EA009327B1 - Способ получения противоопухолевой вакцины на основе поверхностных антигенов эндотелиальных клеток - Google Patents

Abstract

Согласно способу получения противоопухолевой вакцины с использованием эндотелиальных клеток живые эндотелиальные клетки подвергают витальному для клеток воздействию протеазы, отбирают высвободившиеся поверхностные антигены, при этом обработку живых эндотелиальных клеток протеазой повторяют с интервалами, необходимыми для восстановления клетками поверхностных антигенов, аккумулируют поверхностные антигены до достижения их дозы, необходимой для вакцинации, контролируют качество получаемой вакцины. Технический результат, достигаемый при использовании изобретения, заключается в повышении эффективности лечения онкологических заболеваний за счет повреждения опухолевых сосудов путем преодоления иммунной толерантности организма к ЭК опухолевых сосудов. Имеется в виду преодоление иммунной толерантности именно к активированным ЭК, что позволяет преимущественно вызывать повреждение иммунной системой именно опухолевых сосудов.

Description

Изобретение относится к медицинским технологиям, а именно к иммунотерапии онкологических больных, и может быть использовано в медицине для терапии онкологических заболеваний и профилактики их рецидивов.

Ограниченные возможности лечения опухолевых заболеваний хирургическими и химиотерапевтическими методами делают актуальным дальнейшее развитие существующих и поиск новых способов лечения онкологических больных. В частности, сегодня особое внимание уделяется антиангиогенной терапии, принцип действия которой основан на подавлении развития кровеносных сосудов опухоли.

В развитии опухоли выделяют две основные фазы ее роста: преваскулярную и васкулярную. В первой фазе опухоль растет, получая питательные вещества и кислород путем диффузии их из сосудов нормальных тканей больного, что не позволяет опухоли вырасти более нескольких кубических миллиметров. Для дальнейшего роста опухоли необходим переход во вторую фазу роста, которая характеризуется ее васкуляризацией (Бо1кшап 1., νΐιηΐ 1з еу1бепсе 111а1 !ишогз аге апдюдепез1з берепбеп!? 1. №111. Сапсег 11151.. 1990, ν.82, 4-6). Появление сосудов резко увеличивает питание опухоли и ведет к ее усиленному росту и повышению вероятности метастазирования (Напайап Ό., Бо1кшап 1. Райетпз апб ешетдшд шесйаП18Ш8 о! 1йе апдюдешс з^йсй бштпд !ишопдепез1з. Се11, 1996, ν. 86, 353-364). Применение антиангиогенных веществ предотвращает развитие сосудов опухоли, что, соответственно, ведет к подавлению ее второй фазы роста.

Один из известных способов предотвращения васкуляризации опухоли - это вакцинация больного с целью преодоления иммунной толерантности к эндотелиальным клеткам (ЭК), выстилающим внутренние стенки сосудов. В результате клеточной и гуморальной цитотоксичности ЭК погибают, что приводит к нарушению формирования сосудов опухоли и, как следствие, гибели опухолевых клеток. Существуют различные способы получения антигенов для подобных вакцин, наиболее близкими данному изобретению являются вакцины на основе антигенов самих ЭК.

Из литературных данных известен способ получения вакцины на основе ксеногенных ЭК, т. е. клеток, выделенных из эндотелия сосудов организма другого биологического вида (см., например, Vе^ Υ., 1ттипо111егару о! 1ишог8 \νίΐ1ι хеподепею епбо1йейа1 се11з а5 а νасс^πе, №Ш1ге Мебюше, 2000, ν. 6, 11601166). Недостатком подобных вакцин является присутствие в них ксеногенных, по сути балластных, антигенов, что приводит к распределению иммунного ответа между ними и антигенами, определяющими специфичный иммунный ответ на ЭК.

Из другого источника известна вакцина на основе аллогенных ЭК, т.е. клеток другого организма, но того же биологического вида (см, например, 8саррайсс1 Б.А., Ыо1ап О.Р., 1пбисйоп о! апй-!ишот 1шшипйу ίπ писе изшд а зупдепею епбо1НеНа1 се11 νасс^πе, Апйсапсет Кез., 2003, ν. 23, 1165-1672; авторы научной работы также сравнивают разные варианты вакцин на основе ЭК). Присутствие в вакцине аллогенных антигенов также приводит к снижению силы и специфичности иммунной реакции на специфичные для ЭК антигены.

