CN110596364A - 一种前列腺特异性抗原检测的比率电化学传感器的构建方法及其应用 - Google Patents

一种前列腺特异性抗原检测的比率电化学传感器的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种前列腺特异性抗原检测的比率电化学传感器的构建方法，属于电化学分析技术领域。本发明主要内容包括提供一种Ag@RF‑Ag NP、rGO/Fe3O4/Cu2O纳米材料的合成方法；基于Ag@RF‑Ag NPs中Ag NPs较强电化学氧化峰与rGO/Fe3O4/Cu2O Ns中Cu2O NPs稳定的电化学氧化峰以及二者峰电位互不干扰，以Ag@RF‑Ag NPs中Ag NPs的电化学氧化峰作为检测信号，以rGO/Fe3O4/Cu2O Ns中Cu2O NPs的电化学氧化峰为参比信号，设计了具有磁性的比率电化学传感器。本发明操作简易，灵敏度高，特异性强。该比率电化学传感器应用于检测PSA。

Description

一种前列腺特异性抗原检测的比率电化学传感器的构建方法 及其应用
技术领域
本发明申请属于电化学分析技术领域，尤其涉及一种前列腺特异性抗原检测的比率电化学传感器的构建方法。
背景技术
前列腺上皮细胞分泌的特异性抗原(PSA)，是一种生物标志物，其一般存在与人体血清中，当在血清中的含量达到4ng/mL，就具有患癌的风险。因此，PSA的早期准确诊断可以增加成功治疗的机会。迄今为止，PSA检测采用了几种技术，包括表面增强拉曼散射，荧光测定，色谱方法等，但是这些实验方法具有操作繁琐，不稳定，仪器昂贵等缺点。但是对癌症的早期诊断对后期治疗有着重要的作用，因此急需开发高灵敏度、高准确性的检测PSA的方法。众所周知，电化学传感器具有高灵敏，检测简单，易操作的优点，所以电化学传感器用于检测PSA具有巨大的应用潜力。
在已有的电化学生物传感器中，通过采用电活性纳米材料作为电化学信标可以有效的提高电化学传感器的灵敏度，常用的电活性纳米材料包括单一纳米材料(Ag，Cu2O等)以及具有核壳纳米材料的(Au@Ag，Au@CdO等)。但是，单一的电化学信号容易受到外来物质的影响，在生命环境下检测PSA准确性会受到干扰，因此，需要改善电化学传感器的构建策略，来提高检测过程的准确度。
发明内容
本申请针对单一信号传感器的不足，本发明提供了一种前列腺特异性抗原检测的比率电化学传感器的构建方法。本发明以两个信号作为输出信号，结果重现性良好，操作简易，绿色无污染，灵敏度高。
本发明的技术方案如下：
一种前列腺特异性抗原检测的比率电化学传感器的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
(1)Apt-Ag@RF-Ag NPs溶液的制备：
向Tris-硼酸(TBE)缓冲溶液中加入Ag@RF-Ag NPs溶液以及浓度为0.5～1.5μM的前列腺上皮细胞分泌的特异性抗原适配体溶液，室温下摇晃11～13h，之后离心去除上清液，将固相物质重新分散在超纯水中，即得Apt-Ag@RF-Ag NPs溶液；
(2)MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极的制备：
利用粒径为0.03～0.07μm的三氧化二铝抛光粉对直径为3～5mm的MGCE电极进行打磨，之后再依次用乙醇和超纯水超声洗涤，并吹干待用，将rGO/Fe3O4/Cu2O NSs溶液滴涂在电极表面，在室温下放置0.5～1.5h，得到MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O电极；随后将步骤(1)中所得Apt-Ag@RF-Ag NPs溶液滴涂在MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O电极上，在30～40℃下孵育30～50min，之后用水冲洗电极，即得MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极；
(3)比率电化学传感器的构建：
