CN110747167A - 一种半合子bak细胞的制备方法及其应用 - Google Patents
一种半合子bak细胞的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及肿瘤免疫技术领域，具体涉及一种半合子BAK细胞的制备方法及其应用。本发明提供的半合子BAK细胞的制备方法包括将单个核细胞在含有生物反应调节剂组合I的细胞培养基中进行活化后再进行扩增培养；其中，生物反应调节剂组合I包括选自抗人CD3单克隆抗体、赫赛汀、唑来膦酸、粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子、干扰素γ、白介素2中的至少两种。本发明的BAK细胞制备方法可有效减少单个核细胞的活化步骤，简化制备工艺，利用较少的活化试剂可得到大量高质量、具有广泛高效的肿瘤细胞杀伤活性且安全性高的BAK细胞，具有较高的经济性和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫技术领域，具体涉及一种半合子BAK细胞的制备方法、利用该制备方法制备得到的半合子BAK细胞及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是继心血管疾病之后的危害人类健康的第二号杀手，近年来，肿瘤的发生率和死亡率呈逐年上升的趋势，且肿瘤发病呈年轻化趋势。恶性肿瘤的传统疗法包括手术、化疗和放疗等，但是这些治疗手段都存在一定的局限性：手术常因癌细胞浸润到邻近或转移到远端组织而不能根除；化疗、放疗则在杀伤癌细胞的同时亦累及到正常组织和细胞，不同肿瘤对放、化疗的敏感性存在较大差异，同时会发生严重的毒副作用，这些均限制了放化疗的临床疗效。
随着人们对肿瘤发生发展机制的深入研究及肿瘤免疫学、分子生物学、生物工程技术的发展，肿瘤的免疫治疗迅速发展成为肿瘤治疗的第四种治疗模式。免疫治疗可以单独使用，也可以与现代手术、化疗和放疗方法联合应用，具有很强的互补作用，不但能够清除体内不同部位的肿瘤细胞，预防肿瘤复发与转移，而且对病人受损的免疫系统又能起到恢复与重建的独特作用。
免疫治疗包括肿瘤疫苗治疗、细胞因子治疗、过继性细胞免疫治疗及单克隆抗体免疫治疗等，其中，过继性免疫细胞治疗成为当前研究的热点，淋巴因子活化的细胞(Lymphokine activated killer,LAK)即是一种为癌症患者提供过继性免疫细胞的治疗技术，该治疗技术为采集患者外周血，提取外周血单个核细胞，后经与白介素2(Interleukin2,IL-2)共孵育，最后将IL-2与活化的细胞回输患者。然而，接受LAK细胞治疗的患者会发生严重副作用，使得患者对治疗并不满意。因此，肿瘤浸润淋巴细胞(Tumorinfiltrating lymphocyte,TIL)治疗技术随之得到发展，该技术需要从癌症患者体内采集肿瘤组织，在体外从实体肿瘤组织中提取淋巴细胞，经IL-2刺激后，将活化后的淋巴细胞与IL-2同时回输患者。该治疗技术的缺点是必须通过临床无菌手术切取患者肿瘤组织，体外操作比较复杂，且在施用过程中同样会产生副作用。随后，美国斯坦福大学的Schmidt Wolf教授于1991年首次报道了使用细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokines induced killercells，CIK)进行癌症的辅助治疗，CIK细胞是将人外周血中的单个核细胞在多种细胞因子，如CD3单克隆抗体、IFN-γ、IL-2、IL-15等的作用下，经扩增培养获得的一群异质性混合细胞，该混合细胞中主要效应细胞为CD3+CD56+细胞，同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，因CD3分子是T细胞的表面标志，CD56分子是NK细胞的表面标志，所以又被称为NK细胞样T淋巴细胞，即NKT细胞，因此，具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和自然杀伤细胞的无MHC限制性的广谱杀瘤、抗病毒活性的优点。后续临床上又尝试使用细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocytes,CTL)，即一种肿瘤特异性CD8阳性T淋巴细胞，该细胞为主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)限制性T细胞，需使用自体或异体交叉反应性肿瘤刺激外周血单个核细胞进行生产制备。但该治疗技术同样需要切取患者自体肿瘤组织或者人工合成肿瘤相关性抗原刺激T淋巴细胞，所获得的肿瘤特异性CTL细胞识别癌细胞必须依赖MHC-I分子，而大多数癌细胞在增殖过程中通常会通过低表达或者不表达MHC-I分子，从而发生免疫逃逸，因此，肿瘤特异性CTL在实际使用过程中对于逃逸的癌细胞同样也束手无策。
传统的过继性免疫细胞治疗均是通过分离患者自体外周血或实体肿瘤组织中的单个核细胞，将单个核细胞在预先包被多聚赖氨酸的培养瓶中静置，去掉贴壁细胞后，收集悬浮细胞，加入经CD3单克隆抗体和/或CD28单克隆抗体和/或重组人纤粘连蛋白Retronectin包被过的培养瓶中，同时再加入IFN-γ，培养1～4天后，再添加CD3单克隆抗体和/或CD28单克隆抗体和/或重组人纤粘连蛋白Retronectin、IL-2、IL-1α、IL-15、IL-21等进行扩增培养。扩增培养后的细胞给予患者回输，起到清除微小癌灶，预防复发和转移，提高生活质量的作用。回输免疫细胞作用机制基本可以归为两类：1、通过经典αβT淋巴细胞表面的CD3-TCR蛋白复合体与MHC-I分子相互作用来识别并杀灭癌细胞，如LAK细胞、TIL细胞、CTL细胞；2、通过经典αβT淋巴细胞表面的CD3-TCR蛋白复合体与MHC-I分子相互作用以及通过神经细胞黏附分子CD56(NCAM-1)与癌细胞相互作用的双重方式识别并杀灭癌细胞，如CIK细胞。
