CN1973030A - 抗原预激得到的树突状细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明提供对疾病，主要是乙型肝炎的预防、治疗有效的树突状细胞。通过包括用HBs抗原预激树突状细胞的步骤的方法得到的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞，对于乙型肝炎的预防或治疗是有效的。作为HBs抗原，可以使用HB疫苗中所含有的HBs抗原。通过包括用疫苗预激树突状细胞的步骤的方法得到的疫苗预激的树突状细胞，不仅可以用于患者，也可以用于正常人群。用于预激的疫苗，可以使用各种疫苗。
Description
技术领域
[0001]本发明涉及可以用于疾病预防或治疗的树突状细胞。
背景技术
[0002](树突状细胞疗法及其问题点)
在癌症治疗等领域里，细胞免疫疗法中的树突状细胞疗法正引起人们的关注。
[0003]树突状细胞是体内抗原递呈能力最强的抗原递呈细胞(antigenpresenting cell：APC)，它能够把所结合到的抗原表位递呈给T细胞，以此来激活T细胞，从而提高免疫应答。
[0004]树突状细胞疗法是指树突状细胞在体外被癌细胞提取物或者癌特异性抗原预激，提高抗原递呈能力后再回输入体内的治疗方法。
[0005]癌细胞提取物一般为多种物质的混合物。因此，被癌细胞提取物所预激的树突状细胞被认为是被癌细胞提取物中所含有的多种类的癌抗原所预激的，所以认为它能够诱导对癌的强力免疫反应。但是，像这种被含有多种物质的混合物所预激的树突状细胞，递呈的抗原是非特异性的，所以只能运用于癌症患者的治疗，不能运用于正常人群的预防。
[0006]另外，虽然使用癌特异性抗原预激的树突状细胞递呈的抗原能够特定，但存在现在得到鉴定的癌特异性抗原数量还不多的问题。
[0007]作为使抗原递呈于树突状细胞的另一种形态，例如将来自抗原的肽编码的基因导入树突状细胞并令其表达的方法已为人所知。虽然以此方法得到的树突状细胞能够引起对特定抗原的强力免疫应答，但是在现阶段，通过基因操作得到的树突状细胞的还未被允许运用于正常人群的疾病预防等。
[0008](关于肝炎)
肝炎主要是由病毒，酒精，药物等原因引起的肝脏炎症。由肝炎病毒引起的肝炎最为常见，至今已发现了7种肝炎病毒。另外，日本的病毒性肝炎中以乙型，丙型肝炎为主。
[0009]肝炎可大致分为急性肝炎和慢性肝炎。所谓慢性肝炎，是指持续6个月以上的肝炎。甲型肝炎是经口感染，为急性肝炎，不会慢性化。乙型，丙型肝炎是经血液感染、母婴垂直感染、家族及异性间的水平感染。另外，乙型，丙型肝炎由急性转为慢性肝炎的病例也很多，一旦慢性化后，转变为肝硬化、肝癌等严重的肝脏疾病的比率非常高。
[0010](关于乙型肝炎)
乙型肝炎患者遍布于全世界，全世界约有乙型肝炎病毒感染者3亿5千万人。尤其以中国的感染者居多，估计有1亿2千万人。整个东南亚的感染者数占全世界感染者数的70％以上。另据报道，世界上每年有约100万人因该疾病死亡。日本的乙型肝炎病毒感染者估计有100万人以上，其中10％左右为慢性肝炎患者。
[0011](乙型肝炎的治疗方法及其问题点)
目前还没有针对乙型肝炎的特效药。因此，治疗以减少病毒数量，抑制其活性为目的。干扰素疗法和拉米夫定疗法是最具代表性的治疗方法。
[0012]干扰素疗法是距今20年前开始的最早的针对乙型肝炎的治疗方法。干扰素有协助免疫系统抑制病毒增殖的作用。由于干扰素疗法是病毒数量越少越有效果，所以一般在治疗病毒数量为乙型肝炎的1000分之1的丙型肝炎上能发挥显著的疗效。但是在乙型肝炎治疗上，只有对20％的患者有效。另外，一旦转变为肝硬化，干扰素就更难以起作用。而且，治疗所使用的干扰素从开发到成品需要花费很高的成本，1个疗程需要200-300万日元，给患者带来沉重的经济负担等的问题也很多。
[0013]拉米夫定本来是用于艾滋病治疗被开发的药物，现在它对治疗乙型肝炎有效果也已为人所知。拉米夫定具有直接抑制病毒DNA合成的作用，也具有抑制乙型肝炎急剧恶化和重症化的效果。据报道，拉米夫定对于干扰素治疗无效的乙型肝炎患者也有效，但是病毒不在增殖状态时无效。而且，存在由于长期给药而出现拉米夫定耐药性病毒等问题。
[0014]另外，由于疗效的评价方法各不相同，所以这些乙型肝炎治疗方法无法同时比较效果。再者，即使使用这些治疗方法，也认为不可能把乙型肝炎病毒完全从体内去除。因此，为了防止上述的乙型肝炎患者的增加，乙型肝炎的预防被认为是很重要的。
[0015](乙型肝炎的预防方法及其问题点)
从预防乙型肝炎的观点来看，一般有效的方法为HB疫苗的接种。
[0016]为了预防慢性乙型肝炎，即使正常人群，体内含有、及维持抗HBs抗体也很重要。现在的HB疫苗是基于乙型肝炎病毒的表面抗原HBs抗原所制成的。通常，通过3次接种这种HB疫苗后，对于HB疫苗产生效果的人体内可产生抗HBs抗体。产生抗体的人以后就不会被感染乙型肝炎，即使几年后抗体值下降时，只要体内产生过一次抗HBs抗体，就能避免感染。另外，也可以通过追加接种来再次提高抗体值。
[0017]但是，HB疫苗也存在着一些问题。
[0018]首先，正常人群中约有10％是HB疫苗无应答者(non-reponder)，即使给予HB疫苗也不能产生抗HBs抗体。医务工作者中也有不少HB疫苗无应答者，日本约有数十万人。
[0019]另外，对于伴随免疫功能低下疾病的患者，例如，HIV患者、肝脏病患者、透析患者中，HB疫苗也不能充分发挥效果。对于肥胖及吸烟者，由于免疫功能低下，这些人对于HB疫苗的反应性也较低。
[0020]再者，HB疫苗对于免疫抑制剂使用中的肝移植患者等不起作用，所以患者不会产生抗HBs抗体。但是，对于乙型肝炎相关的肝移植来说，由于维持抗HBs抗体值对于治疗的结果有很大的影响，所以肝移植后，患者需要被反复给予抗HBs人体免疫球蛋白。给药频率必需2周1次，这就会带来一年250万日元的沉重的经济负担。今后，考虑到以患者较多的东南亚为中心，乙型肝炎相关肝移植激增，因此需要世界性地解决这个经济问题。
发明内容
发明要解决的课题
[0021]本发明的目的是提供对疾病的预防或治疗有效的树突状细胞，特别是提供用于乙型肝炎的预防或治疗的树突状细胞。
解决课题的手段
[0022]1、具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞
本发明中的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞是包括通过HBs抗原预激树突状细胞的步骤方法得到的、具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。
[0023]本发明中的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞是将HBs抗原表位递呈给T细胞并激活T细胞，以提高对HBs抗原的免疫应答。因此，通过本发明可以提供对乙型肝炎的预防或治疗有效的，且具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。
[0024]在本发明的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞中，在上述方法的基础上可以从血液中得到上述树突状细胞。据此，来自血液的树突状细胞可以用来提供本发明中具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。另外，采用现有的方法，通过比较简单的操作便可以从血液中得到树突状细胞。
[0025]在本发明的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞中，上述方法可以进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
[0026]在本发明的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞中，上述生物可以为人。由于可以从人体得到树突状细胞，所以通过本发明，具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞用于人类成为可能。因此通过本发明可以提供对人的乙型肝炎的预防或治疗有效的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。
[0027]在本发明的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞中，上述HBs抗原可以是含有HB疫苗的HBs抗原。对于人来说，HB疫苗已经在市场上被销售，并且其对包括正常人群在内的所有人类的安全性和有效性是已经被认可的。因此根据本发明，可以提供例如对能安全且有效地运用于人的、具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。另外，由于HB疫苗可以使用于正常人群，因此本发明的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞不仅仅是为了治疗乙型肝炎用于乙型肝炎患者等，同时也可以以对乙型肝炎的预防为目的用于正常人群。而且，不仅限于人类，对于其他生物，通过使用对该生物安全且有效的HB疫苗预激的树突状细胞，也可以预防或治疗该生物的乙型肝炎。
[0028]2、具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的制备方法
本发明的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的制备方法是以包括通过HBs抗原预激树突状细胞的步骤为特点。据此，可以得到对乙型肝炎的预防或治疗有效的，且具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。
[0029]本发明中的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的制备方法进一步包括从血液得到上述树突状细胞的步骤。据此，来自血液的树突状细胞可以用来提供本发明中具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。另外，采用现有的方法，通过比较简单的操作便可以从血液中得到树突状细胞。
[0030]本发明中的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的制备方法进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