Наиболее близкий изобретению аналог известен из статьи Окар Υ. Е! а1. (Уассшайоп νί(1ι аи!о1одоиз епбо!йе1шш 1пЫЬйз апдюдепез1з апб ше!аз1аз1з о! со1оп сапсег Итоидй аиЮшшипйу, Сапсег 8ск, 2004, ν. 95, 1, 85-90). Способ включает применение эндотелиальных клеток. В известном способе в составе вакцины используют аутологичные ЭК, т. е. клетки, полученные из вакцинируемого или генетически идентичного организма (например, из той же линии мышей). Подобные вакцины дают наиболее сильный и специфичный иммунный ответ, определяющий лечебный эффект. Однако, как и всем вакцинам, приготовленным на основе цельных клеток, им свойственно наличие в них множества балластных веществ, в частности цитозольных белков, углеводов и липидов. Балластные вещества существенно снижают в вакцине долю антигенов, являющихся потенциальной мишенью для действия иммунной системы (внутриклеточные антигены не доступны для действия иммунной системы). Также следует отметить, что известный способ приготовления вакцины не вызывает специфичный иммунный ответ на ЭК именно опухолевых сосудов.

Целью данного изобретения являлось создание способа получения противоопухолевой вакцины на основе антигенов ЭК для преодоления иммунной толерантности организма к ЭК опухолевых сосудов. Предпосылками для данного изобретения являлось известное отличие ЭК сосудов нормальных тканей, которые находятся в стадии покоя при физиологических условиях, и ЭК опухолей, которые активированы, т.е. активно пролиферируют и мигрируют. Известно, что активированные ЭК имеют по сравнению с ЭК сосудов нормальных тканей повышенную экспрессию многих специфических белков, таких как интегрин α_νβ₃ (О1абзоп С.Ь. е! а1., Аш. 1. Ра!1о1., 1996, ν. 148, 1423-1434), Е-селектин (Уо1ш М. е! а1., Сйп. Сапсег Кез., 2000, ν. 6, 3236-3240), эндоглин (Виггслтз Б. е! а1., Сйп. Сапсег Кез., 1995, ν. 1, 1623-1634), эндосиалин (ТакайазЫ К. е! а1., 1. Сйп. Икез!., 1994, ν. 93, 2357-64) и УЕОБ-рецепторы (Воососк С. е! а1.,

1. №й1. Сапсег 1пз!., 1995, ν. 87, 506-516). Также известны различия в профилях экспрессии многих белков из патентов И8 2006210975, опубл. 21.09.2006, И8 2005142138, опубл. 30.06.2005, И8 2006127902, опубл. 15.06.2006, νθ 2004091383, опубл. 28.10.2004. В контексте данного изобретения особо важны выявленные отличия в белках, представленных на поверхности ЭК, в частности нейрофилинах, интегринах, рецепторах и т.д. (см. также патент МешЬгапе аззос1а!еб !ишог епбоИейиш шагкегз, νθ 2004001004, опубл. 31.12.2003), что позволяет получить антигены, специфичные для ЭК опухолевых сосудов.

- 1 009327

Технический результат, достигаемый при использовании патентуемого изобретения, заключается в повышении эффективности лечения онкологических заболеваний за счет повреждения опухолевых сосудов путем преодоления иммунной толерантности организма к ЭК опухолевых сосудов. Имеется в виду преодоление иммунной толерантности именно к активированным ЭК, что позволяет преимущественно вызывать повреждение иммунной системой именно опухолевых сосудов.

Указанный технический результат достигается при реализации способа получения противоопухолевой вакцины с использованием ЭК. Согласно настоящему изобретению живые ЭК подвергают витальному для клеток воздействию протеазы, отбирают высвободившиеся поверхностные антигены, при этом обработку живых ЭК протеазой повторяют с интервалами, необходимыми для восстановления клетками поверхностных антигенов, аккумулируют поверхностные антигены до достижения их дозы, необходимой для вакцинации, контролируют качество получаемой вакцины.

В предпочтительном варианте реализации способа используют активированные ЭК.

Могут быть использованы свежевыделенные из сосудов опухоли, активированные ЭК.

При недостаточном количестве выделившихся из сосудов опухолей ЭК способ может включать размножение ЭК культивированием.

В предпочтительном варианте реализации способа в качестве протеазы используют трипсин.

Активированные ЭК могут выделять из сосудов опухоли и культивировать в условиях, поддерживающих их активированное состояние.

При этом активированное состояние ЭК при культивировании может быть поддержано сокультивированием с опухолевыми клетками.

