CN110917136A - 一种抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明专利公开了棕榈酸修饰的IKVAV的应用及其抗肿瘤纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗及其制备方法，通过将棕榈酸修饰的IKVAV与表位肽耦联，采用纳米乳和MPLA双佐剂系统，成功制备具有抗肿瘤作用的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗。制得的疫苗具有良好的质量稳定性，对BEAS细胞无明显的细胞毒性，同时可促进黏膜上皮细胞对表位肽的摄取，引起Th1型免疫应答，并诱导CTL反应有效杀伤和清除表达OVA258‑276肽段的细胞。该疫苗对EG7.0荷瘤小鼠有效抑制肿瘤的生长并延长小鼠的存活时间，发挥良好预防性和治疗肿瘤效果。

Description

一种抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及肿瘤的鼻腔粘膜疫苗，还涉及纳米乳鼻腔粘膜疫苗的制备方法和应用。

背景技术

众多的病原微生物是通过黏膜途径感染人体的，主要是通过人体的一些腔道诸如呼吸道、消化道以及生殖道。腔道直接与外界环境相接触包括空气、食物、水等等，就给病原微生物感染提供了便利。据估计，感染性疾病每年导致630万5岁以下的儿童死亡，排名前三的疾病分别是肺炎、痢疾以及疟疾，分别占总死亡人数的14.9％、9.2％和7.3％，通过呼吸道、消化道传播的感染性疾病导致儿童死亡的比重很大。大部分的传统疫苗通过注射途径免疫不能够诱导很强的黏膜免疫应答，而通过黏膜递送疫苗可以有效诱导抗原特异性的黏膜免疫应答。因此在人体的第一道防线即黏膜部位成功诱导保护性免疫意义十分重大。与此同时，黏膜疫苗也可以和传统注射接种疫苗一样诱导系统性免疫的产生。黏膜疫苗接种途径多样，包含口服接种、鼻内接种、口腔接种等。其中鼻内接种具有诸多优势：由于鼻粘膜具有丰富的毛细血管和淋巴管，其表面积相对较大，有利于疫苗抗原成分的摄取；操作简单，可自行接种；能克服口服接种后抗原易被消化道降解的不足。除了能在黏膜局部诱导产生保护性免疫，黏膜疫苗还有其他一些优势，例如不需要注射，没有痛苦，依从性好，接种率高。也可避免注射器重复使用带来的风险。

虽然鼻内疫苗有诸多的优势，但其开发目前面临许多困难。目前采用黏膜途径递送的人用疫苗屈指可数，例如脊髓灰质炎减毒活疫苗、霍乱疫苗、伤寒热疫苗以及某些流感滴鼻疫苗等。由于人体的鼻黏膜表面具有多重天然的防御机制，例如鼻黏膜表面存在粘液层，给疫苗成功递送带来很大困难，因此鼻内疫苗往往需要合适的递送系统来增加抗原的递送效率，减少抗原在鼻黏膜部位的降解与清除，从而增强疫苗的免疫保护效果。目前主要的递送系统策略包括病毒样颗粒、多聚物纳米粒、脂质体以及纳米乳等，而其中的纳米乳是疫苗优良的递送系统。

纳米乳是一种热动学稳定的油水分散体系，可包裹疫苗抗原成分直接递送于黏膜表面。根据制备工艺和材料的不同，纳米乳的尺寸可介于20-200nm间，与病原体的尺寸接近，可迅速被黏膜摄取并进一步递送至APCs。一般油包水型乳剂适宜递送亲水性药物而水包油型反之，合适的剂型选择可以增强疫苗的缓释效果。因此，纳米乳剂型可以很好地运用于鼻内疫苗，Makidon等的研究发现，重组HBsAg可被包裹至纳米乳中，以之进行鼻内接种免疫可以增强疫苗的免疫保护应答。纳米乳促进抗原黏膜递送涉及多种机制，包括形成胶束、渗透黏膜上皮以及促进淋巴转运等。以MF59为代表的乳剂作为人用疫苗佐剂已使用多年，其安全性及有效性得到了广泛的认可，然而作为黏膜递送系统而言其还存在一些不足，例如其平均粒径在160nm左右，黏膜递送效率不佳，并且只能诱导体液免疫应答而对于细胞免疫应答作用有限。我们前期的研究发现，20-50nm左右的纳米乳作为蛋白抗原的递送系统进行鼻内接种免疫可以显著增强抗原的黏膜免疫应答，增强对宿主的免疫保护效果，针对不同的抗原，能一定程度地增强Th1及Th17应答。上述研究结果提示，纳米乳作为黏膜疫苗递送系统需要进行有针对性的合理设计。

