CN108426931A - 一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫分析和生物传感检测技术领域，具体涉及一种基于Hemin‑rGO的电化学免疫传感器的制备方法及应用。本发明利用负载银纳米粒子的微孔碳球间隔的Hemin‑rGO多孔复合材料作为检测抗体标记物，构建的夹心型电化学免疫传感器实现了肿瘤标志物癌胚抗原的检测，具备灵敏度高，特异性强，成本低、检测限低等优点，对肺癌的早期诊断及病情监测具有重要的科学意义和应用价值。

Description

一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器的制备方法及应用，具体是采用负载银纳米粒子的微孔碳球间隔的Hemin-rGO多孔复合材料作为检测抗体标记物，实现了对肿瘤标志物癌胚抗原的灵敏测定。
背景技术
癌症是严重威胁人类健康的高发病率和高死亡率的疾病。据世界卫生组织(WHO)2018年2月的最新数据，近六分之一的死亡由癌症造成，并预计在今后二十年新发病例数将持续增加，癌症已经成为导致人类死亡的主要“杀手”之一。早期癌症病人的治愈率可达80%以上，但癌症早期发现和诊断存在一定困难，对其相关癌症肿瘤标志物的检测是早期发现癌症的重要途径。肿瘤标志物在癌症的早期阶段含量往往很低，因此，发展高灵敏度、高精度、高选择性的早期癌症诊断方法十分迫切。
近年来，随着肿瘤标志物早期检测研究的进行，电化学免疫传感器脱颖而出，在肿瘤标志物的检测中展现了较高的灵敏度、较好的选择性和重现性以及较广的检测范围，受到广泛关注。在利用电化学免疫传感器检测肿瘤标志物时，被测样品的预处理简单，检测过程操作简便，检测迅速，总体成本较低，在肿瘤标志物的临床检测中具有很好的应用前景。本发明以金纳米粒子（Au NPs）为基底材料，以负载银纳米粒子的微孔碳球间隔的Hemin-石墨烯多孔复合材料（Ag NPs@CS/Hemin-rGO）为检测抗体标记物制备电化学免疫传感器，以H2O2的还原反应为电响应信号来源，用于肿瘤标记物的精确定量检测。
Au NPs具有良好的导电性和生物相容性，其作为电化学免疫传感器工作电极的基底材料不仅能够高效传递电荷，而且可以为捕获抗体的孵化提供良好的微环境，稳定地结合捕获抗体，从而提高电化学免疫传感器工作电极传感界面构筑的稳定性。以负载银纳米粒子的微孔碳球（Ag NPs@CS）作为Hemin-rGO的间隔器，不仅有效克服了Hemin-rGO易发生不可逆堆叠的缺点，保持了Hemin-rGO对催化H2O2还原的有效性，而且使复合材料（Ag NPs@CS/Hemin-rGO）形成了复杂的层隙孔结构，对电解液中的H2O2具有了一定地吸附能力，提高H2O2的反应量，并提供了大的比表面积和大量的催化活性位点，高效催化H2O2的还原，有效放大了电响应信号，提升电化学免疫传感器的灵敏度。
本发明所构建的电化学免疫传感器实现了肿瘤标志物癌胚抗原的定量灵敏检测，检测限低，并具有良好的选择性、重现性和稳定性，为癌症的早期临床检测提供可靠的诊断依据。
发明内容：
本发明提供了一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器的制备方法及应用，实现了癌胚抗原的高灵敏检测。
本发明目的之一是提供一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器的制备方法。
本发明目的之二是将所制备的基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器应用于癌胚抗原的高灵敏、特异性检测。
本发明采用的技术方案，包括以下步骤。
1．一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将直径为4mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）取6.0 µL的Au NPs溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水清洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、10 ~ 20 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，置于4.0 °C冰箱中晾干；
（4）将3.0 µL、0.5~ 1.5%的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液清洗电极表面，置于4.0 °C冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、10fg/mL ~ 200 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，置于4.0 °C冰箱中30 ~ 40 min后，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液清洗，置于4.0 °C冰箱中晾干；
（6）滴加6.0 µL、0.5 ~ 3.0 mg/mL的AgNPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液，置于4.0 °C冰箱中30~ 40 min后，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液清洗，置于4.0 °C冰箱中晾干，得到一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器。
