CN111849822A - 对抗菌素敏感的非o1/o139型霍乱弧菌菌株及应用 - Google Patents

对抗菌素敏感的非o1/o139型霍乱弧菌菌株及应用 Download PDF

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CN111849822A CN202010738880.8A CN202010738880A CN111849822A CN 111849822 A CN111849822 A CN 111849822A CN 202010738880 A CN202010738880 A CN 202010738880A CN 111849822 A CN111849822 A CN 111849822A
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Abstract

本发明提供了一种对抗菌素敏感的非O1/O139型霍乱弧菌菌株及应用，该菌株为Vibrio cholerae CHN‑F4菌株，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020260；其编码的特异性lolB基因的序列如SEQ ID NO.1所示；其编码的16S rRNA基因的序列如SEQ ID NO.2所示；其对十种抗菌素敏感，包括氨苄西林、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、利福平、壮观霉素、链霉素、四环素、复方新诺明和甲氧苄氨嘧啶；本发明不仅为我国检测用微生物参考物质提供了新菌种资源，而且为霍乱弧菌进化、食品安全，以及环境污染的研究提供了模式菌株。

Description

对抗菌素敏感的非O1/O139型霍乱弧菌菌株及应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种从中国长江入海口表层海水中分离、鉴定得到的对十种抗菌素敏感的非O1/O139型霍乱弧菌菌株(即Vibrio cholerae CHN-F4)及应用。
背景技术
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是革兰氏阴性细菌，隶属于γ-变形菌门(Gammaproteobacteria)、弧菌目(Vibrionales)、弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌属(Vibrio)。该菌生存于近岸海域、河口、养殖水域等环境，并常见于甲壳类和鱼类等水产品中。迄今为止，已被鉴定的霍乱弧菌至少分为206个血清型，其中仅O1和O139血清型产生“霍乱”毒素(Cholera Toxin，CT)和毒素共调节菌毛(Toxin-Coregulated Pilus，TCP)，引发“霍乱”的爆发与流行。据文献报道，大多数霍乱弧菌环境分离菌株不携带CT和TCP的编码基因。中国长江入海口具有独特的生态环境，然而，涉及中国长江入海口的霍乱弧菌及其对抗菌素耐受性的研究鲜有报道。
源自中国长江入海口表层海水中，对十种抗菌素敏感的非O1/O139型霍乱弧菌未见报道。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明从中国长江入海口表层海水中分离、鉴定得到一株对十种抗菌素敏感的菌株，经鉴定为一株新的非O1/O139型霍乱弧菌菌株，即Vibriocholerae CHN-F4，从而填补了我国在该领域研究的空白。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种对抗菌素敏感的非O1/O139型霍乱弧菌菌株，拉丁文学名为Vibriocholerae，菌株名为CHN-F4。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center forType Culture Collection,CCTCC)，中国，武汉大学；保藏日期为2020年7月1日；保藏编号为：CCTCC NO：M 2020260。
该非O1/O139型霍乱弧菌菌株不携带霍乱毒素、毒素共调节菌毛的编码基因ctxAB和tcpA，及辅助毒素小带联结毒素(Zonula Occludens Toxin，ZOT)、附属霍乱肠毒素(Accessory Cholera Enterotoxin，ACE)的编码基因zot和ace，上述检测均为阴性。
进一步地，该非O1/O139型霍乱弧菌CHN-F4菌株的特异性lolB基因的序列如SEQID NO.1所示。
进一步地，该非O1/O139型霍乱弧菌CHN-F4菌株的16S rRNA基因的序列如SEQ IDNO.2所示。
进一步地，该非O1/O139型霍乱弧菌CHN-F4菌株对十种抗菌素敏感，包括氨苄西林(Ampicillin)、氯霉素(Chloramphenicol)、庆大霉素(Gentamicin)、卡那霉素(Kanamycin)、利福平(Rifampicin)、壮观霉素(Spectinomycin)、链霉素(Streptomycin)、四环素(Tetracycline)、复方新诺明(Sulfamethoxazole-Trimethoprim)和甲氧苄氨嘧啶(Trimethoprim)。