[0031]在本发明的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的制备方法中，上述生物可以是人。据此，可以提供对人类乙型肝炎的预防或治疗有效的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。
[0032]在本发明的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的制备方法中，上述HBs抗原可以是含有HB疫苗的HBs抗原。据此，可以提供能安全且有效的用于生物例如包括正常人群在内的所有人类，对乙型肝炎的预防或治疗有效的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。
[0033]3、含有具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的组合物
本发明中含有具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的组合物是以含有具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞为特点。据此，本发明中的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞可以通过例如与其他物质混合、悬浮、合成等状态进行使用。具体的说，本发明中的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞有悬浮于例如PBS、生理盐水、RPMI-1640培养基等的形态，也有添加例如TNF-α、IL-12、HB疫苗、GM-CSF、OK432、及其它免疫调节剂等的形态。因此，可以根据使用目的或提高其效果选择相应的形态来使用本发明中的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。
[0034]本发明中含有具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的组合物可以进一步含有HB疫苗添加剂。
[0035]在本发明中含有具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的组合物，上述组合物的形态可以是实验试剂或实验试剂盒。据此，本发明中的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞可以通过相应的形态用于研究例如免疫研究。
[0036]在本发明中含有具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的组合物中，上述组合物可以是医药组合物。据此，本发明中的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞可以以相应的形态用于医疗例如乙型肝炎的预防或治疗。
[0037]在本发明中含有具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的组合物中，上述组合物可以是免疫应答激活剂。据此，本发明中的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞可以以投用药剂形式用于激活对HBs抗原的免疫应答。
[0038]在本发明中含有具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的组合物中，上述组合物可以是细胞疫苗。据此，本发明中的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞可以直接体内给药，并且能够激活对HBs抗原的免疫应答。
[0039]在本发明中含有具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的组合物中，上述细胞疫苗可以是乙型肝炎预防或治疗疫苗。据此，本发明中含有上述细胞疫苗的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞可以通过在体内激活对HBs抗原的免疫应答以预防或治疗乙型肝炎。
[0040]4、使用具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞进行乙型肝炎预防或治疗的方法。
本发明中针对乙型肝炎的预防或治疗方法主要是以使用具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞为主。据此，本发明中的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞是通过激活对HBs抗原的免疫应答以预防或治疗乙型肝炎。例如对于那些至今对HB疫苗无应答的正常人群或者患有伴随免疫功能低下的疾病的人、正在使用免疫抑制剂的人等目前的HB疫苗不能发挥效果的人，通过本发明有关的乙型肝炎的预防或治疗方法，变得能够产生抗HBs抗体，可以预防或治疗乙型肝炎。
[0041]在本发明中使用具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞进行乙型肝炎预防或治疗的方法中，本发明中的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞可以包括给药于生物的步骤。据此，本发明中的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞通过在体内激活对HBs抗原的免疫应答，从而能够预防或治疗乙型肝炎。另外，本发明中针对乙型肝炎的预防或治疗方法是将HB疫苗直接体内给药，与目前的乙型肝炎的预防或治疗方法相比，本发明中的方法可以发挥更高的效果。
[0042]本发明中使用具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞进行乙型肝炎预防或治疗的方法中，上述生物可以是人。因此可以预防或治疗人类的乙型肝炎。
[0043]5、疫苗预激的树突状细胞
本发明中的树突状细胞是通过包括用疫苗预激树突状细胞的步骤的方法得到的疫苗预激的树突状细胞。
[0044]在本发明的疫苗预激的树突状细胞中，“疫苗预激的树突状细胞”指通过包括疫苗预激的步骤的方法得到的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。
[0045]本发明的疫苗预激的树突状细胞是将疫苗中含有的抗原表位递呈给T细胞并激活T细胞，从而提高对上述抗原的免疫应当。因此，通过本发明可以提供对疾病的预防或治疗有效的疫苗预激的树突状细胞。
[0046]另外，例如人的场合，实际上作为疫苗上市的是确认对人有安全性、有效性，并获得批准的疫苗。因此根据本发明，可以提供，例如能安全且有效地用于人的疫苗预激的树突状细胞。再者，不只局限于人，对于其他生物，也可以通过对该生物安全且有效的疫苗预激的树突状细胞来预防或治疗该生物的疾病。
[0047]在本发明的疫苗预激的树突状细胞中，上述方法可以进一步包括从血液得到上述树突状细胞的步骤。据此，来自血液的树突状细胞可以用来提供本发明中的疫苗预激的树突状细胞。另外，采用现有的方法，通过比较简单的操作便可以从血液中得到树突状细胞。
[0048]在本发明的疫苗预激的树突状细胞中，上述方法可以进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
[0049]在本发明的疫苗预激的树突状细胞中，上述生物可以是人。据此，可以得到来自人体的树突状细胞。从而可以将本发明中的疫苗预激的树突状细胞用于人。因此，通过本发明，可以提供对人的疾病的预防或治疗有效的疫苗预激的树突状细胞。
[0050]在本发明的疫苗预激的树突状细胞中，上述疫苗可以是预防或治疗疾病的疫苗。据此，可以提供含有递呈上述疾病相关的抗原的疫苗预激的树突状细胞。因此可以预防或治疗上述疾病。
[0051]在本发明的疫苗预激的树突状细胞中，上述疫苗可以是肝炎疫苗。作为肝炎疫苗，例如，已知有甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗等。例如，人的场合，实际上作为疫苗上市的是确认对人有安全性、有效性，并获得批准的疫苗。因此通过本发明可以提供对人安全、有效的具有肝炎病毒抗原递呈能力的肝炎疫苗预激的树突状细胞。另外，由于肝炎疫苗可以使用于正常人群，因此根据本发明，可以提供例如能安全且有效的用于人的、具有肝炎病毒抗原递呈能力的肝炎疫苗预激的树突状细胞。另外，由于肝炎疫苗可以用于正常人群，所以，本发明有关的肝炎疫苗预激的树突状细胞，例如，不只是对肝炎患者等的治疗肝炎目的，也可以以预防肝炎为目的用于正常人群。再者，不只局限于人，对于其他生物，也可以通过对该生物安全且有效的疫苗预激的树突状细胞来预防或治疗该生物的疾病。
[0052]在本发明的疫苗预激的树突状细胞中，上述肝炎疫苗可以是含有HBs抗原的HB疫苗。据此，可以提供能安全且有效的用于生物例如包括正常人群在内的所有人的，对乙型肝炎的预防或治疗有效的，具有HBs抗原递呈能力的疫苗预激的树突状细胞。
[0053]6、疫苗预激的树突状细胞的制备方法
本发明中的疫苗预激的树突状细胞的制备方法是以包括用疫苗预激树突状细胞的步骤为特点。据此，可以得到对疾病的预防或治疗有效的疫苗预激树突状细胞。
[0054]本发明中的疫苗预激的树突状细胞的制备方法可以进一步包括从血液得到上述树突状细胞的步骤。据此，来自血液的树突状细胞可以用来提供本发明中的疫苗预激的树突状细胞。另外如果使用血液，采用现有的方法，通过比较简单的操作便可以从血液中得到树突状细胞。
[0055]本发明中的疫苗预激的树突状细胞的制备方法可以进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
[0056]在本发明的疫苗预激的树突状细胞的制备方法，上述生物可以是人。据此，可以提供对人疾病的预防或治疗有效的疫苗预激的树突状细胞。
[0057]在本发明的疫苗预激的树突状细胞的制备方法，上述预激所使用的疫苗可以是预防或治疗疾病的疫苗。据此，可以提供对上述疾病预防或治疗有效的疫苗预激的树突状细胞。
[0058]在本发明的疫苗预激的树突状细胞的制备方法，上述预激所使用的疫苗可以是肝炎疫苗。据此，可以提供能安全且有效的用于生物例如包括正常人群在内的人的、对肝炎的预防或治疗有效的、具有肝炎病毒抗原递呈能力的肝炎疫苗预激的树突状细胞。
[0059]在本发明的疫苗预激的树突状细胞的制备方法，上述肝炎疫苗可以是含有HBs抗原的HB疫苗。据此，可以提供能安全且有效的用于生物例如包括正常人群在内的人的、对乙型肝炎的预防或治疗有效的、具有HBs抗原递呈能力的疫苗预激的树突状细胞。