2．所述Au NPs溶液的制备，步骤如下：
将0.5 ~ 1.5 mL、质量分数为1.0%的氯金酸溶液加入到500 mL三口烧瓶中，继续加入99 mL的超纯水后，在磁力搅拌下，100℃油浴加热15 ~ 25min后，加入1.5 ~ 3.5mL、质量分数为1.0%的柠檬酸钠溶液，继续100℃油浴加热10 ~ 20 min，冷却至室温，得到Au NPs溶液。
3．所述Ag NPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液的制备，包括以下步骤：
（1）Ag NPs@CS的制备
将0.5 ~ 1.0 mL、25.0%的氨水加入100 ~ 200 mL、30.0%的乙醇溶液中，磁力搅拌50 ~100 min后，加入1.0 ~ 2.0 g间苯二酚，在30 ℃水浴下磁力搅拌50 ~ 100 min后，加入1.0~ 2.0 mL、37%的甲醛溶液，继续磁力搅拌24 h后，转移到真空干燥箱中，100℃下老化24 h，离心，将沉淀物置于60℃真空干燥箱中干燥24 h，取出研磨，得到酚醛树脂微球；
取0.1 ~ 0.3 g酚醛树脂微球置于玛瑙研钵中，加入0.1 ~ 0.3 mL超纯水，继续加入45~ 150 mg的氢氧化钾，研磨60 ~ 120 min后，加入1mL无水乙醇离心，在室温下晾干并研磨后，放入管式电阻炉内，在氮气保护下，300℃保温60min，继续升温至600℃并保温180 min，冷却至室温后，用10.0%的盐酸洗涤，抽滤至滤液为中性后，置于60℃真空干燥箱中干燥24h，制得CS；
称取100 mg的CS，超声分散到40~ 50mL超纯水中，加入1.0 mL、50 mmol/L的硝酸银溶液和1.0 mL新配制的质量分数为5.0%的柠檬酸钠溶液，在室温下磁力搅拌1.0 ~ 3.0 min后，加入0.3 ~ 1.0 mL新配制的10.0 mmol/L的硼氢化钠溶液，磁力搅拌6 ~ 10 h后，在10000 rpm下离心10 min，将沉淀物置于真空干燥箱中，在30 ℃干燥24h，得到Ag NPs@CS；
（2）Hemin-rGO的制备
量取90~ 100 mL浓硫酸加入到1000 mL烧杯中，在0 ℃冰浴并磁力搅拌下，缓慢加入2.0 g石墨粉，搅拌均匀后，加入0.5 ~ 1.5 g硝酸钠，继续缓慢加入10 ~ 15 g高锰酸钾，在0 ℃冰浴下磁力搅拌60~ 120min后，移入50℃水浴，磁力搅拌90 ~ 150 min后，将水浴温度升至55℃，磁力搅拌2 ~ 3 h，逐滴加入50 ~ 100 mL超纯水后，继续缓慢加入200 mL的超纯水，磁力搅拌10 ~ 20min，然后匀速加入10 ~ 20 mL、质量分数为30%的H2O2，搅拌10 ~15min，在室温下静置12h，取下层沉淀离心，超纯水清洗后，将沉淀物移入透析带并密封，置于1000 mL烧杯中，加入800 mL超纯水透析4 ~ 5天后，取1.0 g沉淀物，加入200 ~ 400 mL超纯水，超声20 ~ 30 min，在3000 rpm下离心5 ~ 10 min，取上清液，继续以4500 rpm离心2 ~ 5 min，将此次得到的上清液置于100 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12 h后，放入冷冻干燥机中，-80 ℃下冷冻干燥后，得到GO；
取99.9 mL超纯水置于250 mL烧杯中，在磁力搅拌下，加入100 mg的GO，超声10~ 30min后，在磁力搅拌下加入5.0 ~ 10.0 g的2-氨基吡啶和5.0 mg的氯高铁血红素Hemin，超声20 ~ 40 min后，将上述混合物转移到聚四氟乙烯高压反应釜中，130℃下保温24~36h后，在8000 rpm下离心10 min，将沉淀物移入50 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12 h后，放入冷冻干燥机中，-80 ℃下冷冻干燥后得到Hemin-rGO；
（3）Ag NPs@CS/Hemin-rGO的制备
取20 mL超纯水置于100 mL烧杯中，在磁力搅拌下，每隔5min，分别依次加入0.1 ~ 0.2mL、10.0 mg/mL的Hemin-rGO和0.1 ~ 0.2 mL、10 mg/mL的Ag NPs@CS，直至加入5.0 mL的Hemin-rGO和5.0 mL的Ag NPs@CS，继续搅拌1 ~ 3 h，将得到的分散液置于100 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12h后，放入冷冻干燥机中，-80 ℃下冷冻干燥，得到Ag NPs@CS/Hemin-rGO；
（4）Ag NPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液的制备
取6.0 ~ 12.0 mg的Ag NPs@CS/Hemin-rGO加入2.0 mL的pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，超声10 ~ 20 min后，加入2.0 mL、20.0 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2，置于4.0°C恒温振荡器中振荡8 ~12h，得到Ag NPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液，4.0°C冰箱中保存备用。