一种对抗菌素敏感的非O1/O139型霍乱弧菌菌株在检测和研究微生物中的应用。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明的对抗菌素敏感的非O1/O139型霍乱弧菌菌株，即Vibrio cholerae CHN-F4；其编码的霍乱弧菌的特异性lolB基因的序列如SEQ ID NO.1所示；其编码的16S rRNA基因的序列如SEQ ID NO.2所示；其不携带“霍乱”毒素CT和毒素共调节菌毛TCP的编码基因ctxAB、tcpA，以及辅助毒素小带联结毒素ZOT和附属霍乱肠毒素ACE的编码基因zot和ace；其对十种抗菌素敏感，包括氨苄西林、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、利福平、壮观霉素、链霉素、四环素、复方新诺明和甲氧苄氨嘧啶；本发明不仅为我国检测用微生物参考物质提供了新菌种资源，而且为霍乱弧菌进化、食品安全，以及环境污染的研究提供了模式菌株。
附图说明
图1是本发明实施例1中获得的霍乱弧菌CHN-F4菌株在胰蛋白胨大豆培养基(Tryptic Soy Broth，TSB)(pH 8.5，3％NaCl)琼脂(1.5％)平板上的菌落特征，培养温度为37℃。
图2是本发明实施例3中上述霍乱弧菌CHN-F4菌株的精氨酸双水解酶试验(Double-Arginine Dihydrolase Test，D-ADT)(A)和七叶苷水解试验(EsculinHydrolysis Test，EHT)(B)结果。其中，反应管号从左至右依次表示接种阳性对照(霍乱弧菌GIM 1.449标准菌株)、空白对照(未接种菌株)、接种霍乱弧菌CHN-F4菌株。
图3是本发明实施例4中4.1的获得的霍乱弧菌CHN-F4菌株的基因组DNA样品的琼脂糖凝胶电泳分析结果。其中，泳道M表示DNA分子量Marker(λDNA/Hind III Marker)；泳道1：阳性对照，霍乱弧菌GIM 1.449标准菌株的基因组DNA样品；泳道2：空白对照，不加DNA样品；泳道3：霍乱弧菌CHN-F4菌株的基因组DNA样品。电泳条件：琼脂糖凝胶浓度为0.7％，电压100V，电泳时间约30min。
图4是本发明实施例4中4.2获得的霍乱弧菌CHN-F4菌株的霍乱弧菌的特异性lolB基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果。其中，泳道M表示DNA分子量Marker(D15000+200)；泳道1:阳性对照，反应模板为标准菌株霍乱弧菌GIM 1.449的基因组DNA样品；泳道2：空白对照，不加DNA模板；泳道3：霍乱弧菌CHN-F4菌株的基因组DNA样品。电泳条件：琼脂糖凝胶浓度为2％，电压120V，电泳时间约35min。
图5是本发明实施例4中4.3获得的霍乱弧菌CHN-F4菌株的16S rRNA基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果。其中，泳道M表示DNA分子量Marker(D15000+200)；泳道1:阳性对照，反应模板为标准菌株霍乱弧菌GIM 1.449的基因组DNA样品；泳道2：空白对照，不加DNA模板；泳道3：反应模板为霍乱弧菌CHN-F4菌株的基因组DNA样品。电泳条件：琼脂糖凝胶浓度为2％，电压120V，电泳时间约30min。
图6是本发明实施例5获得的霍乱弧菌CHN-F4菌株基于16S rRNA基因的系统进化树(Phylogenetic Tree)。其中，霍乱弧菌CHN-F4菌株的16S rRNA基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；其它参考菌株的16S rRNA基因的核苷酸序列来源自GenBank数据库，其序列登录号标注于菌株名称后面括号内，包括16株霍乱弧菌、2株副溶血性弧菌(Vibroparahaemolyticus)，以及2株创伤弧菌(Vibrio vulnificus)。
霍乱弧菌CHN-F4(Vibrio cholerae CHN-F4)保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)，中国，武汉大学；保藏日期为2020年7月1日，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020260。
具体实施方式