[0060]7、含有疫苗预激的树突状细胞的组合物
本发明中的含有疫苗预激的树突状细胞的组合物是以含有疫苗预激的树突状细胞为特点。据此，本发明中的疫苗预激的树突状细胞可以通过例如与其他物质混合、悬浮、合成等状态进行使用。具体的说，本发明中的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞有悬浮于例如PBS、生理盐水、RPMI-1640培养基等的形态，也有添加例如TNF-α、IL-12、HB疫苗、GM-CSF、OK432、及其它免疫赋活剂等的形态。因此，可以根据使用目的或提高其效果选择相应的形态来使用本发明中的疫苗预激的树突状细胞。
[0061]在本发明的含有疫苗预激的树突状细胞的组合物可以进一步含有疫苗添加剂。
[0062]在本发明的含有疫苗预激的树突状细胞的组合物中，上述成分的形态可以是实验试剂或实验试剂盒。据此，本发明中的疫苗预激的树突状细胞可以通过相应的形态用于研究例如免疫研究。
[0063]在本发明的含有疫苗预激的树突状细胞的组合物中，上述组合物可以是医药组合物。据此，本发明中的疫苗预激的树突状细胞可以以相应的形态用于医疗例如疾病的预防或治疗。
[0064]在本发明的含有疫苗预激的树突状细胞的组合物中，上述组合物可以是免疫应答激活剂。据此，本发明中的疫苗预激的树突状细胞可以以相应用量和用法用于激活对疫苗中含有的抗原的免疫应答。
[0065]在本发明的含有疫苗预激的树突状细胞的组合物中，上述组合物可以是细胞疫苗。据此，本发明中的疫苗预激的树突状细胞可以直接体内给药，并且能够激活对疫苗中含有的抗原的免疫应答。
[0066]在本发明的含有疫苗预激的树突状细胞的组合物中，上述细胞疫苗可以是疾病预防或治疗疫苗。据此，本发明中含有上述细胞疫苗的疫苗预激的树突状细胞可以通过在体内激活对疫苗的含有的抗原的免疫应答以预防或治疗疾病。
[0067]8、使用疫苗预激的树突状细胞进行疾病预防或治疗的方法。
本发明中针对疾病的预防或治疗方法是以使用本发明中的疫苗预激的树突状细胞为特点。据此，本发明中的疫苗预激的树突状细胞是通过激活对疫苗中含有的抗原的免疫应答以预防或治疗疾病。例如对于那些为了预防或治疗上述疾病，至今对疫苗无应答的正常人群或患有伴随免疫功能低下疾病、正在使用免疫抑制剂等目前的疫苗不能充分发挥效果的人，通过本发明有关的疾病预防或治疗方法变得能够产生抗体，可以预防或治疗疾病。
[0068]在本发明使用疫苗预激的树突状细胞进行疾病预防或治疗的方法中可以包括将本发明有关的疫苗预激的树突状细胞给予生物的步骤。据此，本发明中的疫苗预激的树突状细胞通过在体内激活对疫苗中含有的抗原的免疫应答，从而能够预防或治疗疾病。另外，本发明有关的疾病的预防或治疗方法与目前的将疫苗直接给予生物体内的疾病的预防或治疗方法相比，本发明中的方法可以发挥更高的效果。
[0069]在本发明使用疫苗预激的树突状细胞进行疾病预防或治疗的方法中，上述生物可以是人类。因此可以预防或治疗人类的乙型肝炎。
[0070]9、用于人体的疫苗预激的树突状细胞
本发明中的用于人体的疫苗预激的树突状细胞有以下主要特点：是为了预防或治疗人类乙型肝炎的疫苗预激的树突状细胞；上述疫苗预激的树突状细胞是采自乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者的末捎血，疫苗预激的树突状细胞是通过从末梢血分离的单核细胞中得到树突状细胞的取得步骤以及包括用疫苗预激上述树突状细胞的预激步骤的制备方法得到的；上述预激所使用的疫苗的特点是为了预防或治疗乙型肝炎。
[0071]在本发明的用于人体的疫苗预激的树突状细胞中，上述疫苗预激的树突状细胞例如可以诱导Th2不诱导Th1，甚至不诱导CTL。
[0072]在本发明的用于人体的疫苗预激的树突状细胞中，有以下优点。用于癌症治疗的树突状细胞疗法是以诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)为目的，通过促进Th1的诱导，不诱导Th2使树突状细胞活性化。相对而言，本发明中用于人体的疫苗预激的树突状细胞主要是例如为了诱导Th2，不诱导Th1和CTL，与用于癌症治疗的树突状细胞疗法的机制完全不同。也就是说，如果使用本发明中的疫苗预激的树突状细胞例如可以不诱导CTL而能产生抗体，也不会引起因CTL对肝细胞的攻击而产生的肝损害(例如重症肝炎等)从而本发明的用于人体的疫苗预激的树突状细胞对于乙型肝炎患者以及乙型肝炎病毒携带者是极为有效的。同时，本发明的用于人体的疫苗预激的树突状细胞的不诱导Th1和CTL的机制还未明确。
[0073]在本发明的用于人体的疫苗预激的树突状细胞中，在用疫苗预激上述树突状细胞的步骤中，预激时间例如可以是8-24小时。另外，在取得上述树突状细胞的步骤中，可以是分离获得的单核细胞与GM-CSF及IL-4细胞共培养。
[0074]10、用于人体的疫苗预激的树突状细胞的制备方法
本发明中的用于人体的疫苗预激的树突状细胞的制备方法有一下主要特点：采自乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者的末捎血，运用从人体血液得到树突状细胞(从末梢血分离的单核细胞中得到树突状细胞)的取得步骤；以及为了预防或治疗人类乙型肝炎采用包括用疫苗预激上述树突状细胞的预激步骤在内的制备方法；在上述预激步骤中用于预激的疫苗的特征是用于预防或治疗乙型肝炎。用通过本发明的制备方法得到的用于人体的疫苗预激的树突状细胞，例如可以在人体中诱导Th2，不诱导Th1，甚至不诱导CTL。
[0075]在本发明中的用于人体的疫苗预激的树突状细胞的制备方法中，上述疫苗预激步骤所需要的预激时间可以是8-24小时。
[0076]在本发明中的用于人体的疫苗预激的树突状细胞的制备方法的上述树突状细胞的取得步骤中，可以是分离获得的单核细胞与GM-CSF及IL-4共培养。
[0077]11、为了预防或治疗人类乙型肝炎的医药品
本发明中的为了预防或治疗人类乙型肝炎的医药品是以含有上述本发明中的用于人体的疫苗预激的树突状细胞为特点。本发明的医药品中，本发明的疫苗预激的树突状细胞例如能够诱导Th2，不诱导Th1，甚至不诱导CTL。由于CTL不被诱导，因此如果使用本发明的医药品，例如不会因CTL攻击肝细胞等而引起重症肝炎。如果进一步使用本发明的医药品，无论是乙型肝炎患者，还是为了预防或治疗乙型肝炎至今对疫苗无应答的正常人群或目前的疫苗不能发挥充分效果的人都可以通过抗体的产生，对乙型肝炎的预防或治疗成为可能。上述乙型肝炎可以是慢性乙型肝炎。本发明中为了预防或治疗人类乙型肝炎的医药品的给药方式没有特别的限制，例如可以是皮下注射。
[0078]12、使用疫苗预激的树突状细胞对人类乙型肝炎进行预防或治疗的方法
使用疫苗预激的树突状细胞对人类乙型肝炎进行预防或治疗的方法有以下主要特点：包括将来源于自身的树突状细胞经过疫苗预激，然后给药于乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者的预防或治疗的方法；上述疫苗预激的树突状细采自乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者的末捎血；通过包括从末梢血分离的单核细胞中得到树突状细胞的取得步骤以及包括用疫苗预激上述树突状细胞的预激步骤的制备方法得到用于人体的疫苗预激的树突状细胞；上述预激步骤中使用的疫苗的特点是为了预防或治疗乙型肝炎。
[0079]在使用本发明的用于人体的疫苗预激的树突状细胞对人体乙型肝炎进行预防或治疗的方法中，本发明中的用于人体的疫苗预激的树突状细胞例如能够诱导Th2，不诱导Th1，甚至不诱导CTL。如果通过本发明的预防或治疗方法，无论是乙型肝炎患者，还是为了预防或治疗乙型肝炎至今对疫苗无应答的正常人群或目前的疫苗不能发挥充分效果的人都可以通过抗体的产生，对乙型肝炎的预防或治疗成为可能。进一步说，本发明的预防或治疗方法是使用乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者自身的树突状细胞，因此安全性极高。上述乙型肝炎可以是慢性乙型肝炎。在使用本发明的用于人体的疫苗预激的树突状细胞对人类乙型肝炎进行预防或治疗的方法中，用于人体的疫苗预激的树突状细胞的给药方式没有特别的限制，例如可以是皮下注射。
[0080]13、为了预防或治疗人体乙型肝炎的用于人体的疫苗预激的树突状细胞的使用
为了预防或治疗人体乙型肝炎的用于人体的疫苗预激的树突状细胞的使用有以下主要特点：上述疫苗预激的树突状细采自乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者的末捎血；通过包括从末梢血分离的单核细胞中得到树突状细胞的取得步骤以及用疫苗预激上述树突状细胞的预激步骤的制备方法得到用于人体的疫苗预激的树突状细胞；上述预激步骤中使用的疫苗是为了预防或治疗乙型肝炎的疫苗。上述疫苗预激的树突状细胞采自乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者的末捎血并给药于他们自身。
[0081]如果将本发明的用于人体的疫苗预激的树突状细胞使用于人类乙型肝炎的预防或治疗，无论是乙型肝炎患者，还是为了预防或治疗乙型肝炎至今对疫苗无应答的正常人群或目前的疫苗不能发挥充分效果的人都可以通过抗体的产生，对乙型肝炎的预防或治疗成为可能。进一步说，由于使用的是乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者自身的树突状细胞，因此安全性极高。本发明的用于人体的疫苗预激的树突状细胞，例如可以诱导Th2，不诱导Th1，甚至不诱导CTL。上述乙型肝炎可以是慢性乙型肝炎。
附图说明
[0082][图1]图1表示的是在实施例1中，HB疫苗预激的树突状细胞给药前的抗HBs抗体值。
[图2]图2表示的是在上述实施例中，HB疫苗的预激引起的树突状细胞的HAL-DR以及CD86变化的曲线图。
[图3]图3表示的是在上述实施例中，HB疫苗的预激引起的树突状细胞的T细胞幼稚化辅助能力变化的曲线图。
[图4]图4表示的是在上述实施例中，通过HBs记忆T细胞的使用，HB疫苗预激的树突状细胞对HBs记忆T细胞的增殖能力的效果曲线图。
[图5]图5表示的是在上述实施例中，通过HBs记忆T细胞的使用，HB疫苗预激的树突状细胞对抗HBs抗体的产生能力的效果曲线图。
[图6]图6表示的是在上述实施例中，通过血液生化检查所进行的HB疫苗预激的树突状细胞的安全性试验的检查项目。
[图7]图7表示的是在上述实施例中，ALT的检查结果的曲线图。
[图8]图8表示的是在上述实施例中，CRP的检查结果的曲线图。
[图9]图9表示的是在上述实施例中，PT的检查结果的曲线图。
[图10]图10表示的是在上述实施例中，肌酐(Creatinine)的检查结果的曲线图。