4.癌胚抗原的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，与所制备的传感器为工作电极构成三电极系统，在10.0 mL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法在初始电位为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间为400.0 s；
（3）当背景电流稳定后，向10.0 mL、pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10.0 μL、5.0 mol/L的H2O2，电流再次稳定后，记录电流的变化；
（4）采用不同浓度的肿瘤标志物抗原进行测定，记录不同浓度肿瘤标志物抗原所对应的电流值变化；
（5）利用工作曲线法，得到待测样品中肿瘤标志物抗原的浓度。
上述肿瘤标志物为癌胚抗原。
本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1）本发明制备了一种基于Hemin-rGO电化学免疫传感器，具有检出限低，线性范围宽，灵敏度高，操作简单以及成本低等优势，对肿瘤标志物的高灵敏度、高选择性定量检测有良好的应用前景。
（2）本发明以Au NPs作为电化学免疫传感器工作电极的基底材料，不仅能够高效传递电荷，而且可以稳定地结合捕获抗体，从而提高电化学免疫传感器工作电极检测的灵敏度和传感界面构筑的稳定性。
（3）本发明将一种基于Hemin-rGO的多孔复合材料作为标记物，用于实现信号放大，以Ag NPs@CS作为Hemin-rGO的间隔器，形成了一种具有复杂孔隙结构的复合材料AgNPs@CS/Hemin-rGO，其多层多孔的结构能够形成大量的反应活性位点，高效催化H2O2的还原，有效放大电响应信号，提升了电化学免疫传感器的灵敏度。
（4）一种基于Hemin-rGO电化学免疫传感器，实现了对癌胚抗的灵敏检测，对癌胚抗原检测的线性范围是20fg/mL~200ng/mL，检测限低至6.7 fg/mL，表明一种基于Hemin-rGO电化学免疫传感器可以达到准确测定的目的。
具体实施方式
现将本发明具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将直径为4mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）取6.0 µL的Au NPs溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水清洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、10 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，置于4.0 °C冰箱中晾干；
（4）将3.0 µL、0.5%的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液清洗电极表面，置于4.0 °C冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、10fg/mL ~ 200 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，置于4.0 °C冰箱中30 min后，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液清洗，置于4.0 °C冰箱中晾干；
（6）滴加6.0 µL、0.5 mg/mL的AgNPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液，置于4.0 °C冰箱中30min后，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液清洗，置于4.0 °C冰箱中晾干，得到一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器。
实施例2一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将直径为4mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）取6.0 µL的Au NPs溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水清洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、15 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，置于4.0 °C冰箱中晾干；
（4）将3.0 µL、1.0%的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液清洗电极表面，置于4.0 °C冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、10fg/mL ~ 200 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，置于4.0 °C冰箱中35 min后，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液清洗，置于4.0 °C冰箱中晾干；