T细胞受体(T cell receptor,TCR)表达在T淋巴细胞的膜表面，负责识别抗原物质，TCR有两种结构链：αβ链(通常表达于传统辅助型T细胞和杀伤性T细胞表面)和γδ链，含有TCRαβ链的T淋巴细胞称为αβT淋巴细胞，含TCRγδ链的则称为γδT淋巴细胞。αβ或γδ二聚体以非共价键结合的形式，与CD3蛋白复合体耦连，形成TCR-CD3复合体。αβT淋巴细胞是参与免疫应答的主要细胞群，占成熟T淋巴细胞的90～95％，而γδT淋巴细胞仅占外周血T淋巴细胞的0.5％～5％，但γδT从细胞分化上是先于αβT细胞出现的，主要分布于皮肤、小肠、食道、肺和生殖器等黏膜上皮组织中。另外，γδT淋巴细胞具有非MHC限制性的杀瘤作用，对多种自体、同种异体或异种肿瘤细胞均表现出显著的杀伤活性。
CD56抗原与神经细胞黏附分子(Neural cell adhesion molecule，NCAM)结构一致，是第一个被鉴定、分离并测序的细胞间黏附分子，结构上来说，NCAM的胞外域由5个IgG样区域组成。以往的研究认为，CD56分子是NK细胞(Natrual killer cells)表面表达的标志物，该分子后来在T细胞表面检测到且能发挥非MHC限制性细胞毒性作用。有研究显示，CD56阳性细胞，包括CD3+CD56+αβT、CD3+CD56+γδT细胞、CD3-CD56+NK细胞的杀瘤作用显著高于CD56阴性细胞。
生物反应调节剂(Biological response modifier，BRM)活化的杀伤细胞(Activated killer cells)，即BRM-活化的杀伤细胞(BAK细胞)是利用非MHC限制性的免疫细胞(γδT细胞和NK细胞)发挥识别和杀灭癌细胞的作用，因此，BAK细胞对大多数恶性肿瘤具有抵抗性，应用范围广泛。BAK细胞中的γδT细胞通过自身表达的NKG2D与肿瘤细胞表面的MHC-I型分子相关蛋白A/B发生结合，CD56+细胞(包括CD3-CD56+NK细胞、CD3+CD56+NKT细胞)则通过神经黏附分子NCAM以及ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用)作用与肿瘤细胞结合，从而引起BAK细胞活化，进而释放细胞毒性物质，如穿孔素和颗粒酶，引起肿瘤细胞的坏死。同时，BAK细胞分泌部分细胞因子，如TNF-α、IFN-γ，协同细胞表面表达的Fas(CD95)配体(FasL)和TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand)分子诱导肿瘤细胞发生凋亡。BAK细胞杀伤肿瘤细胞的作用机制如图1所示。
半合子是指染色体有50％相同的个体，如子女与父母、父母与子女、兄弟姐妹之间，此三类关系为直系亲属，均适用于半合子。因此，针对恶性肿瘤患者开展过继性免疫细胞治疗时，在确定亲属间半合子关系的前体下，供受两者可无需进行双方HLA配型，可直接采集子女或者父母的血细胞制备BAK细胞，待细胞大量扩增并质检合格后，收获细胞，制备成BAK细胞治疗产品，用于父母或者子女进行抗肿瘤的治疗。
此外，1956年，Barnes等在动物实验中发现，异基因骨髓干细胞移植(allo-BMT)具有抗白血病效应，将该效应成为移植物抗白血病作用(Graft Versus Leukaemia,GVL)。20世纪80年代，人们在接受allo-BMT的淋巴瘤患者中也发现了类似作用，并称该作用为移植物抗淋巴瘤作用。目前，GVL反应也已从过去主要指移植物抗白血病作用扩展到其他非血液系统恶性肿瘤，将其称为移植物抗肿瘤效应(Graft Versus Tumor，GVT)，是当前较为有效的肿瘤免疫细胞治疗效应。肿瘤细胞免疫原性低下，缺乏表达激活T细胞所需的第二信号，在MHC-I类分子丢失或突变的同时可高表达非经典MHC-I类分子，如HLA-G、HLA-E，传递强烈的杀伤抑制性信号，这些使得肿瘤细胞可逃避机体特异性和非特异性细胞的杀伤，造成机体对肿瘤细胞产生免疫耐受。而异基因免疫治疗可打破肿瘤免疫耐受，使针对肿瘤的特异性免疫应答得以进行，即产生移植物抗肿瘤效应，这也是异基因细胞移植后产生的一种特有的异体抗肿瘤反应。
因此，采集半合子的直系亲属外周血行BAK细胞治疗，所获半合子BAK细胞中除了HLA匹配的免疫细胞发挥抗肿瘤作用外，还存在与患者HLA并不匹配的免疫细胞，该部分细胞在输入患者体内后，即可通过MHC限制性和非限制性两种方式杀伤患者体内的癌细胞，产生移植物抗肿瘤效应。
目前，用于过继性细胞免疫治疗的免疫细胞的制备方法主要存在如下问题：
(1)初始分离得到的单个核细胞需预先处理，去掉贴壁细胞，收集悬浮细胞加入活化试剂进行培养，该操作步骤繁琐，任何一个环节发生污染或中间细胞制备质量差都会导致细胞培养失败，对技术人员的操作要求比较高；
(2)培养瓶需要事先经抗体包被，对于需要时间紧迫的细胞制备而言，无法保证即时操作，即时预存预先包被的培养瓶，抗体也会因离开原装保存条件而使效价降低，势必影响细胞培养质量；
(3)细胞制备工艺中存在使用较多非临床级蛋白类抗体和细胞因子，对于用于临床回输患者的细胞而言，无形中会增加患者的风险；
(4)在细胞制备工艺中重复添加CD3单克隆抗体、IFN-γ等试剂，造成试剂的浪费，同时培养周期长也会增加培养基用量，从而直接导致生产成本升高；
(5)肿瘤组织在发生发展过程中，会通过多种途径发生免疫逃逸，如低表达或不表达MHC-I分子，使得传统依赖MHC-I分子获取癌细胞抗原信息的淋巴细胞无法识别癌细胞，从而使临床疗效大打折扣；
(6)部分治疗技术需要临床无菌手术切除癌症患者的肿瘤组织，对于无法获得肿瘤组织的患者则无法开展过继性免疫细胞治疗；
(7)在癌症的发生和持续发展过程中，患者免疫力会逐渐降低，包括免疫细胞数量减少、免疫功能的降低以及免疫细胞的耗竭等，因此，如果这部分患者想要接受过继性免疫细胞治疗，可能无法获得数量足够且功能正常的起始免疫细胞，导致无法获得足够临床可用的细胞量；
(8)通常，癌症患者需接受手术、放疗、化疗等治疗，其外周血中的免疫细胞数量比健康人要低，接受过继性免疫细胞治疗的患者需要采集自体血液，而由于其体内免疫细胞较少，这就需要采集更多血液，对于免疫力已经较为微弱的癌症患者而言，无疑会更加减退机体的抗肿瘤能力；
(9)部分治疗技术使用人工合成的肿瘤相关性抗原，由于这些抗原物质均具有免疫原性，经抗原活化的淋巴细胞回输患者体内，机体容易产生针对该外源抗原的不良反应。