取5～15μL一系列不同浓度的PSA标准溶液加到电极表面，在35～40℃温度条件下孵育20～40min，冲洗电极，通过微分脉冲伏安法DPV检测MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极的电化学信号，并分别记录测试数据中Ag NPs与Cu2O NPs的电化学响应情况，横坐标是PSA浓度的对数值，纵坐标是Ag NPs的氧化峰峰强度与Cu2O NPs的氧化峰峰强度的比值，建立Ag NPs的氧化峰峰强度与Cu2O NPs的氧化峰峰强度的比值和PSA浓度对数值间的标准曲线。
步骤(1)中所述Ag@RF-Ag NPs溶液的制备步骤如下：
①将间苯二酚水溶液、甲醛溶液以及AgNO3溶液置于三口烧瓶中混合均匀，在磁力搅拌条件下加热至沸腾，随后加入氢氧化铵溶液，继续加热回流20～40min，自然冷却至室温，离心洗涤，在真空下干燥得到Ag@RF NPs；
②将步骤①中所得Ag@RF NPs置于氨气环境中，并称取80～120mg干燥的Ag@RFNPs置于干净的滤纸上，将滤纸放在盛有5～15mL浓度为20％～30％的氨水中，静置一定时间后将反应刻蚀后的纳米粒子溶于5～15mL水中，即得浓度为8～16mg/mL的Ag@RF-Ag NPs溶液。
步骤(2)中所述rGO/Fe3O4/Cu2O NSs溶液的制备方法是：取rGO/Fe3O4 NSs溶液加入到硝酸铜溶液中，室温超声20～30min，使溶液充分混合均匀，随后将NaOH溶液加入到混合体系中搅拌20～40min，待混合均匀后加入水合肼溶液，并在室温下搅拌30～50min，用水洗涤后离心取固相，将所得固相重新分散在超纯水中，得到rGO/Fe3O4/Cu2O NSs溶液。
步骤(1)中所述PSA适配体序列为5'-SH-(CH2)6-ATT AAA GCT CGCCAT CAA ATAGC-3'。
步骤(1)中所述Tris-硼酸(TBE)缓冲溶液的浓度为1-10mM，pH值为8.2～8.4；其中，Tris-硼酸(TBE)缓冲溶液、Ag@RF-Ag NPs溶液和腺上皮细胞分泌的特异性抗原PSA-Apt适配体溶液体积比为10～30:1～3:5～15。
步骤①中所述间苯二酚水溶液浓度为0.5～1.5mg/mL，甲醛溶液体积浓度为37％～40％，AgNO3溶液浓度为0.005～0.015mol/L，氢氧化铵溶液浓度为2～3wt％；其中间苯二酚水溶液、甲醛溶液、AgNO3溶液与氢氧化铵溶液的体积比为20～40:0.014～0.07:0.5～1.5:0.05～0.15。
步骤①中所述加热温度为90～110℃。
所述rGO/Fe3O4 NSs的浓度为6～10mg/mL，硝酸铜溶液的浓度为0.0005～0.0015g/mL，NaOH溶液的浓度为0.03～0.04mol/L，水合肼溶液浓度为80～90mmol/L，其中rGO/Fe3O4NSs溶液、硝酸铜溶液、NaOH溶液与水合肼溶液的体积比为：0.5～1.5:5～15:0.06～0.1:100～300。
所述前列腺特异性抗原检测的比率电化学传感器，所述的比率电化学传感器应用于检测前列腺上皮细胞分泌的特异性抗原PSA。
本发明有益的技术效果在于：
基于Ag@RF-Ag NPs中Ag NPs较强的电化学氧化峰与rGO/Fe3O4/Cu2O Ns中Cu2ONPs稳定的电化学氧化峰以及二者峰电位之间相距较远互不干扰的基础，以Ag@RF-Ag NPs中Ag NPs的电化学氧化峰作为检测信号，以rGO/Fe3O4/Cu2O Ns中Cu2O NPs的电化学氧化峰为参比信号，设计了具有磁性的比率电化学传感器。
该比率电化学传感器的检测原理为：PSA适配体先通过巯基与Ag@RF-Ag NPs连接，同时通过π-π堆集附在石墨烯表层，使得Ag@RF-Ag NPs与rGO/Fe3O4/Cu2O Ns相连接。从而电化学传感器在0.2伏～0.1伏之间产生Ag@RF-Ag NPs中Ag NPs的检测峰，-0.2伏～-0.1伏产生rGO/Fe3O4/Cu2O Ns中Cu2O NPs的参比峰。当加入PSA后，由于PSA与PSA适配体具有更好地结合力，使得Ag@RF-Ag NPs与rGO/Fe3O4/Cu2O Ns的连接断开，Ag@RF-Ag NPs从电极上脱落。从而导致检测峰电流强度减弱，而参比峰电流几乎不受影响，以此为基础设计了用于检测PSA的比率电化学传感器。其中较强的检测信号(Ag@RF-Ag NPs)扩展了检测的灵敏度，而稳定的参比信号(rGO/Fe3O4/Cu2O Ns)的存在很大的提高了检测的准确度，为有效检测PSA提供了契机。