本发明提供了一种对抗菌素敏感的非O1/O139型霍乱弧菌菌株及应用。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例中所用的主要试剂包括：硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂(Thiosulfate Citrate Bile Sucrose Agar，TCBS)、胰蛋白胨大豆培养基(Tryptic SoyBroth，TSB)均购自北京陆桥技术有限责任公司，中国；七叶苷培养基(Esculin Medium)、精氨酸双水解酶试验培养基(Double-Arginine Hydrolase Test Medium)均购自上海沐微生物科技有限公司，中国；20×磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffered Saline，PBS，pH 7.4-7.6)、石蜡油(Paraffin Oil)、50×三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸(Tris base-Acetic acid-Ethylenediaminetetraacetic acid,TAE)均购自上海生工生物工程股份有限公司，中国；DNase/RNase-free去离子水、DNA分子量Markers(λDNA/Hind III Marker和D15000+2000)均购自天根生化科技有限公司，中国；2×Taq Master Mix购自上海近岸科技有限公司，中国；Mueller-Hinton Agar(MHA)培养基、氨苄西林(Ampicillin(AMP)，10μg)、氯霉素(Chloramphenicol(CHL)，30μg)、庆大霉素(Gentamicin(CN)，10μg)、卡那霉素(Kanamycin(KAN)，30μg)、利福平(Rifampicin(RIF)，5μg)、壮观霉素(Spectinomycin(SPT)，100μg)、链霉素(Streptomycin(STR)，10μg)、四环素(Tetracycline(TET)，30μg)、复方新诺明(Sulfamethoxazole-Trimethoprim(SXT)，25μg)、甲氧苄氨嘧啶(Trimethoprim(TM)，5μg)均购自OXOID，英国；氯化钠(NaCl)、氢氧化钠(NaOH)均购自国药集团化学试剂有限公司，中国；革兰氏染色液试剂盒购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，中国；滤膜(0.22μm孔径，47mm直径)购自Millipore，爱尔兰；TaKaRa MiniBEST BacterialGenomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒购自Takara Biomedical Technology Co.,Ltd.，中国。
实施例中所用的标准菌株霍乱弧菌GIM 1.449购自广东省微生物菌种保藏中心；大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922菌株购自上海工业微生物研究所。
实施例中所用的主要仪器设备包括：MLS-3750型高压蒸汽灭菌锅(SANYO，日本)；DHP-9082型恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，中国)；JY300C型核酸电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司，中国)；自动凝胶成像扫描仪(BioRad，美国)；Mastercycler proS银制梯度PCR仪、5417R型台式高速低温冷冻离心机(Eppendorf，德国)；多功能酶标仪(BioTek SynergyTM 2multi-Mode Microplate Reader)(BioTek Instruments,Inc.,美国)；PL2002型梅特勒-托利多精密天平(METTLER TOLEDO，瑞士)；ACB-A型超净工作台(EscoMicro Pte Ltd.，新加坡)。
实施例中所用的寡核苷酸引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
实施例1：霍乱弧菌CHN-F4菌株的分离
参考中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口食品中霍乱弧菌检验方法(SN/T 1022-2010)，以及美国食品与药品监督管理局制定的细菌学分析手册(8thEdition，Revision A，1998)分离、鉴定霍乱弧菌。
2018年6月19日15时，于中国长江入海口(30°87′44.55″N，121°95′24.54″E)，采集表层(<20cm)海水于无菌采样瓶中，置于低温冷藏采样箱于半小时内运回实验室进行下列分析。
利用循环水式多用真空泵，采用中性滤纸过滤去除水样中的泥沙颗粒，收集滤液；再通过0.22μm孔径滤膜过滤，弃滤液，把截留菌体的滤膜(2L海水/滤膜)置于5mL无菌1×PBS溶液中，充分震荡悬浮滤膜上的菌体，于5000×g离心6min，弃上清液，收集细胞沉淀。用1mL 1×PBS溶液悬浮菌体沉淀，再加入9mL 1×PBS溶液，充分混匀，制备成1:10(v/v)的菌体稀释液。按上述操作依次制备10倍梯度(101-106，v/v)的菌体稀释液。根据其浊度，选择适当稀释度分别涂布于选择性TCBS(pH8.6±0.2，3％NaCl)琼脂(1.5％)平板上，每个稀释度的不同涂布量(100-200μL)各重复3次。在室温下，待涂布液被吸收后，将TCBS平板倒置于37℃恒温培养箱中，培养14-18h，观察单菌落的生长情况。
