JP2018515138A - 微生物集団の改変および微生物相の修飾 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細菌集団の増殖阻害、混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率の改変の方法、そのための核酸アレイおよび該アレイを含むベクターに関する。本発明は、宿主細胞核酸修飾のために改変されたシステム、該システムの要素および工業および製薬へのこれらの応用に関する。本発明は、例えば、環境、食品および飲料使用のための微生物の処理に特に有用である。本発明は、とりわけ産業用または家庭用システムにおける基質または流体の微生物学的影響下での腐食(MIC)または生物付着の処理方法に関する。本発明はまた、本方法に使用するための処理された流体およびベクターにも関する。ある実施態様において、本方法は、アレイの水平伝播を使用する。本発明はまたこの目的のために可動遺伝要素(MGE)により構成されるアレイおよび該アレイを含むベクターも提供する。
細菌集団増殖阻害および共存する細菌種の相対比率の改変は、広範な工場および他の施設における、水路、飲料水または他の環境施設での処理に応用される。またヒトおよび非ヒト動物、例えば、家畜における感染症の低減または腸内または口内微生物相のリバランスのための細菌改変にも応用される。近年、色々な体重または肥満プロファイルを有するヒトにおける腸内細菌の相対比率の分析またはクローン病のような疾患における細菌の影響の可能性の探索にも興味がもたれている。
(1)獲得がCas1およびCas2による侵入DNAの認識およびプロトスペーサーの開裂により開始する;
(2)プロトスペーサー配列が、リーダー配列に隣接する直接反復にライゲートされる;および
(3)一本鎖伸張がCRISPRを修復し、直接反復を二本化する。
本発明の第一形態
本発明者らは、次の1以上の特性を用いる、微生物相(ヒト、動物または環境微生物相)で天然に一緒に生ずる細菌の混合共同体における特定の細菌株の集団増殖の阻害を始めて示したと確信する。
・野生型細胞のターゲティング;
・野生型内在性Casヌクレアーゼ活性の利用;
・必須である抗生物質耐性遺伝子のターゲティング;
・ここで標的は野生型配列である
による集団増殖阻害。
・ヒト微生物相(例えば腸内微生物相)種の混合集団における混合集団のターゲティング;
・ここで集団は3種含み;
・これらの種の中の1種の選択的死滅と、他種の細胞の温存を含み;
・このような阻害により温存される系統的に近い他の種の存在下での細胞増殖阻害のターゲティング;
・標的ファーミキューテス種および非ファーミキューテス種を含む混合集団における細胞増殖阻害のターゲティング;
・混合集団中の異なるファーミキューテス種を温存しながら特定のファーミキューテス株の細胞増殖阻害のターゲティング;
・混合集団における異なるグラム陽性菌種を温存しながら特定のグラム陽性細菌株の細胞増殖阻害のターゲティング;
・片利共生ヒト腸内細菌種を温存しながら病原性(ヒトにおける)細菌種のターゲティング;
・プロバイオティクヒト腸内細菌種を温存しながら病原性細菌種のターゲティング;
・表面の混合細菌集団における細胞増殖阻害のターゲティング;
・特定の細菌種単独でのまたは共同体で複数の他の細菌種と混合されているときの少なくとも10倍増殖阻害の達成;および
・特定の細菌種の2つの異なる株の少なくとも10倍増殖阻害の達成。
各宿主細胞について、システムは(i)〜(iv)の要素を含む。
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列;
(ii)HM−crRNAをコードするスペーサー配列(HM−スペーサー)および反復を含む宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾(HM)CRISPRアレイであって、HM−crRNAは該Casを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの;
(iii)任意のtracrRNA配列またはtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(iv)ここで、システムの該要素は、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりHM−crRNAがCasを標的にガイドし、宿主細胞における宿主CRISPR/Casシステムを修飾し;そして
ここで標的配列がCasにより修飾され、それにより宿主細胞が殺されるかまたは宿主細胞増殖が抑制される。
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列;
(ii)HM−crRNAをコードするスペーサー配列(HM−スペーサー)および反復を含む宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾(HM)CRISPRアレイであって、HM−crRNAは該Casを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの;
(iii)任意のtracrRNA配列またはtracrRNA配列を発現するためのDNA配列;
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりHM−crRNAがCasを標的にガイドし、宿主細胞における宿主CRISPR/Casシステムを修飾するものである、
(i)〜(iv)の要素を含む、システム。
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列;
(ii)HM−crRNAをコードするスペーサー配列(HM−スペーサー)および反復を含む改変された宿主修飾(HM)CRISPRアレイであって、HM−crRNAは該Casを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの;
(iii)任意のtracrRNA配列またはtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりHM−crRNAがCasを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾し;
ここでCasヌクレアーゼは宿主細胞に内在性であり、そしてここで標的配列がCasにより修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細胞増殖を減少させるものである
(i)〜(iv)の要素を含む。
別法において、HM−crRNAおよびtracrRNAは単一ガイドRNA(gRNA)からなる。
ここで各ベクターは、細胞における該ファージの標的ヌクレオチド配列を修飾するためにファージ感染宿主細胞に導入するための改変されたファージ修飾(PM)CRISPRアレイを含み、
(a)ここでPM−CRISPRアレイは、PM−crRNAの発現のための1以上の配列およびファージ感染宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み;そして
(b)ここでPM−crRNAは感染宿主細胞にCas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドして、標的配列を修飾するために、ファージ標的配列とハイブリダイズできる。
宿主細胞の標的ヌクレオチド配列の修飾のための宿主修飾(HM)CRISPR/Casシステム(例えば、第一形態の使用のため)であって、
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列;
(ii)HM−crRNAをコードするスペーサー配列(HM−スペーサー)および反復を含む改変された宿主修飾(HM)CRISPRアレイであって、HM−crRNAは該Casを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主標的配列とハイブリダイズ可能な配列を含むもの;
(iii)任意のtracrRNA配列またはTracrRNA配列を発現するためのDNA配列;
(iv)ここでシステムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりHM−crRNAがCasを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾するものである
(i)〜(iv)の要素を含み、
ここで、所望により、要素(i)は宿主細胞に内在性である。
(a)ここでPM−CRISPRアレイは、PM−crRNAの発現のための1以上の配列およびファージ感染宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み;そして
(b)ここでPM−crRNAは、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)を感染宿主細胞にガイドして、標的配列を修飾するためにファージゲノム標的配列にハイブリダイズできる。
例えば、アレイは宿主細胞CRISPR/Casシステムで機能的であるCRISPR反復を含む。これは、細菌混合物における所望の細胞へのアレイの選択性増加に有益である。これはまた宿主細胞におけるアレイの機能に必要な1以上のCasタンパク質(および/またはtracrRNA)をコードする嵩高いヌクレオチド配列を包含する必要がない可能性があるため、アレイおよび本発明のアレイを含むベクターの産生を単純化する。別法において、アレイは同族Cas9コード化配列および所望により同族tracrRNAコード化配列と提供される。
内在性CRISPR/Casシステムを含む細菌宿主細胞修飾のための改変された核酸ベクターであって、ベクターは
(a)CRISPR/Casシステムで使用するためのまたは本発明に従い使用するための複数の異なるcrRNA(例えば、単一ガイドRNA、すなわち、gRNA)の発現のための核酸配列を含み;そして
(b)Casヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
ここで、該crRNAの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして該crRNAの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配列は該第一配列と異なり;そして
(c)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は抗抗生物質耐性遺伝子(またはそのRNA)を含み、所望により、これらの遺伝子は異なり;
(d)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含み;
(e)第一配列は必須遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含むまたは
(f)第一配列は病原性遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含む。
宿主細菌細胞(例えば、上記したような病原性細菌細胞)のゲノムまたは宿主細胞におけるウイルス(例えば、ファージ)のゲノムの標的配列を修飾するための改変されたCRISPRアレイを含む核酸ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ファージまたはファージミド)であって、
(a)ここでCRISPRアレイはcrRNA(例えば、gRNAとして提供される)の発現のための1以上の配列および宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み;
(b)ここでcrRNAは宿主細胞におけるCas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズできる;
(c)ここでアレイは第一細菌と、異なる種の第二細菌細胞の間で水平伝播できるトランスポゾンからなる。
可動遺伝要素(MGE)を含むまたはこれからなる改変されたCRISPR核酸ベクターであって、ここでMGEは宿主細胞(例えば、病原性細菌細胞)のゲノムまたは宿主細胞におけるウイルス(例えば、プロファージ)のゲノムの標的配列修飾のための伝達起点(oriT)およびCRISPRアレイを含み、
(a)ここでCRISPRアレイは、crRNAの発現のための1以上の配列および宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み;
(b)ここでcrRNAは宿主細胞におけるCas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズでき;
(c)ここでベクターは(i)第一宿主細胞の第一核酸と第二核酸位置間(ここで各位置は染色体またはプラスミドの位置であり、標的配列は宿主細胞に含まれる)または(ii)第一宿主細胞と第二宿主細胞間(ここで標的配列は第一および/または第二宿主細胞に含まれる)で伝達可能である。
産業用または家庭用システムにおける基質の微生物腐食(MIC)または生物付着を制御する方法であって、ここで基質の表面は基質のMICまたは生物付着に介在する第一微生物種の第一宿主細胞の集団と接触し、方法は
(i)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベクターはCRISPRアレイを含み、それによりCRISPRアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(a)各CRISPRアレイはcrRNAの発現のための1以上のヌクレオチド配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み;そして
(b)各crRNAは、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり;そして
(ii)宿主細胞においてCas存在下該cRNAを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該基質のMICまたは生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
原油、ガスまたは石油化学製品回収、加工、保存または輸送装置に含まれる基質の微生物腐食(MIC)または生物付着を制御する方法であって、ここで基質の表面は第一宿主細胞の集団と接触し、ここで第一宿主細胞は、基質のMICまたは生物付着に介在する第一種の硫黄または硫酸還元細菌(SRB)、細胞外重合物質産生細菌(EPSB)、酸産生細菌(APB)、硫黄または硫化物酸化細菌(SOB)、鉄酸化細菌(IOB)、マンガン酸化細菌(MOB)、アンモニア産生細菌(AmPB)または酢酸産生細菌(AcPB)であり、ここで表面および細胞集団は海水、淡水、フラッキング液体または井戸中の液体からなる群から選択され、方法は
(i)細胞集団とベクターを、液体と第一宿主細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを混合することにより接触させ、各ベクターはCRISPRアレイを含み、それによりCRISPRアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(a)各CRISPRアレイはcrRNAの発現のための1以上の配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み;
(b)各crRNAは、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり;
(c)ここで(a)の各々の配列は、第一宿主細胞において各crRNAの発現および産生のために配列R1−S1−R1’を含み、ここでR1は第一CRISPR反復であり、R1’は第二CRISPR反復であり、R1またはR1’は任意であり、S1は該第一宿主細胞の標的配列と80%以上同一であるヌクレオチド配列を含むかまたはこれからなる第一CRISPRスペーサーであり、そして
(ii)宿主細胞においてCas存在下該cRNAを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該基質のMICまたは生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
本方法に使用するためのベクターであって、ここで第一細胞は硫酸還元細菌(SRB)細胞、例えば、デスルホビブリオまたはデスルホトマキュラム細胞であり、ベクターはSRBターゲティングのための1以上のCRISPRアレイを含み、ここで各アレイは(a)〜(c)に定義したとおりである。
(i)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベクターはCRISPRアレイを含み、それによりCRISPRアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(a)各CRISPRアレイはcrRNAの発現のための1以上のヌクレオチド配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み;そして
(b)各crRNAは、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズででき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり;そして
(ii)宿主細胞においてCas存在下該cRNAを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
(i)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベクターはCRISPRアレイを含み、それによりCRISPRアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(a)各CRISPRアレイはcrRNAの発現のための1以上の配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み;そして
(b)各crRNAは、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり;そして
(ii)宿主細胞においてCas存在下該cRNAを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
(a)CRISPRアレイはcrRNAの発現のための配列および該宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み;
(b)crRNAは、宿主細胞にCas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列の修飾(例えば、標的配列の切断)のために宿主細胞標的配列とハイブリダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在するヌクレオチド配列であり;
(c)ここで(a)の配列はcrRNAの発現および産生のために配列R1−S1−R1’を含み、ここでR1は第一CRISPR反復であり、R1’は第二CRISPR反復であり、R1またはR1’は任意であり、S1は宿主細胞標的配列と80%以上同一であるヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる第一CRISPRスペーサーである。
第一の態様において、
第一Casをコードする発現可能な遺伝子を修飾する方法であって、方法は