В другом варианте реализации способа активированное состояние ЭК при культивировании может быть поддержано сокультивированием с фрагментами опухолевой ткани.

В предпочтительном варианте реализации способа используют активированные ЭК из сосудов опухоли самого пациента.

В других вариантах могут быть использованы активированные ЭК из сосудов опухоли другого пациента.

Может быть использована культура ЭК, активированных сокультивированием ίη νίίτο с опухолевыми клетками. При этом ЭК могут активировать опухолевыми клетками самого пациента.

В другом варианте ЭК могут активировать опухолевыми клетками другого пациента.

ЭК могут активировать клеточной линией опухолевых клеток.

В других вариантах реализации способа может быть использована культура ЭК, активированных ίη νίίτο, добавлением в ростовую среду активирующих веществ.

В этом случае ЭК могут активировать по меньшей мере одним активирующим фактором.

В частности ЭК могут активировать, применяя фактор роста эндотелия сосудов (УЕСТ).

В другом варианте могут использовать культуру ЭК, активированных ίη νίίτο, добавлением кондиционированной среды культуры опухолевых клеток.

Для усиления иммунного ответа к поверхностным антигенам могут добавлять адъюванты.

Далее изобретение поясняется конкретными примерами реализации изобретения и прилагаемыми фигурами, на которых изображено следующее.

На фиг. 1 приведена схема варианта осуществления способа получения вакцины.

На фиг. 2 показаны графики роста опухоли гепатомы Н22, привитой мышам ВАЕВ/с, в первой ()> второй ¹экспериментальных и контрольной (·> группах (показаны средние значения размера опухоли в группе ± стандартное отклонение).

На фиг. 3 показаны гистологические срезы тканей опухолей мышей первой (А), второй (Б) экспериментальных и контрольной (В) групп и соответствующие им ангиогенные индексы (АИ); стенки сосудов опухоли на фигуре имеют темное окрашивание (соответствует коричневому цвету на цветной фотографии).

Фиг. 1 поясняет вариант реализации предложенного способа. Из ткани опухоли, полученной в результате биопсии или хирургического удаления опухоли, получают живые ЭК для инициации первичной культуры активированных ЭК. Далее клетки при необходимости размножают культивированием до нужного количества.

Помимо ЭК сосудов опухоли, изначально находящихся в активированном состоянии, при реализации патентуемого способа могут быть использованы также ЭК, полученные из сосудов нормальных тканей, как находящиеся в стадии покоя, так и активированные различными способами.

Следующим и ключевым этапом изобретения является обработка живых клеток витальными концентрациями протеазы.

Для получения необходимой для вакцинации дозы антигенов процесс обработки клеток трипсином повторяют несколько раз с интервалами от нескольких часов до нескольких дней, необходимыми для репарации клетками поверхностных антигенов. Аккумулированные таким образом антигены далее обрабатывают в соответствии с технологией получения конкретной вакцины, а именно могут очищать, концентрировать, анализировать на предмет своего состава, а также модифицировать или смешивать с адъ

- 2 009327 ювантами для увеличения иммуногенности.

Получение антигенов для вакцинации согласно данному изобретению дает следующие преимущества:

все преимущества аутовакцин, а именно их специфичность для конкретного больного;

все преимущества поливалентных вакцин, а именно множественность антигенов;

обогащение вакцины поверхностными антигенами ЭК (предпочтительно активированных), что обеспечивает при вакцинации преодоление иммунной толерантности к ЭК сосудов опухоли;

возможность получения необходимой для вакцинации дозы антигенов путем их аккумулирования, а не размножением ЭК, что является существенным, так как первичные культуры клеток при размножении ίη νίΐΓΟ постепенно меняют свой антигенный состав и становятся непригодными для вакцинации.

Практическое применение поверхностных антигенов ЭК, получаемых согласно данному изобретению, обусловлено их идентичностью фрагментам белков, представленным на поверхности ЭК сосудов (в том числе и опухолевых), а именно идентичностью аминокислотных последовательностей и имеющимся у них модификациям (например, гликозилированию). Применение поверхностных антигенов активированных ЭК, получаемых согласно данному изобретению, обусловлено их идентичностью фрагментам белков, представленным на поверхности ЭК именно опухолевых сосудов.

