CN112345605A - 同时检测两种神经内分泌肿瘤标志物的电化学免疫传感器 - Google Patents

同时检测两种神经内分泌肿瘤标志物的电化学免疫传感器 Download PDF

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Abstract

一种同时检测两种神经内分泌肿瘤标志物的电化学免疫传感器，属于电化学生物传感技术领域。该传感器以两个并联的玻碳电极为工作电极，电极表面依次修饰金属离子功能化的多孔硅酸镁/金纳米粒子/聚乙二醇/壳聚糖复合材料和识别抗体。当标志物与抗体间发生特异性结合，通过差分脉冲伏安法记录两种金属离子可区分的电信号来实现对CgA和CgB的同时检测，与抗体反应的标志物越多，电信号越低。优点在于，提供的电化学免疫传感器灵敏度高、检测限低，可弥补单一标志物的局限性，提高神经内分泌肿瘤诊断的准确性。

Description

同时检测两种神经内分泌肿瘤标志物的电化学免疫传感器
技术领域
本发明属于电化学生物传感技术领域，提供了一种同时检测神经内分泌肿瘤标志物,即同时检测两种神经内分泌肿瘤(NETs)标志物嗜铬粒蛋白A(CgA)和嗜铬粒蛋白B(CgB)的电化学免疫传感器。
背景技术
神经内分泌肿瘤(NETs)是起源神经内分泌细胞的一组罕见肿瘤。近年来，NETs发病率在全球内持续增长。NETs在初期通常是无症状的，NETs患者中有60–80％被诊断为晚期，且直肠和胰腺等NETs在临床上易被误诊误治。因此，通过有效的肿瘤标志物筛选和早期诊断NETs对于提高患者治疗效果至关重要。
目前，血清嗜铬粒蛋白A(CgA)是NETs中最常用的标志物，可用于协助诊断、指导治疗和评估疗效。现有的血清CgA检测方法灵敏度低，早期诊断不敏感。另外，口服质子泵抑制剂(PPIs)和肾功能不全患者，炎性肠病和其他胰腺疾病等CgA出现假性升高。嗜铬粒蛋白B(CgB)是一种与CgA相同家族的分泌蛋白，可用作NETs的生物标志物。CgB在直肠和胰腺NETs中的阳性率高于CgA，且不受PPIs等因素的影响，从而可以弥补CgA敏感性不足的缺点。因此，实现对血清CgA和CgB同时检测，对于提高NETs临床诊断的准确性具有十分重要的意义，但目前尚无同时检测CgA和CgB的生物传感器。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测两种神经内分泌肿瘤标志物的电化学免疫传感器，即同时检测两种NETs标志物CgA和CgB的电化学免疫传感器，并同时检测CgA和CgB电化学免疫传感器的制备方法。
本发明同时检测两种NETs标志物CgA和CgB的电化学免疫传感器，其工作电极由两个并联的玻碳电极组成，所述玻碳电极表面依次修饰金属离子功能化多孔硅酸镁/金纳米粒子/聚乙二醇/壳聚糖(PMS-M2+/AuNPs/PEG/CS)复合材料和抗体。
一个玻碳电极表面修饰的复合材料中吸附的金属离子为铜离子(Cu2+)，修饰的抗体为CgA抗体，用于识别检测CgA；另一个玻碳电极表面修饰的复合材料中吸附的金属离子为铅离子(Pb2+)，修饰的抗体为CgB抗体，用于识别检测CgB。其中，Cu2+和Pb2+具有明显可区分的差分脉冲伏安(DPV)峰电位，其峰电流分别用作电化学同时检测CgA和CgB的信号输出。
该传感器的制备方法包括以下步骤：
(1)金属离子功能化多孔硅酸镁(PMS-M2+)的制备
将8～12mg PMS加入10～30mL硝酸铜或硝酸铅溶液中，其中PMS与硝酸铜(或硝酸铅)的质量比为1：(0.5～3)，将溶液超声分散后在20～25℃下搅拌6～10h，然后离心洗涤，置于55～65℃烘箱中干燥，制得PMS-Cu2+或PMS-Pb2+。
(2)PMS-M2+/AuNPs/PEG/CS的制备