(a)ガイドRNA(gRNA1)とCas遺伝子を、該遺伝子から発現される第一Casの存在下で合わせ、そして
(b)gRNA1を該Cas遺伝子の配列(例えば、そのプロモーターまたは第一Casコード化DNA配列)とハイブリダイズさせて、第一Casを遺伝子にガイドさせ、それによりCasがCas遺伝子を修飾する
ことを含む。
(a)第一ベクターまたは該組み合わせのベクターは、第一Casをガイドして、第一部位(CS1)で予定したプロトスペーサー配列(PS1)を修飾するためにPS1と相補性であるガイドRNA(gRNA1、例えば、単一gRNA)を含み、ここでPS1は第一Casと同族であるPAM(P1)に隣接するかまたは発現可能な配列はtracrRNAとgRNA1を形成するcrRNAをコードし;そして
(b)PS1およびP1は発現可能な第一Casコード化遺伝子の配列であり、PS1は第一CasによりCS1で修飾され得る。
CRISPR/Casシステムの要素をコードする1.4kbを超える外来性DNA配列を含む核酸ベクターであって、ここで配列は、宿主細胞(ここでのあらゆる細胞、例えば、ヒト、動物または細菌または古細菌宿主細胞)における1以上のHM−またはPM−crRNAまたはgRNAの発現のための改変されたアレイまたは改変された配列(所望によりここに記載されるとおり)を含み、ここでアレイまたは改変された配列はcRNAまたはgRNAと同族であるCasヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含まず、所望により、少なくとも2個、3個または4個のcRNAまたはgRNAが外来性DNAによりコードされる。
微生物集団増殖阻害および微生物比率改変
本発明は、ヒトの微生物相におけるバクテロイデス門(例えば、バクテロイデス)、ファーミキューテスおよび/またはグラム陽性または陰性細菌の比率の改変のような、細菌集団増殖阻害または混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率の改変、例えば、ヒトまたは動物マイクロバイオームの改変のための方法、使用、システム、アレイ、cRNA、gRNAおよびベクターに関する。例えば、ここに記載する第一〜第三形態参照。本発明は、例えば、宿主細菌細胞、例えば、バクテロイデス門細胞またはファーミキューテス細胞の1以上の標的ヌクレオチド配列の修飾を含む。
本発明は、宿主細胞標的を含む次のコンセプトを提供する。
1. 細菌宿主細胞の死滅または増殖減少のための宿主修飾(HM)CRISPR/Casシステムの使用であって、各宿主細胞について、システムは
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列;
(ii)HM−crRNAをコードするスペーサー配列(HM−スペーサー)および反復を含む改変された宿主修飾(HM)CRISPRアレイであって、HM−crRNAは該Casを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの;
(iii)任意のtracrRNA配列またはtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりHM−crRNAがCasを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾する
(i)〜(iv)の要素を含み、
ここでCasヌクレアーゼは宿主細胞に内在性であり、そしてここで標的配列がCasにより修飾され、それにより宿主細胞を死滅させるかまたは宿主細胞増殖を減少させる。
混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率を変えるための宿主修飾(HM)CRISPR/Casシステムの使用であって、第二細菌は宿主細胞に含まれ、各宿主細胞について、システムは
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列;
(ii)HM−crRNAをコードするスペーサー配列(HM−スペーサー)および反復を含む改変された宿主修飾(HM)CRISPRアレイであって、HM−crRNAは該Casを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの;
(iii)任意のtracrRNA配列またはtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりHM−crRNAがCasを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾する
(i)〜(iv)の要素を含み、
ここで、所望によりCasヌクレアーゼは宿主細胞に内在性であり、そして
ここで標的配列がCasにより修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細胞増殖が減少する。
ここで各宿主細胞について、システムは
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列;
(ii)HM−crRNAをコードするスペーサー配列(HM−スペーサー)および反復を含む改変された宿主修飾(HM)CRISPRアレイであって、HM−crRNAは該Casを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの;
(iii)任意のtracrRNA配列またはtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりHM−crRNAがCasを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾する
(i)〜(iv)の要素を含み、
ここで、所望によりCasヌクレアーゼは宿主細胞に内在性であり、そして
ここで標的配列がCasにより修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細胞増殖が減少する。
混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率を変えるための宿主修飾(HM)CRISPR/Casシステムの使用であって、第二細菌は各々標的プロトスペーサー配列を含む複数の宿主細胞を含み、各宿主細胞について、システムは上に定義した要素(ii)および(iii)を含み、システムはさらにCasヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列を含み、ここで該要素(ii)および該Casコード化配列は宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターに含まれ、それにより(i)によりコードされるHM−crRNAは、Casを標的にガイドして宿主細胞における標的配列を修飾し;
ここでCasヌクレアーゼは宿主細胞に内在性であり、そしてここで標的配列がCasにより修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細胞増殖が減少する。
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列;
(ii)HM−crRNAをコードするスペーサー配列(HM−スペーサー)および反復を含む改変された宿主修飾(HM)CRISPRアレイであって、HM−crRNAは該Casを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主標的配列とハイブリダイズ可能な配列を含むもの;
(iii)任意のtracrRNA配列またはtracrRNA配列を発現するためのDNA配列;
(iv)ここで、システムの該要素は、宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つの核酸ベクターに分けられ、それによりHM−crRNAがCasを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾する;
(i)〜(iv)の要素を含み、
ここで、所望により、要素(i)は宿主細胞に内在性である。
(a)前記何れかのコンセプトに記載のCRISPR/Casシステム、方法または使用において使用するための複数の異なるcrRNA(例えば、gRNA)を発現する核酸配列を含み;そして
(b)所望によりCasヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
ここで、該crRNAの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして該crRNAの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配列は該第一配列と異なり;そして
(c)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は抗抗生物質耐性遺伝子(またはそのRNA)を含み、所望により、これらの遺伝子は異なり;
(d)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含み;
(e)第一配列は必須遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含むまたは
(f)第一配列は病原性遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含む。
集団の増殖阻害のための細菌宿主細胞集団の野生型内在性Casヌクレアーゼ活性の使用であって、ここで各宿主細胞は野生型Casヌクレアーゼ活性を有する内在性CRISPR/Casシステムを有し、使用は集団の宿主細胞の形質転換を含み、ここで各形質転換宿主細胞は、宿主細胞における宿主修飾(HM)cRNAまたはガイドRNA(gRNA)の提供のために改変されたヌクレオチド配列で形質転換され、HM−cRNAまたはgRNAは、内在性Casを標的にガイドするための宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能な配列を含み、ここでcRNAまたはgRNAは、該野生型ヌクレアーゼ活性を有する宿主細胞の内在性Casヌクレアーゼと同属であり、宿主細胞形質転換後、集団の増殖が阻害される。
本発明のある態様において、標的配列は、宿主細菌細胞に感染するファージの配列である。本発明により達成されるファージゲノムの所望の修飾は、ファージ死滅またはノックダウンに関するだけでなく、むしろ宿主細胞における所望のファージ遺伝子または調節要素活性化であり得る(例えば、ファージが、宿主細胞生存能または増殖の増加と関連する所望のタンパク質または他の産物を発現するとき)。あるいは、修飾は、例えば、本発明によりファージ標的部位に標的化される誘導可能Casの使用により、誘導可能ファージ遺伝子発現制御であり得る。ある実施態様において、本発明は、宿主細胞におけるCasヌクレアーゼでの切断によるファージ標的部位の修飾のために提供される。これは、例えば、以下の種々の理由により有用であり得る。
A. 標的部位を、それを活性化または不活性化するための変異のため(例えば、抗宿主遺伝子の遺伝子ノックダウンまたは不活性化のためまたはファージ標的が宿主染色体に統合されているとき宿主細胞死滅のため);
B. 標的配列または標的配列を含む大型配列欠失のため(例えば、本発明をファージゲノムの空間部位を標的とする第一および第二PM−crRNAと使用するとき、ここで各部位の切断は、切断間のファージ核酸の欠失をもたらす);
C. 宿主細胞ゲノムに所望のPM−DNA配列を挿入するため(例えば所望のPM−DNAの相同組換え挿入のために宿主核酸において1以上のPM−crNAガイド切断を提供することにより)。
1. 第一細菌および第二細菌の亜集団を含む混合細菌集団中の該亜集団の相対比率を改変する方法であって、ここで第一細菌は宿主細胞(例えば、バクテロイデス門宿主細胞)であり(ここで第一細菌は所望によりファージにより感染され、第二細菌は該ファージにより感染されない(またはバクテロイデス門ではない))、方法は、ベクター核酸(例えば、そのPM含有トランスポゾン)の宿主細胞への導入のために1以上の工程で混合集団と複数のベクターを合わせ、混合集団において細菌増殖をさせることを含み、ここで該第一細菌と第二細菌の相対比率が改変され;
ここで各ベクターは、細胞における標的ヌクレオチド配列(例えば、該ファージの)の修飾のために宿主細胞に導入するための改変されたファージ修飾(PM)CRISPRアレイを含む、
(a)ここでPM−CRISPRアレイはそれぞれPM−crRNAの1以上の発現のための配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み;そして
(b)ここでPM−crRNAは宿主細胞におけるCas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズできる。
(a)ここでPM−CRISPRアレイは、PM−crRNAの発現のための1以上の配列およびバクテロイデス門ファージ感染宿主細胞における該配列の転写のためのプロモーターを含み;そして
(b)ここでPM−crRNAは感染宿主細胞においてCas(例えば、Casヌクレアーゼをガイドし、標的配列を修飾するためにバクテロイデス門ファージゲノム標的配列とハイブリダイズできる。
宿主細菌細胞(例えば、上記したような病原性細菌細胞)のゲノムまたは宿主細胞におけるウイルス(例えば、ファージ)のゲノムの標的配列を修飾するために改変されたHM−CRISPRアレイを含む核酸ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ファージまたはファージミド)であって、
(a)ここでCRISPRアレイは、crRNAの発現のための1以上の配列および宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み;そして
(b)ここでcrRNAは宿主細胞におけるCas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズできる。
(i)ここでR1は第一CRISPR反復であり、R1’は第二CRISPR反復であり、R1またはR1’は任意であり、
(ii)S1は該標的配列に95%以上同一であるヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる第一CRISPRスペーサーである、
前記態様の何れかの方法、アレイまたはベクターまたはここでのあらゆる使用。例えば、標的配列はプロトスペーサーを含むかまたは本発明のアレイが宿主細胞にあるときCasと同族プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に直ぐに隣接したプロトスペーサー配列に含まれ、ここでCasはまた該アレイから発現されるcrRNAとも同族である。ある実施態様において、Casは細胞に内在性である。他の例において、Casは細胞に外来性である、例えば、本発明のベクターにより提供される。
44. 宿主細菌細胞(例えば、ファーミキューテスまたは上記したような病原性細菌細胞)のゲノムまたは宿主細胞におけるウイルス(例えば、ファージ)のゲノムの標的配列修飾のための改変されたCRISPRアレイを含む核酸ベクター(例えば、プラスミド、ウイルス、ファージまたはファージミド)であって、
(a)ここでCRISPRアレイは、crRNAの発現のための1以上の配列(例えば、gRNAに含まれる)および宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み;
(b)ここでcrRNAは宿主細胞におけるCas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズでき;
(c)ここでアレイは第一細菌と、異なる種の第二細菌細胞の間で水平伝播できるトランスポゾンからなる。
(a)ここでCRISPRアレイは、crRNAの発現のための1以上の配列および宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み;
(b)ここでcrRNAは宿主細胞におけるCas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズでき;
(c)ここでベクターは(i)第一宿主細胞の第一核酸と第二核酸位置間(ここで各位置は染色体またはプラスミドの位置であり、標的配列は宿主細胞に含まれる)または(ii)第一宿主細胞と第二宿主細胞間(ここで標的配列は第一および/または第二宿主細胞に含まれる)で伝達される。
(1)宿主細胞と運搬体細胞を合わせ、
(a)ここで運搬体細胞は、標的修飾のためのCRISPRアレイを含むCRISPR核酸ベクターを含み、
(b)ここでCRISPRアレイは、crRNAの発現のための1以上の配列および宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み;
(c)ここでcrRNAは宿主細胞におけるCas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために標的配列とハイブリダイズでき;そして
(2)これらの細胞を一緒に培養し、ここでベクターが運搬体細胞から宿主細胞に伝達され、それによりcrRNAが宿主細胞におけるCasをガイドするために標的配列とハイブリダイズし、標的が修飾される
ことを含む、方法。
A:該第一細菌を宿主細胞に提供し;
B:該第二細菌を宿主細胞に提供し、ここで第二細胞は第一細胞と異なる種または株の細胞であり;
C:改変されたCRISPRアレイを第一細菌宿主細胞に導入し、ここで各CRISPRアレイは、crRNAの発現のための1以上の配列および該第二宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み、ここでcrRNAは宿主細胞におけるCas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾するために第二細胞に含まれる標的配列とハイブリダイズでき;
D:混合細菌集団を産生するために第一細菌および第二細菌細胞を一緒に合わせ;そして
E:CRISPRアレイの第一細菌細胞から第二細菌細胞への水平伝播が生じるように混合集団において細菌を増殖させ、ここで第二細胞における標的配列がCas修飾され、それにより該第一細菌と第二細菌の相対比率が変えられる
ことを含む、方法。
(i)ここでR1は第一CRISPR反復であり、R1’は第二CRISPR反復であり、R1またはR1’は任意であり、
(ii)S1は該標的配列に95%以上同一であるヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる第一CRISPRスペーサーである、
前記実施態様の何れかのベクター、組成物、食糧、飲料、集団または方法。
運搬体および宿主細胞が異なる種の細菌細胞であり、ここで宿主細胞がヒト微生物相種のものであり、運搬体細胞がヒト微生物相における非病原性である種のものであり、ここで標的配列が運搬体細胞のゲノムに含まれず、MGEが運搬体および宿主細胞において動作可能であるoriTを含み、ここでMGEが運搬体細胞から宿主細胞に水平伝播可能である、前記の実施態様の何れかの方法。
1. 標的配列が宿主CRISPR/Casシステムのヌクレオチド配列であり、それによりcrRNAが宿主細胞における宿主CRISPR/Casシステムを修飾するようにCasを標的にガイドする、態様44〜50の何れかのベクター。
i. 第一反復の最も5’ヌクレオチドと隣接するCRISPRアレイリーダーまたはリーダープロモーター配列(および所望により反復の該最も5’ヌクレオチドを含む、例えば、第一反復の5’末端に最初の3ヌクレオチドを含む);
