自第三细菌水平转移质粒载体或转座子至第一细菌宿主细胞)或转导(例如通过第一细菌宿主细胞的噬菌体载体感染)被引入宿主细胞内。
14. 任何一个前述方面的方法、阵列或载体，其中这种或每一种阵列或载体由人或非人动物肠道共栖或共生细菌细胞(例如本文描述的载体细菌细胞)包含。因此，细胞属于与人或非人动物共栖或共生的肠道细菌种类。
15. 方面12-15中任何一个的方法或载体，其中这种或每一种载体为包含在厚壁菌门宿主细胞或在拟杆菌门噬菌体感染的宿主细胞(例如拟杆菌属细胞)中为可操作的，和任选地在如在方面15定义的共栖或共生细菌细胞中为可操作的复制起始位点的质粒、噬菌体或噬菌粒。在一个实例中，复制起始位点为oriT或本文描述的任何其它复制起始位点。
16. 方面12-16中任何一个的方法或载体，其中这种或每一种载体为包含能够在以下两者之间水平转移的序列(例如本文描述的转座子)的质粒或噬菌粒：(1) 不是拟杆菌属细胞的人或非人动物共栖或共生细菌细胞与(2) 其为拟杆菌属细胞的所述噬菌体感染的细胞之间；或者(3) 不是厚壁菌门细胞的人或非人动物共栖或共生细菌细胞与(4) 包含靶标序列的厚壁菌门细胞之间。
17. 方面12-17中任何一个的方法或载体，其中这种或每一种载体为能够在以下两者之间水平转移的质粒或噬菌粒序列(例如本文描述的转座子)：(1) 其为拟杆菌属细胞的所述噬菌体感染的细胞与(2) 其适合于益生给予人或非人动物肠道的细菌细胞之间；或者(3) 包含靶标序列的厚壁菌门细胞与(4) 其适合于益生给予人或非人动物肠道的细菌细胞之间。
18. 方面15-18中任何一个的方法或载体，其中共栖、共生或益生菌种类选自以下：乳酸杆菌属种类(例如嗜酸菌(例如La-5、La-14或NCFM)、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、高加索乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或干酪乳杆菌例如代田菌)、双歧杆菌属种类(例如两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌或婴儿双歧杆菌)、嗜热链球菌和屎肠球菌。
任何一个前述方面的方法、阵列或载体，其中启动子对于在如在方面15-19的任何一个定义的所述噬菌体感染的拟杆菌门宿主细胞内和在共栖、共生或益生细菌细胞中；或在如在方面15-19的任何一个中定义的包含靶标序列的厚壁菌门细胞内和在共栖、共生或益生细菌细胞中所述序列的转录是可操纵的。例如，启动子为病毒或细菌启动子，例如T7启动子。在一个实例中，启动子为宿主细胞启动子，例如宿主CRISPR/Cas阵列的启动子。
19. 任何一个前述方面的方法、阵列或载体，或者本文的任何用途，其中修饰为(i) 切割靶标序列，(ii) 下调包含靶标序列的基因转录，(iii)上调包含靶标序列的基因转录，或(iv) 添加、删除或替换靶标上的核酸序列。
20. 任何一个前述方面的方法、阵列或载体，其中拟杆菌门噬菌体为选自crAss噬菌体、GB-124 噬菌体、GA-17噬菌体、HB-13噬菌体、H16-10噬菌体、B40-8噬菌体和脆弱拟杆菌噬菌体ATCC51477-B1的拟杆菌属噬菌体。参照Nat Commun. 2014年7月24日; 5:4498.doi: 10.1038/ncomms5498,“一种在人粪便宏基因组的未知序列发现的高度丰富的细菌噬菌体(A highly abundant bacteriophage discovered in the unknown sequences ofhuman faecal metagenomes)”, Dutilh BE等。crAss噬菌体~97 kbp基因组在公开可用的宏基因组中比所有其它已知噬菌体一起丰富六倍；其在病毒样颗粒(VLP)衍生的宏基因组和全社群宏基因组(total community metagenomes)中分别包含多达全部读数的90%和22%；并且其总计在公共数据库中占所有的人粪便宏基因组测序读数的1.68 %。采用新的同现分析方法，Dutilh等预测用于这种噬菌体的拟杆菌属宿主，与拟杆菌属相关蛋白同系物和噬菌体基因组中编码的独特碳水化合物结合区相同。
21. 任何一个前述方面的方法、阵列或载体，或者本文的任何用途，其中靶标序列由宿主细胞感染性、噬菌体溶原性或溶解性周期、或噬菌体生存能力需要的噬菌体基因，例如必需基因或外壳蛋白基因包含。
22. 任何一个前述方面的方法、阵列或载体，其中靶标序列由BACON (拟杆菌门相关的碳水化合物结合)结合区-编码序列(例如其中宿主为拟杆菌属宿主)或细胞内溶素编码序列包含。参照FEBS Lett. 2010年6月3日; 584(11):2421-6, doi:10.1016/j.febslet.2010.04.045. 2010年4月21日电子出版,“挖掘新结合区的宏基因组数据：BACON，一种新的碳水化合物结合模块(Mining metagenomic data for novel domains:BACON, a new carbohydrate-binding module)”, Mello L等。在噬菌体结构蛋白中存在BACON结合区可通过提出的细菌噬菌体粘附于粘液模型来解释。按照这种模型，噬菌体通过衣壳显示的碳水化合物结合区(比如免疫球蛋白样折叠或BACON结合区)粘附于组成肠粘液层的粘液糖蛋白，以便与噬菌体感染的细菌更频繁的相互作用。
25. 任何一个前述方面的方法、阵列或载体，或者本文的任何用途，其中CRISPR阵列包含序列R1-S1-R1’，用于宿主细胞内crRNA的表达和产生，
(i) 其中R1为第一CRISPR重复区，R1’为第二CRISPR重复区，和R1或R1’为任选的；和
(ii) S1为包含或由与所述靶标序列具有95%或更多同一性的核苷酸序列组成的第一CRISPR间隔区。例如，当本发明的阵列处于宿主细胞中时，靶标序列包含前间区或由紧邻与Cas同源的前间区邻近基序(PAM)的前间区序列组成，其中Cas也与自阵列表达的crRNA同源。在一个实施方案中，Cas对细胞为内源性的。在另一个实例中，Cas对宿主细胞为外源性的，例如由本发明的载体提供。
26. 方面25的方法、阵列或载体，其中R1和R1’与和宿主细胞相同种类的细胞CRISPR阵列的重复序列具有至少95% (例如96、97、98、99或100%)同一性。
27. 方面25的方法、阵列或载体，其中R1和R1’每一个与选自多形拟杆菌和脆弱拟杆菌(例如脆弱拟杆菌NCTC 9343)的拟杆菌属种类的CRISPR阵列(例如II-C型阵列)的重复序列具有至少95% (例如96、97、98、99或100%)同一性，其中宿主细胞包含具有重复序列功能的CRISPR/Cas系统，并且为例如所述种类的拟杆菌属细胞。
28. 方面27的方法、阵列或载体，其中R1和R1’分别与所述种类例如所述种类的所述宿主细胞的CRISPR阵列的第一(5’-most)和第二(紧邻第一重复区的3’的重复区)重复序列具有至少95% (例如96、97、98、99或100%)同一性。在一个实例中，阵列为II-C型阵列。在一个实例中，阵列或载体进一步包含R2-S2-R2’，其中间隔区S2与间隔区S1 (例如用于靶向宿主细胞或噬菌体基因组中的不同靶标位点)相同或不同，其中R2和R2’在宿主细胞内为功能性的，并且任选地与R1相同。例如，R1、R1’、R2和R2’中每一个为脆弱拟杆菌CRISPR重复区。
29. 方面25的方法、阵列、用途或载体，其中(iii) R1和R1’中每一个与拟杆菌属种类细胞的CRISPR阵列(例如II-C型阵列)的重复序列相同，其中种类选自粪便拟杆菌、多毛拟杆菌、解纤维素拟杆菌、coprocola拟杆菌、嗜粪拟杆菌、coprosuis拟杆菌、狄氏拟杆菌、多雷拟杆菌、埃氏拟杆菌、faecis拟杆菌、finegoldii拟杆菌、fluxus拟杆菌、脆弱拟杆菌(例如脆弱拟杆菌NCTC 9343)、肠道拟杆菌、产黑素拟杆菌、nordii拟杆菌、oleiciplenus拟杆菌、口腔拟杆菌、卵形拟杆菌、嗜果胶拟杆菌、蓝斑拟杆菌、粪便拟杆菌、多形拟杆菌、单形拟杆菌、普通拟杆菌和木糖降解拟杆菌，和(iv) 其中宿主细胞包含具有重复序列功能的CRISPR/Cas系统，并且为选自所述群(group)的种类的拟杆菌属细胞(例如与所选择的(iii)的种类相同的种类)。
30. 方面25的方法、阵列、用途或载体，其中R1和R1’具有用于修饰靶标序列的所述宿主拟杆菌门或厚壁菌门细胞的CRISPR系统的功能。在一个实例中，R1、R1’、R2和R2’为相同细菌种类例如拟杆菌属比如多形拟杆菌或脆弱拟杆菌或链球菌属比如嗜热链球菌或化脓性链球菌的II型(例如II-C型) CRISPR/Cas系统重复区。
31. 方面25的方法、阵列、用途或载体，其中R1和R1’与拟杆菌门(例如拟杆菌属或普雷沃菌属)或厚壁菌门(例如链球菌属)细胞的CRISPR阵列(例如II-C型阵列)的重复序列具有至少95% (例如96、97、98、99或100%)同一性。
32. 方面25的方法、阵列、用途或载体，其中R1和R1’中的每一个与选自表2的SEQID NOs: 1-5的序列具有至少95% (例如96、97、98、99或100%)同一性，并且任选地第一细菌细胞为例如表2的种类或菌株(例如与选择的序列对应列出的种类或菌株)的拟杆菌属细胞。
33. 方面25的方法、阵列、用途或载体，其中R1和R1’中的每一个与选自表2的SEQID NOs: 6-11序列具有至少95% (例如96、97、98、99或100%)同一性，并且任选地第一细菌细胞为例如表2的种类或菌株(例如与选择的序列对应列出的种类或菌株)的普雷沃菌属细胞。
34. 任何一个前述方面的方法、阵列或载体，其中这种或每一种阵列与所述宿主细胞中具有crRNA功能的一种或多种Cas核酸酶联合，以修饰靶标序列。例如靶标序列包含紧邻前间区序列邻近基序(PAM)的前间区序列，任选地其中PAM与由拟杆菌门宿主细胞包含的Cas核酸酶同源。在一个实例中，Cas为II-C型核酸酶。
35. 任何一个前述方面的方法、阵列或载体，其中这种或每一种阵列与所述宿主细胞中具有crRNA功能，编码一种或多种Cas核酸酶的核酸序列联合，以修饰靶标序列。
36. 方面25的方法、阵列、用途或载体，其中R1和R1’具有II型Cas9核酸酶(例如化脓性链球菌、嗜热链球菌或金黄色葡萄球菌Cas9)的功能，以修饰所述宿主细胞内的靶标，任选地其中方法、阵列或载体进一步根据方面34或35，其中Cas为所述Cas9。
37. 一种可通过方面1-10或14-36中任何一个的方法得到的活体外细菌混合种群或本文的用途。例如，混合种群处于用于医疗或营养用途的容器中。例如，容器为灭菌容器。
38. 一种用于给予人或非人动物用于治疗、预防、化妆品、人或非人动物体重减少(例如化妆品减少)或营养用途的组合物，组合物包含方面37的混合种群。在一个实例中，组合物用于口服、全身、吸入、直肠内、眼、颊或阴道内给予。在一个实例中，组合物用于给予人或非人动物的肠道或口腔。
39. 一种包含方面37的混合种群或方面38的组合物，用于人或非人动物消费的食品或饮料。
40. 方面39的食品或饮料，其为营养增补剂或者益生菌饮料或食品。
41. 一种用于在人或非人动物或在饮用水治疗(处理)或预防拟杆菌门感染的抗生素组合物，其中组合物包含方面11-36的任何一个的阵列或载体，任选地其中修饰为依据方面21 (iii)或(iv)。
42. 一种用于增加人或非人动物的肠道拟杆菌门的比例(例如治疗或预防肥胖症、糖尿病) (例如I型糖尿病)或胃肠道炎性病症)的益生菌组合物，其中组合物包含方面11-36中任何一个的阵列或载体，任选地其中修饰为依据方面21 (iii)或(iv)。
43. 用于增加人或动物肠道拟杆菌属与厚壁菌门的相对比例，例如用于治疗或预防肥胖症、糖尿病(例如I型糖尿病)或胃肠道病症(例如克罗恩病、炎症性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)或溃疡性结肠炎)的方面38、41或42的组合物。
在一个备选方案中，任何一种本发明构造中的“阵列”可被编码HM-crRNA或gRNA用于宿主细胞内表达的工程化核苷酸序列替换。因此，涉及阵列的任何一个本文方面的特征可在备选方案中进行必要的变更应用于这样的工程化序列。
可动遗传元件与CRISPR系统
44. 一种包含工程化CRISPR阵列，用于在宿主细胞修饰宿主细菌细胞(例如厚壁菌门或致病性细菌细胞，比如以上描述的)基因组或病毒(例如噬菌体)基因组的靶标序列的核酸载体(例如质粒、病毒、噬菌体或噬菌粒)，
(a) 其中CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA (例如由gRNA包含)的序列和用于宿主细胞内序列转录的启动子；
(b) 其中crRNA能够杂交于靶标序列，以在宿主细胞内引导Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列；
(c) 其中阵列由其能够在不同种类的第一和第二细菌细胞之间水平转移转座子包含。
任选地，Cas核酸酶为宿主细胞的野生型内源性Cas核酸酶。
45. 方面44的载体，其中阵列用于给予人或非人动物；并且第一细胞种类对人或动物为非致病性的，和第二细胞种类对人或动物为致病性的，其中阵列由第一细胞包含。
46. 方面45的载体，其中第一细胞种类为与人或动物，例如肠道微生物群种类共栖或共生的种类。
47. 方面45或46的载体，其中第一细胞种类选自乳酸杆菌属种类(例如嗜酸菌(例如La-5、La-14或NCFM)、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、高加索乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或干酪乳杆菌例如代田菌)、双歧杆菌属种类(例如两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌或婴儿双歧杆菌)、嗜热链球菌和屎肠球菌。
48. 方面44-47中任何一个的载体，其中载体由供人或动物消费的饮料(例如益生菌饮料)或食品包含。
49. 方面44-48中任何一个的载体，其中载体包含至少一个用于靶向靶标序列的重复区-间隔区-重复区单元，其中重复区与宿主细胞的CRISPR/Cas系统重复区具有至少95% (例如96、97、98、99或100%)同一性，载体的重复区借以在宿主细胞为可操纵的，以引导宿主系统的Cas修饰靶核苷酸序列。
50. 方面49的载体，其中载体缺乏Cas (例如Cas核酸酶)编码序列。
本发明的宿主CRISPR/Cas系统核苷酸序列的靶向，对于去除宿主细胞对载体(例如入侵的病毒)的抗性或者减少抗性的出现或增加是有用的。例如，本发明从而提供靶向和敲落内源性CRISPR/Cas系统的活性，以至新的载体(例如噬菌体)间隔区采集被抑制的有利条件。
迁移的一个特征是存在转移需要的顺式作用区(oriT)。该区域为质粒中造成位点和链特异性切口以开始转移事件的DNA加工起始位点。本发明提供如下采用可动遗传元件(MGEs)的进一步实施方案：
1. 一种在宿主细胞内包含或由可动遗传元件(MGE) (其中MGE包含转移起始位点(oriT)和用于修饰宿主细胞(例如致病性细菌细胞)基因组或病毒(例如前噬菌体)基因组的靶标序列的CRISPR阵列)组成的工程化CRISPR核酸载体，
(a) 其中CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的序列和用于在宿主细胞序列转录的启动子；
(b) 其中crRNA能够杂交于靶标序列，以在宿主细胞内引导Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列；
(c) 其中载体能够在以下之间转移：(i) 第一宿主细胞的第一和第二核酸位置之间，其中每一个位置为染色体或质粒上的位置，并且靶标序列由宿主细胞包含，或(ii) 第一和第二宿主细胞之间，其中靶标序列由第一和/或第二宿主细胞包含。
MGEs的实例为ICEs、转座子、质粒和细菌噬菌体。转移起始位点(oriT)为含有它的DNA在接合期间自细菌宿主到受体转移必需的短序列(例如多达500 bp)。oriT为顺式作用-其被发现于正在转移的相同DNA上，并且其连同DNA一起转移。典型的转移起始位点包含3个功能定义区：切口区、转移区和终止区。
任选地，启动子对所述序列在第一和第二(和任选地第三)细胞中转录是可操纵的。
任选地，靶标序列由第二细胞包含。任选地靶标序列不由第二细胞包含。
在一个实例中，第一和第二细胞属于不同的细菌种类(例如在人类微生物种群发现的，例如肠道、腋窝、阴道或口腔中的种类)。在一个实例中，第一和第二细胞为活体外的。在另一个实例中，第一和第二细胞由人类肠道、阴道、腋窝或口腔微生物组体内或活体外包含。
2. 实施方案1的载体，其中MGE为或包含整合性接合元件(ICE)。或者，MGE为可迁移MGE (即能采用由基因编码不由MGE 携带的因子，以被迁移)。关于MGEs的术语“可迁移的”和“接合性”对技术人员(skilled addressee)是显而易见的。
参照ICEberg数据库(http://db-mml.sjtu.edu.cn/ICEberg/)，其提供用于本发明的合适ICEs和合适oriT来源的实例。在一个实例中，ICE为ICE家族的成员，包括选自1-28组(group)的ICE，或者oriT为以下这样家族成员的oriT：1=SXT/R391；2=Tn916；3=Tn4371；4=CTnDOT/ERL；5=ICEclc；6=ICEBs1；7=ICEHin1056；8=PAPI-1；9=ICEMlSym(R7A)；10=ICESt1；11=SPI-7；12=ICE6013；13=ICEKp1；14=TnGBS1；15=Tn5253；16=ICESa2603；17=ICEYe1；18=10270-RD.2；19=Tn1207.3；20=Tn1806；21=ICEA5632；22=ICEF-I/II；23=ICEAPG2；24=ICEM；25=10270-RD.1；26=Tn5801；27=PPI-1；28=ICEF-III。家族描述见于ICEberg数据库。例如，Tn916家族由Roberts等(2009) (Trends Microbiol. 2009年6月;17(6):251-8. doi: 10.1016/j.tim.2009.03.002. 2009年5月20日电子出版；“ 一种关于移动的modular master：可动遗传元件的Tn916家族(A modular master on the move:the Tn916 family of mobile genetic elements)”, Roberts A, Mullany P)定义。属于Tn916家族的因子通过以下标准定义：它们必须具有在Roberts等显示的一般组织，并且它们必须具有核心区域(接合和调节模块)，其在DNA水平上序列和结构与初始Tn916相似。例外是一些接合转座子(比如Tn1549，其先前已分类在该家族)和与在相应参考文献中描述的具有高度蛋白相似性的那些。
3. 实施方案2的载体，其中ICE为转座子，例如接合转座子。在一个实例中，MGE为其在功能性辅助元素存在下可迁移的可迁移转座子，任选地其中转座子与所述辅助元素联合。
4. 任何一个前述实施方案的载体，其中载体为质粒，任选地其中MGE为由质粒包含的转座子。例如转座子为接合转座子。在一个实例中，转座子为可迁移的转座子(例如采用一种或多种由质粒，例如被质粒的转座子序列外面的基因编码的因子可迁移的)。任选地，转座子为I型转座子。任选地，转座子为II型转座子。
5. 任何一个前述实施方案的载体，其中oriT在第一和第二宿主细胞为功能性的。这对于促进细菌种群中跨细菌的扩散和传播是有用的，例如当第一和第二细胞属于不同种类时。
6. 实施方案5的载体，当被第一细胞包含时，其中第一细胞包含编码对使MGE转移至第二细胞是可操纵的蛋白的核苷酸序列，其中序列不由MGE包含。这用于对这样的序列避免在MGE采用间隔区。例如，这使得构建更紧密的MGE用于在细胞之间转移，或者使得包含更大或更多的CRISPR阵列，例如包含多种间隔区以靶向宿主细胞内的相应序列，或者靶向第一和第二宿主细胞内的不同序列。
7. 实施方案6的载体，其中序列不由载体包含。这用于对这样的序列避免在载体或MGE采用间隔区。例如，这使得构建更紧密的载体或MGE用于在细胞之间转移，或者使得包含更大或更多的CRISPR阵列，例如包含多种间隔区以靶向宿主细胞内的相应序列，或者靶向第一和第二宿主细胞内的不同序列，和/或包含一种或多种编码Cas蛋白(例如Cas9)的序列。
8. 实施方案6或7的载体，其中序列由第一细胞的接合转座子包含。这是有用的，因为其使得利用MGE外面的因子影响接合转位，用于本发明的MGE在第一和第二宿主细胞(例如人类微生物组的不同细菌种类的)之间水平转移。
9. 实施方案8的载体，其中转座子对使MGE转移至第二细胞是反式可操纵的。这是有用的，因为其使得利用MGE外面的因子影响接合转位，用于本发明的MGE在第一和第二宿主细胞(例如人类微生物组的不同细菌种类的)之间水平转移。例如，本发明MGE的oriT与由宿主细胞接合转座子包含的oriT相同。这用于使得本发明MGE用由宿主细胞编码的因子操纵，用于影响MGE在第一和第二宿主细胞(例如不同种类，例如人类微生物组种类的细菌细胞)之间水平转移。这使得MGE更紧密或释放空间用于以上讨论的CRISPR阵列和/或Cas基因。
术语“反式可操纵的”意指MGE (ICE)对于采用自载体核苷酸序列外面的宿主核苷酸序列表达的蛋白(例如通过宿主细胞的接合转座子表达的蛋白)水平转移，以使MGE (或整个载体，比如含有MGE的质粒)转移至第二细胞中是可操纵的。
10. 任何一个前述实施方案的载体，当由第一细胞包含时，其中MGE的oriT与由第一细胞的ICE包含的oriT相同，其中ICE对使MGE转移至第二细胞中是反式可操纵的。
11. 任何一个前述实施方案的载体，其中载体oriT为拟杆菌门(例如拟杆菌目或拟杆菌属)或普雷沃菌属转座子的oriT。当第一和/或第二宿主细胞分别为拟杆菌门(例如拟杆菌目或拟杆菌属)或普雷沃菌属细胞时这是有用的。例如，第一细胞为这样种类的细胞和第二细胞为厚壁菌门细胞，靶标序列由第二细胞而不是第一细胞包含，CRISPR阵列借以在第二细胞内引导Cas切割靶标序列。在一个实例中，靶标序列由第二细胞的必需基因或抗生素抗性基因包含(并且对于后者，任选地载体与所述抗生素联合，或者与所述抗生素联合给予人或非人动物)。任选地，转座子为CTnDot或CTnERL转座子，并且载体与四环素联合，或者与四环素联合给予人或非人动物。
12. 任何一个前述实施方案的载体，其中载体oriT为CTnDot、CTnERL SXT/R391、Tn916或Tn4371家族转座子oriT。
13. 任何一个前述实施方案的载体，其中MGE包含第一和第二末端重复序列及重复序列之间的CRISPR阵列。
14. 任何一个前述实施方案的载体，其中MGE在以下位置留下转座子拷贝：(1) 当其已转移至第二位置时，在第一核酸位置；或(2) 当其已转移至第二细胞时，在第一细胞中。这对于促进MGE在包含宿主细胞的细菌种群中的传播和保持是有用的。在一个备选方案中，MGE在以下位置不留下转座子拷贝：(1) 当其已转移至第二位置时，在第一核酸位置；或(2) 当其已转移至第二细胞时，在第一细胞中。
15. 当被第一和/或第二细胞包含(例如载体的第一和第二拷贝由第一和第二细胞包含)时任何一个前述实施方案的载体。
16. 实施方案15的载体，其中第一和第二细胞为不同种类的细胞。例如，第一细胞为乳酸杆菌属细胞(例如本文描述的)和/或第二细胞为拟杆菌门(例如拟杆菌属细胞，例如本文描述的这种细胞)或厚壁菌门细胞(例如本文描述的这种细胞)。在一个实例中，第一细胞为拟杆菌门(例如拟杆菌属细胞，例如本文描述的这种细胞)和第二细胞为厚壁菌门细胞(例如本文描述的这种细胞)，例如用于给予人类的肠道微生物组，用于治疗或预防胃肠道病症或糖尿病，或者用于治疗或预防肥胖症。
17. 实施方案15或16的载体，其中第一和第二细胞为细菌或古细菌细胞。
18. 实施方案16或17的载体，其中第一细胞在人类为非致病性的(例如共栖或共生的细菌细胞)和任选地第二细胞在人类为致病性的。在一个备选方案中，第二细胞在人类为非致病性细胞。术语“在人类非致病性的”包括细胞比如某些细菌种类(例如拟杆菌属种类，比如脆弱拟杆菌)，其可居寄居于人类微生物组(例如肠道、阴道、腋窝或口腔微生物组)而没有致病性或显著致病性，但是在人体其它环境中为致病性的。技术人员易于理解，第一细胞类型可保留在人体中或其上和第二细胞类型应在人体中或其上减少。例如，CRISPR阵列修饰第二细胞的基因组，以杀伤或减少人体中或其上的细胞生存能力或生长。例如，靶标位点由第二细胞包含并且位点被所述Cas核酸酶切割，从而使包含靶标位点的基因失活或下调。例如，基因为第二细胞的必需基因或抗生素抗性基因。在一个实例中，基因为治病基因。
19. 任何一个前述实施方案的载体，或者本文的任何用途，其中第二细胞(每一种宿主细胞)为选自以下的细胞：(i) 金黄色葡萄球菌细胞，例如对选自甲氧西林、耐万古霉素的和替考拉宁的抗生素抗性的；(ii) 铜绿假单胞菌细胞，例如对选自头孢菌素类(例如头孢他啶)、碳青霉烯类(例如亚胺培南或美罗培南)、氟喹诺酮类、氨基糖苷类(例如庆大霉素或妥布霉素)和粘菌素的抗生素抗性的；(iii) 克雷伯氏菌属(例如肺炎克雷伯氏菌)细胞，例如对碳青霉烯类抗性的；(iv) 链球菌属(例如肺炎链球菌或化脓性链球菌)细胞，例如对选自红霉素、克林霉素、β-内酰胺类、大环内酯类、阿莫西林、阿奇霉素和青霉素的抗生素抗性的；(v) 沙门氏菌属(例如血清型伤寒沙门氏菌)细胞，例如对选自头孢曲松、阿奇霉素和环丙沙星的抗生素抗性的；(vi) 志贺氏菌属细胞，例如对选自环丙沙星和阿奇霉素的抗生素抗性的；(vii) 结核分枝杆菌细胞，例如对选自耐异烟肼(INH)、利福平(RMP)、氟喹诺酮类、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素的抗生素抗性的；(viii) 肠球菌属细胞，例如对万古霉素抗性的；(ix) 肠杆菌科细胞，例如对选自头孢菌素类和碳青霉烯类的抗生素抗性的；(x) 大肠杆菌细胞，例如对选自甲氧苄啶、呋喃妥因、头孢氨苄和阿莫西林的抗生素抗性的；(xi) 梭菌属(例如难辨梭状芽胞杆菌)细胞，例如对选自氟喹诺酮类抗生素和碳青霉烯类的抗生素抗性的；(xii) 淋病奈瑟氏菌细胞，例如对选自头孢克肟(例如口服用头孢菌素类)、头孢曲松(注射用头孢菌素类)、阿奇霉素和四环素的抗生素抗性的；(xiii) 鲍曼不动杆菌细胞，例如对选自β-内酰胺类、美罗培南和碳青霉烯类的抗生素抗性的；或(xiv) 弯曲菌属细胞，例如对选自环丙沙星和阿奇霉素的抗生素抗性的。这样的种类对人类可为致病性的。
20. 实施方案19的载体或用途，其中靶标位点由第二细胞的抗生素抗性基因包含，其中抗生素为在实施方案19中列举的相应抗生素。
21. 实施方案15-20中任何一个的载体，其中第一细胞为拟杆菌门(例如拟杆菌目或拟杆菌属)细胞、乳酸杆菌属(例如嗜酸菌(例如La-5、La-14或NCFM)、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、高加索乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或干酪乳杆菌例如代田菌)、双歧杆菌属(例如两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌或婴儿双歧杆菌)、嗜热链球菌、屎肠球菌、另枝菌属、产碱杆菌属、副拟杆菌属、坦纳菌属或木聚糖茵属细胞。
22. 任何一个前述实施方案的载体，其中第一和/或第二核酸位置(i) 由拟杆菌门(例如拟杆菌目或拟杆菌属)细胞包含；或者第一和/或第二宿主细胞(ii) 为拟杆菌门(例如拟杆菌目或拟杆菌属)或普雷沃菌属细胞。
23. 实施方案22的载体，其中第一细胞为拟杆菌门(例如拟杆菌目或拟杆菌属)细胞和第二细胞为厚壁菌门(例如梭菌属或葡萄球菌属)细胞，例如其中载体用于给予人类肠道微生物组，用于治疗或预防胃肠道病症或糖尿病，或者用于治疗或预防肥胖症。
24. 实施方案16或17的载体(或本文的任何用途)，其中第一细胞(每一种第一细胞)为环境中(例如水或土壤环境中)环境可接受的，和任选地第二细胞(每一种宿主细胞)为环境中不可接受的。水环境对技术人员为易于显而易见的，并可例如为海洋或水道(例如湖泊、运河、河流或水库)环境。在一个实例中，水环境为打算供人消费的饮用水或者污水。在一个实例中，土壤环境为农业土地的土壤或挖掘现场(例如矿物或金属挖掘现场)的土壤。
对于“可接受的”和“不可接受的”，技术人员应易于理解，第一细胞类型可在环境中保留和第二细胞类型应在环境中减少。例如，CRISPR阵列修饰第二细胞的基因组，以杀伤或减少环境中的细胞生存能力或生长。例如，靶标位点由第二细胞包含，并且位点被所述Cas核酸酶切割，从而使包含靶标位点的基因失活或下调。例如，基因为第二细胞的必需基因或抗生素抗性基因。在一个实例中，基因为治病基因。
在一个实例中，环境为人类微生物组，例如口腔微生物组或肠道微生物组或血流。在一个实例中，环境不为人体内或其上的环境。在一个实例中，环境不为非人动物体内或其上的环境。在一个实施方案中，环境为空气环境。在一个实施方案中，环境为农业环境。在一个实施方案中，环境为石油或石油回收环境，例如石油或油田或井。在一个实例中，环境为供人或非人动物消费的食品或饮料中或其上的环境。
在一个实例中，本文的载体、系统、载体、阵列、crRNA、gRNA、方法或任何用途用于工业，或者环境为工业环境，其中工业为选自以下领域的行业：医疗和健康护理、制药、人类食品、动物饲料、植物肥料、饮料、乳品、肉品加工、农业、畜牧业、养禽业、鱼类和贝类养殖、兽医、石油、天然气、石油化工、水处理、污水处理、包装、电子和计算机、个人健康护理和化妆用具、化妆品、牙科、非医疗牙科、眼科、非医疗眼科、矿物开采与加工、金属开采与加工、采石、航空、汽车、铁路、航运、空间、环境、土壤处理、纸浆和造纸、服装制造、染料、印刷、粘合剂、空气处理、溶剂、生物防御、维生素增补剂、冷藏、纤维沤麻和生产、生物技术、化学、工业清洁产品、家庭清洁产品、肥皂和洗涤剂、消费品、林业、渔业、休闲、回收、塑料、兽皮、皮革和仿麂皮、废物管理、殡葬事业、燃料、建筑、能源、钢铁和烟草行业领域。
25. 与核酸(例如DNA)联合用于在修饰的靶标位点包含的任何一个前述实施方案的载体。
在一个实例中，修饰为靶标位点的切割，并且核酸(例如DNA)通过在宿主细胞中同源重组而包含。这对于采用本发明的载体影响精确靶向修饰宿主细胞基因组是有用的。
26. 实施方案25的载体，其中用于包含的核酸为或包含调控元件或外显子序列，例如人类序列。
27. 与用于MGE迁移的转座酶联合的任何一个前述实施方案的载体。
28. 任何一个前述实施方案的载体，其中载体或MGE包含在第一宿主细胞可操纵的毒素-抗毒素模块；任选地其中毒素-抗毒素模块包含在除第一细胞外的细胞中不可操纵或操纵减少的抗毒素基因。
29. 任何一个前述实施方案的载体，其中载体或MGE包含在第二宿主细胞可操纵的毒素-抗毒素模块；任选地其中毒素-抗毒素模块包含在除第二细胞外的细胞中不可操纵或操纵减少的抗毒素基因。
30. 任何一个前述实施方案的载体，其中载体或MGE包含在第一和第二宿主细胞可操纵的毒素-抗毒素模块；任选地其中毒素-抗毒素模块包含在除第一和第二细胞外的细胞中不可操纵或操纵减少的抗毒素基因。采用毒素-抗毒素模块用于赋予选择性的有利条件，并且因此MGE保留和传播。例如，模块为I型模块，例如Hok-Sok模块。例如，模块为II型模块，例如HiCa-HicB模块。例如，模块为tad-ata型毒素-抗毒素模块。例如，模块为质粒沉溺模块。在一个实例中，第一和/或第二细胞为拟杆菌属细胞和模块为拟杆菌属种类的模块，例如Txe/YoeB家族沉溺模块(参见例如http://www.uniprot.org/uniprot/F0R9D1)、RelE/StbE家族沉溺模块(参见例如http://www.uniprot.org/uniprot/F0R9A0)、HigA家族沉溺模块(参见例如http://www.uniprot.org/uniprot/D7J8V2或http://www.uniprot.org/uniprot/D2ESD0)、RelE/StbE家族沉溺模块(参见例如http://www.uniprot.org/uniprot/F0R5F4)。采用载体或MGE中的毒素-抗毒素可用于使得破坏除了期望的细胞外的带有载体的细胞(例如第一和第二和/或第三细菌细胞)。在该实例中，MGE或载体包含细菌毒素-抗毒素模块的毒素基因和同源抗毒素基因，其中毒素和抗毒素基因的表达分别受到例如来自不同启动子的调控。例如，毒素基因可包含在第一、第二(和第三)细胞中组成型活化的启动子，以至毒素总是被产生。抗毒素基因可包含可被第一和/或第二细胞中，但是不是不同菌株或种类的非靶细胞中的一种或多种因子(例如表达的蛋白)诱导的启动子。众所周知，抗毒素天生地比细菌毒素-抗毒素系统的毒素更不稳定，并且因此载体或MGE转移至不是靶细胞(例如不是第一和/或第二细胞)的细胞，将导致毒素在没有抗毒素表达或抗毒素活性较低的情况下进行表达，因此导致非靶细胞的细胞死亡。这因此对靶细胞(第一、第二和第三细胞)摄取并保留本发明的载体，以至其可在其中具有期望的CRISPR阵列活性以及在种群(比如肠道微生物群)跨靶细胞传播造成选择压力。这也限制载体或MGE向非靶细胞传播，以至阵列的作用在种群中受到控制-在这方面，对不摄取载体的非靶细胞存在压力，并且如果它们这样做，受体细胞将不能在种群中存活，从而限制含有MGE和阵列的非靶细胞的复制。
31. 任何一个前述实施方案的载体，其中第一和第二细胞属于相同的门(例如两种细菌细胞)，并且载体为在以下可复制或可操纵的：(d) 在第一细胞和/或第二细胞但是不在相同门的另一细胞；(e) 在第一细胞和/或第二细胞但是不在相同目的另一细胞；(f)在第一细胞和/或第二细胞但是不在相同纲的另一细胞；(g) 在第一细胞和/或第二细胞但是不在相同目的另一细胞；(h) 在第一细胞和/或第二细胞但是不在相同科的另一细胞；(i) 在第一细胞和/或第二细胞但是不在相同属的另一细胞；(j) 在第一细胞和/或第二细胞但是不在相同种类的另一细胞；(k) 在第一细胞和/或第二细胞但是不在相同菌株的另一细胞。
这提供本发明载体在微生物组中的选择性(例如用于选择性杀伤混合细菌种群中的第二宿主细胞类型)。这可例如通过将MGE或阵列(例如其启动子)工程化，以至其需要表达用于复制或操纵的特定蛋白(例如表达产生crRNA)来实现。例如，启动子可选自在第一和/或第二细胞但是不在其它细胞中操纵的启动子，或者其中MGE被工程化，以至其复制起始位点中的一个或多个依赖于在第一和/或第二细胞但是不在其它细胞中产生的蛋白或其它因子。
32. 任何一个前述实施方案的载体在细胞混合种群中的第一和第二拷贝，其中第一载体由第一细胞包含，第二载体由第二细胞包含，细胞属于不同种类(例如不同的细菌种类)，并且载体MGEs中的一种或两者能够转移至第三细胞(例如细菌细胞)，其中第三细胞种类与第一或第二细胞的种类相同，或者为不同于第一和第二细胞种类的种类。这是有用的，因为第一细胞可起载体作用(例如当其为非致病性时，其可被给予人或动物，以至栖居人类或动物，比如其微生物组)。通过水平转移，载体可向第三细胞转移并传播本发明的CRISPR阵列(直接或经第二细胞，后者对阵列起储库的作用)。阵列然后可在第三细胞内介导靶标序列的Cas修饰(例如切割)，例如使第三细胞的必需或抗生素抗性基因失活或下调。
通常在本文，当靶标序列被细胞的抗生素抗性基因包含时，本发明的载体、工程化序列或阵列可与抗生素一起(同时或依序)给予人或动物。这对于杀伤或减少包含靶标序列的细胞增殖是有用的。在这方面，载体、工程化序列或阵列由包含抗生素的组合物包含，其中靶标序列为对所述抗生素的抗性编码的基因序列。
任选地，混合种群包含第三细胞。
在一个实例中提供多种第一细胞，每一种包含本发明的载体。在一个实例中提供多种第二细胞，每一种包含本发明的载体。在一个实例中提供与多种第二细胞联合的多种第一细胞，每一种包含本发明的载体。在一个实例中提供与多种第二细胞和多种第三细胞联合的多种第一细胞，至少2种(或全部)所述多种的细胞包含本发明的载体。
33. 实施方案32的载体，其中载体或MGE包含在第一、第二和第三宿主细胞中可操纵的毒素-抗毒素模块；任选地其中毒素-抗毒素模块包含在除第一、第二和第三细胞外的细胞中不可操纵或操纵减少(即更少)的抗毒素基因。
34. 任何一个前述实施方案的载体，其中MGE为接合转座子，oriT在第一和第二宿主细胞中为功能性的，MGE包含第一和第二末端重复序列和重复序列之间的CRISPR阵列，并且其中第一和第二细胞为细菌细胞，第二细胞属于人类微生物群细胞种类(例如致病性种类)，其中靶标位点由第二细胞而非第一细胞包含，并且其中所述修饰使第二细胞中包含所述靶标的基因或调控序列失活或下调。
通常，第一细胞可从而起本发明阵列的载体和储库作用，其可通过MGEs的水平转移进行转移。
在一个实例中，MGE为接合型拟杆菌们转座子，oriT在第一和第二宿主细胞中具有拟杆菌门oriT功能，MGE包含第一和第二末端重复序列和重复序列之间的CRISPR阵列，并且其中第一和第二细胞为细菌细胞，第一细胞为拟杆菌门细胞和第二细胞为厚壁菌门细胞(例如梭菌属或葡萄球菌属细胞)，其中靶标位点由第二细胞而非第一细胞包含，并且其中所述修饰使第二细胞中包含所述靶标的基因或调控序列失活或下调。
35. 当由第一或第二细胞包含时实施方案34的载体。
36. 任何一个前述实施方案的载体，其中第一和第二细胞由混合细菌细胞种群，例如人或非人动物(例如狗、猫或马)肠道、阴道、腋窝或口腔微生物群种类的种群包含。正如以上说明的那样，种群用于给予人或动物以栖居其微生物组。
37. 一种包含多种如在实施方案22中定义的细胞的活体外组合物，其中每一种细胞包含实施方案1-36中任何一个的载体。或者，组合物在体内，例如在非人动物体内。
38. 一种包含实施方案1-36中任何一个的载体或实施方案37的组合物，供人或非人动物消费的饮料或食品。饮料可为例如益生菌饮料，例如用于人或动物日常消费，每两天或每周一次，例如在人或动物治疗或预防肥胖症或胃肠道病症。
39. 一种包含多种拟杆菌属细胞的组合物，其中每一种细胞包含实施方案1-36中任何一个的载体。
通常，细胞可起本发明阵列的载体或储库作用，用于给予人或动物微生物组(例如肠道微生物组)，例如以在人或动物治疗或预防肥胖症或胃肠道病症。
40. 一种包含第一细胞亚群和第二细胞亚群的细菌细胞混合种群，其中第一细胞包含实施方案1-36中任何一个的载体，其中载体能够在第一和第二细胞亚群之间水平转移。当其可被给予(例如鼻内)人或动物以至细菌栖居人或动物的一种或多种微生物组(例如肠道微生物组)时，这样的种群是有用的。第一(任选地还有第二)细胞可起本发明CRISPR阵列的载体作用，尤其是当那些细胞对人或动物为非致病性的(例如在肠道微生物组非致病性的)。微生物组可为本文公开的任何其它微生物组或微生物种群。
41. 实施方案40的种群，其中第一和第二细菌种类中的一或两者能够栖居人或非人动物的肠道微生物群，并且任选地第一细菌与人或动物共栖或共生。通常，第一细菌可被安全给予人或动物，并可起本发明阵列的载体作用，用于之后转移至微生物群的其它细胞。
42. 实施方案40的种群，其中混合种群由饮料或水(例如水道或供人消费的饮用水)或土壤包含。在水或土壤中提供种群用于在环境或(对水)加热、冷却或工业系统，或在饮用水存储容器进行这种处理。
在任何一个实施方案的实例中，第二细胞为包含靶标序列的霍乱细胞，其中当靶标序列被修饰时杀伤细胞或减少细胞增殖。在一个实例中，第二细胞由供人消费的水(例如供人消费处理之前或之后的这种水)包含。在一个实例中，载体由用于给予人的药用组合物包含，以在人治疗或预防霍乱。
43. 一种体外包含多种实施方案1-36中任何一个的载体的组合物。例如，组合物在工业装置或容器(例如用于食品、消费品、化妆品、个人健康护理产品、石油或石油生产)中与多种类细菌种群混合。
44. 用于给予人或非人动物的任何一个前述实施方案的载体、组合物、食品、饮料或种群，用于其微生物组的治疗性或预防性栖居和再平衡，或者用于通过美容改变人或动物(例如用于美容减肥)。
45. 一种修饰宿主细胞内的靶标核苷酸序列的方法，方法包括
(1) 使宿主细胞与载体细胞合联合，
(a) 其中载体细胞包含含有用于修饰靶标的CRISPR阵列的CRISPR核酸载体，
(b) 其中CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的序列和用于宿主细胞内序列转录的启动子；
(c) 其中crRNA能够杂交于靶标序列，以引导宿主细胞内的Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶序列；和
(2) 一起培养细胞，其中载体自载体细胞转移至宿主细胞，crRNA借以杂交于靶标序列，以引导宿主细胞内的Cas并修饰靶标。
在一个实例中，方法在活体外实施。在一个实例中，方法为美容方法并且不是治疗性或预防性的医疗方法。
46. 实施方案45的方法，其中载体为依据实施方案1-36中的任何一个。
47. 实施方案45或46的方法，其中宿主细胞为人或非人动物微生物组细菌种类的细胞，任选地其中宿主细胞为致病性细菌种类的细胞。在一个实例中，本文的任何微生物组选自肠道、阴道、腋窝、头皮、皮肤或口腔微生物组。
48. 实施方案45-47中任何一个的方法，其中载体细胞属于为共栖或或共生的人或非人动物微生物组细菌种类的种类。在一个实例中，载体细胞对人为非致病性的，例如当被鼻内、局部或口服给予时。
在本文的任何一个构造、概念、方面、实施方案或实例中，本发明的载体、组合物、阵列或种群被鼻内、局部或口服给予人或非人动物，或者用于这样的给予。旨在治疗人或动物微生物组的技术人员将能依感兴趣的微生物组而定确定最佳给予途径。例如，当微生物组为肠道微生物组时，给予可为鼻内或口服的。当微生物组为头皮或腋窝微生物组时，给予可为局部的。当微生物组处于口腔或喉咙时，给予可为口服的。
49. 实施方案45-48中任何一个的方法，其中宿主细胞属于人或非人动物的肠道微生物组细菌种类。
50. 一种改变包含所述亚群的细菌混合种群中第一和第二细菌宿主细胞种类的亚群相对比例的方法，方法包括
A: 提供所述第一细菌宿主细胞；
B: 提供第二细菌宿主细胞，其中第二细胞为与第一细胞不同种类或菌株的细胞；
C: 向第一细菌宿主细胞中引入工程化CRISPR阵列，其中每一种CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的序列和用于所述第二宿主细胞内序列转录的启动子，其中crRNA能够杂交于由所述第二细胞包含的靶标序列，以引导宿主细胞内的Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列；
D: 把第一和第二细菌细胞合联合一起，以产生混合的细菌种群；和
E: 使得混合种群中的细菌生长，以至发生CRISPR阵列自第一细菌细胞水平转移至第二细菌细胞，其中第二细胞中的靶标序列为Cas修饰的，借以改变所述第一与第二细菌的相对比例。
51. 实施方案50的方法，其中每一种CRISPR阵列为依据实施方案1-26中的任何一个。
52. 实施方案50或51的方法，方法进一步包括获得步骤E混合种群的第一样品，并任选地比较细胞的第一样品中的第二细胞比例和第二样品中的第二细胞比例，其中第二样品为用于在步骤B中提供第二细胞的细菌细胞混合种群的样品，并且比较显示第二细胞的比例在步骤E之后升高或降低。
53. 实施方案52的方法，其中第二样品为人或动物微生物组(例如肠道、阴道、头皮、腋窝、皮肤或口腔细胞)的样品。
54. 实施方案50-53中任何一个的方法，其中人或动物微生物组(例如肠道、阴道、头皮、腋窝、皮肤或口腔细胞)的样品用于提供步骤B的第二细胞。
55. 实施方案50-54中任何一个的方法，其中重组、培养的第一细胞种群被用于步骤A。
56. 实施方案50-55中任何一个的方法，其中质粒、ICE或转座子水平转移被用于步骤E，其中每一种质粒、ICE或转座子包含所述CRISPR阵列。
57. 用于人或非人动物微生物群的治疗性或预防性再平衡的实施方案50-56中任何一个的方法，例如用于治疗或预防肥胖症、糖尿病、炎症性肠病(IBD)、胃肠道病症或口腔病症。糖尿病可为I型或II型。在一个实例中，预防为医疗性的。在一个实例中，本文的预防为非医疗性的，例如用于美容或卫生目的。例如，微生物群为腋窝微生物群并且方法用于预防或减少人的体味。例如，在这种情况下方法下调介导人体气味的产生和/或持久性的宿主细菌细胞的生长或生存能力。