溶液A：浓度为1～3mgmL-1的PMS-Cu2+或PMS-Pb2+溶液；溶液B：含有0.4～0.6wt.％聚乙二醇(PEG)，0.4～0.6wt.％壳聚糖(CS)和0.4～0.6mM金纳米粒子(AuNPs)的混合溶液。将溶液A和B按照1：(0.5～2)的体积比混合，并超声分散。
(3)所述传感器工作电极的制备
1)将5～10μL PMS-Cu2+/AuNPs/PEG/CS和PMS-Pb2+/AuNPs/PEG/CS溶液分别滴到两个洁净的玻碳电极表面，并在20～25℃下干燥；
2)将步骤1)中用PMS-Cu2+/AuNPs/PEG/CS和PMS-Pb2+/AuNPs/PEG/CS修饰的玻碳电极分别与5～10μL浓度为8～12μg mL-1的CgA和CgB抗体溶液在3～5℃下孵育过夜，然后用去离子水冲洗，3～5℃下储存备用。
所述PMS-M2+中的PMS，通过以下方法制备：
将六水合硝酸镁溶于混合溶剂中，配制浓度为8～12mg L-1的硝酸镁溶液，所述混合溶剂为乙醇和水的混合溶剂，其中乙醇占混合溶剂的体积百分比为96～98％。配制浓度为0.2～0.25mgmL-1的硅酸钠水溶液。在搅拌条件下，按照硅酸钠溶液与硝酸镁溶液的体积比为1：(9～12)，将硅酸钠溶液逐滴加入硝酸镁溶液中，搅拌1～5min得到白色浆液。将所得白色浆液转移到水热反应釜中，加热至160～180℃，反应18～30h。反应结束后待自然冷却至室温，离心分离，并用去离子水和乙醇洗涤至中性，离心所得沉淀置于55～65℃烘箱中干燥，即得到PMS。
所述传感器的制备方法，制备步骤(2)中所述的AuNPs，通过以下方法制备：
在搅拌的条件下，将90～110mL浓度为0.8～1.2mM的氯金酸溶液加热至沸腾回流，然后将8～12mL浓度为35～40mM的柠檬酸钠溶液快速加入到上述溶液中。当溶液颜色变成酒红色后，继续在搅拌条件下煮沸10～20min，得到AuNPs分散液。
该传感器用于CgA和CgB的同时检测，步骤如下：
(1)将0.1pgmL-1～100ng mL-1一系列不同浓度的CgA和CgB标准溶液分别滴加到权利要求1所述的修饰有CgA和CgB抗体的玻碳电极上，并在36.5～37.5℃下孵育30～90min，用去离子水冲洗晾干；
(2)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，以两个并联的修饰后的玻碳电极为工作电极，Pt丝为对电极，饱和Ag/AgCl为参比电极，以pH 4.5～5.5的醋酸缓冲溶液为测试底液，通过DPV方法来检测，扫描电压范围为-0.7～0.3V，记录固定标志物蛋白前后Cu2+和Pb2+的峰电流值分别用于定量检测CgA和CgB，与抗体反应的标志物越多，电流值越低。
(3)根据Cu2+和Pb2+所得电流的变化差值与其对应CgA和CgB标准溶液浓度之间的关系，制作工作曲线。图4为实施例1中制备的电化学免疫传感器同时检测不同浓度的CgA和CgB的差分脉冲伏安图，图5和图6分别为实施例1中制备的电化学免疫传感器检测CgA和CgB的工作曲线图，如图所示，峰电流大小随着样品溶液中CgA和CgB浓度的增加而降低。工作曲线表明电流峰值与目标抗原浓度的对数之间呈良好的线性关系。CgA检测线性范围为0.1pgmL-1至100ng mL-1，检测限为5.3fg mL-1(S/N＝3)。CgB(与CgA相同的浓度范围内)的检测限为2.1fg mL-1(S/N＝3)
(4)将待测样品溶液代替CgA和CgB标准溶液，按照上述方法对待测样品进行检测，根据所述工作曲线，得到待测样品中CgA和CgB的浓度。
本发明的有益效果是：
(1)本发明构建的电化学免疫传感器可用于两种NETs标志物CgA和CgB的同时检测。