ii. 第一反復の直ぐ5’の最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30または32)ヌクレオチド連続ヌクレオチドの配列;
iii. 第一反復の最も5’ヌクレオチドの最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30または32)連続ヌクレオチドの配列または
iv. 第一スペーサー反復の直ぐ3’の最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30または32)連続ヌクレオチドの配列(および所望によりここで配列は第一スペーサー最も3’ヌクレオチドを含む、例えば、第一反復の3’末端3’末端に最後の3ヌクレオチドを含む)。
i. crRNAが構造R−S−Rを含むかまたはこれからなり、ここでR=CRISPR反復およびS=CRISPRスペーサーであり、ここでSは(5’から3’方向で)V−HRまたはHR−Vを含みまたは、ここでV=ベクターのDNA配列と同一の配列およびHR=宿主細胞CRISPRアレイのCRISPRアレイの反復のDNA配列であり;
ii. ここでHRの配列は宿主CRISPRアレイのVの配列と直ぐ隣接し;そして
iii. ここでが細胞における宿主CRISPRアレイの修飾のためにCasを宿主標的にガイドするために宿主CRISPRアレイのスペーサーとハイブリダイズできる、
段落1、2または3のベクター。
20. 第一アレイのスペーサー(または該スペーサー)が同一である第一反復に隣接し、第二アレイのスペーサー(または該スペーサー)が同一である第二反復に隣接し、ここで第一反復が第二反復と異なる、段落18または19の収集物。
宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を修飾するための本発明のCRISPRアレイまたはベクターであって、
a. ここで宿主細胞は標的配列転写のための第一内在性プロモーター(第一宿主プロモーター)を含み;
b. ここでCRISPRアレイはcrRNAをコードする配列およびcrRNA転写のための第一プロモーターを含み、crRNAは所望により単一ガイドRNA(gRNA)に含まれ、Casを、標的配列を修飾するために宿主細胞における標的にガイドするために宿主標的配列とハイブリダイズでき;
c. ここで第一プロモーターの配列は、第一宿主プロモーターの配列と異なる第二内在性宿主プロモーターの配列である。
1. 宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を修飾するための宿主修飾(HM)CRISPR/Casシステム(例えば、タイプI、IIまたはIII)であって、(i)〜(iv)
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列(例えば、Cas9);
(ii)スペーサー配列(HM−スペーサー)およびHM−crRNAをコードする反復を含む改変された宿主修飾(HM)CRISPRアレイ(例えば、上記アレイ)であって、HM−crRNAは、標的配列を修飾するためにCasを宿主細胞にガイドするために宿主標的配列とハイブリダイズ可能な配列を含むもの;
(iii)任意のtracrRNA配列またはtracrRNA配列を発現するためのDNA配列;
(iv)ここで、システムの該要素は、2、3以上ー(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50以上)のcrRNAをコードする核酸配列のコピーを含み、ここでコピーは、宿主細胞配列をターゲティングための同じスペーサー配列を含む(例えば、宿主病原性、耐性または必須遺伝子配列またはベクター適応に介在する宿主CRISPR/Casシステム要素の配列)
の要素を含む、システム。
この形態は、外来性配列運搬のための限定的な容量しか有しない標的ベクター、例えばウイルスまたはファージにおける空間を解放するのに有利である。空間の解放により、宿主耐性回避に有用である多くのターゲティングスペーサーまたはアレイを含むことができる。これは、例えば、ベクターにおいてコードするよりむしろ内在性Casエンドヌクレアーゼの利用に有利である − 特にspまたはsaCas9のようなかさ高いCas配列について。さらに、非宿主源由来のいくつかの外来性Casで見られ得るような、適合性が劣る機会はない。ウイルス、例えば、ファージゲノムサイズを減少させる能力は、また宿主細胞取り込み(宿主細胞におけるウイルス感染および/または維持)にも有利であり得る。いくつかの例において、ベクター(例えば、ファージ)による宿主の侵襲は、宿主Casヌクレアーゼの発現の増加を含み、宿主CRISPR/Cas活性を情報制御し得ることが利点である − 宿主が侵入核酸を退治する試みにおいて。しかしながら、これはまた、この発明形態のアレイ、ベクター、システムおよび他の態様での使用のために、これらが、宿主Casにより認識される1以上の反復を含むとき、内在性Casを提供するのに有利である。本発明が宿主CRISPRアレイをターゲティングする1以上のスペーサーを含む場合(また本発明の第一形態のとおり)、これは、宿主CRISPRアレイ自体の不活性化を促進し、“自殺”宿主細胞と同類であり、次いで、これがそれ自体のCRISPRシステムの不活性化のためにそれ自体のCasヌクレアーゼを使用する。
1. 宿主細胞の標的ヌクレオチド配列を修飾するための宿主修飾(HM)CRISPR/Cas9システム(例えば、タイプI、IIまたはIII)であって、(i)〜(iv)
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列(例えば、Cas9);
(ii)スペーサー配列(HM−スペーサー)およびHM−crRNAをコードする反復を含む改変された宿主修飾(HM)CRISPRアレイ(例えば、上記の本発明のアレイ)であって、HM−crRNAは該Casを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主標的配列とハイブリダイズ可能な配列を含むもの;
(iii)任意のtracrRNA配列またはTracrRNA配列を発現するためのDNA配列;
(iv)ここでシステムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりHM−crRNAがCasを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾する、
の要素を含む、システム。
a. Casヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列(例えば、Cas9);
b. スペーサー配列(HM−スペーサー)およびHM−crRNAをコードする反復を含む改変された宿主修飾(HM)CRISPRアレイであって、HM−crRNAは、該Casを宿主細胞における標的にガイドするために宿主標的配列とハイブリダイズ可能な配列を含むもの;
c. 任意のtracrRNA配列またはTracrRNA配列を発現するためのDNA配列;
d. ここでシステムの要素は少なくとも第一および第二核酸ベクターに分けられ、ここで第一ベクターは要素(a)を含むが、第二ベクターは要素(a)を欠き;そして
e. ここでベクターは宿主細胞に同時にまたは逐次的に共形質転換でき、それによりHM−crRNAがCasを標的にガイドし、宿主細胞における標的配列を修飾する
に従う要素を含む、システム。
(a)先の例の何れかに従うCRISPR/Casシステムにおいて使用するための複数の異なるcrRNAを発現するための核酸配列を含み;そして
(b)Casヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き(例えば、Cas9)、
ここで、該crRNAの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして該crRNAの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配列は該第一配列と異なり;そして
(c)第一配列は抗微生物(例えば、抗生物質)耐性遺伝子(またはそのRNA)に含まれ、第二配列は抗微生物耐性遺伝子(またはそのRNA)に含まれ、所望により、これらの遺伝子は異なり;
(d)第一配列は抗微生物耐性遺伝子(またはそのRNA)に含まれ、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含み;
(e)第一配列は必須遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含むまたは
(f)第一配列は病原性遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含む、
ベクター。
(a’)先の例の何れかに従うCRISPR/Casシステムにおいて使用するための複数の異なるcrRNAを発現するための核酸配列を含み;そして
(b’)Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をコードする核酸配列を欠き、
ここで、該crRNAの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして該crRNAの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配列は該第一配列と異なり;そして
第一および/または第二配列が宿主CRISPR/Casシステムの標的配列であり、この配列は
(c’)宿主CRISPRアレイにおける反復DNAまたはRNA配列(例えば、ここで反復は最も5’反復である(第一反復));
(d’)tracrRNA配列またはtracrRNAコード化DNA配列;
(e’)CRISPRアレイリーダー配列;
(f’)Cas遺伝子プロモーター(例えば、Cas1、Cas2またはCsn2プロモーター);
(g’)CRISPRアレイリーダープロモーター配列または
(h’)Casコード化DNAまたはRNA配列((例えば、ここでCasはCas9、Cas1、Cas2またはCsn2である)、例えば、ここで第一のcrRNAは宿主Cas1遺伝子配列(またはそのRNAの配列)をターゲティングでき、第二のcrRNAは宿主Cas2遺伝子配列(またはそのRNAの配列)をターゲティングできる)
であるまたはこれを含む、
ベクター。
i. 第一反復の最も5’ヌクレオチドと隣接するCRISPRアレイリーダーまたはリーダープロモーター配列(および所望により反復の該最も5’ヌクレオチドを含む)、例えば、第一反復の5’末端に最初の3ヌクレオチドを含み;
ii. 第一反復の直ぐ5’の最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30または32)連続ヌクレオチドの配列;
iii. 第一反復の最も5’ヌクレオチドの最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30または32)連続ヌクレオチドの配列または
iv. 第一スペーサーの直ぐ3’の最大20(例えば、3、5、7、9、10、12、15、20、30または32)連続ヌクレオチドの配列(および所望によりここで配列は第一スペーサー最も3’ヌクレオチドを含む)、例えば、第一反復の3’末端3’末端に最後の3ヌクレオチドを含むもの
であるまたはこれを含む、
例24のベクター。
i. 宿主CRISPR/Casシステムが同族PAMを認識できる;
j. ここでベクターDNAがこのようなPAMをプロトスペーサー配列の直ぐ3’に含み;
k. ここでV=プロトスペーサーの1または最大40(例えば、最大15)ヌクレオチドであり;そして
l. ここでHR=宿主CRISPRアレイの反復の連続配列と同一の配列である、
例29のベクター。
a. ベクターは宿主における第一crRNAを発現するための第一核酸配列を含み;そして
b. ここで第一配列は(5’から3’方向で)R1a−S1−R1bを含み、ここでR1a=第一CRISPR反復であり、ここでR1aは任意であり;R1b=第二CRISPR反復であり、S1=宿主配列に相補的なCRISPRスペーサー(例えば、例23または24に記載する宿主配列)であり、ここでR1aおよびR1bは宿主Casヌクレアーゼ(例えば、タイプIIヌクレアーゼ、例えば、Cas9)により認識され;
c. ここでベクターは、(i)(b)の反復を認識するCasヌクレアーゼ(例えば、Cas9)をコードする核酸配列および/または(ii)第一配列によりコードされるcrRNA配列に相補的であるtracrRNA配列をコードする核酸配列を欠く。
d. ベクターが宿主における第二crRNAを発現するための第二核酸配列を含み、ここで第二crRNAは第一crRNAと異なり;
e. ここで第二配列が(5’から3’方向で)R2a−S2−R2bを含み、ここでR2a=第一CRISPR反復であり、ここでR2aは任意であり;R2b=第二CRISPR反復およびS2=宿主配列に相補的なCRISPRスペーサー(例えば、例23または24に記載する宿主配列)、ここでR2aおよびR2bが宿主Casヌクレアーゼ(例えば、タイプIまたはIIヌクレアーゼ、例えば、Cas6)により認識される、
例36のベクター。
f. ここで第一ベクターは例36に従う;
g. ここで第二ベクターは宿主における第二crRNAを発現するための第二核酸配列を含み、ここで第二crRNAは第一crRNAと異なり;
h. ここで第二配列は(5’から3’方向で)R2a−S2−R2bを含み、ここでR2a=第一CRISPR反復であり、ここでR2aは任意であり;R2b=第二CRISPR反復およびS2=宿主配列に相補的なCRISPRスペーサー、ここでR2aおよびR2bは宿主Casヌクレアーゼ(例えば、タイプIまたはIIヌクレアーゼ、例えば、Cas6)により認識される。
本発明は、共進化を促進するための宿主およびウイルスの一括コンディショニングおよびそれゆえに宿主のウイルス(例えば、ファージ)へのコンディショニングおよびその逆を含む、微生物(例えば、ファージおよび/または細菌集団)を産生する方法を提供する。発現または活性のcrRNAの抑制可能制御を使用して、本発明は、所望のスペーサー活性が、宿主におけるスペーサガイドCas作用により課せられる負荷存在下または非存在下、例えば、抗生物質耐性遺伝子ターゲティング存在下または非存在下で生じるのをコンディショニングすることを可能にするためにオンまたはオフに切り替えできる、意図的に共進化を制御可能な方法で調節する。この方法で、細菌集団を、所望の遺伝子のファージ不活性化に遭遇し得る状況(例えば、乳製品または食品製造発酵物)における使用または細菌を死滅させまたは調整する、例えば、抗生物質耐性ノックダウンのために使用するファージの調整における使用において、調整できる。この形態は、さらに、ある実施態様において、本方法が意図的に宿主との培養中にのアレイ抗生物質耐性遺伝子不活性化の活性を抑制するため、抗生物質耐性細菌宿主と、宿主の抗生物質耐性遺伝子を標的とする1以上の本発明のCRISPRアレイを含むウイルス、例えば、ファージの培養を可能とする。それ故に、耐性細菌宿主集団を培養においてファージの増殖に使用でき(例えば、工業用培養コンテナまたはプラント中)、ファージおよび宿主が共進化し、増殖、故に、宿主細胞の培養能力(これはそうしなければファージ拡大を最小化する)を妨害する抗生物質耐性不活性化効果なしに相互に調整されることを可能とし、一方所望のファージの他の全ての要素が培養宿主集団に対して調整されることをなお可能とする。得られたファージ集団のサンプルの試験を、例えば、実験室規模で、抗生物質耐性宿主細胞集団を使用して、しかし、宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子をターゲティングするアレイが抑制解除された試験ファージを用いて、実施できる。原核細胞およびファージ設定における遺伝子発現の天然に存在するおよび合成の抑制、例えば、tetシステムまたは光誘発可能システムは当業者に周知である。
1. 微生物の製造方法であって、
(a)宿主細胞においてヌクレオチド配列ターゲティングのための宿主CRISPR/Casシステムを含む宿主細胞を提供し;
(b)宿主細胞に感染可能であるウィルスを提供し、ここで
(i)ウイルスは宿主細胞の標的ヌクレオチド配列修飾のための1以上の改変された宿主修飾(HM)CRISPRアレイ(例えば、上記アレイ)を含み;
(ii)第一該HM−アレイは、Casを宿主細胞における標的にガイドし、標的配列を修飾するように第一宿主標的配列とハイブリダイズできるスペーサー配列(HM−スペーサー)を含む第一HM−crRNAをコードし、所望によりここで第一標的配列の修飾が宿主細胞増殖または生存能を低下させ;そして
(iii)第一HM−アレイが第一HM−crRNAの転写について可逆性に抑制可能であるおよび/または第一HM−crRNA活性が抑制可能であり;
(c)1以上のHM−CRISPRアレイを細胞に導入するために宿主細胞をウイルスで感染させ;
(d)細胞における第一HM−crRNAの転写および/または第一HM−crRNA活性を抑制し;
(e)ウイルスの集団(PV1)を含む宿主細胞の集団(PH1)を産生するために感染宿主細胞を培養し;そして
(f)ウイルス集団PV1および/または培養宿主細胞集団を得る
ことを含む、方法。
A. 所望により(a)、(f)の宿主細胞または段落2のさらに培養した細胞と同一である宿主細胞の集団(PH2)を得て;
B. Aの宿主細胞を集団PV1からのウイルスで感染させ;
C. 細胞における第一HM−crRNAの転写および/または第一HM−crRNA活性を抑制し;
D. 感染宿主細胞を培養してウイルスの集団(PV2)を含む宿主細胞の集団(PH3)を産生し;そして
E. ウイルス集団PV2(またはそのウイルス)および/または培養宿主細胞集団を得る
ことを含む、前段落の何れかの方法。
* これは、サンプルのウイルスが観点上に播種された細胞またはPH4に添加されるとき、プラーク形成の標準アッセイを使用して試験できる。
** これは、標準プラークアッセイを使用して決定できる。
(iv)該1以上のHM−アレイが、Casを宿主細胞における第二標的にガイドし、標的配列を修飾するように第二宿主標的配列とハイブリダイズできるHM−スペーサーを含む第二HM−crRNAをコードするHM−アレイを含み、ここで第二標的配列は宿主CRISPR/Casシステムのヌクレオチド配列であり、それにより第二HM−crRNAは、Casを第二標的にガイドして、宿主細胞における宿主CRISPR/Casシステムを修飾し、ここで第二標的配列の修飾は宿主CRISPR/Casシステムの機能を低減または排除し;そして
(v)ここで(iv)のHM−アレイは、第二宿主標的配列とハイブリダイズできる第二HM−crRNAの転写のために(a)の細胞で活性である、
前段落の何れかの方法。
A. 宿主CRISPRアレイにおける反復DNAまたはRNA配列(例えば、ここで反復は最も5’反復である(第一反復));
B. tracrRNA配列またはtracrRNAコード化DNA配列;CRISPRアレイリーダー配列;
C. Cas遺伝子プロモーター(例えば、Cas1、Cas2またはCsn2プロモーター);
D. CRISPRアレイリーダープロモーター配列または
E. Casコード化DNAまたはRNA配列(例えば、ここでCasはCas9、Cas1、Cas2またはCsn2である)
を含む、段落39〜42の何れかの方法。
F. 第一反復の最も5’ヌクレオチドと隣接するCRISPRアレイリーダーまたはリーダープロモーター配列(および所望により反復の該最も5’ヌクレオチドを含む);