Известно, что рост опухоли невозможен без ее васкуляризации. Накопленные и очищенные поверхностные антигены ЭК (предпочтительно активированных), смешанные с усиливающим иммунный ответ адъювантом, вводят в организм человека или животного. В результате клеточного и гуморального иммунного ответа организма на уничтожение введенных антигенов, перекрестно уничтожаются ЭК, имеющиеся и/или вновь возникающие в сосудах опухоли, что и определяет лечебный и профилактический цитостатический эффект вакцинации. Для получения полноценного иммунного ответа применяют повторные инъекции поверхностных антигенов.

Ниже представлен первый пример реализации способа получения противоопухолевой вакцины против привитой мышам опухоли гепатомы человека Н22 на основе аутологичных активированных ЭК.

Культуру аутологичных ЭК получают из сосудов печени ВЛЬВ/е мышей согласно Ве11ош с1 а1. (ΜίοϊΌναδο. Вех. 1992, ν. 43, 20-45). Активацию ЭК проводят добавлением кондиционированной ростовой среды клеток Н22 в ростовую среду ЭК в соотношении 1:3. На 5-7-й день после активации ЭК получают поверхностные антигены согласно следующему протоколу.

1. Ростовую среду удаляют из флакона с культурой активированных ЭК и не менее 3 раз промывают монослой клеток стерильным физиологическим раствором, используя объем, равный половине ростовой среды. Промывку осуществляют для удаления остатков ростовой среды.

Следующим и ключевым этапом является обработка клеток витальной для них концентрацией протеазы, в качестве которой выбирают трипсин (активность ~3000 Ед./мг).

2. Добавляют к монослою клеток 0,0001% раствор трипсина, используя 1 мл раствора на 25 см² поверхности культурального флакона.

3. Инкубируют флакон при 37°С. Между 5 и 7 мин инкубации отбирают из флакона раствор трипсина, содержащий отщепленные поверхностные антигены.

4. К клеткам добавляют свежеприготовленную ростовую среду, содержащую сыворотку (обычно 10%), и продолжают их культивирование.

5. Для получения необходимой для вакцинации дозы аккумулируют поверхностные антигены, повторяя с интервалом в сутки пп.1-4, и контролируют качество получаемой вакцины путем оценки качества (пригодности) культуры активированных ЭК для получения специфичных для сосудов опухоли антигенов.

Условия обработки клеток протеазой могут существенно варьировать, например от нескольких до десятков минут воздействия на клетки трипсином в концентрации от 0,00001 до 0,5%, и подбираются индивидуально для каждой первичной культуры активированных ЭК. В случае использования трипсина с другой активностью его концентрацию меняют прямо пропорционально увеличению или уменьшению активности.

Непосредственно перед воздействием трипсина клетки необходимо промыть, например, физиологическим раствором для удаления остатков ростовой среды. Высвободившиеся под воздействием трипсина антигены, представляющие собой фрагменты поверхностных белков, отбирают от клеток любым подходящим для этого способом, например смывают или отбирают пипеткой.

В процессе культивирования антигенный состав ЭК, как и любых культивируемых клеток, меняется, что приводит к несоответствию антигенов, получаемых с культуры клеток, и антигенов на поверхности ЭК сосудов опухоли пациента. Для предотвращения получения некачественной вакцины пригодность культуры ЭК для наработки антигенов оценивают в соответствии со способом определения качества клеточной культуры, описанным в заявке на получение евразийского патента «Способ определения качества клеточной культуры» (заявители: Лохов П.Г., Балашова Е.Е., приоритет от 06.04.2007).

Известно, что обработка клеток витальной для них концентрацией протеазы приводит к отщеплению поверхностных антигенов клеток (см., например, заявку на получение евразийского патента № 200700598 «Противоопухолевая вакцина, способ получения противоопухолевой вакцины и способ

- 3 009327 проведения противоопухолевой иммунотерапии», приоритет от 07.03.2007). Таким образом, согласно данному изобретению действие трипсина, как и других протеаз, приводит к высвобождению в раствор поверхностных антигенов ЭК. Высвободившиеся под воздействием трипсина поверхностные антигены ЭК (фрагменты поверхностных белков), к которым в основном и относятся пригодные для иммунизации антигены, используют для вакцинации онкологических больных.

Следует отметить, что забор раствора трипсина, содержащего отщепленные от клеток антигены, желательно осуществлять до момента открепления клеток от дна культурального флакона, что позволит предотвратить попадание клеток в раствор антигенов и избежать дополнительной стадии очистки.