与传统的单一信号检测相比，传统的单一信号检测的结果容易受外界环境的干扰，因此对实验环境及实验设备的要求较高。而该比率电化学生物传感器通过收集两种信号进行检测，这两种信号所受外界环境影响相似，将二者的比率作为输出信号可以得到更为准确、高灵敏度以及良好重现性的检测结果。
附图说明
图1是实施例2中制备的纳米材料的TEM粒径图，其中，图1A为合成的纳米材料Ag@RF NPs中Ag核的粒径统计，图1B为合成的整个纳米材料Ag@RF NPs的粒径统计；
图2是实施例2中制备得到的比率电化学传感器对PSA的检测结果图，其中A图表示MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极与不同浓度的PSA反应后，Ag NPs与Cu2O NPs的DPV电化学信号响应情况，B图表示Ag NPs的DPV电化学信号与Cu2O NPs的DPV电化学信号的比值和PSA浓度的对数值间的标准曲线。
图3是存在10ng/mL的其他干扰物质的情况下(AFP，CEA，Cys,，GSH，Trp)，评估实施例2构建的比率电化学传感器对PSA检测的特异性结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1：
1.材料的合成，具体方法如下：
(1)Ag@RF NPs的合成：将20mL0.5 mg/mL的间苯二酚水溶液，0.014mL37％甲醛溶液以及0.5mL0.005 mol/L的AgNO3混合在三口烧瓶里，在磁力搅拌下，90℃下加热至沸腾，之后加入0.05mL 2wt％的氢氧化铵溶液，继续回流20min，自然冷却至室温，离心洗涤，在真空下干燥，即得Ag@RF NPs；
(2)Ag@RF-Ag NPs的合成：将步骤(1)中制备得到的Ag@RF NPs置于氨气环境内，将80mg干燥的Ag@RF NPs置于干净的滤纸上，滤纸放在盛有5mL体积浓度为20％的氨水的20mL烧杯上进行刻蚀反应，静置一定时间后将刻蚀后的纳米粒子溶于5mL水中，即得浓度为16mg/mL的Ag@RF-Ag NPs溶液；
(3)Apt-Ag@RF-Ag NPs溶液制备：向TBE缓冲溶液中加入Ag@RF-Ag NPs溶液以及浓度为0.5μM的PSA-Apt溶液，室温下摇晃11h，之后离心去除上清液，将固相物质重新分散在超纯水中，即得Apt-Ag@RF-Ag NPs溶液；
(4)rGO/Fe3O4/Cu2O NSs溶液的制备方法是：取rGO/Fe3O4 NSs溶液加入到硝酸铜溶液中，室温超声20min，使溶液充分混合均匀，随后将NaOH溶液加入到混合体系中搅拌20min，待混合均匀后加入水合肼溶液，并在室温下搅拌30min，用水洗涤后并离心取固相，将所得固相重新分散在超纯水中，得到rGO/Fe3O4/Cu2O NSs溶液。
(5)MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极的制备：利用粒径为0.03μm的三氧化二铝抛光粉对直径为3mm的MGCE电极进行打磨，之后再依次用乙醇和超纯水超声洗涤，并吹干待用，将步骤(4)中所得5μL rGO/Fe3O4/Cu2O NSs溶液滴涂在电极表面，在室温下放置0.5h，得到MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O电极；随后将步骤(3)中所得5μL Apt-Ag@RF-Ag NPs溶液滴涂在MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O电极上，在35℃下孵育30min，之后用水冲洗电极，即得MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极；
(6)比率电化学传感器的构建：
在已构建好的比率电化学传感器的体系中，取5μL不同浓度的PSA标准溶液(0，10，100，500，1000，5000，10000，500000，100000，1000000pg/mL)加到电极表面，在35℃温度条件下孵育20min，冲洗电极，并通过微分脉冲伏安法(DPV)检测MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极信号，并分别记录测试数据中Ag NPs与Cu2O NPs的电化学响应情况，其中检测信号是Ag NPs在电势为+0.15V出现的氧化峰峰强度，参比信号是Cu2O NPs在电势为-0.2V出现的氧化峰峰强度，横坐标是PSA浓度的对数值，纵坐标是MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极测试数据中Ag NPs的氧化峰峰强度与Cu2O NPs的氧化峰峰强度的比值，建立MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极测试数据中Ag NPs的氧化峰峰强度与Cu2ONPs的氧化峰峰强度的比值和PSA浓度对数值间的标准曲线。