58. 实施方案50-57中任何一个的方法，方法包括提供不同于载体和宿主细胞的种类或菌株的第三细菌宿主细胞，其中第三细胞由步骤E的混合种群包含，或与步骤E之后的所述种群联合，其中发生CRISPR阵列水平转移至第三宿主细胞。
59. 实施方案58的方法，其中第三细胞不包含所述靶标序列。
这样，第三细胞可起阵列载体的作用并且能够把阵列水平转移至包含靶标序列的宿主细胞。
60. 实施方案58的方法，其中第三细胞不包含用于Cas修饰的靶标序列。
61. 实施方案50-60中任何一个的方法，其中载体(任选地还有第三)细胞属于在实施方案21中列举的种类，例如拟杆菌门细胞。
62. 实施方案50-60中任何一个的方法，其中宿主细胞属于在实施方案19中列举的种类或厚壁菌门细胞。
63. 任何一个前述实施方案的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中每一种载体为或由质粒、噬菌体(例如包装的噬菌体)或噬菌粒包含。
64. 任何一个前述实施方案的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中修饰为(i) 切割靶标序列，(ii) 下调包含靶标序列的基因转录，(iii) 上调包含靶标序列的基因转录，或(iv) 添加、删除或替换靶标上的核酸序列。
65. 任何一个前述实施方案的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中每一种靶标序列为由宿主细胞的调控元件或基因包含的序列，其中基因为必需基因、CRISPR基因或抗生素抗性基因，任选地其中调控元件为这样基因的元件。在一个备选方案中，基因为治病基因。
66. 任何一个前述实施方案的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中每一种靶标序列为由噬菌体基因组包含的序列，其中噬菌体由宿主细胞包含。在一个实例中，靶标序列由宿主细胞感染性、噬菌体溶原性或溶解性周期、或噬菌体生存能力需要的噬菌体基因，例如必需基因或外壳蛋白基因包含。
在一个实例中，拟杆菌门噬菌体为选自crAssphage、GB-124噬菌体、GA-17噬菌体、HB-13噬菌体、H16-10噬菌体、B40-8噬菌体和脆弱拟杆菌噬菌体ATCC51477-B1的拟杆菌属噬菌体。这用于例如提供给人或动物肠道微生物组的拟杆菌门生存优势。这样，可以改变拟杆菌门与厚壁菌门的比例，以增加前者相对于后者的比例(例如用于治疗或预防肥胖症)。在一个实例中，靶标序列由BACON (拟杆菌门相关的碳水化合物结合)结合区-编码序列(例如其中宿主为拟杆菌属宿主)或细胞内溶素编码序列包含。
67. 任何一个前述实施方案的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中每一种CRISPR阵列包含用于在宿主细胞表达和产生相应crRNA的序列R1-S1-R1’，
(i) 其中R1为第一CRISPR重复区，R1’为第二CRISPR重复区，和R1或R1’为任选的；和
(ii) S1为第一CRISPR间隔区，其包含或由与所述靶标序列具有95%或更多同一性的核苷酸序列组成。
68. 实施方案67的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中R1和R1’与第二宿主细胞种类的CRISPR阵列的第一和第二重复序列分别具有至少95%同一性。
69. 实施方案67或68的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中R1和R1’具有所述宿主细胞的CRISPR/Cas系统用于修饰靶标序列的功能。
70. 任何一个前述实施方案的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中这种或每一种阵列与一种或多种Cas核酸酶联合，其具有宿主细胞内的相应crRNA修饰靶标序列的功能。靶标序列包含紧邻前间区序列邻近基序(PAM)的前间区序列。
71. 任何一个前述实施方案的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中这种或每一种阵列与编码一种或多种Cas核酸酶的核酸序列联合，其具有宿主细胞相应crRNA修饰靶标序列的功能。
72. 实施方案67-71中任何一个的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中R1和R1’具有II型Cas9核酸酶(例如化脓性链球菌或金黄色葡萄球菌Cas9)修饰所述宿主细胞内的靶标的功能，任选地其中载体、组合物、食品、饮料、种群或方法进一步依据实施方案70或71，其中Cas为所述Cas9。
73. 一种可通过实施方案50-72中任何一个的方法得到的细菌活体外混合种群。
74. 一种用于给予人或非人动物，用于治疗、预防、美容、人或非人动物体重减轻(例如化妆品减少)或营养用途的组合物，组合物包含实施方案73 的混合种群。
75. 一种包含实施方案73的混合种群或实施方案74的组合物的供人或非人动物消费的食品或饮料。
76. 实施方案75的食品或饮料，其为营养增补剂或者益生菌饮料或食品。
77. 一种用于在人或非人动物或在饮用水或土壤治疗(处理)或预防细菌感染的抗生素组合物，其中组合物包含实施方案1-36和63-72中任何一个的载体。
78. 一种用于在人或非人动物增加肠道拟杆菌门的比例(例如治疗或预防肥胖症、糖尿病或胃肠道炎性病症)的益生菌组合物，其中组合物包含实施方案1-36和63-72中任何一个的载体。
79. 用于在人或动物增加肠道拟杆菌属与硬壁菌类的相对比例，例如用于治疗或预防肥胖症、糖尿病或胃肠道病症的实施方案74、77或78的组合物。
80. 任何一个前述实施方案的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中载体不包含对于阵列可操纵的Cas核酸酶编码序列。这对于节省载体空间是有用的(例如使得包含更大阵列或更多阵列用于宿主细胞靶向---这可用于靶向多个基因组位置，以减少对本发明阵列出现抗性的可能性)。
81. 任何一个前述实施方案的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中MGE不包含对于阵列可操纵的Cas核酸酶编码序列。这对于节省MGE空间是有用的(例如使得包含更大阵列或更多阵列用于宿主细胞靶向---这可用于靶向多个基因组位置，以减少对本发明阵列出现抗性的可能性)。例如，这可避免包含大的编码Cas9核酸内切酶的序列。
82. 实施方案80或81的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中阵列对存在于与第一和/或第二细胞相同的种类或菌株的细胞的Cas核酸内切酶是可操纵的。在一个实例中，阵列对存在于与宿主细胞或第三细胞相同的种类或菌株的细胞的Cas核酸内切酶是可操纵的。这对于节省载体或MGE空间是有用的(例如使得包含更大阵列或更多阵列用于宿主细胞靶向---这可用于靶向多个基因组位置，以减少对本发明阵列出现抗性的可能性)。
83. 任何一个前述实施方案的载体、组合物、食品、饮料或种群，其中第一和第二细胞为不同种类的细菌细胞，其中第二细胞属于人类微生物群种类，和第一细胞属于在所述人类微生物群中非致病性的种类，其中靶标序列不由第一细胞的基因组包含，MGE包含在第一和第二细胞可操纵的oriT，其中MGE能够自第一细胞水平转移至第二细胞。
在一个备选方案中提供：
任何一个前述实施方案的方法，其中载体和宿主细胞为不同种类的细菌细胞，其中宿主细胞属于人类微生物群种类，和载体细胞属于在所述人类微生物群中非致病性的种类，其中靶标序列不由载体细胞的基因组包含，MGE包含在载体和宿主细胞可操纵的oriT，其中MGE能够自载体细胞水平转移至宿主细胞。
84. 权利要求83的载体、组合物、食品、种群或方法，其中载体由细菌噬菌体包含，细菌噬菌体能够感染第一细胞(载体)，以将MGE引入到第一(载体)细胞内。
85. 实施方案83或84的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中靶标序列由第二(宿主)细胞的基因组包含(例如由基因组的必需或抗生素抗性基因包含)。
86. 实施方案85的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中第二(宿主)细胞种类在所述人类微生物群中为致病性的，其中靶标序列通过切割靶标序列或下调包含所述靶标序列的基因进行修饰。在一个实例中，第二(宿主)细胞为具有实施方案19的特征(i)-(xiv)中任何一项的细胞。在一个实例中第二(宿主)细胞为厚壁菌门细胞，例如其中载体用于在人类治疗或预防肥胖症。
87. 实施方案83、84或85的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中第二(宿主)细胞种类在所述人类微生物群中为非致病性的。
88. 实施方案83-87中任何一个的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中第二(宿主)细胞为拟杆菌门或普雷沃菌属细胞；任选地其中MGE能够自第二(宿主)细胞种类水平转移至所述人类微生物群的厚壁菌门种类。例如，当靶标序列由厚壁菌门而非第一(载体)或第二(宿主)细胞包含时，后者用于在人治疗或预防肥胖症。
89. 实施方案83-88中任何一个的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中MGE能够自第二(宿主)细胞种类水平转移至所述人类微生物群的第三细菌细胞种类，其中第三细胞种类在所述人类微生物群中为致病性的并且包含所述靶标序列。在一个实例中，第一(载体)和第二(宿主)细胞不包含靶标序列。
90. 实施方案89的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中第三细胞为具有权利要求19的特征(i)-(xiv)中任何一项的细胞。
91. 任何一个前述实施方案的载体、组合物、食品、饮料、种群或方法，其中MGE没有对阵列的重复序列可操纵的编码Cas核酸内切酶的序列，和其中载体在MGE外面包含这样的序列(例如编码Cas9)。
一般特征中的任何一项也可应用于本发明构造。本文中的任何其它构造、方面、段落、实例、实施方案或概念的特征中的任何一项也可与采用MGEs的本发明构造联合。
因此，本发明提供以下特征(作为段落编号)；这些段落应用于列举时方面的任何一项，或者应用于实施方案1-91中的任何一个，或者应用于本文的任何其它构造：
1. 方面44-55中任何一个的载体，其中靶标序列为宿主CRISPR/Cas系统的核苷酸序列，crRNA借以把Cas引导至靶标以修饰宿主细胞内的宿主CRISPR/Cas系统。
2. 段落1的载体，其中宿主CRISPR/Cas系统为I、II或III型系统，和靶标序列为所述系统类型在至少1、2或3种另外的宿主菌株或种类保存的核苷酸序列，其中所述另外的菌株或种类不同于所述宿主。
3. 任何一个前述段落的载体，其中靶标序列与链球菌属种类(例如嗜热链球菌或化脓性链球菌) CRISPR/Cas系统序列相同。
4. 任何一个前述段落的载体，其中宿主CRISPR/Cas系统的靶标序列包含
i. 一种与第一重复区的5’-most核苷酸相接的CRISPR阵列前导或前导启动子序列(和任选地包含重复区的所述5’-most核苷酸，例如包含在第一重复区5’末端的前3个核苷酸)；
ii. 一种紧邻第一重复区5’的多达20 (例如3、5、7、9、10、12、15、20、30或32)个核苷酸相接核苷酸的序列；
iii. 一种第一重复区的5’-most核苷酸的多达20 (例如3、5、7、9、10、12、15、20、30或32)个相接核苷酸的序列；或
iv. 一种紧邻第一间隔区3’的多达20 (例如3、5、7、9、10、12、15、20、30或32)个相接核苷酸的序列(并且任选地其中序列包含第一间隔区的3’-most核苷酸，例如包含在第一重复区3’末端的最后3个核苷酸)。
5. 段落1、2或3的载体，其中阵列由核酸载体(例如病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒或前噬菌体)包含和
i. crRNA包含或由结构R-S-R组成，其中R=CRISPR重复区和S= CRISPR间隔区，其中S包含(在5’至3’方向) V-HR或HR-V或者，其中V=与载体的DNA序列相同的序列和HR=所述宿主细胞CRISPR阵列的CRISPR阵列重复区的DNA序列；
ii. 其中HR的序列与宿主CRISPR阵列的序列紧接；和
iii. 其中crRNA能够杂交于宿主CRISPR阵列的间隔区，以把Cas引导至宿主靶标，用于修饰细胞中的宿主CRISPR阵列。
例如，V为噬菌体载体外壳蛋白编码序列的序列。在这方面，Heler等在一项细菌抗药性的研究中发现，3种CRISPR无关的细菌噬菌体抗性的突变体对噬菌体吸附显示出明显缺陷(约50%)，表明最有可能是它们携带有包膜抗性突变。
6. 段落5的载体，其中第一crRNA不或基本上不杂交于载体中存在的核酸。例如，第一crRNA不杂交于载体中的V，或者比其杂交于宿主阵列的间隔区杂交不太强烈。杂交试验对技术人员为常规的。例如，其可通过分离或合成载体DNA，并用crRNA温育它而进行体外测定。标准技术，例如采用PCR可用于检测是否发生了杂交(例如在于宿主细胞中发现的pH和温度条件下测试)。
7. 段落5或6的载体，其中V=载体DNA的1或多达40 (例如多达15)个相接核苷酸。紧邻靶标序列中发现的前间区序列中PAM的5’的种子序列对crRNA配对和CRISPR/Cas系统的切割功能是重要的。这种种子序列包括紧邻PAM的5’的约15或12个相接核苷酸。
8. 任何一个前述方面或段落的方法、阵列或载体，其中阵列由载体包含，并且包含(在5’至3’方向)第一重复序列、第一间隔序列和第二重复序列，其中间隔序列包含能够杂交(例如相同或具有大于90%同一性)于宿主细胞中靶标序列的序列，阵列进一步包含用于宿主细胞中重复区和间隔区转录的启动子，并且任选地载体包含Cas核酸酶编码序列和/或tracrRNA编码序列，用于在宿主细胞中编码功能性Cas和/或tracrRNA序列，其中tracrRNA序列包含与第一或第二重复区互补的序列。
9. 任何一个前述方面或段落的方法、阵列或载体，其中CRISPR阵列由载体包含，并且包含(在5’至3’方向)第一重复序列、第一间隔序列和第二重复序列，其中间隔序列包含能够杂交(例如相同或具有大于90%同一性)于宿主细胞中靶标序列的序列，阵列进一步包含用于宿主细胞中重复区和间隔区转录的启动子，并且其中载体不包含Cas核酸酶编码序列和/或tracrRNA编码序列用于在宿主细胞中编码tracrRNA序列，其中tracrRNA序列包含与第一或第二重复区互补的序列，其中HM-CRISPR阵列在宿主细胞中为功能性的，以把Cas (例如内源性宿主Cas核酸酶)引导至宿主靶标位点，任选地采用宿主tracrRNA。
10. 段落8或9的方法、阵列或载体，其中重复区与宿主阵列的重复区相同，其中本发明的CRISPR阵列不包含被宿主CRISPR/Cas系统的Cas (例如Cas核酸酶，例如Cas9)识别的PAM。剔除(omit) Cas序列的能力在本发明阵列中释放出空间。
“必需基因”为其存在或表达是宿主细胞生长或者促进或维持细胞生存能力需要的宿主细胞中的基因。抗性基因为其存在或表达是对抗宿主药物例如抗生素(例如β-内酰胺类抗生素)呈现完全或部分抗性需要的宿主中的基因。致病基因为其存在或表达是宿主细胞能够感染的生物体感染性需要的宿主中的基因，例如其中宿主为病原体(例如植物、动物、人、牲畜、伴侣宠物、植物、鸟、鱼或昆虫)。
11. 任何一个前述方面或段落的方法、阵列或载体，其中CRISPR阵列与非宿主细胞Cas (例如I型系统Cas，其中宿主系统为II或III型；II型系统Cas，其中宿主系统为I或III型；或III型系统Cas，其中宿主系统为I或II型)联合，任选地其中宿主细胞不包含或表达与非宿主Cas的类型相同类型的Cas。这是有用的，因为CRISPR阵列不靶向序列本身(比如载体中)或宿主中载体编码的Cas。
12. 任何一个前述方面或段落的方法、阵列或载体，其中CRISPR阵列与tracrRNA序列或编码tracrRNA序列(例如在与阵列相同的核酸上)的序列联合，任选地其中tracrRNA序列和HM-crRNA由单链引导RNA (gRNA)包含。
13. 任何一个前述方面或段落的方法、阵列或载体，其中CRISPR阵列与Cas或编码Cas的序列联合，任选地其中阵列被整合在宿主细胞基因组中，并且Cas对宿主细胞为内源性的或者由外源序列编码。在一个实例中，Cas编码序列为外源序列，其已例如自质粒或病毒比如噬菌体引入到宿主中。
14. 任何一个前述方面或段落的方法、阵列或载体，其中CRISPR阵列由质粒、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒或前噬菌体的核苷酸序列包含。噬菌粒为包装的噬菌体。前噬菌体为整合至细胞内宿主染色体或游离基因的噬菌体。
15. 任何一个前述方面或段落的方法、阵列或载体，其中CRISPR阵列被整合在宿主细胞基因组中，例如整合在染色体或游离基因核酸中。
在一个实例中，阵列与失活Cas (例如dCas9)联合，其被结合于作用于靶标序列或包含靶标序列的基因的转录或翻译激活剂。这可例如用于开启宿主细胞中的基因表达(例如期望的基因，例如先前已被工程化至宿主细胞中的外源基因序列，例如编码其中宿主为微生物的抗生素，或者在宿主培养中编码产生期望的外源蛋白，例如用于食品、饮料、医药或如本文公开的任何其它本发明应用)。
16. 一种例如用于感染细胞(例如微生物)或者用于医药或牙科学的包含任何一个前述方面或段落的CRISPR阵列的病毒(例如病毒粒子、噬菌体、噬菌粒或前噬菌体)。
17. 一种段落16的病毒粒子种群，其第一和第二病毒粒子包含不同的阵列前导区或启动子和/或用于靶向宿主细胞中或不同宿主菌株中的不同靶标序列。
18. 一种CRISPR阵列的收集液(collection)，每一种阵列依据任何一个前述方面或段落，其中第一阵列包含用于crRNA转录的第一启动子；第二阵列包含用于crRNA转录的不同于第一启动子的第二启动子；和其中每一种启动子与宿主启动子相同或为其同源物；任选地其中第一或两者启动子与宿主Cas (例如Cas1、2、9或Csn2)启动子或宿主CRISPR阵列启动子相同。例如，第一启动子为内源性Cas核酸酶启动子或内源性Cas1或Cas2启动子；或者高度或结构性表达的内源基因或宿主细胞的必需、致病或抗性基因的启动子。通过利用内源性启动子，在宿主进化过程中对保持宿主启动子存在压力，并且因此这降低宿主CRISPR/Cas防御系统靶向一种或多种阵列启动子的可能性。
19. 一种本发明CRISPR阵列的收集液(collection)，其中第一阵列包含一个或多个间隔区(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多个间隔区)；和第二阵列包含多于1个间隔区(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多个间隔区)，其中第二阵列的所述间隔区与第一阵列的一个或多个间隔区相同。当证明HM-阵列中的许多这样间隔区(或者此外跨多种阵列分布间隔区)增加一些HM-阵列间隔区保留在宿主细胞中的机会，即使宿主细胞确实删除其中一些间隔区，这可用于通过HM -阵列间隔区的同源重组逃避(evading)宿主抗性。防御删除也通过在不同阵列中间隔区的相同拷贝侧翼采用的不同重复区得到增强。因此本发明提供以下：
20. 段落18或19的收集液(collection)，其中第一阵列的间隔区(或所述间隔区)侧翼为相同的第一重复区；第二阵列的间隔区(或所述间隔区)侧翼为相同的第二重复区；和其中第一重复区不同于第二重复区。
21. 段落20的收集液(collection)，其中第一重复区与宿主细胞CRISPR/Cas系统的重复区相同。
22. 段落20的收集液(collection)，其中第一重复区不同于宿主CRISPR/Cas系统的重复区。
23. 段落18-22中任何一个的收集液(collection)，其中第一和第二阵列包含在相同的宿主细胞或相同的载体(例如质粒、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒或前噬菌体)中。
24. 段落18-22中任何一个的收集液(collection)，其中第一阵列包含在第一载体中和第二阵列包含在不包含第一阵列的第二载体中(例如其中载体为质粒或病毒粒子(例如相同病毒类型的)或包装的噬菌体(例如相同噬菌体类型的))。
在一个实施方案中，用于本发明方法的载体为由段落18-24中任何一个的阵列包含的载体。
25. 一种包含任何一个前述段落的阵列、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒、前噬菌体、种群或收集液(collection)的宿主细胞。
一般特征中的任何一种(参见以下)也可适用于本构造。
本发明的一个实例提供用于减少对阵列的宿主适应性和抗性风险的以下特征：
用于修饰宿主细胞的靶核苷酸序列的本发明CRISPR阵列或载体，
a. 其中宿主细胞包含用于靶标序列转录的第一内源性启动子(第一宿主启动子)；
b. 其中CRISPR阵列包含编码crRNA的序列和用于crRNA转录的第一启动子，crRNA任选地由单链引导RNA (gRNA)包含，并且能够杂交于宿主靶标序列，以把Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列；
c. 其中第一启动子的序列为不同于第一宿主启动子序列的第二内源性宿主启动子的序列。
在一个实例中，启动子用于每一种载体(例如噬菌体) CRISPR单元，其为宿主中必需基因的启动子-那样宿主将很好表达crRNA (并且如果启动子来自必须总是或经常开启的宿主基因则为组成型的)。宿主不易于适应远离那个启动子，因此不易获得抗性。任选地可对不同的载体CRISPR单元采用不同的必需启动子降低宿主适应性(抗性)的机会。可采用宿主中被阵列(或不同阵列)靶向的致病或必需或抗性基因的启动子。为了获得对噬菌体的抗性，宿主需要突变内源性基因启动子和基因靶向位点(其可例如处于对细胞生长、生存能力或抗宿主药物(例如抗生素)抗性必需的编码序列)，并因此冒这样也使基因失活的风险。
编码crRNAs的核酸序列多个拷贝的本发明条款，其中拷贝包含相同的间隔序列，因为靶向本发明的宿主细胞序列对于减少宿主自载体去除有用靶向间隔区(例如通过宿主细胞同源重组)的机会是有利的。多个靶向间隔区可灵活提供在本发明的相同或多个HM-阵列上，以提供逃避抗性的备选方式。
因此，本发明提供下面的概念：
1. 一种用于修饰宿主细胞的靶核苷酸序列的宿主修饰(HM) CRISPR/Cas系统(例如I、II或III型)，系统包含以下(i)-(iv)的组分：
(i) 至少一种编码Cas核酸酶(例如Cas9)的核酸序列；
(ii) 一种包含间隔序列(HM-间隔区)和编码HM-crRNA的重复区的工程化宿主修饰(HM) CRISPR阵列(例如以上描述的阵列)，HM-CRISPR包含能够杂交于宿主靶标序列，以把Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列的序列；
(iii) 一种任选的tracrRNA序列或表达tracrRNA序列的DNA序列；
(iv) 其中所述系统组分包含2、3或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多个)编码crRNAs的核酸序列的拷贝，其中拷贝包含用于靶向宿主细胞序列(例如宿主致病、抗性或必需基因序列或者介导载体适应性的宿主CRISPR/Cas系统组分的序列)的相同间隔序列。
例如，系统包含编码含有相同间隔区的crRNAs的核酸序列的4或多个或者5或多个所述拷贝。这有利于增加在宿主中表达期望的cRNAs。另外，这提供更大的避免宿主抗性的机会，因为需要靶向多于1个序列(尤其是如果可能存在比如5、10、15、20、30、40、50或100或者更多个拷贝)。拷贝在不同序列上分布(例如载体包含在相同DNA链上间隔排列的这些拷贝)用于减少在间隔区之间或在侧翼重复区之间重组的机会，这然后可导致切除期望的cRNA编码序列。宿主切除所有拷贝的机会通过提供分布在许多载体阵列的拷贝而减少，这也通过包含许多期望的间隔区的拷贝(例如第一载体阵列中的许多拷贝和第二载体阵列中的许多拷贝-可包含至少2、3、4、5、6、10或者更多这样的阵列，每一个阵列包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100或者更多个期望的间隔区的拷贝)来减少。
2. 概念1的系统，其中所述系统组分包含编码含有相同间隔区的crRNAs的核酸序列的4、5、10、15或20多个所述拷贝。
3. 概念1或2的系统，其中拷贝在两种或多种核酸载体CRISPR阵列之间分割(split)。
4. 概念3的系统，其中系统包含第一和第二HM-阵列，其中第一和第二载体CRISPR阵列包含在相同的宿主细胞或相同的载体(例如质粒、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒或前噬菌体)中。
5. 概念3或4的系统，其中第一阵列包含在第一载体中和第二阵列包含在不包含第一阵列的第二载体中(例如其中载体为质粒或病毒粒子(例如相同病毒类型的)或噬菌粒(例如相同噬菌体类型的))。
6. 任何一个前述概念的系统，其中重复区与宿主CRISPR阵列中的重复区相同。
7. 概念1-5中任何一个的系统，其中重复区与宿主CRISPR阵列中的重复区不相同。
8. 一种包含任何一个前述概念的系统、载体、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒或前噬菌体的宿主细胞。
9. 一种包含概念1-8中任何一个的系统、载体、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒或前噬菌体的抗微生物组合物(例如抗生素，例如药物、消毒剂或漱口水)。
一般特征中的任何一项(参见以下)也可适用于本发明的概念。
分割(split)CRISPR/CAS9系统
该构造有利于释放出靶载体，例如携带外源序列的能力受限的病毒或噬菌体的空间。通过释放出空间，能够包含更多的靶向间隔区或阵列，这对逃避宿主抗性是有用的。例如利用内源性Cas核酸内切酶而不是在载体中编码它-尤其是对于庞大的Cas序列比如sp或saCas9是有利的。另外，如同对于一些非宿主来源的外源性Cas可见的那样，不存在相容性差的可能性。减少病毒例如噬菌体基因组大小的能力，也可有益于促进宿主细胞的摄取(在宿主细胞感染和/或保持病毒)。在一些实例中，有利条件是通过载体(例如噬菌体)入侵宿主可上调宿主CRISPR/Cas活性，包括增加宿主Cas核酸酶的表达-宿主试图对抗入侵的核酸。然而，当这些构造包含一个或多个由宿主Cas识别的重复区时，这也用于提供与该构造发明的阵列、载体、系统及其它方面一起使用的内源性Cas。在其中本发明包含一个或多个靶向宿主CRISPR阵列的间隔区(也依据本发明的第一构造)的情况下，这就促进了宿主CRISPR阵列本身的失活，类似于一种“自杀”的宿主细胞，其然后使用自身的Cas核酸酶使自己的CRISPR系统失活。
因此，本发明提供以下特征，编号为例：
1. 一种用于修饰宿主细胞的靶核苷酸序列的宿主修饰(HM) CRISPR/Cas9系统(例如I、II或III型)，系统包含以下(i)-(iv)的组分；
(i) 至少一种编码Cas核酸酶(例如Cas9)的核酸序列；
(ii) 一种包含间隔区序列(HM-间隔区)和编码HM-crRNA的重复区的工程化宿主修饰(HM) CRISPR阵列(例如以上描述的本发明阵列)，阵列，HM-crRNA包含能够杂交于宿主靶标序列，以把所述Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列的序列；
(iii)一种任选的tracrRNA序列或用于表达tracrRNA序列的DNA序列；
(iv)其中所述系统组分在宿主细胞与至少一种能转化宿主细胞的核酸载体之间分割(split)，HM-crRNA借以把Cas引导至靶标，以修饰宿主细胞内的靶标序列。
这里的“分割(split)”意指载体包含系统的一种或多种(但不是全部)组分和宿主细胞包含一种或多种(但不是全部)组分，并且载体包含一种或多种不由宿主细胞包含的组分。在一个实施方案中，载体和宿主细胞没有任何共同组分，例如宿主细胞包含组分(i)和载体包含组分(ii)，并且载体包含组分(iii)和/或宿主细胞包含组分(iii)。当载体在宿主细胞内(例如作为整合或游离型载体，例如前噬菌体)时，意图载体为已由转化宿主细胞的载体提供的核酸(并且由这样核酸提供的系统组分不是被解释为宿主细胞组分的情况中)。这可通过将转化的宿主的核酸(例如染色体和游离核酸)测序并将其与来自相同类型(例如来自相同宿主亲本菌落或克隆，例如当宿主为微生物，例如细菌或古菌时)非转化宿主的序列进行比较易于确定。
任选地，系统为CRISPR/Cas9系统。任选地，(a)的核酸酶为I型Cas核酸酶。任选地，(a)的核酸酶为II型Cas核酸酶(例如Cas9)。任选地，(a)的核酸酶为III型Cas核酸酶。
2. 实例1的系统，其中组分中至少一种对宿主细胞为内源性的。
3. 实例1或2的系统，其中组分(i)对宿主细胞为内源性的。
4. 实例1-3中任何一个的系统，其中组分(iii)对宿主细胞为内源性的。
5. 一种用于修饰宿主细胞的靶核苷酸序列的宿主修饰(HM) CRISPR/Cas系统(例如I、II或III型)，系统包含以下(a)-(e)的组分：
a. 至少一种编码Cas核酸酶(例如Cas9)的核酸序列；
b. 一种包含间隔序列(HM-间隔区)和编码HM-crRNA的重复区的工程化宿主修饰(HM)CRISPR阵列，HM-crRNA包含能够杂交于宿主靶标序列，以把所述Cas引导至宿主细胞内的靶标的序列；
c. 一种任选的tracrRNA序列或用于表达tracrRNA序列的DNA序列；
d. 其中所述系统组分在至少第一与第二核酸载体之间分割(split)，其中第一载体包含组分(a)，但第二载体缺少组分(a)；和
e. 其中载体能同时或依序共同转化宿主细胞，HM-crRNA借以把Cas引导至靶标以修饰宿主细胞内的靶标序列。
以上提供的“分割(split)”的定义进行必要的变更以适用于包含第一和第二载体的本发明实例。
在一个实施方案中tracrRNA序列不是由载体提供，但是为内源性宿主细胞CRISPR/Cas系统的tracrRNA序列，其中tracrRNA能够与细胞内的HM-crRNA杂交，用于随后加工成为成熟的crRNA，用于把Cas引导至宿主细胞内的靶标。
6. 实例5的系统，其中第一载体包含组分(a)和第二载体包含组分(b)和(c)。
7. 实例5或6的系统，其中第一和/或第二载体每一个包含1、2、3或更多个另外的工程化HM-CRISPR阵列。
8. 实例5-7中任何一个的系统，其中第一和第二载体中的一种为噬菌粒和其它载体为辅助噬菌体。
9. 任何一个前述实例(例如实例3或6)的系统，其中crRNA序列和tracrRNA序列由单链引导RNA (gRNA)包含，例如由载体提供。
10. 任何一个前述实例的系统，其中每一种载体具有限制插入外源性核酸的能力。
11. 任何一个前述实例的系统，其中载体或多种载体为病毒(例如病毒粒子、包装的噬菌体、噬菌粒或前噬菌体)。
12. 任何一个前述实例的系统，其中宿主细胞包含具有编码感兴趣的HM-序列的游离末端(HM-DNA)的脱氧核糖核酸链和/或其中系统包含编码HM-DNA的序列(例如整合在载体或宿主细胞基因组或其游离体基因中)，其中HM-DNA包含分别与靶标序列中或其侧翼的一个或多个序列同源的一个或多个序列。
链包含游离末端，即末端未整合到宿主或载体DNA中，以至链具有一个或两个游离末端，即DNA未分别结合于紧邻5’和/或3’的邻近核苷酸。
13. 实例12的系统，其中靶标位点在宿主细胞内被Cas (例如当所述Cas核酸酶为Cas9时通过Cas)切割，并且HM-DNA包含分别与用于把HM-DNA插入到宿主基因组(例如插入到染色体或游离基因位点)的切割侧翼5’和3’同源的第一和第二序列。
14. 实例13的系统，其中插入为通过同源定向重组(HDR)。
15. 实例13的系统，其中插入为通过非同源末端连接(NHEJ)。
16. 实例12-15中任何一个的系统，其中HM-序列为或编码调控元件(例如启动子，例如替代内源性启动子的诱导型启动子)、转录抑制序列、转录增强序列、标记或者编码外源蛋白或区域的序列。
17. 实例12-16中任何一个的系统，其中系统包含第一和第二HM-DNAs，其中第一HM-DNA的序列与第二DNA的序列互补，DNAs借以能够通过同源重组在宿主细胞内联合形成结合的HM-DNA，用于插入到宿主细胞基因组(例如插入到染色体或游离基因位点)。
18. 任何一个前述实例的系统，其中载体或多种载体能够感染宿主细胞，以把包含系统组分的载体核酸引入到细胞中。
19. 任何一个前述实例的系统，其中所述Cas核酸酶为切口酶。
20. 任何一个前述实例的系统，其中细胞为细菌或古生菌，和所述Cas核酸酶由细菌或古生菌的内源性II型CRISPR/Cas系统提供。
21. 任何一个前述实例的系统，其中载体或多种载体在所述宿主细胞内，任选地整合到宿主DNA中。
22. 任何一个前述实例的系统，其中载体或多种载体缺乏Cas核酸酶(例如Cas9)编码序列。
23. 一种用于感染微生物宿主细胞，包含内源性CRISPR/Cas系统的工程化核酸病毒载体(例如以上描述的病毒、病毒粒子或包装的噬菌体)，载体
(a) 包含用于表达多种不同crRNAs，用于任何一个前述实例的CRISPR/Cas系统的核酸序列；和
(b) 缺乏编码Cas核酸酶(例如Cas9)的核酸序列，
其中第一所述crRNAs能够杂交于所述宿主细胞中的第一核酸序列；和第二所述crRNAs能够杂交于所述宿主细胞中的第二核酸序列，其中所述第二序列不同于所述第一序列；和
(c) 第一序列由抗微生物(例如抗生素)抗性基因(或其RNA)包含和第二序列由抗微生物抗性基因(或其RNA)包含；任选地其中基因是不同的；
(d) 第一序列由抗微生物抗性基因(或其RNA)包含和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含；
(e) 第一序列由必需基因(或其RNA)包含和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含；或
(f) 第一序列由致病基因(或其RNA)包含和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含。
24. 一种包含内源性CRISPR/Cas系统，用于转化宿主细胞的工程化(在宿主细胞中自载体直接工程化或分离，其中载体源自转化宿主的工程化载体)核酸载体，载体任选地为如以上描述的载体并且
(a’) 包含用于表达多种不同crRNAs，用于任何一个前述实例的CRISPR/Cas系统的核酸序列；和
(b’)缺乏编码Cas核酸酶(例如Cas9)的核酸序列，
其中第一所述crRNAs能够杂交于所述宿主细胞中的第一核酸序列；和第二所述crRNAs能够杂交于所述宿主细胞中的第二核酸序列，其中所述第二序列不同于所述第一序列；和
第一和/或第二序列为宿主CRISPR/Cas系统的靶标序列，其序列为或包含
(c’) 一种在所述宿主CRISPR阵列中的重复DNA或RNA序列(例如其中重复区为5’-most重复区(第一重复区))；
(d’) 一种tracrRNA序列或tracrRNA编码DNA序列；
(e’) 一种CRISPR阵列前导序列；
(f ’) 一种Cas基因启动子(例如Cas1、Cas2 或Csn2启动子)；
(g’) 一种CRISPR阵列前导启动子序列；或
(h’) 一种Cas编码DNA或RNA序列(例如其中Cas为Cas9、Cas1、Cas2或Csn2)，例如其中第一所述crRNAs能够靶向宿主Cas1基因序列(或其RNA序列)和第二所述crRNAs能够靶向宿主Cas2基因序列(或其RNA序列)。
25. 实例24的载体，其中第一和/或第二靶标序列为或包含
i. 一种与第一重复区5’-most核苷酸相接的CRISPR阵列前导或前导启动子序列(和任选地包含重复区的所述5’-most核苷酸)，例如包含第一重复区5’末端的前3个核苷酸；
ii. 一种紧邻第一重复区5’的多达20 (例如3、5、7、9、10、12、15、20、30或32)个相接核苷酸的序列；
iii. 一种第一重复区的5’-most核苷酸的多达20 (例如3、5、7、9、10、12、15、20、30或32)个相接核苷酸的序列；或
iv. 一种紧邻第一间隔区3’的多达20 (例如3、5、7、9、10、12、15、20、30或32)个相接核苷酸的序列(并且任选地其中序列包含第一间隔区的3’-most核苷酸)，例如包含在第一重复区3’末端的最后3个核苷酸。
26. 实例24或25的载体，其中这种或每一种靶标序列由选自SEQ ID NO: 1-44的序列或其补体包含。
27. 实例24-26中任何一个的载体，其中第一crRNA包含或由结构R-S-R组成，其中R=CRISPR重复区和S= CRISPR间隔区，其中S包含(在5’至3’方向) V-HR或HR-V或者，其中V=与载体的DNA序列相同的序列和HR=所述宿主细胞CRISPR/Cas系统的CRISPR阵列重复区的DNA序列，其中第一crRNA能够杂交于宿主CRISPR阵列的间隔区，以把Cas引导至crRNA的靶标用于修饰细胞中的宿主CRISPR阵列。
28. 实例27的载体，其中第一crRNA基本上不杂交于载体中存在的核酸。例如，其中第一crRNA不杂交于载体中的V，或者比其杂交于宿主阵列的间隔区杂交不太强烈。以上关于测定这个的讨论也适用于该实例。
29. 实例27或28的载体，其中V=载体DNA的1或多达40 (例如多达15)个相接核苷酸。例如，V=载体DNA的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个相接核苷酸。
30. 实例29的载体，其中
i. 能识别同源PAM的宿主CRISPR/Cas系统；
j. 其中载体DNA包含紧邻前间区序列3’的这样的PAM；
k. 其中V= 1或多达40 (例如多达15)个前间区核苷酸；和
l. 其中HR=与宿主CRISPR阵列重复区的相接序列相同的序列。
31. 实例30的载体，其中宿主阵列重复区的所述相接序列为具有宿主重复区至少50%的序列(例如包含宿主重复区的5’-most或3’-most核苷酸)。
32. 实例30或31的载体，其中V=1-40 (例如多达15)个3’-most前间区相接核苷酸；和任选地重复区的所述相接序列包含宿主重复区的5’-most核苷酸。
33. 实例30或31的载体，其中V=1-40 (例如多达15)个5’-most前间区相接核苷酸；和任选地重复区的所述相接序列包含宿主重复区的3’-most核苷酸。
34. 实例27-33中任何一个的载体，其中R=被宿主CRISPR/Cas系统识别的重复区。或者，R=不被宿主CRISPR/Cas系统识别的重复区。在这种情况下，优选地载体包含与R同源，即能在宿主细胞内具有R功能的Cas核酸酶的核苷酸序列(和任选地tracrRNA)。
35. 实例24-34中任何一个的载体，其中第一序列依据(c’)-(h’)中的任何一个和第二序列选自宿主必需基因、致病基因或抗性基因。
36. 一种包含内源性CRISPR/Cas系统，用于感染微生物宿主细胞的用于实例1-22中任何一个的系统的工程化核酸病毒载体(例如病毒粒子或包装的噬菌体)，
a. 载体包含用于在宿主细胞表达第一crRNA的第一核酸序列；和
b. 其中第一序列包含(在5’至3’方向) R1a-S1-R1b，其中R1a=第一CRISPR重复区，其中R1a为任选的；R1b=第二CRISPR重复区和S1=与宿主序列(例如在实例23或24中列举的宿主序列)互补的CRISPR间隔区，其中R1a和R1b被宿主Cas核酸酶(例如II型核酸酶，例如Cas9)识别；
c. 其中载体缺乏(i) 编码识别(b)的重复区的Cas核酸酶(例如Cas9)的核酸序列和/或(ii) 编码与第一序列编码的crRNA序列互补的tracrRNA序列的核酸序列。
例如，载体为由噬菌体包含的核酸载体。
37. 实例36的载体，其中
d. 载体包含用于在宿主表达第二crRNA的第二核酸序列，其中第二crRNA不同于第一crRNA；
e. 其中第二序列包含(在5’至3’方向) R2a-S2-R2b，其中R2a=第一CRISPR重复区，其中R2a为任选的；R2b=第二CRISPR重复区和S2=与宿主序列(例如在实例23或24中列举的宿主序列)互补的CRISPR间隔区，其中R2a和R2b被宿主Cas核酸酶(例如I或II型核酸酶，例如Cas6)识别。
因此，例如，第一和第二核酸序列被相同的包装的噬菌粒包含，例如在相同或不同的CRISPR阵列中。
38. 实例37的载体，其中载体缺乏(iii) 编码识别(e)的重复区的Cas (例如Cas6)的核酸序列和/或(iv) 编码与第二序列编码的crRNA序列互补的tracrRNA序列的核酸序列。
39. 一种包含内源性CRISPR/Cas系统，用于共同感染微生物宿主细胞的用于实例1-22中任何一个的系统的工程化核酸病毒载体(例如以上描述的载体、病毒粒子或包装的噬菌体)的收集液(collection)，收集液(collection)包含第一载体和第二载体，
f. 其中第一载体依据实例36；
g. 其中第二载体包含用于在宿主表达第二crRNA的第二核酸序列，其中第二crRNA不同于第一crRNA；
h. 其中第二序列包含(在5’至3’方向) R2a-S2-R2b，其中R2a=第一CRISPR重复区，其中R2a为任选的；R2b=第二CRISPR重复区和S2=与宿主序列互补的CRISPR间隔区，其中R2a和R2b被宿主Cas核酸酶(例如I或II型核酸酶，例如Cas6)识别。
例如，第一载体被第一包装的噬菌粒包含和第二载体被第二包装的噬菌粒包含。
40. 实例39的收集液(collection)，其中第二载体包含(v) 编码识别(b)的重复区的Cas (例如Cas9)的核酸序列和/或(vi) 编码与第一序列编码的crRNA序列互补的tracrRNA序列的核酸序列。
例如，在这种情况下，Cas功能由内源性宿主系统提供。这节省了载体空间(例如用于包含更多的宿主靶向HM-阵列间隔区)并简化载体和阵列构造。
41. 实例39或40的收集液(collection)，其中第二载体缺乏(vii) 编码识别(h)的重复区的Cas (例如Cas6)的核酸序列和/或(viii) 编码与第二序列编码的crRNA序列互补的tracrRNA序列的核酸序列。
例如，在这种情况下，Cas功能由内源性宿主系统提供。
42. 实例39的集合，其中第一和第二载体每一种缺乏(ix) 编码识别(b)的重复区的Cas (例如Cas9)的核酸序列和(x) 编码识别(h)的重复区的Cas (例如Cas6)的核酸序列；任选地其中收集液(collection)由包含识别(b)和(h)的重复区的一种或多种Cas的宿主细胞包含。
43. 实例42的收集液(collection)，收集液(collection)进一步包含含有(ix)和/或(x)的核酸序列的第三载体(例如病毒粒子或噬菌体)。
44. 实例39-43中任何一个的收集液(collection)，其中每一种载体由相应包装的病毒粒子或噬菌粒或者相应的病毒粒子或噬菌体核酸包含。
45. 实例36-44中任何一个的载体或收集液(collection)，其中R1a和R1b包含相同的重复序列。
46. 实例37-45中任何一个的载体或收集液(collection)，其中R2a和R2b包含相同的重复序列。
47. 实例37-46中任何一个的载体或收集液(collection)，其中(b)的重复区被Cas核酸酶识别，其Cas核酸酶不同于识别(e)的重复区的Cas核酸酶。
48. 实例37-47中任何一个的载体或收集液(collection)，其中宿主包含不同类型的CRISPR/Cas系统(例如I 型和II型系统； I 型和III型系统； II 型和III 系统；或I、II 和III 型系统)。
49. 实例36-48中任何一个的载体或收集液(collection)，其中(b)的重复区被II型Cas核酸酶(例如Cas9)识别。