(2)本发明将PMS引入到电化学免疫传感器的制备当中，PMS作为具有高比表面积的三维花状多孔硅酸盐材料，对Cu2+和Pb2+具有显著的吸附能力，可以作为吸附金属离子的有效载体，实现信号放大和高灵敏检测。
(3)本发明采用PMS-M2+/AuNPs/PEG/CS复合材料作为传感界面。PEG和CS的复合不仅用于固定PMS-M2+和AuNPs，还可以协同增强传感界面的防污能力，提高传感器的特异性、选择性和稳定性。
附图说明
图1为本发明电化学免疫传感器的同时检测示意图。
图2为实施例1制备的PMS-Cu2+的扫描电子显微镜图。
图3为实施例1制备的PMS-Pb2+的扫描电子显微镜图。
图4为实施例1制备的电化学免疫传感器同时检测不同浓度的CgA和CgB的差分脉冲伏安图。
图5为实施例1制备的电化学免疫传感器检测CgA的工作曲线图。
图6为实施例1制备的电化学免疫传感器检测CgB的工作曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方案对本发明作出进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
正如背景技术所介绍的，需要开发一种用于对血清CgA和CgB同时检测的分析方法，针对此，本专利提供一种同时检测CgA和CgB的电化学免疫传感器。
电化学免疫传感器的同时检测示意图如图1所示，Cu2+和Pb2+分别在约0.03V和-0.47V(相对于饱和Ag/AgCl电极)出现可区分的DPV峰电位，因此被用作电活性物质。为了信号放大，采用PMS作为吸附金属离子的有效载体，PMS作为具有高比表面积的二维层状硅酸盐材料，对Cu2+和Pb2+具有显著的吸附能力。通过将金属离子Cu2+和Pb2+吸附到PMS上，制备PMS-Cu2+和PMS-Pb2+复合材料以实现高灵敏的信号输出。然后制备PMS-M2+/AuNPs/PEG/CS混合层用作传感界面，PEG和CS不仅用于固定PMS-M2+和AuNPs，而且二者的复合可以协同增强传感界面的防污能力。通过Au-S键将CgA和CgB的捕获抗体分别固定在生物传感界面PMS-Cu2+/AuNPs/PEG/CS和PMS-Pb2+/AuNPs/PEG/CS上，实现免标记电化学免疫传感器的构建。一旦NETs生物标志物与抗体之间发生特异性结合，就可以通过记录Cu2+和Pb2+的电化学信号的变化来实现对CgA和CgB的同时定量检测，与抗体反应的生物标志物越多，电化学信号越低。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
1、一种同时检测CgA和CgB电化学免疫传感器的制备
(1)PMS-M2+的制备
将10mg PMS加入20mL硝酸铜或硝酸铅溶液中，其中PMS与硝酸铜(或硝酸铅)的质量比为1：2，将溶液超声分散后在22℃下搅拌8h，然后离心洗涤，置于60℃烘箱中干燥，制得PMS-Cu2+或PMS-Pb2+。图2为制备的PMS-Cu2+的扫描电子显微镜图，图3为制备的PMS-Pb2+的扫描电子显微镜图。
(2)PMS-M2+/AuNPs/PEG/CS的制备
溶液A：浓度为2mgmL-1的PMS-Cu2+或PMS-Pb2+溶液；溶液B：含有0.5wt.％PEG，0.5wt.％CS和0.5mM AuNPs的混合溶液。将溶液A和B按照1：1的体积比混合，并超声分散。
(3)传感器工作电极的制备
1)将6μL PMS-Cu2+/AuNPs/PEG/CS和PMS-Pb2+/AuNPs/PEG/CS溶液分别滴到两个洁净的玻碳电极表面，并在22℃下干燥；
2)将步骤1)中用PMS-Cu2+/AuNPs/PEG/CS和PMS-Pb2+/AuNPs/PEG/CS修饰的玻碳电极分别与6μL浓度为10μg mL-1的CgA和CgB抗体溶液在4℃下孵育过夜，然后用去离子水冲洗，4℃下储存备用。