激发获得性免疫是疫苗发挥保护作用的关键，其发挥功能的过程主要是：疫苗抗原穿过黏膜或皮肤等生理屏障，被巨噬细胞等APCs吞噬、分解、加工成不同类型的表位肽，然后被T细胞经T细胞受体(TCR)所识别，同时T细胞表位首先要与MHC分子结合后才能被TCR所识别。CD4+T细胞被其表位肽激活后主要分化为3种辅助性T细胞(Th)：Th1细胞，诱导特异性细胞免疫应答，分泌多种细胞因子；Th2细胞，诱导特异性体液免疫应答；Th17，诱导炎症反应。CD8+T细胞被其表位肽激活后分化为细胞毒性T细胞(CTL)，可直接杀伤病毒、细菌或肿瘤细胞等。

目前大多数疫苗主要是通过诱导体液免疫来抵御微生物感染，另一些针对病毒、胞内感染细菌以及肿瘤的研究显示，细胞免疫应答在宿主获得性免疫中发挥的保护作用更为重要。例如缺失特异性抗体应答的小鼠，经幽门螺杆菌疫苗免疫后其免疫保护效果未受明显影响，而对CD4+T细胞缺失的小鼠却不能产生有效保护作用。此外，CD8+T细胞表位激活CTLs能够直接或间接地通过分泌诸如IFN-γ，TNF-α等细胞因子对肿瘤细胞进行杀伤，因此基于肿瘤特异性的CD8+T细胞表位的肿瘤疫苗研究也是该领域的热点。

在感染或肿瘤发生时，病原体抗原中同时存在着抑制性或保护性等性质不同的表位肽，不同表位的T细胞应答往往会相互干扰或抑制^]，因此选择具有保护作用的T细胞表位肽作为疫苗成分，才有可能获得更好的免疫保护效果。例如癌胚抗原(CEA)在多种肿瘤细胞中高表达，单独利用CEA对小鼠进行免疫保护效果并不好，而通过其保护性T细胞表位CEA625-667免疫小鼠能够诱导抗原特异性T细胞增殖，同时显著提高T细胞分泌IFN-γ的水平，对小鼠具有良好的保护作用。前期的研究发现：幽门螺杆菌HpaA蛋白的CD4+T细胞表位肽HpaA154-171(氨基酸序列为：MEGVLIPAGFIKVTILEP，以下简称P22)对小鼠进行免疫具有良好的保护效果，能够有效降低小鼠胃部的细菌定植量，表明P22为CD4+T细胞表位肽。上述提示：保护性T细胞表位肽可能是预防或治疗感染及肿瘤的关。

虽然保护性T细胞表位肽具有良好的免疫活性，但在应用时需要克服两个主要不足：其一是T细胞表位肽分子小，免疫原性弱；稳定性差，易被降解，难以用于疫苗。目前解决这两个问题的主要策略是通过CpG或MPLA等细胞免疫佐剂，增强其特异性免疫应答；同时通过纳米材料使表位肽颗粒化，增强APCs的摄取，提高递送效率。