50. 实例37-49中任何一个的载体或收集液(collection)，其中(e)的重复区被I或III型Cas核酸酶(例如Cas6)识别。
51. 实例23-50中任何一个的载体或收集液(collection)，其中载体为病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒或前噬菌体。
52. 包含对由载体编码的cRNA可操纵的一种或多种Cas的宿主细胞内的实例23-51中任何一个的载体或收集液(collection)。
53. 包含Cas9的宿主细胞内的实例23-52中任何一个的载体或收集液(collection)。
54. 与HM-DNA联合(例如整合在载体中、质粒上或宿主细胞基因组或其游离基因中)的实例23-53中任何一个的载体或收集液(collection)，其中HM-DNA如在实例12-17的任何一个中列举的那样。
55. 包含用于表达多种不同crRNAs的核酸序列的任何一个前述实例的系统、载体或收集液(collection)，其中所述crRNAs能够靶向宿主细胞中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或100个DNA序列。
56. 任何一个前述实例的系统、载体或收集液(collection)，其包含第一crRNA或编码第一cRNA的核酸序列(能够靶向不是所述Cas核酸酶(例如Cas9)但是介导宿主载体适应性的Cas核酸酶的DNA序列(或其RNA的序列))；任选地包含第二crRNA或编码第二cRNA的核酸序列(能够靶向宿主中的抗性、致病或必需宿主基因(或其RNA))。
57. 任何一个前述实例的系统、载体或收集液(collection)，其包含编码crRNAs的核酸序列的2、3或更多个拷贝，其中拷贝包含用于靶向宿主细胞序列的相同间隔序列(例如致病、抗性或必需基因序列或者介导载体适应性但不是所述Cas核酸酶的宿主CRISPR/Cas系统组分的序列)。
58. 实例57的系统、载体或收集液(collection)，其中拷贝在两个或更多个载体CRISPR阵列之间分割(split)。
59. 任何一个前述实例的系统、载体或收集液(collection)，其中载体重复区与宿主CRISPR阵列中的重复区或宿主CRISPR阵列相同(例如每一种载体重复区与宿主重复区具有至少95%序列同一性)。
60. 实例1-58中任何一个的系统、载体或收集液(collection)，其中载体重复区不与宿主CRISPR阵列中的重复区或宿主CRISPR阵列相同。
61. 任何一个前述实例的系统、载体或收集液(collection)，其包含第一和第二载体CRISPR阵列，这些阵列包含在相同的宿主细胞内或由相同的载体(例如质粒或病毒或病毒粒子或噬菌体或前噬菌体或噬菌粒)包含。
62. 实例61的系统、载体或收集液(collection)，其中第一阵列包含在第一载体中和第二阵列包含在其不含有第一阵列的第二载体中(例如其中载体为质粒或病毒粒子(例如相同病毒类型的)或噬菌粒(例如相同噬菌体类型的)。
63. 一种包含任何一个前述实例的系统、载体、收集液(collection)、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒或前噬菌体的宿主细胞。
64. 一种包含实例1-62中任何一个的系统、载体、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒或前噬菌体的抗微生物组合物(例如抗生素，例如药物、消毒剂或漱口水)。
一起调节微生物
本发明提供用于产生微生物(例如噬菌体和/或细菌种群)的方法，方法包括把宿主和病毒一起调节以促进共同进化，并因此促进宿主到病毒(例如噬菌体)的调节，反之亦然。采用crRNA表达或活性的可阻遏控制，本发明有意以一种可控的方式调控共同进化，其中期望的间隔区活性可被开启或关闭，使得在宿主内间隔区引导的Cas作用施加的应激存在或不存在下，例如在抗生素抗性基因靶向存在或不存在下发生调节。这样，细菌种群可被调整，用于其中可遇到合乎需要基因的噬菌体失活的各种情况(例如乳制品或食品生产培养基)，或者用于调节用于杀伤或调节细菌，例如敲落抗生素抗性的噬菌体。在一个实施方案中，这种构造进一步使得将抗生素抗性细菌宿主与病毒例如噬菌体(含有一种或多种靶向宿主抗生素抗性基因的本发明CRISPR阵列)一起培养，因为在与宿主培养期间方法有意阻遏阵列的抗生素抗性基因失活活性。因此，抗性细菌宿主种群可用于在培养基长大噬菌体(例如在工业培养容器或设备中)，使得噬菌体和宿主共同进化并相互调节而不产生抑制生长从而抑制宿主细胞培养能力的抗生素抗性失活效果(否则将最大限度地减少噬菌体扩增)，并同时仍使得期望的噬菌体的所有其它组分适合培养的宿主种群。例如以实验室规模，使用抗生素抗性宿主细胞种群，但用对宿主细胞的抗生素抗性基因的阵列靶向去阻遏的受试噬菌体，可实施生成的噬菌体种群样品的测试。在原核细胞和噬菌体环境下基因表达的自然发生和合成阻遏为技术人员熟知的，例如tet系统或光诱导系统。
因此，本发明提供以下特征、编号为段落：
1. 一种微生物生产方法，方法包括
(a) 提供包含用于宿主细胞内核苷酸序列靶向的宿主CRISPR/Cas系统的宿主细胞；
(b) 提供能够感染宿主细胞的病毒，其中
(i) 病毒包含一种或多种用于修饰宿主细胞的靶核苷酸序列的工程化宿主修饰(HM)CRISPR阵列(例如以上描述的阵列)；
(ii) 第一所述HM-阵列编码第一HM-crRNA，其包含能够杂交于第一宿主靶标序列，以把Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列的间隔序列(HM-间隔区)，任选地其中第一靶标序列的修饰减少宿主细胞生长或生存能力；和
(iii) 第一HM-阵列对第一HM-crRNA的转录为可逆阻遏的和/或第一HM-crRNA活性为可阻遏的；
(c) 用病毒感染宿主细胞，以把一种或多种HM-CRISPR阵列引入到细胞内；
(d) 在细胞内阻遏第一HM-crRNA的转录和/或第一HM-crRNA活性；
(e) 培养感染的宿主细胞以产生包含病毒种群(PV1)的宿主细胞种群(PH1)；和
(f) 获得病毒种群(PV1)和/或培养的宿主细胞种群。
在一个实例中，第一HM-crRNA包含能够杂交于第一宿主靶标序列，以把Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列的HM-间隔区，其中靶标序列为宿主CRISPR/Cas系统的核苷酸序列，第一HM-crRNA借以把Cas引导至靶标以修饰宿主细胞内的宿主CRISPR/Cas系统，其中靶标序列的修饰减少或消除宿主CRISPR/Cas系统的功能。
在一个备选方案中，修饰增强或抑制宿主中的基因表达。在一个实施方案中，基因为必需基因、致病基因或抗性基因(例如抗生素抗性基因)。在一个实施方案中，修饰增强对宿主为内源性或外源性的基因产物的表达。在一个实例中，宿主为包含外源性核苷酸序列(例如用于产生期望的蛋白)的工程化宿主，并且修饰增强或抑制期望的蛋白在宿主细胞的表达。在一个实例中，期望的蛋白为抗生素和宿主细胞为微生物，例如细菌或古细菌细胞。因此，方法使得培养宿主细胞以产生病毒种群，其中抗生素不被表达，否则阻碍宿主细胞种群的扩展。之后，所分离病毒种群中的一种或多种病毒可用于减少宿主细胞生长或生存能力的抗微生物组合物，因为第一HM-crRNA阻遏可在分离之后去除，从而提供活性的抗生素病毒组合物。本发明因此也提供这样的方法和包含能够在宿主细胞中表达抗生素的病毒的这样的抗生素组合物。例如通过提供结合于转录激活因子的Cas (例如Cas9)，可影响激活表达的修饰，其中Cas为第一HM-crRNA的同源Cas，并且激活因子激活期望的外源性或内源性基因的转录。例如通过提供失活Cas (例如dCas9)，可影响抑制表达的修饰，其中CAs为第一HM-crRNA的同源Cas，并且抑制期望的外源性或内源性基因的转录。
阻遏crRNA转录或活性可为部分或完全的(即crRNA没有活性或没有在宿主自阵列转录)。活性指的是crRNA杂交于同源宿主序列，用于把Cas引导至第一宿主靶标位点进行修饰的能力。
在一个实例中，病毒在被引入到细胞内时不受如此阻遏，方法包括在病毒已经感染细胞后，例如通过采用化学、物理、机械、磁性、光或引起阻遏的其它物质实施步骤(d)。在一个实施方案中，第一HM-阵列包含可阻遏启动子(HM-启动子)用于第一HMcrRNA的转录，并且在把第一HM-阵列引入到细胞内后阻遏启动子(例如通过把阻遏剂(例如化学品或蛋白)结合于启动子)。
在另一个实例中，病毒在实施步骤(c)之前，例如通过采用化学、物理、机械、磁性、光或引起阻遏的其它物质受到如此阻遏。在一个实施方案中，第一HM-阵列包含可阻遏启动子(HM-启动子)用于第一HMcrRNA的转录，并且在把第一HM-阵列引入到细胞内之前阻遏启动子(例如通过把阻遏剂(例如化学品或蛋白)结合于启动子)，其中随后被阻遏的第一HM-阵列被引入到细胞内。
在一个实施方案中，步骤(f)包括分离PV1。在一个实施方案中，步骤包括自PH1的宿主细胞分离PV1或其病毒。
2. 段落1的方法，方法进一步包括在步骤(e)或(f)之后使病毒种群的第一HM-crRNA的转录和/或第一HM-crRNA活性去阻遏，并且任选地之后进一步培养宿主细胞。
3. 任何一个前述段落的方法，方法包括
A. 获得任选地与(a)、(f)的宿主细胞或段落2的进一步培养的细胞相同的宿主细胞种群(PH2)；
B. 用来自种群PV1的病毒感染A的宿主细胞；
C. 阻遏细胞中第一HM-crRNA的转录和/或第一HM-crRNA活性；
D. 培养感染的宿主细胞，以产生包含病毒种群(PV2)的宿主细胞种群(PH3)；和
E. 获得病毒种群(PV2) (或其病毒)和/或培养的宿主细胞种群。
4. 段落3的方法，方法进一步包括在步骤(D)或(E)之后使病毒种群中第一HM-crRNA的转录和/或第一HM-crRNA活性去阻遏，并且任选地之后进一步培养宿主细胞。
5. 任何一个前述段落的方法，方法包括测试病毒种群PV1或PV2在另外的宿主细胞或宿主细胞种群(PH4)上的分离样品，任选地其中另外的细胞或种群PH4与(a)的细胞相同，测试包括用所述样品的病毒感染另外的细胞或种群PH4，等待一段时间使能发生任何宿主细胞生长，并确定是否已经修饰(例如减少，比如减少宿主细胞生长或生存能力*)或发生了另外细胞或种群PH4的预定活性(例如细胞生长或生存能力)，其中细胞或多细胞内的病毒在所述时间段期间使第一HM-crRNA的转录和/或第一HM-crRNA活性去阻遏。
* 对于把样品的病毒加入到铺展在琼脂上的细胞或PH4时的空斑形成，这可采用标准试验进行测试。
6. 任何一个前述段落5的方法，其中所有的宿主细胞为微生物细胞(例如细菌或古细菌细胞)和第一靶标序列的修饰减少宿主细胞生长或生存能力，并且所述测定确定发生了抗微生物活性**。
这可采用标准空斑试验测定。
7. 段落5或6的方法，其中时间段为至少1、5、10、30、60或120分钟。
8. 段落5-7中任何一个的方法，其中(a)的细胞和任选地PH1、PH2和/或PH3细胞不包含第一靶标序列，其中另外的细胞或种群PH4细胞包含第一靶标序列。
9. 段落1-8中任何一个的方法，其中(a)的细胞和任选地PH1、PH2和/或PH3细胞不包含赋予第一抗生素抗性的基因，其中第一靶标序列为这样基因的靶标序列；任选地其中另外的细胞或种群PH4细胞包含这样的基因。
10. 段落1-7中任何一个的方法，其中(a)的细胞和任选地PH1、PH2和/或PH3细胞包含赋予第一抗生素抗性的基因，其中第一靶标序列为这样基因的靶标序列。
11. 任何一个前述段落的方法，其中所有宿主细胞为微生物细胞(例如细菌或古细菌细胞)和第一靶标序列的修饰减少宿主细胞生长或生存能力，或者减少宿主细胞对抗生素的抗性。
12. 任何一个前述段落的方法，其中所有宿主细胞为人、动物(例如非人动物)或植物的感染性疾病病原体。
13. 任何一个前述段落的方法，其中所有宿主细胞属于相同种类，例如选自以下的种类：埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌O157:H7或O104: H4)、志贺氏菌属(例如痢疾杆菌)、沙门氏菌属(例如伤寒沙门氏菌或肠道沙门氏菌，例如血清型鼠伤寒沙门氏菌，例如DT104)、欧文氏菌属、耶尔森菌属(例如鼠疫耶尔森氏菌)、芽胞杆菌属、弧菌属、军团菌属(例如嗜肺军团菌)、假单胞菌属(例如铜绿假单胞菌)、奈瑟氏菌属(例如淋病奈瑟氏菌或脑膜炎奈瑟氏菌)、博德特氏菌属(例如百日咳博德特氏菌)、螺杆菌属(例如幽门螺杆菌)、李斯特氏菌属(例如单核细胞增生李斯特氏菌)、农杆菌属、葡萄球菌属(例如金黄色葡萄球菌，例如MRSA (甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌))、链球菌属(例如化脓性链球菌或嗜热链球菌)、肠球菌属、梭菌属(例如难辨梭状芽胞杆菌或肉毒梭状芽胞杆菌)、棒状杆菌属(例如无枝菌酸棒杆菌)、分枝杆菌属(例如结核分枝杆菌)、密螺旋体属、疏螺旋体属(例如博氏疏螺旋体)、弗朗西斯氏菌属、布鲁氏菌属、弯曲菌属(例如空肠弯曲杆菌)、克雷伯氏菌属(例如肺炎克雷伯氏菌)、弗兰克氏菌属、巴尔通氏体属、立克次体属、希瓦氏菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、普罗威登斯菌属、环丝菌属、双歧杆菌属、短杆菌属、丙酸菌属、乳球菌属、乳杆菌属、小球菌属、明串珠菌属、弧菌属(例如霍乱弧菌，例如O139或创伤弧菌)、嗜血杆菌属(例如流感嗜血杆菌)、布鲁氏菌属例如(流产布鲁氏菌)、弗朗西斯氏菌属、黄单胞菌属、埃立克体属(例如查菲埃立克体)、衣原体属(例如衣原体肺炎)、副衣原体属、肠球菌属(例如粪肠球菌或屎肠球菌，例如利奈唑胺耐药的)、酒球菌属和不动杆菌属(例如鲍曼不动杆菌，例如多重耐药的)。
14. 权利要求13的方法，其中所有宿主细胞为金黄色葡萄球菌细胞，例如对选自甲氧西林、耐万古霉素和替考拉宁的抗生素抗性的。
15. 权利要求13的方法，其中所有宿主细胞为铜绿假单胞菌细胞，例如对选自头孢菌素类(例如头孢他啶)、碳青霉烯类(例如亚胺培南或美罗培南)、氟喹诺酮类、氨基糖苷类(例如庆大霉素或妥布霉素)和粘菌素的抗生素抗性的。
16. 权利要求13的方法，其中所有宿主细胞为克雷伯氏菌属(例如肺炎克雷伯氏菌)细胞，例如对碳青霉烯类抗性的。
17. 权利要求13的方法，其中所有宿主细胞为链球菌属(例如肺炎链球菌或化脓性链球菌)细胞，例如对选自红霉素、克林霉素、β-内酰胺类、大环内酯类、阿莫西林、阿奇霉素和青霉素的抗生素抗性的。
18. 权利要求13的方法，其中所有宿主细胞为沙门氏菌属(例如血清型伤寒沙门氏菌细胞)，例如对选自头孢曲松、阿奇霉素和环丙沙星的抗生素抗性的。
19. 权利要求13的方法，其中所有宿主细胞为志贺氏菌属细胞，例如对选自环丙沙星和阿奇霉素的抗生素抗性的。
20. 权利要求13的方法，其中所有宿主细胞为结核分枝杆菌细胞，例如对选自耐异烟肼(INH)、利福平(RMP)、氟喹诺酮类、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素的抗生素抗性的。
21. 权利要求13的方法，其中所有宿主细胞为肠球菌属细胞，例如对万古霉素抗性的。
22. 权利要求13的方法，其中所有宿主细胞为肠杆菌科细胞，例如对选自头孢菌素类和碳青霉烯类的抗生素抗性的。
23. 权利要求13的方法，其中所有宿主细胞为大肠杆菌细胞，例如对选自甲氧苄啶、呋喃妥因、头孢氨苄和阿莫西林的抗生素抗性的；
24. 权利要求13的方法，其中所有宿主细胞为梭菌属(例如难辨梭状芽胞杆菌)细胞，例如对选自氟喹诺酮类抗生素和碳青霉烯类的抗生素抗性的。
25. 权利要求13的方法，其中所有宿主细胞为淋病奈瑟氏菌细胞，例如对选自头孢克肟(例如口服用头孢菌素)、头孢曲松(注射用头孢菌素)、阿奇霉素和四环素的抗生素抗性的。
26. 权利要求13的方法，其中所有宿主细胞为鲍曼不动杆菌细胞，例如对选自β-内酰胺类、美罗培南和碳青霉烯类的抗生素抗性的。
27. 权利要求13的方法，其中所有宿主细胞为弯曲菌属细胞，例如对选自环丙沙星和阿奇霉素的抗生素抗性的。
28. 任何一个前述段落的方法，其中宿主细胞产生β (β)-内酰胺酶.
29. 任何一个前述段落的方法，其中宿主细胞对在段落14-27的任何一个中列举的抗生素为抗性的。
30. 段落29的方法，其中第一靶标序列为编码对所述抗生素赋予宿主细胞抗性的产物的基因序列。
31. 任何一个前述段落的方法，其中第一靶标序列为抗生素抗性基因的序列(即赋予宿主细胞对抗生素的抗性，例如甲氧西林抗药性)和/或种群PH1、种群PH2、种群PH3和种群PH4中的一种、多种或全部对抗生素或所述抗生素(例如在段落13-27的任何一个中列举的抗生素)为抗性的。
32. 任何一个前述段落的方法，其中病毒种群PV1或PV2的去阻遏病毒具有抗微生物活性(例如抗菌活性，比如当病毒为噬菌体时)；任选地其中宿主细胞或多种细胞包含如在段落30中列举的第一靶标序列，其中第一靶标的修饰提供所述抗微生物活性。
33. 依赖于(dependant from)段落5时任何一个前述段落的方法，其中PH4的细胞对抗生素(例如在段落13-27的任何一个中列举的抗生素)为抗性的，并且(a)的细胞和PH2对所述抗生素为非抗性的。这有助于制造用于药物用途的病毒，因为培养和扩增可相对安全地进行而没有必需应对抗生素抗性宿主细胞的风险(以及这些控制(containment)不足和例如自药物制造设备逸出的风险)。然而，对PH4的测试可在控制(containment)实验室或设置用于抗生素抗性宿主菌株的其它设施实施。当对PH4测试时，第一HM-crRNA被去阻遏，以至可通过本发明的HM-阵列修饰宿主细胞内的抗性基因。
34. 任何一个前述段落的方法，其中宿主CRISPR/Cas系统为I、II或III型系统，并且靶标序列为在与(a)的宿主细胞相同属的至少一、二或三种另外的宿主菌株或种类中的所述系统类型中保存的核苷酸序列。
35. 任何一个前述段落的方法，其中病毒为噬菌体或噬菌粒。
36. 段落35的方法，其中(b)的病毒为覆盖噬菌体科、囊状噬菌体科、丝状噬菌体科、光滑噬菌体科、微小噬菌体科、肌尾噬菌体科、短尾噬菌体科、长尾噬菌体科或复层噬菌体科病毒。
37. 段落35或36的方法，其中(b)的病毒为天然存在的噬菌体，例如自属于与(a)的细胞相同菌株的细胞诱导的噬菌体。
38. 段落35、36或37的方法，其中(b)的噬菌体为采用噬菌体抗性细菌通过选择压力获得的突变噬菌体。
39. 任何一个前述段落的方法，其中在(b)中
(iv) 所述一种或多种HM-阵列包含编码第二HM-crRNA的HM-阵列，第二HM-crRNA包含能够杂交于第二宿主靶标序列，以把Cas引导至宿主细胞中的第二靶标以修饰靶标序列的HM-间隔区，其中第二靶标序列为宿主CRISPR/Cas系统的核苷酸序列，第二HM-crRNA借以把Cas引导至第二靶标，以修饰宿主细胞中的宿主CRISPR/Cas系统，其中第二靶标序列的修饰减少或消除宿主CRISPR/Cas系统的功能；和
(v) 其中(iv)的HM-阵列在(a)的细胞中对于能够杂交于第二宿主靶标序列的第二HM-crRNA的转录是活性的。
在一个实施方案中，(ii)和(iv)的HM-阵列为相同的HM-阵列。在另一个实施方案中，它们为不同的HM-阵列(例如不同CRISPR/Cas类型的阵列，例如I和II型、或II和III型、或I 和III型、或不同的II型阵列)。
40. 段落39的方法，其中PH1-4中任何一种或全部的细胞包含所述第二靶标序列。
41. 段落39或40的方法，其中第二靶标序列与在段落11-24的任何一个中列举的细胞属或种类(例如嗜热链球菌、化脓性链球菌或金黄色葡萄球菌)的CRISPR/Cas系统序列相同。
42. 段落39-41中任何一个的方法，其中第二靶标序列由选自SEQ ID NO: 1-44的序列或其补体包含。
43. 段落39-42中任何一个的方法，其中第二靶标序列包含
A. 一种重复区DNA或RNA序列(例如其中重复区为所述宿主CRISPR阵列中的5’-most重复区(第一重复区))；
B. 一种tracrRNA序列或tracrRNA编码DNA序列；一种CRISPR阵列前导序列；
C. 一种Cas基因启动子(例如Cas1、Cas2或Csn2启动子)；
D. 一种CRISPR阵列前导启动子序列；或
E. 一种Cas编码DNA或RNA序列(例如其中Cas为Cas9、Cas1、Cas2或Csn2)。
44. 段落39-43中任何一个的方法，其中第二靶标序列包含
F. 一种与第一重复区的5’-most核苷酸相接的CRISPR阵列前导或前导启动子序列(和任选地包含重复区的所述5’-most核苷酸)；
G. 一种紧邻第一重复区的5’的多达20个相接核苷酸的序列；
H. 一种第一重复区的5’-most核苷酸的多达20个相接核苷酸的序列；或
I. 一种紧邻第一间隔重复区的3’的多达20个相接核苷酸的序列(和任选地其中序列包含第一间隔区的3’-most核苷酸)。
45. 段落39-44中任何一个的方法，其中
J. 第二HM-crRNA包含或由结构R-S-R组成，其中R=CRISPR重复区和S= CRISPR间隔区，其中S包含(在5’至3’方向) V-HR或HR-V或者，其中V=与(b)的病毒DNA序列具有至少95、96、97、98或99%同一性的序列和HR=所述宿主细胞CRISPR/Cas系统的CRISPR重复区的DNA序列；
K. 其中HR的序列与宿主CRISPR/Cas系统中V的序列紧接；和
L. 其中第二HM-crRNA能够杂交于宿主CRISPR/Cas系统的间隔区，以把Cas引导至间隔区，用于修饰(例如裂解或失活)细胞中的宿主CRISPR/Cas系统。
46. 段落45的方法，其中V=病毒DNA的1或多达40 (例如多达15)个相接核苷酸。
47. 段落39-46中任何一个的方法，其中第二HM-crRNA基本上不杂交于(b)的病毒核酸。
48. 段落45-47中任何一个的方法，其中
a. 宿主CRISPR/Cas系统能够识别同源PAM；
b. 其中(b)的病毒核酸包含紧邻前间区序列3’的这样的PAM；
c. 其中V=前间区的1或多达40 (例如多达15)个核苷酸；和
d. 其中HR=与宿主CRISPR/Cas系统的重复区相接序列相同的序列。
49. 段落48的方法，其中宿主系统重复区的所述相接序列(contiguoussequence)为宿主重复区至少50%的序列(例如包括宿主重复区的5’-most或3’-most核苷酸)。
50. 段落45或46的方法，其中V= 1-40 (例如多达15)个3’-most前间区相接核苷酸；和任选地重复区的所述相接序列包括宿主重复区的5’-most核苷酸。
51. 段落48或49的方法，其中V= 1-40 (例如多达15)个5’-most前间区相接序列；和任选地重复区的所述相接序列包括宿主重复区的3’-most核苷酸。
52. 段落45-51中任何一个的方法，其中R=被宿主CRISPR/Cas系统识别的重复区。
53. 任何一个前述段落的方法，其中这种或每一种HM-CRISPR包含(在5’至3’方向)第一重复序列、第一间隔序列和第二重复序列，其中间隔序列包含能够杂交于宿主细胞中的相应靶标序列的序列，阵列进一步包含用于宿主细胞中重复区和间隔区转录的启动子，和任选地(b)的病毒核酸包含Cas核酸酶编码序列和/或用于编码宿主细胞内的功能性Cas和/或tracrRNA序列的tracrRNA-编码序列，其中tracrRNA序列包含与第一或第二重复区互补的序列。
54. 任何一个前述段落的方法，其中这种或每一种HM-CRISPR阵列包含(在5’至3’方向)第一重复序列、第一间隔序列和第二重复序列，其中间隔序列包含能够杂交于宿主细胞中的相应靶标序列的序列，阵列进一步包含用于宿主细胞中重复区和间隔区转录的启动子，并且其中载体不包含Cas核酸酶编码序列和/或用于编码宿主细胞内tracrRNA序列的tracrRNA编码序列，其中tracrRNA序列包含与第一或第二重复区互补的序列，其中HM-CRISPR阵列在宿主细胞内具有把Cas (例如内源性宿主Cas核酸酶)引导至相应的宿主靶标位点的功能(任选地采用宿主tracrRNA)。
55. 段落53或54的方法，其中重复区与宿主CRISPR/Cas系统的重复区相同，其中这种或每一种HM-CRISPR阵列不包含被宿主CRISPR/Cas系统的Cas (例如Cas核酸酶，例如Cas9)识别的PAM。
56. 任何一个前述段落的方法，其中这种或每一种HM-CRISPR阵列包含HM-间隔区的多于1个拷贝(例如至少2、3或4个拷贝)。
57. 编码第二或第三HM-crRNA (另外的HM-crRNA)的任何一个前述段落的方法，其中另外的HM-crRNA包含能够杂交于宿主靶标序列，以把Cas引导至宿主细胞内的靶标的核苷酸序列；任选地其中靶标序列为宿主细胞的、或者宿主细胞的CRISPR/Cas系统必需组分的必需、致病或抗性基因的核苷酸序列。
58. 任何一个前述段落的方法，其中这种或每一种HM-CRISPR阵列包含与宿主细胞内源性CRISPR重复序列相同的用于产生宿主细胞内相应HM-crRNA的CRISPR重复序列。
59. 任何一个前述段落的方法，其中(b)的病毒包含编码其在(a)的宿主细胞内为功能性的Cas (非宿主Cas)的核苷酸序列(例如其中非宿主Cas为I型系统Cas (其中宿主系统为II或III型)、II型系统Cas (其中宿主系统为I或III型)或者III型系统Cas (其中宿主系统为I或II型))，任选地其中宿主细胞不包含或表达与非宿主Cas类型相同类型的Cas。
60. 任何一个前述段落的方法，其中(b)的病毒包含编码tracrRNA序列的核苷酸序列，任选地其中tracrRNA 序列和第一HM-crRNA由单链引导RNA (gRNA)包含。
61. 任何一个前述段落的方法，其中这种或每一种HM-crRNA由相应的单链引导RNA (gRNA)包含。
62. 任何一个前述段落的方法，其中第一HM-阵列对引起第一靶标序列的Cas裂解、第一靶标序列(或包含第一靶标序列的基因)的激活、第一靶标序列(或包含第一靶标序列的基因)的敲落或第一靶标序列的突变为可操纵的。
63. 一种可通过任何一个前述段落的方法获得的病毒、宿主细胞或病毒种群，任选地其中种群与PV1或PV2相同或者病毒可自这样的种群获得。
64. 一种可通过任何一个前述段落的方法获得的宿主细胞(例如细菌细胞)种群，任选地其中种群与PH1、PH2、PH3或PH4或者任何一个前述段落中列举的培养的细胞种群相同。
65. 段落64的宿主细胞种群，其中种群不包含(b)的病毒核酸，或者不包含所述第一HM-阵列或所述第二HM-阵列(例如如通过PCR测定的那样)。
66. 用于医学或牙科和眼科用途(例如用于在生物体治疗或预防感染或者在生物体限制感染的传播)的段落63-65中任何一个的病毒、宿主细胞或种群。
67. 一种用于食品、饮料、乳制品或化妆品用途(例如用于美容产品，例如化妆品)或者用于卫生用途(例如用于卫生用品，例如肥皂)的包含段落63-66中任何一个的病毒、宿主细胞或种群的组合物。
68. 段落63-67中任何一个的组合物、病毒、宿主细胞或种群，在医药或牙科治疗或预防性使用中的用途。
69. 段落63-68中任何一个的组合物、病毒、宿主细胞或种群，在美容用途(例如用于美容产品，例如化妆品)或者用于卫生用途(例如用于卫生用品，例如肥皂)中的用途。
70. 用于修饰微生物宿主细胞(例如用于杀伤或减少细胞生长或微生物细胞的培养)的段落63-69中任何一个的用途、病毒、宿主细胞或种群。
71. 段落1-63和66-70中任何一个的方法、病毒或病毒种群，其中病毒或所述种群中的病毒表达穿孔素和/或细胞内溶素用于宿主细胞溶菌作用，任选地其中细胞内溶素为噬菌体phi11、噬菌体Twort、噬菌体P68、噬菌体phiWMY或噬菌体K细胞内溶素(例如MV-L细胞内溶素或P-27/HP细胞内溶素)。
72. 段落1-63和66-70中任何一个的方法、病毒或病毒种群，其中病毒或所述种群中的病毒不表达穿孔素和/或细胞内溶素用于宿主细胞溶菌作用。
73. 段落1-63和66-70中任何一个的方法、病毒或病毒种群，其中病毒(例如(b)的病毒)或每一种所述种群中的病毒与在(a)宿主细胞中有功能的抗微生物剂例如抗生素，例如β-内酰胺类抗生素(例如在段落13-27的任何一个中列举的抗生素)联合。
腐蚀、生物膜和生物污损的控制
本发明尤其涉及控制工业或家用系统的基底或流体的微生物影响的腐蚀(MIC)或生物污损的方法。本发明还涉及用于这些方法的处理液和载体。
腐蚀为一系列化学、物理和(微)生物过程的结果，导致材料比如金属(例如钢或铁)、塑料和石头的变质。这是一个世界性的问题，具有巨大的社会和经济后果。目前基于用化学方法生产的产品的腐蚀控制策略处于日益严格的环境法规的压力之下。此外，它们相当低效，并可能受到微生物(例如细菌)对所用物质抗性的阻碍。因此，迫切需要环境友好和可持续的腐蚀控制策略。腐蚀受进行不同的电化学反应和分泌可能具有次生效应的蛋白质和代谢物的不同微生物的复杂过程的影响。
微生物腐蚀过程的严重性自许多工业和家用金属和合金比如不锈钢、镍基和铝基合金及材料比如混凝土、沥青和聚合物易于被微生物降解的事实是显而易见的。保护涂层、抑制剂、油和乳剂也会受到微生物降解的影响。
受微生物影响的腐蚀(MIC)为一个昂贵的问题，其影响烃类生产与加工设备、水分配系统、船舶、轨道车及其它类型的金属和非金属的工业和家用系统。特别是已知MIC对烃类燃料基础设施(包括生产、运输和存储系统)造成相当大的损害，通常会带来灾难性的环境污染结果。在石油工业中约40%的管道腐蚀归因于微生物腐蚀，并导致每年在石油生产、运输和仓储方面出现巨大的经济损失。由于管壁上的结垢过程，管道生物膜可造成设备中的流体流速降低。此外，由于腐蚀而产生管道泄漏，随之而来的是对环境和生产率产生影响。
MIC发生于比如土壤、淡水和海水等环境中，并且据估计造成全部腐蚀损坏中的多于30%。MIC由于微生物比如细菌的固定、代谢物的释放和通常形成诱导或加速腐蚀过程的生物膜而发生。在参与腐蚀过程的细菌群(groups)当中包括：硫或硫酸盐还原菌(SRB)、胞外聚合物产生菌(EPSB)、产酸菌(APB)、硫或硫化物氧化菌(SOB)、铁或锰氧化菌(IOB)、产氨菌(AmPB)或产乙酸菌 (AcPB)。小亚单位核糖体RNA基因焦磷酸测序调查表明，醋酸产生菌(醋杆菌属种类和葡糖醋杆菌属种类)在接触燃料级乙醇和水的环境中普遍存在。
环境条件下的微生物生长直接或间接地影响电化学反应。微生物-基底相互作用导致初始粘附和生物膜形成。微生物比如细菌附着于基底、释放代谢物和形成生物膜影响基底表面的电化学条件，诱导或加速腐蚀过程，从而介导MIC过程。在金属基底上形成细菌生物膜包括以下步骤：I- 通过在金属上吸附有机和无机分子形成膜，这修饰金属表面的载荷分布，并且也用作细菌的营养来源，促进液体中存在的自由漂浮微生物的粘附；II- 好氧菌形成微菌落的粘附和增殖；III- 通过一些固着菌产生胞外聚合物(EPS)；IV -通过好氧自由漂浮微生物细胞进行定植，其通过呼吸消耗氧气，在生物膜中建立如严格厌氧菌要求的局部厌氧环境；和V -增加生物膜厚度，这可有利于外层的脱落。由细菌产生的粘附于生物膜的EPS捕获用于其生长的必需离子；除了在养分可用性低的情况下用作营养来源，它们还用作附着的手段，并通过有利于建立差异化的曝气区保护细菌免受生物杀灭剂干扰腐蚀机制。由于生物膜在具有曝气区(生物膜周围)和非曝气区(生物膜下面)的金属基底上分布不均匀而发生差异曝气的腐蚀过程。金属表面的生物膜形成降低含氧量，达到几乎完全厌氧水平。假单胞菌属为主要的EPS产生属。
一个由腐蚀性细菌介导的MIC生物腐蚀过程的实例如下：(A) 来自淡水、海水、工业/家用系统或储槽的好氧腐蚀性细菌伸出其表面具有条件层的工业或家用系统的设备和管道。(B) EPS-产生菌附着于设备/管道壁并产生EPS，为其它微生物创建有利的附着环境。(C) 发生其它腐蚀性细菌群(groups)粘附于管道壁上，释放其代谢物，通过细胞分裂、消耗可用的氧气发展成微菌落。铁氧化菌的作用导致三价铁沉淀大量积累，造成设备/管道堵塞；硫氧化菌释放的硫酸促进环境酸化。(D) 低氧浓度和由产酸菌释放的有机酸有利于产生硫化氢(H2S)的硫酸盐还原菌的附着与发展，从而加速腐蚀过程和降低局部pH。(E) 结果是设备/管道腐蚀，部分被铁沉淀堵塞，伴有微泄漏和细菌生物被膜。H2S对操作被影响系统的人员构成严重的健康风险。此外，产生厚的生物膜和污泥导致生物污损和妨碍系统的功能。
类似地，细菌种群可在液体比如水商店或储库中(例如饮用水或冷却系统的水中)传播，从而介导液体的生物污损。这也可称为液体的恶化变质。一个实例为水道或饮用水储库恶化变质。
本发明通过提供以下方面1以及下列等等解决这样的MIC和生物污损问题：
1. 一种控制工业或家用系统基底的微生物影响的腐蚀(MIC)或生物污损的方法，其中基底的表面与介导基底的MIC或生物污损的第一微生物种类的第一宿主细胞种群接触，方法包括
(i) 使种群与多种能够转化或转导细胞的载体接触，每一种载体包含CRISPR阵列，CRISPR阵列借以引入到宿主细胞中，其中
(a) 每一种CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的核苷酸序列和用于在宿主细胞序列转录的启动子；和
(b) 每一个crRNA能够杂交于宿主细胞的靶标序列，以在宿主细胞内引导Cas (例如Cas核酸酶，例如Cas9或Cpf1)修饰靶标序列(例如切割靶标序列)；靶标序列为用于介导宿主细胞生存能力的基因序列；和
(ii) 使得所述cRNAs在宿主细胞中于Cas存在下进行表达，从而修饰宿主细胞内的靶标序列，导致宿主细胞生存能力减小并控制所述基底的MIC或生物污损。
在一个实例中，系统包含设备(例如用于工业过程)和表面为所述设备的表面。在一个实例中，每一种阵列为工程化阵列，例如本文公开的任何工程化阵列。在一个实施方案中，载体为本文描述的工程化CRISPR核酸载体。在一个实例中，生物污损包括微生物生物膜和/或污泥的形成、增殖或维持。在一个实例中，第一宿主细胞为固着的。在方面1或4的一个实例中(以下)，“控制”包括防止、减少或消除所述MIC或生物污损，或者减少所述MIC或生物污损在系统中的扩散。细菌如何介导MIC或生物污损的非限制性实例在以上描述。细胞生长或增殖或维持为例如细胞生存能力的特征。因此，在一个实例中，方法减少宿主细胞增殖和/或维持。在一个实例中，方法杀伤宿主细胞。
2. 方面1的方法，其中所述宿主细胞被与所述基底接触的微生物生物膜包含。
3. 任何一个前述方面的方法，其中所述表面和宿主细胞与流体比如水性液体(例如海水、淡水、储存水或饮用水)接触。
淡水为地球表面以冰原、冰盖、冰川、冰山、沼泽、池塘、湖泊、河流和溪流以及地下作为含水层和伏流中的地下水天然存在的水。淡水通常特征为具有低浓度的溶解盐和其它完全溶解的固体。这个术语具体地讲不包括海水和苦咸水，尽管其确实包括富含矿物质的水比如铁质泉。在一个实例中所述淡水为这些淡水类型中的任何一种。饮用水为供人或动物(例如牲畜)消费的水。在一个实例中，流体选自工业冷却水(其中系统为冷却系统)、污水(其中系统为污水处理或储存系统)、饮用水(其中系统为饮用水处理、储存、运输或输送系统)、造纸水(其中系统为纸张制造或加工系统)、游泳池水(其中系统为泳池或泳池水处理或储存系统)、灭火器用水(其中系统为灭火系统)、或者任何管道、槽、坑、池或通道中的工业过程用水。
4. 一种控制工业或家用系统中流体的微生物污损(例如用于控制储库或容器中流体的细菌恶化变质)的方法，其中流体包含介导所述生物污损的第一微生物种类的第一宿主细胞种群，方法包括
(i) 使种群与多种能够转化或转导细胞的载体接触，每一种载体包含CRISPR阵列，CRISPR阵列借以被引入到宿主细胞中，其中
(a) 每一种CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的序列和用于在宿主细胞内序列转录的启动子；和
(b) 每一个crRNA能够杂交于宿主细胞的靶标序列，以引导宿主细胞内的Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列(例如切割靶标序列)；靶标序列为介导宿主细胞生存能力的基因序列；和
其中方法包括所述使得cRNAs在宿主细胞中于Cas存在下进行表达，从而修饰宿主细胞内的靶标序列，导致宿主细胞生存能力减小并控制所述生物污损。
在一个实例中，流体为液体。在一个实例中，流体为气态流体。
系统：一种用于任何一个方面的实例系统选自：
石化产品回收、加工、储存或运输系统；烃类回收、加工、储存或运输系统；原油回收、加工、储存或运输系统；天然气回收、加工、储存或运输系统(例如油井、石油钻井平台、石油钻探设备、油品泵送系统、石油管道、天然气钻井平台、天然气开采设备、天然气泵送设备、天然气管道、油轮、气槽船、储油装备或储气装备)；水处理或储存设备、蓄水池(例如饮用水蓄水池)；空气或水调节(例如冷却或加热)设备，例如冷却液管、冷凝器或热交换器；医疗或手术设备、环境(例如土壤、水道或空气)处理设备、纸张制造或回收设备、发电厂例如火力或核能发电厂、燃料(例如烃类燃料，例如石油、柴油或LPG)储存设备；采矿或冶金、矿物或燃料回收系统例如矿山或采矿设备；工程系统、船舶设备、货物或货物储存设备(例如货物集装箱)；食品或饮料制造、加工或包装设备；清洗设备(例如洗衣设备，例如洗衣机或洗碗机)、餐饮(例如家庭或商业餐饮)设备、耕作设备、建筑(例如建筑、公用事业基础设施或道路施工)设备、航空设备、航空航天设备、运输设备(例如机动车辆(例如汽车、卡车或货车))、轨道车、航空器(例如飞机)或者海洋或水路交通车辆(例如船只或船舶，潜艇或气垫船))、包装设备例如消费品包装设备、或者食品或饮料包装设备、电子产品(例如计算机或移动电话或其电子元件)、或者电子产品制造或包装设备、牙科设备、工业或家用管道(例如海底管道)或储存容器(例如水槽或燃料箱(例如油箱，例如车辆油箱))、地下设备、建筑物(例如住宅或办公室或商业楼宇或工厂或发电站)、道路、桥梁、农业设备、工厂系统、原油或天然气勘探设备、办公室系统和家居系统。
在一个实例中，系统用于选自以下的工业或商业：农业、石油或石化工业、食品或饮料行业、服装行业、包装行业、电子行业、计算机行业、环境行业、化学工业、航空航天工业、汽车行业、生物技术行业、医疗行业、健康行业、牙科产业、能源产业、消费品产业、医药工业、采矿业、清洗业、林业、渔业、休闲业、回收业、化妆品业、塑胶工业、纸浆或造纸工业、纺织业、服装行业、皮革或仿麂皮或兽皮行业、烟草行业或钢铁行业。在一个实例中，待处理的表面或流体为用于所述所选择的行业的设备的表面或流体。在一个实例中，系统用于原油工业。在一个实例中，系统用于天然气工业。在一个实例中，系统用于石油工业。在一个实例中，系统为海运集装箱、平台或钻井平台(例如用于海上或海上的石油或天然气平台或钻井平台)、船舶或船只。在一个实施方案中，这样的系统锚定在海上，例如非暂时性锚定在海上，例如已经在海上锚定1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个月(例如连续几个月)。在一个实施方案中，这样的系统处于国家或州的水域中，例如非暂时性地在这样水域的海水中，例如已经处于所述国家的水域中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个月(例如连续几个月)。
在一个实例中，待处理的基底表面包括不锈钢，碳钢、铜、镍、黄铜、铝、混凝土、塑料或木材。在一个实例中，基底为金属焊接或连接。在一个实例中，表面为金属(例如钢或铁)或非金属(例如塑料、混凝土、沥青、木材、橡胶或石料)表面。在一个实例中，金属为合金(例如不锈钢、黄铜或者镍、锌、铜、镍或铝合金)。在一个实例中，表面为人造聚合物表面。在一个实例中，表面为基底涂层。在一个实例中，基底与土壤、淡水或海水接触。
在一个实例中，流体为饮用水、水道、苦咸水；或者液体燃料例如汽油或柴油(例如用于小汽车或机动车辆)、LPG、煤油、醇(例如乙醇、甲醇或丁醇)、液体氢或液态氨)，在一个实例中，燃料为储存的液体燃料。在一个实例中，流体为油或非水性流体。在一个实例中，流体为由水道或水体例如海水、淡水、饮用水、河流、溪流、池塘、湖泊、蓄水池、储存水(例如储水槽或冷却设备)、地下水、井水、岩层中的水、土壤水或雨水包含的流体。在一个实例中，流体为海水。在一个实例中，基底与该段落中提及的液体接触。在一个实例中，流体或液体选自油、水溶液、水力压裂液、燃料、二氧化碳、天然气、油/水混合物、燃料/水混合物、含盐的水、海洋或海水、苦咸水、淡水来源、湖泊、河流、溪流、沼泽、池塘、沼泽地、来自冰雪融化的径流、泉水、地下水、地下蓄水层、降水、在环境温度下(例如在室温下)为液体并为疏水性的但是可溶于有机溶剂的任何物质、己烷类、苯、甲苯、氯仿、乙醚、植物油类、石化油类、原油、精炼石化产品、挥发性精油、化石燃料、汽油、烃类混合物、喷气式飞机燃料、火箭燃料、生物燃料。在一个实例中，流体为油/水混合物。
本文使用的术语“微生物影响的腐蚀”或“MIC”，除非另外指明，指的是其中系统的任何元件(基底)由于微生物种群例如细菌或古细菌种群中至少一个成员的作用而结构上受到危害的过程。本文使用的术语“生物污损”，除非另外指明，指的是其中微生物(比如细菌和/或古生菌)在与流体(例如水或水性液体、或烃类、或石油化学品)接触的基底表面积累的过程。也包括流体(例如水或水性液体、或烃类、或石油化学品)中微生物(比如细菌和/或古生菌)不合需要的积累与增殖，即流体的“恶化变质”。在一个实例中，细菌由船舶或船只压载水包含，并且细菌为环境上不合需要的。本文使用的术语“基底”指的是上面可附着细胞并可形成和生长生物膜或者上面可发生生物污损(例如形成粘液或淤泥)的任何类型表面。基底可为“工业”基底比如石化、燃料、原油或天然气管道系统的设备表面，或者“非工业”(例如家庭，例如家居或办公室)基底比如厨房台面或淋浴器基底或花园基底。
在任何一个方面的备选方案中，代替宿主细菌细胞的种群，种群为第一种类古细菌细胞的种群。
5. 方面4的方法，其中所述液体为水性液体(例如海水、淡水、储存水或饮用水)。
6. 方面3-5中任何一个的方法，其中方法包括混合流体与载体，从而使宿主细胞与载体接触。例如，载体可与液体(任选地也含有抗生素或生物杀灭剂)预混合，并然后把混合物加入到与表面接触的流体(方面1)或方面4的流体中。
7. 方面1-6中任何一个的方法，其中每一种靶标序列为宿主细胞致病、抗性或必需基因序列，例如其外显子或调控序列。抗性可为抗生素抗性。在一个实例中，宿主细胞与所述抗生素和所述载体接触，以减少宿主细胞生存能力。
8. 方面1-7中任何一个的方法，其中靶标序列的修饰导致宿主细胞杀伤和/或减少宿主细胞生长或增殖。增殖为例如与表面接触的细胞扩增或细胞分布。
9. 方面1-8中任何一个的方法，其中载体包含相同的CRISPR阵列。
10. 方面1-9中任何一个的方法，其中宿主细胞为细菌或古细菌细胞。在一个备选方案中，相反第一细胞为藻类细胞。
11. 方面1-10中任何一个的方法，其中第一宿主细胞为硫酸盐还原菌(SRB)细胞(例如脱硫弧菌属或脱硫肠状菌属细胞)。在一个实例中，细胞选自致黑脱硫肠状菌、地下脱硫状菌、运动热脱硫杆菌属、嗜热脱硫弹状菌属(Thermodesulforhabdus norvegicus)、闪烁古生球菌、脱硫微菌属apsheronum (Desulfomicrobium apsheronum)、脱硫弧菌属gabonensis (Desulfovibrio gabonensis)、长脱硫弧菌、脱硫弧菌属vietnamensis(Desulfovibrio vietnamensis)、鲸脱硫杆菌、脱硫肠菌属halophilum (Desulphomaculumhalophilum)、脱硫杆菌属vibrioformis (Desulfobacter vibrioformis)和嗜热脱硫肠状菌细胞。在一个实例中，种群包含这些细胞种类中两种或多种的混合。
12. 方面11的方法，其中表面或流体由原油、天然气或石化产品回收、加工、储存或运输设备包含。原油为世界上最重要的能源资源之一。其用作许多行业(包括炼油-石化行业)的原材料，其中原油通过各种工艺流程精炼成消费品比如汽油、油类、石蜡油、润滑剂、沥青、家用燃油、凡士林和聚合物。石油衍生产品也常用于许多其它化学过程。在一个备选方案中，流体为所述消费品或者表面与这样的消费品接触。
13. 方面11或12的方法，其中表面与海水、压裂液或井中液体接触；或者其中流体为海水、压裂液或井中液体。