[图11]图11表示的是在上述实施例中，通过血液生化检查所进行的自身免疫反应相关的安全性试验的结果。
[图12]图12表示的是在上述实施例中，通过HB疫苗预激的树突状细胞的给药，抗HBs抗体值的变化的图表。
[图13]图13表示的是在上述实施例中，通过HB疫苗预激的树突状细胞的给药，抗HBs抗体值变化的曲线图。
[图14]图14表示的是在上述实施例中，通过HB疫苗预激的树突状细胞的给药，HB疫苗无应答者的抗HBs抗体值变化的曲线图。
[图15]图15表示的是在实施例2中，通过血液生化检查所进行的自身免疫反应相关的安全性试验结果的曲线图。
[图16]图16表示的是在实施例3中，通过HB疫苗预激的树突状细胞的给药，抗HBs抗体值变化的曲线图。
发明的最佳实施方式
[0083]以下对于本发明的最佳实施方式进行说明。本发明并不只局限于以下实施方式，可能在不超出本发明要约的范围内做各种变更。
[0084]1、具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞
本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞是通过包括用HBs抗原预激树突状细胞的步骤的方法得到的。根据本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞，可以提供对乙型肝炎的预防或治疗有效的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。
[0085]在本实施方式中，“用抗原预激树突状细胞”是指树突状细胞摄取的抗原在上述树突状细胞内分解，上述分解的抗原作为肽具有递呈状态。
[0086]在本实施方式中，作为用抗原预激树突状细胞的具体方法，例如是在适当细胞因子等存在的情况下，使抗原和树突状细胞共存而进行的培养方法。
[0087]对于树突状细胞的取得方法并无特别的限制，最终可以递呈摄取的抗原的树突状细胞可以通过各种方式得到。
[0088]例如可以从血液中得到树突状细胞。具体是，例如使用该领域研究人员都已经知道的方法，从含有树突状细胞的前驱细胞的血液中分化诱导树突状细胞的方法或直接从血液分离树突状细胞的方法。更具体的说，例如主要通过以下方法可以得到树突状细胞：用GM-CSF和TNF-α从骨髓细胞、脐带血或末梢血的CD34阳性前驱细胞中的诱导方法，用GM-CSF和IL-4从脐带血单核细胞或末梢血单核细胞诱导的方法，用GM-CSF和IFN-α从末梢血单核细胞诱导的方法，从末梢血单核细胞直接分离的方法等。
[0089]另外，这些得到树突状细胞的方法，根据需要，也可以进一步包括从生物采血的步骤。上述生物并非局限于是否有无感染乙型肝炎，例如可以是感染乙型肝炎的生物。上述感染乙型肝炎的生物中，可以是包括自然感染乙型肝炎的生物和人工感染乙型肝炎的生物。具体来说，上述能够自然感染乙型肝炎的生物，例如有人、黑猩猩等灵长类、土拔鼠、北京鸭等鸭类等，上述能够人工感染乙型肝炎的生物，例如有松鼠、大鼠、野鸭、鹅、鹭、鹤、小鼠等。特别是，全世界因乙型肝炎而死亡的人数逐渐增加的趋势来看，本发明用于人类时，会有较大的效果。
[0090]另外，作为不从血液得到树突状细胞的方法，例如，分化诱导ES细胞得到树突状细胞的方法。具体地说，例如，将由胚盘胞内部存在的内部细胞块形成的ES细胞与适当的饲养细胞和细胞因子共培养，从而能够分化诱导树突状细胞。
[0091]在本实施方式中，关于培养树突状细胞的培养基，只要对于由树突状细胞的前驱细胞向树突状细胞的分化诱导、树突状细胞的生存、抗原对树突状细胞的预激等无阻碍，通常没有特别的限定，例如可以使用RPMI 1640等，更以RPMI 1640为首选。
[0092]在本实施方式中，细胞因子可以用于诱导树突状细胞。作为用于诱导树突状细胞的细胞因子，只要对于向树突状细胞的分化诱导、树突状细胞的生存、抗原对树突状细胞的预激等无阻碍，通常没有特别的限定，例如可以使用GM-CSF、TNF-α、IL-4、IFN-α等。
[0093]在本实施方式中，HBs抗原的形态只要最终能通过树突状细胞递呈，通常没有特别的限制，既可以是完全的蛋白抗原，也可以是肽抗原。
[0094]另外，本实施方式相关的HBs抗原例如可以以与各种物质或液体合成的形态被使用。具体地说，例如可以用核糖体等磷脂双层膜将HBs抗原导入树突状细胞，或将HBs抗原悬浮于缓冲液(例如PBS)、培养基(RPMI 1640培养基)从而导入树突状细胞。
[0095]另外，关于HBs抗原的添加时机，只要结果能通过树突状细胞递呈HBs抗原，通常没有特别的限制，例如可以在分化诱导树突状细胞后添加。另外，也可以在在分化诱导树突状细胞的同时，添加HBs抗原一起培养。另外，关于HBs抗原的的预激时间，只要结果能通过树突状细胞递呈HBs抗原，通常没有特别的限制，例如可以是8小时-24小时。另外，HBs抗原可以是以包括HB疫苗在内的HBs抗原。
[0096]疫苗例如活性疫苗、死毒疫苗、类毒素等。活性疫苗例如是指由经过减毒处理的病毒或细菌制成。死毒疫苗例如是指将病毒微粒或细菌菌体等精制、加热或福尔马林等药物处理，使病原性丧失或无毒化而制成。类毒素例如是指将细菌产生的毒素经过精制、福尔马林无毒化处理而制成。
[0097]本实施方式中的HB疫苗，只要含有HBs抗原，并无种类限定，现在日本被允许上市的用于人体的HB疫苗属于死毒疫苗。在本实施方式中，在使用死毒疫苗时，可以使用重组沉降乙型肝炎疫苗或沉降乙型肝炎疫苗。
[0098]作为重组沉降乙型肝炎疫苗，例如可以将相当于乙型肝炎病毒DNA的HBs抗原的部分插入酵母菌或动物细胞等的DNA中另其表达，从而制成疫苗的有效成分HBs抗原，然后加入免疫增强剂(铝胶)进行调整后的疫苗可以被使用。作为动物细胞，例如可以使用用CHO细胞调整的疫苗。
[0099]作为沉降乙型肝炎疫苗，例如将从动物细胞等产生的HBs抗原精致以后，然后加入免疫增强剂(铝胶)进行调整后的疫苗可以被使用。作为动物细胞，例如可以使用被huGK-14细胞调整的疫苗。
[0100]2、具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的制备方法
本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的制备方法是包括通过HBs抗原预激树突状细胞的步骤。据此，可以得到对乙型肝炎的预防或治疗有效的，且具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。
[0101]上述方法可以进一步包括从血液得到上述树突状细胞的步骤。据此，来自血液的树突状细胞可以用来提供本发明中具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。另外，采用血液，通过现有的方法，比较简单的操作便可以得到树突状细胞。
[0102]另外，上述方法可以进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
[0103]上述生物可以是人。据此，可以提供对人类乙型肝炎的预防或治疗有效的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。
[0104]另外，上述HBs抗原可以是含有HB疫苗的HBs抗原。据此，可以提供能安全且有效的用于生物例如包括正常人群在内的所有人类，对乙型肝炎的预防或治疗有效的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。
[0105]3、含有具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的成分
本实施方式相关的成分主要是以具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞为主。
[0106]另外，本实施方式相关的成分进一步含有HB疫苗组合物。
[0107]在本实施方式中，“本实施方式相关的组合物进一步含有HB疫苗成分”是指HB疫苗成分包括在任意位置所含有的本实施方式相关的组合物。即是，含有HB疫苗添加物的位置没有特别的限定，可以是和本实施形态相关的组合物中的树突状细胞外、中、细胞膜上等部位。可以判定，本实施方式相关的组合物通过所含的疫苗添加物，作为HBs抗原，用HB疫苗中所含的HBs抗原能够得到和本实施形态相关的、具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。
[0108]HB疫苗添加物例如可以是保存剂、抗生素、稳定剂、防腐剂、免疫增强剂、缓冲剂、等渗透剂等。具体的说，有乙基汞硫代水杨酸钠、硫酸铝钾、氢氧化钠、氯化铝、醋酸、乙酸钠、氯化钠等，并且HB疫苗添加物也不局限于这些。
[0109]作为HB疫苗添加物的检测方法，例如可以用已知的分析方法。具体地说例如通过色谱分离分析、定量分析、红外分光分析、核磁共振分析、质量分析、元素分析等进行的结构分析。
[0110]本实施方式相关的组合物可以是实验试剂或实验试剂盒。据此，本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞可以通过相应的形态用于研究。作为研究领域例如是免疫应答、免疫耐受性、细胞因子产生的信号传递机制相关的研究、或有关用树突状细胞进行免疫治疗的研究。另外例如还有乙型肝炎的预防或治疗的相关研究，例如可以用于基因、RNA、肽、蛋白质、化合物、医药、细胞因子等筛选等目的。
[0111]另外，本实施方式相关的组合物可以是医药组合物。本实施方式相关的医药组合物例如可以以体内直接给药的形态，或在体外与其他物质或细胞混合的形态被使用。
[0112]另外，本实施方式相关的组合物可以是免疫应答激活剂。本实施方式相关的免疫应答激活剂例如可以以直接体内给药的形态，或在体外与其他物质或细胞混合的形态被使用。
[0113]本实施方式相关的组合物用于体外的形态就是本实施方式相关的免疫应答激活剂与T细胞结合，通过将HBs抗原表位递呈给T细胞从而激活T细胞的方法。然后，该T细胞可以用于体内给药。
[0114]本实施方式相关的组合物用于直接体内给药的形态例如作为细胞疫苗进行注射或点滴。细胞疫苗可以是以预防或治疗乙型肝炎的疫苗。另外，关于本实施方式相关的组合物用于直接体内给药的部位，例如可以是静脉内给药、动脉内给药、胸腔内给药、腹腔内给药、皮下给药、肌肉给药、组织给药(例如肝脏内)、淋巴给药。从给药的简便性来看，首选皮下给药。
[0115]4、使用具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞预防或治疗乙型肝炎。
本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞例如可以用于预防或治疗乙型肝炎。