综上所述，目前过继免疫细胞治疗在细胞的生产制备和应用过程中仍存在的诸多不足之处，并且其有效性尚无法满足临床需求，因此，亟需开发一种新的过继免疫细胞治疗技术，一方面使得过继性免疫细胞能够对更广泛的恶性肿瘤具有更高效的抵抗作用，提高患者的生存质量、预防复发和转移，甚至能够延长患者的生存期；另一方面使得过继性免疫细胞的制备工艺更加简单、易于操作、制备成本更低。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一步法活化单个核细胞制备半合子BAK细胞的方法以及利用该方法制备得到的半合子BAK细胞及其应用。
为实现上述目的，本发明开展了半合子BAK细胞的高效制备的研发工作，尽管BAK细胞具有利用非MHC限制性的免疫细胞(γδT细胞和NK细胞)发挥识别和杀灭癌细胞作用的优势，但是，BAK细胞中的γδT细胞为一类连接固有免疫和适应性免疫的独特的一群细胞，既具有抗原提呈细胞细胞APC，如树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞等识别抗原的能力，又具有不依赖于MHC分子的细胞毒杀伤活性；BAK细胞中的NK细胞是一类不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，是机体抗肿瘤和病毒的第一道防线，无需抗原致敏即可识别和杀伤肿瘤细胞和被病毒感染的细胞，不依赖于MHC类分子，发挥非特异性杀伤作用。基于BAK细胞以上特性，将外周血单个核细胞活化为BAK细胞较其它免疫细胞的活化具有更高的难度。基于此，现有技术需要依赖固定化的生物反应调节剂(如生物反应调节剂包被的培养瓶)以及多个生物反应调节剂(其中不乏目前没有临床药用级别的物质)的多步活化来制备BAK细胞。本发明在研发过程中也发现，简单地将生物反应调节剂以非固定化的方式添加或将各种生物反应调节剂一次性添加会极大地影响BAK细胞的制备效率和抗肿瘤活性。本发明通过研究和实践发现，利用特定的生物反应调节剂的组合能够很好地解决上述问题，进而利用目前已有临床药用级别的生物反应调节剂的特定组合，实现了通过在培养基中添加生物反应调节剂、一步法活化外周血单个核细胞制备半合子BAK细胞，有效避免了因需要培养瓶的包被预处理、初始分离得到的单个核细胞需预先处理、细胞培养活化过程中多次、重复添加生物反应调节剂导致的操作繁琐复杂、培养失败概率高、增加成本等问题。
具体地，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种半合子BAK细胞的制备方法，包括：将单个核细胞在含有生物反应调节剂组合I的细胞培养基中进行活化后再进行扩增培养；所述生物反应调节剂组合I包括选自抗人CD3单克隆抗体、赫赛汀、唑来膦酸、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、干扰素γ、白介素2中的至少两种。
上述各种生物反应调节剂在以不同方式复配使用时的浓度优选如下：所述抗人CD3单克隆抗体的浓度为30～500ng/mL、所述赫赛汀的浓度为0.5～20μg/mL、所述唑来膦酸的浓度为0.5～20μmol/L、所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的浓度为200U～2000U/mL、所述干扰素γ的浓度为200U～2000U/mL、所述白介素2的浓度为200U～2000U/mL。
本发明中，抗人CD3单克隆抗体、赫赛汀、唑来膦酸、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、重组人干扰素γ、注射用重组人白介素2、注射液生理盐水、人血白蛋白均为医用无菌产品。
抗人CD3单克隆抗体、赫赛汀、唑来膦酸、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、重组人干扰素γ、注射用重组人白介素2、注射用生理盐水、人血白蛋白均为临床用药，其安全性已经过大量临床应用检验，完全符合原食品与药品监督管理局(CFDA)颁布的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行)》中关于“细胞治疗产品生产过程中使用的筛查试剂盒、分选试剂或材料、细胞分离或活化用抗体或磁珠、培养基、培养过程的添加物和与产品或中间样品接触的生产设备或材料等应经过严格的筛选和适用性的评估，应关注感染性病原微生物和免疫原性等安全性风险，建议尽量使用经监管当局批准的产品，否则建议使用适合产品的高质量级别的产品”的要求。
优选地，所述生物活性调节剂组合I包括抗人CD3单克隆抗体、白介素2以及选自唑来膦酸、赫赛汀和干扰素γ中的至少一种；
在上述生物反应调节剂的组合中，更优选所述生物活性调节剂组合I包括抗人CD3单克隆抗体、白介素2、唑来膦酸和干扰素γ。该生物反应调节剂组合能够显著促进单个核细胞的活化，有效刺激γδT细胞和NK细胞的增殖，提高BAK细胞中γδT细胞和NK细胞的比例，并增强γδT和NK细胞的功能，有效提高半合子BAK细胞的肿瘤杀伤活性。
在上述生物反应调节剂的组合方式的基础上，通过控制白介素2和干扰素γ的用量比能够更高效地促进单个核细胞活化为γδT细胞和NK细胞。优选地，所述含有生物反应调节剂组合I的细胞培养基中，所述白介素2和所述干扰素γ的浓度比为(1～2):1。
更优选地，所述含有生物反应调节剂组合I的细胞培养基中，所述抗人CD3单克隆抗体的浓度为50～450ng/mL，所述唑来膦酸的浓度为0.5～15μmol/L，所述干扰素γ的浓度为500U～1500U/mL，所述白介素2的浓度为500U～1500U/mL。
更优选地，所述含有生物反应调节剂组合I的细胞培养基中，所述抗人CD3单克隆抗体的浓度为50～300ng/mL，所述唑来膦酸的浓度为1～10μmol/L，所述干扰素γ的浓度为500U～1000U/mL，所述白介素2的浓度为500U～1000U/mL。
优选地，所述含有生物反应调节剂组合I的细胞培养基以无血清培养基为溶剂，还含有体积百分含量为1～10％的灭活血清。
本发明中，所述无血清培养基包括选自RPMI 1640培养基、AIM-V培养基、KBM581培养基、X-VIVO 15培养、SCGM培养基、OpTmizer培养基中的一种或多种。