14. 方面1-13中任何一个的方法，其中方法的步骤(i)包括提供第二种类的微生物细胞种群(第二宿主细胞)，第二细胞包含所述载体，其中载体能够自第二宿主细胞中转移至第一宿主细胞；并使第二宿主细胞与第一宿主细胞联合，借以把载体引入到第一宿主细胞中。在一个实例中，第二细胞在环境(例如在水或土壤环境)中为环境、工业或家庭可接受的，并且第一宿主细胞为环境中不可接受的。
15. 方面14的方法，其中第一宿主细胞在与所述载体接触之前由微生物细胞的混合体包含(例如由微生物生物膜包含)，其中混合体包含所述第二种类的细胞。
16. 方面14或15的方法，其中所述第二种类为芽胞杆菌属或硝酸盐还原菌或硝酸盐还原-硫化物氧化细菌(NRB)的种类。
17. 方面16的方法，其中NRB选自弯曲菌属种类、硝化菌属种类、亚硝化单胞菌属种类、硫微螺菌属种类、硫磺单胞菌属种类、陶厄氏菌属种类、副球菌属种类、假单胞菌属种类、红细菌属种类和脱硫弧菌属种类；或者包含至少2个所述种类。
18. 方面17的方法，其中NRB选自NRB选自普通消化杆菌、欧洲亚硝化单胞菌、施氏假单胞菌、铜绿假单胞菌、脱氮副球菌、硫磺单胞菌属deleyianum (Sulfurospirillum deleyianum)和类球红细菌。
19. 方面1-18中任何一个的方法，其中方法包括使所述第一种类的宿主细胞同时或依序与含有所述载体的生物杀灭剂接触。在一个实例中，载体和生物杀灭剂在与宿主细胞接触的组合物中被提供预混合。
20. 方面19的方法，其中生物杀灭剂选自四羟甲基硫酸鏻(THPS)、戊二醛、一氧化氯、二氧化氯、次氯酸钙、次氯酸钾、次氯酸钠、二溴氰基乙酰胺(DBNPA)、二硫氰基甲烷(MBT)、2-(氰硫基甲基硫代)苯并噻唑(TCMTB)、布罗波尔、2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇(BNPD)、三丁基十四烷基氯化鏻(TTPC)、牛磺酰胺及其衍生物、酚类、季铵盐类、含氯物质、喹醛啶盐类、内酯类、有机染料、缩氨基硫脲类、醌类、氨基甲酸酯类、脲、水杨酰胺、对称二苯脲、胍(guanide)、脒类、咪唑啉类、乙酸、苯甲酸、山梨酸、丙酸、硼酸、无水醋酸、亚硫酸、香草酸、对-羟基苯甲酸酯类、异丙醇、丙二醇、苄醇、氯丁醇、苯乙醇、甲醛、碘及其溶液、聚维酮碘、六亚甲基四胺、羟甲基甲硫脲、1- (3-氯烯丙基)-3,5,7-三偶氮(triazo)-1-氮鎓金刚烷氯化物、滔罗定、滔罗胺、N-(5- 硝基-2-呋喃甲叉)-1-氨基-乙内酰脲、5-硝基-2-糠醛缩氨基脲、3,4,4’-三氯二苯脲、3,4’,5-三溴水杨酰苯胺、3-三氟甲基-4,4’-二氯对称二苯脲、8-羟基喹啉、l-环丙基-6-氟-l,4-二氢-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸、1,4-二氢-1-乙基-6-氟-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸、过氧化氢、过乙酸、氧氯苯磺酸钠、对氯间二甲苯酚、2,4,4’-三氯-2’-羟基联苯酚、麝香草酚、双氯苯双胍己烷、苯扎氯铵、西吡氯铵、磺胺嘧啶银、硝酸银、溴、臭氧、异噻唑啉酮、聚氧乙烯(二甲基亚氨基)亚乙基(二甲基亚氨基)亚乙基二氯化物、2-(叔丁基氨基)-4-氯-6-乙基氨基-5’-三嗪(特丁津)及其联合。在一个实例中生物杀灭剂为四羟甲基硫酸鏻(THPS)。在一个实例中，生物杀灭剂为季铵化合物。
21. 方面1-20中任何一个的方法，其中系统用于选自以下的行业操作：采矿、航运；原油、天然气或石化产品的回收或加工；水力压裂、空气或水加热或冷却；饮用水生产、储存或输送；烃类的运输以及废水处理。
22. 方面21的方法，其中表面为在所述所选择的行业使用的设备表面，或者其中流体为由所述所选择的行业使用的设备包含的流体。
23. 方面1-22中任何一个的方法，其中表面为厨房、洗浴或园艺设备的表面，或者其中流体由厨房、洗浴或园艺设备包含。例如，设备用于家庭设置。
24. 当依赖于方面3时方面1-23中任何一个的方法，其中流体为容器(例如水槽或瓶)中含有的适于饮用的流体并且表面为与流体接触的容器表面。
25. 方面1-24中任何一个的方法，其中每一种载体包含可动遗传元件(MGE)，其中MGE包含转移起始位点(oriT)和所述CRISPR阵列；其中MGE能够在所述第一种类的宿主细胞与所述行业或家用系统的另外微生物宿主细胞之间转移。例如，另外的细胞在环境(例如在水或土壤环境)中为环境、行业或家庭可接受的，并且第一宿主细胞为环境中不可接受的。
26. 方面25的方法，其中oriT在第一和另外的宿主细胞中为功能性的。
27. 方面25或26的方法，其中所述第一和另外的宿主细胞由与所述表面接触的流体生物膜包含；或者其中所述细胞由所述流体包含。
28. 方面25、26或27的方法，其中所述另外的细胞为如在方面16-18的任何一个中列举的种类的细胞。在一个实例中，MGE能够自另外的细胞转移至第一宿主细胞和/或反之亦然。
29. 方面25-27中任何一个的方法，其中另外的细胞为所述第一种类的细胞。
例如，在一个实施方案中MGE能够在所述系统种群的第一细胞当中转移。当MGE在转移过程中将自身的拷贝留给其它细胞时，然后这提供了用于传播和扩散MGE，并因此CRISPR阵列通过系统中的细胞群传播和扩散的手段，从而扩散阵列的靶标序列修饰效果。这可例如在与表面接触的生物膜中或流体中有效建立阵列的传播，并且当对常规生物杀灭剂的生物膜渗透为次佳时是有用的。
30. 方面25-29中任何一个的方法，其中每一种MGE为或包含整合性接合元件(ICE)；或者其中每一种载体为能够感染所述第一种类的宿主细胞的噬菌体，并且每一种MGE为能够在细胞之间进行所述转移的噬菌体核酸。
31. 方面30的方法，其中每一种ICE为转座子，例如接合转座子。
32. 方面1-31中任何一个的方法，其中每一种载体为任选地包含方面25-31中任何一个的MGE的质粒。
33. 方面25-32中任何一个的方法，其中第一和/或另外的细胞包含编码对使MGE转移至其它细胞为可操纵的蛋白的核苷酸序列，其中序列不由MGE包含。
34. 方面33的方法，其中序列不由载体包含。
35. 方面33的方法，其中序列由第一细胞和/或另外细胞的接合转座子包含。
36. 方面35的方法，其中转座子对使MGE在第一和另外细胞之间转移是反式可操纵的。
37. 方面25-36中任何一个的方法，其中MGE的oriT与由第一细胞和/或另外细胞的ICE包含的oriT相同，其中ICE对使MGE在第一和另外细胞之间转移是反式可操纵的。
38. 方面25-37中任何一个的方法，其中载体oriT为SRB或SRB转座子的oriT。
39. 方面25-38中任何一个的方法，其中每一种MGE包含第一和第二末端重复序列和重复序列之间的所述CRISPR阵列。
40. 方面25-39中任何一个的方法，其中MGE在以下位置留下CRISPR阵列拷贝：(1)当其已转移至所述另外的宿主细胞时，在第一宿主细胞的基因组中；或(2) 当其已转移至第一宿主细胞时，在所述另外的宿主细胞中。例如，拷贝由从中发生转移的细胞基因组中留下的转座子或前噬菌体包含。
41. 方面25-40中任何一个的方法，其中第一和另外的细胞为不同种类的细菌细胞(例如分别为SRB和NRB、或者SRB和芽孢杆菌属细胞)。
42. 与用于迁移MGE的转座酶联合的当依赖于方面30时的方面25-41中任何一个的方法。
43. 方面1-42中任何一个的方法，其中载体或MGE包含在所述第一种类的宿主细胞可操纵的毒素-抗毒素模块；任选地其中毒素-抗毒素模块包含在另一种类的细胞中不可操纵或操纵减少的抗毒素基因。这些实施方案用于建立选择压力，该压力有利于载体/MGE(并因此为CRISPR阵列)保留在包含靶标序列的第一宿主细胞内。
44. 方面1-43中任何一个的方法，其中载体或MGE包含在所述第二或另外的细胞可操纵的毒素-抗毒素模块；任选地其中毒素-抗毒素模块包含在除了第二或另外细胞的细胞中不可操纵或操纵减少的抗毒素基因。这用于把CRISPR阵列的种群保持在第二或另外的细胞中(例如当这样的细胞存在于也包含第一细胞的生物膜中时)，但是其中毒素-抗毒素模块在第一宿主细胞提供另外的杀伤(超过靶标序列修饰的作用)。在一个实例中，载体或MGE包含在第一宿主细胞和在所述第二或另外的细胞可操纵的毒素-抗毒素模块。
45. 方面43或44中任何一个的方法，其中毒素-抗毒素模块在除第一和第二或另外细胞外的细胞中不可操纵或操纵减少。因此，在第一和第二(或另外)细胞两者可存在选择压力以保持CRISPR阵列。通常，这然后提供了用于在混合种群(例如接触表面的生物膜或由流体包含的种群)的细胞之间水平转移MGEs阵列的储库。
46. 方面25-45中任何一个的方法，其中第一和第二细胞(或者第一和另外的细胞)属于相同的门(例如两种细菌细胞)，并且载体为在以下可复制或可操纵的：(A) 在第一细胞和/或第二(或另外)细胞但是不在相同门的另一细胞；(B) 在第一细胞和/或第二(或另外)细胞但是不在相同目的另一细胞；(C) 在第一细胞和/或第二(或另外)细胞但是不在相同纲的另一细胞；(D) 在第一细胞和/或第二(或另外)细胞但是不在相同目的另一细胞；(E) 在第一细胞和/或第二(或另外)细胞但是不在相同科的另一细胞；(F) 在第一细胞和/或第二(或另外)细胞但是不在相同属的另一细胞；或(G) 在第一细胞和/或第二(或另外)细胞但是不在相同种类的另一细胞。
47. 方面25或当依赖于方面25时方面26-46中任何一个的方法，其中每一种MGE为接合转座子，oriT在第一和另外(或第二)宿主细胞中为功能型的，MGE包含第一和第二末端重复序列和重复序列之间的所述CRISPR阵列，并且其中第一和另外(或第二)细胞为细菌细胞，其中靶标位点由第一细胞而非另外(或第二)细胞包含，并且其中所述修饰使第一细胞中包含所述靶标的基因或调控序列失活或下调，导致第一宿主细胞生存能力减小并控制所述MIC或生物污损。
48. 方面1-47中任何一个的方法，其中每一种CRISPR阵列包含用于在第一宿主细胞表达和产生相应crRNA的序列R1-S1-R1’，
(i) 其中R1为第一CRISPR重复区，R1’为第二CRISPR重复区，和R1或R1’为任选的；和
(ii) S1为第一CRISPR间隔区，其包含或由与所述第一宿主细胞的靶标序列具有95%或更多同一性的核苷酸序列组成。
49. 方面48的方法，其中R1和R1’分别与第一宿主细胞种类的CRISPR阵列的第一和第二重复序列具有至少95、96、97、98或99%同一性。在一个实施方案中，存在R1和R1’两者。
50. 方面48或49的方法，其中R1和R1’具有所述第一种类的所述宿主细胞的CRISPR/Cas系统修饰靶标序列的功能。
51. 方面48-50中任何一个的方法，其中第一宿主细胞为硫酸盐还原菌(SRB)，并且R1和R1’分别与第一宿主细胞种类的CRISPR阵列的重复序列(例如第一重复区)具有至少95、96、97、98或99%同一性。
52. 方面51的方法，其中R1和R1’分别与选自SEQ ID NOs: 50-74的重复序列具有至少95、96、97、98或99%同一性。参见表1。在一个实施方案中，存在R1和R1’两者。
53. 方面51的方法，其中R1和R1’分别与选自SEQ ID NOs: 51、54和69的重复序列具有至少95、96、97、98或99%同一性。SEQ ID NOs: 51、54和69存在于多于1个SRB种类中。这对于用本发明的CRISPR阵列靶向多于1个SRB类型特别有用，例如当这些SRB类型共存于待处理的行业或家用系统中，例如共存于与待处理的基底接触或流体中的种群或生物膜中时。在一个实施方案中，存在R1和R1’两者。
54. 方面48-53中任何一个的方法，其中R1和R1’的序列相同。
55. 方面1-54中任何一个的方法，其中被引入到第一宿主细胞的每一种阵列与一种或多种Cas核酸酶(例如Cas9和/或Cfp1)联合引入，其具有宿主细胞内相应crRNA修饰其靶标序列的功能。
在一个实例中，本文任何一种构造的Cas被使核酸酶活性失活，并且任选地包含靶标序列激活剂或阻遏物。本文的Cas9为例如化脓性链球菌或金黄色葡萄球菌Cas9。
56. 方面1-55中任何一个的方法，其中被引入到第一宿主细胞的每一种阵列与编码一种或多种Cas核酸酶(例如Cas9和/或Cfp1)的核酸序列联合引入，其具有宿主细胞内相应crRNA修饰靶标序列的功能。
57. 方面48-56中任何一个的方法，其中R1和R1’具有II型Cas9核酸酶修饰所述第一宿主细胞内的靶标序列的功能，任选地其中方法进一步依据方面55或56，其中Cas为上所述Cas9。
58. 方面1-57中任何一个的方法，其中所述载体或MGEs中的全部或一些不包含对于相应阵列可操纵的Cas核酸酶编码序列。
59. 方面58的方法，其中每一种所述相应阵列对于第一种类细胞中发现的Cas核酸内切酶是可操纵的。
60. 方面25或当依赖于方面25时方面26-59中任何一个的方法，其中每一种MGE没有对阵列的重复序列可操纵的编码Cas核酸内切酶的序列，和其中相应的载体在MGE外面包含这样的序列(例如编码Cfp1的Cas9)。
61. 一种控制由原油、天然气或石化产品回收、加工、储存或运输设备(例如原油油轮、石油钻井平台或石油钻探设备)包含的基底的微生物影响的腐蚀(MIC)或生物污损的方法，其中基底的表面与第一宿主细胞的种群接触，其中第一宿主细胞为介导基底的MIC或生物污损的第一种类的硫或硫酸盐还原菌(SRB)、胞外聚合物产生菌(EPSB)、产酸菌(APB)、硫或硫化物氧化菌(SOB)、铁氧化菌(IOB)、锰氧化菌(MOB)、产氨菌(AmPB)或产乙酸菌(AcPB)，其中表面和细胞种群与选自海水、淡水、压裂液或井(例如石油或天然气井)中液体的液体接触，方法包括
(i) 通过混合液体与多种能够转化或转导第一宿主细胞的载体，使细胞种群与载体接触，每一种载体包含CRISPR阵列，CRISPR阵列借以被引入到宿主细胞中，其中
(a) 每一种CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的序列和用于在宿主细胞序列转录的启动子；
(b) 每一个crRNA能够杂交于宿主细胞的靶标序列，以引导宿主细胞内的Cas (例如Cas核酸酶，例如Cas9或Cfp1)修饰靶标序列(例如切割靶标序列)；靶标序列为用于介导宿主细胞生存能力的基因序列；
(c) 其中每一个(a)的序列包含用于在第一宿主细胞表达和产生相应crRNA的序列R1-S1-R1’，其中R1为第一CRISPR重复区，R1’为第二CRISPR重复区，和R1或R1’为任选的；和S1为第一CRISPR间隔区，其包含或由与所述第一宿主细胞的靶标序列具有70、75、80、85、90或95%或更多同一性的核苷酸序列组成；和
(ii) 使得所述cRNAs在宿主细胞中于Cas存在下进行表达，从而在宿主细胞内修饰靶标序列，导致宿主细胞生存能力减小并控制所述基底的MIC或生物污损。在一个实施方案中，存在R1和R1’两者。
62. 方面61的方法，其中方法依据方面1或当依赖于方面1时的任何一个前述方面。
63. 方面61或62的方法，其中每一种载体为能够感染第一宿主细胞的噬菌体，或者为包含其含有所述CRISPR阵列的MGE (例如转座子)的载体，其中MGE能够转移至第一宿主细胞内。
64. 方面61、62或63的方法，其中第一细胞为硫酸盐还原菌(SRB)细胞，例如脱硫弧菌属或脱硫肠状菌属细胞。
65. 方面64的方法，其中R1和R1’分别与第一宿主细胞种类的CRISPR阵列的重复序列(例如第一重复区)具有至少95、96、97、98或99%同一性，并且载体阵列对于存在于第一种类细胞内的Cas核酸内切酶为可操纵的。在一个实例中，R1和R1’为相同的序列。
66. 方面65的方法，其中R1和R1’分别与选自SEQ ID NOs: 50-74的重复序列具有至少95、96、97、98或99%同一性。在一个实例中，R1和R1’为相同的序列。
67. 方面66的方法，其中R1和R1’分别与选自SEQ ID NOs: 51、54和69的重复序列具有至少95、96、97、98或99%同一性。参见表1。这对于用本发明的CRISPR阵列靶向多于1个SRB类型特别有用，例如当这些SRB类型共存于待处理的行业或家用系统中，例如共存于与待处理的基底接触或流体中的种群或生物膜中时。在一个实例中，R1和R1’为相同的序列。
68. 方面1-67中任何一个的方法，其中所述多种载体包括另外的载体，其中每一种另外的载体包含一种或多种用于靶向由所述种群包含的另外宿主细胞的CRISPR阵列，其中另外的宿主细胞种类不同于第一宿主细胞种类，其中在步骤(i)中种群的所述另外细胞与多种能够转化或转导另外细胞的所述另外载体接触，每一种载体包含CRISPR阵列，CRISPR阵列借以被引入到另外的宿主细胞内，其中
(a) 每一种CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的序列和用于宿主细胞内序列转录的启动子；和
(b) 每一种crRNA能够杂交于所述另外宿主细胞的靶标序列，以引导宿主细胞内的Cas(例如Cas核酸酶)修饰靶标序列(例如切割靶标序列)；靶标序列为用于介导宿主细胞生存能力的基因序列；和
步骤(ii)包括使得所述cRNAs在所述另外的宿主细胞中于Cas存在下进行表达，从而修饰另外宿主细胞内的靶标序列。
69. 方面68的方法，其中另外的宿主细胞介导所述基底或流体的MIC或生物污损，其中步骤(ii)导致另外宿主细胞的生存能力减小并控制所述基底或流体的MIC或生物污损。
70. 一种控制船舶或船只压载水的细菌生物污损的方法，其中水包含介导所述生物污损的第一微生物种类的第一宿主细胞种群，方法包括
(i) 使种群与多种能够转化或转导细胞的载体接触，每一种载体包含CRISPR阵列，CRISPR阵列借以被引入到宿主细胞中，其中
(a) 每一种CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的序列和用于在宿主细胞序列转录的启动子；和
(b) 每一种crRNA能够杂交于宿主细胞的靶标序列，以引导宿主细胞内的Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列(例如切割靶标序列)；靶标序列为用于介导宿主细胞生存能力的基因序列；和
(ii) 使得所述cRNAs在宿主细胞中于Cas存在下进行表达，从而在宿主细胞内修饰靶标序列，导致宿主细胞生存能力减小并控制所述生物污损。
71. 方面70的方法，其中第一宿主细胞为霍乱弧菌、大肠杆菌或肠球菌种类细胞。
72. 方面70或71的方法，其中步骤(i)包括例如在船舶或船只的船体中混合压载水与载体。
73. 方面70-72中任何一个的方法，其中船舶或船只为海上运输工具和水为海水。
74. 方面70-72中任何一个的方法，其中不是船舶或船只，压载水由集装箱或海上钻井平台，例如石油平台或石油钻井平台包含。在一个实例中，船舶、船只、集装箱、平台或钻井平台锚定在海上(即暂时不在其位置上)。
75. 一种自船舶或船只排放压载水的方法，其中排放的压载水包含通过方面70-74中任何一个的方法处理的水。
76. 方面75的方法，其中水被排入水体例如海、海洋或水道(例如河流、运河、湖泊或水库)或者排入集装箱中。
77. 包含CRISPR阵列的压载海水，其中压载水通过方面70-76中任何一个的方法得到或可得到。
78. 一种包含方面77的压载海水的船舶、船只、集装箱或钻井平台。
79. 一种用于方面61-69中任何一个的方法的载体，其中第一细胞为硫酸盐还原菌(SRB)细胞，例如脱硫弧菌属或脱硫肠状菌属细胞，每一种载体包含一种或多种用于靶向SRB的CRISPR阵列，其中每一种阵列如在方面61的(a)-(c)中那样定义。
80. 方面79的载体，其中R1和R1’依据方面65-67中的任何一个。
81. 一种用于方面70-76中任何一个的方法的载体，其中第一细胞为霍乱(例如弧菌属，例如O1或O139)、大肠杆菌或肠球菌种类细胞，载体包含一种或多种用于靶向细胞的CRISPR阵列，其中每一种阵列如在方面70的(a)和(b)中定义的那样。
82. 方面79-81中任何一个的载体，其中载体为能够感染所述细胞的细菌噬菌体。
83. 方面79-81中任何一个的载体，其中载体为能够转移至所述细胞的转座子或MGE。
84. 任选地与能够减少所述细胞生存能力的生物杀灭剂或抗生素联合的多种载体，其中每一种载体依据方面82或83。
介导MIC或生物污损的细菌：在一个实例中，第一宿主细胞选自硫或硫酸盐还原菌(SRB)、胞外聚合物产生菌(EPSB，例如假单胞菌属)、产酸菌(APB)、硫或硫化物氧化菌(SOB)、铁或锰氧化菌(IOB)、产氨菌(AmPB)和产乙酸菌(AcPB)。例如，第一宿主细胞为AcPB(例如醋酸杆菌和/或葡糖酸醋杆菌)并且表面与烃类燃料(例如燃料级乙醇)和/或水接触。
以下为用于本发明的相关细菌的实例(在一个实例中，第一宿主细胞为以下种类中任何一种的细胞)。嗜酸硫杆菌属细菌产生硫酸。嗜酸性氧化硫硫杆菌(一种嗜酸硫杆菌属细菌的亚属)经常损坏污水管。氧化亚铁铁杆菌直接把铁氧化为铁氧化物和氢氧化物。其它细菌产生各种酸(有机的和矿物的两者)或者氨。在氧的存在下，需氧菌像氧化硫硫杆菌、排硫硫杆菌和蚀阴沟硫杆菌(所有三种广泛存在于环境中)，为引起生源硫化物腐蚀的常见腐蚀因素。没有氧气存在下，厌氧菌尤其是脱硫弧菌属和脱硫肠状菌属为常见的。需盐脱硫弧菌需要至少2.5%浓度的氯化钠，但普通脱硫弧菌和脱硫脱硫弧菌能在淡水和咸水两者中生长。非洲脱硫弧菌为另一种常见的引起腐蚀的微生物。脱硫肠状菌属包括还原硫酸盐的芽孢形成菌。东方脱硫肠状菌和致黑脱硫肠状菌参与腐蚀过程。硫酸盐还原剂需要还原环境，需要至少-100 mV的电极电位才能使其茁壮成长。然而，即使是产生少量的硫化氢也能实现这种转变，因此一旦开始生长，就会加速。
在一个实例中，第一宿主细胞为粘质沙雷氏菌、披毛菌属种类、假单胞菌属种类、芽孢杆菌属种类(例如枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、短小芽胞杆菌或巨大芽孢杆菌)、硫杆菌属种类、硫化叶菌属种类、奥克西托克雷白杆菌、铜绿假单胞菌、施氏假单胞菌、微球菌属、肠球菌属、葡萄球菌属(例如金黄色葡萄球菌)、粪肠球菌或藤黄微球菌细胞。在一个实例中，第一宿主细胞包含两种或多种所述种类的混合体。这些种类已从位于印度西北和西南地区的柴油和轻油运输管道中分离出来，证实了在这些菌群存在下与管线钢管局部腐蚀的关联性。不同的欧洲飞机制造商联合项目证实，在飞机构造中常用的铝合金的强烈腐蚀损伤来自种属微球菌属、肠球菌属、葡萄球菌属和芽孢杆菌属的分离物的参与。这些细菌可能会创建一个微酸性环境(产酸菌)，这有利于其它细菌的发展，或者产生EPS，有利于生物膜的形成(EPS产生菌)。因此，在本发明的一个实施方案中，待处理的系统表面(例如钢制品表面)与柴油或轻油接触，或者待处理的流体为柴油或轻油(并且任选地第一宿主细胞属于该段落中定义的一个或多个种类)。在本发明的一个实施方案中，待处理的系统表面(例如含铝表面，例如航空器表面)与1种、2种、3种或所有以下种属接触：微球菌属、肠球菌属、葡萄球菌属和芽孢杆菌属(第一宿主细胞)。在该段落中任何一个实施方案例的一个实例中，表面为系统的钢或铝部件的表面。
产酸菌：需氧菌能够产生短链有机酸比如乙酸、甲酸、乳酸、丙酸和丁酸作为其来自有机材料发酵代谢的代谢产物。由于需氧代谢它们也是最初的定殖菌。这些微生物存在于各种环境，包括天然气站(gas stands)和油类中。有机酸用作SRB的基底，除降低周围介质的pH外，还加速腐蚀过程。此外，产生的大量有机酸作用于金属的去极化，开始局部腐蚀过程。
硫氧化菌：硫氧化菌为需氧的和兼性厌氧微生物，其自无机硫化合物比如硫化物、亚硫酸盐、硫代硫酸盐和在一些情况下为硫的氧化作用获得生长必需的能量。氧化代谢导致产生硫酸，其促使环境酸化。该群(group)包括许多属，嗜酸硫杆菌属被研究最多。该群(group)也包括选自种属硫化叶菌属、硫微螺菌属、贝格阿托氏菌属、嗜酸硫杆菌属和硫发菌属以及种类泛养硫球菌和脱氮副球菌的细菌种类。在一个实例中，第一宿主细胞为这些种类中任何一种的细胞。
铁氧化菌：铁氧化菌为需氧微生物，属于大型和多样化群(group)，它们自铁氧化得到其代谢所必需的能量。因此，形成氢氧化铁(其通常形成基底表面的不溶性沉淀物)促进具有不同含氧量的区域。它们广泛存在于河流、湖泊和石油生产的水中。他们大多是一个运动鞘(locomotor sheath)，并且其存在可通过作为腐蚀产物沉淀的大量积累的三价铁进行检测。这种积累或无机污垢导致工业设备出现问题，比如石油管道堵塞。其中最常见的是：氧化亚铁硫杆菌和种属泉发菌属、披毛菌属、纤毛菌属和Spherotillus。在一个实例中，第一宿主细胞为这些种类中任何一种的细胞。
硫或硫酸盐还原菌(SRB)：SRB形成形态和系统发育异质的群(heterogenousgroup)，其包括细菌和受限的(restricted)厌氧古细菌，尽管一些种类具有明显的氧耐受性。它们主要是革兰氏阴性细菌、嗜温的和一些通常形成芽孢的嗜热菌。这些微生物能氧化各种低分子量的有机化合物，包括一-或二元脂肪羧酸类、醇类、烃类和芳香族化合物，它们利用硫酸根离子或其它含硫化合物(硫代硫酸盐、亚硫酸盐等)作为电子受体。乙酸盐、乳酸盐、丙酮酸盐和乙醇为其中SRB最常用的底物。SRB生长刺激是由于生物膜中存在厌氧条件，这解释为腐蚀产物与微生物联合沉积，和在采油期间注入水性介质比如海水，其富含硫酸盐。可产生大量的生源硫化氢，管道和其它石油、天然气或石化产品回收、加工、储存或运输设备中形成的大部分H2S来源于SRB的代谢活动。另一个对石油工业的经济影响是H2S对石油和天然气的酸化。
考虑到与SRB代谢活性相关的众多经济损失，已努力使用对环境有害的和有毒的代谢抑制剂比如钼酸盐、硝酸盐和亚硝酸盐及应用生物杀灭剂，这有助于控制SRB的代谢活动和随后抑制生源H2S产生。
几种机制导致包括通过使用代谢抑制剂的生源H2S形成过程：I- SRB和其为通过普通电子供体的亚硝酸盐或硝酸盐还原剂的异养细菌之间的竞争，导致竞争性SRB排斥；II- 氧化还原电位由于硝酸盐还原中介体(一氧化二氮和一氧化氮)的存在而增加，因为H2S的生物产生仅发生在低氧化还原电位(低于-100 mV)；III- 一些SRB能量代谢的变化，还原硝酸盐而不是硫酸盐；IV- 硫化物氧化细菌和硝酸盐或亚硝酸盐还原细菌，其使用硝酸盐或亚硝酸盐再氧化H2S，导致H2S去除；V- 通过亚硝酸盐抑制异化的亚硫酸盐还原酶，以通过SRB中的硫酸盐还原抑制最后的酶促步骤。
在本发明的某些实施方案中，与待处理的基底接触或由待处理的流体包含的宿主细胞种群也在本发明的载体存在下与一种或多种硝酸盐和/或一种或多种亚硝酸盐接触。例如，在同时或依序使用载体的步骤(i)中，将硝酸盐/亚硝酸盐和载体与石油、天然气、石化产品、水或者工业或家庭系统包含的其它流体相结合(例如注入其中)。类似地，另外或者，钼酸盐也可作为SRB控制机制用于这些系统中。因此，在一个实施方案中，在本发明载体存在下，与待处理的基底接触或由待处理的流体包含的宿主细胞种群也与一种或多种钼酸盐接触。例如，在同时或依序使用载体的步骤(i)中，将钼酸盐(S)和载体与石油、天然气、石化产品或者工业或家庭系统包含的其它流体相结合(例如注入其中)。
在其它实施方案中，在本发明的载体存在下，种群与硝酸盐还原菌和/或硝酸盐还原-硫化物氧化细菌(NRSOB) (本文统称“NRB”)接触。例如，同时或依序使用载体，NRB与石油、天然气、石化产品、水或者工业或家庭系统包含的其它流体相结合(例如注入其中)。在一个实例中，NRB包含本发明的载体，其中载体能够自NRB细胞转移至第一宿主细胞(SRB细胞)；并在结合NRB和SRB细胞之后，载体被引入到SRB细胞内。在一个实例中，在与所述载体接触之前，SRB细胞由微生物细胞的混合体包含(例如由微生物生物膜包含)，其中混合体包含NRB种类的细胞。因此，在这种情况下，本发明包括使SRB细胞与NRB细胞(含有载体)接触，其中NRB细胞种类已与要靶向的生物膜中的SRB共存，从而增加含有载体的NRB摄入到生物膜细胞种群的兼容性和机会。这对提高载体被摄入生物膜的机会，从而增加修饰SRB细胞的效力机会和本发明的CRISPR阵列在生物膜内传播的机会(尤其是当阵列由可动遗传元件比如转座子包含或由噬菌体包含时，如本文描述的那样)是有用的。
SRB和NRB通常竞争存在于细菌生长需要的某些油田和工业水系统中的相同非高分子碳源(比如乙酸盐)。与SRB相比较通过增加NRB的生长速率，NRB可在可用非高分子碳源的消耗中战胜SRB，剥夺SRB其生长能力，并产生不合需要的硫化物和减少腐蚀速率。进一步地，通过抑制SRB的生长速率，NRB可占主导地位，再一次在对系统例如油田或工业水系统的可用非高分子碳的竞争中战胜SRB。因此，通过增加种群中NRB与SRB的比例，使种群中的SRB细胞与NRB接触可助于减少SRB细胞的生存能力。
在一个实施方案中，本发明包括使包含第一宿主细胞(例如SRB)的种群与有机和/或无机硝酸盐和亚硝酸盐接触。这些用于刺激所存在的NRB生长，因此助于NRB 战胜SRB。有机和无机硝酸盐或无机亚硝酸盐可用于注入到某些油田和工业水系统中。可用于本公开用途的无机硝酸盐和无机亚硝酸盐包括例如硝酸钾、亚硝酸钾、硝酸钠、亚硝酸钠、硝酸铵及其混合物。这些有机和无机硝酸盐和无机亚硝酸盐为通常可得到的，但可使用非限制性的和任何合适的硝酸盐或亚硝酸盐。
所使用的有机或无机硝酸盐或亚硝酸盐的量取决于多种因素，包括存在于系统种群中的硫酸盐和/或有机酸的量以及抵抗(counteract) SRB需要的预期的NRB量。在某些实施方案中，为了处理与流体接触的基底MIC，或者为了处理本发明液体的生物污损，当使用批处理应用方法应用时，所使用的有机或无机硝酸盐或亚硝酸盐的浓度按液体的重量计小于2000 ppm，或者按重量计500-1600 ppm或者按重量计在约900-1100 ppm之间。当通过连续操作应用时，有机或无机硝酸盐或亚硝酸盐的浓度可按液体的重量计小于500 ppm，或者介于10-500 ppm之间，或者介于10-100 ppm之间。
在一个实施方案中，种群与本发明的载体接触，和同时或依序与NRB (例如其包含载体)和硝酸盐和/或亚硝酸盐接触。
合适的NRB包括能够进行厌氧硝酸盐还原的任何类型的细菌，比如异养硝酸盐还原细菌和硝酸盐还原-硫化物氧化细菌。在一个实例中，NRB包含一、二、三或多种(例如一种或多种)选自以下的NRB：弯曲菌属种类、硝化菌属种类、硫杆菌属种类、亚硝化单胞菌属种类、硫微螺菌属种类、硫磺单胞菌属种类、陶厄氏菌属种类、副球菌属种类、假单胞菌属种类和红细菌属种类。例如，NRB选自以下中的一种或多种：普通消化杆菌、欧洲亚硝化单胞菌、施氏假单胞菌、铜绿假单胞菌、脱氮副球菌、硫磺单胞菌属deleyianum (Sulfurospirillum deleyianum)和类球红细菌。
在某些实施方案中，NRB为在原油、天然气、石化产品或水回收、加工、运输或储存系统(例如在其设备中)中发现，或者在地层比如水或油井中发现的NRB菌株。NRB可被优化以在系统条件下代谢。NRB例如选自NRB菌株库或者可自待处理的系统或类似系统培养。
系统中与SRB细胞接触的NRB的量可取决于多种因素，包括预期的SRB的量，以及任何可能存在的生物杀灭剂。当注入地层时，也可考虑地层的渗透性和孔隙度。在本公开的某些实施方案中，注入液体的NRB的量为1-108菌数计数/ml的液体之间，或者在10-104菌数计数/ml的液体之间。
除了刺激NRB战胜SRB外，可为合乎需要的是在本公开的某些实施方案中与硝酸盐一起引入另外的SRB抑制剂。在一个实例中，SRB与一种或多种选自9,10 -蒽醌、钼酸盐(比如钼酸钠和/或钼酸锂)及其混合物的SRB抑制剂接触。在本公开的某些实施方案中，钼酸盐以按液体的重量计5-100 ppm的范围加入到液体中。
在一个实例中，在例如通过把混合物注入到与待处理的表面接触的液体或把混合物注入到待处理的流体中使第一细胞与混合物接触之前，将本发明的载体和一种或多种生物杀灭剂(即第一宿主细胞的生物杀灭剂，比如SRB生物杀灭剂)混合。
另外或者对含有载体的NRB细胞，本发明考虑使用含有本发明载体的芽孢杆菌属细胞种类。
在一个实施方案中，载体为能够感染SRB的细菌噬菌体并且噬菌体与第一宿主细胞(例如SRB)接触，由噬菌体包含的CRISPR阵列借以被引入到第一宿主细胞内用于其本发明的修饰。在一个实施方案中，当第一个细胞为SRB时，SRB也与本发明的噬菌体载体接触，并且同时或依序与NRB接触。替代或除了与NRB接触外，SRB与硝酸盐和/或亚硝酸盐接触。
参与MIC的实例机制如下；在一个实施方案中，“控制”采用方法包括选自以下的还原机制：
• 微生物(例如细菌)促进生物矿化作用，原因为铁氢氧化物沉积在金属表面，修饰金属/溶液界面的电化学过程，诱导腐蚀；
• 产生有利于生物膜形成的EPS；
• 微生物(例如细菌)促进石油产物降解，原因为作用于金属腐蚀的酶芳基烃羟化酶(AHH)的释放；
• 硫酸的产生，其增加腐蚀过程；和
• 硫的氧化。
在一个实施方案中，方法包括选自以下的还原机制：
• 细菌促进生物矿化作用，原因是铁氢氧化物沉积在表面，其中表面为金属表面；
• 产生EPS；
• 细菌促进系统中石油产物降解，原因是酶芳基烃羟化酶(AHH)释放，其中表面为金属表面；
• 硫酸的产生；和
• 硫的氧化。
应用于MIC或生物污损控制的实例
存在本发明设想的具体实例应用，以减少与细菌相关的腐蚀和/或生物污损。以下描述的应用不打算限制本发明的概念，并且仅为本发明可如何用于控制细菌引起的腐蚀或减少环境污染的例证。
酸性矿山排水：在酸性矿山排水中，细菌的生长会增加环境的酸度。对酸的产生存在一个反应流程，因此为潜在的环境损害。酸性矿山排水问题在全世界被公认为严重的环境问题。酸性矿山排水的来源是硫化铁矿及其它含硫化物矿物的风化和氧化作用。矿坑排水是在黄铁矿(硫化铁)暴露于空气和水并反应形成硫酸和溶解铁而形成的。这些铁的一些或全部可在含矿坑排水的溪流底部沉淀形成红色、橙色或黄色沉淀物。酸性径流进一步将重金属比如铜、铅、汞溶解到地面或地表水中。某些细菌的作用可提高酸性矿山排水行进的速率和程度。
在一个实例中，系统因此为矿山或由矿山包含。流体为矿井排水流体，并且方法减少矿坑排水造成的硫酸。在一个实例中，表面与矿井排水流体接触。
在一个实例中，第一个宿主细胞为嗜酸性氧化亚铁硫杆菌、嗜酸性氧化硫硫杆菌、嗜酸性脱氮硫杆菌、氧化亚铁钩端螺旋菌或嗜热硫氧化硫化杆菌细胞或者这些中两种或多种的混合体。
水力压裂：水力压裂为一种破碎岩层的方法，以便于提取气体及其它烃类。本质上，一旦确定了含气地层，矿井就可在垂直和水平两个方向钻入地球以接近气体。矿井然后采用高压水、砂和大量的化学物质用于使页岩破裂，以使一旦水力压裂完成后保持断裂和裂缝不被上覆岩层的巨大压力所封闭。数百万加仑的水用于压裂井。介于30%-70%之间的压裂液作为“返排”返回到表面。返排含有溶解在压裂水中的任何物质，包括盐。溶解什么取决于位置。返排保留在井场的衬塑坑中，直至其在处置前被卡车运输和处理。在某一时间点，高流量和相对低盐度的水转换成较低流量，但是盐度高得多的“采出水”，以区别于“返排”水。
不论哪种情况下，都存在微生物诱导腐蚀(MIC)的问题。其中特别感兴趣的是SRB。因此，在一个实例中，该系统为水力压裂系统和流体为水力压裂液(如返排水或采出水)或者待处理的表面与这样的液体接触。该方法例如降低SRB的生存能力(例如杀伤SRB和/或减少SRB在液体中的增殖)，和第一宿主细胞为SRB。
例如，第一宿主细胞为嗜酸硫杆菌属细菌、嗜酸性氧化硫硫杆菌、氧化亚铁铁杆菌、氧化硫硫杆菌、排硫硫杆菌、蚀阴沟硫杆菌、脱硫弧菌属(例如需盐脱硫弧菌、普通脱硫弧菌、脱硫脱硫弧菌或非洲脱硫弧菌)或脱硫肠状菌属(例如东方脱硫肠状菌或致黑脱硫肠状菌)细胞，或者这些种类中两种或多种的混合。
冷却设备(例如冷却塔)：在冷却设备比如冷却塔中存在细菌会在若干方面对冷却功能产生不利影响。例如，SRB支持在冷却塔、热交换器等的壁面产生酸性条件，这会导致冷却系统的腐蚀和潜在停机同时进行维修。另外，例如热交换器壁面上的生物膜降低交换器壁的传热系数，导致冷却系统的运行效率降低。
另外，含铁部件的腐蚀可能尤其有害。可经SRB发生铁氧化为铁(II)和硫酸盐还原为硫化物离子，产生铁硫化物沉淀和原位产生腐蚀性氢离子。硫酸盐还原菌对铁的腐蚀很快，并且不像普通的生锈，它不是自限性的。由红色三氧化二铁外壳组成的由脱硫弧菌属产生的腐蚀结与含软的、黑色硫化亚铁中心的黑色磁性铁氧化物‘混合’。
因此，在一个实例中，系统为冷却系统和流体为由系统包含的流体(如水或水性液体)，或者待处理的表面为与这样的流体接触的冷却设备的表面。在一个实例中，第一宿主细胞为SRB (例如本文公开的任何SRB)。在一个实例中，表面为含铁表面。
在一个实例中，第一个宿主细胞为军团菌属细胞。这样的种类对人类健康有害，并在水冷却、加热、加工或储存设备中传播。因此，在一个实例中，系统为这样的设备。
管道腐蚀：烃类和石化管道通常包含足够的水分来允许细菌生长，导致例如SRB引起的MIC。MIC通常由需氧细菌的生物膜造成，其保护厌氧的SRB，并与管道内表面直接接触。这会产生酸性条件及其它金属腐蚀条件，这将导致局部腐蚀和管道最终失效。
在一个实例中，系统包含设备表面(例如管道或钻井设备)，后者包含与第一宿主细胞(例如SRB)接触的表面。例如，系统为原油、烃类、石化产品(例如柴油或石油)、天然气或水的回收、加工、储存或运输系统。例如，管道为石化管道。例如，管道由石油或天然气钻井平台包含。例如，管道表面与海水接触。例如，管道表面与石化流体、原油或天然气接触。
废水处理：废水处理包括在污水处理厂下游添加活性污泥以去除有机污染物。因此，在废水处理设施中处理废水后存在许多可被细菌“消化”的有机污染物。因此，把活性污泥添加到槽/容器中处理过的水中，以处理自废水处理设施流出的废水。
然而，有时槽/容器中的细菌(无论是源自活性污泥、废水本身还是周围环境)将占据主导地位和生长非常快速。这样的快速生长可导致丝状细菌的生长。丝状物可在槽或容器中形成多达细菌种群的20-30%并且漂浮其中。这种丝状生长导致所谓的膨胀污泥。本发明可用于膨胀污泥的控制，这是废水处理的一个重要方面。
因此，在一个实例中，系统为水处理系统和表面为系统容器的表面，其中表面与水和第一宿主细胞接触；或者待处理的流体包含所述水和细胞。在一个实例中，方法控制废水系统污泥中的细菌生长。
航运与运输：传播和船可在其与海水或水道(例如河流、湖泊、池塘或淡水)接触的外表面(例如船体)经历MIC。船体内表面也可受到MIC的影响，因为它们一般地与可能含有介导MIC的微生物比如细菌的湿气或液体接触，例如与压载水接触。例如，海水通常载于船舶的船体(比如油轮)中，以提供海上稳定性；这样的海水含有能介导SRB的细菌。其它运输车辆，比如机动车辆(小汽车、卡车、货车或卡车)、火车、航天器和航空器也可能易受到影响。
因此，在一个实例中，系统为运输车辆(例如用于运送货物和/或人或牲畜，例如小汽车、卡车、货车或卡车、火车、航天器或航空器)。例如，交通工具为船舶或船只，例如石油、天然气或石化产品的海上船舶(例如油轮)。在一个实例中，待处理的表面与海水接触。在一个实例中，表面为船舶或船只船体的外表面。在一个实例中，表面为船舶或船只船体的内表面。
压载水中的细菌持续存在或生长(生物污损)：本发明的一个具体应用是处理海上运载工具(例如船舶或船只)压载水，以减少不合乎需要的细菌，比如霍乱弧菌、大肠杆菌和/或肠球菌种类。
海运量超过世界货物的90%，并造成全球运送约2-30亿吨的压载水，这些压载水通常由船舶运载，以维持其稳定。类似体积的压载水也可能是在国家和区域内每年国内运送的(GloBallast Partnerships (全球压载水管理的合作伙伴关系)，www.globallast.imo.org)。压载水已被公认为外来海洋生物的主要来源，其威胁自然进化的生物多样性，其后果日益被认识到(Anil等，2002)。无意中引入致病性病原菌(在运输过程中自起源或形成的地方输入)，可直接影响到社会和人类健康。船舶压载舱拥有不同的非本地脊椎动物、无脊椎动物、植物、微小藻类、细菌等(Williams等. 1988; Carlton和Geller, 1993; Smith等, 1996; Ruiz等, 2000; Drake等, 2002, 2005, 2007; Mimura等, 2005)。微生物(比如细菌)，由于其天然丰度高、形成休眠期的能力和承受广泛范围环境条件的能力，而比其它生物体更大量地被引入到陌生环境中。虽然带载到压载舱的所有生物体可能无法生存，但是细菌和微藻类都能通过形成囊肿、孢子或其它生理休眠期长期存活于不利条件下(Roszak等, 1983; Hallegraeff 和Bolch, 1992; Anil 等, 2002;Carney等, 2011)。一旦释放，这些微生物很适合入侵，因为其体积小，这有利于其被动散布和比后生动物的生存需求更加简单(Deming, 1997)。在新加坡港船舶检验的压载水样品中弧菌属种类细胞的浓度在1.1-3.9×104ml-1范围内(Joachimsthal等, 2004)。无意引入致病性病原菌会产生直接的社会影响，包括对人类健康的影响。在一项早期研究中发现，引入切萨皮克湾的病原体大多源自与浮游生物有关的细菌，而不是水柱本身(Ruiz等, 2000)。因此，压载水微生物比如细菌和古生菌属于压载水处理/管理项目的主要关注问题。
国际海事组织(IMO)已经制定了一项旨在防止这些有害影响的公约，于2004年通过了《控制和管理船舶压载水和沉淀物的国际公约》(《压舱水管理公约》)。在美国，美国海岸警卫队关于压载水管理的最终规则于2012年6月开始生效，适用于美国水域的压载水排放。
海上压载水交换被认为不是压载水管理的理想方法，并且正在大力发展处理方法。这些方法必须依照IMO的压载水管理公约的标准D-2。标准D2规定，已处理和排放的压载水必须具有：
• 每立方米中最低尺寸大于或等于50微米的活菌少于10个。
• 每毫升中最小尺寸小于50微米和最小尺寸大于或等于10微米的活菌少于10个。
另外，标准D2规定指示微生物的排放量不得超过如下的规定浓度：
• 产生有毒物质的霍乱弧菌(O1和O139)每100毫升小于一个菌落形成单位(cfu)或者每1克(湿重)的浮游动物样品低于1 cfu；
• 每100毫升中大肠杆菌小于250 cfu；
• 每100毫升中肠球菌属小于100 cfu。
这些是作为人类健康标准的指示微生物，但它们不限于这些类型。事实上，已经表明，在一些情况下采用的压载水处理可能会使情况变得更糟。通过去除吃掉细菌的小生物体，一些处理系统已把压载舱变成了细菌培养箱，以至在一些试验中处理过的排放物始终比没有处理的排放物含有高数千倍浓度的细菌。增加的细菌可能包括人类病原体。
因此，在本发明的一个实例中(例如依据方面70或依赖于方面70的方面)，系统为船舶或船只或海上运载工具(例如船舶或船只，例如港口、码头或海上的油轮)。在一个实例中，包含第一宿主细胞的流体为船舶或船只或海上运载工具的压载水(例如船舶或船只压载水，例如油轮压舱水)。在一个实例中，系统为海上集装箱或平台或钻井平台(例如石油和天然气钻井平台)，例如在海上。在一个实例中，流体为这样的集装箱、平台或钻井平台的压载水。
在一个实施方案中，有害细菌(本发明的第一宿主细胞，例如根据方面70或依赖于方面70的方面)属于选自以下的种类：霍乱弧菌、留萌弧菌、海洋弧菌、大肠杆菌、肠球菌属种类、类黄假单胞菌、施氏假单胞菌、缓慢弧菌、海假交替单胞菌、河豚毒素假交替单胞菌、假交替单胞菌属种类、恶臭假单胞菌、食油假单胞菌、灿烂弧菌、嗜环弧菌、希拉氏肠球菌、屎肠球菌、轮虫弧菌、水蛹假交替单胞菌、普城沙雷菌、黄褐假单胞菌、托拉斯假单胞菌、施氏假单胞菌、施氏假单胞菌、塔氏弧菌、美丽盐单胞菌、热液海源菌、嗜环弧菌、塔氏弧菌、普城沙雷菌、假交替单胞菌属种类、假别单胞菌、产黄假单胞菌、施氏假单胞菌、食鹿角菜假交替单胞菌、粘着杆菌种类、蕈状芽孢杆菌、需钠弧菌、白翎芽孢杆菌、希拉氏肠球菌、戊糖乳杆菌、食鹿角菜交替假单胞菌和铜绿假单胞菌。
在一个实例中，第一个宿主细胞为需氧异养细菌。在一个实例中，第一个宿主细胞为霍乱弧菌细胞(例如菌株O1或/或O139)。在一个实例中，第一个宿主细胞为大肠杆菌细胞。在一个实例中，第一个宿主细胞为肠球菌属种类细胞。
“Characterization of Bacteria in Ballast Water Using MALDI-TOF MassSpectrometry (采用MALDI-TOF质谱表征压载水中的细菌)”，Kaveh E等, PLoS One.2012; 7(6): e38515; 2012年6月7日在线公开。doi:10.1371/journal.pone.0038515 (通过参照结合到本文中)公开了一种合适、快速和高效经济的压载水细菌监测方法 。
本发明的一个具体实例如下：