[0116]使用具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞预防或治疗乙型肝炎，例如可以结合现有的乙型肝炎预防或治疗方法配合使用。
[0117]另外，使用本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞预防或治疗乙型肝炎，包括将具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞对生物进行给药的步骤。关于上述生物，例如可以是上述能够感染乙型肝炎的生物。另外，如果能够抑制排斥反应，树突状细胞的来源生物和给药生物可以是同源生物，也可以是异源生物。同源生物的情况，可以将本实施方式相关的树突状细胞给药于自身得到树突状细胞的生物体内，也可以给药于对组织相容性抗原一致的其他生物体内。
[0118]例如，上述生物可以是人。这种情况下，HLA的配型尽可能要一致。因此，树突状细胞最好是来源于具有血缘关系的提供者的树突状细胞。使用自身细胞则无需考虑HLA的配型，所以使用来自给药对象自己的树突状细胞最佳。
[0119]本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞，如上所述，可以以直接体内给药的形态被使用，或在体外与T细胞结合而激活T细胞，该T细胞以体内给药的形态被使用。但是，T细胞是效应细胞，发挥一次作用后，短时间内便死亡、消失。因此，为了预防或治疗乙型肝炎，必需高频率地反复给予T细胞。同时树突状细胞也作用于原态T细胞、HBs记忆T细胞、B细胞，并反复给予刺激，从而具有长时间且强力的效果。因此，考虑将本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞直接体内给药的形态作为首选。
[0120]5、本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的使用例及其效果。
以下是本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的使用例及其效果。本使用例包括将具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞给药于人的步骤。本使用例能够适用于预防或治疗乙型肝炎。再者，本使用例不仅限于以下情况，本使用例相关的树突状细胞的使用形态可以在不超出本发明要约的范围内进行各种变更。
[0121]5-1、适用于乙型肝炎的预防
已知在正常人群中约有10％是对HB疫苗无应答者，即使给予HB疫苗也不会产生抗HBs抗体。由于乙型肝炎是通过血液感染的，因此认为医务工作者等对于抗HBs抗体具有较高的必要性，但是这些人中也有不少是HB疫苗无应答者。
[0122]在此，将本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞给药于这些HB疫苗无应答者，使他们能够产生抗HBs抗体。为了预防乙型肝炎，抗HBs抗体值至少需要维持在10mIU/mL。根据下述实验例11的结果可知，给予1次本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞，HB疫苗无应答者的抗HBs抗体值平均上升至30mIU/mL，10mIU/mL以上的抗体值可以维持约3-6个月。因此，通过本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞，可以使现在的HB疫苗无应答者能够产生抗体，从而能够预防乙型肝炎的感染。
[0123]另外，现在为了预防乙型肝炎所使用HB疫苗通常必须在一定时期内接种3次。根据下述实验例11的结果可知，给予1次本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞，不只是对于HB疫苗无应答者，而且能提高对于HB疫苗有作用的正常人群(应答者)的抗HBs抗体值。因此，本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞，不只是用于HB疫苗无应答者，也可以作为新的预防乙型肝炎的手段用于HB疫苗应答者，而且可以减少接种次数和减轻经济负担。
[0124]另外，已知现有的HB疫苗对于HIV患者、肝病患者、透析患者、肥胖者和吸烟者等免疫功能低下的人群不能充分发挥效果。认为这些人通过本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞，能够产生抗HBs抗体。
[0125]5-2、适用于乙型肝炎的治疗
对于乙型肝炎治疗，目前主要是使用抗病毒剂。但是，长期使用抗病毒剂易高频率出现对抗病毒剂不起作用的突变病毒。由此，乙型肝炎病毒量再次上升，有导致肝炎恶化的危险性。
[0126]在此，如果使用本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞，估计可以降低这种突变病毒的出现频率，被认为是乙型肝炎治疗中的一大优点。
[0127]另外，肝移植对象等正在给予免疫抑制剂的人也由于处于免疫抑制状态，通常的HB疫苗不起作用且不能产生抗HBs抗体。但是，在乙型肝炎相关肝移植中，维持抗HBs抗体值对于治疗结果有很大的影响已为人所知，所以患者在移植后，必需每2周给予1次抗HBs人免疫球蛋白。这给患者带来一年约250万日元的经济负担，这是一个需要解决的全球性的经济问题。
[0128]因此，认为将本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞给药于患者，患者可以产生抗HBs抗体。根据下述实验例11的结果，估计例如每3-6个月给予1次本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞，抗HBs抗体值就可以维持在10mIU/mL以上。由此可见，如果使用本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞，与使用抗HBs人免疫球蛋白相比，可以大幅度降低给药频率，从而可以大幅度减轻患者的经济负担。
[0129]另外，至今所使用的HB疫苗是作为乙型肝炎的预防疫苗，作为乙型肝炎的治疗疫苗只适用于试验而未被使用。
[0130]相反，如上所述，根据本实施方式所使用的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞，使现有的HB疫苗不仅能用于乙型肝炎的预防，而且能用于治疗。也就是说，扩大了现在实际运用中且已确认了安全性有效性的HB疫苗的用途。进一步说，发现了可以提高现有HB疫苗效果的新的使用形态。
[0131]由此看来，本实施方式相关的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞具有广泛的用途和较大的优点。
[0132]6、疫苗预激的树突状细胞
本实施方式相关的疫苗预激的树突状细胞由包括用疫苗预激树突状细胞的步骤的方法得到的。据此，可以提供对疾病的预防或治疗有效的疫苗预激的树突状细胞。
[0133]上述方法进一步可以包括从血液得到树突状细胞的步骤。
[0134]另外，上述方法进一步可以包括从生物采集上述血液的步骤。上述生物可以是人。
[0135]另外，上述方法可以以从乙型慢性肝炎或病毒携带者的末梢血分离的单核细胞中得到树突状细胞。人的情况下，能够安全简单地反复采集末梢血。
[0136]另外，关于HBs抗原的添加时机，只要结果能通过树突状细胞递呈HBs抗原，通常没有特别的限制，例如可以在分化诱导树突状细胞后添加。另外，也可以在在分化诱导树突状细胞的同时，添加HBs抗原一起培养。另外，关于HBs抗原的的预激时间，只要结果能通过树突状细胞递呈HBs抗原，通常没有特别的限制，例如可以是8小时-24小时
[0137]作为疫苗，只要结果能通过树突状细胞递呈上述疫苗中含有的抗原，通常没有特别的限制，例如可以使用活性疫苗、死毒疫苗、类毒素、抗毒素等。另外，只要结果能通过树突状细胞递呈上述疫苗中含有的抗原，通常形态没有特别的限制，例如可以使用液状疫苗、沉降型疫苗、冻干疫苗等。
[0138]作为本实施方式中可以使用的疫苗例，有百日咳疫苗、破伤风疫苗、骨髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、风症疫苗、日本脑炎疫苗、流感疫苗、BCG疫苗等的结核疫苗、流行性腮炎疫苗、水痘疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、肺炎球菌疫苗、黄热病疫苗、狂犬病疫苗、霍乱疫苗、外耳氏病钩端螺旋体混合疫苗、眼睛蛇抗毒素、蝮蛇疫苗、鼠疫疫苗、MMR疫苗、肠伤寒疫苗、流感b菌结合型疫苗、流脑疫苗、痢疾疫苗、疟疾疫苗等。在本实施方式中可以使用的疫苗并不只局限于上述疫苗。
[0139]上述用于预激的疫苗是可以预防或治疗疾病的疫苗。例如上述用于预激的疫苗可以是肝炎疫苗，上述肝炎疫苗可以是含有HBs抗原的HB疫苗。
[0140]7、疫苗预激的树突状细胞的制备方法
本实施方式相关的疫苗预激的树突状细胞的制备方法是包括疫苗预激树突状细胞的步骤。据此，可以得到对疾病的预防或治疗有效的疫苗预激树突状细胞。
[0141]上述制备方法可以进一步包括从血液中得到上述树突状细胞的步骤。据此，来自血液的树突状细胞可以用来提供本发明中的疫苗预激的树突状细胞。另外，采用血液，通过现有的方法，比较简单的操作便可以得到树突状细胞。
[0142]另外，上述制备方法可以进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
[0143]上述生物可以是人类。据此，可以获得对人类疾病的预防或治疗有效的疫苗预激的树突状细胞。
[0144]另外，上述用于预激的疫苗可以是对疾病预防或治疗的疫苗。据此，可以提供对上述疾病预防或治疗的疫苗预激的树突状细胞。
[0145]上述用于预激的疫苗可以是肝炎疫苗。据此，可以提供能安全且有效的用于生物例如包括正常人群在内的所有人类，对肝炎的预防或治疗有效的具有肝炎病毒抗原递呈能力的肝炎疫苗预激的树突状细胞。
[0146]上述用于预激的疫苗可以是含有HBs抗原的HB疫苗。据此，可以提供能安全且有效的用于生物例如包括正常人群在内的所有人类，对乙型肝炎的预防或治疗有效的具有HBs抗原递呈能力的疫苗预激的树突状细胞。
[0147]8、含有疫苗预激的树突状细胞的组合物
本实施方式相关的组合物可以含有疫苗预激的树突状细胞。
[0148]另外，本实施方式相关的组合物进一步含有疫苗添加物。
[0149]在本实施方式中，“本实施方式相关的组合物进一步含有疫苗添加物”是指疫苗添加物包括在任意位置所含有的本实施方式相关的组合物。即是，含有疫苗添加物的位置没有特别的限定，可以是本实施方式相关的组合物中的树突状细胞外、中、细胞膜上等部位。可以判定，本实施方式相关的组合物通过所含的疫苗添加物作为抗原，用疫苗中所含的抗原能够得到疫苗预激的树突状细胞。