G. 第一反復の直ぐ5’の最大20連続ヌクレオチドの配列;
H. 第一反復の最も5’ヌクレオチドの最大20連続ヌクレオチドの配列または
I. 第一スペーサー反復の直ぐ3’の最大20連続ヌクレオチドの配列(および所望によりここで配列は第一スペーサー最も3’ヌクレオチドを含む)
を含む、段落39〜43の何れかの方法。
J. 第二HM−crRNAが構造R−S−Rを含みまたはこれからなり、ここでR=CRISPR反復およびS=CRISPRスペーサーであり、ここでSは(5’から3’方向で)V−HRまたはHR−Vを含みまたは、ここでV=(b)のウイルスのDNA配列と少なくとも95%、96%、97%、98%または99%同一である配列であり、HR=該宿主細胞CRISPR/CasシステムのCRISPR反復のDNA配列であり;
K. ここでHRの配列は、宿主CRISPR/CasシステムにおけるVの配列に直ぐ隣接し;そして
L. ここで第二HM−crRNAは、細胞における宿主CRISPR/Casシステムを修飾(例えば、開裂または不活性化)するためにCasをスペーサーにガイドするために宿主CRISPR/Casシステムのスペーサーとハイブリダイズできる、
段落39〜44の何れかの方法。
a. 宿主CRISPR/Casシステムが同族PAMを認識でき;
b. ここで(b)のウイルスの核酸がこのようなPAMをプロトスペーサー配列の直ぐ3’に含み;
c. ここでV=プロトスペーサーの1または最大40(例えば、最大15)ヌクレオチドであり;そして
d. ここでHR=宿主CRISPR/Casシステムの反復の連続配列と同一の配列である、
段落45〜47の何れかの方法。
本発明は、とりわけ産業用または家庭用システムにおける基質または流体の微生物腐食(MIC)または生物付着を制御する方法に関する。本発明はまた本方法に使用するための処理流体およびベクターに関する。
1. 産業用または家庭用システムにおける基質の微生物腐食(MIC)または生物付着を制御する方法であって、ここで基質の表面は基質のMICまたは生物付着に介在する第一微生物種の第一宿主細胞の集団と接触しており、
(i)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベクターはCRISPRアレイを含み、それによりCRISPRアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(a)各CRISPRアレイはcrRNAの発現のための1以上のヌクレオチド配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み;そして
(b)各crRNAはCas(例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9またはCpf1)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾(例えば、標的配列を切断)するために宿主細胞における標的配列とハイブリダイズでき;標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり;そして
(ii)宿主細胞においてCas存在下該cRNAを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該基質のMICまたは生物付着の制御をもたらす
ことを含む、方法。
(i)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させることを含み、各ベクターはCRISPRアレイを含み、それによりCRISPRアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(a)各CRISPRアレイはcrRNAの発現のための1以上の配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み;そして
(b)各crRNAは、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり;そして
ここで方法は、宿主細胞においてCas存在下該cRNAを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該生物付着の制御をもたらすことを含む。
石油化学製品回収、加工、保存または輸送システム、炭化水素回収、加工、保存または輸送システム、原油回収、加工、保存または輸送システム、天然ガス回収、加工、保存または輸送システム(例えば、油井、石油掘削装置、石油採掘装置、石油ポンプ輸送システム、石油パイプライン、ガス掘削装置、ガス抽出装置、ガスポンプ輸送装置、ガスパイプライン、石油タンカー、ガスタンカー、石油貯蔵装置またはガス貯蔵装置)、水プロセシングまたは貯蔵装置、水貯留槽(例えば、飲用水貯留槽)、空気または水コンディショニング(例えば、冷却または加熱)装置、例えば、冷媒管、凝縮装置または熱交換機、医療または外科的装置、環境(例えば、土壌、水路または空気)処理装置、製紙またはリサイクリング装置、発電装置、例えば、火力または核発電装置、燃料(例えば、炭化水素燃料、例えば、石油、ディーゼルまたはLPG)貯蔵装置、採鉱または冶金、鉱物または燃料回収システム、例えば、採掘または採鉱装置、工学系、船舶装置、貨物または物品貯蔵装置(例えば、輸送コンテナ)、食品または飲料製造、加工または包装装置、洗浄装置(例えば、洗濯装置、例えば、洗濯機または食器洗浄機)、配膳(例えば、家庭用または商業的配膳)装置、飼育装置、構築(例えば、建築、公共施設基盤または道路構築)装置、航空装置、航空宇宙装置、輸送装置(例えば、動力車(例えば、自動車、大型トラックまたは小型トラック)、列車、航空機(例えば、飛行機)または海または水路輸送媒体(例えば、船舶または船、潜水艦またはホバークラフト))、包装装置、例えば、消費財包装装置または食品または飲料包装装置、電子機器(例えば、コンピューターまたは携帯電話またはその電子機器要素)または電子機器製造または包装装置、歯科装置、産業用または家庭用配管(例えば、海中パイプ)または保存コンテナ(例えば、水タンクまたは燃料タンク(例えば、ガソリンタンク、例えば、輸送媒体用ガソリンタンク))、地下装置、建築(例えば、住居または会社または商業的施設または工場または発電所)、車道、橋、農業装置、工場システム、原油または天然ガス探査装置、会社システム、および家庭用システム。
(i)ここでR1は第一CRISPR反復であり、R1’は第二CRISPR反復であり、R1またはR1’は任意であり、
(ii)S1は該第一宿主細胞の標的配列と95%以上同一であるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる第一CRISPRスペーサーである、
態様1〜47の何れかの方法。
(i)細胞集団とベクターを、液体と第一宿主細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを混合することにより接触させ、各ベクターはCRISPRアレイを含み、それによりCRISPRアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(a)各CRISPRアレイはcrRNAの発現のための1以上の配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み;
(b)各crRNAは宿主細胞におけるCas(例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9またはCfp1)ををガイドして標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために宿主細胞の標的配列とハイブリダイズ可能であり;標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり;
(c)ここで(a)の各々の配列は、第一宿主細胞において各crRNAの発現および産生のために配列R1−S1−R1’を含み、ここでR1は第一CRISPR反復であり、R1’は第二CRISPR反復であり、R1またはR1’は任意であり、S1は該第一宿主細胞の標的配列に70%、75%、80%、85%、90%または95%以上同一であるヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる第一CRISPRスペーサーであり、そして
(ii)宿主細胞においてCas存在下該cRNAを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該基質のMICまたは生物付着の制御をもたらす
ことを含む。ある実施態様において、R1およびR1’の両者が存在する。
(a)各CRISPRアレイはcrRNAの発現のための1以上の配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み;そして
(b)各crRNAが宿主細胞におけるCas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列を修飾(例えば、標的配列を切断)するために該さらなる宿主細胞の標的配列とハイブリダイズ可能であり;標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり;そして
工程(ii)は該さらなる宿主細胞においてCas存在下該cRNAの発現を可能にすることを含み、それによりさらなる宿主細胞における標的配列を修飾する、
態様1〜67の何れかの方法。
(i)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベクターはCRISPRアレイを含み、それによりCRISPRアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(a)各CRISPRアレイはcrRNAの発現のための1以上の配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み;そして
(b)各crRNAは、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり;そして
(ii)宿主細胞においてCas存在下該cRNAを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の低下および該生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
・金属表面上の水酸化鉄堆積によるバイオミネラル化の微生物(例えば、細菌)促進、界面金属/溶液の電気化学過程を修飾し、腐食を誘発する;
・バイオフィルムの形成を支持するEPSの製造;
・金属の腐食に作用する、酵素アリール炭化水素ヒドロキシラーゼ(AHH)の放出による石油製品の分解の微生物(例えば、細菌)促進;
・腐食過程を増加させる硫酸の製造;および
・硫黄の酸化
から選択される、機構の減少を含む。
・金属製表面表面上への水酸化鉄の堆積によるバイオミネラル化の細菌促進;
・EPSの製造;
・金属製表面である酵素アリール炭化水素ヒドロキシラーゼ(AHH)の放出によるシステムにおける石油製品の分解の細菌促進;
・硫酸の製造;および
・硫黄の酸化
から選択される機構を減少させる。
細菌と関連した腐食および/または生物付着の減少のための、本発明により企図される具体的適応例がある。下記適応は、本発明のコンセプトを限定する意図はなく、本発明が細菌誘導腐食の制御または環境汚染減少にどのように使用できるかを単に説明するものである。
・最小寸法50マイクロメートルの立方メートル以上あたり10未満の生存可能生物
・最小寸法50マイクロメートル未満または最小寸法10マイクロメートルのミリリットル以上あたり10未満の生存可能生物
でなければならないことを特定する。
・100ミリリットルあたり1コロニー形成単位(cfu)未満または1グラム(湿重量)動物プランクトンサンプルあたり1cfu未満の毒素性ビブリオ・コレラエ(O1およびO139)
・100ミリリットルあたり250cfu未満のエシェリキア・コリ
・100ミリリットルあたり100cfu未満の腸管腸球菌。
船または船舶のバラスト水における細菌生物付着を制御する方法であって、ここで水は該生物付着に介在する第一微生物種(例えばコレラ、エシェリキア・コリまたはエンテロコッカス)の第一宿主細胞の集団を含み、方法は
(i)該集団と、細胞の形質転換または形質導入が可能な複数のベクターを接触させ、各ベクターはCRISPRアレイを含み、それによりCRISPRアレイが宿主細胞に導入され、ここで
(a)各CRISPRアレイはcrRNAの発現のための1以上の配列および宿主細胞の配列の転写のためのプロモーターを含み;そして
(b)各crRNAは、Cas(例えば、Casヌクレアーゼ)を宿主細胞にガイドし、標的配列を修飾する(例えば、標的配列を切断する)ために、宿主細胞の標的配列とハイブリダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能に介在する遺伝子配列であり;そして
(ii)宿主細胞においてCas存在下該cRNAを発現させ、それにより宿主細胞において標的配列を修飾し、宿主細胞生存能の減少および該生物付着の制御をもたらす
ことを含む。
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85. 細菌宿主細胞へのCRISPRアレイ導入のためのベクターであって、ここで細菌は水系伝染が可能であり、ここで
(a)CRISPRアレイはcrRNAの発現のための配列および該宿主細胞における配列の転写のためのプロモーターを含み;
(b)crRNAは、宿主細胞にCas(例えば、Casヌクレアーゼ)をガイドし、標的配列の修飾(例えば、標的配列の切断)のために宿主細胞標的配列とハイブリダイズでき、標的配列は宿主細胞生存能介在のためのヌクレオチド配列(例えば、遺伝子または制御配列)であり;
(c)ここで(a)の配列はcrRNAの発現および産生のために配列R1−S1−R1’を含み、ここでR1は第一CRISPR反復であり、R1’は第二CRISPR反復であり、R1またはR1’は任意であり、S1は宿主細胞標的配列と80%以上同一(例えば、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一)であるヌクレオチド配列を含むまたはこれからなる第一CRISPRスペーサーである、
ベクター。
本発明のこれらの態様は、例えば、細胞またはインビトロで、Cas活性を制御するのに有用である。本発明は、Casコード化遺伝子のCas活性を制限するためのターゲティングに関し、これは、Casの一過性制御に有益である。本発明はまた、例えば、細胞の修飾ゲノムにおける標的外Cas切断の機会を減らすための、高いストリンジェンシーが望ましい設定でも有用であり得る。適用は、例えば、細胞または細胞を含む組織または生物の遺伝子治療または遺伝子ターゲティングのために、標的外効果が最小化または排除されなければならない、例えば、ヒト、動物または植物細胞の修飾における。例えば、極めて高いストリンジェンシーが、Cas修飾をヒトにおける遺伝子治療または疾患もしくは状態の処置もしくは予防のために患者に投与されるヒト細胞(例えば、iPS細胞)の所望の変更に使用されるとき、必要である。本開示は、本発明の方法および製品の一部としてこれらの適用を提供する。
1. 第一Casをコードする発現可能な遺伝子を修飾する方法であって、
(a)ガイドRNA(gRNA1)とCas遺伝子を、該遺伝子から発現される第一Casの存在下で合わせ、そして
(b)gRNA1を該Cas遺伝子の配列(例えば、そのプロモーターまたは第一Casコード化DNA配列)とハイブリダイズさせて、第一Casを遺伝子にガイドさせ、それによりCasがCas遺伝子を修飾する
ことを含む、方法。
I. Cas遺伝子が第一Casと同族であるPAM(P1)に隣接する第一プロトスペーサー(PS1)を含み、ここでPS1が第一Casにより第一部位(CS1)で修飾(例えば、切断)され;
II. gRNA1が第一CasのガイドのためにPS1と相補性である配列を含み、ここでPS1が工程(b)においてCS1で修飾され;
III. 標的核酸がPAM(P−t)に隣接するプロトスペーサー配列(PS−t)を含み、ここでP−tは第一Casと同族であり;
IV. 工程(b)の前または間に、方法はガイドRNA(gRNA−t)と標的核酸および該遺伝子により発現される第一Casを接触させることを含み、ここでgRNA−tはPS−tとハイブリダイズし、第一CasをCS−tの修飾のためにガイドし;そして
V. 方法は、所望により修飾標的核酸の単離または配列決定を含む、
項19または20の方法。
(i)標的核酸のヌクレオチド配列が削除され;
(ii)さらなる核酸のヌクレオチド配列が削除され;
(iii)標的核酸のヌクレオチド配列がさらなる核酸に挿入され;および/または
(iv)さらなる核酸のヌクレオチド配列が標的核酸に挿入される、
項1〜24の何れかの方法。
(a)第一ベクターまたは該組み合わせのベクターは、第一Casをガイドして、第一部位(CS1)で予定したプロトスペーサー配列(PS1)を修飾するためにPS1と相補性であるガイドRNA(gRNA1、例えば、単一gRNA)を含み、ここでPS1は第一Casと同族であるPAM(P1)に隣接するかまたは発現可能な配列はtracrRNAとgRNA1を形成するcrRNAをコードし;そして
(b)PS1およびP1は発現可能な第一Casコード化遺伝子の配列であり、PS1は第一CasによりCS1で修飾され得る。
次の特性を、本発明のあらゆる形態(例えば、その態様、実施態様、コンセプト、段落または例の何れか)に適用する。
例えば、標的配列は染色体配列、内在性宿主細胞配列、野生型宿主細胞配列、非ウイルス染色体宿主細胞配列であり、外来性配列および/または非ファージ配列ではなく(すなわち、これらの1以上または全て)、例えば、配列は宿主細胞染色体に含まれる抗生物質耐性遺伝子または必須遺伝子配列のような野生型宿主染色体細胞配列である。例えば、配列は宿主細胞プラスミド配列、例えば、抗生物質耐性遺伝子配列である。
1.4kbを超えるまたは4.2kbを超えるCRISPR/Casシステムの要素をコードする外来性DNA配列を含む核酸ベクターを提供し、ここで配列は、宿主細胞(ここでのあらゆる細胞、例えば、ヒト、動物または細菌または古細菌宿主細胞)における1以上のHM−またはPM−crRNAまたはgRNAの発現のための改変されたアレイまたは改変された配列(所望によりここに記載されるとおり)を含み、ここでアレイまたは改変された配列はcRNAまたはgRNAと同族であるCasヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含まない、所望によりここで少なくとも2、3または4cRNAまたはgRNAが外来性DNAによりコードされる。ある実施態様において、宿主細胞は、crRNAまたはgRNAと同族であるCasヌクレアーゼを発現する細菌または古細菌細胞である。ヒトまたは動物(例えば、齧歯類、ラットまたはマウス)細胞での使用のためのような他の例において、Casヌクレアーゼは異なる核酸ベクターによりコードされる。例えば、ここで該細胞はヒトまたは動物細胞であり、ベクターはAAVまたはレンチウイルスベクターである。例えば、本発明は、このようなベクターを含む宿主細胞を含み、ここで宿主細胞は該Casを発現する。例えば、宿主細胞はエクスビボでのヒトまたは動物細胞である。