待测试的CHN-F4菌株在选择性TCBS琼脂平板上的菌落呈黄色。用无菌接种环挑取黄色单菌落纯化两次后，接种于TSB琼脂平板上，于37℃培养14-18h。CHN-F4菌株的菌落呈圆形，表面凸起、光滑，直径为2-3mm(如图1)。
实施例2：霍乱弧菌CHN-F4的革兰氏染色鉴定
采用革兰氏染色液试剂盒，根据试剂盒说明书步骤，进行涂片固定、初染、脱色、复染、油镜镜检等操作。革兰氏染色阳性反应呈紫色，而阴性反应呈淡红色。
测待试的CHN-F4菌株的革兰氏染色呈淡红色，为阴性反应(图略)。
实施例3：霍乱弧菌CHN-F4的生化鉴定
采用精氨酸双水解酶试验(D-ADT)和七叶苷水解试验(EHT)鉴定CHN-F4菌株。
将待测试的CHN-F4菌株接种于5mL TSB液体培养基(pH值为8.5)中，置于37℃震荡培养12-18h(180rpm)，得到新鲜培养物。次日接入覆盖无菌矿物油的D-ADT培养基中，37℃培养24h。观察培养基的颜色变化：阴性反应呈深黄色，阳性反应呈红色。同时，接入EHT培养基中，37℃培养24h。观察培养基的颜色变化：阴性反应呈棕色，阳性反应呈黑色。阳性对照菌株为霍乱弧菌GIM 1.449。
接种CHN-F4菌株的D-ADT培养基呈深黄色，为阴性反应；接种CHN-F4菌株的EHT培养基呈棕色，也为阴性反应。上述两项生化试验均为阴性，且与标准菌株霍乱弧菌GIM1.449的生化试验结果一致，初步鉴定CHN-F4菌株为霍乱弧菌(如图2)。
实施例4：霍乱弧菌CHN-F4的分子生物学鉴定
采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术，扩增待测试的CHN-F4菌株的霍乱弧菌的特异性lolB基因和16S rRNA基因；采用DNA序列测定技术，测定PCR扩增产物的DNA序列；利用美国生物技术信息国家中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)的GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)，采用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件进行序列的比对和分析。
4.1霍乱弧菌CHN-F4基因组DNA的制备和分析
将待测试的CHN-F4菌株接入5mL TSB液体培养基中，置于37℃震荡培养12-18h(180rpm)，得到新鲜培养物。采用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA ExtractionKit Ver.3.0试剂盒，按照试剂盒说明书步骤，提取其基因组DNA。采用琼脂糖凝胶电泳分析DNA样品的完整性，并采用BioTek SynergyTM多功能酶标仪测定其浓度和纯度。
图3为CHN-F4菌株的基因组DNA样品的琼脂糖凝胶电泳分析结果。从图3可见，DNA样品的条带明亮，无降解，无RNA污染；且测得的DNA样品的OD260nm/OD280nm值在1.8-2.0范围内，满足PCR反应的要求。
4.2霍乱弧菌特异性lolB基因的PCR扩增及产物的鉴定
PCR反应体系：总体积50μL，包括20μL DNase/RNase-free去离子水，25μL 2×TaqMaster Mix，上下游引物(VHMF和VHA-AS5)各1.25μL(5μM)，2.5μL模板DNA。VHMF的引物序列(5’→3’)为TGGGAGCAGCGTCCATTGTG；VHA-AS5的引物序列(5’→3’)为CAATCACACCAAGTCACTC；预测的扩增产物长度为516bp。
PCR反应条件：94℃预变性5min；30个循环，每个循环包括：94℃，1min，57℃，1min，72℃，1min；最后72℃，7min；于4℃保存。霍乱弧菌GIM 1.449菌株的基因组DNA作为阳性对照，空白对照不加模板DNA。
PCR反应产物的鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。取5μL PCR反应液，上样于2％琼脂糖凝胶，1×TAE电泳缓冲液，恒压120V，电泳约30min。采用自动凝胶成像扫描仪拍照，记录实验结果。获得的PCR反应产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行DNA序列的测定。
如图4所示，以待测试的CHN-F4菌株的基因组DNA为模版，扩增霍乱弧菌的特异性lolB基因，得到阳性扩增结果，获得单一的PCR产物，长度约为0.5kb。通过序列测定，获得其DNA序列为451bp，如SEQ ID NO.1所示。BLAST比对和分析结果显示，CHN-F4菌株的lolB基因与GenBank数据库中许多霍乱弧菌菌株的lolB基因具有极高的序列同源性。例如，与霍乱弧菌2010V-1116菌株(Accession No.CP051124.1)、霍乱弧菌10432-62菌株(AccessionNo.CP010812.1)的lolB基因的核苷酸序列相似度均为100％，覆盖率(Query Cover)均为99％，E-value均为0.0。与霍乱弧菌ATCC39315(N16961)菌株(Accession No.CP028827.1)、霍乱弧菌O1 biovar EI Tor菌株C6709(Accession No.CP047297.1)、霍乱弧菌O395菌株(CP045719.1)等的lolB基因的核苷酸序列相似度均为99.56％，覆盖率(Query Cover)均为99％，E-value均为0.0。上述结果说明CHN-F4菌株的基因组中存在霍乱弧菌的特异性lolB基因。