因此，本发明聚焦黏膜疫苗以及T细胞表位的特点，进行T细胞表位的鼻内疫苗设计研究，同时根据课题组前期的研究基础，选择纳米乳作为递送系统，提高T细胞表位肽的鼻内递送效率，增强其免疫应答强度。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供棕榈酸修饰的IKVAV在制备疫苗表位肽偶联剂中的应用；本发明的目的之二在于提供一种抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗；本发明的目的之三在于提供抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗的制备方法；本发明的目的之四在于提供所述抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗在制备诱导CTL反应有效杀伤和清除表达OVA_258-276肽段细胞的疫苗中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、棕榈酸修饰的IKVAV在制备疫苗表位肽偶联剂中的应用。

优选的，所述表位肽为OVA_257-264表位肽，所述表位肽氨基酸序列为H₂N-SIINFEKL-OH。

2、一种抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗，所述疫苗的表位肽偶联有棕榈酸修饰的IKVAV，所述表位肽为OVA_257-264表位肽，偶联有棕榈酸修饰IKVAV的表位肽序列为C₁₆H₃₁O-A4G3EIKVAV-SGSG-LKEFNIIS-H₂N。

优选的，所述疫苗还包括油相、表面活性剂和免疫佐剂，所述油相为角鲨烯或IPM、所述表面活性剂为吐温-80和吐温60、吐温85，所述佐剂为单磷酰脂质A。

优选的，所述疫苗各组分浓度如下：油相0.06～0.1g/mL、表面活性剂0.2～0.25g/mL和免疫佐剂1～2mg/mL。

优选的，所述棕榈酸修饰的IKVAV偶联OVA_257-264表位肽1～8mg/mL。

更优选的，所述棕榈酸修饰的IKVAV偶联OVA_257-264表位肽浓度为4mg/ml。

优选的，所述疫苗平均粒径为22.61±0.71nm，包封率为84.07±7.59％。

3、所述的抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗的制备方法，依次加入油相、表面活性剂、助表面活性剂、偶联有棕榈酸修饰IKVAV的表位肽和水，然后采用低能乳化中的转相法制备纳米乳疫苗。

4、所述抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗在制备诱导CTL反应有效杀伤和清除表达OVA_258-276肽段细胞的疫苗中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明NE-IO/MPLA纳米乳鼻黏膜疫苗，该疫苗抗原偶联棕榈酸修饰的IKVAV，油相为角鲨烯(Squalene，SQ)，表面活性剂为吐温-80，佐剂为单磷酰脂质A，制备出粒径为23nm、包封率为84％的NE-IO/MPLA疫苗。由于棕榈酸修饰的IKVAV(层黏连蛋白的核心5肽)偶联后增加了强疏水部分，整个偶联分子呈现一定的两亲性，从而增强被纳米乳负载的稳定性，并且偶联后即作为抗原成分，更参与了纳米乳的形成。疫苗中添加单磷酰脂质A为佐剂能够增强特异性CTL应答。通过研究不同OEP载药浓度制备纳米乳的粒径、电位、分散性以及在黏蛋白(Mucin)存在条件下是否发生聚集和细胞毒性实验。结果显示，该疫苗不会与粘蛋白发生相互作用而导致聚集；细胞毒性实验结果证实在稀释20倍及以上时，NE-IO/MPLA、NE-I/MPLA及相应浓度的OEP与BEAS-2B细胞作用24小时并未观察到明显的细胞毒性，表明NE-IO/MPLA疫苗的毒性较小。NE-IO/MPLA能够引起较强的Th1型免疫应答，能有效杀伤和清除表达OVA_258-276肽段细胞。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为不同IO浓度对NE-IO/MPLA在纯水或黏蛋白溶液中粒径、Zeta电位的影响结果图(A：粒径结果；B：Zeta电位)。

图2为不同IKVAV-PA浓度对NE-I/MPLA在纯水或黏蛋白溶液中粒径、Zeta电位的影响结果图(A：粒径结果；B：Zeta电位)。

图3为不同IO载药量对NE-IO/MPLA包封率影响结果图。

图4为NE-IO/MPLA的特征鉴定图(A：粒径分布；B：Zeta电位；C：TEM对NE-IO/MPLA疫苗观察结果；D：AFM对NE-IO/MPLA疫苗观察结果)。