Клетки при обработке витальными концентрациями протеазы не погибают, что дает возможность повторять процесс обработки первичной культуры ЭК трипсином для получения необходимой для вакцинации дозы антигенов. При этом в интервалах между воздействием трипсином клетки инкубируют согласно протоколу их культивирования (т.е. при 37°С в СО₂-инкубаторе, в ростовой среде с сывороткой и необходимыми для поддержания активированного состояния добавками).

Аккумулированные поверхностные антигены обрабатывают в соответствии с технологией получения конкретной вакцины, а именно их могут очищать, концентрировать, анализировать на предмет состава, а также модифицировать или смешивать с адъювантами для увеличения иммуногенности.

В других вариантах реализации изобретения процесс обработки клеток протеазой может быть сопряжен с процессом пассирования клеток.

Раствор трипсина можно готовить как на стерильном физиологическом растворе, так и на любом подходящем для этого солевом или буферном растворе.

В других вариантах реализации изобретения вместо трипсина могут быть использованы другие протеазы, например химотрипсин, протеаза К и т.д.

Патентуемый способ получения противоопухолевой вакцины может применяться к любым вариантам культур ЭК, в частности, культивированным в матриксе и на подложках, различным вариантам сокультивирования клеток, а также к свежевыделенным ЭК.

Далее изобретение поясняется вторым примером способа получения противоопухолевой вакцины с использованием первичной культуры активированных ЭК, выделенных из сосудов опухоли рака толстого кишечника человека.

1. Фрагмент ткани опухоли толстого кишечника, полученный в результате хирургического удаления опухоли, переносят в стерильную пробирку со средой РЬРМ1 1640, содержащую антибиотики, и транспортируют в лабораторию.

2. Переносят ткань опухоли в стерильных условиях в чашку Петри и механически удаляют участки некроза, сгустки крови, а также остатки жировой и соединительной ткани.

3. Осторожно ножницами размельчают ткань опухоли на маленькие фрагменты.

4. Инкубируют фрагменты опухолевой ткани 30 мин в 0,2% растворе коллагеназы при 37°С в объеме, необходимом для того, чтобы покрыть раствором фрагменты опухоли.

5. Отбирают раствор коллагеназы и осторожно промывают фрагменты опухолевой ткани раствором РВ8.

6. Добавляют 3 мл среды КРМ1 1640 и диссоциируют фрагменты опухолевой ткани до мелких клеточных агрегатов энергичным пипетированием.

7. Дают осесть крупным клеточным агрегатам и оставшиеся в растворе клетки переносят в новую пробирку, центрифугируют 5 мин при 170 д при комнатной температуре.

8. Полученный клеточный осадок ресуспендируют в КРМ1 1640.

9. 1 мл суспензии клеток центрифугируют в градиенте Перколла 20 мин при 670 д при комнатной температуре.

10. Отбирают фракцию клеток, соответствующую 1,033-1,047 плотности градиента Перколла (соответствует ЭК), добавляют 10 мл КРМ1 1640, ресуспендируют, осаждают клетки центрифугированием 5 мин при 170 д.

11. Ресуспендируют ЭК в ростовой среде (КРМ1-1640, гепарин, эндотелиальный ростовой фактор, кондиционированная среда опухолевых клеток, 10% фетальной бычьей сыворотки) и культивируют в культуральном флаконе.

12. Удаляют из флакона с ЭК ростовую среду и трижды промывают клетки физиологическим раствором или раствором РВ8, используя объем, равный не менее половины объема заливаемой в культуральный флакон ростовой среды. В результате промывки с клеток должны быть удалены следы сыворотки, содержащейся в ростовой среде.

13. Добавляют к клеткам 0,0001% раствор трипсина (активность ~3000 Ед./мг), используя 1 мл раствора на 25 см² поверхности культурального флакона.

14. Инкубируют флакон при 37°С. Между 5 и 7 мин инкубации отбирают из флакона раствор, содержащий отщепленные от клеток поверхностные антигены. ЭК в момент отбора раствора должны оставаться прикрепленными ко дну культурального флакона. Если под воздействием трипсина часть клеток открепилась и стала свободно плавать, то раствор центрифугируют при 400 д в течение 5 мин и используют супернатант, свободный от примеси клеток.

- 4 009327

15. Для инактивации остатков трипсина в культуральном флаконе с ЭК необходимо добавить свежеприготовленную культуральную среду, содержащую сыворотку и продолжить культивирование клеток при 37°С и 5% СО₂.