实施例2：
1.材料的合成，具体方法如下：
(1)Ag@RF NPs的合成：将30mL浓度为0.5mg/mL的间苯二酚水溶液，0.014mL体积浓度为38％甲醛溶液以及1mL浓度为0.01mol/L的AgNO3混合在三口烧瓶里，在磁力搅拌下，100℃加热至沸腾，之后加入0.1mL，2.5wt％的氢氧化铵溶液，继续回流30min，自然冷却至室温，离心洗涤，在真空下干燥，即得Ag@RF NPs，对合成的纳米材料Ag@RF NPs进行粒径分析，结果如图1所示(图1A为合成的纳米材料Ag@RF NPs中Ag核的粒径统计，图1B为合成的整个纳米材料Ag@RF NPs的粒径统计)。从图1A中可以看出Ag核的平均粒径为18.02±4.50nm，外层的聚合物RF壳的厚度为44.7±4.0nm(注：Ag@RF NPs由中心的Ag核和包裹着Ag核的RF壳组成，所以Ag核粒径+RF壳的厚度x2＝Ag@RF NPs粒径，可由此得出RF壳厚度)，形成的最终产物Ag@RF NPs的平均粒径为107.5±9.4nm。
(2)Ag@RF-Ag NPs的合成：为了更好的实现Ag为电化学信标的传感器的构建，将在氨气氛围内，实现Ag核的溶出，以及在RF表面上的原位还原形成Ag@RF-Ag NPs：将步骤(1)中制备得到的Ag@RF NPs置于氨气环境内，将100mg干燥的Ag@RF NPs置于干净的滤纸上，滤纸放在盛有10mL体积浓度为25％的氨水的20mL烧杯上进行刻蚀反应，静置一定时间后将刻蚀后的纳米粒子溶于10mL水中，即得浓度为10mg/mL的Ag@RF-Ag NPs溶液。
(3)Apt-Ag@RF-Ag NPs溶液制备：向TBE缓冲溶液中加入Ag@RF-Ag NPs溶液以及浓度为1μM的PSA-Apt溶液，室温下摇晃12h，之后离心去除上清液，将固相物质重新分散在超纯水中，即得Apt-Ag@RF-Ag NPs溶液；
(4)rGO/Fe3O4/Cu2O NSs溶液的制备方法是：取rGO/Fe3O4 NSs溶液加入到硝酸铜溶液中，室温超声25min，使溶液充分混合均匀，随后将NaOH溶液加入到混合体系中搅拌30min，待混合均匀后加入水合肼溶液，并在室温下搅拌40min，用水洗涤后并离心取固相，将所得固相重新分散在超纯水中，得到rGO/Fe3O4/Cu2O NSs溶液。
(5)MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极的制备：利用粒径为0.05μm的三氧化二铝抛光粉对直径为4mm的MGCE电极进行打磨，之后再依次用乙醇和超纯水超声洗涤，并吹干待用，将步骤(4)中所得10μL rGO/Fe3O4/Cu2O NSs溶液滴涂在电极表面，在室温下放置1h，得到MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O电极；随后将步骤(3)中所得10μL Apt-Ag@RF-Ag NPs溶液滴涂在MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O电极上，在37℃下孵育40min，之后用水冲洗电极，即得MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极；
(6)比率电化学传感器的构建：