优选地，所述灭活血清为半合子供者灭活血清。
优选地，在所述单个核细胞接种在含有生物反应调节剂组合I的细胞培养基进行活化时，所述单个核细胞的初始接种浓度为1×106～3×106/mL。
在进行活化培养后，还需对细胞进行扩增培养，本发明通过对扩增培养步骤的优化，使得其能够与活化培养步骤更好地协同配合，有效提高半合子BAK细胞中γδT细胞和NK细胞的比例和功能，有效提高BAK细胞的肿瘤杀伤活性。
具体地，所述扩增培养包括：在活化培养2～4天后，向活化培养体系中补加所述活化培养体系体积的20～40％的含有生物反应调节剂组合II的所述无血清培养基和所述活化培养体系体积1～10％的灭活血清，以后每隔1～3天补加培养体系体积50％～100％的含有白介素2的所述无血清培养基和培养体系体积1～3％的灭活血清。
其中，所述生物反应调节剂组合II包括选自唑来膦酸、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、干扰素γ、白介素2中的一种或多种。
优选地，所述生物反应调节剂组合II包括唑来膦酸和白介素2。
更优选地，所述含有生物反应调节剂组合II的所述无血清培养基中，所述唑来膦酸的浓度为1～10μmol/L，所述白介素2的浓度为500U～1000U/mL。所述含有白介素2的所述无血清培养基中，所述白介素2的浓度为500U～1000U/mL。
优选地，在活化培养2～4天后，向活化培养体系中补加所述活化培养体系体积的20～40％的含有生物反应调节剂组合II的所述无血清培养基和1～10％的灭活血清后，调整细胞密度为0.5×106～1.5×106/mL。
优选地，在培养第5～7天时，将培养细胞全部转入透气性培养袋中，补加现有培养体系总体积50％～100％的含有500U～1500U/mL白介素2的无血清培养基和1％～10％的灭活血清，继续培养。细胞培养至第14～21天时，收集细胞，于4℃～8℃条件下，1500rpm～2000rpm离心10～15分钟，离心清洗2～3次，以注射用生理盐水重悬BAK细胞，后经40～100μm一次性滤网过滤，得到BAK单细胞悬液，将所得BAK细胞悬液注入于含0.5％～2％人血白蛋白的注射用生理盐水中。
本发明中，除特殊说明外，所有细胞培养优选均在37℃、5％CO2培养箱中进行。
本发明中，所述单个核细胞优选采用包括如下步骤的方法制备得到：
(1)采集外周血经肝素钠抗凝处理后分离血细胞或利用单采机、枸橼酸钠抗凝处理获得血细胞，利用注射用生理盐水将所述血细胞进行1～5倍比例的稀释；
(2)在稀释的血细胞中加入人淋巴细胞分离液，在20℃～25℃条件下，1800rpm～2500rpm离心15～25分钟；所述稀释血细胞与所述人淋巴细胞分离液的体积比为(1～3)：1；
(3)吸取中间层液体于50～60℃放置30～60分钟，在4℃～8℃条件下，3000rpm～3500rpm离心25～30分钟；
(4)吸取位于中间层的白膜层，清洗2～3次后以所述无血清培养基悬浮。
优选地，上述步骤(1)中，将采集的外周血进行艾滋病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、人巨细胞病毒(HCMV)、嗜人T淋巴细胞病毒(HTLV)和梅毒螺旋体的感染情况以及细菌、真菌、支原体的感染情况检测，保证HIV、HBV、HCV、HCMV、HTLV以及梅毒螺旋体、细菌、真菌、支原体血检测均应为阴性。
上述步骤(2)中，人淋巴细胞分离液为使用葡聚糖和泛影葡胺按比例配制，比重为1.060～1.080g/mL；先添加人淋巴细胞分离液，后将稀释血细胞添加至人淋巴细胞分离液的上层，形成明显分界；在离心过程中使用水平离心机进行离心。
利用本发明所述制备方法制备得到的BAK细胞若在2小时内使用，可于20℃～25℃保存；若保存时间超过2小时，可于4℃～8℃冷藏保存。
利用本发明所述制备方法制备得到的BAK细胞悬液，按照《中国药典》中规定的培养法检验无菌规程检验细菌、真菌和支原体；按照《中国药典》中规定的凝胶法检验致热源规程检验内毒素；采用实时定量PCR法检验艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒和梅毒螺旋体。BAK细胞终产品经检验后，应为细菌阴性，真菌阴性，支原体阴性，病毒(艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒和梅毒螺旋体)核酸含量低于检验低限值。内毒素含量应小于0.5EU/mL。
利用本发明所述制备方法制备得到的半合子BAK细胞悬液经血球计数板配合台盼蓝染色法，计算BAK细胞总数和细胞活率，满足如下标准：细胞总数≥5×109，细胞活率≥90％。
利用本发明所述制备方法制备得到的半合子BAK细胞悬液经荧光标记的CD45抗体、CD3抗体、CD4抗体、CD8抗体、TCRγδ抗体、CD56抗体染色，通过流式细胞仪检测各亚群细胞比例，满足如下标准：CD3+T细胞≥80％，CD4+T细胞＜20％，CD8+T细胞≥60％，TCRγδ+T细胞≥30％，CD56+细胞≥30％。
第二方面，本发明提供一种半合子BAK细胞，所述半合子BAK细胞中CD3+T、TCRγδ+T、CD4+T、CD8+T、CD56+亚群细胞的比例如下：CD3+T细胞≥80％，TCRγδ+T细胞≥30％，CD4+T细胞＜20％，CD8+T细胞≥60％，CD56+细胞≥30％。
优选地，所述半合子BAK细胞为利用所述半合子BAK细胞的制备方法制备得到。
更优选地，所述半合子BAK细胞为细菌阴性、真菌阴性、支原体阴性；艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒和梅毒的核酸含量低于检验低限值；内毒素含量＜0.5EU/mL。
利用所述的半合子BAK细胞的制备方法制备得到的半合子BAK细胞。