1.4kbを超えるまたは4.2kbを超える外来性DNA配列を含む核酸ベクターを提供し、ここで外来性DNAは、CRISPR/Casシステムの1以上の要素をコードし、宿主細胞において1以上のHM−crRNAまたはgRNAを発現するための改変されたアレイまたは配列(例えば、ここに記載する任意のこのようなもの)を含み、ここで外来性配列は、cRNAまたはgRNAと同族であるCasヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を欠き、所望により少なくとも2つの異なるcRNAまたはgRNAが外来性DNAによりコードされる。例えば、本発明はこのようなベクターを含む宿主細胞を含み、ここで宿主細胞は該Casを発現する。例えば、cRNAまたはgRNAは各標的プロトスペーサー配列に対して宿主細胞においてハイブリダイズでき、ここで各プロトスペーサー配列は抗生物質耐性または必須宿主遺伝子に含まれる。これは、我々が、混合および非混合細胞集団における少なくとも10倍の選択的宿主細胞増殖阻害を示す、実施例により例示される。混合物は、ヒト微生物相に見られる種および株の組み合わせを模倣する。
1. 本発明の態様の何れかによるアレイ、改変された配列、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド、プロファージ、集団または収集物を含む、抗微生物組成物(例えば、抗生物質、例えば、医薬、殺菌剤または口腔洗浄剤)。
プラスミドはバクテロイデス種で極めて一般的であり、株の20〜50%に見られる。多くのプラスミドがoriTおよびトランス作用性可動化遺伝子を有し、これによりコンジュゲーションによる伝達が可能となる。それ故に、例えば、ベクターは、oriTおよび/または可動化遺伝子を含むプラスミドであり、例えば、ここで第一または第二細菌はバクテロイデスである。例えば、改変された配列はこのようなベクターに含まれる。
抗生物質耐性は、世界的な問題である。抗生物質耐性の新規形態は国境を越え、大陸間を容易に拡散できる。多くの形態の耐性が、相当な速度で拡散した。世界保健リーダーは、抗生物質耐性微生物を“悪夢細菌”であり、世界の全ての国の人々に“壊滅的脅威をもたらす”と述べている。米国で、毎年少なくとも2百万人が、感染処置が企図される抗生物質の1以上に耐性である細菌による重度感染を獲得する。少なくとも23,000人がこれらの抗生物質耐性感染の直接の結果として毎年死亡する。さらに多くが、抗生物質耐性感染に合併する他の状態により死亡する。さらに、毎年約250,000人が、クロストリジウム・ディフィシル(C. difficile)感染による入院加療を必要とする。これらの感染の大部分で、抗生物質の使用が、病気に至る主要因である。米国で少なくとも14,000名が、C. difficile感染により毎年死亡する。これらの感染の多くが予防できたはずである。抗生物質耐性感染は、既に負担が掛かりすぎている米国および他の健康管理システムに相当なかつ不可避の費用を加える。大部分、抗生物質で用意に処置可能な感染と比較して、抗生物質耐性感染は長期および/または高価な処置を必要とし、長期入院、さらなる通院および健康管理使用を必要とし、大きな身体障害および死亡にいたる。米国経済への抗生物質耐性の総経済的費用は計算が困難である。見積もりは多様であるが、200億ドル超もの高額が直接健康管理費用であり、これに加えて生産性喪失による社会へのさらなる費用は年間350億ドルもの高額である(2008ドル)とされる。抗生物質の使用は、世界中で抗生物質耐性に至る唯一の最も重要な因子である。抗生物質は、ヒト医薬で使用される最も一般的に処方されている薬物の一つである。しかしながら、人々に処方される全抗生物質の最大50%が不要であるかまたは処方するには最適に効果的ではない。抗生物質は、疾患の管理および処置のために、さらに食糧生産動物の成長を促すために、食用動物にでも一般的に使用されている。成長を促すための抗生物質の使用は必要ではなく、この実施は減らすべきである。米国食品医薬品局(FDA)の最近のガイドラインは、この目標に向けた行程を記載している。食用動物で使用されている薬物の量とヒトで使用されている量を直接比較するのは困難であるが、食品生産において使用される抗生物質が多いとの証拠がある。
1. 所望により宿主細胞が、例えば、メチシリン、バンコマイシン、リネゾリド、ダプトマイシン、キヌプリスチン、ダルホプリスチンおよびテイコプラニンから選択される抗生物質に耐性であるスタフィロコッカス・アウレウス細胞であり、宿主標的部位(または標的部位の1以上)が該抗生物質に対する宿主耐性を付与する遺伝子に含まれる。
例えば、組成物(例えば、抗生物質と組み合わされたHM−組成物または改変された配列)は次の何れかである。例えば、組成物は、医科、眼科、歯科または医薬組成物(例えば、抗宿主ワクチンに含まれる)である。例えば、組成物は抗微生物組成物、例えば、抗生物質または抗ウイルス、例えば、医薬、殺菌剤または口腔洗浄剤である。例えば、組成物は、化粧品組成物(例えば、顔または体のメイクアップ組成物)である。例えば、組成物は除草剤である。例えば、組成物は殺虫剤(例えば、宿主がバチルス(例えば、チューリンゲンシス)宿主であるとき)である。例えば、組成物は飲料(例えば、ビール、ワインまたはアルコール飲料)添加物である。例えば、組成物は食品添加物(例えば、宿主がエシェリキア・コリ、サルモネラ、リステリアまたはクロストリジウム(例えば、ボツリヌム)宿主であるとき)である。例えば、組成物は水添加物である。例えば、組成物は、水生動物環境(例えば、魚用水槽における)添加物である。例えば、組成物は石油または石油化学工業組成物であるかまたはこのような組成物に含まれる(例えば、宿主が硫酸還元細菌、例えば、デスルホビブリオ宿主であるとき)。例えば、組成物は石油または石油化学添加物である。例えば、組成物は化学添加物である。例えば、組成物は殺菌剤(例えば、ヒトまたは動物使用のため、例えば、外科的または医学的使用または赤ちゃんの食餌のための装置の殺菌)である。例えば、組成物は、ヒトまたは動物使用のための個人衛生組成物である。例えば、組成物は環境使用、例えば、土壌処理または環境除染のための組成物(例えば、汚水または石油、石油化学または化学から、例えば、宿主が硫酸還元細菌、例えば、デスルホビブリオ宿主であるとき)である。例えば、組成物は植物成長刺激因子である。例えば、組成物は、石油、石油化学、金属または鉱物抽出において使用するための組成物である。例えば、組成物は布処理または添加物である。例えば、組成物は動物皮革、革製品またはスエード処理または添加物である。例えば、組成物は染料添加物である。例えば、組成物は飲料(例えば、ビールまたはワイン)醸造または発酵添加物(例えば、宿主がラクトバチルス宿主であるとき)である。例えば、組成物は紙添加物である。例えば、組成物はインク添加物である。例えば、組成物は接着剤添加物である。例えば、組成物は抗ヒトまたは動物または植物寄生虫組成物である。例えば、組成物は空気添加物(例えば、エアコンディショニング装置におけるまたはそれにより産生される空気のための、例えば、宿主がレジオネラ宿主)である。例えば、組成物は凍結防止添加物(例えば、宿主がレジオネラ宿主であるとき)である。例えば、組成物は洗眼または眼科組成物(例えば、コンタクトレンズ流体)である。例えば、組成物は乳製品食品(例えば、組成物はミルクまたは乳製品であるまたはこれに含まれる;例えば、ここで宿主はラクトバチルス、ストレプトコッカス、ラクトコッカスまたはリステリア宿主である)に含まれる。例えば、組成物は家庭用または工業用洗浄製品(例えば、宿主がエシェリキア・コリ、サルモネラ、リステリアまたはクロストリジウム(例えば、ボツリヌム)宿主であるとき)であるまたはこれに含まれる。例えば、組成物は燃料に含まれる。例えば、組成物は溶媒(例えば、水以外)に含まれる。例えば、組成物はベーキング添加物(例えば、食品ベーキング添加物)である。例えば、組成物は研究室試薬(例えば、生命工学または組み換えDNAまたはRNA技術において使用)である。例えば、組成物は、繊維浸漬剤に含まれる。例えば、組成物は、ビタミン合成過程に使用するためであるる。例えば、組成物は抗作物または植物腐敗組成物(例えば、宿主が腐生栄養性細菌であるとき)である。例えば、組成物は、例えば、金属腐食を阻止または減少するための、抗腐食化合物(例えば、宿主が硫酸還元細菌、例えば、デスルホビブリオ宿主であるとき、例えば石油抽出、処理または封じ込め装置、金属抽出、処理または封じ込め装置または鉱物抽出、処理または封じ込め装置の腐食の減少または阻止に使用するため)である。例えば、組成物は農業または畜産組成物であるかまたはこのような組成物に含まれる。例えば、組成物は貯蔵牧草添加物である。本発明は、この段落に記載する組成物の何れかの使用またはこの段落に記載する適用の何れかにおける使用のための、ここに記載するHM−CRISPRアレイ、HM−CRISPR/Casシステム、HM−crRNA、HM−スペーサー、HM−DNA、HM−Cas、HM−組成物またはgRNAを提供し、例えば、ここで宿主細胞は微生物細胞または細菌もしくは古細菌細胞である。本発明は、この段落に記載した適用の何れかのための方法を提供し、ここで方法は、本発明のHM−CRISPRアレイ、HM−CRISPR/Casシステム、HM−crRNA、HM−スペーサー、HM−DNA、HM−Cas、gRNAまたはHM−組成物と、宿主細胞(例えば、微生物、細菌または古細菌細胞)をあわせることを含む。ある実施態様において、宿主細胞はヒト(またはヒト胚)または動物中または上に存在しない。
Wall, J. D., B. J. Rapp-Giles, and M. Rousset. 1993. “Characterization of a small plasmid from Desulfovibrio desulfuricans and its use for shuttle vector construction”. J. Bacteriol. 175:4121-4128;
Seyedirashti S et al; J Gen Microbiol. 1992 Jul;138(7):1393-7, “Molecular characterization of two bacteriophages isolated from Desulfovibrio vulgaris NCIMB 8303 (Hildenborough)”;
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混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率の改変、例えば、in微生物相
1. 混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率を変えるための宿主修飾(HM)CRISPR/Casシステムの使用であって、第二細菌は宿主細胞に含まれ、
各宿主細胞について、システムは(i)〜(iv)
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列;
(ii)HM−crRNAをコードするスペーサー配列(HM−スペーサー)および反復を含む宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾(HM)CRISPRアレイであって、HM−crRNAは該Casを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの;
(iii)任意のtracrRNA配列またはtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(iv)ここで、システムの該要素は、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりHM−crRNAがCasを標的にガイドし、宿主細胞における宿主CRISPR/Casシステムを修飾し;そして
ここで標的配列がCasにより修飾され、それにより宿主細胞を死滅させるかまたは宿主細胞増殖を減少させる
の要素を含む。
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列;
(ii)HM−crRNAをコードするスペーサー配列(HM−スペーサー)および反復を含む宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾(HM)CRISPRアレイであって、HM−crRNAは該Casを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの;
(iii)任意のtracrRNA配列またはtracrRNA配列を発現するためのDNA配列;
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりHM−crRNAがCasを標的にガイドし、宿主細胞における宿主CRISPR/Casシステムを修飾する
の要素を含む、システム。
(g)前記コンセプトの何れかのCRISPR/Casシステムまたは使用における使用のための複数の異なるcrRNAを発現するための核酸配列を含み(例えば、gRNAに含まれる);そして
(h)所望によりCasヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
ここで、該crRNAの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして該crRNAの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配列は該第一配列と異なり;そして
(i)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は抗抗生物質耐性遺伝子(またはそのRNA)を含み、所望により、これらの遺伝子は異なり;
(j)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含み;
(k)第一配列は必須遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含むかまたは
(l)第一配列は病原性遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含む、
ベクター。
表面の細菌の集団増殖阻害および処理のための野生型内在性Casの利用
1. 集団の増殖阻害のための細菌宿主細胞集団の野生型内在性Casヌクレアーゼ活性の使用であって、ここで集団は複数の宿主細胞を含み、各宿主細胞は野生型Casヌクレアーゼ活性を有する内在性CRISPR/Casシステムを有し、使用は集団の宿主細胞の形質転換を含み、ここで各形質転換宿主細胞は、宿主細胞における宿主修飾(HM)cRNAまたはガイドRNA(gRNA)の提供のために改変されたヌクレオチド配列で形質転換され、HM−cRNAまたはgRNAは、内在性Casを標的にガイドするための宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能な配列を含み、ここでcRNAまたはgRNAが該野生型ヌクレアーゼ活性を有する宿主細胞の内在性Casヌクレアーゼと同族であり、宿主細胞の該形質転換後、集団の増殖が阻害されるもの。
(i)該Casヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列;
(ii)スペーサー配列(HM−スペーサー)および該HM−crRNAをコードする反復を含む改変された宿主修飾HM−CRISPRアレイ;
(iii)任意のtracrRNA配列またはtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりHM−crRNAは該Casを標的にガイドして、標的配列を修飾するもの;
の要素を含む、実施態様1の使用であって、ここで標的配列はCasにより宿主細胞において修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細胞増殖が減少する
に従う要素を含む。
(a)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は抗抗生物質耐性遺伝子(またはそのRNA)を含み、所望により、これらの遺伝子は異なり;
(b)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含み;
(c)第一配列は必須遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含むかまたは
(d)第一配列は病原性遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含む、
実施態様1の使用。
混合集団における運搬体と宿主細胞間の水平伝播
1. 運搬体細菌を含む混合細菌集団を産生する方法であって、ここではそれぞれ第一細菌および第二細菌の第一および第二亜集団を含み、ここで亜集団は互いに異なる第一および第二種の細菌であり、第二細菌は複数の宿主細胞を含み、ここで運搬体細菌は、各々宿主細胞における宿主細胞修飾(HM)cRNAまたはガイドRNA(gRNA)を提供するための改変されたヌクレオチド配列を含む第一細菌細胞であり、HM−cRNAまたはgRNAは、第一Casヌクレアーゼを標的にガイドし、標的を修飾するために宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能な配列を含み、ここで運搬体細菌は標的配列を含まず、方法は
a. 各々該改変されたヌクレオチド配列を含む複数の核酸を提供し;
b. 該複数の核酸と、それぞれ第一細菌および第二細菌種の第一および第二亜集団を含む第一混合集団を合わせ、第二亜集団は宿主細胞を含み;
c. 宿主細胞の存在下該第一亜集団の細胞を核酸で形質転換させ、それにより該運搬体細胞および該宿主細胞を含む第二混合集団を産生することを含み、ここで運搬体細胞に含まれる該改変されたヌクレオチド配列は形質転換宿主細胞における該HM−cRNAまたはgRNAの産生のために宿主細胞を形質転換するために宿主細胞に水平伝播可能である、
方法。
実施例1:環境処理または除染
石油、金属および鉱物工業
ある実施態様において、宿主細胞は鉱物採掘抗または地域、金属採掘抗または地域、油田または石油または石油化学産業(例えば、宿主が嫌気性硫酸還元細菌、例えば、デスルホビブリオ細菌であるときの、これらの何れかのため)に存在する。例えば、本組成物は、酸化剤(例えば、次亜塩素酸ナトリウム)、4級アンモニウム化合物またはイソチアゾロンを含むかまたは次亜塩素酸ナトリウム、4級アンモニウム化合物またはイソチアゾロンと同時にまたは逐次的に施用される。デスルホビブリオ細菌宿主修飾のための本発明における使用に適当なベクターの例はバクテリオファージである。下記引用文献は、デスルホビブリオに感染するファージの単離のための適当な方法を記載する。本発明におけるベクターとしての使用のために、引用文献の何れかに記載されるバクテリオファージが使用され得る。あるいは、ベクターはナノ粒子により提供される。
Heidelberg et alは、2コピーのほぼ同一のミュー様バクテリオファージDVUO189−221、DVU2847−79、DVU2688−733およびバクテリオファージの残遺物(remnants)がデスルホビブリオ・ブルガリス・ヒルデンバラのゲノムに存在することを記載している。このようなファージは、本発明における使用のためのファージベクター改変の基礎となり得る。
Seyedirashti S et al, J Gen Microbiol. 1991 Jul;137(7):1545-9, “Induction and partial purification of bacteriophages from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough) and Desulfovibrio desulfuricans ATCC 13541;