在已构建好的比率电化学传感器的体系中，取10μL不同浓度的PSA标准溶液(10，50，100，500，1000，5000，10000，500000，100000，1000000pg/mL)加到电极表面，在37℃温度条件下孵育30min，冲洗电极，并通过微分脉冲伏安法(DPV)检测MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极的电化学信号响应情况，并分别记录测试数据中Ag NPs与Cu2O NPs的电化学信号响应情况，其中检测信号是Ag NPs在电势为+0.2V出现的氧化峰峰强度，参比信号是Cu2O NPs在电势为-0.15V出现的氧化峰峰强度，横坐标是PSA浓度的对数值，纵坐标是MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极测试数据中Ag NPs的氧化峰峰强度与Cu2O NPs的氧化峰峰强度的比值，建立MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极测试数据中Ag NPs的氧化峰峰强度与Cu2O NPs的氧化峰峰强度的比值和PSA浓度对数值间的标准曲线，结果如图2所示。
实施例3：
1.材料的合成，具体方法如下：
(1)Ag@RF NPs的合成：将40mL浓度为0.5mg/mL的间苯二酚水溶液，0.014mL体积浓度为40％甲醛溶液以及1.5mL浓度为0.015mol/L的AgNO3溶液混合在三口烧瓶里，在磁力搅拌下，110℃加热至沸腾，之后加入0.15mL，3wt％的氢氧化铵溶液，继续回流40min，自然冷却至室温，离心洗涤，在真空下干燥，即得Ag@RF NPs。
(2)Ag@RF-Ag NPs的合成：将步骤(1)中制备得到的Ag@RF NPs在氨气环境内，将120mg干燥的Ag@RF NPs置于干净的滤纸上，滤纸放在盛有15mL体积浓度为30％的氨水的20mL烧杯上，进行刻蚀反应，静置一定时间后将刻蚀后的纳米粒子溶于15mL水中，即得浓度为8mg/mL的Ag@RF-Ag NPs溶液。
(3)Apt-Ag@RF-Ag NPs溶液制备：向TBE缓冲溶液中加入Ag@RF-Ag NPs溶液以及浓度为1.5μM的PSA-Apt溶液，室温下摇晃13h，之后离心去除上清液，将固相物质重新分散在超纯水中，即得Apt-Ag@RF-Ag NPs溶液；
(4)rGO/Fe3O4/Cu2O NSs溶液的制备方法是：取rGO/Fe3O4 NSs溶液加入到硝酸铜溶液中，室温超声30min，使溶液充分混合均匀，随后将NaOH溶液加入到混合体系中搅拌40min，待混合均匀后加入水合肼溶液，并在室温下搅拌50min，用水洗涤后并离心取固相，将所得固相重新分散在超纯水中，得到rGO/Fe3O4/Cu2O NSs溶液。
(5)MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极的制备：利用粒径为0.07μm的三氧化二铝抛光粉对直径为5mm的MGCE电极进行打磨，之后再依次用乙醇和超纯水超声洗涤，并吹干待用，将步骤(4)中所得15μL rGO/Fe3O4/Cu2O NSs溶液滴涂在电极表面，在室温下放置1.5h，得到MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O电极；随后将步骤(3)中所得15μL Apt-Ag@RF-Ag NPs溶液滴涂在MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O电极上，在40℃下孵育50min，之后用水冲洗电极，即得MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极；
(6)比率电化学传感器的构建：在已构建好的比率电化学传感器的体系中，取15μL不同浓度的PSA标准溶液(10，100，200，400，600，800，1000，100000，100000，1000000pg/mL)加到电极表面，在40℃温度条件下孵育40min，冲洗电极，并通过微分脉冲伏安法(DPV)检测MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极的电化学信号响应情况，并分别记录测试数据中Ag NPs与Cu2O NPs的电化学信号响应情况，其中检测信号是Ag NPs在电势为+0.25V出现的氧化峰峰强度，参比信号是Cu2O NPs在电势为-0.1V出现的氧化峰峰强度，横坐标是PSA浓度的对数值，纵坐标是MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极测试数据中Ag NPs的氧化峰峰强度与Cu2O NPs的氧化峰峰强度的比值，建立MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极测试数据中Ag NPs的氧化峰峰强度与Cu2O NPs的氧化峰峰强度的比值和PSA浓度对数值间的标准曲线。