图5为NE-IO/MPLA的细胞毒性检测结果图。

图6为NE-IO/MPLA促进OEP被BEAS-2B细胞的摄取(A：共聚焦显微镜观察FITC绿色荧光信号；B：流式细胞检测结果)。

图7为整合素阻断对BEAS-2B摄取NE-IO/MPLA的影响结果图。

图8为免疫后小鼠特异性抗体水平ELISA检测结果图。

图9为免疫后小鼠脾细胞刺激上清中细胞因子检测结果图(A：IL-4；B：IL-5；C：IL-6；D：IL-2；E：TNF-α；F：IFN-γ)。

图10为抗原特异性CD8⁺T细胞检测结果图。

图11为体外CTL试验结果图(A：流式细胞术检测CFSE^high细胞结果；B：CFSE^high细胞的比例)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

针对模式抗原卵清蛋白(OVA)CD8⁺T细胞表位肽OVA_257-264(OVA epitope peptide，简称OEP)的纳米乳疫苗，同时使用C57BL/6小鼠皮下E.G7细胞荷瘤模型对该疫苗的免疫保护效果进行评价。

实施例1、IO的合成

IKVAV-PA偶联OVA_257-264表位肽(IO)，序列为C₁₆H₃₁O-A4G3EIKVAV-SGSG-LKEFNIIS-H₂N，由上海波泰生物科技有限公司合成，分子量为2584.67，纯度>95％。

IKVAV-PA，序列为C₁₆H₃₁O-A4G3EIKVAV，由上海波泰生物科技有限公司合成，分子量为1351.28，纯度>95％。

OVA_257-264表位肽(OEP)，序列为H₂N-SIINFEKL-OH，由上海波泰生物科技有限公司合成，分子量为963.14，纯度>95％。

实施例2、IO/MPLA疫苗的处方

处方1：0.06g角鲨烯(Squalene，后简称SQ，)，0.2g吐温-85(Tween-85，后简称T80)，1mg单磷酰脂质A(MPLA)；

处方2：0.06g角鲨烯(Squalene，后简称SQ，)，0.2g吐温-60(Tween-60，后简称T80)，1mg单磷酰脂质A(MPLA)；

处方3:0.06g IPM，0.2g吐温-60(Tween-60，后简称T80)，1mg单磷酰脂质A(MPLA)；

处方4：0.06g IPM，0.2g吐温-80(Tween-80，后简称T80)，1mg单磷酰脂质A(MPLA)；

处方5：0.06g IPM，0.2g吐温-85(Tween-85，后简称T80)，1mg单磷酰脂质A(MPLA)；

处方6：0.02g IPM，0.25g吐温-85(Tween-85，后简称T80)，1mg单磷酰脂质A(MPLA)；

处方7：0.1g IPM，0.2g吐温-85(Tween-85，后简称T80)，1mg单磷酰脂质A(MPLA)；

处方8：0.1g角鲨烯(Squalene，后简称SQ，)，0.2g吐温-60(Tween-60，后简称T80)，

1mg单磷酰脂质A(MPLA)；

处方9：用0.06g角鲨烯(Squalene，后简称SQ，)，0.2g吐温-80(Tween-80，后简称T80)，1mg单磷酰脂质A(MPLA)

处方10：用0.03g角鲨烯(Squalene，后简称SQ，)，0.25g吐温-80(Tween-80，后简称T80)，2mg单磷酰脂质A(MPLA)