[0150]作为疫苗添加物，例如保存剂、抗生素、稳定剂、防腐剂、免疫增强剂、缓冲剂、等渗透剂、着色剂等。具体的说，作为保存剂有乙基汞硫代水杨酸钠、福尔马林等；作为抗生素有红霉素、红霉素乳酸糖盐、硫酸卡那霉素等；作为其他添加剂有精致白糖、L-谷氨酸钠、明胶、乳糖、谷氨酸钾、D-山梨糖醇、人血清白蛋白、聚山梨酸酯80、甘氨酸、葡萄糖、氢氧化钠、氯化铝、醋酸、乙酸钠、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、酚红、L-盐酸精氨酸、磷酸氢二钠、磷酸一钾、L-精氨酸、盐酸赖氨酸等。除此之外的添加剂可以做为稳定剂、防腐剂、免疫增强剂、缓冲剂、等渗透剂、着色剂等添加剂。并且疫苗添加物也不局限于这些。
[0151]本实施方式相关的组合物可以是实验试剂或实验试剂盒。据此，本实施方式相关的疫苗预激的树突状细胞可以通过相应的形态用于各种研究。可以使用的研究领域，例如疾病的信号传递机制相关的研究，或有关用树突状细胞进行免疫治疗的研究。另外例如此类疾病的预防或治疗的相关研究，例如可以用于基因、RNA、肽、蛋白质、化合物、医药、细胞因子等筛选等目的。
[0152]另外，本实施方式相关的组合物可以是医药组合物。本实施方式相关的医药组合物可以以体内直接给药的形态，或在体外与其他物质或细胞混合的形态被使用。
[0153]另外，本实施方式相关的组合物可以是免疫应答激活剂。本实施方式相关的免疫应答激活剂例如可以以直接体内给药的形态，或在体外与其他物质或细胞混合的形态被使用。
[0154]本实施方式相关的组合物用于体外的形态例如是本实施方式相关的免疫应答激活剂与T细胞结合，通过将HBs抗原表位递呈给T细胞从而激活T细胞的方法。然后，该T细胞可以用于体内给药。
[0155]本实施方式相关的组合物用于直接体内给药的形态例如是注射或点滴细胞疫苗。细胞疫苗可以是预防或治疗乙型肝炎的疫苗。另外，关于本实施方式相关的成分用于直接体内给药的部位，例如可以是静脉内给药、动脉内给药、胸腔内给药、腹腔内给药、皮下给药、肌肉给药、组织给药(例如肝脏内)、淋巴给药。从给药的简便性来看，首选皮下给药。
[0156]9、使用疫苗预激的树突状细胞预防或治疗乙型肝炎。
本实施方式相关的疫苗预激的树突状细胞可以用于预防或治疗疾病。上述疾病可以是乙型肝炎及慢性乙型肝炎。
[0157]使用疫苗预激的树突状细胞预防或治疗乙型肝炎，例如可以结合现有的疾病预防或治疗方法配合使用。
[0158]另外，本实施方式相关的疾病的预防或治疗，包括将疫苗预激的树突状细胞对生物进行给药的步骤。关于上述生物，可以是上述能够感染疾病的生物。另外，如果能够抑制排斥反应，树突状细胞的来源生物和给药生物可以是同源生物，也可以是异源生物。同源生物的情况，可以将本实施方式相关的树突状细胞给药于自身得到树突状细胞的生物体内，也可以给药于对组织相容性抗原一致的其他生物体内。
[0159]例如，上述生物可以是人类。这种情况下，HLA的配型尽可能要一致。
因此，树突状细胞最好是来源于具有血缘关系的提供者的树突状细胞。使用自身细胞则无需考虑HLA的配型，所以使用来自给药对象自己的树突状细胞最佳。
[0160]本实施方式相关的疫苗预激的树突状细胞，如上所述，可以以直接体内给药的形态被使用，或在体外与T细胞结合而激活T细胞，该T细胞以体内给药的形态被使用。但是，T细胞是效应细胞，发挥一次作用后，短时间内便死亡、消失。因此，为了预防或治疗乙型肝炎，必需高频率地反复给予T细胞。同时树突状细胞也作用于原态T细胞、记忆T细胞、B细胞，并反复给予刺激，从而具有长时间且强力的效果。因此，考虑将本实施方式相关的疫苗预激的树突状细胞直接体内给药的形态作为首选。
[0161]10、本实施方式相关的疫苗预激的树突状细胞的使用例及其效果。
以下是本实施方式相关的疫苗预激的树突状细胞的使用例及其效果。本使用例包括将疫苗预激的树突状细胞给药于人的步骤。本使用例能够适用于预防或治疗疾病。再者，本使用例不仅限于以下情况，本使用例相关的树突状细胞的使用形态可以在不超出本发明要约的范围内进行各种变更。
[0162]目前，在针对癌症治疗等进行的树突状细胞疗法中，主要是用癌细胞中提取的物质预激树突状细胞。如背景技术中所述，从细胞中提取的物质一般为多种物质的混合物。因此，被细胞提取物所预激的树突状细胞被认为是被细胞提取物中所含有的各种抗原所预激的。同时也认为这样处理的树突状细胞是包括递呈非特异抗原或与疾病无关的抗原以及具有递呈能力的树突状细胞的总和。这样制成的树突状细胞已经被批准用于癌症治疗等领域，但还未被允许用于正常人群。因此细胞提取物预激的树突状细胞还不能用于正常人群对疾病的预防。
[0163]对此，本实施方式中的疫苗预激的树突状细胞可以通过疫苗预激树突状细胞来制备。实际被出售的疫苗是经批准的，并且其对包括正常人群在内的所有人类的安全性和有效性也是已经被认可的。因此，本实施方式相关的疫苗预激的树突状细胞不仅可以用于患者的疾病治疗，也可以用于正常人群的疾病预防。
[0164]例如关于结核，日本战后患者数虽然顺利减少，但是自1980年起，减少率变缓，1997年起患者数连续3年增加。另外，治疗结核必需长期给予抗结核药物，由此产生耐药菌的可能性极高，为了防止产生耐药菌，2种以上药物并用是基本原则。
[0165]在此，本实施方式相关的疫苗预激的树突状细胞可以用于治疗结核。在此作为本实施方式相关的疫苗预激的树突状细，可以使用由用包括BCG疫苗等结核疫苗预激的步骤的方法得到疫苗预激的树突状细胞。据此，估计可以降低如上所述的耐药菌出现的频率，并认为这是结核治疗中的一大优点。另外，关于其他疾病，用疫苗预激的树突状细胞治疗可以期待同样的效果，预想对于治疗其他疾病也有很大的优点。
[0166]另外，作为使抗原递呈于树突状细胞的另一种方法，通过转染插入抗原编码基因的质粒载体，或感染插入抗原编码基因的病毒载体，令目的基因在树突状细胞表达的方法已为人所知。在现阶段，虽然以此方法得到的树突状细胞能够用于患者的疾病治疗，但是还未被允许运用于正常人群的疾病预防。
[0167]对此，本实施方式相关的疫苗预激的树突状细胞如上所述，不仅可以作为患者对疾病的治疗疫苗，也可以作为正常人群对疾病的预防疫苗。
[0168]另外对于疫苗无效的患者，认为原因之一是树突状细胞的功能低下。也就是认为，目前只是单纯的给予疫苗，但是并未充分激活树突状细胞的活性。
[0169]因此，本实施方式相关的疫苗预激的树突状细胞，例如通过以直接体内给药的形态被使用，或在体外与T细胞结合而激活T细胞，该T细胞以体内给药的形态被使用，从而能够使那些对于目前疫苗无效且不能产生抗体的正常人群产生针对目的抗原的抗体。
[0170]由此可见，本实施方式相关的疫苗预激的树突状细胞具有广泛的用途和很大的优点。另外也认为，本实施方式相关的疫苗预激的树突状细胞能够用于疾病的预防或治疗，并且与以往的树突状细胞疗法完全区分开了。
[0171]另外，在本发明的最佳实施方式项中，第6-10中所提到的预激的定义、预激的具体方法、树突状细胞的取得方法、树突状细胞培养用的培养基或细胞因子、疫苗成分的检测方法等，如果没有特别注释，与该项第1-5中所记载的解释、方法、物质相同。
实施例1
[0172]以下就本发明的实验例做具体说明，但是本发明不只限于以下实验例。
[0173](实验例1)树突状细胞的制备
(1)用肝素(Novo-heparin注1000：Aventis公司制)注射器(Terumo SyringeSS-50ESZ：Terumo公司制)从每个受验者(有反复使用过HB疫苗经验的健康志愿者5人为实验对象)采血40-60mL。在洁净工作台内将采得的血与血液同量的磷酸盐缓冲液水(PBS)充分混合。然后，使用Ficoll-Conray液(比重1.077)通过密度梯度离心法，分离单核细胞。于室温，1800rpm-3000rpm离心30分钟，将离心后的中间层作为单核细胞取出。
[0174](2)同时，按以下步骤从各受验者得到自身血清。首先，用无肝素注射器(Terumo Syringe SS-10ESZ：Terumo公司制)从每个受验者采血10mL。然后，用灭菌过的真空采血管(Becton DickinSon公司制)将采得的血液3000rpm离心分离血清。
[0175](3)在(1)得到的单核细胞中加入PBS并充分混合。然后，于4℃，1800rpm-2700rpm离心10分钟，按与(1)同样的步骤，再度回收单核细胞。此步骤至少需要重复2次，才能充分洗净单核细胞。
[0176](4)从(3)得到的单核细胞中计数，以2×106-2×107/mL的细胞数，每个35mm培养皿中加入2mL。培养基是使用加入1-5％浓度从(2)得到的各受试者自身血清的RPMI 1640培养基(Nipro公司制)。在专用培养室，于37℃，5％CO2浓度，75％空气的条件下进行培养。
[0177](5)将(4)的单核细胞培养90分钟以后，按以下步骤分离粘附细胞。首先，从培养室取出培养皿，在洁净工作台中静置5分钟。然后，倾斜培养皿，用培养液小心洗所有的粘附细胞，以去除淋巴细胞。
[0178](6)再培养(5)得到的粘附细胞(单核细胞)，每枚培养皿中加入2mL含有800U/mL的GM-CSF(Pepro.Tech EC公司制)、500U/mL的IL-4(Pepro.Tech EC公司制)和1-5％浓度的自身血清的RPMI 1640培养基进行4天的培养。
[0179](7)培养第4天，去除1mL的培养上清，再加入1mL(6)所记载的培养基，再培养4天。
[0180](7)培养第8天，从培养皿中回收树突状细胞，并测定树突状细胞数。
[0181](实验例2)用HB疫苗预激树突状细胞。
(1)将实验例1得到的树突状细胞分成两份。1份树突状细胞中加入最终浓度为2.5-5μg/mL的HB疫苗(r-HB疫苗“Mitsubishi”：Mitsubishi Pharma公司制)(成分：HBs抗原20μg/mL、乙基汞硫代水杨酸钠0.01w/v％/mL、硫酸铝钾5.2g/mL)，培养8-24小时，这样就得到了含有HBs抗原的HB疫苗预激的树突状细胞。(以下，该细胞称为“HB疫苗预激的树突状细胞”)。在专用培养室，于37℃，5％CO2浓度，75％空气的条件下进行培养。另一份树突状细胞不添加HB疫苗进行培养，作为阴性对照。
[0182](2)培养后，从培养皿中回收HB疫苗预激的树突状细胞。回收的细胞中加入PBS，于4℃，1500rpm离心5分钟，并去除上清。重复此步骤5次，以充分洗净树突状细胞。往所得到的树突状细胞中加入500μL PBS。同时，对于作为阴性对照的树突状细胞也进行同样的操作。
[0183](实验例3)HB疫苗预激的树突状细胞的给药