第三方面，本发明提供所述半合子BAK细胞的制备方法或利用所述制备方法制备得到的半合子BAK细胞在制备抗肿瘤、抗感染或免疫调节药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的半合子BAK细胞制备方法在细胞制备开始无需预先将单个核细胞中的贴壁细胞和悬浮细胞分离，直接进行细胞活化；无需预先或临时包被培养容器，直接在培养基中添加生物反应调节剂即可；为一步法活化，无需多次、重复添加活化试剂；因此，具有操作简单、步骤少，可降低细胞扩增失败的概率，省时省力、培养试剂用量少、制备BAK细胞数量、质量和抗肿瘤活性高的优势，有效降低半合子BAK细胞制备的成本并提高了制备效率，非常方便临床单位医疗技术人员使用，具有较高的经济性和应用价值；
(2)本发明的半合子BAK细胞制备方法所用的生物反应调节剂目前均有临床使用级别药品，且均为可溶性蛋白与细胞因子，原料来源安全、可靠。利用本发明提供的制备方法制备的半合子BAK细胞的安全性高，可降低临床使用细胞的风险性；
(3)本发明提供的半合子BAK细胞制备方法均采用无血清培养基，进而有效降低生产成本；且后续培养过程不使用动物来源血清和人AB血清，可防止异种血清蛋白引起过敏反应以及交叉感染；
(4)利用本发明提供的半合子BAK细胞制备方法进行单个核细胞的活化扩增，细胞总数≥5×109，细胞活率≥90％；CD3+T细胞≥80％，CD4+T细胞＜20％，CD8+T细胞≥60％，TCRγδ+T细胞≥30％，CD56+细胞≥30％。由于制备得到的半合子BAK细胞中主要效应细胞为CD56+γδT细胞和NK细胞，其杀灭肿瘤细胞的作用不受限于MHC-I型分子的限制，可通过淋巴细胞功能性抗原1(LFA-1)与神经细胞间黏附分子(NCAM)结合以及ADCC作用与肿瘤细胞识别，理论上可对所有实体瘤和血液肿瘤细胞均具有杀灭作用。体外肿瘤杀伤试验显示其对肝癌细胞、肺癌细胞均具有较高的杀伤活性。
(5)利用本发明的制备方法制备半合子BAK细胞，无需采集癌症患者自己的血液，只需要采集直系亲属间的半合子供者的血液，供者与受者之间无需进行HLA配型，可最大程度保护癌症患者的免疫力不受损伤，同时，半合子供者可不断采集外周血行半合子BAK细胞的制备，可持续为癌症患者过继输注BAK细胞，使得过继免疫细胞治疗具有较强的可持续性；
(6)利用本发明的制备方法制备得到的半合子BAK细胞中与癌症患者HLA不匹配的免疫细胞输入癌症患者体内后，亦可发挥移植物抗肿瘤(GVT)反应，可提高半合子BAK细胞的抗肿瘤作用；另外，半合子BAK细胞对癌症患者的淋巴细胞杀伤活性较低，经癌症患者使用后，能够尽量降低宿主免疫排斥，减少不良反应的发生。
附图说明
图1为本发明背景技术部分BAK细胞对于肿瘤细胞的作用机制示意图。
图2为本发明实验例1中半合子BAK细胞的生长扩增状况；其中，A、B、C、D分别代表细胞扩增第3天、第7天、第14天、第21天的细胞状态。
图3为本发明实验例1中半合子BAK细胞的扩增曲线。
图4为本发明实验例2中活化扩增的半合子BAK细胞中CD3、CD4抗原表达情况。
图5为本发明实验例2中活化扩增的半合子BAK细胞中CD3、CD8抗原表达情况。
图6为本发明实验例2中活化扩增的半合子BAK细胞中CD56抗原表达情况。
图7为本发明实验例2中活化扩增半合子BAK细胞中TCRγδ抗原表达情况。
图8为本发明实验例3中半合子BAK细胞分泌IFN-γ情况检测结果。
图9为本发明实验例4中半合子BAK细胞杀伤肿瘤细胞活性检测结果。
图10为本发明实验例5中半合子BAK细胞对患者来源细胞的杀伤活性检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 BAK细胞的制备方法(1)
本实施例以半合子BAK细胞为例，提供一种BAK细胞的制备方法，具体步骤如下：
1、半合子供血者感染筛查
(1)采集半合子供血者5～10mL外周血，于医疗机构检验科检测艾滋病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、人巨细胞病毒(HCMV)、嗜人T淋巴细胞病毒(HTLV)和梅毒螺旋体的感染情况。供者HIV、HBV、HCV、HCMV、HTLV和梅毒螺旋体应均为阴性。
(2)采集半合子供血者5～10mL外周血，于医疗机构检验科进行血培养，检测供者外周血中的细菌、真菌、支原体感染情况。供者外周血细菌、真菌、支原体血培养应为阴性。
2、单个核细胞分离
(1)采集肝素钠抗凝的半合子供者外周全血100ml，用注射用生理盐水按照生理盐水：血细胞＝1:1的比例进行稀释；
(2)采用密度为1.077g/mL人淋巴细胞分离液，按照稀释血细胞：淋巴细胞分离液＝2:1的体积比，先将30mL淋巴细胞分离液加入50mL离心管中，再将15mL稀释血细胞缓慢加入到淋巴细胞分离液上层，在水平离心机中，25℃条件下，于2000rpm离心20分钟；
(3)离心结束后，吸弃每支50mL离心管最上层5mL液体，然后继续吸取10mL液体，加入新的50mL离心管中，于56℃水浴中放置30分钟，于4℃～8℃条件下，3000rpm离心30分钟，离心结束后，吸取离心上清液，转入新的50mL离心管中，备用；
(4)吸取离心管中间处的白膜层，加入50mL离心管中，加入注射用生理盐水至45mL，4℃～8℃条件下，于1800rpm离心10分钟，共离心清洗3次；
(5)所得细胞用AIM-V无血清培养基重悬成单细胞悬液，吸取200μl细胞悬液，计算单个核细胞总数和细胞活率。
3、细胞活化
(1)向AIM-V无血清培养基中加入白介素2、抗人CD3单克隆抗体、唑来膦酸和干扰素γ，使得白介素2的终浓度为500U/mL，抗人CD3单克隆抗体的终浓度为50ng/mL、唑来膦酸的终浓度为1μmol/L、干扰素γ的终浓度为500U/mL；
(2)单个核细胞计数后，将单个核细胞加入培养瓶中，调整细胞密度为2×106/mL；
(3)按照培养体系总体积的5％，向培养瓶中再加入相应体积的半合子供者的灭活血清；
(4)单个核细胞与AIM-V无血清培养基、各种生物反应调节剂和灭活血清混合均匀后，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
4、细胞扩增培养
(1)单个核细胞于培养瓶中静置培养3天，取样计数细胞密度，向培养瓶中补加现有培养体系总体积30％的含有500U/ml白介素2和1μmol/L的唑来膦酸的AIM-V无血清培养基以及现有培养体系总体积2％的半合子供者的灭活血清，调整培养瓶内细胞密度为1.0×106/mL；