4.3 16S rRNA基因的PCR扩增及产物的鉴定
PCR反应体系：总体积50μL，包括20μL DNase/RNase-free去离子水，25μL 2×TaqMaster Mix，上下游引物(27F和1492R)各1.25μL(5μM)，2.5μL模板DNA。27F的引物序列(5’→3’)为GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R的引物序列(5’→3’)为TACGGCTACCTTGTTACGAC；预测扩增产物的长度约为1.5kb。
PCR反应条件：94℃预变性5min；30个循环：94℃，1min，55℃，1min，72℃，2min；最后72℃延伸10min；于4℃保存。霍乱弧菌GIM 1.449菌株的基因组DNA作为阳性对照，阴性对照不加模板DNA。
PCR反应产物的鉴定：采用上述4.2中的方法。
如图5所示，待测试的CHN-F4菌株的16S rRNA基因的PCR扩增产物为单一的DNA条带，长度约为1.5kb。测定、拼接、得到其序列全长为1443bp，如SEQ ID NO.2所示。BLAST比对和分析结果显示，CHN-F4菌株的16S rRNA序列与GenBank数据库中的霍乱弧菌的16S rRNA基因具有极高的序列同源性。例如，与霍乱弧菌ATCC39315(N16961)菌株(AccessionNo.CP028827.1)、O1 biovar EI Tor菌株HC1037(Accession No.CP026647.1)、DMS/RR/HCP2菌株(Accession No.MK168584.1)、Sa5Y菌株(Accession No.CP028892.1)等的16SrRNA基因的核苷酸序列相似度均为99.82％，覆盖率(Query Cover)均为100％，E-value均为0.0。上述结果进一步证明CHN-F4菌株为霍乱弧菌，且CHN-F4菌株的基因组中存在霍乱弧菌的16S rRNA基因。
实施例5：霍乱弧菌CHN-F4的系统进化分析
采用MEGA 7.0(version 7.0)软件以邻接算法(Neighbor-Joining Method)构建系统发育树，并且进行1,000次bootstrap校验。
基于上述霍乱弧菌CHN-F4菌株的16S rRNA基因的核苷酸序列，以及GenBank中已知的15株霍乱弧菌、2株副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)、2株创伤弧菌(V.vulnificus)的16S rRNA基因的核苷酸序列构建了系统发育树(图6)。由图6可见，所有测试的弧菌聚类为两个大簇，分别为Clusterα、Clusterβ。其中，霍乱弧菌CHN-F4与GenBank中已知的16株霍乱弧菌聚类为Clusterβ，具有相近的系统发育关系；而参考菌株副溶血性弧菌和创伤弧菌均聚类为Clusterα。
实施例6：霍乱弧菌CHN-F4毒力基因的检测
采用PCR技术，扩增霍乱弧菌CHN-F4菌株的“霍乱”毒素编码基因ctxAB和tcpA，以及辅助毒素编码基因zot和ace。阳性对照为霍乱弧菌ATCC39315(N16961)菌株的基因组DNA(中国疾病预防控制中心提供)。
PCR反应体系、PCR反应条件、PCR产物的鉴定与实施例4中4.2相同，只是根据每对引物的熔解温度和预测的扩增产物长度，确定PCR反应条件中的退火温度和延伸时间，其中ctxAB、ace、zot基因的PCR反应的退火温度均为55℃，而tcpA基因的退火温度为54℃。扩增ctxAB基因的引物及其序列(5’→3’)为ctxAB-F(TGAAATAAAGCAGTCAGGTG)和ctxAB-R(GGTATTCTGCACACAAATCAG)，预测的产物长度约为778bp。扩增tcpA基因的引物及其序列(5’→3’)为tcpA-F(ATGCAATTATTAAAACAGCTTTTTAAG)和tcpA-R(TTAGCTGTTACCAAATGCAACAG)，预测的产物长度约为675bp。扩增zot基因的引物及其序列(5’→3’)为zot-F(TCGCTTAACGATGGCGCGTTTT)和zot-R(AACCCCGTTTCACTTCTACCCA)，预测的产物长度约为947bp。扩增ace基因的引物及其序列(5’→3’)为ace-F(TAAGGATGTGCTTATGATGGACACCC)和ace-R(CGTGATGAATAAAGATACTCATAGG)，预测的产物长度约为316bp。
以霍乱弧菌CHN-F4菌株的基因组DNA为模版，PCR扩增上述编码“霍乱”毒素和辅助毒素的基因ctxAB、tcpA、zot和ace，结果显示，均无扩增产物，说明霍乱弧菌CHN-F4基因组中不存在ctxAB、tcpA、zot和ace基因，该菌株不产生“霍乱”毒素CT和TCP，以及辅助毒素ZOT和ACE，为非O1/O139型霍乱弧菌。