(1)测定HB疫苗预激的树突状细胞给药前抗HBs抗体值。首先，从5名受验者(有反复使用过HB疫苗经验的健康志愿者)采血，方法同实验例1(2)，从各受验者得到血清。通过CLIA发测定所得血清的抗HBs抗体值。结果如图1所示，受验者5人中，2人能够产生抗HBs抗体(抗HBs抗体阳性，应答者)3人不能够产生抗HBs抗体(抗HBs抗体阴性，无应答者)
[0184](2)将HB疫苗预激的树突状细胞给药于受验者。首先，用从实验例2中得到的HB疫苗预激的树突状细胞500μL中的50μL，对各受验者进行对于自己的树突状细胞的刺皮实验。结果是所有的受验者均为阴性。然后，将450μL自身的HB疫苗预激的树突状细胞分别皮下给药于各受验者。在实验例1-3所示的HB疫苗预激的树突状细胞的制备，给药过程中，研究人员均穿戴灭菌工作服、灭菌口罩、灭菌帽进行操作，且尽可能在洁净工作台中进行。所使用的试剂是购入的灭菌试剂(PBS：Invitrogen公司制，RPMI 1640：Nipro公司制)，使用时，用肉眼和显微镜确认试剂没有混浊。另外，通过测定培养上清中的内毒素，以确认培养过程中没有因微生物引起的污染。
[0185](实验例4)HB疫苗预激的树突状细胞的表面抗原解析
使用流式细胞仪进行细胞表面抗原的解析。
[0186](1)将实验例2得到的HB疫苗预激的树突状细胞及未预激的树突状细胞于5℃，1500rpm离心5分钟，并回收。回收的细胞用PBS/FCM(PH7.22：Gibco公司制)洗1次，再次于5℃，1500rpm离心5分钟，并回收。
[0187](2)将(1)所得到的树突状细胞分装到4个试管中，分别加入(a)10μLFITC标记的小鼠IgG(Cat.No.349041：Becton Dickinson公司制)，(b)2μL PE标记的小鼠IgG(Cat.No.349043：Becton Dickinson公司制)，(c)10μL FITC标记的小鼠抗人HLA-DR单克隆抗体(PM-32414X：Becton Dickinson公司制)，(d)10μL PE标记的抗人CD86(B70/B7-2)抗体(Cat.No.555658：Becton Dickinson公司制)。将它们置于冰上30分钟，加入2mL溶解液(Becton Dickinson公司制)，于5℃，2000rpm离心5分钟。
[0188](3)用PBS/FCM(PH7.22)反复充分地清洗回收的树突状细胞后，用FACScalibur(Becton Dickinson公司制)对表面抗原进行解析。
[0189](4)解析的结果如图2所示。图2的横轴表示的是解析的表面抗原，纵轴表示的是表面抗原的相对浓度。结果显示，HB疫苗预激的树突状细胞与未预激的树突状细胞相比，HLA-DR的表达上升1.2倍，CD86的表达上升1.6倍。由此可以看出，HB疫苗预激的树突状细胞已经成熟。
[0190](实验例5)HB疫苗预激的树突状细胞的功能解析-1
(1)从未注射过疫苗的其他人的末梢血中，与实验例1(1)相同地方法采集单核细胞。
[0191](2)使用autoMACS(Miltenyi Biotec公司制)和Pan Tcell isolationkit(Miltenyi Biotec公司制)从单核细胞分离T细胞。首先，每1×107的单核细胞中加入80μL MACS-Buffer，再加入20μL半抗原标记的混合物(CD11b、CD16、CD19、CD36、CD56)，于6-12℃混合10分钟。然后，用MACS-Buffer洗净并去除上清，重复该操作2次。接下来，每1×107的单核细胞中加入80μL MACS-Buffer，再加入20μL MACS抗半抗原抗体标记的玻璃细珠，于6-12℃混合15分钟。然后，用MACS-Buffer洗净并去除上清。接着，每1×107的单核细胞中加入500μLMACS-Buffer，用autoMACS的分选程序进行分选，以采集T细胞。
[0192](3)在(a)1×104未预激的树突状细胞，(b)1×104HB疫苗预激的树突状细胞中，分别加入2×105从(2)得到的T细胞，培养108小时。所使用的培养基是加入10％FCS(Filtron公司制)的RPMI 1640培养基。
[0193](4)分别加入3H标记的胸苷再培养12小时后，从培养皿回收细胞。
[0194](5)使用γ线计数器(LS6500：Beckman公司制)评估摄取能力，如图3所示。图3的纵轴表示的是胸苷的摄取能力，横轴左起分别表示的是(3)中所示的(a)(b)。由此可以看出，对于HLA不一致的T细胞，HB疫苗预激的树突状细胞与未预激的树突状细胞相比，T细胞的幼稚化辅助能力亢进1.5-2倍。
[0195](实验例6)HB疫苗预激的树突状细胞的功能解析-2
(1)每个受验者(有反复使用过HB疫苗经验的健康志愿者，且是HB疫苗应答者)采血60mL，用实验例1(1)、实验例5(2)的方法采集T细胞。(以下，将该T细胞称作“HBs记忆T细胞”)。
(2)用实验例1的方法从相同受验者采集树突状细胞，分为2份。一份用实验例2的方法，制备HB疫苗预激的树突状细胞，另一份不用HB疫苗预激，作为阴性对照。
[0196](3)将(a)HBs记忆T细胞1×105细胞与HB疫苗10μg，(b)HBs记忆T细胞1×105与未预激的树突状细胞1×104细胞，(c)HBs记忆T细胞1×105与疫苗预激的树突状细胞1×104细胞，分别混合培养。
[0197](4)7天后，在测定的12小时前加入3H标记的胸苷，使用与实验例5(5)同样的γ线计数器测定胸苷的摄取能力。
[0198](5)结果如图4所示。图4的纵轴表示的是cpm比，横轴左起分别表示的是(3)中所示的(a)(b)(c)。由此可以看出，与(b)未预激的树突状细胞混合培养的情况相比，(c)HB疫苗预激的树突状细胞混合培养的cpm高达7倍，HBs记忆T细胞也有增加。
[0199](实验例7)HB疫苗预激的树突状细胞的功能解析-3
(1)每个受验者(有反复使用过HB疫苗经验的健康志愿者，且是HB疫苗应答者)采血60mL，用实验例1(1)的方法采集单核细胞
[0200](2)将单核细胞6×107与(a)什么也不混合，(b)HB疫苗10μg(c)未预激的树突状细胞1×105，(d)疫苗预激的树突状细胞1×105细胞，分别混合培养。培养条件与实验例1(4)相同。
[0201](3)5天后，回收培养上清，用CLIA法测定抗HBs抗体值。
[0202](4)结果如图5所示。图5的纵轴表示的是抗HBs抗体值，横轴左起分别表示的是(2)中所示的(a)(b)(c)(d)。由此可以看出，与HB疫苗或未预激的树突状细胞混合培养的场合，不能产生抗HBs抗体，与HB疫苗预激的树突状细胞混合培养的的场合，能够产生抗HBs抗体，约15-56mIU/mL。
[0203](实验例8)HB疫苗预激的树突状细胞的给药伴随的过敏反应试验(0-24小时)
(1)实验例3中，HB疫苗预激的树突状细胞皮下给药于各受验者，在0-24小时间确认有无伴随炎症等过敏反应。
[0204](2)结果是，使用HB疫苗预激的树突状细胞的所有5人均无发热、潮红、休克等急性过敏反应。因此，确认了HB疫苗预激的树突状细胞的安全性。
[0205](实验例9)通过血液生化学检查进行安全性试验(第0、1、3、14天)
(1)为了进一步确认实验例3中HB疫苗预激的树突状细胞的安全性，对于各受验者进行包括CBC、肝功能、肾功能等约50以上项目的检查。主要的检查项目如图6所示。
[0206](2)ALT、CRP、PT、肌酐检查的结果如图7-10所示。各图的横轴表示的是自给药起的天数，纵轴表示的是各检查项目的值。结果是，使用HB疫苗预激的树突状细胞的所有5人，血液生化学检查均无异常。因此，确认了HB疫苗预激的树突状细胞的安全性。
[0207](实验例10)通过血液生化学检查进行自身免疫反应相关的安全试验(第0、14天)
(1)为了研究实验例3中HB疫苗预激的树突状细胞是否引起自身免疫反应，进行了IgG、IgM量的测定、甲状腺试验、微粒体试验、抗核抗体等自身抗体检查。
[0208](2)结果如图11所示。结果是，使用HB疫苗预激的树突状细胞的所有5人，均无自身免疫反应。因此，确认了HB疫苗预激的树突状细胞的安全性。
[0209](实验例11)体内HB疫苗预激的树突状细胞的抗HBs抗体诱导能力的评价(第0天、2、3、4、12周)
(1)用实验例1(2)的方法，从实验例3中被给予HB疫苗预激的树突状细胞的各受验者采集血清，用CLIA法测定抗HBs抗体值。
[0210](2)结果如图12、13、14所示。图12、14的横轴表示的是给药起的周数，纵轴表示的是抗HBs抗体值。另外，图13是图12表的数值化。图14表示的是HB疫苗无应答的受验者的抗HBs抗体值的变化图。根据图12、13的结果，通过给予1次HB疫苗预激的树突状细胞，HB疫苗无应答的3名受验者中有2人可以产生抗HBs抗体。另外，HB疫苗应答的2名受验者的抗HBs抗体也有所上升。由于这4例受验者的抗HBs抗体为10mIU/mL，因此认为给予1次HB疫苗预激的树突状细胞，便可产生足够量的抗体以预防或治疗乙型肝炎。另外，根据图14的结果可见，HB疫苗应答的受验者的抗HBs抗体值为10mIU/mL，并可以维持3个月。
实施例2
[0211]从受验者(乙型肝炎患者2人以及乙型肝炎肝移植的患者1人)采血，通过上述实施例1的实验例1相同的方法，从血液中制备树突状细胞。然后，通过实施例1的实验例2相同的方法，用所得到的树突状细胞制备HB疫苗预激的树突状细胞。
[0212]通过实施例1的实验例1相同的方法，用HB疫苗预激的树突状细胞500μL中的50μL，对各受验者进行对于自己的树突状细胞的刺皮实验。结果是所有的受验者均为阴性。然后，将450μL自身的HB疫苗预激的树突状细胞分别皮下给药于各受验者。给药后，并未发现上述受验者的自觉症状有任何变化。
[0213]为了进一步确认HB疫苗预激的树突状细胞的安全性，对于各受验者在第0、3、14及28天，进行包括CBC、肝功能、肾功能等约50以上项目的检查。上述所有受验者，在给药前后，血液生化学检查均无变化也无异常。上述受验者中的1名乙型肝炎患者的ALT、CRP、PT、WBC的检查结果如图15所示。横轴表示的是给药起的日数，纵轴表示的是检查项目的值。由此可见，HB疫苗预激的树突状细胞对于乙型肝炎患者是安全的。
实施例3
[0214]对于被皮下给予HB疫苗预激的树突状细胞的受验者(乙型肝炎患者)，上述给药后的2周及6周后，将450μL自身的HB疫苗预激的树突状细胞分别皮下给药于各受验者。从受验者采集血清，用该血清通过CLIA发测定抗HBs抗体值(第0、2、6、10、14、18及22周)。结果如图16所示。自第1次(第0周)给药后便产生HBs抗体，第3次(第6周)给药后，HBs抗体也显著上升。但是在该测定期间中所进行的肝功能及转氨酶检查，并未发现有上升。