（6）滴加6.0 µL、2.0 mg/mL的AgNPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液，置于4.0 °C冰箱中35min后，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液清洗，置于4.0 °C冰箱中晾干，得到一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器。
实施例3一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将直径为4mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）取6.0 µL的Au NPs溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水清洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、20 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，置于4.0 °C冰箱中晾干；
（4）将3.0 µL、1.5%的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液清洗电极表面，置于4.0 °C冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、10fg/mL ~ 200 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，置于4.0 °C冰箱中40 min后，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液清洗，置于4.0 °C冰箱中晾干；
（6）滴加6.0 µL、3.0 mg/mL的AgNPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液，置于4.0 °C冰箱中40min后，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液清洗，置于4.0 °C冰箱中晾干，得到一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器。
实施例4将0.5 mL、质量分数为1.0%的氯金酸溶液加入到500 mL三口烧瓶中，继续加入99 mL的超纯水后，在磁力搅拌下，100℃油浴加热15 min后，加入1.5 mL、质量分数为1.0%的柠檬酸钠溶液，继续100℃油浴加热10 min，冷却至室温，得到Au NPs溶液。
实施例5将1.0 mL、质量分数为1.0%的氯金酸溶液加入到500 mL三口烧瓶中，继续加入99 mL的超纯水后，在磁力搅拌下，100℃油浴加热20 min后，加入2.5mL、质量分数为1.0%的柠檬酸钠溶液，继续100℃油浴加热15 min，冷却至室温，得到Au NPs溶液。
实施例6将1.5 mL、质量分数为1.0%的氯金酸溶液加入到500 mL三口烧瓶中，继续加入99 mL的超纯水后，在磁力搅拌下，100℃油浴加热25 min后，加入3.5mL、质量分数为1.0%的柠檬酸钠溶液，继续100℃油浴加热20 min，冷却至室温，得到Au NPs溶液。
实施例7所述Ag NPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液的制备，包括以下步骤：
（1）Ag NPs@CS的制备
将0.5 mL、25.0%的氨水加入100 mL、30.0%的乙醇溶液中，磁力搅拌50 min后，加入1.0g间苯二酚，在30℃水浴下磁力搅拌50 min后，加入1.0 mL、37%的甲醛溶液，继续磁力搅拌24 h后，转移到真空干燥箱中，100℃下老化24 h，离心，将沉淀物置于60℃真空干燥箱中干燥24 h，取出研磨，得到酚醛树脂微球；
取0.1 g酚醛树脂微球置于玛瑙研钵中，加入0.1 mL超纯水，继续加入45 mg的氢氧化钾，研磨60 min后，加入1mL无水乙醇离心，在室温下晾干并研磨后，放入管式电阻炉内，在氮气保护下，300℃保温60min，继续升温至600℃并保温180 min，冷却至室温后，用10.0%的盐酸洗涤，抽滤至滤液为中性后，置于60℃真空干燥箱中干燥24h，制得CS；
称取100 mg的CS，超声分散到40 mL超纯水中，加入1.0 mL、50 mmol/L的硝酸银溶液和1.0 mL新配制的质量分数为5.0%的柠檬酸钠溶液，在室温下磁力搅拌1.0 min后，加入0.3mL新配制的10.0 mmol/L的硼氢化钠溶液，磁力搅拌6 h后，在10000 rpm下离心10 min，将沉淀物置于真空干燥箱中，在30 ℃干燥24h，得到Ag NPs@CS；
（2）Hemin-rGO的制备