16. Раствор, полученный в п.14, концентрируют на вакуумном концентраторе при 45°С. Предварительно раствор можно обессолить любым подходящим для этого способом, например обратно фазовой хроматографий, гель-фильтрацией и т.д.

17. Для наработки необходимого для вакцинации количества антигенов пп.12-16 повторяют с интервалом от нескольких часов до нескольких суток, при этом контролируют качество получаемой вакцины путем оценки культивируемых ЭК на предмет пригодности их для получения антигенов специфичных для сосудов опухоли больного.

В предпочтительном варианте реализации изобретения ЭК сокультивируют с опухолевыми клетками, происходящими из той же опухоли, что и ЭК.

В другом варианте реализации изобретения ЭК сокультивируют с опухолевыми клетками, происходящими из опухоли другого пациента, или опухолевой клеточной линией.

В другом варианте реализации изобретения ЭК сокультивируют с фрагментами опухоли, из которой были получены ЭК, или фрагментами опухоли другого пациента.

В другом варианте реализации изобретения активированные ЭК происходят от другого пациента (аллогенные ЭК).

Поверхностные антигены культивируемых ЭК, получаемые согласно данному изобретению, должны быть специфичны для ЭК опухоли донора клеток. Однако культивирование существенно искажает фенотип клеток по причине невозможности искусственного воссоздания ίη νίΐτο условий, при которых растут клетки в организме больного. Таким образом, пригодность культуры ЭК для наработки антигенов для вакцины подлежит обязательному контролю и осуществляется согласно способу, описанному в указанной выше заявке на получение евразийского патента «Способ определения качества клеточной культуры».

Для подтверждения противоопухолевой активности вакцины, полученной согласно данному изобретению, был поставлен модельный эксперимент на подопытных мышах - 18 самцах породы ВЛЬВ/с примерно одного возраста и веса (3 группы по 6 животных в каждой).

Антигены были получены согласно первому примеру реализации изобретения с культуры аутологичных активированных и неактивированных ЭК. Полученные антигены были обессолены гельфильтрацией на сефадексе С-10 и сконцентрированы на вакуумном концентраторе.

Подопытным мышам была привита опухоль подкожным введением 1 млн опухолевых клеток гепатомы Н22. На 7-й день после привития опухоли мышей вакцинировали подкожным введением антигенов в количестве 150 мкг, предварительно смешав их в соотношении 1:1 (об./об.) с полным адъювантом Фрейнда. Повторные иммунизации проводили в течение 4 недель (по одной инъекции в неделю) с применением неполного адъюванта Фрейнда. Животным первой экспериментальной группы вводили вакцину, приготовленную согласно первому примеру реализации изобретения с использованием аутологичных активированных ЭК. Животным второй экспериментальной группы вводили вакцину, приготовленную согласно первому примеру реализации изобретения с использованием аутологичных, но неактивированных ЭК. Животным контрольной группы вводили в эквивалентном объеме и по той же схеме, что и экспериментальным группам, смешанный с РВ8 адъювант Фрейнда.

В течение 3 месяцев с момента привития опухолей отслеживали рост опухолей в контрольной и экспериментальных группах. Из результатов измерений, представленных на фиг. 2, следует уменьшение и исчезновение опухолей у животных из экспериментальных групп, что указывает на выраженный противоопухолевый эффект у вакцины, содержащей поверхностные антигены ЭК, при этом более выраженный эффект наблюдается у вакцины на основе поверхностных антигенов активированных ЭК.

Для подтверждения противососудистого механизма действия вакцины были измерены ангиогенные индексы (АИ, количество сосудов на 1000 клеток опухоли) для опухолей контрольной и экспериментальных групп по гистологическим срезам опухолей с применением иммуноферментного окрашивания стенок сосудов опухолей.

Свежевыделенные фрагменты ткани опухолей брали у мышей на 30-й день после привития опухоли, фиксировали 10% раствором формалина на РВ8 (рН 7,0-7,2) и заливали в парафин. Для иммуногистохимического исследования изготовляли гистологические срезы толщиной 4 мкм.

Для выявления сосудов гистологические срезы красили с помощью мышиных антител против СЭ31 человека по стандартной авидин-биотин-пероксидазной методике. Парафин удаляли этанолом. Для блокирования эндогенной пероксидазной активности срезы обрабатывали 3% перекисью водорода. Неспецифическое связывание антител блокировали 3% раствором БСА на РВ8. Срезы последовательно инкубировали с первичными антителами к СЭ31, биотинилированными антителами против иммуноглобулинов мыши и стрептавидин-биотин-пероксидазным комплексом. Срезы красили добавлением свежеприготовленного раствора диаминобензидина и докрашивали гематоксилином. После каждого шага процедуры срезы промывали РВ8. Отрицательным контролем служили препараты, окрашенные по описанной методике, с заменой первичных антител на мышиный иммуноглобулин С.