制备工艺，采用低能乳化法各制备1mL纳米乳。具体方法是依次加入油相、表面活性剂、助表面活性剂、偶联有棕榈酸修饰IKVAV的表位肽和水，然后采用低能乳化中的转相法制备纳米乳疫苗。通过粒度分析和高速离心(13000rpm,5min)检测发现，上述处方1-10均可以形成质量稳定合格的(即粒径检测均处于1-100纳米范围内，高速离心不分层)纳米乳佐剂疫苗。由于满足质量稳定合格的(即粒径检测均处于1-100纳米范围内，高速离心不分层)纳米乳佐剂疫苗的上述处方较多，因此后期的实验选择以处方9为代表进行研究。

实施例3、IO/MPLA疫苗对在载药量的影响

处方9中分别加入0mg、1mg、2mg、4mg及8mg IO，制备了含有不同浓度IKVAV-PA的纳米乳(后简称NE-I/MPLA)，即未偶联OEP的纳米乳，同样采用0.06g SQ，0.2g T80，1mg MPLA体系。由于IKVAV-PA与IO的分子量之比约为1:2，因此分别加入0.4mg、0.8mg、1.6mg及3.2mgIKVAV-PA，采用低能乳化法各制备1mL纳米乳。

上述不同处方制得的纳米乳使用超纯水或黏蛋白溶液稀释200倍后，通过Nano ZS动态光散射粒径电位分析仪在25℃下测量粒径和Zeta电位，从而确定处方最佳IO浓度。结果如图1所示。图1中A显示，不同IO浓度组(0mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL及8mg/mL)在纯水中的粒径大小分别为：133.60±3.70nm、167.62±9.31nm、121.06±4.25nm、29.33±2.82nm和88.37±2.80nm。不同IO浓度组(0mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL及8mg/mL)在0.05mg/mL黏蛋白溶液中粒径大小分别为：163.83±7.59nm、175.03±16.98nm、142.37±11.29nm、30.37±2.49nm和92.97±8.70nm。还可以观察到，各组在纯水或黏蛋白溶液中粒径较为接近，在黏蛋白溶液中略有增高，基本上粒径在100nm左右，但在4mg/mL时粒径突然降低至29.33±2.82nm，增加IO浓度至8mg/mL时粒径再次突增至88.37±2.80nm。

Zeta电位如图1中B所示，结果显示不同IO浓度组(0mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL及8mg/mL)在纯水中的Zeta电位分别为：-35.53±1.22mV、-13.37±2.10mV、-11.03±1.62mV、-16.67±1.76mV及-11.1±2.36mV。不同IO浓度组(0mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL及8mg/mL)在0.05mg/mL黏蛋白溶液中的Zeta电位分别为：-28.77±0.40mV、-10.83±1.72mV、-12.47±0.70mV、-15.13±1.46mV及-10.13±4.24mV。上述结果表明各配方制备的纳米乳表面均带负电荷，在无IO时(即0mg/mL)带电荷较多，引入IO后Zeta电位绝对值下降，各组约在-10mV至-15mV范围内，且纯水中或黏蛋白溶液中各处方纳米乳电位基本无差异。

上述结果表明NE-IO/MPLA各处方在黏蛋白溶液中均较为稳定，不发生明显聚集，同时IO终浓度为4mg/mL时其粒径最小，明显区别于其他浓度组，且粒径在20-50nm范围内，该处方为NE-IO/MPLA的最佳处方。

同时本实施例也摸索了不含表位肽的空白纳米乳NE-I/MPLA负载IKVAV-PA的最佳载药浓度。通过Nano ZS动态光散射粒径电位分析仪在25℃下测量粒径和Zeta电位，结果如图2所示。

如图2中A所示，不同IKVAV-PA浓度组(0mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL及4mg/mL)在纯水中的粒径大小分别为：133.62±3.71nm、145.43±11.83nm、111.92±7.56nm、22.61±0.71nm和185.53±7.58nm。不同IKVAV-PA浓度组(0mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL及4mg/mL)在0.05mg/mL黏蛋白溶液中粒径大小分别为：163.80±7.59nm、163.37±6.49nm、134.97±3.55nm、22.67±0.15nm及179.47±5.20nm。还可以观察到，NE-I/MPLA各组在纯水或黏蛋白溶液中粒径较为接近，在黏蛋白溶液中略有增高，基本上粒径在100nm左右，但在2mg/mL时粒径突然降低至22.61±0.71nm，增加IKVA-PA浓度至4mg/mL时粒径再次突增至179.47±5.20nm。其结果与NE-IO/MPLA等摩尔浓度(IKVAV-PA与IO)各处方趋势基本一致。