量取90 mL浓硫酸加入到1000 mL烧杯中，在0 ℃冰浴并磁力搅拌下，缓慢加入2.0 g石墨粉，搅拌均匀后，加入0.5 g硝酸钠，继续缓慢加入10 g高锰酸钾，在0 ℃冰浴下磁力搅拌60 min后，移入50 ℃水浴，磁力搅拌90 min后，将水浴温度升至55℃，磁力搅拌2 h，逐滴加入50 mL超纯水后，继续缓慢加入200 mL的超纯水，磁力搅拌10 min，然后匀速加入10 mL、质量分数为30%的H2O2，搅拌10 min，在室温下静置12h，取下层沉淀离心，超纯水清洗后，将沉淀物移入透析带并密封，置于1000 mL烧杯中，加入800 mL超纯水透析4天后，取1.0 g沉淀物，加入200 mL超纯水，超声20 min，在3000 rpm下离心5 min，取上清液，继续以4500rpm离心2 min，将此次得到的上清液置于100 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12 h后，放入冷冻干燥机中，-80 ℃下冷冻干燥后，得到GO；
取99.9 mL超纯水置于250 mL烧杯中，在磁力搅拌下，加入100 mg的GO，超声10 min后，在磁力搅拌下加入5.0 g的2-氨基吡啶和5.0 mg的氯高铁血红素Hemin，超声20 min后，将上述混合物转移到聚四氟乙烯高压反应釜中，130℃下保温24h后，在8000 rpm下离心10min，将沉淀物移入50 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12 h后，放入冷冻干燥机中，-80℃下冷冻干燥后得到Hemin-rGO；
（3）Ag NPs@CS/Hemin-rGO的制备
取20 mL超纯水置于100 mL烧杯中，在磁力搅拌下，每隔5min，分别依次加入0.1 mL、10.0 mg/mL的Hemin-rGO和0.1 mL、10 mg/mL的Ag NPs@CS，直至加入5.0 mL的Hemin-rGO和5.0 mL的Ag NPs@CS，继续搅拌1 h，将得到的分散液置于100 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12h后，放入冷冻干燥机中，-80 ℃下冷冻干燥，得到Ag NPs@CS/Hemin-rGO；
（4）Ag NPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液的制备
取6.0 mg的Ag NPs@CS/Hemin-rGO加入2.0 mL的pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，超声10min后，加入2.0 mL、20.0 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2，置于4.0°C恒温振荡器中振荡8h，得到Ag NPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液，4.0°C冰箱中保存备用。
实施例8所述Ag NPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液的制备，包括以下步骤：
（1）Ag NPs@CS的制备
将0.7 mL、25.0%的氨水加入150 mL、30.0%的乙醇溶液中，磁力搅拌75 min后，加入1.5g间苯二酚，在30 ℃水浴下磁力搅拌75 min后，加入1.5 mL、37%的甲醛溶液，继续磁力搅拌24 h后，转移到真空干燥箱中，100℃下老化24 h，离心，将沉淀物置于60℃真空干燥箱中干燥24 h，取出研磨，得到酚醛树脂微球；
取0.2 g酚醛树脂微球置于玛瑙研钵中，加入0.2 mL超纯水，继续加入100 mg的氢氧化钾，研磨90 min后，加入1mL无水乙醇离心，在室温下晾干并研磨后，放入管式电阻炉内，在氮气保护下，300℃保温60min，继续升温至600℃并保温180 min，冷却至室温后，用10.0%的盐酸洗涤，抽滤至滤液为中性后，置于60℃真空干燥箱中干燥24h，制得CS；
称取100 mg的CS，超声分散到45 mL超纯水中，加入1.0 mL、50 mmol/L的硝酸银溶液和1.0 mL新配制的质量分数为5.0%的柠檬酸钠溶液，在室温下磁力搅拌2.0 min后，加入0.7mL新配制的10.0 mmol/L的硼氢化钠溶液，磁力搅拌8 h后，在10000 rpm下离心10 min，将沉淀物置于真空干燥箱中，在30 ℃干燥24h，得到Ag NPs@CS；
（2）Hemin-rGO的制备
量取95 mL浓硫酸加入到1000 mL烧杯中，在0 ℃冰浴并磁力搅拌下，缓慢加入2.0 g石墨粉，搅拌均匀后，加入1.0 g硝酸钠，继续缓慢加入12.5 g高锰酸钾，在0 ℃冰浴下磁力搅拌90min后，移入50℃水浴，磁力搅拌120 min后，将水浴温度升至55℃，磁力搅拌2.5 h，逐滴加入75 mL超纯水后，继续缓慢加入200 mL的超纯水，磁力搅拌15 min，然后匀速加入15mL、质量分数为30%的H2O2，搅拌12 min，在室温下静置12 h，取下层沉淀离心，超纯水清洗后，将沉淀物移入透析带并密封，置于1000 mL烧杯中，加入800 mL超纯水透析4.5天后，取1.0 g沉淀物，加入300 mL超纯水，超声25 min，在3000 rpm下离心7 min，取上清液，继续以4500 rpm离心3 min，将此次得到的上清液置于100 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12 h后，放入冷冻干燥机中，-80 ℃下冷冻干燥后，得到GO；