一种控制船舶或船只压载水中的细菌生物污损的方法，其中水包含介导所述生物污损的第一微生物种类的第一宿主细胞种群(比如霍乱、大肠杆菌或肠球菌种类)，方法包括
(i) 使种群与多种能够转化或转导细胞的载体接触，每一种载体包含CRISPR阵列，CRISPR阵列借以被引入到宿主细胞中，其中
(a) 每一种CRISPR阵列包含一个或多个用于表达crRNA的序列和用于在宿主细胞内序列转录的启动子；和
(b) 每一种crRNA能够杂交于宿主细胞的靶标序列，以引导宿主细胞内的Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列(例如切割靶标序列)；靶标序列为用于介导宿主细胞生存能力的基因序列；和
(ii) 使得所述cRNAs在宿主细胞内于Cas存下进行表达，从而修饰宿主细胞内的靶标序列，导致宿主细胞生存能力减小和控制所述生物污损。
在一个实例中，步骤(i)包括使压载水与载体混合，例如在船舶或船只的船体中。
在一个实例中，船舶或船只为海上运载工具和水为海水。不是船舶或船只，在一个备选方案中，压载水由集装箱或海上钻探平台例如石油平台或石油钻井平台包含。
本发明也包括自船舶或船只排放压载水的方法，其中排放的压载水包括通过以上具体实例方法处理的水。在一个实例中，水被排放到水体例如海、海洋或水道(如河流、运河、湖泊或水库)中。
本发明也包括包含CRISPR阵列的船舶或船只压载水，其中压载水通过以上具体实例得到或可得到。本发明也包括包含CRISPR阵列的海运集装箱压载水，其中压载水通过以上具体实例得到或可得到。本发明也包括在海上平台或钻井平台(例如石油或天然气钻井平台)的压载水，水包含CRISPR阵列，其中压载水通过以上具体实例得到或可得到。阵列如在具体实例的(a)和(b)中列举的那样。
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本发明也提供如下的载体和CRISPR阵列。
85. 一种包含用于引入细菌宿主细胞的CRISPR阵列的载体，其中细菌能经水传播，其中
(a) CRISPR阵列包含用于表达crRNA的序列和用于所述宿主细胞内序列转录的启动子；
(b) crRNA能够杂交于宿主细胞靶标序列，以引导宿主细胞内的Cas (例如Cas核酸酶)修饰靶标序列(例如切割靶标序列)；靶标序列为用于介导宿主细胞生存能力的核苷酸序列(例如基因或调控序列)；
(c) 其中(a)的序列包含用于表达和产生crRNA的序列R1-S1-R1’，其中R1为第一CRISPR重复区，R1’为第二CRISPR重复区，并且R1和R1’为任选；和S1为第一CRISPR间隔区，其包含或由与宿主细胞靶标序列具有80%或更多同一性(例如85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性)的核苷酸序列组成。
所谓“经水传播”意指所述细菌的细胞能在水，或者在不同生物体之间、生物体内、不同环境之间、或生物体与环境之间的水性液体中传播。实例为霍乱弧菌、肠球菌属种类和大肠杆菌。霍乱弧菌为一种带有极性鞭毛的革兰氏阴性逗号形细菌。其属于γ-变形菌门类别。有两个主要生物型的霍乱弧菌(古典的和埃尔托型)，及众多的血清型。霍乱弧菌为霍乱的病原体，是小肠的一种严重细菌感染，也是发展中国家的主要死亡原因。霍乱弧菌的致病基因是检测和研究霍乱弧菌感染的有趣目标。大多数这些基因位于两个致病岛，即TCP (毒素协同调节菌毛)和CTX (霍乱毒素)，组成前噬菌体1、2。TCP含有参与宿主经菌毛粘附的基因簇，而CTX基因参与霍乱毒素3的合成。
在一个实施方案中，载体为分离的载体(即载体不在所述宿主细胞内)。在一个实例中，载体为工程化或合成载体(即非天然存在的载体)。
在一个实例中，阵列为ICP1阵列，即ICP1霍乱弧菌噬菌体的阵列，例如其中噬菌体为ICP1_2003_A、ICP1_2004_A、ICP1_2005_A、ICP1_2006_E或ICP1_20011_A。在一个实例中，阵列为CR1或CR2 ICP1噬菌体阵列，例如这样阵列的工程化或非天然存在的衍生物。
在一个实例中，CRISPR阵列和Cas为1-E 型或1-F型，例如亚型系统17。
在一个实例中，CRISPR阵列包含多种序列，每一种用于表达相应的crRNA并与用于所述宿主细胞内序列转录的启动子相关。
在一个实例中，载体或每一种载体包含多种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)所述CRISPR阵列。
在一个实例中，载体包含编码所述Cas的核苷酸序列。
在另一个实例中，载体没有这样的序列。例如在这种情况下，阵列对于由宿主细胞产生的一种或多种Cas为可操纵的。
86. 方面85的载体，其中细胞为霍乱弧菌、肠球菌属或大肠杆菌细胞。
87. 方面85或86的载体，其中载体没有能够表达所述Cas的核苷酸序列。
因此，在一个实例中，载体不编码Cas核酸酶。在一个备选方案中，载体编码所述Cas。
88. 方面85、86或87的载体，其中靶标序列为17-45个相接核苷酸，例如18, 19,20或21个相接核苷酸的前间区序列。
在一个实例中，每一种间隔区(S1)为17-45个相接核苷酸，例如18、19、20、21、30、31、32或33个相接核苷酸的核苷酸序列。霍乱弧菌PLE的前间区序列为例如32个相接核苷酸，并且靶向它的载体可例如具有32个相接核苷酸的间隔序列，其与32个核苷酸的PLE序列具有100%或至少80、90或95%的同一性。在载体包含多个间隔区时，间隔区可为不同间隔区的混合体，或者可为相同的间隔区。例如，阵列包含多种间隔区，其中间隔区的亚组(sub-set)为相同的。例如，相同的间隔区与编码宿主细胞致病因子的基因前间区序列可为同源的。使用多间隔区可为有利的，一旦载体处于细胞内，如果宿主切割一个或多个间隔区-未切割的间隔区仍能形成crRNAs并回归(home to)靶标序列。在载体或阵列中采用不同间隔区的混合体有利于使宿主对入侵载体的适应性风险降至最低，从而最大限度地减少抗性。
89. 方面85-88中任何一个的载体，其中靶标序列为致病、抗性或必需基因序列。在一个实例中，靶标序列为PICI样元件(PLE)，例如霍乱弧菌PLE，例如PLE1的序列。
90. 方面85-89中任何一个的载体，其中靶标序列为致病岛序列，任选地其中宿主细胞为霍乱弧菌细胞和靶标序列为TCP、CTX或VPI序列。在一个实例(例如其中宿主为弧菌属)中，致病岛为TCP (毒素协同调节菌毛)或CTX (霍乱毒素)。弧菌属致病岛(VPI)含有主要参与产生毒素协同调节菌毛(TCP)的基因。其为一种结构上类似于噬菌体基因组，侧翼为两个重复区(att样位点)的大的遗传元件(约40 kb)。VPI含有两种与其它几种基因一起的基因簇(TCP簇和ACF簇)。acf簇由4种基因组成：acfABCD。tcp簇由15种基因组成：tcpABCDEFHIJPQRST和调控基因toxT。
91. 方面85-90中任何一个的载体，其中宿主细胞为霍乱弧菌和靶标序列为CTXφ基因序列。霍乱毒素的基因由插入霍乱弧菌基因组中的模板细菌噬菌体CTXphi (CTXφ)携带。CTXφ能够把霍乱毒素基因从一种霍乱弧菌菌株传播至另一种，为一种水平基因转移的形式。毒素协同调节菌毛的基因由VPI致病岛(VPI)编码。
92. 方面85-90中任何一个的载体，其中宿主细胞为霍乱弧菌和靶标序列为ctxB、tcpA、ctxA、tcpB、wbet、hlyA、hapR、rstR、mshA或tcpP序列。
93. 方面85-92中任何一个的载体，其中靶标序列为17-45个相接核苷酸(例如18、19、20 或21个相接核苷酸)的靶标序列，并与革兰氏阳性菌例如金黄色葡萄球菌致病岛(SaPI)的噬菌体诱导性染色体岛(PICI)的序列具有至少80%同一性(例如85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性)。以下提供ICP1噬菌体(aka ICP1相关噬菌体)间隔序列的实例。这些间隔序列与霍乱弧菌的靶标序列(前间区序列)同源。
94. 方面85-93中任何一个的载体，其中宿主细胞为霍乱弧菌和crRNA能够杂交于霍乱弧菌细胞中前间区序列邻近基序(PAM)的5、4或3个核苷酸内的靶标序列，其中PAM为GA。
95. 方面85-94中任何一个的载体，其中宿主细胞为霍乱弧菌和细胞为埃尔托型、O1或O139霍乱弧菌细胞。在一个实例中，霍乱弧菌为血清型O1埃尔托型N16961、埃尔托生物型18或埃尔托型菌株MJ-1236。在一个实例中，宿主细胞为大肠杆菌O157:H7细胞。
96. 方面85-95中任何一个的载体，其中载体为能够感染所述宿主细胞的细菌噬菌体。在一个实例中，宿主细胞为大肠杆菌，和噬菌体为λ或T4噬菌体。在一个实例中，宿主细胞为肠球菌属细胞和噬菌体为肠球菌属噬菌体IME-EF1、phiEF24C、□Ef1或EFDG1(参见Appl Environ Microbiol. 2015年4月; 81(8):2696-705. doi: 10.1128/AEM.00096-15.2015年2月6日电子出版,“噬菌体疗法靶向粪肠球菌属生物膜(Targeting Enterococcusfaecalis biofilms with phage therapy)”, Khalifa L等)。
97. 方面96的载体，其中宿主细胞为霍乱弧菌和载体为能够感染霍乱弧菌细胞的细菌噬菌体。
98. 方面97的载体，其中细菌噬菌体选自CTXφ、ICPI噬菌体和肌尾病毒，例如其中噬菌体为ICP1_2003_A、ICP1_2004_A、ICP1_2005_A、ICP1_2006_E或ICP1_20011_A，任选地为工程化和非天然存在的噬菌体。
99. 方面85-98中任何一个的载体，其中载体为或包含ICE，例如转座子。ICE可包含本文描述的ICE的任何特征。
100. 方面99的载体，其中转座子为能够自第一转移至第二所述宿主细胞的接合转座子。
101. 方面99或100的载体，其中转座子在第一细胞中留下CRISPR阵列的拷贝。
102. 方面85-101中任何一个的载体，其中这种或每一种阵列由相应的可动遗传元件(MGE)包含，其中MGE包含在宿主细胞中可操纵的转移起始位点(oriT)。MGE可依据本文描述的任何MGE。
103. 方面85-102中任何一个的载体，其中载体为工程化载体。
104. 一种包含多种方面85-103中任何一个的载体的水或食品处理组合物。
在一个实例中，水为压载水、海水、苦咸水、淡水、饮用水、水道水(例如河口水)或工业用水。在一个实例中，水为人类胃肠道(GI)流体中的水。
在一个实例中，宿主细胞由贝类、鱼类、稻米或谷物包含。在一个实例中，组合物用于处理食物和宿主细胞为大肠杆菌O157:H7细胞。在一个实例中，靶标序列为在大肠杆菌(例如O157:H7)宿主细胞中编码志贺毒素的序列。在一个迄今为止描述的水源性种类的备选方案中，宿主细胞为沙门氏菌属或李斯特氏菌属细胞。
105. 一种用于在人治疗或预防霍乱弧菌感染的药物，药物包含多种方面85-103中任何一个的载体。在一个备选方案中，本发明提供用于在人治疗或预防大肠杆菌感染的药物，药物包含多种本发明的载体。在一个备选方案中，本发明提供用于在人治疗或预防肠球菌属感染的药物，药物包含多种本发明的载体。
106. 方面104或105的组合物或药物，其进一步包含抗宿主细胞抗生素或抗宿主细胞生物杀灭剂。
以下实施例5为与霍乱相关的实例。
任何一般特征(参见下文)也可应用于本构造(第六构造)。以下任何构造可与本构造联合，例如以提供包含在本文一项或多项权利要求中的特征联合。
调控CAS活性
本发明的这些方面可用于调控Cas活性(例如在细胞或体外)。本发明涉及靶向Cas编码基因以限制Cas活性，这有利于Cas的时序调控。本发明也可用于其中期望增加Cas活性严格性的环境下，例如在修饰细胞基因组时减少Cas切割脱靶的机会。例如在修饰人、动物或植物细胞应用时，例如对于细胞或组织或者包含细胞的生物体的基因疗法或基因靶向的脱靶效应应减至最小或者避免。例如，当采用其被给予患者用于基因疗法或者用于在人治疗或预防疾病或病症的Cas修饰在人类细胞(例如iPS细胞)进行期望的改变时，需要非常高的严格性。本公开提供这些应用作为本发明方法和产物的部分。
本发明因此提供下面条款：
1. 一种修饰编码第一Cas的可表达基因的方法，方法包括：
(a) 在自所述基因表达的第一Cas存在下使引导RNA (gRNA1)与Cas基因联合；和
(b) 使得gRNA1能够杂交于所述Cas基因的序列(例如启动子或其第一Cas编码DNA序列)，并把第一Cas引导至基因，Cas借以修饰Cas基因。
在一个实例中，方法为体外无细胞方法(例如重组方法)。在另一个实例中，方法在细胞内实施，例如，其中基因通过编码其自身的Cas切割(即内源性Cas用于切割基因)。
2. 条款1的方法，其中Cas为核酸酶和Cas基因被切割。
3. 条款1或2的方法，其中Cas基因突变、下调或失活。
4. 条款1-3中任何一项的方法，其中第一Cas为Cas9。
5. 条款1-4中任何一项的方法，其中gRNA1为单链引导RNA。
6. 条款1-5中任何一项的方法，其中方法在宿主细胞内实施。
7. 条款6的方法，其中细胞为原核细胞，例如细菌或古细菌细胞(例如大肠杆菌细胞)。
8. 条款6的方法，其中方法为重组方法。
9. 条款6、7或8的方法，其中细胞属于人或非人动物病原体种类或菌株(例如金黄色葡萄球菌)。
10. 条款6-9中任何一项的方法，其中细胞为人类微生物群种类，例如人类肠道微生物种类的细胞。
11. 条款6-10中任何一项的方法，其中Cas基因由宿主CRISPR/Cas系统包含。
任选地外源性第一Cas编码序列不用于方法中，例如当宿主细胞包含与gRNA1同源的野生型内源性Cas核酸酶时。
12. 条款6的方法，其中细胞为真核细胞(例如人、非人动物、酵母或植物细胞)。
13. 条款12的方法，其中方法在非人类胚胎、非人类受精卵、非人类生殖细胞内、或者在人或动物实施(例如其中方法为美容方法)；任选地其中方法不为用于通过手术或疗法或诊断治疗人或动物体的方法。
14. 条款6-3中任何一项的方法，其中Cas基因由在步骤(a)中引入细胞的核酸包含。
15. 条款6-4中任何一项用于减少宿主细胞对经核酸载体转化或在宿主细胞内保持核酸载体的抗性发展的方法。
16. 条款1-15中任何一项的方法，或其用于人或动物药物治疗、预防或诊断的核酸或细胞产物(例如用于人或动物、当方法在人或动物细胞实施时的人或动物细胞的基因疗法；或者用于当方法在细菌细胞内实施时在人或动物治疗或预防细菌感染)。
17. 条款1-6中任何一项的方法，其中方法在体外实施。
18. 条款1-16中任何一项的方法，其中方法在体内实施，任选地不在人类胚胎内和任选地其中方法不为用于通过手术或疗法或诊断治疗人或动物体的方法。
19. 条款1-18中任何一项的方法，其中gRNA1自在步骤(a)中与Cas基因联合的第一核酸转录产生。
20. 条款19的方法，其中方法在细胞内实施和在步骤(a)中编码gRNA1的第一核酸被引入到细胞内；或者在步骤(a)中编码crRNA的第一核酸被引入到细胞内，其中crRNA与tracrRNA在细胞内一起形成gRNA1。
21. 条款19或20的方法，其中Cas基因与包含靶标位点(CS-t)的靶标核酸联合以被第一Cas修饰，和其中
I. Cas基因包含邻近与第一Cas同源的PAM (P1)的第一前间区(PS1)，其中PS1在第一位点(CS1)由第一Cas修饰(例如切割)；
II. gRNA1包含与用于引导第一Cas的PS1互补的序列，其中PS1在步骤(b)中于CS1被修饰；
III. 靶标核酸包含邻近PAM (P-t)的前间区序列(PS-t)，其中P-t与第一Cas同源；
IV. 在步骤(b)之前或期间，方法包括使引导RNA (gRNA-t)与靶标核酸和自所述基因表达的第一Cas联合，其中gRNA-t杂交于PS-t并引导第一Cas修饰CS-t；和；
V. 方法任选地包括对修饰的靶标核酸进行分离或测序。
22. 任何条款21的方法，其中gRNA-t通过自步骤IV中与Cas联合的核酸(例如所述第一核酸)转录产生。
23. 条款22的方法，其中方法在细胞内实施并且核酸编码crRNA，其中crRNA在细胞内与tracrRNA一起形成gRNA-t。
24. 条款21-23中任何一项的方法，其中gRNA1的产生在gRNA-t产生之后开始，PS-t借以在PS1被修饰(例如切割)之前于靶标核酸的拷贝被修饰(例如切割)，以使第一Cas表达下调或失活。
25. 条款1-24中任何一项的方法，其进一步包括联合切割靶标核酸与另外的核酸，借以在核酸之间发生同源重组和
(i) 靶标核酸的核苷酸序列被删除；
(ii) 另外核酸的核苷酸序列被删除；
(iii)靶标核酸的核苷酸序列被插入到另外的核酸中；和/或
(iv)另外核酸的核苷酸序列被插入到靶标核酸中。
26. 条款25的方法，其中(i)发生，从而使核苷酸序列或靶标核酸的调控元件失活。
27. 条款25的方法，其中(i)发生，从而使核苷酸序列或靶标核酸的调控元件激活。
28. 条款25、26 或27的方法，其中(ii)发生，从而使核苷酸序列或另外核酸的调控元件失活。
29. 条款25、26 或27的方法，其中(ii)发生，从而使核苷酸序列或另外核酸的调控元件激活。
30. 条款25-29中任何一项的方法，其中(iii)发生，任选地放置与另外核酸的调控元件存在功能关系的插入序列和/或创建新的标记序列。
31. 条款25-30中任何一项的方法，其中(iv)发生，任选地放置与靶标核酸的调控元件存在功能关系的插入序列和/或创建新的标记序列。
32. 条款30或31的方法，其进一步包括检测新的标记序列或其表达产物以确定同源重组已经发生。
33. 条款21-32中任何一项的方法，其进一步包括对靶标核酸产物、另外的核酸产物和/或第一载体产物进行分离或测序。
34. 条款1-33中任何一项的方法，其中第一载体如在条款35-55的任何一项中定义的那样。
35. 一种例如用于条款1的方法的第一(例如分离的)核酸载体或载体的组合，其中
(a) 第一载体或所述联合的载体包含编码引导RNA (gRNA1，例如单链gRNA)的可表达核苷酸序列，引导RNA与预定的前间区序列(PS1)互补，用于引导第一Cas在第一位点(CS1)修饰PS1，其中PS1为与第一Cas同源的邻近PAM (P1)；或者可表达序列编码与tracrRNA一起形成gRNA1的crRNA；和
(b) PS1和P1为可表达的第一Cas编码基因的序列，并且PS1能够在CS1被第一Cas修饰。
在任何构造中的本文每一种载体可为携带特定序列的线形或圆形(例如闭合环状，任选地为超螺旋的)的DNA。
36. 条款35的载体或联合，其中第一Cas为核酸酶，其中CS1能够被核酸酶切割。
37. 条款35或36的载体或联合，其中第一Cas为Cas9。
38. 条款35-37中任何一项的载体或联合，其中gRNA1为单链引导RNA。
39. 条款35-38中任何一项的载体或联合，其中核苷酸序列可在用于产生gRNA1的原核细胞(例如细菌或古细菌)内表达。
40. 一种包含条款39的载体或联合的重组试剂盒(例如其中细胞为重组许可的大肠杆菌细胞)。
41. 条款35-38中任何一项的载体或联合，其中核苷酸序列可在用于产生gRNA1的真核细胞(例如人、动物、植物或酵母细胞)内表达。
42. 条款35-41中任何一项的载体或联合，其中第一载体或所述联合的载体(例如第二载体)包含编码引导RNA (gRNA-t，例如单链gRNA)的可表达核苷酸序列，引导RNA与靶标核酸的预定前间区序列(PS-t)互补，用于引导第一Cas修饰(例如切割) PS-t；或者可表达序列编码与tracrRNA一起形成gRNA-t的crRNA；靶标核酸包含邻近PAM (P-t)的PS-t，其中P-t与用于修饰PS-t的第一Cas同源。
43. 条款42的载体或联合，其进一步与所述靶标核酸联合。
44. 条款43的载体或联合，其中所述靶标核酸为细胞的染色体或游离核酸。
45. 条款44的载体或联合，其中细胞属于人或非人动物病原体种类或菌株(例如金黄色葡萄球菌)的细胞。
46. 条款44或45的载体或联合，其中细胞为人类微生物群种类，例如人类肠道微生物种类的细胞。
47. 条款44-46中任何一项的载体或联合，其中PS-t由细胞(例如原核细胞)的必需基因、致病基因或抗生素抗性基因序列包含。
48. 条款47的载体或联合，其中当第一Cas修饰(例如切割)PS-t时基因下调或失活。
49. 条款47的载体或联合，其中当第一Cas修饰PS-t时基因上调或激活。
50. 与编码第一Cas (例如由第一载体包含)的所述基因联合的条款35-49中任何一项的载体或联合。
51. 当在细胞内时条款35-50中任何一项的载体或联合，其中细胞包含含有编码第一Cas的所述基因的CRISPR/Cas系统。
52. 条款35-51中任何一项的载体或联合，其用于在人或非人动物治疗、预防或诊断疾病或病症，例如用于人或动物、当方法在人或动物细胞内实施时人或动物细胞的基因疗法；或者当方法在细菌细胞内实施时用于在人或动物治疗或预防细菌感染。
53. 一种其包含条款35-52中任何一项的第一载体或联合的食品、食品成分或前体成分、饮料、水(例如打算供人类消费)、工业或环境物质(例如石油、石油产品、土壤或水道或水库，或者用于回收或加工石油、石油产品、土壤、水、食品、食品成分或前体、或饮料或饮料前体成分的设备)。
54. 一种包含条款35-52中任何一项的第一载体或联合的抗生素(例如抗细菌或抗古细菌)组合物。
55. 一种用于在人或动物中治疗或预防疾病或症状(例如细菌感染或肥胖症)的药物，药物包含条款35-52中任何一项的第一载体或联合。
在一个实例中，载体、联合、药物或抗生素由医疗设备或医疗容器(例如注射器、吸入器或静脉输液袋)包含。
任何一般特征(参见下文)也可应用于本构造。以下任何构造可与本构造联合，例如以提供包括在本文一项或多项权利要求中的特征联合。
普遍适用的特征
以下特征应用于本发明的任何构造(例如在其方面、实施方案、概念、段落或实例中的任何一项)：
在一个实例中，靶标序列为染色体序列、内源性宿主细胞序列、野生型宿主细胞序列、非病毒性染色体宿主细胞序列、不是外源序列和/或非噬菌体序列(即这些中的一种多种或全部)，例如序列为野生型宿主染色体细胞序列，比如由宿主细胞染色体包含的抗生素抗性基因或必需基因序列。在一个实例中，序列为宿主细胞质粒序列，例如，抗生素抗性基因序列。
在一个实例中，至少两种靶标序列被Cas修饰，例如抗生素抗性基因和必需基因。这样多靶向可用于减少逃逸突变宿主细胞的进化。
在一个实例中，Cas为野生型内源性宿主细胞Cas核酸酶和/或每一种宿主细胞为野生型宿主细胞。因此，在一个实施方案中本发明采用不需要首先使内源性Cas去阻遏以提供相关Cas活性的宿主细胞。在一个实例中，每一种宿主细胞具有组成型Cas核酸酶活性，例如组成型野生型Cas核酸酶活性。在一个实例中，宿主细胞为细菌细胞；在另一个实例中宿主细胞为古细菌细胞。采用内源性Cas是有利的，因为这能使编码HM-或PM-cRNA或gRNA的载体内空间得以释放。例如，当II型CRISPR/Cas系统用于本发明的宿主细胞修饰时，II型Cas9核苷酸序列为大型的并且在那种情况下采用宿主细胞的内源性Cas反而是有利的。在4.2千碱基(kb)测量下时最常使用的Cas9来自化脓性链球菌。当其为有效的核酸酶时，分子长度可超越载体能容纳多少遗传物质的极限，这种极限对在活体动物组织及本文描述的其它环境下使用CRISPR造成障碍(参见F.A. Ran等,“采用金黄色葡萄球菌Cas9的体内基因组编辑(In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9),”Nature, doi:10.1038/nature14299, 2015)。因此，在一个实施方案中，本发明的载体为AAV载体，或者具有不超过AAV载体的外源性DNA插入能力，并且Cas为宿主细胞的内源性Cas，其中细胞为细菌或古细菌细胞。
嗜热链球菌Cas9 (UniProtKB-G3ECR1 (CAS9_STRTR))核苷酸序列具有1.4kb大小。
因此，在一个实施方案中，本发明提供
一种包含多于1.4kb或多于4.2kb，编码CRISPR/Cas系统组分的外源性DNA序列的核酸载体，其中序列包含用于在宿主细胞(本文的任何细胞，例如人、动物或细菌或古细菌宿主细胞)表达一种或多种HM-或PM-crRNAs或gRNAs的工程化阵列或工程化序列(任选地如本文描述的那样)，其中阵列或工程化序列不包含编码与crRNA(s)或gRNA(s)同源的Cas核酸酶的核苷酸序列；任选地其中至少2、3或4种cRNAs或gRNAs由外源DNA编码。在一个实施方案中，宿主细胞为表达与crRNAs或gRNAs同源的Cas核酸酶的细菌或古细菌细胞。在另一个实例中，比如对于用于人或动物(例如啮齿动物、大鼠或小鼠)细胞，Cas核酸酶由不同的核酸载体编码。在一个实例中，其中细胞为人或动物细胞，载体为AAV或慢病毒载体。在一个实例中，本发明包括包含这样载体的宿主细胞，其中宿主细胞表达所述Cas。在一个实例中，宿主细胞为活体外人或动物细胞。
本发明也提供
一种包含多于1.4kb或多于4.2kb的外源性DNA序列的核酸载体，其中外源性DNA编码CRISPR/Cas系统的一种或多种组分和包含用于在宿主细胞表达一种或多种HM-crRNAs或gRNAs的工程化阵列或序列(例如本文中描述的任何这样的阵列或序列)，其中外源序列没有编码与crRNA(s)或gRNA(s)同源的Cas核酸酶的核苷酸序列；任选地其中至少2种不同的cRNAs或gRNAs由外源DNA编码。在一个实例中，本发明包括包含这样载体的宿主细胞，其中宿主细胞表达所述Cas。在一个实例中，cRNAs或gRNAs能够在宿主细胞内杂交于相应的靶前间区序列，其中每一个前间区序列由抗生素抗性或必需宿主基因包含。这通过本文的样例举例说明，其中我们显示宿主细胞在混合或非混合细胞种群中的选择性生长抑制作用达至少10倍。混合物刺激在人类微生物群发现的种类和菌株的联合。
所谓的“编码CRISPR/Cas系统组分的外源性DNA序列”意指插入到载体骨架中的DNA，或者先前已经发生所述插入(例如采用重组DNA技术，比如重组工程技术)的载体后代中的这样DNA。在一个实例中，外源性DNA为载体插入容纳能力的95、90、80、85、70或60%。
在一个实例中，载体为病毒载体。病毒载体对外源性DNA插入具有特别有限的容量，因此需要考虑病毒包装容量。需要为编码重要病毒功能，比如用于表达外壳蛋白和聚合酶的序列留出空间。在一个实例中，载体为噬菌体载体或AAV或慢病毒载体。其中宿主为细菌细胞的噬菌体载体是有用的。
本发明提供一种联合产物试剂盒(例如用于在如本文描述的人或动物受试者治疗或预防疾病或病症)，其中试剂盒包含阵列、载体、系统、细胞、工程化cRNA或gRNA编码序列或者cRNA或gRNA，其与抗生素(第一抗生素)的联合，其中cRNA或gRNA能够杂交于由细菌宿主细胞的抗生素抗性基因包含的前间区序列，其中抗生素为所述第一抗生素。抗生素可为本文公开的任何抗生素。在一个实施方案中，抗生素在配方中与阵列、载体、系统、细胞、工程化cRNA或gRNA编码序列或者cRNA或gRNA联合。在一个实例中，试剂盒在与含有阵列、载体、系统、细胞、工程化cRNA或gRNA编码序列或者cRNA或gRNA的容器分开的容器中包含抗生素。
在一个实施方案中，除非另外指明，这种或每一种细胞为细菌细胞、古细菌细胞、藻类细胞、真菌细胞、原生动物细胞、无脊椎动物细胞、脊椎动物细胞、鱼类细胞、鸟类细胞、哺乳动物细胞、伴侣动物细胞、狗细胞、猫细胞、马细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、兔细胞、真核细胞、原核细胞、人类细胞、动物细胞、啮齿动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。另外，在这种情况下，优选地细胞属于相同的门、目、科或属。
通过使用术语“工程化”，对技术人员(skilled addressee)应为显而易见的是，本发明的阵列、序列、载体、MGE或任何其它构造、概念、方面、实施方案、段落或实施例等为非天然存在的。例如，MGE、载体或阵列包含与MGE、载体或阵列的其它序列或组分一起非天然发现的一种或多种序列或组分。例如，阵列对这种或每一种宿主细胞为重组的、人工的、合成的或外源性的(即非内源性或非野生型)。
在一个实例中，本发明的阵列或载体被分离，例如自宿主细胞分离。在一个实例中，阵列或载体不与在细胞内与阵列的重复序列一起天然发现的Cas核酸内切酶编码序列联合。
在一个实例中，当不在宿主细胞内时，载体、MGE或阵列不与Cas核酸内切酶编码序列联合。在一个实例中，载体或MGE不包含Cas核酸内切酶编码序列。
在一个实例中，靶标修饰或切割通过dsDNA Cas核酸酶(例如Cas9，例如spCas9或saCas9)实施，借以通过非同源末端连接(NHEJ)进行切口修复。这通常在修复位点引入突变(插入缺失)，其对靶标位点的失活(例如噬菌体基因或调控元件，比如其必需基因或调控元件)是有用的。在另一个实例中，切割通过其在单链上切割(但不做双链DNA切割)的ssDNACas核酸酶(例如Cas9核酸酶)实施。这对有利于切割的HDR修复是有用的，其减少插入缺失的机会。当靶标位点(或包含它的基因或调控元件)为合乎需要时，例如当在靶标位点插入HM-或PM-DNA用于期望的位点修饰时，这可能是有用的。例如，在这种情况下，修饰的基因产生融合蛋白，蛋白包含与宿主DNA编码序列融合的HM-DNA编码的氨基酸，或与噬菌体DNA编码序列融合的PM-DNA编码的氨基酸序列。本发明也提供通过这样方法得到或可得到的编码融合蛋白的序列。在另一个实例中，HM-或PM-DNA包含调控元件(例如用于调控基因表达的启动子、增强子、阻遏蛋白或诱导型开关)，以至融合产物包含与宿主或噬菌体基因或调控元件DNA融合的所述DNA，从而产生融合基因。本发明也提供通过这样方法得到或可得到的融合基因。在一个实施方案中，本发明提供包含这样融合基因的载体(例如病毒、病毒粒、噬菌体、噬菌粒、前噬菌体或质粒)，任选地其中载体包含在细菌细胞内(例如原核、真核、细菌、古细菌或酵母细胞)。在一个实例中，细胞为体外的。
在一个实例中，HM或PM-DNA为细胞内的载体DNA。例如，载体中的HM-或PM-DNA侧翼可为位点特异性重组位点(例如frt或lox位点)，其通过或由宿主细胞或由载体序列编码的位点特异性重组酶的作用切割。在另一个实例中，载体包含转录为HM-或PM-DNA的RNA拷贝的DNA和用于自RNA产生HM-或PM-DNA的逆转录酶(例如通过载体核酸序列编码)。这对产生期望的HM-或PM-DNA的许多拷贝是有用的，以增加在一个或多个靶标位点有力或有效引入的机会。在另一个实施方案中，HM-或PM-DNA为或由转导或转化宿主细胞的第二载体(例如第二噬菌体或质粒)的核酸编码。例如，这可能为辅助噬菌体(其也可编码一种或多种包装第一噬菌体载体需要的外壳蛋白)。在另一个实例中，DNA被提供在载体DNA中并且侧翼为臂，其中当载体包含在宿主细胞中时5’臂包含由Cas核酸酶识别的PAM，并且3’臂通过这样的PAM侧翼紧邻下游(3’)，在宿主细胞内Cas借以用其侧翼臂裂解释放HM-或PM-DNA，侧翼臂可被设计成与宿主靶标序列中切口侧翼的宿主序列同源，HM-DNA借以被整合到宿主基因组中，或者PM-DNA被整合到噬菌体基因组中。在一方面，本发明提供包含这样HM-或PM-DNA的核酸和包含这样核酸的臂或载体(例如噬菌体或包装的噬菌体)，任选地其中载体由宿主细胞包含。任选地，HM-DNA与本文定义的HM-阵列联合。任选地， PM-DNA与本文定义的PM-阵列联合。
本发明的一个具体应用为改变活体外或体内混合细菌种群中拟杆菌门(例如拟杆菌属)细菌的比例。如以上讨论的那样，这可用于环境治理比如治理被不期望的拟杆菌门感染的水道或饮用水，或者有利于人类或动物体内有用的共栖或共生拟杆菌门，例如用于产生为这样的目的给予人或动物的细菌培养物。在后者的一个实例中，本发明对增加拟杆菌门相对于厚壁菌门的相对比例是有用的，其比例与体重降低有关并因此在治疗或预防用于医疗或美容目的的肥胖症方面发现用途。
研究表明，拟杆菌属在预防难辨梭状芽孢杆菌感染方面具有作用。限制潜在病原体的进入和增殖的免疫反应的发展深切依赖于脆弱拟杆菌。而且，潘氏细胞蛋白可通过多形拟杆菌刺激应答反应产生抗菌肽，并且这些分子可预防定殖于肠道的病原体。另外，多形拟杆菌可诱导潘氏细胞产生杀菌凝集素RegIII，其通过结合于革兰氏阳性菌的肽聚糖发挥其抗微生物作用。因此，本发明以其任何构造用于增加肠道细菌混合种群中拟杆菌属(例如多形拟杆菌和/或脆弱拟杆菌)比例的用途，对限制人或非人动物的种群或肠道致病细菌的定殖是有用的。
Hooper等证实多形拟杆菌能够修饰由岩藻糖阻遏基因和信号系统介导的复杂相互作用中的肠道岩藻糖基化。利用转录分析证明，多形拟杆菌能够调控多种宿主基因的表达，包括参与营养吸收、粘膜屏障防御和血管生成因子产生的那些基因。
在一个实施方案中，混合种群由第一和第二细菌组成(即没有另外的细菌种群)。
在一个实例中，这种或每一种阵列为载体中的重组阵列和/或载体中的分离阵列。在一个实例中，阵列包含在宿主细胞(例如微生物、细菌或古细菌细胞)内。
在一个实例中，所述Cas为宿主细胞的内源性Cas核酸酶(例如Cas9)。通过利用宿主的Cas，这使得有效利用阵列中的宿主类型重复区和也利用内源性crRNA的可能性-释放出否则其在载体中有限的容纳能力，比如病毒或噬菌体(注意Cas基因序列比如II型Cas9为大型的)。
在一个实例中，宿主CRISPR/Cas系统为I型系统。在一个实例中，宿主CRISPR/Cas系统为II型系统。在一个实例中，宿主CRISPR/Cas系统为III型系统。
由本发明的HM-crRNA或gRNA引导的Cas为宿主内源性Cas或在靶标序列中与PAM相容的载体编码的Cas。
任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为革兰氏阴性菌(例如螺旋状菌属或弧菌属)。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为革兰氏阳性菌。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为支原体属、衣原体属、螺旋体属或结核分枝杆菌属。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为链球菌属(例如化脓性链球菌或嗜热链球菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为链球菌属(例如金黄色葡萄球菌，例如MRSA)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为大肠杆菌(例如O157: H7)宿主，例如其中Cas由载体编码或内源性宿主Cas核酸酶活性被去阻遏。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为假单胞菌属(例如铜绿假单胞菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为弧菌属(例如霍乱弧菌(例如O139)或创伤弧菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为奈瑟氏菌属(例如淋病奈瑟氏菌或脑膜炎奈瑟氏菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为博德特氏菌属(例如百日咳博德特氏菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为嗜血杆菌属(例如流感嗜血杆菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为志贺氏菌属(例如痢疾杆菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为布鲁氏菌属(例如流产布鲁氏菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为弗朗西斯氏菌属宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为黄单孢菌属宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为农杆菌属宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为欧文氏菌属宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为军团菌属(例如嗜肺军团菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为李斯特氏菌属(例如单核细胞增生李斯特氏菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为弯曲菌属(例如空肠弯曲杆菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为耶尔森氏菌属(例如鼠疫耶尔森氏菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为疏螺旋体属(例如博氏疏螺旋体)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为螺杆菌属(例如幽门螺杆菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为梭菌属(例如难辨梭状芽孢杆菌或肉毒梭状芽孢杆菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为埃立克体属(例如查菲埃立克体)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为沙门氏菌属(例如伤寒沙门氏菌或肠道沙门氏菌，例如血清型鼠伤寒沙门氏菌，例如DT 104)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为衣原体属(例如衣原体肺炎)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为副衣原体属宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为棒状杆菌属(例如无枝菌酸棒杆菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为克雷伯氏菌属(例如肺炎克雷伯氏菌)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为肠球菌属(例如粪肠球菌或屎肠球菌，例如利奈唑胺耐药的)宿主。任选地，宿主(或第一和/或第二细菌)为不动杆菌属(例如鲍曼不动杆菌，例如多重耐药的)宿主。
在一个实例中，细胞为原核细胞。在一个实例中，细胞为细菌细胞。在一个实例中，细胞为古细菌细胞。在一个实例中，细胞为微生物细胞。在一个实例中，细胞为原生动物细胞。在一个实例中，细胞为鱼类细胞。在一个实例中，细胞为鸟类细胞。在一个实例中，细胞为爬行动物细胞。在一个实例中，细胞为蛛形纲动物细胞。在一个实例中，细胞为酵母细胞(例如酵母细胞)。在一个实例中，宿主细胞为植物细胞。在一个实例中，宿主细胞为动物细胞(例如不是人类细胞，例如不是啮齿动物细胞)。在一个实例中，宿主细胞为人类细胞(例如不是胚胎或人类的细胞)，例如为体外宿主细胞。在一个实例中，细胞为牲畜或伴侣宠物动物细胞(例如牛、猪、山羊、绵羊、马、狗、猫或兔细胞)。在一个实例中，宿主细胞为昆虫细胞(在其生命周期的任何阶段的昆虫，例如卵、幼虫或蛹)。在一个实例中，宿主细胞为原生动物细胞。在一个实例中，细胞为头足类动物细胞。
任选地，阵列、系统、工程化核苷酸序列或载体核酸进一步包括(例如一种、两种或多种)核定位信号(NLS)，例如当宿主细胞为真核细胞例如植物或动物时用于靶向细胞核。在一个实例中，NLS侧覆盖本发明的Cas编码核酸序列和/或本发明阵列的每一末端，特别是用于在真核宿主细胞中靶向。
tracrRNA序列可从本发明的阵列或载体剔除(omitted)，例如对于不使用tracrRNA 类型的Cas系统。
在一个实例中，引导至靶标的Cas为核酸外切酶。任选地本文提及的切口酶为双链切口酶。
切口酶的一个实例为Cas9切口酶，即Cas9具有两个核酸酶功能区即RuvC和/或HNH功能区中的一个失活。
任选地，宿主系统为I型系统(和任选地阵列、HM-crRNA或gRNA属于不同的CRISPR系统，例如II或III型)。任选地阵列或工程化序列与含有编码同阵列、HM-crRNA或gRNA相同系统的Cas的核苷酸序列的病毒或质粒联合，例如其中Cas对于宿主系统不操纵或有效操纵。任选地宿主系统为II型系统(和任选地阵列、HM-crRNA或gRNA属于不同的CRISPR系统，例如I或III型)。任选地阵列或工程化序列与含有编码同阵列、HM-crRNA或gRNA相同系统的Cas的核苷酸序列的病毒或质粒联合，例如其中Cas对于宿主系统不操纵或有效操纵。任选地，宿主系统为III型系统(和任选地阵列、HM-crRNA或gRNA属于不同的CRISPR系统，例如，I或II型)。任选地工程化序列的阵列与含有编码同阵列相同系统的Cas的核苷酸序列的病毒或质粒联合，例如其中Cas对于宿主系统不操纵或有效操纵。
本文提及的使用载体DNA也可在一个备选实施方案中进行必要的变更应用于上下文允许的载体RNA。例如，其中载体为RNA载体。因此，当上下文允许时，当指涉本文载体DNA时，本发明的所有特征在备选方案中被公开，并被认为是“RNA”而不是“DNA”。在一个实例中，这种或每一种载体也编码逆转录酶。
在一个实例中，这种或每一种阵列或工程化核苷酸序列由纳米粒载体或以脂质体提供。
在一个实例中，Cas为用于切割的Cas核酸酶、用于干扰(interrupting)的失活Cas(dCas)或与用于激活靶标的转录激活因子偶联的dCas。
在一个实例中，宿主CRISPR/Cas系统包含宿主CRISPR阵列和用于宿主中核苷酸序列靶向的同源宿主Cas。在一个实例中，宿主靶标序列包含至少5、6、7、8、9、10、20、30或40个相接核苷酸。在一个实例中，靶标序列被Cas例如Cas9切割。在一个实施方案中，序列不处于间隔区。
在一个实例中，这种或每一种阵列或工程化序列包含对于宿主内crRNA或gRNA转录为功能性的外源性启动子。
在一个实例中，这种或每一种阵列重复区与宿主阵列的重复区相同，其中CRISPR阵列不包含被宿主CRISPR/Cas系统的Cas (例如Cas核酸酶，例如Cas9)识别的PAM。这进行必要的变更应用于HM-crRNA和gRNA的重复序列。该实施方案为有利的，因为其只是使得CRISPR阵列使用内源性宿主Cas靶向宿主靶标序列。那么这是有效的，因为阵列是专为宿主元件(machinery)使用，并因此有助于宿主细胞中发挥作用。另外，或者(例如其中阵列与外源性(非宿主内源性) Cas编码序列联合提供)，该实施方案使得CRISPR阵列使用内源性编码的tracrRNA，因为CRISPR阵列重复区会杂交于内源性tracrRNA用于产生前(pre-crRNA)和加工成其与宿主靶标序列杂交的成熟crRNA。后者复合物然后能引导内源性Cas核酸酶(例如Cas9)或引导自CRISPR阵列包含的序列产生的Cas。因此，该实施方案提供简单构造包含CRISPR阵列但不包含tracrRNA-和/或Cas核酸酶编码序列的载体(例如包装的病毒或噬菌体)的灵活性。这对于载体构造而言更为直截了当，并且也在载体(例如病毒或噬菌体)中释放出有价值的空间，这是对于载体，特别是病毒载体(例如噬菌体)的容量限制的有用记忆。另外的空间可为有用的，例如使得在阵列中包含更多的空间，例如以靶向用于修饰的宿主基因组，比如使宿主基因失活或为宿主内表达带入期望的非宿主序列。另外或者，空间可用于在载体中包含多种CRISPR阵列。例如，这些可为一个排列，其中第一阵列属于第一CRISPR/Cas类型(例如II型或II-A型)，和第二阵列能够属于第二种类型(例如I 或III型或者II-B型)。另外或者，阵列能够使用宿主内的不同Cas核酸酶(例如一个阵列对宿主Cas核酸酶为可操纵的和第二阵列对外源性Cas核酸酶(即载体编码的核酸酶)为可操纵的)。这些方面提供用于靶向宿主的元件(machinery)，一旦载体被引入，那么当宿主需要靶向更大范围的元件时其有益于减少宿主对载体的抗性。例如，如果宿主能够获得基于第一CRISPR阵列序列的新间隔区，那么第二CRISPR阵列仍能够在宿主内起作用，以靶向宿主细胞内相应靶标序列。因此，该实施方案对减少宿主对载体的适应性是有用的。