2、PMS的制备
将六水合硝酸镁溶于混合溶剂中，配制浓度为10mg L-1的硝酸镁溶液，所述混合溶剂为乙醇和水的混合溶剂，其中乙醇占混合溶剂的体积百分比为97％。配制浓度为0.23mgmL-1的硅酸钠水溶液。在搅拌条件下，按照硅酸钠溶液与硝酸镁溶液的体积比为1：11，将硅酸钠溶液逐滴加入硝酸镁溶液中，搅拌3min得到白色浆液。将所得白色浆液转移到水热反应釜中，加热至170℃，反应24h。反应结束后待自然冷却至室温，离心分离，并用去离子水和乙醇洗涤至中性，离心所得沉淀置于60℃烘箱中干燥，即得到PMS。
3、AuNPs的制备
在搅拌的条件下，将100mL浓度为1.0mM的氯金酸溶液加热至沸腾回流，然后将10mL浓度为38.8mM的柠檬酸钠溶液快速加入到上述溶液中。当溶液颜色变成酒红色后，继续在搅拌条件下煮沸15min，得到AuNPs分散液。
4、CgA和CgB的同时检测
(1)将0.1pgmL-1～100ng mL-1一系列不同浓度的CgA和CgB标准溶液分别滴加到修饰有CgA和CgB抗体的玻碳电极上，并在37℃下孵育60min，用去离子水冲洗晾干；
(2)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，以两个并联的玻碳电极为工作电极，Pt丝为对电极，饱和Ag/AgCl为参比电极，以pH 5.0的醋酸缓冲溶液为测试底液，通过DPV方法来检测，扫描电压范围为-0.7～0.3V，记录固定标志物蛋白前后Cu2+和Pb2+的峰电流值分别用于定量检测CgA和CgB，与抗体反应的标志物越多，电流值越低。
(3)根据Cu2+和Pb2+所得电流的变化差值与其对应CgA和CgB标准溶液浓度之间的关系，制作工作曲线。
(4)将待测样品溶液代替CgA和CgB标准溶液，按照上述方法对待测样品进行检测，根据所述工作曲线，得到待测样品中CgA和CgB的浓度。
5、实际血样检测
通过标准加入法进行回收实验，验证了本发明电化学免疫传感器在临床诊断上的可行性。取人血清样品，离心分离后取上清液，用构建的传感器检测出人血清样品中的CgA和CgB的含量，然后向人血清中加入一定浓度的CgA和CgB标准溶液，通过检测到的回收值与加入量的比值计算出样品的中CgA和CgB的回收率，结果见表1。
表1人血清样品中CgA和CgB的检测结果
Figure BDA0002759103240000081
表中n为平行检测次数。
由表1可知，检测结果的相对标准偏差小于5.0％，回收率在96.8％～105％之间，说明本发明的电化学免疫传感器可以用于人血清中CgA和CgB的同时检测，检测结果准确可靠。
实施例2
1、一种同时检测CgA和CgB电化学免疫传感器的制备
(1)PMS-M2+的制备
将8mg PMS加入10mL硝酸铜或硝酸铅溶液中，其中PMS与硝酸铜(或硝酸铅)的质量比为1：0.5，将溶液超声分散后在20℃下搅拌6h，然后离心洗涤，置于55℃烘箱中干燥，制得PMS-Cu2+或PMS-Pb2+。
(2)PMS-M2+/AuNPs/PEG/CS的制备
溶液A：浓度为1mgmL-1的PMS-Cu2+或PMS-Pb2+溶液；溶液B：含有0.4wt.％PEG，0.4wt.％CS和0.4mM AuNPs的混合溶液。将溶液A和B按照1：0.5的体积比混合，并超声分散。
(3)传感器工作电极的制备
1)将5μL PMS-Cu2+/AuNPs/PEG/CS和PMS-Pb2+/AuNPs/PEG/CS溶液分别滴到两个洁净的玻碳电极表面，并在20℃下干燥；
2)将步骤1)中用PMS-Cu2+/AuNPs/PEG/CS和PMS-Pb2+/AuNPs/PEG/CS修饰的玻碳电极分别与5μL浓度为8μg mL-1的CgA和CgB抗体溶液在3℃下孵育过夜，然后用去离子水冲洗，3℃下储存备用。