(2)以后每隔1～3天，取样计数细胞密度，补加现有培养体系总体积50％的含有500U/ml白介素2的AIM-V无血清培养基和总体积2％的半合子供者的灭活血清，细胞于37℃、5％CO2培养箱中继续培养；
(3)培养第7天，将培养细胞全部转入透气性培养袋中，补加现有培养体系总体积100％的含有500U/ml白介素2的AIM-V无血清培养基和总体积2％的半合子供者的灭活血清，细胞于37℃、5％CO2培养箱中继续培养；
(4)细胞培养至14～21天时，收集细胞于250mL离心管中，4℃～8℃条件下，于1800rpm离心10分钟，共离心清洗3次；
(5)清洗结束后，以注射液生理盐水重悬BAK细胞，后经70μm一次性滤网过滤，得BAK单细胞悬液，最后将所得BAK细胞注入含1％人血白蛋白的注射用生理盐水中，2小时内于20℃～25℃保存，2小时以上于4℃～8℃冷藏保存。
实施例2 BAK细胞的制备方法(2)
本实施例以半合子BAK细胞为例，提供一种BAK细胞的制备方法，其与实施例1的区别仅在于步骤3细胞活化的步骤(1)，具体如下：
向AIM-V无血清培养基中加入白介素2、抗人CD3单克隆抗体、唑来膦酸和干扰素γ，使得白介素2的终浓度为800U/mL，抗人CD3单克隆抗体的终浓度为100ng/mL、唑来膦酸的终浓度为5μmol/L、干扰素γ的终浓度为800U/mL。
实验例1 BAK细胞质量检定
分别对利用实施例1和2的BAK细胞制备方法制备得到的BAK细胞进行质量检定，具体如下：
(1)在细胞培养初始、第3天、第7天、第14天、第21天分别取样、拍照，血球计数板计算细胞数量，根据细胞数量绘制细胞扩增曲线。其中，利用实施例1的BAK细胞制备方法制备半合子BAK细胞过程中细胞生长状况如图2所示，细胞扩增曲线如图3所示。。
(2)提取BAK细胞样品，按照《中国药典》中规定的培养法检验无菌规程检验细菌、真菌和支原体；按照《中国药典》中规定的凝胶法检验致热源规程检验内毒素；采用实时定量PCR法检验艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒和梅毒。
经检验，所有制备的BAK细胞为细菌阴性，真菌阴性，支原体阴性，病毒(艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒和梅毒)核酸含量低于检验阈值底限，内毒素含量＜0.5EU/mL，符合临床注射用药标准，可用于癌症患者进行免疫细胞治疗。
实验例2 BAK细胞表面功能抗原检测
分别对利用实施例1和2的BAK细胞制备方法制备得到的BAK细胞进行细胞表面功能抗原检测，具体方法如下：
BAK细胞悬液于1200rpm离心5分钟，弃掉上清液，加入200μL PBS缓冲液重悬细胞，将BAK细胞悬液平均分成四份，每份100μL，分别加入一支流式上样管中，向其中一份BAK细胞中分别加入10μL FITC-anti-CD3抗体、10μL PE-anti-CD4-PE抗体、10μL APC-anti-CD8抗体；其中一份BAK细胞中加入10μL FITC-anti-CD3抗体、10μL PE-anti-CD56抗体；其中一份BAK细胞加入10μL FITC-anti-CD3抗体、10μL PE-anti-TCRγδ抗体。混匀后，细胞悬液于室温避光孵育30分钟，每隔15分钟，轻弹上样管底部混匀细胞。孵育结束后，向每支上样管中加入1mL PBS缓冲液，于1500rpm离心10分钟。离心结束后，弃掉上清液，向每支上样管中加入500μL PBS缓冲液，重悬细胞成单细胞悬液，上流式细胞仪检测。
利用实施例1的BAK细胞制备方法制备的半合子BAK细胞的CD3、CD4、CD8、CD56和TCRγδ的检测结果分别如图4、图5、图6和图7所示，结果表明，CD3+T细胞比例为92.05％，CD4+T细胞比例为11.52％，CD8+T细胞比例为81.08％，TCRγδ+T细胞比例为65.48％，CD56+细胞比例为55.07％，符合BAK细胞的质控标准要求。
实验例3半合子BAK细胞分泌IFN-γ能力检测
分别对利用实施例1和2的BAK细胞制备方法制备得到的半合子BAK细胞在培养第3天、第7天、第14天、第21天吸取培养上清液采用ELISA法进行IFN-γ分泌能力检测，具体方法如下：
(1)向酶标板的标准孔中加入倍比稀释的IFN-γ标准品，每孔加入100μl，向样品孔中加入稀释一定倍数的样品，每孔加入100μl。每孔均设置3孔复孔；
(2)向每孔中加入50μl稀释后的IFN-γBiotinylated antibody，混匀后盖上封板摸，室温(18～25℃)孵育2小时；
(3)扣去孔内液体，每孔加入300μl 1×请吸缓冲液，静置1分钟后，弃掉孔内液体。重复3次，每次在滤纸上扣干；
(4)向每孔中加入100μl Streptavidin-HRP，盖上封板膜，室温(18～25℃)孵育20分钟；
(5)洗板：重复步骤(3)；
(6)显色：向每孔中加入100μl TMB，室温(18～25℃)避光温育5～30分钟，根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判断终止反应。通常显色在10～20分钟即可达到很好效果；
(7)终止反应：迅速向每孔中加入100μl终止液，终止反应后10分钟内行酶标仪检测，在450nm波长处读取吸光值(OD值)。
结果计算：横坐标为标准品浓度，纵坐标为OD值，连接标准品各点获取一条直线，根据各组OD值得出各时间点IFN-γ浓度。其中，利用实施例1的BAK细胞制备方法制备的半合子BAK细胞的IFN-γ分泌检测结果如图8所示，结果表明，半合子BAK细胞能够高效分泌IFN-γ。
实验例4半合子BAK细胞杀伤肿瘤细胞活性
分别对利用实施例1和2的BAK细胞制备方法制备得到的半合子BAK细胞进行杀伤肿瘤细胞活性检测，具体方法如下：
(1)靶细胞制备与种植。收集肝癌细胞HepG2、肺腺癌细胞A549和白血病细胞K562细胞，取1×106个细胞加入5mL高糖DMEM培养基中，调整细胞密度为2×105/mL，向96孔板中各孔加入50μL HepG2细胞、A549细胞和K562细胞悬液；