Seyedirashti S et al, J Gen Microbiol. 1992 Jul;138(7):1393-7, “Molecular characterization of two bacteriophages isolated from Desulfovibrio vulgaris NCIMB 8303 (Hildenborough)”;
*Walker CB et al; Environ Microbiol. 2006 Nov;8(11):1950-9, “Recovery of temperate Desulfovibrio vulgaris bacteriophage using a novel host strain”;
Miranda et al, Corrosion Science 48 (2006) 2417-2431, “Biocorrosion of carbon steel alloys by an hydrogenotrophic sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio capillatus isolated from a Mexican oil field separator”;
Eydal et al, The ISME Journal (2009) 3, 1139-1147; doi:10.1038/ismej.2009.66; published online 11 June 2009, “Bacteriophage lytic to Desulfovibrio aespoeensis isolated from deep groundwater”;
Walker CB et al; Environ Microbiol. 2009 Sep;11(9):2244-52. doi: 10.1111/j.1462-2920.2009.01946.x, “Contribution of mobile genetic elements to Desulfovibrio vulgaris genome plasticity”
*[この文献に記載される配列は、Accession No. DQ826728-DQ826732の下にGenBankに寄託されており、引用によりここに包含させる]
本発明の代替的適用は、水または汚水処理のためのここに記載するHM−CRISPRアレイ、HM−CRISPR/Casシステム、HM−crRNA、HM−スペーサー、HM−DNA、HM−CasまたはHM−組成物を提供し、例えばここで宿主は硫酸還元細菌、例えば、デスルホビブリオ細菌である。
例えば、宿主における標的ヌクレオチド配列は、重金属耐性遺伝子の配列である。所望によりまた宿主はデスルホビブリオ細菌、例えば、デスルホビブリオ・ブルガリスである。
本発明の別の適用は、ヒトまたは動物における細菌感染の処置、予防または減少(例えば、拡散または拡大の減少)のための、ここに記載するHM−CRISPRアレイ、HM−CRISPR/Casシステム、HM−crRNA、HM−スペーサー、HM−DNA、HM−CasまたはHM−組成物を提供する。
第一の例において、感染は、ヒトにおけるMRSA宿主細胞が原因である。宿主細胞はスタフィロコッカス・アウレウス宿主細胞であり、本発明のHM−アレイは、クラスI、IIまたはIIIスタフィロコッカスパッケージ化ファージ(カウドウイルス目またはミオウイルス科ファージ)の集団に含まれる。ファージ集団を、メチシリンまたはバンコマイシンと併用してまたは併用せずにMRSA感染患者に投与する。一つの治験で、ファージHM−アレイは、(i)内在性スタフィロコッカス・アウレウスCRISPRアレイのリーダープロモーターの3’の20ヌクレオチドの領域および(ii)メチシリン宿主細胞における耐性遺伝子を標的とする。バンコマイシンを投与するとき、常用量より低用量が患者に投与される。宿主細胞感染がノックダウンされ、ファージ医薬に対する耐性が確立されないか通常より低い割合または重度で確立されると考えられる。他の治験において、これらの治験におけるファージがまた必須スタフィロコッカス・アウレウス遺伝子ftsZを標的とする以外、設計は同一である(Liang et al, Int J Infect Dis. 2015 Jan;30:1-6. doi: 10.1016/j.ijid.2014.09.015. Epub 2014 Nov 5, “Inhibiting the growth of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in vitro with antisense peptide nucleic acid conjugates targeting the ftsZ gene”)。
さらなる治験は、ファージKエンドリシンをメチシリンに加えてまたはその代わりに投与した以外、上記の治験を反復した。
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細菌の比率の改変を、混合腸内微生物相サンプルにおけるクロストリジウム・ディフィシル細菌のノックダウンを参照して記載する本例に従い実施する。サンプルは、バクテロイデスおよびメトロニダゾール(MTZ)耐性クロストリジウム・ディフィシル株630亜集団を含む。エクスビボで、混合集団を、CRISPRアレイを含むように本発明により改変されている運搬体細菌(ラクトバチルスアシドフィルスLa−14および/またはLa−5)の集団と合わせる。
各CRISPRアレイは、運搬体細菌およびクロストリジウム・ディフィシル細胞と適合性であるプラスミドに含まれる。アレイは、oriT、intDOT配列、tetQ−rteA−rteBオペロン、rteCおよびオペロンxis2c−xis2d−orf3−excも含む、バクテロイデスシータイオタオミクロンCTnDotトランスポゾンに含まれる。一つの実験において、mobおよびtraオペロンを除外する(代わりにトランスポゾンが運搬体細菌と組み合わされた混合物において伝達されるバクテロイデス細胞により供給されるこれらに依存する)。他の実験において、mobおよびtraオペロンはトランスポゾンに含まれる。
細胞質膜を超えるタンパク質転座が全細菌において必須過程である。コアにATPase、SecAおよび膜溝、SecYEGを含むSecシステムは、このタンパク質輸送の大部分を担う。第二並行Secシステムは、多数のグラム陽性種において報告されている。このアクセサリーSecシステムは、活性化させるATPase、SecA2の第二コピーの存在により特徴付けられ、そこで、試験されており、SecA2はSec基質のサブセットの転座を担う。多くの病原性グラム陽性種と共通して、クロストリジウム・ディフィシルは2コピーのSecAを有する。S層タンパク質(SLP)およびさらなる細胞壁タンパク質(CwpV)の輸出はSecA2に依存する。細胞壁における成熟SLPレベルの減少に一致する、SLPの細胞質前駆体SlpAおよび他の細胞壁タンパク質の蓄積が、ドミナントネガティブsecA1またはsecA2アレルを発現する細胞で観察される。さらに、SecA1またはSecA2のドミナントネガティブアレル発現またはアンチセンスRNAノックダウンが増殖を劇的に遮断し、両Secシステムがクロストリジウム・ディフィシルで必須であることを示す。
アレイは、クロストリジウム・ディフィシル細胞の必須遺伝子(SecA2)における配列のターゲティングのためのR1−S1−R1’ CRISPR単位を含む。他の実験において、ターゲティングは、MTZおよび所望により1以上の他の抗クロストリジウム・ディフィシル抗生物質存在下、cdeA遺伝子に対する。各スペーサー(S)は、SecAまたはcdeA遺伝子の20量体ヌクレオチド配列を含み、ここで配列は反復配列と同族であるクロストリジウム・ディフィシル株630 CRISPR/CasシステムのPAMを含む。各反復は、クロストリジウム・ディフィシル株630反復と同一であり、配列
5’-ATTTACATACCACTTAGTTAATATAAAAC-3’ (配列番号118)
を有する。
別のセットの実験において、次の配列を反復用に使用する。
5’-GTTTTATATTAACTAAGTGGTATGTAAAT-3’ (配列番号119)
後続実験において、運搬体細菌を含む飲料を産生し、これを数日間連続してヒト患者に1回または2回消費させる。患者に処置期間中テトラサイクリンも投与する。便分析が、便サンプル中のクロストリジウム・ディフィシルの比率が減少する(およびバクテロイデス対クロストリジウム・ディフィシルの比率が増加する)ことを確認すると予測される。
世界保健機構(WHO)コレラファクトシート107番(2015年7月更新)を参照する。コレラは、細菌ビブリオ・コレラエに汚染された食品または水の摂取により引き起こされる急性下痢性感染である。研究者らは、毎年凡そ140〜430万症例があり、世界的に毎年28000〜142000名がコレラにより死亡すると推定している。2時間〜5日間の短潜伏期間が、大流行の爆発的パターンの可能性を誘発する因子である。コレラは、極めて病原性の疾患である。小児および成人の両方を襲い、数時間以内に死亡し得る。ビブリオ・コレラエに感染した人の約80%は何の症状も発症しないが、細菌は糞便中に感染後1〜10日残り、環境に排出されて戻り、他の人に感染する可能性がある。症状を発症した人の中で、80%は軽度または中程度の症状であるが、約20%が急性水様下痢と重度脱水を発症する。これは、未処置だと死をもたらし得る。
ビブリオ・コレラエの2つの血清型 − O1およびO139 − が大流行し得る。ビブリオ・コレラエO1は大流行の大部分の原因であり、一方O139 − 1992年にバングラデシュで初めて同定された − は、東南アジアに限局性である。非O1および非O139ビブリオ・コレラエは、軽度下痢を引き起こしうるが、伝染病とはならない。近年、新規バリアント株がアジアおよびアフリカの数箇所で検出されている。所見は、これらの株が、致死率が高いより重度のコレラをもたらすことを示唆する。ビブリオ・コレラエの主貯留槽はヒトおよび半鹹水および河口半塩水のような水系源であり、藻類異常発生としばしば関連する。
著者らは、ICP1 CRISPR/Casシステムが2CRISPR座位(CR1およびCR2と命名)および6cas遺伝子からなり、その組織およびタンパク質産物がタイプ1−F(エルシニア・ペスチス)サブタイプシステム17のCasタンパク質と最も相同であると説明する。ビブリオ・コレラエは、2つの生物型、古典的およびEl Torに分類され、前者は早期の大流行と関連しており、その後El Tor生物型18に置き換わっている。古典的株、ビブリオ・コレラエO395は、タイプI−E(エシェリキア・コリ)サブタイプ17に属するCRISPR/Casシステムを有し、今日までCRISPR/Casシステムを有するEl Tor株に関する記載は何もない。それ故に、ICP1ファージにおけるCRISPR/Casシステムの起源は未知である。
crRNAにおける予測幹を形成する部分的パリンドローム配列に下線を付したCR1およびCR2コンセンサス直接反復のRNA配列は次のとおりである。
GUUAGCAGCCGCAUAGGCUGCUUAAAUA [配列番号75]
本発明の例えば、アレイの本および各反復は、配列番号75と少なくとも80、90、95%、96%、97%、98%または99%同一(または配列番号75と同一)である配列を含むまたはこれからなる。
例えば、本発明のアレイ(または各アレイ)は、下線を付したスペーサー配列の一つ、複数または全てを含む改変されたアレイである。アレイスペーサーは、次のとおり、天然に存在しない配置を含み得る。
例えば、アレイは、タイプ8aおよび/または9aのスペーサーおよびタイプ1a〜7aの0、1、2、3、4、5または6(しかし7ではない)を含む。例えば、アレイは、タイプ4bのスペーサーおよび1b〜3bの0、1または2、3(しかし3以上ではない)を含むを含む。例えば、アレイは、タイプ8aのスペーサーおよび9a、4b、1c、3d、1eおよび3eの一つ、複数または全てを含む。例えば、アレイは、タイプ9aのスペーサーおよび8a、4b、1c、3d、1eおよび3eの一つ、複数または全てを含む。例えば、アレイは、タイプ4bのスペーサーおよび8a、9a、1c、3d、1eおよび3eの一つ、複数または全てを含む。例えば、アレイは、タイプ1cのスペーサーおよび8a、9a、4b、3d、1eおよび3eの一つ、複数または全てを含む。例えば、アレイは、タイプ3dのスペーサーおよび8a、9a、4b、1c、1eおよび3eの一つ、複数または全てを含む。例えば、アレイは、タイプ1eのスペーサーおよび8a、9a、4b、1c、3dおよび3eの一つ、複数または全てを含む。例えば、アレイは、タイプ3eのスペーサーおよび8a、9a、4b、1c、3dおよび1eの一つ、複数または全てを含む。
第一アレイはICP1_ 2011_Aスペーサー配列(例えば、8aおよび/または9a)を含み、第二アレイはICP1_ 2006_E、ICP1_ 2005_AまたはICP1_ 2004_Aのスペーサー配列(例えば、4b、1c、3d、1eおよび3eから選択される1以上のスペーサー)を含む。
例えば、ベクターは、8a、9a、4b、1c、3d、1eおよび3eから選択される1、2、3、4、5、6または全7スペーサータイプを含む。例えば、ベクターは、該選択タイプの1以上の複数コピーを含む。例えば、ベクターにおけるこの、いくつかのまたは各アレイは、第一スペーサー(アレイのプロモーターの最近接)を含み、ここで第一スペーサーは8a、9a、4b、1c、3d、1eおよび3eから選択される。この方法での位置決めは、天然アレイが第一スペーサーを最も頻繁に使用するため、有利である。
例えば、それぞれ平均読み取り5.6および4.7を有したvc0309およびvc0753における挿入変異体は、増殖が激しく減弱した。同様に、vc0237およびvc1773変異体は、インビトロ競合実験において野生型細胞より適切でなかった。リストはまたvca0360、vca0477、vca0486およびvca0488を含む推定毒素/抗毒素アディクション座位からの多数の抗毒素遺伝子も含む。このような遺伝子は、活性毒素と関連するとき、必須であると推定される。
著者らは、表4における必須ビブリオ・コレラエ遺伝子を発見した。著者らは、必須であると考えられる200を超える遺伝子間領域を同定した。
それ故に、本発明の例えば、宿主細胞がビブリオ・コレラエ細胞であるとき、標的配列はvc0631、vc2024、vc2626、vc2763−vc2767またはvc2768−vc2770配列である。本発明の例えば、宿主細胞がビブリオ・コレラエ細胞であるとき、標的配列はvc0309およびvc0753、vc0237およびvc1773、vca0360、vca0477、vca0486またはvca0488配列である。
それ故に、本発明の例えば、宿主細胞がビブリオ・コレラエ細胞であるとき、標的配列はtcpA配列またはtcpAモジュレーター配列(すなわち、tcpA自体またはその発現産物を介して調節するヌクレオチド配列)である。例えば、配列はptsIまたはptsH配列である。例えば、標的配列は、ホスホエノールピルベートホスホトランスフェラーゼシステム(PTS)の配列またはtcpPH、aphABまたはtoxT配列である。例えば、標的配列はEIIA(Glc)タンパク質をコードする遺伝子である。
本発明のための適当な標的配列はまた表5にも示す − 次の何れか一つの配列(病原性遺伝子は下線を付す)。
ある実施態様において、細胞はビブリオ(例えば、コレラ)細胞であり、標的配列はこれらの遺伝子の何れかの配列である。
病原性遺伝子を表6に示す。
ある実施態様において、細胞はビブリオ(例えば、コレラ)細胞であり、標的配列はこれらの遺伝子の何れかの配列である。
ある実施態様において、細胞はビブリオ(例えば、コレラ)細胞であり、標的配列はace、cep、ctxA、ctxB、orfU、zot、rstA、rstB、rstR、acfA、acfB、acfC、tagE、aldA、int、tagA、tagD、tcpA、tcpB、tcpC、tcpD、tcpE、tcpF、tcpH、tcpI、tcpJ、tcpP、tcpQ、tcpR、tcpS、tcpTまたはtoxT配列である。
1. 材料および方法
1.1. 株
次の株を、この実施例および実施例7および8の過程で使用した:エシェリキア・コリMG1655、エシェリキア・コリTOP10、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD-9(ATCC BAA-491, Manassas, Virginia)、ストレプトコッカス・サーモフィルスDSM 20617(T)(DSMZ, Braunschweig, Germany)、ラクトコッカス・ラクティスMG1363およびストレプトコッカス・ミュータンスClarke 1924DSM 20523(DSMZ, Braunschweig, Germany)。
培地選択および遺伝子構築物の試験の経過中、種々のストレプトコッカス株を使用した。ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9(ATCC BAA-491)およびエシェリキア・コリTOP10を、その適合性増殖要件のために考慮した。全株をトッドヘヴィットブロス(TH)(T1438 Sigma-Aldrich)で、特に断らない限り、好気性条件および37℃で培養した。株を25%グリセロール中、−80℃で保存した。
全株を、TH培地で37℃で20時間増殖させた。ストレプトコッカス・サーモフィルスの選択培地は、3g・l−1の2−フェニルエタノール(PEA)を添加したTH培地であった。PEAを培地に添加し、121℃で15分、15psiでオートクレーブに付した。寒天プレートを、1.5%(wt/vol)寒天を対応する培地に添加することにより調製した。選択またはプラスミド維持に必要であるとき、30μg ml−1カナマイシンを両ストレプトコッカス・サーモフィルス株およびエシェリキア・コリおよび500μg ml−1をストレプトコッカス・ミュータンスに使用した。
ある場合、株およびプラスミドによって、48時間までの長いインキュベーションが、PEA添加培地での増殖を見るために必要である可能性がある。使用する生物の生存能の対照として、対照TH寒天を並行して実施すべきである。
エシェリキア・コリ(One Shot(登録商標)ThermoFischer TOP10 Chemically Competent細胞)を全サブクローニング手順において使用した。PCRを、Phusionポリメラーゼを使用して実施した。全PCR産物を、製造業者のプロトコールに従い、Nucleospin GelおよびMacherey-NagelによるPCR Clean-upで精製した。精製フラグメントを34μl総体積で、1μl酵素添加1×FD緩衝液中制限酵素DpnIで消化させた。消化反応物を再び製造業者のプロトコールに従い、Nucleospin GelおよびMacherey-NagelによるPCR Clean-upで精製した。Gibsonアセンブリーを、製造業者(NewEngland Biolab)のプロトコールに従い、10μl反応物中で実施した。
プラスミドDNAを、製造業者の指示に従いQiagenキットを使用して調製した。グラム陽性株についての修飾は、細胞溶解を促進するため細菌の0.5%グリシンおよびリゾチーム添加培地での増殖を含んだ。
1.4.1 エレクトロコンピテントエシェリキア・コリ細胞および形質転換
市販のエレクトロコンピテント細胞をクローニングおよび実験に使用した(One Shot(登録商標)ThermoFischer TOP10 Chemically Competentエシェリキア・コリ)。エレクトロポレーションを標準設定を使用して実施した:Electro Cell Manipulator(BTX Harvard Apparatus ECM630)を使用する1800V、25μFおよび200Ω。パルス後、1ml LB−SOC培地を添加し、細胞を37℃で1時間インキュベートした。形質転換細胞を、50μg ml−1のカナマイシン含有LB寒天に播種した。