- 5 009327

На фиг. 3 представлены гистологические срезы тканей опухолей мышей первой (А), второй (Б) экспериментальных и контрольной (В) групп, которым соответствуют ангиогенные индексы (АН), равные 16, 32 и 80. Данный факт подтверждает ингибирование васкуляризации в результате вакцинации поверхностными антигенами ЭК, причем более выраженное ингибирование соответствует вакцине на основе активированных ЭК.

Следует отметить, что результаты модельного эксперимента не ограничивают успешное применение изобретения животными ввиду идентичности механизма иммунного ответа у животных и человека. Способ введения антигена и его доза в пересчете на 1 кг веса сохраняют силу в случае иммунизации человека, однако схема вакцинации (дозы, количество повторных введений, а также применяемые адъюванты) может быть индивидуальна для каждого больного ввиду тяжести протекания заболевания, стадии опухолевого заболевания, степени васкуляризации опухоли, способности организма к выраженному иммунному ответу на введенные антигены, параллельно проводимой лекарственной терапии и т. д.

Ниже приведен пример противоопухолевой вакцины на основе поверхностных антигенов ЭК, изготовленной согласно второму варианту реализации изобретения для проведения противоопухолевой вакцинации человека.

Вакцина состоит из 1 мг смеси антигенов ЭК, полученных согласно второму варианту реализации изобретения, растворенных в 0,5 мл РВ8, смешанных с 1 мл адъюванта Монтанид Ι8Α-51 (адъювант фирмы 8уи1ех на основе водно-масляной эмульсии, содержащий сквален, Плюнорик Ь121, Твин 80).

Вакцину по одной дозе вводят пациенту подкожно в течение 3 недель еженедельно и 5 месяцев ежемесячно.

Эффективность вакцинации оценивается по возникшей напряженности иммунитета в отношении вводимых поверхностных антигенов. На 2-3 день после инъекции оценивают реакцию гиперчувствительности к введенным антигенам по размеру покраснения, возникшего в месте их введения. При этом за базовое значение берется размер покраснения после первой инъекции. Очевидное усиление реакции гиперчувствительности при повторных вакцинациях укажет на возникший противоопухолевый иммунный ответ.

Возможно внутривенное или внутримышечное введение вакцины, а также введение вакцины без адъювантов.

Получение иммунного ответа при использовании вакцины, изготовленной патентуемым способом, обеспечивается за счет присутствия в ее составе поверхностных антигенов ЭК. Множественность антигенов, по сути фрагментов поверхностных белков, присутствующих в вакцине, обеспечивает возможность получения иммунного ответа на все клетки, которые имеют на поверхности белки с теми же аминокислотными последовательностями.

При получении противоопухолевых вакцин согласно настоящему способу могут быть использованы не только активированные ЭК самого пациента, но и ЭК другого пациента.

Эффект при лечении достигается в обоих случаях ввиду наличия на поверхностях ЭК сосудов опухолей различных пациентов антигенов, имеющих одинаковые аминокислотные последовательности.

Вместе с тем при использовании аутовакцин, полученных согласно настоящему способу, эффект более выражен, поскольку в этом случае вакцина содержит антигены, индивидуальные для ЭК сосудов опухоли конкретного больного.

Эффект при лечении достигается также и в случае использования ЭК, полученных из нормальных тканей, как находящихся в стадии покоя, так и активированных различными способами. Данный эффект объясняется наличием поверхностных антигенов, общих для всех ЭК, и некоторой общностью в изменении антигенного состава ЭК при активации их различными способами.

Следует отметить, что использование вакцины, изготовленной согласно патентуемому способу, позволяет многократно увеличить эффективность лечения онкологических заболеваний по сравнению с использованием моновалентных вакцин.

При использовании вакцины, изготовленной согласно патентуемому способу, обеспечивается возможность преодоления иммунной толерантности организма к ЭК сосудов опухоли за счет того, что вакцина обогащена специфичными для ЭК сосудов опухоли антигенами.