2、PMS的制备
将六水合硝酸镁溶于混合溶剂中，配制浓度为8mg L-1的硝酸镁溶液，所述混合溶剂为乙醇和水的混合溶剂，其中乙醇占混合溶剂的体积百分比为96％。配制浓度为0.2mgmL-1的硅酸钠水溶液。在搅拌条件下，按照硅酸钠溶液与硝酸镁溶液的体积比为1：9，将硅酸钠溶液逐滴加入硝酸镁溶液中，搅拌1min得到白色浆液。将所得白色浆液转移到水热反应釜中，加热至160℃，反应18h。反应结束后待自然冷却至室温，离心分离，并用去离子水和乙醇洗涤至中性，离心所得沉淀置于55℃烘箱中干燥，即得到PMS。
3、AuNPs的制备
在搅拌的条件下，将90mL浓度为0.8mM的氯金酸溶液加热至沸腾回流，然后将8mL浓度为35mM的柠檬酸钠溶液快速加入到上述溶液中。当溶液颜色变成酒红色后，继续在搅拌条件下煮沸10min，得到AuNPs分散液。
4、CgA和CgB的同时检测
与实施例1中CgA和CgB同时检测步骤相同，不同之处在于CgA和CgB的孵育条件为36.5℃下孵育30min，DPV测试底液为pH 4.5的醋酸缓冲溶液。
实施例3
1、一种同时检测CgA和CgB电化学免疫传感器的制备
(1)PMS-M2+的制备
将12mg PMS加入30mL硝酸铜或硝酸铅溶液中，其中PMS与硝酸铜(或硝酸铅)的质量比为1：3，将溶液超声分散后在25℃下搅拌10h，然后离心洗涤，置于65℃烘箱中干燥，制得PMS-Cu2+或PMS-Pb2+。
(2)PMS-M2+/AuNPs/PEG/CS的制备
溶液A：浓度为3mgmL-1的PMS-Cu2+或PMS-Pb2+溶液；溶液B：含有0.6wt.％PEG，0.6wt.％CS和0.6mM AuNPs的混合溶液。将溶液A和B按照1：2的体积比混合，并超声分散。
(3)传感器工作电极的制备
1)将10μL PMS-Cu2+/AuNPs/PEG/CS和PMS-Pb2+/AuNPs/PEG/CS溶液分别滴到两个洁净的玻碳电极表面，并在25℃下干燥；
2)将步骤1)中用PMS-Cu2+/AuNPs/PEG/CS和PMS-Pb2+/AuNPs/PEG/CS修饰的玻碳电极分别与10μL浓度为12μg mL-1的CgA和CgB抗体溶液在5℃下孵育过夜，然后用去离子水冲洗，5℃下储存备用。
2、PMS的制备
将六水合硝酸镁溶于混合溶剂中，配制浓度为12mg L-1的硝酸镁溶液，所述混合溶剂为乙醇和水的混合溶剂，其中乙醇占混合溶剂的体积百分比为98％。配制浓度为0.25mgmL-1的硅酸钠水溶液。在搅拌条件下，按照硅酸钠溶液与硝酸镁溶液的体积比为1：12，将硅酸钠溶液逐滴加入硝酸镁溶液中，搅拌5min得到白色浆液。将所得白色浆液转移到水热反应釜中，加热至180℃，反应30h。反应结束后待自然冷却至室温，离心分离，并用去离子水和乙醇洗涤至中性，离心所得沉淀置于65℃烘箱中干燥，即得到PMS。
3、AuNPs的制备
在搅拌的条件下，将110mL浓度为1.2mM的氯金酸溶液加热至沸腾回流，然后将12mL浓度为40mM的柠檬酸钠溶液快速加入到上述溶液中。当溶液颜色变成酒红色后，继续在搅拌条件下煮沸20min，得到AuNPs分散液。
4、CgA和CgB的同时检测
与实施例1中CgA和CgB同时检测步骤相同，不同之处在于CgA和CgB的孵育条件为37.5℃下孵育90min，DPV测试底液为pH 5.5的醋酸缓冲溶液。
上述实施例描述了本发明的详细情况，但是本发明并不局限于此。在本发明的技术构思范围内，对本发明的技术方案进行的任何改进和多种简单变形，均属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种同时检测两种神经内分泌肿瘤标志物的电化学免疫传感器，其特征在于，工作电极由两个并联的玻碳电极组成，所述玻碳电极表面依次修饰金属离子功能化多孔硅酸镁/金纳米粒子/聚乙二醇/壳聚糖(PMS-M2+/AuNPs/PEG/CS)复合材料和抗体；