取99.9 mL超纯水置于250 mL烧杯中，在磁力搅拌下，加入100 mg的GO，超声20 min后，在磁力搅拌下加入7.5 g的2-氨基吡啶和5.0 mg的氯高铁血红素Hemin，超声30 min后，将上述混合物转移到聚四氟乙烯高压反应釜中，130℃下保温30 h后，在8000 rpm下离心10min，将沉淀物移入50 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12 h后，放入冷冻干燥机中，-80℃下冷冻干燥后得到Hemin-rGO；
（3）Ag NPs@CS/Hemin-rGO的制备
取20 mL超纯水置于100 mL烧杯中，在磁力搅拌下，每隔5min，分别依次加入0.15 mL、10.0 mg/mL的Hemin-rGO和0.15 mL、10 mg/mL的Ag NPs@CS，直至加入5.0 mL的Hemin-rGO和5.0 mL的Ag NPs@CS，继续搅拌2 h，将得到的分散液置于100 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12h后，放入冷冻干燥机中，-80 ℃下冷冻干燥，得到Ag NPs@CS/Hemin-rGO；
（4）Ag NPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液的制备
取10.0 mg的Ag NPs@CS/Hemin-rGO加入2.0 mL的pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，超声15min后，加入2.0 mL、20.0 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2，置于4.0℃恒温振荡器中振荡8~12h，得到Ag NPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液，4.0℃冰箱中保存备用。
实施例9所述Ag NPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液的制备，包括以下步骤：
（1）Ag NPs@CS的制备
将1.0 mL、25.0%的氨水加入200 mL、30.0%的乙醇溶液中，磁力搅拌100 min后，加入2.0 g间苯二酚，在30 ℃水浴下磁力搅拌100 min后，加入2.0 mL、37%的甲醛溶液，继续磁力搅拌24 h后，转移到真空干燥箱中，100℃下老化24 h，离心，将沉淀物置于60℃真空干燥箱中干燥24 h，取出研磨，得到酚醛树脂微球；
取0.3 g酚醛树脂微球置于玛瑙研钵中，加入0.3 mL超纯水，继续加入150 mg的氢氧化钾，研磨120 min后，加入1mL无水乙醇离心，在室温下晾干并研磨后，放入管式电阻炉内，在氮气保护下，300℃保温60min，继续升温至600℃并保温180 min，冷却至室温后，用10.0%的盐酸洗涤，抽滤至滤液为中性后，置于60℃真空干燥箱中干燥24h，制得CS；
称取100 mg的CS，超声分散到50mL超纯水中，加入1.0 mL、50 mmol/L的硝酸银溶液和1.0 mL新配制的质量分数为5.0%的柠檬酸钠溶液，在室温下磁力搅拌3 min后，加入1.0 mL新配制的10.0 mmol/L的硼氢化钠溶液，磁力搅拌10 h后，在10000 rpm下离心10 min，将沉淀物置于真空干燥箱中，在30 ℃干燥24h，得到Ag NPs@CS；
（2）Hemin-rGO的制备
量取100 mL浓硫酸加入到1000 mL烧杯中，在0 ℃冰浴并磁力搅拌下，缓慢加入2.0 g石墨粉，搅拌均匀后，加入1.5 g硝酸钠，继续缓慢加入15 g高锰酸钾，在0 ℃冰浴下磁力搅拌120min后，移入50℃水浴，磁力搅拌150 min后，将水浴温度升至55℃，磁力搅拌3 h，逐滴加入100 mL超纯水后，继续缓慢加入200 mL的超纯水，磁力搅拌20 min，然后匀速加入20mL、质量分数为30%的H2O2，搅拌15 min，在室温下静置12 h，取下层沉淀离心，超纯水清洗后，将沉淀物移入透析带并密封，置于1000 mL烧杯中，加入800 mL超纯水透析5天后，取1.0g沉淀物，加入400 mL超纯水，超声30 min，在3000 rpm下离心10 min，取上清液，继续以4500 rpm离心5 min，将此次得到的上清液置于100 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12 h后，放入冷冻干燥机中，-80 ℃下冷冻干燥后，得到GO；
取99.9 mL超纯水置于250 mL烧杯中，在磁力搅拌下，加入100 mg的GO，超声30 min后，在磁力搅拌下加入10.0 g的2-氨基吡啶和5.0 mg的氯高铁血红素Hemin，超声40 min后，将上述混合物转移到聚四氟乙烯高压反应釜中，130℃下保温36 h后，在8000 rpm下离心10min，将沉淀物移入50 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12 h后，放入冷冻干燥机中，-80℃下冷冻干燥后得到Hemin-rGO；
（3）Ag NPs@CS/Hemin-rGO的制备
取20 mL超纯水置于100 mL烧杯中，在磁力搅拌下，每隔5min，分别依次加入0.2 mL、10.0 mg/mL的Hemin-rGO和0.2 mL、10 mg/mL的Ag NPs@CS，直至加入5.0 mL的Hemin-rGO和5.0 mL的Ag NPs@CS，继续搅拌3 h，将得到的分散液置于100 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12h后，放入冷冻干燥机中，-80 ℃下冷冻干燥，得到Ag NPs@CS/Hemin-rGO；