另一个益处是可在CRISPR阵列包含(或分布在载体中多种这样的阵列上)相同间隔区(例如用于靶向宿主细胞内的靶标位点的间隔区)的多个拷贝。这是有益的，因为有人提出宿主比如细菌和古生菌的适应性可能包括自其其中间隔区靶向有益的宿主DNA的阵列失去间隔区 (PLoS Genet. 2013; 9(9): e1003844. doi: 10.1371/journal.pgen.1003844. 2013年9月26日电子出版, “处理CRISPR免疫的进化缺点：细菌和有益的质粒(Dealing with the evolutionary downside of CRISPR immunity:bacteria and beneficial plasmids)”, Jiang W等)。据认为通过重复序列的重组发生间隔区-重复区单元的去除。因此，根据发明的本方面，提供1、2、3、4、5、6或更多种本发明的CRISPR阵列或工程化序列，其包含多种(例如2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100或更多种)杂交于宿主靶标序列的间隔区拷贝。这减少宿主细胞内通过重组失去所有这些间隔区的机会。在该方面的进一步应用中，CRISPR阵列包含含有一种或多种(例如2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或更多种)间隔区拷贝的第一阵列和含有一种或多种(例如2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或更多种)相同间隔区拷贝的第二阵列，其中第一阵列中的间隔区拷贝每一个侧翼为第一重复区和第二阵列中的相同间隔区拷贝每一个侧翼为第二重复区，其中第一重复区不同于第二重复区。这有益于选择第一和第二重复区中的至少一个不被宿主Cas核酸酶(或相同的宿主核酸酶)识别，以减少包含多于一种阵列的宿主适应的机会。在一个实例中，第一阵列与未被宿主细胞编码并对第一重复区为同源Cas的Cas核酸酶序列相结合。任选地，第二阵列也与未被宿主细胞编码并对第二重复区为同源Cas的Cas核酸酶序列(例如与第一阵列的相同或不同)相结合。
一个实施方案提供包含在第一载体中的第一阵列和包含在其不包含第一阵列的第二载体中的第二阵列(例如其中载体为质粒或病毒粒子(例如相同病毒类型的)或包装的噬菌体(例如相同噬菌体类型的))。这是有用的，因为载体可被同时或依序引入到相同的宿主细胞中。因此，当宿主对第一阵列获得抗性时，引入第二阵列以提供抗性宿主(例如细菌或古菌)先前没有与其共同进化，从而提供抗宿主细胞的第二修饰(例如敲落)波的第二阵列。这也提供了灵活性，因为第三种这样的载体(包含不同于第一和第二阵列和间隔区的间隔区或阵列)能与第二载体同时或依序引入到宿主细胞，以提供对第一阵列间隔区具有抗性的宿主进化过程中先前不存在的宿主细胞修饰的另外途径。代替阵列，可以使用本发明的工程化核苷酸序列。
因此，在一个实施方案中，本发明提供用于修饰宿主细胞的组合物，其中组合物提供如本文描述的任何阵列或工程化序列。因此，在一个实施方案中，本发明提供用于修饰宿主细胞组合物，其中组合物提供第一载体(例如病毒粒子或包装的噬菌体)中如本文描述的第一阵列和第二载体(例如分别为病毒粒子或包装的噬菌体)中如本文描述的第二第一这样的阵列，其中第二阵列包含靶向一个或多个宿主靶标序列并且不被第一阵列包含的一个或多个间隔区。代替阵列，可以使用本发明的工程化核苷酸序列。
在一个实施方案中，载体或工程化序列包含在噬病毒体载体中并且宿主或者为可感染细胞的病毒。例如，宿主为可能已感染阿米巴细胞的大型病毒。例如，宿主为Sputnik病毒、Pithovirus、mimivirus、mamavirus、巨型病毒或潘多拉病毒，例如，其中宿主病毒处于水中。在该实施方案的一个实施例中，本发明用于水或污水处理(例如净化，例如水道、河流、湖泊、池塘或海洋治理)。
在一个实施方案中，这种或每一种载体或工程化序列为或由ΦΝΜ1噬菌体包含，例如其中宿主细胞为金黄色葡萄球菌(例如MRSA)细胞。
一般特征也提供以下条款：
1. 一种抗微生物组合物(例如抗生素，例如药物、消毒剂或漱口水)，其包含本发明任何一个方面的阵列、工程化序列、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒、前噬菌体、种群或收集液(collection)。
2. 用于医疗或牙科或眼科用途(例如用于在生物体治疗或预防感染或者限制在生物体的扩散)的条款1的组合物。
在一个实例中，生物体为植物或动物，例如脊椎动物(例如本文公开的任何哺乳动物或人)或者作物或食用植物。
3. 一种包含本发明的阵列、工程化序列、系统、收集液(collection)、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒、前噬菌体、组成、种群、收集液(collection)、用途或方法，用于化妆品用途(例如用于美容产品，例如化妆品)或用于卫生用途(例如用于卫生产品，例如肥皂)的组合物。
4. 包含条款1-35中任何一项的阵列、工程化序列、收集液(collection)、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒、前噬菌体、种群或收集液(collection)的组合物在医药或用于牙科治疗或预防用途中的用途。
5. 包含本发明的阵列、工程化序列、收集液(collection)、系统、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒、前噬菌体、组成、种群、收集液(collection)、用途或方法的组合物在化妆品用途(例如用于美容产品，例如化妆品)或用于卫生用途(例如用于卫生产品，例如肥皂)的用途。
6. 本发明的阵列、工程化序列、系统、收集液(collection)、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒、前噬菌体、组合物、种群或收集液(collection)在能够修饰宿主细胞的靶核苷酸序列的宿主修饰(HM) CRISPR/Cas9系统(例如 I、II 或III型)中的用途，其中阵列、工程化序列、系统、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒、前噬菌体、种群或收集液(collection)为依据本发明。
7. 条款4、5或6的用途，其中阵列、工程化序列、系统、收集液(collection)、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒、前噬菌体、种群或收集液(collection)不处于宿主细胞内。
8. 条款5或6的用途，其中阵列、工程化序列、收集液(collection)、系统、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒、前噬菌体、种群或收集液(collection)处于宿主细胞(例如微生物，细菌或古菌细胞)内。
9. 条款4-6中的任何一项用于修饰微生物细胞(例如用于杀伤或减少细胞生长或微生物细胞培养)的用途。
10. 一种修饰宿主细胞(例如微生物细菌或古菌)内靶核苷酸序列的方法，方法包括用本发明的阵列、工程化序列、系统、收集液(collection)、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒、种群或收集液(collection)转化宿主细胞，靶核苷酸序列借以被Cas修饰，其中宿主靶标序列为细胞的宿主CRISPR/Cas系统的核苷酸序列。
11. 一种减少宿主细胞对经核酸载体转化或在宿主细胞内保持核酸载体的抗性发展的方法，其中宿主细胞包含靶核苷酸序列，方法包括用本发明的阵列、工程化序列、收集液(collection)、系统、病毒、病毒粒子、噬菌体、噬菌粒、种群或收集液(collection)转化宿主细胞，靶核苷酸序列借以被Cas修饰(例如切割、突变或敲落)。
12. 条款11的方法，其中载体为能够感染宿主细胞的病毒和转化步骤包括用载体感染宿主细胞。
13. 条款11或12的方法，其中宿主细胞为细菌或古细菌细胞和载体为噬菌体或噬菌粒。
14. 条款11-13中任何一项的方法，其中宿主靶标序列对CRISPR/Cas介导的载体序列间隔区的采集为必需的。
15. 任何一项前述条款的阵列、工程化序列、系统、载体、细胞、收集液(collection)、组合物、用途或方法，其中至少组分(ii)被包含在其能够表达细胞内溶素用于宿主细胞溶菌作用的病毒(例如噬菌体)中，任选地其中细胞内溶素为噬菌体phi11、噬菌体Twort、噬菌体P68、噬菌体phiWMY或噬菌体K细胞内溶素(例如MV-细胞内溶素或P-27/HP细胞内溶素)。
16. 与用于宿主细胞溶菌作用的细胞内溶素联合，例如与MV-细胞内溶素或P-27/HP细胞内溶素或其功能同源物联合的条款15的阵列、工程化序列、系统、载体、收集液(collection)、细胞、组合物、用途或方法。
17. 与抗微生物药，例如抗生素，例如β-内酰胺类抗生素联合的任何一项前述条款的阵列、工程化序列、系统、载体、收集液(collection)、细胞、组合物、用途或方法。
18. 任何一项前述条款的阵列、工程化序列、系统、载体、收集液(collection)、细胞、组合物、用途或方法，其中宿主细胞为葡萄球菌属、链球菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、李斯特氏菌属、大肠杆菌属、脱硫弧菌属或梭菌属宿主细胞。
19. 任何一项前述条款的阵列、工程化序列、系统、载体、收集液(collection)、细胞、组合物、用途或方法，其中宿主细胞为葡萄球菌属(例如金黄色葡萄球菌)宿主细胞和至少组分(ii)包含在I、II或III类葡萄球菌属噬菌体(例如包装的噬菌体)中，任选地为有尾噬菌体目或肌尾噬菌体科噬菌体。
20. 任何一项前述条款的阵列、工程化序列、系统、载体、细胞、收集液(collection)、组合物、用途或方法，其中宿主细胞为β-内酰胺类抗生素抗性金黄色葡萄球菌、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素抗性金黄色葡萄球菌或替考拉宁抗性金黄色葡萄球菌，和任选地靶标序列分别为宿主β-内酰胺类抗生素抗性基因、甲氧西林抗性基因、万古霉素抗性基因或替考拉宁抗性基因的序列。
用于产生和测试本发明噬菌体载体的合适方法为例如在WO2014/124226中公开的一般方法。
可动遗传元件、转座子和载体(用于本发明的任何构造)
质粒在拟杆菌属种类中很常见，并且在20-50%的菌株中被发现。许多质粒具有oriT和反式作用迁移基因，这使得它们通过接合转移。因此，在一个实例中，载体为包含oriT和/或迁移基因的质粒，例如其中第一或第二细菌为拟杆菌属。在一个实例中，工程化序列由这样的载体包含。
在一个实例中，宿主细胞、或者第一或第二细菌天然包含转座子。转座子(具有可迁移和接合两方面)不独立复制；相反，它们自染色体DNA切除和整合到染色体DNA中，并且与染色体DNA一同被拷贝。接合转座子具有切除和整合的机制，类似于质粒和细菌噬菌体两者的一些特征。接合转座子在拟杆菌属当中实际上普遍存在：超过80%的拟杆菌属菌株包含至少一种接合转座子。拟杆菌属的接合转座子属于至少两个家族；CTnDot被最好描述。通常，其中它们被发现的菌株名称被添加到命名中(例如在多形拟杆菌的DOT菌株中发现的CTnDot)。除能被插入到染色体中以外，拟杆菌属接合转座子能够插入到共驻留质粒中，并且通过使其本身整合到质粒中和便于质粒-接合转座子杂合体转移进入另一细胞而使它们顺式迁移(即它们可作用于物理上相邻的实体)。通过供应便于质粒转移需要的因子，同时在物理上保持与质粒分开，它们也可“反式”迁移共驻留质粒。
接合转座子不排除彼此做质粒，所以菌株能聚集多于一种接合转座子。此外，一些证据表明在菌株中存在接合转座子的多于一种拷贝导致刺激转位(反式激活)。从理论上讲，这表明当环境中累积更多的接合转座子时，转座子基因向其它细菌的转移也会增加，并且基因有明显向上的螺旋式分布。许多拟杆菌属转座子携带tetQ基因并且因而赋予四环素抗性。进一步地，自主转移和其它活动明显由低水平的四环素刺激，通过tetQ-rteA-rteB操纵子调控。四环素增加rteA和-B的转录，其对双组分调控系统的传感器和激活组分进行编码。转而，RteB激活rteC的表达，其对自主转移是必要的。
在一个实例中，载体(例如包含工程化序列的载体)包含转座子，其中转座子包含本发明的工程化序列、HM-或PM-阵列，其中转座子在宿主细胞或者在第一或第二细菌宿主细胞种类内为可操纵的。在一个实施方案中，转座子为拟杆菌属转座子(例如CTnDot转座子，例如多形类杆菌或脆弱拟杆菌CTnDot转座子)和宿主细胞、或者第一或第二细菌为或包含拟杆菌属(例如属于与所述CTnDot转座子相同的种类)。在一个实例中，转座子为接合转座子。在一个实例中，转座子为可迁移转座子。在一个实例中，转座子可在拟杆菌属细胞之间转移。在一个实例中，转座子包含intDOT序列。在一个实例中，转座子包含oriT。在一个实例中，转座子编码一种或多种交配孔蛋白用于转座子在宿主细胞之间的接合转移。
在一个实例中，本发明提供包含拟杆菌属tetQ基因的转座子。在一个实例中，转座子进一步包含拟杆菌属tetQ-rteA-rteB操纵子。在一个实例中，第一或第二细菌为拟杆菌属。在一个实例中，转座子为编码一种或多种用于转座子在宿主细胞之间接合转移的交配孔蛋白的拟杆菌属CTnDot转座子，并且包含一种或多种本发明的阵列或工程化序列，oriT、intDOT序列和tetQ-rteA-rteB操纵子，和任选地用于或与四环素联合给予或被给予本文提及的所述人或非人动物。大多数拟杆菌属CTns的转移通过四环素刺激。转座子对宿主细胞内的整合酶为可操纵的或者对转座子的相同或不同载体上携带的外源性整合酶为可操纵的。在一个实施方案中，载体为包含转座子和编码同源整合酶的核苷酸序列的噬菌体(例如包装的噬菌体)。噬菌体能够感染用于转座子复制和切除的宿主细菌细胞，例如用于在混合细菌种群(例如肠道微生物种群)中接合转移至邻近的宿主细胞。
在一个实施方案中，转座子由携带一种或多种宿主细胞之间转座子转移必需的基因序列的载体包含，其中所述基因序列在载体核酸上转座子的外部。例如，载体为能够感染宿主细胞(例如拟杆菌属宿主细胞)的包装的噬菌体，其中噬菌体核酸包含所述转座子，其含有本发明的阵列和转座子的上游或下游及对转座子的接合转移可操纵的一种或多种基因(例如编码用于转座子接合转移的释放酶、偶联蛋白和/或交配桥蛋白一种或多种基因；和/或mob和tra操纵子中的一种或两者)，其中一种、多种或所有这些基因不由转座子包含。在一个实例中，这些基因为用于自第一宿主细胞内染色体DNA切除转座子的基因。因此，转座子能够在该细胞内部迁移并携带其对于随后接合转移进入第二宿主细胞必需的基因。通过以这种方式在转座子外部的载体上提供一些转座子基因，这在转座子中释放出空间用于包含本发明的工程化序列或阵列DNA，以至这可被容纳并由迁移的转座子携带。本发明提供包含一种或多种这样转座子的这样载体，用于本发明的方法、用途或系统或者通常用于引入到细菌细胞中(在这种情况下不是靶向噬菌体序列，包含在转座子中的阵列能够靶向细菌靶标序列以修饰序列，例如利用包含转座子的细胞内的Cas切割它)。
CTnDot切除与整合的分子机制与细菌噬菌体而不是转位更为相似。CTnDOT整合酶和切割蛋白其自身与细菌噬菌体的相当类似。因此，在一个实施方案中一种或多种本发明转座子的整合酶和/或切割蛋白的功能分别由噬菌体整合酶和/或切割蛋白提供，并且转座子不包含其功能由噬菌体蛋白提供的编码这样整合酶或切割蛋白的相应基因。
在一个实例中，转座子包含rteC和操纵子xis2c-xis2d-orf3-exc。任选地，载体另外包含转座子外部的mob和tra操纵子(例如在载体核酸中转座子的上游或下游)。因此，这在转座子中释放出空间用于提供本发明的CRISPR阵列序列或工程化序列。
许多接合转座子能够迁移其它元件。例如，许多共驻留质粒由接合转座子以反式迁移。这发生于含有oriT的质粒采用CTn提供的交配孔蛋白用于转移至受体细胞时。拟杆菌属CTns也显示当以顺式迁移元件时，对CTns特征是不典型的。例如，如果CTnDOT自染色体切除并整合在质粒上，其能提供交配孔(oriT)和迁移(释放酶/偶联)蛋白，使其通过“以顺式”起作用来转移整个质粒。这种采用反式和顺式迁移机制两者的能力是不常见的，并且提示拟杆菌属CTns具有更大的容量来迁移其它元件。
在一个实例中，本发明的载体为包含一种或多种本发明的工程化序列或阵列和与宿主细胞种类编码交配孔蛋白的CTnDot转座子同源的oriT的质粒，质粒借以可在包含所述CTnDot转座子的宿主细胞内迁移。因此，质粒能够在宿主细胞之间水平转移，从而使本发明的阵列在这样的宿主细胞(例如拟杆菌属细胞)的种群中传播。在一个实例中，本发明提供包含载体细菌种群的组合物，其中载体细菌与这样的本发明质粒载体相容，载体借以能够在混合载体与受体菌时水平转移至包含同源CTnDot转座子的受体宿主细菌细胞(例如拟杆菌属或厚壁菌门，例如链球菌属细胞)。在一个实例中，载体细菌由供人或非人动物消费的饮料(例如益生菌饮料，比如本文描述饮料)或食品包含，载体细菌借以能够与人或动物(例如在口腔或肠道)包含的受体菌混合。CTnDOT样家族中的其它转座子包括CTnERL和CTn341，尽管这些元件与CTnDOT不同，并且因此替代CTnDot转座子，本发明一般方面的转座子可为CTnERL或CTn341转座子，当转座子由细菌或古细菌宿主细胞包含时，转座子携带一种或多种期望的CRISPR阵列或工程化序列用于靶向一种或多种细菌或噬菌体核苷酸靶标位点。
为使发生接合转座子的转移，发生主要有3个步骤。第一步是从染色体上切除以形成共价闭合环状中间物。第二，然后将单链拷贝通过交配孔转移至受体细胞，之后拷贝变成双链。第三，完整的双链CTn整合到受体的染色体。接合转座子为复制的，作为CTn的拷贝保留在供体细胞内。因为元件位于染色体内，它也垂直转移到后代细胞。这是重要的，因为当期望的CRISPR阵列或工程化序列(和任选地Cas序列)存在于CTns上时，它们不仅易于在种群内转移，而且它们也很稳定地保持世代相传。这可见于例如保留抗生素抗性决定簇时。进一步地，确信拟杆菌属可用作抗生素抗性决定簇的储库，其向拟杆菌属以外的其它生物体传播这些基因，甚至可能把这些元件转移至瞬时通过肠道的生物体。类似地，使用给予人或非人动物的本发明载体，可建立本发明阵列或工程化序列的贮库，例如用于治疗或预防肥胖症、糖尿病或炎症性肠病(IBD)或者本文公开的任何其它疾病或症状。
在一个实例中，可通过利用一种或多种由转座子(例如CTnDot)包含的阵列或序列开发期望的CRISPR阵列或工程化序列的储库，转座子能够被拟杆菌属细胞(例如人或非人动物的肠道或口腔中)包含，其中阵列/序列不靶向宿主拟杆菌属细胞的序列，但确实靶向由不同种类的肠道生物群细胞(例如细菌细胞) (例如厚壁菌门细胞或致病性细菌细胞，例如链球菌属、难辨梭状芽孢杆菌、幽门螺杆菌、沙门氏菌属、李斯特氏菌属、耶尔森菌属、志贺氏菌属或弯曲菌属细胞)包含的核苷酸序列。因此，能够发生以这种方式把本发明的阵列或序列转移至邻近的受体致病性或不期望的细菌，并且一旦在受体细胞内本发明的阵列可被操纵，以把Cas引导至宿主细胞内的相应靶标位点修饰(例如切割)位点。在这种情况下，阵列/序列可包含在感兴趣的受体细胞中发现的重复序列，以至阵列/序列可用受体细胞内的内源性CRISPR/Cas系统操纵。这避免了需要在本发明的载体、工程化序列或转座子中包含Cas和/或tracrRNA编码序列，从而释放出空间和简化构造。增加空间可用于使得在受体细胞中包含更多的间隔区以靶向更多的靶标位点。在一个备选方案中，转座子阵列或序列包含II型Cas9编码序列和同源重复序列。例如，Cas9 (本文提及的任何Cas9)为化脓性链球菌、嗜热链球菌或金黄色葡萄球菌的Cas9，并可任选地为切口酶或dCas9 (“失活Cas9”)。当拟杆菌属为专性厌氧菌(或强烈偏好厌氧环境)并且通常在肠道环境外为致病性时，使用拟杆菌属细胞作为本发明载体或转座子的载体可能是不合乎需要的，例如当给予人或动物的肠道或口腔时。为了解决这个问题，本发明提供包含本发明的载体、工程化序列或转座子的细菌载体种群，其中载体细菌与这样的载体、序列或转座子相容，载体、序列或转座子借以能够在混合载体与受体菌时水平转移至肠道微生物群中的受体宿主细菌细胞(例如拟杆菌属)。在一个实例中，载体细菌由供人或非人动物消费的饮料(例如益生菌饮料，比如本文描述的饮料)或食品包含，载体细菌可借以与人或动物包含的(例如在口腔或肠道)受体菌混合。在一个实施方案中，载体、序列或转座子包含本发明的CRISPR阵列，其中阵列靶向由受体细胞包含的核苷酸序列以修饰靶序列，例如通过切割序列使包含靶标序列的基因失活。在一个备选方案中，载体、序列或转座子能够水平转移(例如接合转座子转移)至细菌的第二受体种群，其对第一受体菌属于不同的种类，其中核苷酸序列靶标位点由第二受体菌包含但不由第一受体菌包含，靶标位点借以由第二受体菌(宿主细胞)中的Cas修饰。
在一个实例中，第一受体菌为拟杆菌属细菌和第二受体菌为厚壁菌门或致病性细菌，例如肠道细菌。在一个实例中，载体细菌包含含有一种或多种接合转座子(例如CTnDot转座子)的本发明载体(例如噬菌体或质粒)，其能够被载体细菌、第一细菌和第二细菌包含，例如其中转座子包含oriT和载体细菌，第一细菌和第二细菌与oriT相容。
在一个备选方案中，载体细菌能够例如在人或非人动物体内，例如在肠道、口腔或全身(例如在血液中)把本发明的载体、工程化序列或转座子直接转移至厚壁菌门或致病性细菌。在一个实例中，致病性细菌为难辨梭状芽孢杆菌、幽门螺杆菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌属、李斯特氏菌属、耶尔森菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、链球菌属或弯曲菌属细菌。
在一个实例中，载体细菌为选自以下的一个或多个种类的细菌：乳酸杆菌属种类(例如嗜酸菌(例如La-5、La-14或NCFM)、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、高加索乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳酸链球菌、罗伊氏乳杆菌或干酪乳杆菌例如代田菌)、双歧杆菌属种类(例如两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌或婴儿双岐杆菌)、嗜热链球菌和屎肠球菌。例如，细菌为嗜酸乳杆菌细菌。
可迁移转座子(像可迁移质粒)不能自主转移但能在TcR辅助元件存在下于细胞之间转移。最常讨论的这类拟杆菌属转座子包括Tn4399、Tn4555和非复制拟杆菌属单元。例如，可迁移转座子Tn4555在可遗传头孢西丁抗性研究期间以普通拟杆菌的临床分离被首次检测到。因此，在一个实施方案中，本发明的转座子为可迁移转座子(例如拟杆菌属可迁移转座子)，例如包含一种或多种本发明的阵列或序列的Tn4399或Tn4555。转座子与TcR辅助元件联合。
在一个实例中，本发明的转座子为肠球菌属Tn916或革兰氏阳性菌Tn1546转座子。转座子(例如作为CTnDot、Tn4399或Tn4555转座子)特征可为例如依据其末端重复区和/或转座酶或解离酶编码序列。在一个备选实例中，载体或转座子包含选自pMB1、pBR322、ColE1、R6K (与pir基因联合)、p15A、pSC101、F1和pUC的复制起始位点。在一个实例中，转座子与转座子迁移或转移需要的因子(例如抗生素，例如四环素)联合。在一个实例中，转座子包含抗生素抗性基因(例如四环素抗性基因)和转座子与所述抗生素联合(例如与所述抗生素同时或依序给予人)。在一个实例中，转座子为与同源转座酶联合的piggyBac、水手或睡美人转座子。在一个实例中，转座子为I类转座子。在一个实例中，转座子为II类转座子。在一个实例中，转座子为Tn家族转座子。
靶向细菌宿主中的抗生素抗性
抗生素抗性是一个世界性问题。新形式的抗生素抗性可以跨越国际边界轻松地在各大洲之间传播。许多形式的抗性以惊人的速度传播。世界卫生组织领导人已将抗生素抗性微生物描述为“噩梦细菌”，其对世界上每一个国家的人“造成灾难性的威胁”。每年在美国至少有200万人对一种或多种被设计治疗那些感染的抗生素产生抗性的细菌产生严重感染。每年至少有23000人直接死于这些抗生素抗性感染。更多的死于抗生素抗性感染并发症的其它病症。另外，每年有将近250000人需要住院治疗难辨梭状芽孢杆菌(艰难梭菌)感染。在大多数这些感染中，抗生素的使用是导致这种疾病的一个主要影响因素。在美国每年至少14000人死于难辨梭状芽孢杆菌感染。许多这些感染是可以预防的。抗生素抗性感染给已经不堪重负的美国和其它医疗保健体系带来了可观的和可以避免的费用。在大多数情况下，抗生素抗性感染需要长期和/或昂贵的治疗，延长住院时间，需要额外的去看医生和医疗保健用途，并且与用抗生素易于治疗的感染相比较导致更大的残疾和死亡。抗生素抗性对美国经济的总经济成本很难计算。估计数不尽相同，但在过度的直接医疗费用范围高达200亿美元，社会生产力损失的追加成本高达每年350亿美元(2008美元)。抗生素的使用是导致全世界抗生素抗性的最重要因素。抗生素是用于人类医学的最常用处方药物。然而，为人们提供的所有处方用抗生素中，多达50%是不需要的，或者没有规定的最佳效果。抗生素也常用于食用动物，以预防、控制和治疗疾病，以及促进食用动物的生长。使用抗生素促进生长是没有必要的，并且这种做法应逐步取消。最近美国食品与药品管理局(FDA)的指导方针描述了实现这一目标的途径。很难直接比较用于食用动物的药物量和人类使用的数量，但有证据表明，在食品生产中使用了更多的抗生素。
抗生素抗性增长的另一个主要因素是细菌的耐药菌株在人与人之间或自环境中的非人类来源(包括食物)传播。有四个核心行动将有助于打击这些致命的感染：1. 预防感染和防止耐药性的传播；2. 跟踪耐药菌；3. 提高今天的抗生素使用；和4. 促进开发新型抗生素和开发耐药菌的新诊断试验。细菌将不可避免地找到抵御我们开发的抗生素的方法，这就是为什么现在需要采取积极行动来保持不要出现新的耐药性和防止已经存在的耐药性蔓延。
本发明提供用于靶向抗生素抗性宿主和减少宿主对本发明组合物出现进一步抗性的可能性的改善手段。
使用本发明的宿主细胞和在这样的细胞靶向抗生素抗性的另外实施例如下：
1. 任选地宿主细胞为金黄色葡萄糖球菌细胞，例如对选自甲氧西林、万古霉素、利奈唑胺、达托霉素、喹奴普丁、达福普汀和替考拉宁的抗生素产生抗性，并且宿主靶标位点(或者一个或多个靶标位点)由对所述抗生素赋予宿主抗性的基因包含。
2. 任选地宿主细胞为铜绿假单胞菌细胞，例如对选自头孢菌素(例如头孢他啶)、碳青霉烯类(例如亚胺培南或美罗培南)、氟喹诺酮类、氨基糖苷类(例如庆大霉素或妥布霉素)和粘菌素的抗生素产生抗性，并且宿主靶标位点(或者一个或多个靶标位点)由对所述抗生素赋予宿主抗性的基因包含。
3. 任选地宿主细胞为克雷伯氏菌属(例如肺炎克雷伯氏菌)细胞，例如对碳青霉烯类产生抗性，并且宿主靶标位点(或者一个或多个靶标位点)由对所述抗生素赋予宿主抗性的基因包含。
4. 任选地宿主细胞为链球菌属(例如嗜热链球菌、肺炎链球菌或化脓性链球菌)细胞，例如对选自红霉素、克林霉素、β-内酰胺类抗生素、大环内酯类、阿莫西林、阿奇霉素和青霉素的抗生素产生抗性，并且宿主靶标位点(或者一个或多个靶标位点)由对所述抗生素赋予宿主抗性的基因包含。
5. 任选地宿主细胞为沙门氏菌属(例如血清型伤寒沙门氏菌)细胞，例如对选自头孢曲松、阿奇霉素和环丙沙星的抗生素产生抗性，并且宿主靶标位点(或者一个或多个靶标位点)由对所述抗生素赋予宿主抗性的基因包含。
6. 任选地宿主细胞为志贺氏菌属细胞，例如对选自环丙沙星和阿奇霉素的抗生素产生抗性，并且宿主靶标位点(或者一个或多个靶标位点)由对所述抗生素赋予宿主抗性的基因包含。
7. 任选地宿主细胞为结核分枝杆菌细胞，例如对选自耐异烟肼(INH)、利福平(RMP)、氟喹诺酮类、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素和阿奇霉素的抗生素产生抗性，并且宿主靶标位点(或者一个或多个靶标位点)由对所述抗生素赋予宿主抗性的基因包含。
8. 任选地宿主细胞为肠球菌属细胞，例如对万古霉素产生抗性，并且宿主靶标位点(或者一个或多个靶标位点)由对所述抗生素赋予宿主抗性的基因包含。
9. 任选地宿主细胞为肠杆菌科细胞，例如对选自头孢菌素类和碳青霉烯类的抗生素产生抗性，并且宿主靶标位点(或者一个或多个靶标位点)由对所述抗生素赋予宿主抗性的基因包含。
10. 任选地宿主细胞为大肠杆菌细胞，例如对选自甲氧苄啶、呋喃妥因、头孢氨苄和阿莫西林的抗生素产生抗性，并且宿主靶标位点(或者一个或多个靶标位点)由对所述抗生素赋予宿主抗性的基因包含。
11. 任选地宿主细胞为梭菌属(例如难辨梭状芽孢杆菌)细胞，例如对选自氟喹诺酮类抗生素和碳青霉烯类的抗生素产生抗性，并且宿主靶标位点(或者一个或多个靶标位点)由对所述抗生素赋予宿主抗性的基因包含。
12. 任选地宿主细胞为淋病奈瑟氏菌细胞，例如对选自头孢克肟(例如一种口服头孢菌素)、头孢曲松(一种注射用头孢菌素)、阿奇霉素和四环素的抗生素产生抗性，并且宿主靶标位点(或者一个或多个靶标位点)由对所述抗生素赋予宿主抗性的基因包含。
13. 任选地宿主细胞为鲍曼不动杆菌细胞，例如对选自β-内酰胺类、美罗培南和碳青霉烯类的抗生素产生抗性，并且宿主靶标位点(或者一个或多个靶标位点)由对所述抗生素赋予宿主抗性的基因包含。
14. 任选地宿主细胞为弯曲菌属细胞，例如对选自环丙沙星和阿奇霉素的抗生素产生抗性，并且宿主靶标位点(或者一个或多个靶标位点)由对所述抗生素赋予宿主抗性的基因包含。
15. 任选地，宿主细胞产生β(β)-内酰胺酶。
16. 任选地，宿主细胞为对实施例1-14的任何一项中列举的抗生素产生抗性的细菌宿主细胞。
在一个实施方案中，宿主细胞为USA300金黄色葡萄球菌菌株细胞。
在一个实例中，这种或每一种宿主靶标序列由宿主细胞的质粒，例如金黄色葡萄球菌质粒(例如USA300菌株的质粒)包含，例如，靶标由金黄色葡萄球菌细胞的pUSA01、pUSA02或pUSA03质粒包含。在一个实例中，第一和/或第二靶标由宿主mecA、mecA2或sek基因序列(例如金黄色葡萄球菌菌株细胞的)包含。在一个实例中，第一和/或第二靶标由宿主致病岛核苷酸(例如DNA)序列包含。在实例中，本发明的间隔区包含或由在WO2014/124226的第26页上表1中公开的间隔区组成，其间隔序列通过参照结合到本文中。在一个实例中，工程化序列、HM-crRNA或gRNA包含这样的间隔区。
其在小鼠皮肤定殖(colonisation)试验(例如在WO2014/124226, Kugelberg E,等. 通过采用金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌在小鼠建立浅表皮肤感染模型(Establishment of a superficial skin infection model in mice by usingStaphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes). Antimicrob AgentsChemother. 2005;49:3435-3441或Pastagia M等，一种新型嵌合细胞溶素显示优于莫匹罗星对于耐甲氧西林和敏感金黄色葡萄球菌菌株的皮肤去殖(decolonization) (A novelchimeric lysin shows superiority to mupirocin for skin decolonization ofmethicillin-resistant and -sensitive Staphylococcus aureus strains)，Antimicrob Agents Chemother. 2011; 55:738-744中公开的那样)中有效减少或杀伤或抑制抗生素抗性细菌宿主生长的本发明组合物、用途、方法系统、载体、收集液(collection)、阵列、工程化序列、病毒、噬菌体、噬菌粒、前噬菌体或病毒粒子，其中第一和/或第二靶标由对所述抗生素赋予抗性的宿主基因包含，例如其中宿主为金黄色葡萄球菌(例如USA300菌株)宿主。
提及化脓性链球菌序列可在Genbank收录号NC_002737下得到，其在854757-858863号位置具有cas9基因。化脓性链球菌Cas9氨基酸序列可在NP_269215号下得到。这些序列通过参照结合到本文中用于本发明。在20150079680中公开的另外序列，无论是明确地还是通过参照结合其中，也可通过参照结合到本文中用于本发明。也可参照WO2013/176772中序列和方法的公开，其通过参照结合到本文中。实例tracrRNA序列为在WO2014/124226的第15页公开的那些序列，其通过参照结合到本文中用于本发明。
在一个实例中，这种或每一种重复区包含或由长度为20-50 (例如24-47，例如30、29、28、27、26、25或24)个相接核苷酸组成。
在一个实例中，这种或每一种间隔区包含或由长度为18-50 (例如24-47，或者24-40，例如30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18)，例如19或20个相接核苷酸组成。
在一个实例中，第一重复区(most 5’在本发明的HM-阵列)紧邻与包含第一宿主靶标的序列互补的间隔序列的5’。这是有用的，鉴于观察到新获得的间隔区(例如入侵噬菌体序列的)通常在细菌的这个位置被结合，并且因此本发明第一间隔区的定位以这种方式用于促进其用途。
在一个实例中，病毒(例如噬菌体)核酸包含复制起点位点(ori)和装配位点。在一个实例中，病毒的核酸也包含一种、多种或所有编码必需衣壳蛋白的基因，例如rinA、terS和terL基因。在一个实例中，一种、多种或所有这些由用于与本发明病毒共同感染的伴侣辅助病毒(例如辅助噬菌体)替换包含，这在后者中释放出空间，用于包含更多HM-阵列核酸和/或更多在宿主内可操纵的Cas编码核酸。在一个实例中，病毒核酸包含野生型噬菌体基因组的片段，其中片段由至少包含rinA、terS和terL基因的基因组的连续核苷酸或编码噬菌体蛋白的同义基因组成。
在一个实例中，宿主细胞属于人类微生物群中发现的菌株或种类。
在一个实例中，这种或每一种靶标位点由介导宿主致病性粘附、定殖、入侵、免疫反应抑制、致病、必需蛋白或功能表达或毒素产生的基因包含。在一个实例中，基因为编码细胞毒素、α-溶血素、β-溶血素、γ-溶血素、杀白细胞素、致死毒素PV杀白细胞素(Panton-Valentine lekocidin) (PVL)、外毒素、TSST-1、肠毒素、SEA、SEB、SECn、SED、SEE、SEG、SHE、SEI、表皮剥脱毒素、ETA或ETB的基因，任选地其中宿主为金黄色葡萄球菌，例如MRSA。
在一个实例中，这种或每一种CRISPR阵列为本文公开的构造、实施方案、实例、概念、方面、段落或条款中任何一项的阵列。在一个实例中，这种或每一种工程化核苷酸序列为本文公开的构造、实施方案、实例、概念、方面、段落或条款中任何一项的工程化核苷酸序列。
在一个实例中，这种或每一种载体为本文公开的构造、实施方案、实施例、概念、方面、段落或条款中任何一项的载体。
在本文公开的构造、实施方案、实例、方面、段落或条款中任何一项的一个实例中，载体或MGE为或包含casposon。MGE在下文进一步描述。在一个实例中，casposon为一个家族1、2或3 casposon。在一个实例中，本发明的MGE包含casposon末端倒置重复区和任选地包含casposon Cas1编码序列。在一个实例中，本发明的MGE为或包含缺少Cas1的casposon并且对宿主细胞的Cas1迁移是可操纵的。对于casposons的详细说明参见BMC Biol. 2014年5月19日; 12:36. doi: 10.1186/1741-7007-12-36,“Casposons：一种起源于原核CRISPR-Cas免疫性的新超家族自我合成DNA转座子(Casposons: a new superfamily of self-synthesizing DNA transposons at the origin of prokaryotic CRISPR-Casimmunity)”, Krupovic M等。
本发明的另外实例应用
在一个实例中，组成(例如与抗生素联合的HM-组成或工程化序列)为以下中的任何一种：在一个实例中，组成为医学、眼科、牙科或药用组成(例如由抗宿主疫苗包含)。在一个实例中，组成为抗微生物组成，例如抗生素或抗病毒物质，例如药物、消毒剂或漱口水。在一个实例中，组成为化妆品组成(如面部或身体化妆成分)。在一个实例中，组成为除草剂。在一个实例中，组成为杀虫剂(例如当宿主为芽孢杆菌属(例如苏云金芽孢杆菌)宿主时)。在一个实例中，组成为饮料(例如啤酒、葡萄酒或酒精饮料)添加剂。在一个实例中，组成为食品添加剂(例如其中宿主为大肠杆菌、沙门氏菌属、李斯特氏菌属或梭菌属(例如肉毒梭状芽孢杆菌)宿主)。在一个实例中，组成为水添加剂。在一个实例中，组成为用于水生动物环境(例如鱼缸中)的添加剂。在一个实例中，组成为石油或石化工业组成或者包含在这样的组成中(例如当宿主为硫酸盐还原菌，例如脱硫弧菌属宿主)。在一个实例中，组成为石油或石油化工添加剂。在一个实例中，组成为化学添加剂。在一个实例中，组成为消毒剂(例如供人类或动物使用的消毒设备，例如用于手术或医疗用途，或者用于婴儿喂养)。在一个实例中，组成为供人类或动物使用的个人卫生组合物。在一个实例中，组成为用于环境用途，例如用于土壤处理或环境净化(例如自污水，或自石油、石化产品或化学品，例如当宿主为硫酸盐还原菌，例如脱硫弧菌属宿主时)的组成。在一个实例中，组成为植物生长促进剂。在一个实例中，组成为用于石油、石化产品、金属或矿物提取的组成。在一个实例中，组成为织物处理或添加剂。在一个实例中，组成为兽皮、皮革或仿麂皮处理或添加剂。在一个实例中，组成为染料添加剂。在一个实例中，组成为饮料(例如啤酒或葡萄酒)酿造或发酵添加剂(例如当宿主为乳酸杆菌属宿主)。在一个实例中，组成为纸张添加剂。在一个实例中，组成为油墨添加剂。在一个实例中，组成为胶添加剂。在一个实例中，组成为抗人类、动物或植物寄生虫的组成。在一个实例中，组成为空气添加剂(例如用于空气调节设备中的空气或由空气调节设备产生的空气，例如其中宿主为军团菌属宿主)。在一个实例中，组成为防冻添加剂(例如其中宿主为军团菌属宿主)。在一个实例中，组成为洗眼液或眼科组成(例如隐形眼镜液)。在一个实例中，组成由乳制品包含(例如组成在或为牛奶或奶制品；例如其中宿主为乳酸杆菌属、链球菌属、乳球菌属或李斯特氏菌属宿主)。在一个实例中，组成为或由家用或工业清洁产品包含(例如其中宿主为大肠杆菌、沙门氏菌属、李斯特氏菌属或梭菌属(例如肉毒梭状芽孢杆菌)宿主)。在一个实例中，组成由燃料包含。在一个实例中，组成由溶剂(例如水除外)包含。在一个实例中，组成为烘焙添加剂(例如食品烘焙添加剂)。在一个实例中，组成为实验室试剂(例如用于生物技术或者重组DNA或RNA技术)。在一个实例中，组成由纤维沤麻剂包含。在一个实例中，组成用于维生素合成工艺。在一个实例中，组成为抗作物或植物的破坏成分(例如当宿主为腐生菌)。在一个实例中，组成为防腐化合物，例如用于防止或减少金属腐蚀(例如当宿主为硫酸盐还原菌，例如脱硫弧菌属宿主，例如用于减少或防止石油提取、处理或保存设备；金属提取、处理或保存设备；或者矿物提取、处理或保存设备的腐蚀)。在一个实例中，组成为农业或耕作组成或者包含在这样的组成中。在一个实例中，组成为青贮饲料添加剂。本发明提供一种本文描述用于在该段落中描述的任何一种组成，或者用于在该段落中描述的任何一项应用的HM-CRISPR阵列、HM-CRISPR/Cas系统、HM-crRNA、HM-间隔区、HM-DNA、HM-Cas、HM-组成或gRNAas，例如其中宿主细胞为微生物细胞或者细菌或古细菌细胞。本发明提供一种用于在该段落中描述的任何一项应用的方法，其中方法包括联合HM-CRISPR阵列、HM-CRISPR/Cas系统、HM-crRNA、HM-间隔区、HM-DNA、HM-Cas、gRNA或HM-组成与宿主细胞(例如微生物、细菌或古细菌细胞)。在一个实施方案中，宿主细胞不存在于人类(或人类胚胎)或动物体内或上面。
本发明的任何一个方面用于工业或家庭用途，或者用于这样用途的方法。例如，其用于农业、石油或石化工业、食品或饮料行业、服装行业、包装行业、电子行业、计算机行业、环境行业、化学工业、航空航天工业、汽车行业、生物技术行业、医疗行业、健康行业、牙科产业、能源产业、消费品产业、医药工业、采矿业、清洗业、林业、渔业、休闲业、回收业、化妆品业、塑胶工业、纸浆或造纸工业、纺织业、服装行业、皮革或仿麂皮或兽皮行业、烟草行业或钢铁行业。
在本文，其中有提及脱硫弧菌属宿主，宿主能够被脱硫叶菌属、脱硫杆菌属、脱硫杆菌属、脱硫球菌属、脱硫念珠菌属、脱硫丝菌属、Desulfobotulus或脱硫八叠球菌属宿主或本文公开的任何其它硫还原菌替代。在一个用于油、水、污水或环境应用的实施方案中，宿主为脱硫弧菌属capillatus宿主。
广泛的微生物分析和16S rRNA序列测定表明，种属脱硫弧菌属只是约8组可自环境分离的不同硫酸盐还原菌之一。其中7组为革兰氏阴性菌，而1组代表革兰氏阳性菌(脱硫肠状菌属)。种属脱硫弧菌属具有一个相当小的基因组。对普通脱硫弧菌和巨大脱硫弧菌(其可能是本发明的宿主)的基因组的初步估计分别为1.7 Mbp和1.6 Mbp。这有助于鉴别用于本发明的期望的靶标序列(例如在必需或抗性基因中的序列)。脱硫脱硫弧菌(其可能为本发明的宿主)内源质粒G200的表征使得构建穿梭载体(Wall 1993，其载体可用作本发明的载体)，并且来自普通脱硫弧菌Hildenborough (其可能为本发明的宿主)的两种细菌噬菌体的分离与表征(Seyedirashti，1992)可提供有效遗传操控脱硫弧菌属种类的其它途径。在一个实例中，载体为mu或mu样细菌噬菌体。
一种实例宿主为普通脱硫弧菌亚种vulgaris Postgate和Campbell (ATCC®29579™)菌株名称：NCIB 8303 [DSM 644，Hildenborough]。
用丝裂霉素C或紫外线处理细菌先前已用于自细菌诱导噬菌体(Driggers &Schmidt)，并且这是一种用于获得合适的宿主-匹配噬菌体，产生用于本发明的任何实例或方面的载体的合适方法。
本发明应用于乳品工业(例如奶酪或黄油或奶制品制造)或发酵(例如葡萄酒或醋或酱油)或啤酒酿造或面包制作行业。例如对于乳品工业应用，本发明的方法为一种用于生产乳制品的方法，方法包括使乳酸产生菌(例如乳酸杆菌属宿主细胞)的培养基发酵一段时间，以自培养基产生乳酸，并且之后通过自与细菌混合的一种或多种本发明阵列、系统、载体、种群或采集液(collections)引起crRNA表达来抑制细菌生长，借以减少或抑制细菌产生乳酸。这可用于减少食物/饮料破坏或者不合需要的食物/饮料味道和/或气味。在一个实例中，在细菌中包含诱导性HM-阵列，其中方法包括在第一时间段之后加入诱导剂。
参考文献
Wall, J.D., B.J. Rapp-Giles, and M. Rousset. 1993.“来自脱硫脱硫弧菌的小质粒的表征及其用于穿梭载体构建的用途(Characterization of a small plasmid fromDesulfovibrio desulfuricans and its use for shuttle vector construction)”. J.Bacteriol. 175:4121-4128;
Seyedirashti S et al; J Gen Microbiol. 1992 Jul; 138(7):1393-7,“自普通脱硫弧菌NCIMB 8303 (Hildenborough)分离的两种细菌噬菌体的分子表征(Molecularcharacterization of two bacteriophages isolated from Desulfovibrio vulgarisNCIMB 8303 (Hildenborough)”;
Driggers & Schmidt, J. gen. Virol. (I97O), 6, 421-427,“在茎菌属诱导有缺陷和温和的细菌噬菌体(Induction of Defective and Temperate Bacteriophages inCaulobacter)”.