一个玻碳电极表面修饰的复合材料中吸附的金属离子为铜离子Cu2+，修饰的抗体为CgA抗体，用于识别检测CgA；另一个玻碳电极表面修饰的复合材料中吸附的金属离子为铅离子Pb2+，修饰的抗体为CgB抗体，用于识别检测CgB；其中，Cu2+和Pb2+具有区分的差分脉冲伏安DPV峰电位，其峰电流分别用作电化学同时检测CgA和CgB的信号输出。
2.根据权利要求1所述传感器，其特征在于，该传感器的制备方法包括以下步骤：
(1)金属离子功能化多孔硅酸镁(PMS-M2+)的制备
将8～12mg PMS加入10～30mL硝酸铜或硝酸铅溶液中，其中PMS与硝酸铜(或硝酸铅)的质量比为1：(0.5～3)，将溶液超声分散后在20～25℃下搅拌6～10h，然后离心洗涤，置于55～65℃烘箱中干燥，制得PMS-Cu2+或PMS-Pb2+；
(2)PMS-M2+/AuNPs/PEG/CS的制备
溶液A：浓度为1～3mgmL-1的PMS-Cu2+或PMS-Pb2+溶液；溶液B：含有0.4～0.6wt.％聚乙二醇(PEG)，0.4～0.6wt.％壳聚糖(CS)和0.4～0.6mM金纳米粒子(AuNPs)的混合溶液。将溶液A和B按照1：(0.5～2)的体积比混合，并超声分散；
(3)传感器工作电极的制备
1)将5～10μL PMS-Cu2+/AuNPs/PEG/CS和PMS-Pb2+/AuNPs/PEG/CS溶液分别滴到两个洁净的玻碳电极表面，并在20～25℃下干燥；
2)将步骤1)中用PMS-Cu2+/AuNPs/PEG/CS和PMS-Pb2+/AuNPs/PEG/CS修饰的玻碳电极分别与5～10μL浓度为8～12μg mL-1的CgA和CgB抗体溶液在3～5℃下孵育过夜，然后用去离子水冲洗，3～5℃下储存备用。
3.根据权利要求1中所述的传感器，其特征在于，该传感器用于CgA和CgB的同时检测的步骤如下：
(1)将0.1pgmL-1～100ngmL-1一系列不同浓度的CgA和CgB标准溶液分别滴加到权利要求1所述的修饰有CgA和CgB抗体的玻碳电极上，并在36.5～37.5℃下孵育30～90min，用去离子水冲洗晾干；
(2)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，以两个并联的修饰后的玻碳电极为工作电极，Pt丝为对电极，饱和Ag/AgCl为参比电极，以pH 4.5～5.5的醋酸缓冲溶液为测试底液，通过DPV方法来检测，扫描电压范围为-0.7～0.3V，记录固定标志物蛋白前后Cu2+和Pb2+的峰电流值分别用于定量检测CgA和CgB，与抗体反应的标志物越多，电流值越低；
(3)根据Cu2+和Pb2+所得电流的变化差值与其对应CgA和CgB标准溶液浓度之间的关系，制作工作曲线；
(4)将待测样品溶液代替CgA和CgB标准溶液，按照上述方法对待测样品进行检测，根据所述工作曲线，得到待测样品中CgA和CgB的浓度。
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CN113049651A (zh) * 2021-03-15 2021-06-29 重庆大学 一种同时检测乳腺癌四种标志物的原位电化学免疫传感器
CN115112735A (zh) * 2022-06-27 2022-09-27 华中科技大学 一种鼻炎标志物传感器及其制备方法

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