(2)效应细胞制备与种植。取BAK细胞，以无血清培养基调整细胞密度分别为1×107/mL、4×106/mL，向已种植HepG2细胞、A549细胞和K562细胞的孔内分别加入50μL四种细胞密度的效应细胞，使效应细胞与靶细胞的数量比分别达50:1、20:1、10:1，每组设置5复孔；
(3)同时，分别设置5复孔单独靶细胞孔、单独效应细胞孔和单独培养基孔，其中，向单独靶细胞孔中再加入50μl无血清培养基，向单独效应细胞孔中再加入50μl高糖DMEM培养基，单独培养基孔中则加入50μl无血清培养基和50μl高糖DMEM培养基；
(4)细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时，向各孔中分别加入10μl CCK-8试剂，于37℃、5％CO2培养箱中孵育4小时后，培养板各孔在酶标仪450nm波长处检测OD值。
按照公式：杀伤效率＝[1-(效靶孔-效应细胞孔)/(靶细胞孔-培养基对照孔)]×100％，计算各效靶比时效应细胞杀伤肿瘤细胞的活性。利用实施例1的BAK细胞制备方法制备的半合子BAK细胞杀伤肿瘤细胞活性检测结果如图9所示，结果表明，半合子BAK细胞对于肝癌细胞、肺腺癌细胞和白血病细胞系均具有较高的杀伤活性。
实验例5半合子BAK细胞对患者来源细胞的杀伤活性
分别对利用实施例1和2的BAK细胞制备方法制备得到的半合子BAK细胞对患者来源细胞的杀伤活性进行检测，具体方法如下：
(1)靶细胞制备与种植。
分别收集1例肝癌和1例非小细胞肺癌患者的手术切除的实体组织，在体外经剪碎和酶消化方式制备获得患者的肝癌细胞和肺癌细胞。另外，分别采集两例患者10ml外周血，以密度梯度离心法分离单个核细胞。分别取两例患者的1×106个肝癌细胞、肺癌细胞和单个核细胞，加入5mL高糖DMEM培养基中，调整细胞密度为2×105/mL，向96孔板中各孔加入50μL肝癌细胞、肺癌细胞和单个核细胞悬液；
(2)效应细胞制备与种植：分别取两例患者的半合子BAK细胞，以无血清培养基调整细胞密度分别为1×107/mL、4×106/mL，向已种植肝癌细胞、肺癌细胞和单个核细胞的孔内分别加入50μL四种细胞密度的效应细胞，使效应细胞与靶细胞的数量比分别达50:1、20:1、10:1，每组设置5复孔；
(3)同时，分别设置5复孔单独靶细胞孔、单独效应细胞孔和单独培养基孔，其中，向单独靶细胞孔中再加入50μl无血清培养基，向单独效应细胞孔中再加入50μl高糖DMEM培养基，单独培养基孔中则加入50μl无血清培养基和50μl高糖DMEM培养基；
(4)细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时，向各孔中分别加入10μl CCK-8试剂，于37℃、5％CO2培养箱中孵育4小时后，培养板各孔在酶标仪450nm波长处检测OD值。
(5)按照公式：杀伤效率＝[1-(效靶孔-效应细胞孔)/(靶细胞孔-培养基对照孔)]×100％，计算各效靶比时效应细胞杀伤靶细胞的活性。利用实施例1的BAK细胞制备方法制备的半合子BAK细胞对患者来源细胞的杀伤活性检测结果如图10所示，结果表明，半合子BAK细胞对于癌症患者机体来源的肿瘤细胞亦具有高效的杀伤活性，而对于受者的淋巴细胞的杀伤活性极低，具有较高的安全性。，
将利用实施例2的制备方法制备得到的半合子BAK细胞同样进行实验例1～5的检测，结果表明，利用实施例2的制备方法制备得到的半合子BAK细胞的细胞生长、质量、表面抗原表达情况、IFN-γ的分泌能力、肿瘤细胞的杀伤活性以及淋巴细胞的杀伤活性等方面的性能与实施例1的制备方法制备得到的半合子BAK细胞相当。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种半合子BAK细胞的制备方法，其特征在于，包括：将单个核细胞在含有生物反应调节剂组合I的细胞培养基中进行活化后再进行扩增培养；所述生物反应调节剂组合I包括选自抗人CD3单克隆抗体、赫赛汀、唑来膦酸、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、干扰素γ、白介素2中的至少两种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗人CD3单克隆抗体的浓度为30～500ng/mL、所述赫赛汀的浓度为0.5～20μg/mL、所述唑来膦酸的浓度为0.5～20μmol/L、所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的浓度为200U～2000U/mL、所述干扰素γ的浓度为200U～2000U/mL、所述白介素2的浓度为200U～2000U/mL。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述生物活性调节剂组合I包括抗人CD3单克隆抗体、白介素2以及选自唑来膦酸、赫赛汀和干扰素γ中的至少一种；
优选地，所述生物活性调节剂组合I包括抗人CD3单克隆抗体、白介素2、唑来膦酸和干扰素γ。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述含有生物反应调节剂组合I的细胞培养基中，所述白介素2和所述干扰素γ的浓度比为(1～2):1；
优选地，所述含有生物反应调节剂组合I的细胞培养基中，所述抗人CD3单克隆抗体的浓度为50～450ng/mL，所述唑来膦酸的浓度为0.5～15μmol/L，所述干扰素γ的浓度为500U～1500U/mL，所述白介素2的浓度为500U～1500U/mL；
更优选地，所述含有生物反应调节剂组合I的细胞培养基中，所述抗人CD3单克隆抗体的浓度为50～300ng/mL，所述唑来膦酸的浓度为1～10μmol/L，所述干扰素γ的浓度为500U～1000U/mL，所述白介素2的浓度为500U～1000U/mL。
5.根据权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述细胞培养基以无血清培养基为溶剂，还含有体积百分含量为1～10％的灭活血清；
优选地，所述无血清培养基包括选自RPMI 1640培养基、AIM-V培养基、KBM581培养基、X-VIVO 15培养、SCGM培养基、OpTmizer培养基中的一种或多种。