エレクトロポレーションプロトコールは、Somkuti and Steinberg, 1988を改変した。40mM DL−スレオニン(T8375 Sigma-Aldrich)添加THブロス中のストレプトコッカス・サーモフィルスの一夜培養を同じ培地5ml中、100倍に希釈し、OD6000.3〜0.5まで増殖させた(接種約2.5時間後)。細胞を10,000×gで10分の4℃での遠心分離により採取し、5mlの氷冷洗浄緩衝液(0.5Mスクロース+10%グリセロール)で3回洗浄した。細胞洗浄後、OD60015〜30でエレクトロポレーション緩衝液(0.5M スクロース、10%グリセロールおよび1mM MgCl2)中に懸濁させた。エレクトロポレーション緩衝液中の細胞は、使用するまで4℃に維持しても(1時間以内)または後に使用するためにエッペンドルフチューブに50μlで等分し、液体窒素で冷凍し、−80℃で保存してもよい。
1μlの精製プラスミドDNAを50μlの細胞懸濁液に添加し、エレクトロポレーションを予め冷やした2mm−ギャップエレクトロポレーションキュベットで実施した。エレクトロポレーション設定は、Electro Cell Manipulator(BTX Harvard Apparatus ECM630)を使用して2500V、25μFおよび200Ωであった。電気パルス直後、1mlのTHブロスを細胞に添加し、懸濁液を10分氷上に維持し、その後細胞を3時間、37℃でインキュベートした。耐性遺伝子を発現させるための時間の後、細胞を30μg ml−1のカナマイシン含有TH寒天プレートに播種した。構築物により、コロニーは37℃でインキュベーション12〜48時間後可視化した。
本試験で使用した全プラスミドは、ストレプトコッカス・クレモリスからの潜在性プラスミドpWV01に由来する広宿主範囲発現ベクターであるpBAV1K−T5に基づき(Bryksin & Matsumura, 2010)、主鎖をGibson法を使用して他のフラグメントとアセンブリーするためのオーバーハングを有するものを使用して増幅した。
キシロース誘導可能システムを、XylRリプレッサーの前にプロモーターgyrAをクローニングすることにより構築した(図1)。XylRリプレッサーは、バチルス・スブチリス株SCK6(Zhang et al. 2011)から、Gibsonアセンブリーのためのオーバーハングを含むリバースプライマーおよびgyrAプロモーターを導入するために使用するウルトラマーであるフォワードプライマー(Xie et al. 2013)およびpBAV1KT5主鎖へのアセンブリーのための対応するオーバーハングを用いて増幅した。得られたフラグメントは、Pldha+PxylAハイブリッドプロモーター(Xie et al. 2013)を含むウルトラマーを用いてpCL002(未公開研究)から増幅させたmCherryを隣接させた。3つの得られたPCR産物を、製造業者の指示に従いGibson Master Mix(登録商標)(NewEngland Biolab)で構築した。産物を最後にエシェリキア・コリTOP10エレクトロコンピテント細胞に形質転換した。図1参照。
ストレプトコッカス・サーモフィルスは、4つの異なるCRISPRシステムを有し(Sapranauskas, et al. 2011)、この研究のために、タイプII CRISPR1 (ST1−CRISPR)システムを選択した。標的配列の設計は、LMD−9の利用可能なゲノム配列(GenBank: CP000419.1)に基づいた。ST1−CRISPRアレイを、CRISPRアレイ反復およびスペーサーのみを、キシロース誘導可能プロモーター下に含み(Xie et al. 2013)、続いてストレプトコッカス種の強構成的プロモーター下の対応するtracrRNAがあるように設計した(Sorg et al. 2014)(図2、配列番号)。
tracrRNAは、crRNAの成熟に役割を有し、ストレプトコッカス・サーモフィルス内在性RNase IIIにより支持され、crRNAと複合体を形成する。この複合体は、エンドヌクレアーゼST1−Cas9のガイドとして働く(Horvath & Barrangou, 2010)。キシロース誘導可能プロモーターからの合成アレイの転写後、内在性Cas9およびRNAeは、それを機能的gRNAに処理する。gRNA/Cas9複合体は、標的位置での二本鎖中断をもたらす。
アレイの設計は、高GC含量およびcrRNAの適切な成熟に必要ではないことが示唆されているtracrRNA部分を減少した(すなわち、完全tracrRNA配列)2つの特異的標的配列を使用した(Horvath & Barrangou, 2010)。
2標的は、必須遺伝子(DNAポリメラーゼIIIサブユニットアルファ)および抗生物質耐性遺伝子(tetA様遺伝子)(配列番号)であった。
プライマーをpBAV1KT5−XylR−PldhA主鎖増幅に使用した。CRISPRアレイgBlockおよびオーバーハングを有する主鎖を、製造業者(NewEngland Biolabs)の指示に従いGibson Master Mix(登録商標)で混合した。産物を最後にエシェリキア・コリTOP10エレクトロコンピテント細胞に形質転換した。
一夜固定相培養物を、対応する抗生物質含有THブロスで1:100に希釈した。対数中期細胞を、種々の濃度のD−(+)−キシロース(0%wt/vol、0.001%wt/vol、0.01%wt/vol、0.1%wt/vol、0.5%wt/volおよび1%wt/vol)で誘発させ、細胞培養を培地の自己蛍光の程度を評価するために培地で直接、細胞懸濁液または懸濁液緩衝液(PBS緩衝液)で測定した。細胞培養物の20μlサンプルを平底96ウェルプレートで、PBS緩衝液で1/10希釈した。細胞懸濁液または培地の蛍光をプレートリーダーで読んだ。mCherry蛍光を、励起波長558nmおよび放出波長612nmを使用して測定した。再懸濁細胞の吸光度をOD600nmで測定した。最低3回の独立した生物学的反復を各実験で行った。
両方ともDNAポリメラーゼIIIをターゲティングするCRISPRアレイおよびストレプトコッカス・サーモフィルスのtetAを含むプラスミドを備えたストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9およびエシェリキア・コリTOP10を、一夜、プラスミド維持のために30μg ml−1のカナマイシンを添加した3ml培養で増殖させた。翌日、96ウェル深ウェルプレートで、500μlの一夜培養物の1/100を、30μg ml−1カナマイシン添加新鮮TH培地に接種した。対数中期細胞培養を1%キシロースで誘発した。死滅効果をストレプトコッカス・サーモフィルスおよびエシェリキア・コリ単独で試験した。試験した各株および条件について、陰性対照をキシロース非存在下に維持した。細胞をOD約0.5まで増殖させ、次にTH培地で10倍連続希釈し、96ウェルレプリケーター(Mettler Toledo LiquidatorTM 96)を使用して、5μL体積滴をTH寒天に維持し、TH寒天をg・l−1 PEAプレートで添加した。プレートを24時間、37℃でインキュベートし、コロニー形成単位(CFU)をトリプリケート測定から計算した。
2.1 増殖条件および選択培地
我々は、まず、最初に細菌株および我々が共培養実験に使用することを意図していた全株の増殖を支持する培養プロトコールの確立に着手した。我々は、37℃でTHブロスにおけるエシェリキア・コリと類似した増殖を支持できたストレプトコッカス・サーモフィルス株LMD−9を使用した(図3)。
混合培養からの種々の細菌の鑑別は、それぞれの種の細胞数を決定するために重要である。マッコンキー寒天を用いてエシェリキア・コリを選択的に増殖させることは可能であるが、ストレプトコッカス・サーモフィルスの選択的増殖のための特定の培地はない。PEA寒天は、グラム陰性菌(エシェリキア・コリ)からグラム陽性菌(ストレプトコッカス・サーモフィルス)を単離するのに使用される選択培地である。さらに、我々は、種々の濃度のPEAが他のグラム陽性菌の増殖を一部阻害し、これが本実験で使用する他のグラム陽性細菌間の選択を可能とすることを発見した(図4)。3g・l−1のPEAが、エシェリキア・コリの増殖を制限しながら、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9を選択的増殖させることが証明された。
ストレプトコッカス種のための誘導システムは、先に、異種性キシロース誘導カセット(Xyl−S)を作ることによりバチルス・メガテリウムキシロースオペロン(図5)に基づき開発された。xylRおよびxylAプロモーターを、それぞれ、ストレプトコッカス・ミュータンスの構成的に発現されるgyrAおよびldhプロモーターと置き換えた。ストレプトコッカス種のためのこの発現カセットは、様々な種間で感度および発現レベルの差を示従、しかしながらシステムはストレプトコッカス・サーモフィルスで試験されなかった(Xie et al. 2013)。それ故に我々は、まずストレプトコッカス・サーモフィルスにおけるキシロース誘導カセットの検証に着手した。
誘導カセットの別バージョンを、xylRプロモーターのみをストレプトコッカス・ミュータンスのgyrAプロモーターで置換し、内在性バチルス・メガテリウムxylAプロモーターをそのままにすることにより構築した。キシロース誘導可能システムの設計中、我々は、両バージョンの誘導可能プロモーター、バチルス・メガテリウムに見られる天然PXylAプロモーターおよびPXylAプロモーターのリプレッサー結合部位に融合した高度に保存されたプロモーターPldhaのハイブリッドプロモーターを考慮した(図5)。数ストレプトコッカス種のみがキシロースを代謝すると報告されており、故に他のストレプトコッカス種におけるxylAプロモーターを認識するための制御機構の存在の可能性はない。それ故に我々は両キシロース誘導システムを構築従、mCherryのPldha+XylAシステムでの誘導性のみ試験した。
キシロースでのmCherry誘導可能発現を決定するために、プラスミド(pBAV1KT5−XylR−mCherry−Pldha+XylA)との細胞の対数中期培養物を、種々の濃度のキシロースで誘発した。誘導6時間後、我々はmCherry蛍光を培養物で測定し、我々は、プラスミド担持細胞での実質的に高い全体的発現レベルを観察した(図6)。残念ながらシステムが、キシロースを添加していない培養物でも相当レベルの基底発現を示したことが見られた。これは、システムが‘漏出性’であり、死滅−アレイでは、システムがキシロースで誘導される前から細胞死をもたらし得ることを意味する。しかしながら、その後の研究で、我々は両バージョンのプラスミド(pBAV1KT5−XylR−mCherry−Pldha+XylAおよびpBAV1KT5−XylR−mCherry−PxylA)を使用した。
CRISPRアレイにおけるゲノムターゲティングスペーサーが、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9の死滅を誘発できるかを決定するために、我々は、先に構築した2キシロース誘導可能システム(pBAV1KT5−XylR−mCherry−Pldha+XylAおよびpBAV1KT5−XylR−mCherry−PxylA)にCRISPRアレイを挿入した。これらのプラスミドで、我々はmCherryを、CRISPRアレイ含有gBlockと置き換えた(図7)。Pldha+XylAプロモーターを有するバリアントは、PxylAより強力であり、高い基底活性を有することが予測された(Xie et al. 2013)。
エシェリキア・コリにおいてプラスミドを構築後、我々は、プラスミドをストレプトコッカス・サーモフィルスに形質転換した。これは、我々が特定の細菌種の細胞死を誘発できたかどうかの決定を可能とする。興味深いことに、強Pldh+XylAハイブリッドプロモーター含有プラスミドに曝したストレプトコッカス・サーモフィルスの細菌宿主集団サイズ(増殖細菌および寒天プレート上のコロニー数計数により示す)は、弱い、通常のPxylAプロモーターを含むプラスミドに曝したストレプトコッカス・サーモフィルスと比較して10倍低く(図8;強アレイ発現での52コロニー対弱アレイ発現での556コロニー、10.7倍差)、2株は、同じバッチのエレクトロコンピテントストレプトコッカス・サーモフィルス細胞を使用して並行して形質転換されている。これは、我々に、CRISPRアレイターゲティングストレプトコッカス・サーモフィルス遺伝子担持プラスミドが、内在性CasヌクレアーゼおよびRNase IIIを使用して細胞を殺し、それにより集団増殖を10倍阻害することを示唆した。
我々は、PxylAプロモーター含有プラスミドで形質転換した宿主細胞における弱アレイ発現が、強プロモータープラスミドよりはるかに低くても、ある程度の細胞死をもたらすと予測した。我々は、観察された10倍阻害より大きな集団増殖阻害が、強アレイ発現の活性の比較を、何れのアレイコード化プラスミドにも曝していないストレプトコッカス・サーモフィルス(例えば腸内微生物相から直接単離された細菌)と行ったときに見られることを予測した。それ故に、我々は、内在性Casヌクレアーゼを利用するための宿主細胞におけるアレイ(または単一ガイドRNA)発現は、ここに記載する環境、医薬および他の設定における標的宿主細胞の効率的増殖阻害提供に有用であることを確信する。抗生物質の共投与も、、特に1以上の抗生物質耐性遺伝子が標的であるとき、増殖阻害の増強に有用である。
この研究において、我々は、内在性Cas9システムを使用してストレプトコッカス・サーモフィルスを特異的に死滅させるCRISPR−アレイの設計に着手した。死滅シグナルの制御を獲得するために、我々は、ストレプトコッカス・サーモフィルスで適用できる誘導可能システムを探索した。バチルス・メガテリウムからのキシロース誘導可能XylRシステムは先にストレプトコッカス・ミュータンスで適用されていたが(Xie, 2013)、ストレプトコッカス・サーモフィルスではなかった。この研究において、我々は、ストレプトコッカス・サーモフィルスでのXylR−mCherry−Pldha回路設計を使用して、xylR誘導システムの機能性を示した。我々は、0.1%wt/volがストレプトコッカス・サーモフィルスでXylRシステムを完全に誘発するのに十分であることを発見した(図6)。
共培養ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびエシェリキア・コリの存在比を観察するために、我々は、培養培地への3g・l−1のPEAの添加が、エシェリキア・コリの増殖を制限しながら、ストレプトコッカス・サーモフィルスの選択的増殖を可能とすることを確立した(図4)。
ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9ゲノムにおけるDNAポリメラーゼIIIサブユニットアルファおよびtetA様遺伝子をターゲティングするST1−CRISPRアレイを、キシロース誘導可能プロモーター(Xie et al. 2013)下においた。これらの領域のターゲティングは、二本鎖中断をもたらし、故にストレプトコッカス・サーモフィルス生存能を制限するはずである(図9)。改変されたアレイを、コード化CRISPRアレイ加工のために内在性CRISPR/Cas機構を使用してストレプトコッカス・サーモフィルスゲノムを標的とするよう設計したため、アレイは、エシェリキア・コリのような無関係株の増殖に、そのゲノムに類似する標的が見られるとしても、影響がないことが予測される。これは、実施例8に記載するとおり、混合細菌集団(ヒト微生物相の態様を模倣)で試験して、成功した。
表面上の宿主細胞増殖を阻害する本発明の能力の証明は、本発明がヒトまたは動物対象におけるここに開示する微生物相が介在するまたは引き起こされる疾患または状態の処置または予防のためである実施態様において重要かつ望ましい。このような微生物相は、一般に対象の組織(例えば、腸、口腔、肺、腋窩、眼、膣、肛門、耳、鼻または咽頭組織)と接触しており、故に我々は、表面上の微生物相細菌種(ストレプトコッカスにより例示される)の増殖阻害の活性の証明は、この有用性を支持すると考える。
実施例6は、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9の特異的増殖阻害を示した。ここで、我々は、増殖阻害が、また第二株:ストレプトコッカス・サーモフィルスDSM 20617でも得ることができることを示す。実施例6に記載した方法を(ストレプトコッカス・サーモフィルスDSM 20617の選択培地は、2.5g・l−1の2−フェニルエタノール(PEA)添加TH培地であった以外)、それ故に、後者の株に適用した。
CRISPRアレイプラスミドで形質転換したストレプトコッカス・サーモフィルスDSM 20617を、回復のために液体培地で3時間、37℃でインキュベートし、これはカナマイシン耐性の発現を可能とした。回復期間後、細胞死を誘発するための1%キシロース存在下および対照としてキシロース非存在下で、細胞を種々の選択培地に播種した(図10)。(1)キシロース誘導により、ストレプトコッカス・サーモフィルスの増殖が阻害できる(‘強’プロモータープラスミド対対照で約10倍)、(2)‘強’システム(pBAV1KT5−XylR−CRISPR−PldhA)が‘弱’システム(pBAV1KT5−XylR−CRISPR−PxylA)より多い増殖減少をもたらすことが示される。
我々は、次に、3種の混合集団における特定の細菌種の選択的増殖阻害を示した。我々は、ヒトおよび動物の腸内微生物相に見られる種を選択した(ストレプトコッカス・サーモフィルスDSM 20617(T)、ラクトバチルス・ラクティスおよびエシェリキア・コリ)。我々は2グラム陽性種(ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトコッカス・ラクティス)を包含させ、これが前者の種の選択的死滅に対する能力に影響するかを調べ、さらに困難性を上げるために(および微生物相をより密接に模倣するために)、ストレプトコッカス・サーモフィルスと系統的に関連する種であるためラクトコッカス・ラクティスを選択した(2種間の高16sリボソームRNA配列同一性により示される)。ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトコッカス・ラクティスは、両者ともファーミキューテスである。さらに、微生物相を模倣するため、ヒト片利共生腸種(エシェリキア・コリ)を包含させた。
実施例6に示す方法を株に使用した(選択培地が2.5g・l−1の2−フェニルエタノール(PEA)添加TH培地であった以外)。
0.5Mスクロースおよび1%グリシン添加TH培地でのラクトコッカス・ラクティスの一夜培養物を5mlの同じ培地で100倍希釈し、30℃でOD6000.2〜0.7まで増殖させた(接種約2時間後)。細胞を7000×gで5分、4℃で回収し、5mlの氷冷洗浄緩衝液(0.5Mスクロース+10%グリセロール)で3回洗浄した。細胞洗浄後、OD60015〜30でエレクトロポレーション緩衝液(0.5Mスクロース、10%グリセロールおよび1mM MgCl2)に懸濁した。エレクトロポレーション緩衝液中の細胞を使用するまで4℃に維持するか(1時間以内)または後に使用するためにエッペンドルフチューブに50μlで等分し、液体窒素で冷凍し、−80℃で保存した。
全種のエレクトロポレーション条件は実施例6に記載のとおりであった。