实施例7：霍乱弧菌CHN-J2-13抗菌素耐受性的测定
参考美国临床与实验室标准研究所(Clinical and Laboratory StandardsInstitute，CLSI)的Kirby-Bauer纸片扩散法(CLSI,2006,Approved Standard-NinthEdition,M2-A9,Vol.26No.1)测定受试霍乱弧菌的抗菌素敏感性。用无菌接种环随机挑取TSB琼脂平板上霍乱弧菌CHN-J2-13菌株的单菌落4-5个，参考实施例3方法，制备新鲜的过夜培养物。用0.85％NaCl校正菌液浓度为0.5麦氏比浊度标准(OD600nm＝0.08-0.13)。在15min内，用无菌棉拭子蘸取所得菌液，并旋转挤压几次去掉多余的菌液，涂布于MHA琼脂平板整个表面，每次旋转60度，最后沿平板内缘涂抹一周。待平板表面菌液吸收后，采用OXOID药敏纸片分配器将药敏片贴于MHA琼脂平板表面(3片/平板(90mm))。在15min内，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱，培养12-18h。观察MHA琼脂平板上抗菌素药敏片周围有无抑菌圈及其大小，抑菌圈的边缘应以肉眼见不到细菌明显生长为限。分别测量出现的抑菌圈直径(mm)。根据抑菌圈大小将细菌对药物分为敏感，中介或耐药，具体参考CLSI的抗微生物纸片扩散标准(Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests,M02-A11)，以及抗菌素药敏纸片说明书对结果进行判读。三次平行重复。以大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株。
研究结果显示，霍乱弧菌CHN-F4对10种抗菌素AMP、CHL、CN、KAN、RIF、SPT、STR、SXT、TET和TM均敏感(表1)。
表1霍乱弧菌CHN-F4菌株对10种抗菌素的耐受性
抗菌素 抑菌圈(mm) 表型
AMP >＝17 敏感
CHL >＝18 敏感
CN >＝15 敏感
KAN >＝18 敏感
RIF >＝20 敏感
SPT >＝18 敏感
STR >＝15 敏感
SXT >＝16 敏感
TET >＝19 敏感
TM >＝16 敏感
综上，证明本发明提供的霍乱弧菌CHN-F4菌株为一种对十种抗菌素敏感的非O1/O139型霍乱弧菌菌株。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002606103990000091
Figure BDA0002606103990000101
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 对抗菌素敏感的非O1/O139型霍乱弧菌菌株及应用
<141> 2020-07-28
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 451
<212> DNA
<213> 霍乱弧菌Vibrio cholerae CHN-F4菌株的lolB基因的序列(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atcaggcagc ggaatgggct tatgttgcca ctcaatcgct tggtaacgtt ggtattctac 60
gtgccattcc gccgttgagg cgagtttggt gagagtggca agagtgtttt gttcattcaa 120
ctcgtaatgg gttgcttggg tcggcaagcc taaaatccaa tcttcaagct gttcaacggg 180
aatatctaac cctgttaaat tgcggatcag gctttgtgca tcttggtcgc ggtagatttg 240
atcatcataa gtttcgaccc gcgcaccttg ttcatcgacc tgtaagttca gcacggtttg 300
accaagaaaa ttgcttaaac gcagtgagag tttttgtggg cttttttgcc attgaaagtt 360
gaacgattgt cgctgatcgg gcgcgatata gccgagtttt ccggttaatt gataatgttg 420
aatttgttct agagtgactt ggtgtgattg a 451
<210> 2
<211> 1443
<212> DNA
<213> 霍乱弧菌Vibrio cholerae CHN-F4菌株的16S rRNA基因的序列(2 Ambystomalaterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
cttgcgcagc tacacatgca gtccgagcgg cagcacagaa ggaactttgt tccttgggtg 60
gcgagcggcg gacgggtgag taatgcctgg gaaattcgcc cggtagaggg ggataaccat 120