测试例
1，特异性测定
为了评估实施例2所构建的比率电化学传感器的特异性，将10μL质量浓度为1000pg/mL的PSA标准溶液分别与10μL质量浓度为10ng/mL的胚胎抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)，谷胱甘肽(GSH)，半胱氨酸(Cys)，色氨酸(Trp)均匀混合，形成混合溶液。然后取10μL不同混合溶液加到MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极表面，在37℃温度条件下孵育30min，用超纯水冲洗电极，检测MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极的电化学信号，并分别记录测试数据中Ag NPs与Cu2O NPs的电化学信号响应情况。其中在存在10ng/mL的其他干扰物质(AFP，CEA，Cys,，GSH，Trp)的情况下，实施例2构建的比率电化学传感器对PSA检测的特异性如图3所示(图中Id为Ag NPs的DPV电化学响应信号，Ir为Cu2O NPs的DPV电化学响应信号情况，纵坐标为Ag NPs的DPV氧化峰峰强度与Cu2O NPs的DPV氧化峰峰强度的比值，横坐标为PSA标准液以及不同的混合液)。由图3可知，在存在不同的干扰物质的情况下，该比率电化学传感器对应的纵坐标(Ag NPs的DPV电化学响应信号与Cu2O NPs的DPV电化学响应信号的比值)几乎没有发生变化，这就进一步证实了实例2所构建的比率电化学传感器对于PSA的测定具有良好的特异性。
(2)准确性测定
将4mL的人体血液样品在8000r/min的转速下离心取固相，将得到的固相重新分散在pH＝7.4的4mL浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液(PBS)中。向人体血清中加入不同浓度的PSA标准溶液分别记录为1号样(PSA质量浓度为500pg/mL)，2号样(PSA质量浓度为1000pg/mL)，3号样(PSA质量浓度为4000pg/mL)，4号样(PSA质量浓度为5000pg/mL)，然后各取10μL不同样品加到实施例2中制备得到的比率电化学传感器体系MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极表面，在37℃温度条件下孵育30min，用超纯水冲洗电极，检测MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极的电化学信号，并分别记录测试数据中Ag NPs与Cu2O NPs的DPV电化学信号响应情况以此检测PSA含量。最终检测所得的人体血清中PSA的回收率为98.5％-102.4％(1号样回收率为102.4％，2号样回收率为98.5％，3号样回收率为100.3％，4号样回收率为98.5％)。由回收率可知，实施例2所构建的比率电化学传感器对于PSA的测定具有良好的准确性。

Claims (9)

1.一种前列腺特异性抗原检测的比率电化学传感器的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
(1)Apt-Ag@RF-Ag NPs溶液的制备：
向Tris-硼酸TBE缓冲溶液中加入Ag@RF-Ag NPs溶液以及浓度为0.5～1.5μM的前列腺上皮细胞分泌的特异性抗原适配体溶液，室温下摇晃11～13h，之后离心去除上清液，将固相物质重新分散在超纯水中，即得Apt-Ag@RF-Ag NPs溶液；
(2)MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极的制备：
利用粒径为0.03～0.07μm的三氧化二铝抛光粉对直径为3～5mm的MGCE电极进行打磨，之后再依次用乙醇和超纯水超声洗涤，并吹干待用，将rGO/Fe3O4/Cu2O NSs溶液滴涂在电极表面，在室温下放置0.5～1.5h，得到MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O电极；随后将步骤(1)中所得Apt-Ag@RF-Ag NPs溶液滴涂在MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O电极上，在30～40℃下孵育30～50min，之后用水冲洗电极，即得MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极；