ストレプトコッカス・サーモフィルスDSM 20617、ラクトコッカス・ラクティスMG1363およびエシェリキア・コリTOP10を、DNAポリメラーゼIIIをターゲティングするCRISPRアレイおよびストレプトコッカス・サーモフィルスのtetAを含むプラスミドで遺伝学的に形質転換した。形質転換後、全細胞を単独および共培養で3時間、37℃で培養し、プラスミドによりコードされる抗生物質耐性発現のための回復をさせた。我々は、CRISPRコード化増殖阻害の読み出し情報として形質転換効率を使用することを決定した。そして、細胞を回復させた後、培養物を、全てカナマイシンが添加されたTH培地、PEA添加THおよびマッコンキー寒天に播種し、1%キシロースで誘導した。
2.0 ラクトコッカス・ラクティス、エシェリキア・コリおよびストレプトコッカス・サーモフィルスの系統的距離
ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトコッカス・ラクティスの16S rrNAコード化DNA配列における計算された配列類似性は83.3%と決定された。次の16S配列を使用した:エシェリキア・コリ:AB030918.1、ストレプトコッカス・サーモフィルス:AY188354.1、ラクトコッカス・ラクティス:AB030918。配列を次のパラメータを用いてニードルでアラインした(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html):−gapopen 10.0 -gapextend 0.5 -endopen 10.0 -endextend 0.5 -aformat3 pair -snucleotide1 -snucleotide2。図11は、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクティスおよびエシェリキア・コリからの16S配列の最尤推定系統樹を示す。
ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトコッカス・ラクティスは、多くの発酵食品およびヨーグルトで一般に組み合わせで使用される。我々は、宿主と密接に関係する腸微生物として一般に知られ、ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトコッカス・ラクティスの16SリボソームRNA領域の先の特徴づけがこれらの生物が系統学的に密接に関係することを示していたため、これらの株を選択した(Ludwig et al., 1995)。並行して、我々はまたエシェリキア・コリがまた腸微生物共同体で一般に見られるため、我々の混合集団共培養実験においてこの生物の増殖も評価した。我々はまず細菌株および我々が共培養実験に使用することを意図していた全株の増殖を支持する培養プロトコールの確立に着手した。我々は、全株がTHブロスで37℃で増殖が支持され得ることを発見した(図3)。
混合培養からの種々の細菌の鑑別は、様々な種の細胞数を決定するために重要である。マッコンキー寒天を用いてエシェリキア・コリを選択的に増殖させることは可能であるが、ストレプトコッカス・サーモフィルスの選択的増殖のための特定の培地はない。PEA寒天は、グラム陰性菌(エシェリキア・コリ)からグラム陽性菌(ストレプトコッカス・サーモフィルス)を単離するのに使用される選択培地である。さらに、種々の濃度のPEAが他のグラム陽性菌の増殖を一部阻害し、これが本実験で使用する他のグラム陽性細菌間の選択を可能とする。2.5g・l−1のPEAの使用が、ラクトコッカス・ラクティスおよびエシェリキア・コリの増殖を制限しながら、ストレプトコッカス・サーモフィルスを選択的増殖させることを確実とした。
全株をカナマイシン選択マーカーを有するpBAV1KT5のベクター主鎖を使用したプラスミドで形質転換し、我々は、30μg ml−1のカナマイシン添加培地が、プラスミドを維持しながら細胞を増殖させるのに十分であることを発見した。
我々は、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクティスおよびエシェリキア・コリをCRISPRアレイを含むプラスミドで形質転換し、当量部で合わせた全細菌種の共同体でこれらを培養し、これはまた我々がストレプトコッカス・サーモフィルスに特異的に細胞死をもたらすことができたかを決定することも可能とした。我々は、全種をpBAV1KT5−XylR−CRISPR−PXylAまたはpBAV1KT5−XylR−CRISPR−Pldha+Xylプラスミドで形質転換した。
図12は、pBAV1KT5−XylR−CRISPR−PxylAまたはpBAV1KT5−XylR−CRISPR−PldhA+Xylプラスミドを担持するエシェリキア・コリ、ラクトコッカス・ラクティスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスの共培養における選択的ストレプトコッカス・サーモフィルス増殖阻害を示す。pBAV1KT5−XylR−CRISPR−PxylAまたはpBAV1KT5−XylR−CRISPR−PldhA+Xylプラスミドを担持するエシェリキア・コリで増殖差異は観察されない(中央カラム)。しかしながら、ストレプトコッカス・サーモフィルス(2.5g・l−1 PEA添加TH寒天上で選択的増殖、最後のカラム)は、我々が予想したとおり、pBAV1KT5−XylR−CRISPR−PxylA(強)またはpBAV1KT5−XylR−CRISPR−PldhA+XylA(弱)プラスミドで形質転換効率の減少を示した。こうして、我々は、細胞の混合集団における標的ストレプトコッカス・サーモフィルス亜集団の選択的増殖阻害を示した。
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例えば、本発明の1以上のスペーサーは、この配列表における各配列を標的とする。配列番号1−44は、タイプII CRISPR/Casシステム配列、例えば、ストレプトコッカス配列である。
Claims (35)
- 混合細菌集団中の第一細菌および第二細菌の亜集団の相対比率を変えるための宿主修飾(HM)CRISPR/Casシステムの使用であって、第二細菌は宿主細胞に含まれ、各宿主細胞について、下記(i)〜(iv)
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列;
(ii)HM−crRNAをコードするスペーサー配列(HM−スペーサー)および反復を含む宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾(HM)CRISPRアレイであって、HM−crRNAは該Casを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの;
(iii)任意のtracrRNA配列またはtracrRNA配列を発現するDNA配列;
(iv)ここで、システムの該要素は、宿主細胞と宿主細胞を形質転換する少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりHM−crRNAがCasを標的にガイドし、宿主細胞における宿主CRISPR/Casシステムを修飾し;そして
ここで標的配列がCasにより修飾され、それにより宿主細胞が死滅するかまたは宿主細胞増殖が減少する
の要素を含む、システム。 - 細菌宿主細胞の標的ヌクレオチド配列の修飾のための請求項1に記載の使用のための宿主修飾(HM)CRISPR/Casシステムであって、下記(i)〜(iv)
(i)Casヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸配列;
(ii)HM−crRNAをコードするスペーサー配列(HM−スペーサー)および反復を含む宿主細胞標的配列および改変された宿主修飾(HM)CRISPRアレイであって、HM−crRNAは該Casを宿主細胞の標的にガイドし、標的配列を修飾するために宿主細胞標的配列とハイブリダイズする配列を含むもの;
(iii)任意のtracrRNA配列またはtracrRNA配列を発現するためのDNA配列;
(iv)ここで、システムの該要素は宿主細胞と、宿主細胞を形質転換できる少なくとも一つの核酸ベクターの間で分かれ、それによりHM−crRNAがCasを標的にガイドし、宿主細胞における宿主CRISPR/Casシステムを修飾する
の要素を含む、システム。 - ベクターまたはベクターがCas(例えば、Cas9)ヌクレアーゼコード化配列を欠く、請求項2に記載のシステム。
- 各宿主細胞がヒト微生物相に見られる株または種のものである、請求項1〜3の何れかに記載の使用またはシステム。
- (a)混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率の改変、(b)混合細菌集団におけるファーミキューテス亜集団(宿主細胞)の比率の減少、(c)混合集団における第一ファーミキューテス種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団が該cRNAにより増殖が阻害されない第二ファーミキューテス種を含むもの、(d)混合細菌集団における第一グラム陽性細菌種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団が該cRNAにより増殖が阻害されない第二グラム陽性細菌種を含むもの、(e)混合細菌集団におけるある細菌種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団が該cRNAにより増殖が阻害されない異なる細菌種を含み、ここで第一種が他の種の16sリボソームRNAコード化DNA配列と少なくとも80%同一である16sリボソームRNAコード化DNA配列を含むもの、(f)混合細菌集団における第一細菌ヒト腸内微生物相種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス)の比率の減少であって、ここで混合集団は異なる細菌種を含み、ここで異なる種が該cRNAにより増殖が阻害されないヒト腸プロバイオティク種であるものまたは(g)混合細菌集団における細菌ヒト腸内微生物相種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス)の比率の減少であって、ここで混合集団が異なる細菌種を含み、ここで異なる種が該cRNAにより増殖が阻害されないヒト腸片利共生種であるもののための、請求項1または4に記載の使用。
- (a)混合細菌集団におけるバクテロイデス門細菌の比率の改変、(b)混合細菌集団におけるファーミキューテス亜集団(宿主細胞)の比率の減少もの、(c)混合集団における第一ファーミキューテス種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団が該cRNAにより増殖が阻害されない第二ファーミキューテス種を含むもの、(d)混合細菌集団における第一グラム陽性細菌種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団が該cRNAにより増殖が阻害されない第二グラム陽性細菌種を含むもの、(e)混合細菌集団におけるある細菌種(宿主細胞)の比率の減少であって、ここで混合集団が該cRNAにより増殖が阻害されない異なる細菌種を含み、ここで第一種が他の種の16sリボソームRNAコード化DNA配列と少なくとも80%同一である16sリボソームRNAコード化DNA配列を含むもの、(f)混合細菌集団における第一細菌ヒト腸内微生物相種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス)の比率の減少であって、ここで混合集団が異なる細菌種を含み、ここで異なる種が該cRNAにより増殖が阻害されないヒト腸プロバイオティク種であるものまたは(g)混合細菌集団における細菌ヒト腸内微生物相種(宿主細胞、例えば、ファーミキューテス)の比率の減少であって、ここで混合集団が異なる細菌種を含み、ここで異なる種が該cRNAにより増殖が阻害されないヒト腸片利共生種であるものであって、ここで(a)〜(g)は、ヒトまたは動物対象における(i)比率が減少される該細菌種による微生物相感染または(ii)比率が減少される該細菌種が介在する疾患または状態の処置または予防のためである、請求項2または3に記載のシステム。
- ファーミキューテスに対するバクテロイデス門の相対的比率を増加させるための、請求項5または6に記載の使用またはシステム。
- 該Casヌクレアーゼが該細胞の内在性タイプII CRISPR/Casシステムにより提供される、請求項1〜7の何れかに記載の使用またはシステム。
- 要素(i)が宿主細胞に内在性である、請求項1〜8の何れかに記載の使用またはシステム。
- 標的配列が宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子、病原性遺伝子または必須遺伝子に含まれる、請求項1〜9の何れかに記載の使用またはシステム。
- 標的配列が宿主染色体配列である、請求項1〜10の何れかに記載の使用またはシステム。
- あるいはHM−crRNAおよびtracrRNAが単一ガイドRNA(gRNA)からなる、例えばベクターにより提供される、請求項1〜11の何れかに記載の使用またはシステム。
- 宿主細胞が目的のHM配列をコードする遊離末端(HM−DNA)を有するデオキシリボ核酸鎖を含むおよび/またはここでシステムがHM−DNAをコードする配列を含み、ここでHM−DNAは、HM−DNAを宿主ゲノム(例えば、染色体またはエピソーム部位)に挿入するために標的配列内にあるまたは隣接する1個以上の配列にそれぞれ相同である1個以上の配列を含む、請求項1〜12の何れかに記載の使用またはシステム。
- 内在性CRISPR/Casシステムを含む細菌宿主細胞修飾のための請求項1の使用のための改変された核酸ベクターであって、
(a)請求項1〜13の何れかに記載のCRISPR/Casシステムまたは使用における使用のための複数の異なるcrRNAを発現するための核酸配列を含み(例えば、gRNAに含まれる);そして
(b)所望によりCasヌクレアーゼをコードする核酸配列を欠き、
ここで、該crRNAの第一は該宿主細胞の第一核酸配列とハイブリダイズでき、そして該crRNAの第二は該宿主細胞の第二核酸配列とハイブリダイズでき、ここで該第二配列は該第一配列と異なり;そして
(c)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は抗抗生物質耐性遺伝子(またはそのRNA)を含み、所望により、これらの遺伝子は異なり;
(d)第一配列は抗生物質耐性遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含み;
(e)第一配列は必須遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含むまたは
(f)第一配列は病原性遺伝子(またはそのRNA)を含み、第二配列は必須または病原性遺伝子(またはそのRNA)を含む、
ベクター。 - ベクターによりコードされるcRNA(例えば、単一ガイドRNA)により動作可能である1以上のCasを含む宿主細胞宿主内の、請求項14に記載のベクター。
- システムまたはベクター、ここでHM−CRISPRアレイが同じスペーサーの複数コピーを含む、請求項1〜15の何れかに記載の使用。
- ベクターが複数のHM−CRISPRアレイを含む、請求項1〜16の何れかに記載の使用、システムまたはベクター。
- 各ベクターがウイルスまたはファージである、請求項1〜17の何れかに記載の使用、システムまたはベクター。
- システムまたはベクターがcrRNA(例えば、gRNA)をコードする核酸配列の2、3またはそれ以上のコピーを含み、ここでコピーが宿主細胞配列(例えば、病原性、耐性または必須遺伝子配列)のターゲティングのための同じスペーサー配列を含む、請求項1〜18の何れかに記載の使用、システムまたはベクター。
- コピーが2以上のベクターCRISPRアレイ間に別れる、請求項20に記載の使用、システムまたはベクター。
- 請求項1〜20の何れかに記載のシステムまたはベクターを含む、細菌宿主細胞。
- アレイが抗生物質薬剤と組み合わされるまたは使用が宿主細胞の第一抗生物質への暴露を含み、ここで標的配列が該第一抗生物質への耐性のために抗生物質耐性遺伝子に含まれる、請求項1〜21の何れかに記載の使用、システム、ベクターまたは細胞。
- 宿主細胞がスタフィロコッカス、ストレプトコッカス、シュードモナス、サルモネラ、リステリア、エシェリキア・コリ、デスルホビブリオまたはクロストリジウム宿主細胞である、請求項1〜22の何れかに記載の使用、システム、ベクターまたは細胞。
- 各ベクターが請求項14または15に記載される、請求項1〜13または16〜23の何れかに記載の使用、システムまたは細胞。
- 宿主細胞集団増殖が、該HM−アレイまたは該gRNAをコードするヌクレオチド配列で形質転換されていない該宿主細胞の集団の増殖と比較して少なくとも5倍減少している、請求項1〜24の何れかに記載の使用、システム、ベクターまたは細胞。
- 表面上の宿主細胞集団増殖が阻害される、請求項1〜25の何れかに記載の使用、システム、ベクターまたは細胞。
- 第一細菌がヒトとプロバイオティク、片利共生または相利共生である(例えば、ヒト腸における)、請求項1〜の何れかに記載の使用、システム、ベクターまたは細胞。
- 第一細菌および第二細菌が何れもファーミキューテスであり、異なる種または株の細菌であるかまたは第一細菌が腸内細菌科であり、第二細菌がファーミキューテスである、請求項1〜27の何れかに記載の使用、システム、ベクターまたは細胞。
- 宿主細胞が細菌細胞ではなくて古細菌細胞であるかまたは各集団が細菌集団ではなくて古細菌集団である、請求項1〜28の何れかに記載の使用、システム、ベクターまたは細胞。
- 産業用またはエクスビボでの医学的流体、表面、装置またはコンテナまたは水路、水、飲料、食糧または化粧品の処理のためであって、ここで宿主細胞が流体、表面、装置、コンテナ、水路、水、飲料、食糧または化粧品に含まれるまたは上にある、請求項1、4、5、7〜13、16〜20および22〜29の何れかの使用。
- HM−cRNAまたはgRNAがNNAGAAWまたはNGGNGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接する宿主細胞標的プロトスペーサー配列とハイブリダイズ可能な配列を含む、請求項1〜30の何れかに記載の使用、システム、ベクターまたは細胞。
- 1.4kbを超える外来性DNA配列を含み、ここで外来性DNAはCRISPR/Casシステムの1以上の要素をコードし、宿主細胞におけるHM−crRNAまたはgRNAの発現のための改変されたアレイを含み、ここで外来性配列がcRNAまたはgRNAと同族であるCasヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を欠き、ここで少なくとも2つの異なるcRNAまたはgRNAが外来性DNAによりコードされる(例えば、少なくとも2HM−CRISPRアレイにより)、請求項1〜31の何れかに記載のその使用、システムまたは細胞における使用のための核酸ベクター。
- ベクターが宿主細胞を形質転換できるウイルスベクターである、請求項32に記載のベクター。
- cRNAまたはgRNAは各標的プロトスペーサー配列に対して宿主細胞においてハイブリダイズでき、ここで各プロトスペーサー配列が抗生物質耐性または必須宿主遺伝子に含まれる、請求項32または33に記載のベクター。
- 宿主細胞がヒト微生物相種の細胞である、請求項34〜36の何れかに記載のベクター。
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