（4）Ag NPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液的制备
取12.0 mg的Ag NPs@CS/Hemin-rGO加入2.0 mL的pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，超声20min后，加入2.0 mL、20.0 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2，置于4.0°C恒温振荡器中振荡12 h，得到Ag NPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液，4.0°C冰箱中保存备用。
实施例10癌胚抗原的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，与所制备的传感器为工作电极构成三电极系统，在10.0 mL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法在初始电位为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间为400.0 s；
（3）当背景电流稳定后，向10.0 mL、pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10.0 μL、5.0 mol/L的H2O2，电流再次稳定后，记录电流的变化；
（4）采用不同浓度的肿瘤标志物抗原进行测定，记录不同浓度肿瘤标志物抗原所对应的电流值变化；
（5）根据所得电流强度与癌胚抗原浓度之间的线性关系，绘制工作曲线，测得制备的传感器对癌胚抗原检测的线性范围为20fg/mL ~ 200ng/mL，检测限为6.7fg/mL。

Claims (5)

1.一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）取6.0 µL的Au NPs溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水清洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、10 ~ 20 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，置于4.0°C冰箱中晾干；
（4）将3.0 µL、0.5~ 1.5%的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液清洗电极表面，置于4.0 °C冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、10fg/mL ~ 200 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，置于4.0 °C冰箱中30 ~ 40 min后，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液清洗，置于4.0 °C冰箱中晾干；
（6）滴加6.0 µL、0.5 ~ 3.0 mg/mL的AgNPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液，置于4.0 °C冰箱中30~ 40 min后，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液清洗，置于4.0 °C冰箱中晾干，得到一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器。
2.如权利要求1所述的一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器的制备方法，所述AuNPs溶液的制备，步骤如下：
将0.5 ~ 1.5 mL、质量分数为1.0%的氯金酸溶液加入到500 mL三口烧瓶中，继续加入99 mL的超纯水后，在磁力搅拌下，100℃油浴加热15 ~ 25min后，加入1.5 ~ 3.5mL、质量分数为1.0%的柠檬酸钠溶液，继续100℃油浴加热10 ~ 20 min，冷却至室温，得到Au NPs溶液。
3.如权利要求1所述的一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器的制备方法，所述AgNPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液的制备，包括以下步骤：
（1）Ag NPs@CS的制备
将0.5 ~ 1.0 mL、25.0%的氨水加入100 ~ 200 mL、30.0%的乙醇溶液中，磁力搅拌50 ~100 min后，加入1.0 ~ 2.0 g间苯二酚，在30 ℃水浴下磁力搅拌50 ~ 100 min后，加入1.0~ 2.0 mL、37%的甲醛溶液，继续磁力搅拌24 h后，转移到真空干燥箱中，100℃下老化24 h，离心，将沉淀物置于60℃真空干燥箱中干燥24 h，取出研磨，得到酚醛树脂微球；