[0215]以上结果可见，疫苗预激的树突状细胞给药后，由于未发现转氨酶上升，使用本发明的疫苗预激的树突状细胞，不会诱导CTL，但能产生HBs抗体。通常，CTL被诱导，转氨酶就会上升。虽然这里不诱导CTL的机制仍不明确，但是考虑用于预激的HB疫苗的成分可能与该不诱导CTL的机制有着深刻的关系。另外，本发明的疫苗预激的树突状细胞即使用于乙型肝炎患者，也能诱导产生HBs抗体，可见是以诱导体液性免疫为主。
Claims (61)
1.具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞，其特征在于，它是通过包括用HBs抗原预激树突状细胞的步骤的方法得到的。
2.权利要求1所述的具有HBs抗原递呈能力树突状的细胞，其特征在于，上述方法进一步包括从血液得到上述树突状细胞的步骤。
3.权利要求2所述的具有HBs抗原递呈能力树突状的细胞，其特征在于，上述方法进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
4.权利要求3所述的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞，其特征在于，上述生物为人。
5.权利要求1所述的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞，其特征在于，上述HBs抗原包括含有HB疫苗的HBs抗原。
6.具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的制备方法，其特征在于，它是包括用HBs抗原预激树突状细胞的步骤的方法。
7.权利要求6所述的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的制备方法，其特征在于，进一步包括从血液得到上述树突状细胞的步骤。
8.权利要求7所述的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的制备方法，其特征在于，进一步包括从生物采血的步骤。
9.权利要求8所述的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的制备方法，其特征在于，上述生物为人。
10.要求6所述的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞的制备方法，其特征在于，上述HBs抗原包括含有HB疫苗的HBs抗原。
11.一种组合物，其特征在于，它包含权利要求1所述的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，它进一步包括HB疫苗添加物。
13.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，它是实验试剂或实验试剂盒。
14.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，它是医药组合物。
15.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，它是免疫应答激活剂。
16.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，它是细胞疫苗。
17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，上述细胞疫苗为预防或治疗乙型肝炎的疫苗。
18.一种预防或治疗乙型肝炎的方法，其特征在于，它使用权利要求1所述的具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞。
19.如权利要求18所述的预防或治疗乙型肝炎的方法，其特征在于，包括将上述具有HBs抗原递呈能力的树突状细胞给药于生物的步骤。
20.如权利要求19所述的预防或治疗乙型肝炎的方法，其特征在于，上述生物为人。
21.如疫苗预激的树突状细胞，其特征在于，它是通过包括用疫苗预激树突状细胞的步骤的方法得到的。
22.如权利要求21所述的疫苗预激的树突状细胞，其特征在于，上述方法进一步包括从血液得到上述树突状细胞的步骤。
23.如权利要求22所述的疫苗预激的树突状细胞，其特征在于，上述方法进一步包括从生物采血的步骤。
24.如权利要求23所述的疫苗预激的树突状细胞，其特征在于，上述生物为人。
25.如权利要求21所述的疫苗预激的树突状细胞，其特征在于，上述用于预激的疫苗为疾病预防或治疗的疫苗。
26.如权利要求21所述的疫苗预激的树突状细胞，其特征在于，上述用于预激的疫苗为肝炎疫苗。
27.如权利要求26所述的疫苗预激的树突状细胞，其特征在于，上述肝炎疫苗为含有HBs抗原的HB疫苗。
28.一种疫苗预激的树突状细胞的制备方法，其特征在于，它是包括用疫苗预激树突状细胞的步骤的方法。
29.如权利要求28所述的疫苗预激的树突状细胞的制备方法，其特征在于，进一步包括从血液得到上述树突状细胞的步骤。
30.如权利要求29所述的疫苗预激的树突状细胞的制备方法，其特征在于，进一步包括从生物采血的步骤。
31.如权利要求30所述的疫苗预激的树突状细胞的制备方法，其特征在于，上述生物为人。
32.如权利要求28所述的疫苗预激的树突状细胞的制备方法，其特征在于，上述用于预激的疫苗为预防或治疗疾病的疫苗。
33.如权利要求28所述的疫苗预激的树突状细胞的制备方法，其特征在于，上述用于预激的疫苗为肝炎疫苗。
34.如权利要求33所述的疫苗预激的树突状细胞的制备方法，其特征在于，上述肝炎疫苗为含有HBs抗原的HB疫苗。
35.一种组合物，其特征在于，它包含权利要求21所述的疫苗预激的树突状细胞。
36.如权利要求35所述的组合物，其特征在于，它进一步包括疫苗添加物。
37.如权利要求35所述的组合物，其特征在于，它是实验试剂或实验试剂盒。
38.如权利要求35所述的组合物，其特征在于，它是医药组合物。
39.如权利要求35所述组合物，其特征在于，它是免疫应答激活剂。
40.如权利要求35所述的组合物，其特征在于，它是细胞疫苗。
41.如权利要求40所述的组合物，其特征在于，上述细胞疫苗为预防或治疗乙型肝炎的疫苗。
42.一种预防或治疗疾病的方法，其特征在于，它是使用权利要求21所述的疫苗预激的树突状细胞预防或治疗疾病的方法。
43.如权利要求42所述的预防或治疗疾病的方法，其特征在于，包括将上述疫苗预激的树突状细胞给药于生物的步骤。
44.如权利要求43所述的预防或治疗疾病的方法，其特征在于，上述生物为人。
45.一种用于人体的疫苗预激的树突状细胞，它是为了预防或治疗乙型肝炎的疫苗预激的树突状细胞，其特征在于，上述疫苗预激的树突状细胞是通过包括树突状细胞的取得步骤和预激步骤的制备方法得到的疫苗预激的树突状细胞，树突状细胞的取得步骤是采集乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者末梢血、并从该末梢血中分离单核细胞来得到树突状细胞的步骤，而预激步骤是用疫苗预激树突状细胞的步骤，上述预激步骤所使用的疫苗是为了预防或治疗乙型肝炎的疫苗。
46.如权利要求45所述的用于人体的疫苗预激的树突状细胞，其特征在于，在上述疫苗预激步骤中，预激时间为8-24小时。
47.如权利要求45所述的用于人体的疫苗预激的树突状细胞，其特征在于，在上述树突状细胞取得步骤中，分离的单核细胞是与GM-CSF及IL-4共培养的。
48.如权利要求45所述的用于人体的疫苗预激的树突状细胞，其特征在于，对于人诱导Th2而不诱导Th1。
49.如权利要求45所述的用于人体的疫苗预激的树突状细胞，其特征在于，对于人不诱导CTL。
50.一种预防或治疗人类乙型肝炎的医药品，它是包括权利要求49所述的用于人体的疫苗预激的树突状细胞的医药品。
51.如权利要求50所述的医药品，其特征在于，上述乙型肝炎为慢性乙型肝炎。
52.一种用于人体的疫苗预激的树突状细胞的制备方法，其特征在于，它是包括树突状细胞的取得步骤和预激步骤的制备方法，树突状细胞的取得步骤是通过采集乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者末梢血，并从该末梢血中分离单核细胞来得到来源于人的血液的树突状细胞，而预激步骤是用疫苗预激上述树突状细胞，从而得到用于预防或治疗人类乙型肝炎的疫苗预激的树突状细胞，上述预激步骤中用于预激的疫苗是为了预防或治疗乙型肝炎的疫苗。
53.如权利要求45所述的制备方法，其特征在于，在上述疫苗预激步骤中，预激时间为8-24小时。
54.如权利要求45所述的制备方法，其特征在于，在上述树突状细胞取得步骤中，分离的单核细胞是与GM-CSF及IL-4共培养的。
55.如权利要求45所述的制备方法，其特征在于，上述用于人体的疫苗预激的树突状细胞，对于人诱导Th2而不诱导Th1。
56.如权利要求48所述的制备方法，其特征在于，上述用于人体的疫苗预激的树突状细胞，对于人不诱导CTL。
57.一种通过用于人体的疫苗预激的树突状细胞来预防或治疗人类乙型肝炎的方法，其特征在于，它是将来源于自身树突状细胞的疫苗预激的树突状细胞给药于乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者，用于人体的疫苗预激的树突状细胞是通过包括树突状细胞的取得步骤和预激步骤的制备方法得到的，树突状细胞的取得步骤是通过采集乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者末梢血，从该末梢血中分离单核细胞来得到树突状细胞的步骤，而预激步骤是预激上述树突状细胞的步骤，上述用于预激的疫苗是预防或治疗乙型肝炎的疫苗。
58.如权利要求57所述的预防或治疗的方法，其特征在于，上述用于人体的疫苗预激的树突状细胞，对于人诱导Th2而不诱导Th1。
59.如权利要求57所述的预防或治疗的方法，其特征在于，上述用于人体的疫苗预激的树突状细胞，对于人不诱导CTL。
60.如权利要求59所述的预防或治疗的方法，其特征在于，上述乙型肝炎为慢性乙型肝炎。
61.一种用于人体的疫苗预激的树突状细胞在预防或治疗人类乙型肝炎上的用途，其特征在于，上述疫苗预激的树突状细胞是通过包括树突状细胞的取得步骤和预激步骤的制备方法得到的，树突状细胞的取得步骤是通过采集乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者末梢血，从该末梢血中分离单核细胞来得到树突状细胞的步骤，而预激步骤是预激上述树突状细胞的步骤，上述用于预激步骤的疫苗是预防或治疗乙型肝炎的疫苗，上述疫苗预激的树突状细胞给药于被采集上述末梢血的乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者。
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