6.根据权利要求1～5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述单个核细胞的初始接种浓度为1×106～3×106/mL。
7.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述扩增培养包括：在活化培养2～4天后，向活化培养体系中补加活化培养体系体积的20～40％的含有生物反应调节剂组合II的所述无血清培养基和活化培养体系体积1～10％的灭活血清；以后每隔1～3天补加培养体系体积50％～100％的含有白介素2的所述无血清培养基和培养体系体积1～3％的灭活血清；
所述生物反应调节剂组合II包括选自唑来膦酸、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、干扰素γ、白介素2中的一种或多种；
优选地，所述生物反应调节剂组合II包括唑来膦酸和白介素2；
更优选地，所述含有生物反应调节剂组合II的所述无血清培养基中，所述唑来膦酸的浓度为1～10μmol/L，所述白介素2的浓度为500U～1000U/mL；
所述含有白介素2的所述无血清培养基中，所述白介素2的浓度为500U～1000U/mL。
8.根据权利要求1～7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述单个核细胞的制备包括如下步骤：
(1)采集外周血经肝素钠抗凝处理后分离血细胞或利用单采机、枸橼酸钠抗凝处理获得血细胞，利用注射用生理盐水将所述血细胞进行1～5倍比例的稀释；
(2)在稀释的血细胞中加入人淋巴细胞分离液，在20℃～25℃条件下，1800rpm～2500rpm离心15～25分钟；所述稀释血细胞与所述人淋巴细胞分离液的体积比为(1～3)：1；
(3)吸取中间层液体于50～60℃放置30～60分钟，在4℃～8℃条件下，3000rpm～3500rpm离心25～30分钟；
(4)吸取位于中间层的白膜层，清洗2～3次后以所述无血清培养基悬浮。
9.一种半合子BAK细胞，其特征在于，所述半合子BAK细胞中CD3+T、TCRγδ+T、CD4+T、CD8+T、CD56+亚群细胞的比例如下：CD3+T细胞≥80％，TCRγδ+T细胞≥30％，CD4+T细胞＜20％，CD8+T细胞≥60％，CD56+细胞≥30％；
优选地，所述半合子BAK细胞为利用权利要求1～8任一项所述制备方法制备得到；
更优选地，所述半合子BAK细胞为细菌阴性、真菌阴性、支原体阴性；艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒和梅毒的核酸含量低于检验低限值；内毒素含量＜0.5EU/mL。
10.权利要求1～8任一项所述的制备方法或权利要求9所述的半合子BAK细胞在制备抗肿瘤、抗感染或免疫调节药物中的应用。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN111748524A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-10-09 | 嘉禾弘生(深圳)健康产业集团有限公司 | 一种因子法体外高效扩增nk细胞的方法 |
| CN115896016A (zh) * | 2022-09-07 | 2023-04-04 | 普华赛尔生物医疗科技有限公司 | 培养组合物及其在培养免疫细胞中的应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102732481A (zh) * | 2012-06-13 | 2012-10-17 | 郑意端 | 一种人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法 |
| CN106350488A (zh) * | 2016-09-19 | 2017-01-25 | 大连大学 | 用于治疗肿瘤的pd‑1封闭cik的制备方法 |
| CN106399242A (zh) * | 2016-09-13 | 2017-02-15 | 北京多赢时代转化医学研究院 | 联合制备CAR‑Vγ9Vδ2T细胞和CAR‑NKT细胞的方法 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102732481A (zh) * | 2012-06-13 | 2012-10-17 | 郑意端 | 一种人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法 |
| CN106399242A (zh) * | 2016-09-13 | 2017-02-15 | 北京多赢时代转化医学研究院 | 联合制备CAR‑Vγ9Vδ2T细胞和CAR‑NKT细胞的方法 |
| CN106350488A (zh) * | 2016-09-19 | 2017-01-25 | 大连大学 | 用于治疗肿瘤的pd‑1封闭cik的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| M.INTRONA: "CIK as therapeutic agents against tumors", 《JOURNAL OF AUTOIMMUNITY》 * |
| 段彦龙等: "一种高倍扩增细胞因子诱导杀伤细胞方法", 《大连理工大学学报》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111748524A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-10-09 | 嘉禾弘生(深圳)健康产业集团有限公司 | 一种因子法体外高效扩增nk细胞的方法 |
| CN115896016A (zh) * | 2022-09-07 | 2023-04-04 | 普华赛尔生物医疗科技有限公司 | 培养组合物及其在培养免疫细胞中的应用 |
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