概念：
改变细菌混合种群中(例如在微生物群中)第一和第二细菌亚群的相对比例
1. 用于改变细菌混合种群中第一和第二细菌亚群的相对比例的宿主修饰(HM)CRISPR/Cas系统的用途，第二细菌包含宿主细胞，对于每一种宿主细胞，系统包含以下(i)-(iv)的组分：
(i) 至少一种编码Cas核酸酶的核酸序列；
(ii) 一种宿主细胞靶标序列和包含间隔序列(HM-间隔区)与编码HM-crRNA的重复区的工程化宿主修饰(HM) CRISPR阵列，HM-crRNA包含杂交于宿主细胞靶标序列，以把所述Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列的序列；
(iii) 一种任选的tracrRNA序列或表达tracrRNA序列的DNA序列；
(iv) 其中所述系统组分在宿主细胞与至少一种转化宿主细胞的核酸载体之间分割(split)，HM-crRNA借以把Cas引导至靶标以修饰宿主细胞内的宿主CRISPR/Cas系统；和
其中靶标序列被Cas修饰，借以杀伤宿主细胞或减少宿主细胞生长。
2. 一种用于修饰细菌宿主细胞的靶核苷酸序列的用于概念1的宿主修饰(HM)CRISPR/Cas系统，系统包含以下(i)-(iv)的组分：
(i) 至少一种编码Cas核酸酶的核酸序列；
(ii) 一种宿主细胞靶标序列和包含间隔序列(HM-间隔区)与编码HM-crRNA的重复区的工程化宿主修饰(HM) CRISPR阵列，HM-crRNA包含能够杂交于宿主靶标序列，以把所述Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列的序列；
(iii) 一种任选的tracrRNA序列或用于表达tracrRNA序列的DNA序列；
(iv) 其中所述系统组分在宿主细胞与至少一种可转化宿主细胞的核酸载体之间分割(split)，HM-crRNA借以把Cas引导至靶标以修饰宿主细胞内的宿主CRISPR/Cas系统。
3. 概念2的系统，其中载体或多种载体缺乏Cas (例如Cas9)核酸酶编码序列。
4. 任何一个前述概念的用途或系统，其中每一种宿主细胞属于人类微生物群中发现的菌株或种类。
5. 用于以下的概念1或4用途：(a) 改变拟杆菌门细菌在混合细菌种群中的比例；(b) 减少厚壁菌门亚群(宿主细胞)在混合细菌种群中的比例；(c) 减少第一厚壁菌门种类(宿主细胞)在混合种群中的比例，其中混合种群包含其生长不受所述cRNA抑制的第二厚壁菌门种类；(d) 减少第一革兰氏阳性细菌种类(宿主细胞)在混合细菌种群中的比例，其中混合种群包含其生长不受所述cRNA抑制的第二革兰氏阳性细菌种类；(e) 减少细菌种类(宿主细胞)在混合细菌种群中的比例，其中混合种群包含其生长不受所述cRNA抑制的不同细菌种类，其中第一种类具有16s核糖体RNA编码DNA序列，其与其它种类的16s核糖体RNA编码DNA序列具有至少80、82、83、84、85、90或95%同一性；(f) 减少第一细菌人类肠道微生物群种类(宿主细胞，例如厚壁菌门)在混合细菌种群中的比例，其中混合种群包含不同的细菌种类，其中这种不同种类为其生长不受所述cRNA抑制的人类肠道益生菌种类；或(g) 减少细菌人类肠道微生物群种类(宿主细胞，例如厚壁菌门)在混合细菌种群中的比例，其中混合种群包含不同的细菌种类，其中这种不同种类为其生长不受所述cRNA抑制的人类肠道共栖种类。
6. 用于以下的概念2或3系统：(a) 改变拟杆菌门细菌在混合细菌种群中的比例；(b) 减少厚壁菌门亚群(宿主细胞)在混合细菌种群中的比例；(c) 减少第一厚壁菌门种类(宿主细胞)在混合种群中的比例，其中混合种群包含其生长不受所述cRNA抑制的第二厚壁菌门种类；(d) 减少第一革兰氏阳性细菌种类(宿主细胞)在混合细菌种群中的比例，其中混合种群包含其生长不受所述cRNA抑制的第二革兰氏阳性细菌种类；(e) 减少细菌种类(宿主细胞)在混合细菌种群中的比例，其中混合种群包含其生长不受所述cRNA抑制的不同细菌种类，其中第一种类具有16s核糖体RNA编码DNA序列，其与其它种类的16s核糖体RNA编码DNA序列具有至少80、82、83、84、85、90或95%同一性；(f) 减少第一细菌人类肠道微生物群种类(宿主细胞，例如厚壁菌门)在混合细菌种群中的比例，其中混合种群包含不同的细菌种类，其中这种不同种类为其生长不受所述cRNA抑制的人类肠道益生菌种类；或(g) 减少细菌人类肠道微生物群种类(宿主细胞，例如厚壁菌门)在混合细菌种群中的比例，其中混合种群包含不同的细菌种类，其中这种不同种类为其生长不受所述cRNA抑制的人类肠道共栖种类；其中(a)-(g)用于在人或动物受试者治疗或预防(i) 由其比例被减少的所述细菌种类引起的微生物群感染；或(ii) 由其比例被减少的所述细菌种类介导的疾病或病症。
7. 用于增加拟杆菌门相对于厚壁菌门的相对比例的概念5或6的用途或系统。
8. 任何一个前述概念的用途或系统，其中所述Cas核酸酶由细胞的内源性II型CRISPR/Cas系统提供。
9. 任何一个前述概念的用途或系统，其中组分(i)对宿主细胞为内源性的。
10. 任何一个前述概念的用途或系统，其中靶标序列由宿主细胞的抗生素抗性基因、致病基因或必需基因包含。
11. 任何一个前述概念的用途或系统，其中靶标序列为宿主染色体序列。
12. 任何一个前述概念的用途或系统，其中可选择地，HM-crRNA和tracrRNA由例如由载体提供的单链引导RNA (gRNA)包含。
13. 任何一个前述概念的用途或系统，其中宿主细胞包含具有编码感兴趣的HM-序列的游离端(HM-DNA)的脱氧核糖核酸链和/或其中系统包含编码HM-DNA的序列，其中HM-DNA包含分别与用于把HM-DNA插入到宿主基因组(例如插入到染色体或游离基因位点)的靶标序列中或其侧翼的一个或多个序列同源的一个或多个序列。
14. 一种用于概念1的用途，用于修饰包含内源性CRISPR/Cas系统的细菌宿主细胞的工程化核酸载体，载体
(a) 包含用于表达用于任何一个前述概念的CRISPR/Cas系统或用途的多种不同crRNAs (例如由gRNAs包含)的核酸序列；和
(b) 任选地缺乏编码Cas核酸酶的核酸序列，
其中第一所述crRNAs能够杂交于所述宿主细胞内的第一核酸序列；和第二所述crRNAs能够杂交于所述宿主细胞内的第二核酸序列，其中所述第二序列不同于所述第一序列；和
(c) 第一序列由抗生素抗性基因(或其RNA)包含和第二序列由抗生素抗性基因(或其RNA)包含；任选地其中这些基因是不同的；
(d) 第一序列由抗生素抗性基因(或其RNA)包含和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含；
(e) 第一序列由必需基因(或其RNA)包含和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含；或者
(f) 第一序列由致病基因(或其RNA)包含和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含。
15. 包含一种或多种Cas的宿主细胞内的概念14的载体，所述Cas对载体编码的cRNA (例如单链引导RNA)为可操纵的。
16. 任何一个前述概念的用途、系统或载体，其中HM-CRISPR阵列包含相同间隔区的多个拷贝。
17. 任何一个前述概念的用途、系统或载体，其中载体包含多种HM-CRISPR阵列。
18. 任何一个前述概念的用途、系统或载体，其中每一种载体为病毒或噬菌体。
19. 任何一个前述概念的用途、系统或载体，其中系统或载体包含编码crRNAs(例如gRNAs)的核酸序列的2、3或多个拷贝，其中拷贝包含用于靶向宿主细胞序列(例如致病、抗性或必需基因序列)的相同间隔序列。
20. 概念20的用途、系统或载体，其中拷贝在两个或更多个载体CRISPR阵列之间分割(split)。
21. 一种包含在任何一个前述概念中列举的系统或载体的细菌宿主细胞。
22. 任何一个前述概念的用途、系统、载体或细胞，其中阵列与抗生素联合；或者用途包括使宿主细胞暴露于第一抗生素，其中靶标序列由对所述第一抗生素抗性的抗生素抗性基因包含。
23. 任何一个前述概念的用途、系统、载体或细胞，其中宿主细胞为葡萄球菌属、链球菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、李斯特氏菌属、大肠杆菌属、脱硫弧菌属或梭菌属宿主细胞。
24. 概念1-13或16-23中任何一个的用途、系统或细胞，其中每一种载体依据概念14或15。
25. 任何一个前述概念的用途、系统、载体或细胞，其中与未用所述HM-阵列或编码所述gRNA的核苷酸序列转化的所述宿主细胞种群的生长相比较，宿主细胞种群的生长减少至少5倍。
26. 任何一个前述概念的用途、系统、载体或细胞，其中表面宿主细胞种群的生长受到抑制。在一个实施例中，种群与人类组织表面(例如肠道组织表面，例如体内或活体外)接触。
26. 任何一个前述概念的用途、系统、载体或细胞，其中其第一细菌为益生的、与人类共栖或共生的(例如在人类肠道)。
28. 任何一个前述概念的用途、系统、载体或细胞，其中第一和第二细菌两者为厚壁菌门，并且为不同种类或菌株的细菌；或者其中第一细菌为肠杆菌科和第二细菌为厚壁菌门。
29. 任何一个前述概念的用途、系统、载体或细胞，其中宿主细胞为古细菌细胞而不是细菌细胞，或者每一种种群为古细菌种群而不是细菌种群。
30. 概念1、4、5、7-13、16-20和22-29中的任何一个用于处理工业或活体外医用流体、表面、装置或容器，或者用于处理水道、水、饮料、食品或化妆品的用途，其中宿主细胞由流体、表面、装置、容器、水道、水、饮料、食品或化妆品包含或在其上。
31. 任何一个前述概念的用途、系统、载体或细胞，其中HM-cRNA或gRNA包含能够杂交于宿主细胞靶前间区序列的序列(其为邻近的NNAGAAW或NGGNG前间区序列邻近基序(PAM))。
32. 一种任何一个前述概念的，或用于任何一个前述概念的，或者任何一个前述概念的用途、系统或细胞的核酸载体，载体包含多于1.4kb的外源性DNA序列，其中外源性DNA编码CRISPR/Cas系统的一个或多个组分，并且包含用于在宿主细胞表达HM-crRNAs 或gRNAs的工程化阵列，其中外源序列没有编码Cas核酸酶，与cRNA(s)或gRNA(s)同源的核苷酸序列；其中至少2种不同的cRNAs或gRNAs由外源性DNA (例如由至少2种HM-CRISPR阵列)编码。
33. 前述32的载体，其中载体为能够转化宿主细胞的病毒载体。
34. 前述32或33的载体，其中cRNAs或gRNAs能够在宿主细胞内杂交于相应的靶前间区序列，其中每一种前间区序列由抗生素抗性或必需宿主基因包含。
35. 概念34-36中任何一个的载体，其中宿主细胞为人类微生物群种类的细胞。
实施方案：
利用野生型内源性CAS抑制种群生长及处理表面细菌
1. 细菌宿主细胞种群的野生型内源性Cas核酸酶活性抑制种群生长的用途，其中种群包含多种宿主细胞并且每一种宿主细胞包含具有野生型Cas核酸酶活性的内源性CRISPR/Cas系统，用途包括转化种群的宿主细胞，其中每一种转化的宿主细胞用工程化核苷酸序列转化，用于提供宿主细胞内的宿主修饰(HM) cRNA或引导RNA (gRNA)，HM-cRNA或gRNA包含能够杂交于宿主细胞靶前间区序列，用于把内源性Cas引导至靶标的序列，其中cRNA或gRNA与具有所述野生型核酸酶活性的宿主细胞的内源性Cas核酸酶同源，并且之后种群的宿主细胞生长的所述转化被抑制。
宿主细胞可属于相同的种类或菌株。
2. 实施方案1的用途，其中与未用所述工程化核苷酸序列转化的所述宿主细胞的种群生长相比较，宿主细胞种群生长的抑制作用为生长减少至少5倍。
3. 实施方案1的用途，其中表面的种群生长被抑制。
4. 实施方案2的用途，其中表面的种群生长被抑制。
5. 实施方案1的用途，所述抑制包括使用HM-CRISPR/Cas系统用于杀伤或减少所述宿主细胞的生长，对于每一种宿主细胞，系统包含以下(i)-(iv)的组分：
(i) 至少一种编码所述Cas核酸酶的核酸序列；
(ii) 一种包含间隔序列(HM-间隔区)与编码所述HM-crRNA的重复区的工程化宿主修饰(HM) CRISPR阵列；
(iii) 一种任选的tracrRNA序列或表达tracrRNA序列的DNA序列；
(iv) 其中所述系统组分在宿主细胞与至少一种转化宿主细胞的核酸载体之间分割(split)，HM-crRNA借以把所述Cas引导至靶标以修饰靶标序列；
其中靶标序列在宿主细胞内被Cas修饰，借以杀伤宿主细胞或减少宿主细胞生长。
6. 任何一个前述实施方案用于改变细菌混合种群中第一和第二细菌亚群的相对比例的用途，第二细菌包含所述宿主细胞。
7. 实施方案6的用途，其中宿主细胞属于人类微生物群中发现的菌株或种类。
8. 实施方案6或7的用途，其中宿主细胞与不同菌株或种类的细胞混合，其中不同细胞为肠杆菌科或者益生的、与人类共栖或共生的细菌(例如在人类肠道)。
9. 任何一个前述实施方案用于改变包含拟杆菌门细菌和其它细菌的混合细菌种群中拟杆菌门细菌的比例的用途，任选地用于增加种群中拟杆菌门相对于一种、多种或所有厚壁菌门种类(例如相对于链球菌属)的相对比例。
10. 任何一个前述实施方案用于改变混合种群中第一细菌相对于第二细菌的相对比例的用途，其中第一和第二细菌两者为厚壁菌门，并且为不同种类或菌株的细菌，第二细菌包含宿主细胞。在一个实例中，用途增加第一相对于第二细菌的比例。
11. 实施方案1的用途，其中工程化核苷酸序列不与外源性Cas核酸酶编码序列联合。
12. 实施方案5的用途，其中载体或多种载体缺乏Cas核酸酶编码序列。
13. 实施方案1的用途，其中每一种宿主细胞属于在人类微生物群中发现的菌株或种类。
14. 实施方案6的用途，其中每一种宿主细胞属于在人类微生物群中发现的菌株或种类。
15. 实施方案13的用途，其中每一种宿主细胞与不同菌株或种类的细胞混合，其中不同细胞为肠杆菌科或者益生的、与人类共栖或共生的细菌(例如在人类肠道)。
16. 实施方案1的用途，其中用途改变拟杆菌门细菌在包含拟杆菌门细菌和其它细菌的混合细菌种群中的比例，任选地其中用途改变拟杆菌门相对于一种、两种或所有厚壁菌门(例如链球菌属)种类在种群中的相对比例。
17. 实施方案1的用途，其中第一和第二细菌两者为厚壁菌门和用途改变第一相对于第二细菌在混合种群中的相对比例。在一个实例中，用途增加第一相对于第二细菌的比例。
18. 实施方案1的用途，其中所述Cas核酸酶由宿主细胞内源性II型CRISPR/Cas系统提供和/或HM-cRNA或gRNA包含能够杂交于邻近5’-NNAGAAW-3’前间区序列邻近基序(PAM)的宿主细胞靶前间区序列的序列。
19. 实施方案5的用途，其中所述Cas核酸酶由宿主细胞内源性II型CRISPR/Cas系统提供。
20. 实施方案5的用途，其中组分(iii)对宿主细胞为内源性的。
21. 实施方案5的用途，其中每一种转化的宿主细胞包含对组分(ii)在细胞内产生所述HM-crRNA为可操纵的内源性RNase III。
22. 实施方案1的用途，其中靶标序列由宿主细胞的抗生素抗性基因、致病基因或必需基因包含。
23. 实施方案1的用途，其中工程化核苷酸序列与抗生素联合。
24. 实施方案5的用途，其中HM-crRNA和tracrRNA由单链引导RNA (gRNA)包含。
25. 实施方案1的用途，其中转化的宿主细胞每一个包含具有编码感兴趣的HM-序列的游离端(HM-DNA)的脱氧核糖核酸链，其中HM-DNA包含分别与用于把HM-DNA插入到宿主基因组的靶标序列中或其侧翼的一个或多个序列同源的一个或多个序列，其中HM-DNA序列被插入到宿主细胞基因组中。
26. 实施方案1的用途，包括在宿主细胞内表达多种不同的crRNAs (或gRNAs)用于杂交于宿主细胞前间区靶标序列，其中第一所述crRNAs (或gRNAs)能够杂交于第一前间区核酸序列；和第二所述crRNAs (或gRNAs)能够杂交于第二前间区核酸序列，其中所述第二序列不同于所述第一序列；和
(a) 第一序列由抗生素抗性基因(或其RNA)包含和第二序列由抗生素抗性基因(或其RNA)包含；任选地其中这些基因为不同的；
(b) 第一序列由抗生素抗性基因(或其RNA)包含和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含；
(c) 第一序列由必需基因(或其RNA)包含和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含；或者
(d) 第一序列由致病基因(或其RNA)包含和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含。
27. 实施方案6的用途，其中宿主细胞由人或动物受试者包含的混合细菌种群包含，和用途(i) 在受试者治疗由混合种群包含的所述宿主细胞引起的感染；(ii) 在受试者治疗或减少由所述宿主细胞介导的病症或疾病的风险；(iii) 减少由所述宿主细胞引起或介导的人的体味；或者(iv) 为人类的个人卫生处理。
28. 实施方案1的用途，其中用途在人或动物受试者治疗或减少所述宿主细胞感染的风险，其中宿主细胞每一种包含其含有所述靶前间区序列的抗生素抗性基因(对第一抗生素具有抗性)，其中用途包括给予受试者工程化核苷酸序列和第一抗生素，其中在受试者减少或预防感染。
29. 实施方案1的用途，其中每一种工程化核苷酸序列进一步包含抗生素抗性基因，其中HM-crRNA或gRNA不靶向抗生素抗性基因和用途包括使种群暴露于所述抗生素和多种所述工程化序列，从而促进在宿主细胞内保持HM-crRNA或gRNA编码序列。
30. 实施方案1的用途，其中宿主细胞为革兰氏阳性菌细胞或链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、李斯特氏菌属、大肠杆菌属、脱硫弧菌属、霍乱弧菌或梭菌属细胞。
31. 实施方案1用于处理工业或医用流体、表面、装置或容器，或者用于处理水道、水、饮料、食品或化妆品的用途，其中宿主细胞由流体、表面、装置、容器、水道、水、饮料、食品或化妆品包含或在其上，和其中宿主细胞种群的生长被抑制，从而实施所述处理。
在一个备选方案中，任何实施方案依赖于任何一个前述实施方案。
方面：
在载体和混合种群中的宿主细胞之间水平转移
1. 一种用于产生包含载体细菌的混合细菌种群的方法，其中种群分别包含第一和第二细菌的第一和第二亚群，其中亚群为彼此不同并且第二细菌包含多种宿主细胞的第一和第二种类的细菌，其中载体细菌为第一细菌细胞，每一个包含工程化核苷酸序列，用于提供宿主细胞内的宿主细胞修饰(HM) cRNA或引导RNA(gRNA)，HM-cRNA或gRNA包含能够杂交于宿主细胞靶前间区序列，用于把第一Cas核酸酶引导至靶标以修饰靶标的序列，其中载体细菌不包含靶标序列，方法包括：
a. 提供多种核酸，每一种包含所述工程化核苷酸序列；
b. 使所述多种核酸与分别包含第一和第二细菌种类的第一和第二亚群的第一混合种群联合，第二亚群包含宿主细胞；
c. 在宿主细胞存在下使核酸转化所述第一亚群的细胞，从而产生包含所述载体细胞和所述宿主细胞的第二混合种群，其中由载体细胞包含的所述工程化核苷酸序列能够水平移动至宿主细胞，以转化宿主细胞用于在转化的宿主细胞内产生所述HM-cRNA或gRNA。
2. 方面1的方法，进一步包括得到第二混合种群。
3. 方面1的方法，进一步包括自第二混合种群分离多种载体细胞。
4. 方面1的方法，进一步包括在转化的宿主细胞内产生所述HM-cRNA或gRNA，其中所述HM-cRNA或gRNA序列杂交于所述转化的宿主细胞内的靶前间区序列，并把第一Cas核酸酶引导至靶标，从而用第一Cas核酸酶修饰靶标。
5. 方面4的方法，进一步包括得到包含所述靶标修饰的宿主细胞(例如其中宿主细胞由包含所述第一细菌种类的混合种群包含)。
6. 方面1的方法，其中cRNA或gRNA与宿主细胞的内源性Cas核酸酶同源，其中核酸酶为所述第一Cas核酸酶。
7. 方面1的方法，其中cRNA或gRNA与载体细胞的内源性Cas核酸酶同源，其中核酸酶为所述第一Cas核酸酶。
8. 方面7的方法，其中核酸酶具有野生型核酸酶活性。
9. 方面1、6、7或8的方法，其中第一Cas核酸酶为Cas9。
10. 方面9的方法，其中Cas9为链球菌属Cas9。
11. 方面1的方法，其中每一种工程化核苷酸序列由相应的核酸载体包含，其中载体能够在载体和宿主细胞之间水平转移。
12. 方面1或11的方法，其中每一种工程化序列由相应的可动遗传元件例如转座子或质粒包含。
13. 方面1的方法，其中在宿主细胞的所述转化后，宿主细胞亚群的生长被抑制。
14. 方面13的方法，其中与未用所述工程化核苷酸序列转化的所述宿主细胞的种群生长相比较，宿主细胞种群生长的抑制作用为至少5倍。
15. 方面13或14的方法，其中表面宿主细胞种群生长被抑制。
在一个备选方案中，任何方面依赖于任何一个前述方面。
在一个实例中，方法为在人、动物或植物受试者治疗或预防疾病或病症的方法，例如如本文描述的那样，其中方法影响所述治疗或预防。本发明提供通过用于这样的治疗或预防方法的方法得到或可得到的混合细菌种群。
在一个实例中，方法在环境、设备、装置、容器、水道、水、流体、食品、饮料、微生物群、微生物组或化妆品的混合细菌种群实施，例如如本文描述的那样，其中与第一细胞相比较方法减少宿主细胞的比例。
在一个实例中，方法的产物用于给予人或非人动物的肠道，用于治疗或预防人或动物的肥胖症、糖尿病或炎症性肠病(IBD)。
在一个实例中，第一和第二种类为人或非人动物肠道共栖或共生细菌的种类。
当其可被给予(例如鼻内)人或动物以至细菌栖居人或动物的一种或多种微生物组(例如肠道微生物组)时，方法的产物是有用的。第一细胞起载体作用，尤其是当这些细胞对人或动物为非致病性的(例如在肠道微生物组中是非致病性的)。微生物组可为本文公开的任何其它微生物组或微生物种群。
在一个实例中，第一第二细菌种类能够栖居人或非人动物的肠道微生物群，并且第一细菌与人或动物共栖或共生。有用的是，第一细菌能够安全给予人或动物，并且能起载体作用，用于之后将工程化序列转移至微生物群的宿主细胞。
在一个实例中，工程化序列由本文公开的任何阵列或载体包含。在一个实例中，方法使用本文公开的任何CRISPR/Cas系统。
在一个实例中，第一细胞为拟杆菌门(例如拟杆菌目或拟杆菌属)细胞、乳酸杆菌属(例如嗜酸菌(例如La-5、La-14或NCFM)、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、高加索乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳酸链球菌、罗伊氏乳杆菌或干酪乳杆菌如代田菌)、双歧杆菌属种类(例如两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌或婴儿双岐杆菌)、嗜热链球菌、屎肠球菌、另枝菌属、产碱杆菌属、副拟杆菌属、坦纳菌属、大肠杆菌属或木聚糖茵属细胞。
在一个实例中，宿主细胞属于人类微生物群种类和载体细胞属于在所述人类微生物群中为非致病性的种类的细胞，其中靶标序列不由载体细胞的基因组包含，工程化序列由包含其在载体和宿主细胞中为可操纵的oriT的MGE包含，其中MGE能够从载体细胞水平转移至宿主细胞。在一个实例中，工程化序列、MGE或载体由细菌噬菌体包含，细菌噬菌体能够感染第一细胞(载体)，以引导MGE进入第一(载体)细胞。之后MGE能够水平转移至宿主细胞。
在一个实例中，第一细胞为拟杆菌门或普雷沃菌属细胞；任选地其中MGE能够从所述人类微生物群的第一细胞种类水平转移至厚壁菌门种类(宿主细胞)。当靶标序列被厚壁菌门但不是第一(载体)细胞包含时，厚壁菌门种类例如用于在人中治疗或预防肥胖症。
其它实施例
实施例1：环境处理或去污
石油、金属和矿业行业
在一个实施方案中，宿主细胞处于矿山或矿区、金属矿山或矿区、油田或石油或石化产品(例如当宿主为厌氧的硫酸盐还原菌，例如脱硫弧菌属细菌时用于这些中的任何一种)。在一个实施例中，组合物包含氧化剂(例如次氯酸钠)、季铵化合物或异噻唑啉酮或者与次氯酸钠、季铵化合物和异噻唑啉酮同时或依序给予。用于本发明修饰脱硫弧菌属细菌宿主的合适载体的一个实例为细菌噬菌体。以下参考文献描述用于分离感染脱硫弧菌属的噬菌体的合适方法。作为本发明的载体，可以使用任何参考文献描述的细菌噬菌体。或者，载体由纳米粒子提供。
Heidelberg等描述几乎相同的μ样细菌噬菌体DVUO189-221、DVU2847-79、DVU2688-733的两个拷贝，并且细菌噬菌体的剩余部分存在于普通脱硫弧菌Hildenborough的基因组中。这样的噬菌体可为设计用于本发明的噬菌体载体的基础。
参考文献：
Seyedirashti S等, J Gen Microbiol. 1991年7月; 137(7):1545-9,“来自普通脱硫弧菌(希尔登伯勒(Hildenborough))和脱硫脱硫弧菌ATCC 13541的细菌噬菌体的诱导和部分纯化 (Induction and partial purification of bacteriophages fromDesulfovibrio vulgaris (Hildenborough) and Desulfovibrio desulfuricans ATCC13541)”;
Seyedirashti S等, J Gen Microbiol. 1992年7月; 138(7):1393-7,“分离自普通脱硫弧菌NCIMB 8303(希尔登伯勒(Hildenborough))的两种细菌噬菌体的分子表征(Molecular characterization of two bacteriophages isolated from Desulfovibriovulgaris NCIMB 8303 (Hildenborough))”;
*Walker CB等; Environ Microbiol. 2006年11月; 8(11):1950-9,“温和普通脱硫弧菌细菌噬菌体采用新宿主菌株的恢复(Recovery of temperate Desulfovibrio vulgarisbacteriophage using a novel host strain)”;
Miranda等, Corrosion Science 48 (2006) 2417-2431,“通过分离自墨西哥油田分离器的氢自养硫酸盐还原菌脱硫弧菌属capillatus的碳钢合金的生物腐蚀(Biocorrosion of carbon steel alloys by an hydrogenotrophic sulfate-reducingbacterium Desulfovibrio capillatus isolated from a Mexican oil fieldseparator)”;
Eydal等, The ISME Journal (2009) 3, 1139-1147; doi:10.1038/ismej.2009.66;2009年6月11日在线发表,“对从深层地下水分离的脱硫弧菌属aespoeensis的噬菌体裂解(Bacteriophage lytic to Desulfovibrio aespoeensis isolated from deepgroundwater)”;
Walker CB等; Environ Microbiol. 2009年9月; 11(9):2244-52. doi: 10.1111/j.1462-2920.2009.01946.x,“可动遗传元件对普通脱硫弧菌基因组可塑性的贡献(Contribution of mobile genetic elements to Desulfovibrio vulgaris genomeplasticity)”.
*[在该文章中描述的序列已在GenBank登录号DQ826728-DQ826732下存放，通过参照结合到本文中]
实施例2：水或污水处理或环境(例如土壤)金属去污
本发明的一个备选应用提供如本文描述用于水或污水处理，例如其中宿主为硫酸盐还原菌，例如脱硫弧菌属细菌的HM-CRISPR阵列、HM-CRISPR/Cas系统、HM-crRNA、HM-间隔区、HM-DNA、HM-Cas或HM-组分(composition)。
在一个实施例中，宿主中的靶核苷酸序列为重金属抗性基因的序列。任选地宿主也为脱硫弧菌属细菌，例如普通脱硫弧菌。
实施例3：医学用途
本发明的一个备选应用提供如本文描述用于在人或动物治疗、预防或减少细菌感染(例如减少细菌的扩散或扩张)的HM-CRISPR阵列、HM-CRISPR/Cas系统、HM-crRNA、HM-间隔区、HM-DNA、HM-Cas或HM-组分(composition)。
在第一实施例中，感染由人体内MRSA宿主细胞引起。宿主细胞为金黄色葡萄球菌宿主细胞和本发明的HM-阵列包含在I、II或III类葡萄球菌属包装噬菌体(有尾噬菌体目或肌尾噬菌体科噬菌体)的种群中。噬菌体种群与或不与甲氧西林或万古霉素一起给予MRSA感染的患者。在一项试验中，噬菌体HM-阵列靶向(i) 在内源性金黄色葡萄球菌CRISPR阵列的前导启动子3’的20个核苷酸的区域和(ii) 宿主细胞中的甲氧西林抗性基因。当给予万古霉素时，给予患者比平时更低的剂量。预计宿主细胞感染将被击倒，并且不建立或以比通常更低的速度或严重性建立对噬菌体药物的抗性。在其它试验中，设计是相同的，除了在那些试验中噬菌体也靶向必需的金黄色葡萄球菌基因ftsZ (Liang等, Int J Infect Dis.2015年1月; 30:1-6. doi: 10.1016/j.ijid.2014.09.015. 2014年11月5日电子出版,“用靶向ftsZ基因的反义肽核酸轭合物体外抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长(Inhibiting the growth of methicillin-resistant Staphylococcus aureus invitro with antisense peptide nucleic acid conjugates targeting the ftsZgene)”)。
另外的试验重复以上试验，但另外或替代甲氧西林给予噬菌体K细胞内溶素。
参考文献
1. Jiang W et al, Nucleic Acids Res. 2013年11月; 41(20):e188. doi:10.1093/nar/gkt780. 2013年9月2日电子出版,“在拟南芥属、烟草、高粱和稻米证实CRISPR/Cas9/sgRNA介导的靶向基因修饰 (Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum andrice)”;
2. Seed KD et al, Nature. 2013年2月28日; 494(7438):489-91. doi: 10.1038/nature11927,“细菌噬菌体编码其自身的CRISPR/Cas适应性反应以逃避宿主的先天免疫(Abacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade hostinnate immunity)”;
3. Semenova E et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2011年6月21日; 108(25):10098-103. doi: 10.1073/pnas.1104144108. 2011年6月6日电子出版,“干扰成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR) RNA是由种子序列控制(Interference by clusteredregularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by aseed sequence)”;
4. Heler R et al, Mol Microbiol. 2014年7月; 93(1):1-9. doi: 10.1111/mmi.12640. 2014年6月4日电子出版,“适应新的威胁：通过CRISPR-Cas免疫系统产生记忆(Adapting to new threats: the generation of memory by CRISPR-Cas immunesystems)”;
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6. Fineran PC et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2014年4月22日; 111(16):E1629-38. doi: 10.1073/pnas.1400071111. 2014年4月7日电子出版,“退化的靶标位点介导快速引物CRISPR适应性(Degenerate target sites mediate rapid primed CRISPRadaptation)”;
7. Wiedenheft et al, Nature. 2011年9月21日;477(7365):486-9. doi: 10.1038/nature10402,“RNA引导的细菌免疫系统监视复合物的结构(Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system)”;
8. Bondy-Denomy et al, Nature 493, 429-432 (2013年1月17日) doi:10.1038/nature11723,“使CRISPR/Cas细菌免疫系统失活的细菌噬菌体基因(Bacteriophage genesthat inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system)”;
9. Nuñez JK et al, Nature. 2015年3月12日; 519(7542):193-8. doi: 10.1038/nature14237. 2015年2月18日电子出版,“在CRISPR-Cas适应性免疫期间整合酶介导的间隔区采集(Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptiveimmunity)”.