取0.1 ~ 0.3 g酚醛树脂微球置于玛瑙研钵中，加入0.1 ~ 0.3 mL超纯水，继续加入45~ 150 mg的氢氧化钾，研磨60 ~ 120 min后，加入1mL无水乙醇离心，在室温下晾干并研磨后，放入管式电阻炉内，在氮气保护下，300℃保温60min，继续升温至600 ℃并保温180min，冷却至室温后，用10.0%的盐酸洗涤，抽滤至滤液为中性后，置于60 ℃真空干燥箱中干燥24 h，制得CS；
称取100 mg的CS，超声分散到40~ 50mL超纯水中，加入1.0 mL、50 mmol/L的硝酸银溶液和1.0 mL新配制的质量分数为5.0%的柠檬酸钠溶液，在室温下磁力搅拌1.0 ~ 3.0 min后，加入0.3 ~ 1.0 mL新配制的10.0 mmol/L的硼氢化钠溶液，磁力搅拌6 ~ 10 h后，在10000 rpm下离心10 min，将沉淀物置于真空干燥箱中，在30 ℃干燥24h，得到Ag NPs@CS；
（2）Hemin-rGO的制备
量取90~ 100 mL浓硫酸加入到1000 mL烧杯中，在0 ℃冰浴并磁力搅拌下，缓慢加入2.0 g石墨粉，搅拌均匀后，加入0.5 ~ 1.5 g硝酸钠，继续缓慢加入10 ~ 15 g高锰酸钾，在0 ℃冰浴下磁力搅拌60~ 120 min后，移入50 ℃水浴，磁力搅拌90 ~ 150 min后，将水浴温度升至55 ℃，磁力搅拌2 ~ 3 h，逐滴加入50 ~ 100 mL超纯水后，继续缓慢加入200 mL的超纯水，磁力搅拌10 ~ 20 min，然后匀速加入10 ~ 20 mL、质量分数为30%的H2O2，搅拌10 ~15min，在室温下静置12h，取下层沉淀离心，超纯水清洗后，将沉淀物移入透析带并密封，置于1000 mL烧杯中，加入800 mL超纯水透析4 ~ 5天后，取1.0 g沉淀物，加入200 ~ 400 mL超纯水，超声20 ~ 30 min，在3000 rpm下离心5 ~ 10 min，取上清液，继续以4500 rpm离心2 ~ 5 min，将此次得到的上清液置于100 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12 h后，放入冷冻干燥机中，-80 ℃下冷冻干燥后，得到GO；
取99.9 mL超纯水置于250 mL烧杯中，在磁力搅拌下，加入100 mg的GO，超声10~ 30min后，在磁力搅拌下加入5.0 ~ 10.0 g的2-氨基吡啶和5.0 mg的氯高铁血红素Hemin，超声20 ~ 40 min后，将上述混合物转移到聚四氟乙烯高压反应釜中，130℃下保温24~36 h后，在8000 rpm下离心10 min，将沉淀物移入50 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12 h后，放入冷冻干燥机中，-80 ℃下冷冻干燥后得到Hemin-rGO；
（3）Ag NPs@CS/Hemin-rGO的制备
取20 mL超纯水置于100 mL烧杯中，在磁力搅拌下，每隔5 min，分别依次加入0.1 ~0.2 mL、10.0 mg/mL的Hemin-rGO和0.1 ~ 0.2 mL、10 mg/mL的Ag NPs@CS，直至加入5.0 mL的Hemin-rGO和5.0 mL的Ag NPs@CS，继续搅拌1 ~ 3 h，将得到的分散液置于100 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12h后，放入冷冻干燥机中，-80 ℃下冷冻干燥，得到Ag NPs@CS/Hemin-rGO；
（4）Ag NPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液的制备
取6.0 ~ 12.0 mg的Ag NPs@CS/Hemin-rGO加入2.0 mL的pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，超声10 ~ 20 min后，加入2.0 mL、20.0 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2，置于4.0°C恒温振荡器中振荡8 ~12h，得到Ag NPs@CS/Hemin-rGO/Ab2溶液，4.0°C冰箱中保存备用。
4.如权利要求1所述制备方法制备的一种基于Hemin-rGO的电化学免疫传感器，应用于肿瘤标志物的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，与所制备的传感器为工作电极构成三电极系统，在10.0 mL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法在初始电位为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间为400.0 s；
（3）当背景电流稳定后，向10.0 mL、pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10.0 μL、5.0 mol/L的H2O2，电流再次稳定后，记录电流的变化；
（4）采用不同浓度的肿瘤标志物抗原进行测定，记录不同浓度肿瘤标志物抗原所对应的电流值变化；
（5）利用工作曲线法，得到待测样品中肿瘤标志物抗原的浓度。
5.如权利要求1、2、3、4所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述肿瘤标志物为癌胚抗原。
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