Данная возможность создается за счет обработки ЭК протеазой в витальной для клеток концентрации. Использование витальных концентраций протеазы позволяет отделять только поверхностные антигены ЭК и избегать гибели самих клеток, влекущей за собой разрушение их плазматических мембран, и как следствие - попадание в вакцину содержимого цитоплазмы, в частности, не представляющей интереса для вакцинации массы внутриклеточных белков. Данный факт приводит к снижению доли специфичных для сосудов опухоли антигенов в известных вакцинах, размыванию иммунного ответа и как следствие - к снижению его специфичности в отношении именно поверхностных антигенов.

Таким образом, использование вакцины, обогащенной поверхностными антигенами, изготовленной согласно настоящему изобретению, позволяет повысить эффективность противоопухолевой иммунотерапии.

Кроме этого, повышение эффективности иммунотерапии достигается за счет использования поверхностных антигенов, полученных аккумулированием с одних и тех же ЭК. Такой способ изготовле- 6 009327 ния противоопухолевой вакцины позволяет получить при каждом воздействии протеазы антигены практически неизменного состава и накапливать необходимое для вакцинации количество поверхностных антигенов. Включение в состав вакцины только специфичных для сосудов данной опухоли антигенов обеспечивается за счет возможности контроля качества получаемой вакцины.

Таким образом, изобретение позволяет получать поверхностные антигены ЭК и осуществлять на их основе иммунотерапию онкологических заболеваний, а именно вакцинацию.

Claims (19)

1. Способ получения противоопухолевой вакцины с использованием эндотелиальных клеток, отличающийся тем, что живые эндотелиальные клетки подвергают витальному для клеток воздействию протеазы, отбирают высвободившиеся поверхностные антигены, при этом обработку живых эндотелиальных клеток протеазой повторяют с интервалами, необходимыми для восстановления клетками поверхностных антигенов, аккумулируют поверхностные антигены до достижения их дозы, необходимой для вакцинации, контролируют качество получаемой вакцины.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют активированные эндотелиальные клетки.

3. Способ по п.1, 2, отличающийся тем, что используют свежевыделенные из сосудов опухоли активированные эндотелиальные клетки.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что включает размножение эндотелиальных клеток культивированием.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протеазы используют трипсин.

6. Способ по пп.1, 2, 4, отличающийся тем, что активированные эндотелиальные клетки выделяют из сосудов опухоли и культивируют в условиях, поддерживающих их активированное состояние.

7. Способ по пп.1, 2, 4, 6, отличающийся тем, что активированное состояние эндотелиальных клеток при культивировании поддерживают сокультивированием с опухолевыми клетками.

8. Способ по пп.1, 2, 4, 6, отличающийся тем, что активированное состояние эндотелиальных клеток при культивировании поддерживают сокультивированием с фрагментами опухолевой ткани.

9. Способ по пп.1, 2, 4, отличающийся тем, что используют активированные эндотелиальные клетки из сосудов опухоли самого пациента.

10. Способ по пп.1, 2, 4, отличающийся тем, что используют активированные эндотелиальные клетки из сосудов опухоли другого пациента.

11. Способ по пп.1, 2, 4, отличающийся тем, что используют культуру эндотелиальных клеток, активированных сокультивированием ΐπ νΐΐΓΟ с опухолевыми клетками.

12. Способ по пп.1, 2, 4, 11, отличающийся тем, что эндотелиальные клетки активируют опухолевыми клетками самого пациента.

13. Способ по пп.1, 2, 4, 11, отличающийся тем, что эндотелиальные клетки активируют опухолевыми клетками другого пациента.

14. Способ по пп.1, 2, 4, 11, отличающийся тем, что эндотелиальные клетки активируют клеточной линией опухолевых клеток.

15. Способ по пп.1, 2, 4, отличающийся тем, что используют культуру эндотелиальных клеток, активированных ΐπ νίίτο добавлением в ростовую среду активирующих веществ.

16. Способ по пп.1, 2, 4, 15, отличающийся тем, что эндотелиальные клетки активируют по меньшей мере одним активирующим фактором.

17. Способ по пп.1, 2, 4, 15, 16, отличающийся тем, что эндотелиальные клетки активируют, применяя фактор роста эндотелия сосудов (УЕОЕ).

18. Способ по пп.1, 2, 4, отличающийся тем, что используют культуру эндотелиальных клеток, активированных ΐπ νΐίΓΟ добавлением кондиционированной среды культуры опухолевых клеток.

19. Способ по п.1, отличающийся тем, что к поверхностным антигенам добавляют адъюванты.