实施例4：改变混合肠道微生物群种群中细菌的比例
按照本实施例实施改变细菌的比例，其通过参照敲落混合肠道微生物群样品中难辨梭状芽孢杆菌细菌进行描述。样品应含有拟杆菌属和甲硝哒唑(MTZ)抗性难辨梭状芽孢杆菌菌株630亚群。活体外混合的种群与已按本发明工程化含有CRISPR阵列的载体细菌种群(嗜酸乳杆菌La-14和/或La-5)联合。
每一种CRISPR阵列包含在与载体细菌和难辨梭状芽孢杆菌细胞相容的质粒上。阵列由多形拟杆菌CTnDot转座子包含，其也包含oriT、intDOT序列、tetQ-rteA-rteB操纵子、rteC和操纵子xis2c-xis2d-orf3-exc。在一项实验中，mob和tra操纵子不包含在内(相反依赖于由转座子在与载体细菌联合的混合物中向其转移的拟杆菌属细胞提供的这些操纵子)。在另一项实验中，mob和tra操纵子包含在转座子中。
蛋白质在细胞质膜上转位在所有细菌中是一个必需的过程。在其核心包含ATP酶、SecA和膜通道SecYEG 的Sec系统负责大多数这种蛋白质转运。第二种平行Sec系统已在许多革兰氏阳性菌种类得到描述。这种辅助Sec系统特征在于存在激活ATP酶SecA2的第二拷贝；其中其已被研究，SecA2负责Sec底物子集的转位。与许多致病性革兰氏阳性菌种类一样，难辨梭状芽孢杆菌具有SecA2的两个拷贝。S-层蛋白(SLPs)和另一种细胞壁蛋白(CwpV)的输出依赖于SecA2。在表达显性负性secA1或secA2等位基因的细胞内观察到SLPs SlpA的细胞质前体和其它细胞壁蛋白的聚集，伴有细胞壁内成熟的SLPs水平降低。此外，无论是显性负性等位基因表达还是SecA1或SecA2的反义RNA敲落显著地影响生长，表明两种Sec系统在难辨梭状芽孢杆菌中为必需的。
难辨梭状芽孢杆菌菌株630 (流行性X型)具有一个含有4290252 bp (G+C 含量=29.06%)的单链环状染色体和一个含有7881 bp (G+C 含量= 27.9%)的环状质粒。全基因组已经测序并发现11%的基因组由可动遗传元件比如接合转座子组成。这些元件提供给难辨梭状芽孢杆菌造成其抗微生物抗性、致病性、宿主相互作用和表面结构产生的基因。例如难辨梭状芽孢杆菌的cdeA基因产生多重耐药外排泵，其显示与已知的多重耐药和毒性化合物排出(MATE)家族中的外排转运蛋白是同源的。蛋白促进药物的能量依赖性和从细胞中钠偶联流出。另外，已显示难辨梭状芽孢杆菌的cme基因能在其它细菌中提供多抗药性。
阵列包含用于在难辨梭状芽孢杆菌细胞的必需基因(SecA2)中靶向序列的R1-S1-R1’ CRISPR单元。在另一项实验中，靶向在MTZ存在下的cdeA基因和任选地一种或多种其它的抗难辨梭状芽孢杆菌抗体。每一种间隔区包含SecA或cdeA基因的20mer核苷酸序列，其中序列包含难辨梭状芽孢杆菌菌株630的与重复序列同源的CRISPR/Cas系统的PAM。每一种重复区与难辨梭状芽孢杆菌菌株630重复区相同并具有序列5’-ATTTACATACCACTTAGTTAATATAAAAC-3’ (SEQ ID NO: 118)。
在备选组实验中，以下序列被用于重复区：
5’-GTTTTATATTAACTAAGTGGTATGTAAAT-3’ (SEQ ID NO: 119)
重复区与对混合种群中难辨梭状芽孢杆菌细胞为内源性的Cas一同起作用。细菌的混合种群作为从患有难辨梭状芽孢杆菌感染的人类患者的粪便样本的活体外样本被检索到。混合种群与载体细菌体外混合，在厌氧条件下于37℃温育以模拟四环素存在下的肠道状况。预计含有CRISPR阵列的转座子将转移至混合体中的拟杆菌属和难辨梭状芽孢杆菌细胞。此外，预计后者细胞中的靶标位点通过Cas核酸酶作用切割，因此减少难辨梭状芽孢杆菌在混合种群中的比例(并且增加拟杆菌属相对于难辨梭状芽孢杆菌的比例)。
在后续实验中，产生包含载体细菌的饮料，并且连续数天被人类患者饮用一次或两次。患者在治疗期间也被给予四环素。预计粪便分析将揭示粪便样本中难辨梭状芽孢杆菌的比例将减少(并且拟杆菌属相对于难辨梭状芽孢杆菌的比例将增加)。
实施例5：霍乱治疗或预防
参考世界卫生组织(WHO)霍乱情况说明书N°107(更新至2015年7月)。霍乱是由细菌霍乱弧菌污染的食物或水摄入引起的急性腹泻感染。研究人员估计由于霍乱每年约有140-430万个病例，并且全世界每年28000-142000人死于霍乱。2小时-5天的短暂潜伏期为引发潜在爆发性疫情的一个因素。霍乱为一种极其致命性疾病。其影响儿童和成人两者，并可在数小时内杀死。感染霍乱弧菌的人中约有80%没有出现任何症状，尽管感染后细菌在其粪便中存在1-10天，并且流回到环境中可能感染其它人。在出现症状的人中，80%的人有轻度或中度症状，同时大约20%的人出现伴随严重脱水的急性水样腹泻。若不及时治疗可能导致死亡。
两种血清型霍乱弧菌(O1和O139)引起爆发。霍乱弧菌O1引起的疾病暴发居多，而1992年第一次发现于孟加拉国的O139局限于东南亚。非O1和非O139霍乱弧菌可引起轻度腹泻，但不会产生流行病。最近，在亚洲和非洲的某些地方发现了新的变异株。观察表明这些菌株造成更严重的霍乱，病死率更高。霍乱弧菌的主要储库为人和水性来源，比如苦咸水和河口，通常与藻花有关。
参考Nature. 2013年2月28日; 494(7438):489-91. doi: 10.1038/nature11927, “细菌噬菌体编码自身的CRISPR/Cas适应性反应来逃避宿主的先天免疫(Abacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade hostinnate immunity)”, Seed KD等(通过参照结合到本文中)，其描述血清型霍乱弧菌O1为严重腹泻疾病霍乱的主要病原体，并且裂解霍乱弧菌的噬菌体已特别是在围绕孟加拉湾的流行地区涉及影响疾病负担。作者描述了ICP1的隔离(用于国际腹泻病研究中心，孟加拉国霍乱噬菌体1)-与霍乱弧菌O1特异性致命性肌尾病毒相关，后者在采集自2001-201114的霍乱患者水稻-水粪便样本和在其出版物中描述的研究中普遍存在。
作者解释ICP1 CRISPR/Cas系统由两种CRISPR位点(命名为CR1和CR2)和六种Cas基因组成，其组织和蛋白产物与1-F型(鼠疫耶尔森氏菌)亚型系统17的Cas蛋白同源性最高。霍乱弧菌分为两种生物型，经典生物型和埃尔托生物型，其中前者与早期的流行病大流行有关，并且已被埃尔托生物型18替代。经典型菌株霍乱弧菌O395具有属于1-E型(大肠杆菌)亚型17的CRISPR/Cas系统，并且迄今为止，尚未见任何埃尔托菌株具有CRISPR/CAS系统的描述。因此，CRISPR/Cas系统在ICP1噬菌体中的起源是未知的。
CR1和CR2共有直接重复序列的RNA序列如下，其中在crRNA中形成预测的茎的部分回文序列用下划线表示：
GUUAGCAGCCGCAUAGGCUGCUUAAAUA [SEQ ID NO: 75]
在本发明的一个实施例中，这种或每一种阵列的重复序列包含或由与SEQ ID NO: 75具有至少80、90、95、96、97、98或99%同一性(或与SEQ ID NO: 75相同)的序列组成。
ICP1 CRISPR中的大多数间隔区对在包括1964年于印度分离的经典菌株O395、1994年于孟加拉国分离的埃尔托菌株MJ-1236和2001-2011年之间于ICDDR,B收集的几种埃尔托菌株在内的霍乱弧菌菌株的子集中发现的18 kb岛的序列显示100%的同一性。18 kb岛类似于革兰氏阳性细菌的噬菌体诱导型染色体岛(PICIs)，包括原型金黄色葡萄球菌致病岛(SaPIs)。SaPIs在某些噬菌体感染后被诱导切除、环合和复制。它们采用不同的机制来干扰噬菌体的繁殖周期以使其自身肆意扩散，这可保护周围的细菌种群免受进一步的噬菌体捕食。ICP1 CRISPR/Cas系统靶向的霍乱弧菌18 kb岛的组织与在PICIs的SaPIs子集中观察到的长度、碱基组成和组织相类似，伴有整合酶在一端同源和比宿主种类低的GC含量(37%与47.5%相比较)。因此，18 kb元件被称作霍乱弧菌PICI样元件(PLE)。
[核苷酸序列= SEQ ID NO: 76 (32 bp前间区序列(SEQ ID NO: 77)以灰色遮蔽，本公开包括在第一个灰色遮蔽的T开始和最后灰色遮蔽的C结束的序列；并且氨基酸序列=SEQ ID NO: 78]
Seed等确定CR1和CR2阵列通过GA PAM序列的识别操纵。Seed等也发现所研究的ICP1相关噬菌体CRISPR阵列中的大多数间隔区显示与霍乱弧菌PLEs相同。间隔区显示在以下表3中；例如，在本发明阵列中的S1选自这些序列中的任何一个。在一个实施方案中，S1选自被下划线序列中的任何一个。
在一个实施例中，本发明的阵列(或每一种阵列)为包含一个、多个或所有带下划线的间隔序列的工程化阵列。阵列间隔区可包含如下非天然存在的排列：
例如，阵列包含8a和/或9a型的间隔区和1a-7a类型中的0、1、2、3、4、5或6 (但不是7)种。例如，阵列包含4b类型的间隔区和1b-3b类型中的0、1或2、3(但不是3或更多)种。例如，阵列包含8a型的间隔区和9a、4b、1c、3d、1e和3e中的一种、多种或所有。例如，阵列包含9a型的间隔区和8a、4b、1c、3d、1e和3e中的一种、多种或所有。例如，阵列包含4b型的间隔区和8a、9a、1c、3d、1e和3e中的一种、多种或所有。例如，阵列包含1c型的间隔区和8a、9a、4b、3d、1e和3e中的一种、多种或所有。例如，阵列包含3d型的间隔区和8a、9a、4b、1c、1e和3e中的一种、多种或所有。例如，阵列包含1e型的间隔区和8a、9a、4b、1c、3d和3e中的一种、多种或所有。例如，阵列包含3e型的间隔区和8a、9a、4b、1c、3d和1e中的一种、多种或所有。
在另一个非天然存在的排列中，载体包含本发明的第一和第二阵列，其中阵列包含至少两种选自1a-1g的间隔区(例如至少两种选自8a、9a、4b、1c、3d、1e和3e的间隔区)，其中间隔区不是相同ICP1噬菌体基因组的间隔区，例如不是所有的ICP1_ 2011_A、或ICP1_2006_E、或ICP1_ 2005_A或ICP1_ 2004_A的间隔区(通过参考上表中的间隔区)。因此，在一个实施方案中：
第一阵列包含ICP1_ 2011_A间隔序列(例如8a和/或9a)，和第二阵列包含ICP1_ 2006_E、ICP1_ 2005_A或ICP1_ 2004_A的间隔序列(例如一种或多种选自4b、1c、3d、1e和3e的间隔区)。
在一个实施例中，载体包含选自8a、9a、4b、1c、3d、1e和3e的1、2、3、4、5、6或所有7种间隔区类型。在一个实施例中，载体包含一种或多种所述所选择类型的多拷贝。在一个实施例中，载体中这种、一些或每一种阵列包含第一间隔区(最接近阵列的启动子)，其中第一间隔区选自8a、9a、4b、1c、3d、1e和3e。以这种方式定位是有利的，因为天然阵列最常见采用第一间隔区。
参考Nucleic Acids Res. 2013年10月; 41(19):9033-48. doi: 10.1093/nar/gkt654. 2013年7月30日电子出版,“霍乱弧菌必需基因集用基于隐马尔可夫模型分析转座子插入测序数据的高分辨率定义(High-resolution definition of the Vibriocholerae essential gene set with hidden Markov model-based analyses oftransposon-insertion sequencing data)”, Chao MC等(通过参照结合)，其公开了高密度转座子诱变对高通量DNA测序(转座子插入测序)的偶联使得同时和全基因组评价单个位点对细菌生长和存活的贡献。HMM结果表明128种基因为在LB下霍乱弧菌的最佳生长需要的。本发明的靶标序列可为这些基因中任何一种的序列(其基因名称和序列通过参照明确结合到本文中，用于提供本发明载体的靶标序列和用于可包含在本文的权利要求中)。
例如，在其分别具有5.6和4.7平均读数的vc0309和vc0753中插入突变体，严重减弱生长。同样地，在体外竞争性实验中，vc0237和vc1773突变体比野生型细胞更不合适。列表中也包括一些得自假定毒素/抗毒素成瘾位点的抗毒素基因，包括vca0360、vca0477、vca0486和vca0488。当与活性毒素相关时，这样的基因被认为是必需的。
作者发现了表4中的必需霍乱弧菌基因。作者鉴定了多于200种似乎是必不可少的基因间隔区。
因此，在本发明的一个实施例中，当宿主细胞为霍乱弧菌细胞时，靶标序列为vc0631、vc2024、vc2626、vc2763-vc2767或vc2768-vc2770序列。在本发明的一个实施例中，当宿主细胞为霍乱弧菌细胞时，靶标序列为vc0309和vc0753、vc0237和vc1773、vca0360、vca0477、vca0486或vca0488序列。
参考Infect Immun. 2015年9月; 83(9):3381-95. doi: 10.1128/IAI.00411-15. 2015年6月8日电子出版,“一项全基因组筛选揭示霍乱弧菌磷酸烯醇丙酮酸磷酸转移酶系统调控致病基因表达( A Genome-Wide Screen Reveals that the Vibrio choleraePhosphoenolpyruvate Phosphotransferase System Modulates Virulence GeneExpression)”, Wang Q等 (通过参照结合)。作者使用基于转座子插入位点(TIS)测序的策略鉴定tcpA表达需要的新因素，其编码TCP的主要亚单位，生物体的主要肠道定殖因子。除了鉴别大部分已知调控tcpA表达的基因以外，筛选得到ptsI和ptsH，其编码酶I(EI)和霍乱弧菌磷酸烯醇丙酮酸磷酸转移酶系统(PTS)的Hpr组分。除了TcpA的表达减少，缺乏EI、Hpr或相关的EIIA (Glc)蛋白的菌株产生较少的霍乱毒素(CT)并且小鼠婴儿肠道定殖的能力减弱。PTS通过调节tcpPH和aphAB的表达调控致病基因表达，其本身控制ToxT (致病基因表达的中枢激活剂)的表达。
因此，在本发明的一个实施例中，当宿主细胞为霍乱弧菌细胞时，靶标序列为tcpA序列或tcpA调控因子序列(即本身或借助其表达产物调控tcpA的核苷酸序列)。例如，序列为ptsI或ptsH序列。在一个实施例中，靶标序列为磷酸烯醇丙酮酸磷酸转移酶系统(PTS)的序列、或tcpPH、aphAB或toxT序列。在一个实施例中靶标序列为编码EIIA(Glc)蛋白的基因序列。
用于本发明的合适靶标序列也显示在表5中-以下任何一种的序列(致病基因带下划线)。
在一个实施方案中，细胞为弧菌属(例如霍乱)细胞并且靶标序列为这些基因的序列(若有的话)。
致病基因显示在表6中。
在一个实施方案中，细胞为弧菌属(例如霍乱)细胞并且靶标序列为这些基因的序列(若有的话)。
来自TCP和CTX致病岛的基因
在一个实施方案中，细胞为弧菌属(例如霍乱)细胞并且靶标序列为ace、cep、ctxA、ctxB、orfU、zot、rstA、rstB、rstR、acfA、acfB、acfC、tagE、aldA、int、tagA、tagD、tcpA、tcpB、tcpC、tcpD、tcpE、tcpF、tcpH、tcpI、tcpJ、tcpP、tcpQ、tcpR、tcpS、tcpT或toxT序列。
实施例6：通过利用野生型内源性Cas的特异性微生物群细菌种群生长的抑制作用
1. 材料和方法
1.1. 菌株
以下菌株用于该实施例及实施例7和8的过程中：大肠杆菌MG1655、大肠杆菌TOP10、嗜热链球菌LMD-9 (ATCC BAA-491，马纳萨斯，弗吉尼亚)、嗜热链球菌DSM 20617(T) (DSMZ，布伦瑞克，德国)、乳酸乳球菌MG1363和变形链球菌Clarke 1924 DSM 20523(DSMZ，布伦瑞克，德国)。
在基因构建体的培养基选择和测试过程中，采用不同的链球菌菌株。嗜热链球菌LMD-9 (ATCC BAA-491)和大肠杆菌TOP10由于其相容性的生长需求而被考虑。除非另外指明，在有氧条件和37℃下，在Todd-Hewitt肉汤(TH) (T1438 Sigma-Aldrich (西格玛奥德里奇))中培养所有菌株。菌株于-80℃下贮存在20%甘油中。
1.2 不同的生长培养基
所有菌株在37℃下于TH培养基上生长20小时。嗜热链球菌的选择性培养基为用3 g l-1的2-苯乙醇(PEA)补充的TH培养基。把PEA加至培养基并在121℃下于15磅/平方英寸下高压蒸汽处理15分钟。通过把1.5% (wt/vol)琼脂加至相应的培养基制备琼脂平板。当对选择或质粒维护必要时，30 μg ml-1卡那霉素被用于嗜热链球菌菌株和大肠杆菌两者，和500 μgml-1用于变形链球菌。
在一些情况下，依赖于菌株和质粒，要看到用PEA补充的培养基上生长可能需要更长的温育，最高达48小时。为了控制所使用生物体的生存能力，必须平行实施对照组TH琼脂。
1.3. 克隆
大肠杆菌(One Shot® ThermoFischer TOP10化学感受态细胞)被用于所有的亚克隆程序。使用Phusion聚合酶实施PCR。按照制造商协议，所有的PCR产物用Nucleospin凝胶和通过Macherey Nagel的PCR清理进行纯化。纯化的片段用在34 µL总体积中含1µL酶的1X FD缓冲液中的限制性内切酶DpnI消化。按照制造商协议所消化的反应用Nucleospin凝胶和通过Macherey Nagel的PCR清理再次进行纯化。按照制造商(NewEngland Biolab)的协议，Gibson组装在10µL反应液中进行。
按照制造商说明书，采用Qiagen试剂盒制备质粒DNA。对革兰氏阳性菌株的修饰包括在用0.5%甘氨酸和溶菌酶补充的培养基中使细菌生长以促进细胞溶菌作用。
1.4. 转化
1. 4.1 电感受态大肠杆菌细胞和转化
市售电感受态细胞被用于克隆和实验(One Shot® ThermoFischer TOP10化学感受态大肠杆菌)。采用标准设置进行电穿孔法：1800 V、25 μF和200 Ω，使用Electro CellManipulator (BTX Harvard Apparatus ECM630)。脉冲后，加入1 ml LB-SOC培养基并于37℃下把细胞温育1小时。在含有50 μg ml-1卡那霉素的LB-琼脂中把转化的细胞接种在板上。
1. 4.2电感受态嗜热链球菌细胞的制备
电穿孔方法自Somkuti和Steinberg改进，1988年。把嗜热链球菌在用40 mM DL-苏氨酸(T8375 Sigma-Aldrich (西格玛奥德里奇))补充的TH肉汤中的过夜培养液以5 ml相同培养基稀释100倍，并生长至OD600介于0.3-0.5之间(接种后大约2.5小时)。通过于4℃下以10000 xg离心10分钟收集细胞，并用5 ml的冰冷冲洗缓冲液(0.5 M蔗糖+ 10%甘油)冲洗3次。在冲洗细胞后，在电穿孔缓冲液(0.5 M蔗糖、10%甘油和1 mM MgCl2)中把它们悬浮至OD600为15-30。把电穿孔缓冲液中的细胞保持在4℃下直到使用(1小时内)或在微量离心管(Eppendorf管)中等分50 μl，在液氮中冷冻它们并贮存在-80℃备用。
1. 4.3 电穿孔嗜热链球菌细胞
把1 μl纯化的质粒DNA加入到50 μl的细胞悬浮液中，并在预先冷却的2 mm-缝隙(gap)电穿孔比色皿实施电穿孔。电穿孔设置为2500 V、25 μF和200 Ω，使用Electro CellManipulator (BTX Harvard Apparatus ECM630)。电脉冲后立即把1 ml的TH肉汤加入到细胞并把悬浮液在冰上保持10分钟，随后把细胞于37℃下温育3小时。用于表达抗性基因的时间之后，把细胞接种在含有30 μg ml-1卡那霉素的TH-琼脂板上。依构造而定，于37℃下温育12 -48小时之间可见菌落。
1. 5. XylS质粒的构造
在该研究中使用的所有质粒为基于pBAV1K-T5，其为衍生自乳酪链球菌(Bryksin &Matsumura，2010)的隐蔽性质粒pWV01的广泛宿主表达载体，采用Gibson方法，使用用于其它片段装配的含有尾引物来扩增骨架。
通过在XylR阻遏物前面克隆启动子gyrA构建木糖诱导系统(图1)。自含有包含用于Gibson装配的尾引物的反向引物和正向引物的枯草芽孢杆菌菌株SCK6 (Zhang等，2011)扩增XylR阻遏物，其为用于引入gyrA启动子的ultramer (Xie等，2013)，并且相应的尾引物装配成pBAV1KT5基本骨架。生成的片段侧翼为自pCL002扩增的mCherry (未发表的工作)，其含包括Pldha+PxylA杂合启动子的ultramer (Xie等，2013)。按照制造商说明书，三种生成的PCR产物在Gibson Master Mix® (NewEngland Biolab)中装配。产物最后在大肠杆菌TOP10电感受态细胞内转化。参见图1。
1. 6. CRISPR阵列质粒的设计和构造
嗜热链球菌具有4种不同的CRISPR系统(Sapranauskas等，2011)， II型CRISPR1 (ST1-CRISPR)系统被选择用于该项工作。靶标序列的设计基于可得到的LMD-9 (GenBank:CP000419.1)的基因组序列。ST1-CRISPR阵列被设计在木糖诱导型启动子下仅含有CRISPR阵列重复区和间隔区(Xie等，2013)，之后在链球菌属种类的强组成型启动子下为相应的tracrRNA (Sorg等，2014) (图2，SEQ ID Nos: )。
tracrRNA在crRNA的成熟中起重要作用，它由嗜热链球菌内源性RNase III加工，与crRNA形成复合物。该复合物起核酸内切酶ST1-Cas9 (Horvath & Barrangou，2010)的引导作用。在得自木糖诱导型启动子的合成阵列转录之后，内源性Cas9和RNAses把它加工成功能性gRNA。gRNA/Cas复合物应在靶标位置引起双链断裂。
阵列的设计采用2种GC含量高和tracrRNA部分减少(即不完整的tracrRNA序列)的特异性靶标序列，其表明对crRNA的适当成熟是不必要的(Horvath & Barrangou, 2010)。
2种靶标为必需基因(DNA聚合酶III亚基α)和抗生素抗性基因(tetA样基因) (SEQID NOs: )。
引物被用于扩增pBAV1KT5-XylR-PldhA骨架。按照制造商指南(NewEnglandBiolabs)，CRISPR阵列gBlock和具有尾引物的骨架在Gibson Master Mix ®上装配。产物最后在大肠杆菌TOP10电感受态细胞内转化。
1. 7. 嗜热链球菌LMD-9中木糖诱导系统的表征
把过夜的稳定生长期培养基1:100稀释到含有相应抗生素的TH肉汤中。用不同浓度的D-(+)-木糖(0、0.001、0.01、0.1、0.5和1% wt/vol)诱导中期培养细胞(Mid-log cells)，并基于细胞悬浮液或悬浮缓冲液(PBS缓冲液)，直接在培养基上测量细胞培养物以评价培养基的自发荧光程度。在96孔平底板上，把20 μL的细胞培养液样品在PBS缓冲液中稀释1/10。在平板阅读器上读取细胞悬浮液或培养液的荧光。使用558 nm激发波长和612 nm发射光测量mCherry荧光。在OD 600 nm处测定重悬浮细胞的吸光度。每个实验至少进行三次独立的生物复制。
1.8. 嗜热链球菌中CRISPR阵列的激活
嗜热链球菌LMD-9和大肠杆菌TOP10两者与含有靶向DNA聚合酶III和嗜热链球菌的tetA的CRISPR阵列的质粒一起，在用30 μg ml-1卡那霉素补充的3 ml培养基上生长过夜以维持质粒。第二天96孔深孔板在新鲜的用30 μg ml-1卡那霉素补充的TH培养基上用500 μl的1/100过夜培养基接种。对数中期细胞培养物用1%木糖诱导。在嗜热链球菌和大肠杆菌上单独测量杀伤作用。对测试阴性对照的每一种菌株和条件保持不含木糖。细胞生长直至~OD0.5并且接着使用96孔复制板(Mettler Toledo Liquidator™ 96)在TH培养基上再连续稀释10倍，在TH琼脂上发现5 μL体积的液滴并用g l-1 PEA板补充TH琼脂。把板于37℃温育24小时，并自一式三份测量计算菌落形成单位(CFU)。
2. 结果
2.1 生长条件和选择性培养基
我们首先着手建立细菌菌株和应支持我们计划用于共同培养实验的所有菌株生长的培养方案。我们使用嗜热链球菌菌株LMD-9，其能够于37℃下在TH肉汤中支持与大肠杆菌类似的生长(图3)。
为测定不同种类的细胞数目，区分得自混合培养基的不同细菌是重要的。使用麦康凯(MacConkey)琼脂可选择性生长大肠杆菌，然而，对嗜热链球菌的选择性生长没有特异性培养基。PEA琼脂为用于自革兰氏阴性菌(大肠杆菌)分离革兰氏阳性菌(嗜热链球菌)的选择性培养基。另外，我们发现不同浓度的PEA部分抑制其它革兰氏阳性菌的生长，这使得其它革兰氏阳性菌之间的选择用于该项工作(图4)。3g l-1的PEA证实使嗜热链球菌LMD-9选择性生长同时限制大肠杆菌的生长。
2.2 诱导系统的设计和验证
通过建立异源木糖诱导盒(Xyl-S)，先前基于巨大芽孢杆菌木糖操纵子(图5)开发了用于链球菌属种类的诱导系统。xylR和xylA启动子分别用变形链球菌组成型表达的gyrA和ldh启动子替代。这种用于链球菌属种类的表达盒在不同种类之间的敏感性和表达水平显示差异，然而，系统未在嗜热链球菌测量(Xie等，2013)。因此，我们首先着手验证嗜热链球菌中的木糖诱导盒。
诱导盒的一个备选版本通过仅用变形链球菌gyrA启动子替换xylR启动子但使巨大芽孢杆菌的xylA启动子保持完整来构建。在木糖诱导系统的设计期间考虑了诱导型启动子的两个版本，
在巨大芽孢杆菌发现的天然P xylA 启动子和与P xylA 启动子的阻遏蛋白结合位点融合(fused)的高度保守启动子P ldha 的杂合启动子(图5)。仅有少数链球菌属种类已被报道代谢木糖，并且因此存在识别其它链球菌属种类中的xylA启动子的调控元件(regulatorymachinery)是不可能的。因此，我们构建木糖诱导系统两者但仅测试具有Pldha+XylA系统的mCherry的可诱导性。
为了测定木糖引起的mCherry诱导表达，用不同浓度的木糖诱导含有质粒(pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA)的细胞对数中期培养物。温育6小时后，我们测量培养基中的mCherry荧光，期间我们在携带质粒的细胞观察到明显更高的总体表达水平(图6)。值得注意的是甚至在其中未加入木糖的培养基中系统显示显著的基础表达水平。这意味着系统是有“漏洞”的并且在杀伤阵列的情况下这能导致细胞死亡，甚至在系统用木糖诱导之前。然而，在该项研究的后续过程中，我们使用两种质粒版本(pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA和pBAV1KT5-XylR-mCherry-PxylA)。
2. 3 CRISPR/CAS9阵列的设计
为了确定CRISPR阵列中的基因组靶向间隔区是否能够引起嗜热链球菌LMD-9死亡，我们把我们设计的CRISPR阵列插入到两种先前构造的木糖诱导系统(pBAV1KT5-XylR-mCherry-Pldha+XylA和 pBAV1KT5-XylR-mCherry-PxylA)。在这些质粒中，我们用含有CRISPR阵列的gBlock替换mCherry(图7)。具有Pldha+XylA启动子的变体被期待比PxylA更强和具有更高的基本活性(Xie等，2013)。
2. 4 使用内源性Cas9的细菌种群生长抑制作用
当我们在大肠杆菌中构建质粒后，我们把质粒转化至嗜热链球菌中。这将使我们能够确定我们是否能够引起特定细菌种类的细胞死亡。有趣的是，暴露于含有强P ldh+XylA 杂合启动子的质粒的嗜热链球菌中的细菌宿主种群大小(通过使细菌在琼脂平板上生长并计数菌落数表明)，当与暴露于含有弱的正常P XylA 启动子的质粒的嗜热链球菌相比较时少了10倍(图8；52个菌落具有强阵列表达相对于556个菌落具有弱阵列表达，10.7倍差异)，使用电感受态嗜热链球菌细胞的相同肉汤，把两种菌株平行转化。这提示我们携带靶向嗜热链球菌基因的CRISPR阵列的质粒能使用内源性Cas核酸酶和RNase III杀伤细胞，从而抑制种群生长达10倍。
我们期待用包含P xylA 启动子的质粒转化的宿主细胞内的弱阵列表达导致一定程度的细胞杀伤，即使远小于具有强启动子的质粒。如果强阵列表达的活性与不暴露于任何阵列编码质粒的嗜热链球菌(比如直接从肠道微生物群分离的细菌)进行比较，我们期待应确定大于所观察到的10倍抑制作用的种群生长抑制作用。因此，我们相信用于利用内源性Cas核酸酶的宿主细胞中阵列(或单链引导RNA)表达应有助于在环境、医疗和本文提及的其它情况中提供靶宿主细胞的有效生长抑制作用。共同给予抗生素也可用于增强生长抑制作用，特别是当靶向一种或多种抗生素抗性基因时。
3. 讨论与展望
在该项研究中，我们着手设计CRISPR-阵列以使用内源性Cas9系统特异性地杀伤嗜热链球菌。为了得到对杀伤信号的控制，我们试图使用能在嗜热链球菌应用的诱导系统。得自巨大芽孢杆菌的木糖诱导XylR系统先前应用于变形链球菌(Xie，2013)但未在嗜热链球菌应用。在该项研究中，我们使用设计的嗜热链球菌中XylR-mCherry-Pldha回路证实xylR诱导系统的功能性。我们发现0.1% wt/vol足以充分诱导嗜热链球菌的XylR系统(图6)。
为了在嗜热链球菌和大肠杆菌共同培养时观察丰度，我们建立了用3 g l-1的PEA补充培养基，使得嗜热链球菌选择性生长同时限制大肠杆菌的生长(图4)。
将靶向嗜热链球菌LMD-9基因组中的DNA聚合酶III α亚基和tetA样基因的ST1-CRISPR阵列置于木糖诱导型启动子下(Xie等，2013)。靶向这些功能区应导致双链断裂，并因此限制嗜热链球菌生存能力(图9)。因为工程化阵列被设计使用内源性CRISPR/Cas元件(machinery) 加工编码的CRISPR阵列来靶向嗜热链球菌基因组，预计阵列对不相关的菌株比如大肠杆菌的生长没有影响，即使在其基因组可发现类似的靶标。在混合细菌种群(模拟人类微生物群的方面)成功进行了测试，如在实施例8中讨论的那样。
在其中本发明用于在人或动物受试者治疗或预防由本文公开的微生物群介导或引起的疾病或病症的实施方案中，证实本发明抑制宿主细胞在表面生长的能力是重要和合乎需要的。这样的微生物群通常与受试者的组织(例如肠道、口腔、肺、腋下、眼、阴道、肛门、耳、鼻或喉组织)接触，并且因此我们确信证实抑制微生物群细菌种类(以链球菌属为例)在表面生长的活性支持这种用途。
实施例7：在不同菌株中特异性微生物群细菌种群生长抑制作用
实施例6证实了嗜热链球菌LMD-9的特异性生长抑制作用。在此我们证实生长抑制作用也可在第二菌株得到：嗜热链球菌DSM 20617。因此，实施例6中所描述的方法应用于后者菌株(除了嗜热链球菌DSM 20617的选择性培养基为用2.5 g l-1的2-苯乙醇(PEA)补充的TH培养基以外)。
温育用CRISPR阵列质粒转化的嗜热链球菌DSM 20617，在37℃于液体培养基上恢复3小时时间段，这使得表达卡那霉素抗性。在恢复期后，在1%木糖存在下把细胞铺展在不同的选择培养基上，以便诱导细胞死亡，并且没有木糖作为对照(图10)。很明显，(1) 通过木糖诱导嗜热链球菌的生长可被抑制(‘强’启动子质粒相对于对照组约为10倍)，(2) ‘强’系统(pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA)比‘弱’系统(pBAV1KT5- XylR-CRISPR-PxylA)导致生长减少得更多。
实施例8：在不同微生物群种类的混合菌群中选择性细菌种群生长抑制作用
我们接下来证实3个种类的混合种群中特定细菌种类的选择性生长抑制作用。我们选择在人类和动物的肠道微生物群发现的种类(嗜热链球菌DSM 20617(T)、乳酸乳杆菌和大肠杆菌)。我们包括两种革兰氏阳性菌种类(嗜热链球菌和乳酸乳杆菌)以观察这是否会影响前者种类的选择性杀伤能力；此外为了增加困难(和更接近模拟微生物群的情况)乳酸乳杆菌被选择，因为这是嗜热链球菌的系统发育相关种类(如通过两个种类之间的高16s核糖体RNA序列同一性表明的那样)。嗜热链球菌和乳酸乳杆菌两者属于厚壁菌门。此外，为了刺激微生物群，人类共栖肠道种类(大肠杆菌)被包括在内。
1. 材料和方法
如在实施例6中阐述的方法为采用的菌株(除了选择性培养基为用2.5g l-1 2-苯乙醇(PEA)补充的TH培养基以外)。
1.1 电感受态乳酸乳杆菌细胞的制备
在用0.5蔗糖和1% M甘氨酸补充的TH培养基上的乳酸乳杆菌的隔夜培养物以5 ml的相同培养基稀释100倍，并在30℃下生长至OD600介于0.2-0.7之间(接种后约2个小时)。于4℃下以7000 x g离心5分钟收集细胞，并用5 ml的冰冷冲洗缓冲液(0.5 M蔗糖+ 10%甘油)冲洗3次。在冲洗细胞后，在电穿孔缓冲液(0.5 M蔗糖、10%甘油和1 mM MgCl2)中把它们悬浮至OD600为15-30。把电穿孔缓冲液中的细胞保持在4℃下直到使用(1小时内)或在微量离心管(Eppendorf管)中等分50 μl，在液氮中冷冻它们并贮存在-80℃备用。
所有种类的电穿孔条件如在实施例6中描述的那样。
1.2 CRISPR阵列的激活：菌群实验
嗜热链球菌DSM 20617、乳酸乳杆菌MG1363和大肠杆菌TOP10用含有靶向DNA聚合酶III和嗜热链球菌的tetA的CRISPR阵列的质粒进行基因转化。转化后使所有细胞单独生长并在37℃下共同培养3小时，使得恢复发展在质粒编码的抗生素抗性。我们决定使用转化效率作为CRISPR编码的生长抑制作用的示值读数。因此，在把恢复培养基的细胞铺展在TH培养基上后，TH用PEA补充和所有麦康凯琼脂(MacConkey agar)用卡那霉素补充，并通过1%木糖诱导。
2. 结果
2.0 乳酸乳杆菌、大肠杆菌和嗜热链球菌之间的系统进化距离
在嗜热链球菌和乳酸乳杆菌的16S rrNA编码DNA序列计算的序列相似性被测定为83.3%。使用以下16S序列：大肠杆菌: AB030918.1，嗜热链球菌: AY188354.1，乳酸乳杆菌：AB030918。序列用具有以下参数的针(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)对齐：-gapopen 10.0 -gapextend 0.5-endopen 10.0 -endextend 0.5-aformat3 pair -snucleotide1 -snucleotide2。图11显示源嗜热链球菌、乳酸乳杆菌和大肠杆菌的16S序列的最大似然系统进化树。
2.1 生长条件和选择性培养基
嗜热链球菌和乳酸乳杆菌通常用于许多发酵食品和酸奶的联合中。我们选择这些菌株，因为它们通常已知为与宿主形成密切关系的肠道微生物，并且先前鉴定的嗜热链球菌和乳酸乳杆菌的16S核糖体RNA区已经显示这些生物体为系统发育密切相关的(Ludwig等，1995)。平行地，我们也评估了用于混合种群共同培养实验的大肠杆菌生长，因为这种生物体在肠道微生物群落中也很常见。我们首先着手建立细菌菌株和栽培协议，其支持我们计划用于共同培养试验的所有菌株的生长。我们发现所有菌株都能在37℃下于TH肉汤中支持生长(图3)。
自混合培养基区分不同的细菌是重要的，以便测定不同种类的细胞数目。用麦康凯(MacConkey)琼脂可选择性生长大肠杆菌，然而，对嗜热链球菌的选择性生长没有特异性培养基。PEA琼脂为用于自革兰氏阴性菌(大肠杆菌)分离革兰氏阳性菌(嗜热链球菌)的选择性培养基。另外，不同浓度的PEA部分抑制不同革兰氏阳性菌种类和菌株的生长，这使得其它革兰氏阳性菌之间的选择用于该项工作。用2.5 g l-1的PEA证实选择性地使嗜热链球菌生长同时限制乳酸乳杆菌和大肠杆菌的生长。
所有菌株用使用具有卡那霉素筛选标记的pBAV1KT5载体骨架的质粒转化；我们发现使用30 μg ml-1卡那霉素补充的培养基足以使细胞生长，同时保持质粒。
2.3 在混合种群中的转化和选择性生长抑制作用
我们用含有CRISPR阵列的质粒转化嗜热链球菌、乳酸乳杆菌和大肠杆菌，并在以相等部分联合的所有细菌种类菌群中培养它们，这使得我们确定我们是否能够特异性地在嗜热链球菌引起细胞死亡。我们用pBAV1KT5-XylR-CRISPR-P XylA 或pBAV1KT5-XylR-CRISPR-P ldha+XylA 质粒转化所有种类。
图12显示在含有pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA或pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA质粒的大肠杆菌、乳酸乳杆菌和嗜热链球菌的共同培养中嗜热链球菌的选择性生长抑制作用。在含有pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA或pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA质粒的大肠杆菌之间未观察到生长差异(中间一列)。然而，嗜热链球菌(在用2.5 gl-1 PEA补充的TH琼脂上选择性生长，最后一列)显示在pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA (强)或pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA +XylA(弱)质粒之间转化效率降低，如我们预期的那样。我们因此证实靶嗜热链球菌亚群在细胞混合种群中的选择性生长抑制作用。
参考文献
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表格
表1：用于本发明的SRBs的重复序列
R1和R1’中每一个可选自这些重复共有序列，例如当系统为原油、天然气或水的回收、处理或存储设备时。
信息来自CRISPRs数据库(www.crispr.u-psud.fr)
1=重复序列(SEQ ID NO: 51)在这些细菌常见；
2=重复序列(SEQ ID NO: 54)在这些细菌常见；
3=重复序列(SEQ ID NO: 69)在这些细菌常见。
条目如通过以下实施例说明的那样读取。
在脱硫脱硫弧菌ND132发现了CRISPR阵列，在3491653位开始和在3498191位结束，其中阵列具有98个间隔序列，每一个侧翼为重复区，其中重复区每一个具有SEQ ID NO: 51序列。这样的重复区也发现于其它细菌的阵列(在注释编号1下，表中最后一列)。
表2：
表3：带下划线的=与霍乱弧菌PLE内的序列具有100%同一性的CRISPR间隔区。
表4
表5
表6
序列：
在一个实例中，本发明的一种或多种间隔区靶向该序列表中的相应序列。SEQ ID NOs:1-44为II型CRISPR/Cas系统序列，例如链球菌属序列。
。

Claims (35)

1. 宿主修饰(HM) CRISPR/Cas系统用于改变细菌混合种群中第一和第二细菌亚群的相对比例的用途，第二细菌包含宿主细胞，对于每一种宿主细胞，所述系统包含以下(i)-(iv)的组分：
(i) 至少一种编码Cas核酸酶的核酸序列；
(ii) 宿主细胞靶标序列和包含间隔序列(HM-间隔区)与编码HM-crRNA的重复区的工程化宿主修饰(HM) CRISPR阵列，HM-crRNA包含杂交于宿主细胞靶标序列，以把所述Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列的序列；
(iii) 任选的tracrRNA序列或表达tracrRNA序列的DNA序列；
(iv) 其中所述系统组分在宿主细胞与至少一种转化宿主细胞的核酸载体之间分割(split)，HM-crRNA借以把Cas引导至靶标以修饰宿主细胞内的宿主CRISPR/Cas系统；和
其中靶标序列被Cas修饰，借以杀伤宿主细胞或减少宿主细胞生长。
2. 用于修饰细菌宿主细胞的靶核苷酸序列的用于权利要求1的宿主修饰(HM)CRISPR/Cas系统，所述系统包含以下(i)-(iv)的组分：
(i) 至少一种编码Cas核酸酶的核酸序列；
(ii) 宿主细胞靶标序列和包含间隔序列(HM-间隔区)与编码HM-crRNA的重复区的工程化宿主修饰(HM) CRISPR阵列，HM-crRNA包含能够杂交于宿主靶标序列，以把所述Cas引导至宿主细胞内的靶标以修饰靶标序列的序列；
(iii) 任选的tracrRNA序列或用于表达tracrRNA序列的DNA序列；
(iv) 其中所述系统组分在宿主细胞与至少一种可转化宿主细胞的核酸载体之间分割，HM-crRNA借以把Cas引导至靶标以修饰宿主细胞内的宿主CRISPR/Cas系统。
3. 权利要求2的系统，其中所述一种或多种载体缺乏Cas (例如Cas9)核酸酶编码序列。
4.任何一项前述权利要求的用途或系统，其中每一种宿主细胞属于人类微生物群中发现的菌株或种类。
5. 权利要求1或4用途，其用于：(a) 改变拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌在混合细菌种群中的比例；(b) 减少厚壁菌门(Firmicutes)亚群(宿主细胞)在混合细菌种群中的比例；(c) 减少第一厚壁菌门种类(宿主细胞)在混合种群中的比例，其中混合种群包含其生长不受所述cRNA抑制的第二厚壁菌门种类；(d) 减少第一革兰氏阳性细菌种类(宿主细胞)在混合细菌种群中的比例，其中混合种群包含其生长不受所述cRNA抑制的第二革兰氏阳性细菌种类；(e) 减少细菌种类(宿主细胞)在混合细菌种群中的比例，其中混合种群包含其生长不受所述cRNA抑制的不同细菌种类，其中第一种类具有16s核糖体RNA编码DNA序列，其与其它种类的16s核糖体RNA编码DNA序列具有至少80%同一性；(f) 减少第一细菌人类肠道微生物群种类(宿主细胞，例如厚壁菌门)在混合细菌种群中的比例，其中混合种群包含不同的细菌种类，其中这种不同种类为其生长不受所述cRNA抑制的人类肠道益生菌种类；或(g) 减少细菌人类肠道微生物群种类(宿主细胞，例如厚壁菌门)在混合细菌种群中的比例，其中混合种群包含不同的细菌种类，其中这种不同种类为其生长不受所述cRNA抑制的人类肠道共栖种类。
6. 权利要求2或3系统，其用于：(a) 改变拟杆菌门细菌在混合细菌种群中的比例；(b)减少厚壁菌门亚群(宿主细胞)在混合细菌种群中的比例；(c) 减少第一厚壁菌门种类(宿主细胞)在混合种群中的比例，其中混合种群包含其生长不受所述cRNA抑制的第二厚壁菌门种类；(d) 减少第一革兰氏阳性细菌种类(宿主细胞)在混合细菌种群中的比例，其中混合种群包含其生长不受所述cRNA抑制的第二革兰氏阳性细菌种类；(e) 减少细菌种类(宿主细胞)在混合细菌种群中的比例，其中混合种群包含其生长不受所述cRNA抑制的不同细菌种类，其中第一种类具有16s核糖体RNA编码DNA序列，其与其它种类的16s核糖体RNA编码DNA序列具有至少80%同一性；(f) 减少第一细菌人类肠道微生物群种类(宿主细胞，例如厚壁菌门)在混合细菌种群中的比例，其中混合种群包含不同的细菌种类，其中这种不同种类为其生长不受所述cRNA抑制的人类肠道益生菌种类；或(g) 减少细菌人类肠道微生物群种类(宿主细胞，例如厚壁菌门)在混合细菌种群中的比例，其中混合种群包含不同的细菌种类，其中这种不同种类为其生长不受所述cRNA抑制的人类肠道共栖种类；其中(a)-(g)用于在人或动物受试者中治疗或预防(i) 由其比例被减少的所述细菌种类引起的微生物群感染；或(ii) 由其比例被减少的所述细菌种类介导的疾病或病症。
7.权利要求5或6的用途或系统，用于增加拟杆菌门相对于厚壁菌门的相对比例。
8.任何一项前述权利要求的用途或系统，其中所述Cas核酸酶由细胞的内源性II型CRISPR/Cas系统提供。
9.任何一项前述权利要求的用途或系统，其中组分(i)对宿主细胞为内源性的。
10.任何一项前述权利要求的用途或系统，其中靶标序列由宿主细胞的抗生素抗性基因、致病基因或必需基因包含。
11.任何一项前述权利要求的用途或系统，其中靶标序列为宿主染色体序列。
12. 任何一项前述权利要求的用途或系统，其中可选择地，HM-crRNA和tracrRNA由例如由载体提供的单链引导RNA (gRNA)包含。
13. 任何一项前述权利要求的用途或系统，其中宿主细胞包含具有编码感兴趣的HM-序列的游离端(HM-DNA)的脱氧核糖核酸链和/或其中系统包含编码HM-DNA的序列，其中HM-DNA包含分别与用于把HM-DNA插入到宿主基因组(例如插入到染色体或游离基因位点)的靶标序列中或其侧翼的一个或多个序列同源的一个或多个序列。
14. 用于修饰包含内源性CRISPR/Cas系统的细菌宿主细胞的用于权利要求1的工程化核酸载体，所述载体
(a) 包含用于表达用于任何一项前述权利要求的CRISPR/Cas系统或用途的多种不同crRNAs (例如由gRNAs包含)的核酸序列；和
(b) 任选地缺乏编码Cas核酸酶的核酸序列，
其中第一所述crRNAs能够杂交于所述宿主细胞内的第一核酸序列；和第二所述crRNAs能够杂交于所述宿主细胞内的第二核酸序列，其中所述第二序列不同于所述第一序列；和
(c) 第一序列由抗生素抗性基因(或其RNA)包含和第二序列由抗生素抗性基因(或其RNA)包含；任选地其中这些基因是不同的；
(d) 第一序列由抗生素抗性基因(或其RNA)包含和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含；
(e) 第一序列由必需基因(或其RNA)包含和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含；或者
(f) 第一序列由致病基因(或其RNA)包含和第二序列由必需或致病基因(或其RNA)包含。
15. 权利要求14的载体，其在包含一种或多种Cas的宿主细胞内，所述Cas对载体编码的cRNA (例如单链引导RNA)为可操纵的。
16.任何一项前述权利要求的用途、系统或载体，其中HM-CRISPR阵列包含相同间隔区的多个拷贝。
17.任何一项前述权利要求的用途、系统或载体，其中载体包含多种HM-CRISPR阵列。
18.任何一项前述权利要求的用途、系统或载体，其中每一种载体为病毒或噬菌体。
19. 任何一项前述权利要求的用途、系统或载体，其中系统或载体包含编码crRNAs(例如gRNAs)的核酸序列的2、3或更多个拷贝，其中拷贝包含用于靶向宿主细胞序列(例如致病、抗性或必需基因序列)的相同间隔序列。
20.权利要求20的用途、系统或载体，其中拷贝在两个或更多个载体CRISPR阵列之间分割(split)。
21.一种包含在任何一项前述权利要求中列举的系统或载体的细菌宿主细胞。
22.任何一项前述权利要求的用途、系统、载体或细胞，其中阵列与抗生素联合；或者用途包括使宿主细胞暴露于第一抗生素，其中靶标序列由对所述第一抗生素有抗性的抗生素抗性基因包含。
23. 任何一项前述权利要求的用途、系统、载体或细胞，其中宿主细胞为葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、李斯特氏菌属(Listeria)、大肠杆菌(E coli)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)或梭菌属(Clostridium)宿主细胞。
24.权利要求1-13或16-23中任何一项的用途、系统或细胞，其中每一种载体依据权利要求14或15。
25.任何一项前述权利要求的用途、系统、载体或细胞，其中与未用所述HM-阵列或编码所述gRNA的核苷酸序列转化的所述宿主细胞种群的生长相比较，宿主细胞种群的生长减少至少5倍。
26.任何一项前述权利要求的用途、系统、载体或细胞，其中表面上的宿主细胞种群的生长受到抑制。
27.任何一项前述权利要求的用途、系统、载体或细胞，其中第一细菌为益生的、与人类共栖或共生的(例如在人类肠道)。
28.任何一项前述权利要求的用途、系统、载体或细胞，其中第一和第二细菌两者为厚壁菌门，并且为不同种类或菌株的细菌；或者其中第一细菌为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和第二细菌为厚壁菌门。
29.任何一项前述权利要求的用途、系统、载体或细胞，其中宿主细胞为古细菌细胞而不是细菌细胞，或者每一个种群为古细菌种群而不是细菌种群。
30.权利要求1、4、5、7-13、16-20和22-29中的任何一项的用途，用于处理工业或活体外医用流体、表面、装置或容器，或者用于处理水道、水、饮料、食品或化妆品，其中宿主细胞由流体、表面、装置、容器、水道、水、饮料、食品或化妆品包含或在其上。
31.任何一项前述权利要求的用途、系统、载体或细胞，其中HM-cRNA或gRNA包含能够杂交于宿主细胞靶前间区序列的序列，所述靶前间区序列为邻近的NNAGAAW或NGGNG前间区序列邻近基序(PAM)。
32. 根据或用于任何一项前述权利要求的用途、系统或细胞的核酸载体，所述载体包含多于1.4kb的外源性DNA序列，其中外源性DNA编码CRISPR/Cas系统的一个或多个组分，并且包含用于在宿主细胞中表达HM-crRNAs或gRNAs的工程化阵列，其中外源性序列没有编码与cRNA或gRNA同源的Cas核酸酶的核苷酸序列；其中至少2种不同的cRNAs或gRNAs由外源性DNA (例如至少2种HM-CRISPR阵列)编码。
33.权利要求32的载体，其中载体为能够转化宿主细胞的病毒载体。
34.权利要求32或33的载体，其中cRNAs或gRNAs能够在宿主细胞内杂交于相应的靶前间区序列，其中每一种前间区序列由抗生素抗性或必需宿主基因包含。
35.权利要求34-36中任何一项的载体，其中宿主细胞为人类微生物群种类的细胞。
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