tggaaacgat ggctaatacc gcataacctc gcaagagcaa agcaggggac cttcgggcct 180
tgcgctaccg gatatgccca ggtgggatta gctagttggt gaggtaaggg ctcaccaagg 240
cgacgatccc tagctggtct gagaggatga tcagccacac tggaactgag acacggtcca 300
gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcc 360
atgccgcgtg tatgaagaag gccttcgggt tgtaaagtac tttcagtagg gaggaaggtg 420
gttaagttaa taccttaatc atttgacgtt acctacagaa gaagcaccgg ctaactccgt 480
gccagcagcc gcggtaatac ggagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc 540
gcatgcaggt ggtttgttaa gtcagatgtg aaagccctgg gctcaaccta ggaatcgcat 600
ttgaaactga caagctagag tactgtagag gggggtagaa tttcaggtgt agcggtgaaa 660
tgcgtagaga tctgaaggaa taccggtggc gaaggcggcc ccctggacag atactgacac 720
tcagatgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 780
cgatgtctac ttggaggttg tgccctagag gcgtggcttt cggagctaac gcgttaagta 840
gaccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac 900
aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaag aaccttacct actcttgaca 960
tccagagaat ctagcggaga cgctggagtg ccttcgggag ctctgagaca ggtgctgcat 1020
ggctgtcgtc agctcgtgtt gtgaaatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080
atccttgttt gccagcacgt aatggtggga actccaggga gactgccggt gataaaccgg 1140
aggaaggtgg ggacgacgtc aagtcatcat ggcccttacg agtagggcta cacacgtgct 1200
acaatggcgt atacagaggg cagcgatacc gcgaggtgga gcgaatctca caaagtacgt 1260
cgtagtccgg attggagtct gcaactcgac tccatgaagt cggaatcgct agtaatcgca 1320
aatcagaatg ttgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg 1380
ggagtgggct gcaaaagaag caggtagttt aaccttcggg aggacgctgc cactttcgtt 1440
cgg 1443

Claims (6)

1.一种对抗菌素敏感的非O1/O139型霍乱弧菌菌株，其特征在于：所述非O1/O139型霍乱弧菌菌株的保藏编号为：CCTCC NO：M 2020260。
2.根据权利要求1所述的对抗菌素敏感的非O1/O139型霍乱弧菌菌株，其特征在于：所述非O1/O139型霍乱弧菌菌株的lolB基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的对抗菌素敏感的非O1/O139型霍乱弧菌菌株，其特征在于：所述非O1/O139型霍乱弧菌菌株的16S rRNA基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的对抗菌素敏感的非O1/O139型霍乱弧菌菌株，其特征在于：所述非O1/O139型霍乱弧菌菌株的抗菌素选自氨苄西林、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、利福平、壮观霉素、链霉素、四环素、复方新诺明和甲氧苄氨嘧啶中的一种以上。
5.根据权利要求1所述的对抗菌素敏感的非O1/O139型霍乱弧菌菌株，其特征在于：所述非O1/O139型霍乱弧菌菌株为霍乱弧菌Vibrio cholerae CHN-F4菌株。
6.一种对抗菌素敏感的非O1/O139型霍乱弧菌菌株在检测和研究微生物中的应用。
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