(3)比率电化学传感器的构建：
取5～15μL一系列不同浓度的PSA标准溶液加到电极表面，在35～40℃温度条件下孵育20～40min，冲洗电极，通过微分脉冲伏安法DPV检测MGCE/rGO/Fe3O4/Cu2O-Apt-Ag@RF-Ag电极的电化学信号，并分别记录测试数据中Ag NPs与Cu2O NPs的电化学响应情况，横坐标是PSA浓度的对数值，纵坐标是Ag NPs的氧化峰峰强度与Cu2O NPs的氧化峰峰强度的比值，建立Ag NPs的氧化峰峰强度与Cu2O NPs的氧化峰峰强度的比值和PSA浓度对数值间的标准曲线。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述Ag@RF-Ag NPs溶液的制备步骤如下：
①将间苯二酚水溶液、甲醛溶液以及AgNO3溶液置于三口烧瓶中混合均匀，在磁力搅拌条件下加热至沸腾，随后加入氢氧化铵溶液，继续加热回流20～40min，自然冷却至室温，离心洗涤，在真空下干燥得到Ag@RF NPs；
②将步骤①中所得Ag@RF NPs置于氨气环境中，并称取80～120mg干燥的Ag@RF NPs置于干净的滤纸上，将滤纸放在盛有5～15mL浓度为20％～30％的氨水中，静置一定时间后将反应刻蚀后的纳米粒子溶于5～15mL水中，即得浓度为8～16mg/mL的Ag@RF-Ag NPs溶液。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述rGO/Fe3O4/Cu2O NSs溶液的制备方法是：取rGO/Fe3O4 NSs溶液加入到硝酸铜溶液中，室温超声20～30min，使溶液充分混合均匀，随后将NaOH溶液加入到混合体系中搅拌20～40min，待混合均匀后加入水合肼溶液，并在室温下搅拌30～50min，用水洗涤后离心取固相，将所得固相重新分散在超纯水中，得到rGO/Fe3O4/Cu2O NSs溶液。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述PSA适配体序列为5'-SH-(CH2)6-ATT AAA GCT CGCCAT CAA ATA GC-3'。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述Tris-硼酸TBE缓冲溶液的浓度为1-10mM，pH值为8.2～8.4；其中，Tris-硼酸TBE缓冲溶液、Ag@RF-Ag NPs溶液和腺上皮细胞分泌的特异性抗原PSA-Apt适配体溶液体积比为10～30:1～3:5～15。
6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤①中所述间苯二酚水溶液浓度为0.5～1.5mg/mL，甲醛溶液体积浓度为37％～40％，AgNO3溶液浓度为0.005～0.015mol/L，氢氧化铵溶液浓度为2～3wt％；其中间苯二酚水溶液、甲醛溶液、AgNO3溶液与氢氧化铵溶液的体积比为20～40:0.014～0.07:0.5～1.5:0.05～0.15。
7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤①中所述加热温度为90～110℃。
8.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述rGO/Fe3O4 NSs的浓度为6～10mg/mL，硝酸铜溶液的浓度为0.0005～0.0015g/mL，NaOH溶液的浓度为0.03～0.04mol/L，水合肼溶液浓度为80～90mmol/L，其中rGO/Fe3O4 NSs溶液、硝酸铜溶液、NaOH溶液与水合肼溶液的体积比为：0.5～1.5:5～15:0.06～0.1:100～300。
9.一种权利要求1所述构建方法制得的前列腺特异性抗原检测的比率电化学传感器，其特征在于，所述的比率电化学传感器应用于检测前列腺上皮细胞分泌的特异性抗原PSA。
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