如图2中B所示，不同IKVAV-PA浓度组(0mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL及4mg/mL)在纯水中的Zeta电位分别为：-35.51±1.22mV、-12.73±3.03mV、-12.02±1.05mV、-14.77±1.26mV及-11.92±1.21mV。不同IKVAV-PA浓度组(0mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL及4mg/mL)在0.05mg/mL黏蛋白溶液中的Zeta电位分别为：-28.77±0.40mV、-16.01±1.55mV、-13.27±0.15mV、-19.91±5.80mV及-14.17±1.59mV。上述结果表明NE-I/MPLA纳米乳表面带负电荷，在无IKVAV-PA时(即0mg/mL)带电荷较多，引入IKVAV-PA后Zeta电位绝对值下降，各组约在-10mV至-15mV范围内，黏蛋白溶液中各处方纳米乳电位仅略有增加，基本无差异。

上述结果表明NE-I/MPLA各处方在黏蛋白溶液中均较为稳定，不发生明显聚集，同时IKVAV-PA终浓度为2mg/mL时其粒径最小，明显区别于其他浓度组，与NE-IO/MPLA中对应结果相类似。

基于粒径、Zeta电位以及在黏蛋白溶液中的检测结果，选择IO浓度为4mg/mL作为制备NE-IO/MPLA疫苗的处方，同时选择IKVAV-PA浓度为1.6mg/mL作为制备NE-I/MPLA空白纳米乳对照的处方。

HPLC检测不同IO载药浓度NE-IO/MPLA疫苗包封率结果：由于在4mg/mL浓度下粒径最小，而8mg/mL浓度下粒径不降反增，可能是超过了载药的最大限度，因此进一步通过包封率的测定来证明这一猜想。

如图3所示，结果显示不同IO浓度组(0mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL及8mg/mL)NE-IO/MPLA的包封率分别为：0％、70.33±8.23％、78.87±6.41％、84.07±7.59％以及42.17±2.95％。IO浓度为1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL时，包封率有上升趋势，但各组包封率间无统计学差异，但当浓度8mg/mL时，包封率与1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL组相比显著降低(P<0.001)。上述结果表明当IO浓度为8mg/mL时，有大量游离IO未被NE-IO/MPLA包裹，IO浓度为4mg/mL左右时可能恰好达到包封极限，因此粒径较小包封率也较高。

实施例3、纳米乳疫苗的表征

根据实施例2的处方工艺，采用IO终浓度为4mg/mL的处方，以实施例1的低能乳化法制备NE-IO/MPLA疫苗。NE-I/MPLA作为对照。采用Nano ZS动态光散射粒径电位仪测定了NE-IO/MPLA疫苗的粒径和Zeta电位。同时，采用TEM以及AFM观察NE-IO/MPLA的疫苗的微观形态。

动态光散射粒径电位仪对NE-IO/MPLA疫苗检测结果如图4中A所示，结果显示，NE-IO/MPLA的粒径分布较窄，主要在10nm至60nm范围内，粒径最集中的范围主要出现在20nm至30nm间，在25℃时平均粒径为22.61±0.71nm。同时，NE-IO/MPLA的Zeta电位为-16.67±1.76mV(图4中B)。

TEM对NE-IO/MPLA疫苗观察结果如图4中C所示。结果显示，放大25万倍后，可观察到NE-IO/MPLA成粒状，分散性良好，基本上无聚集，根据比例尺判断粒径基本上在20nm左右。观察到的结果与动态光散射粒径分析获得的结果基本一致。

AFM对NE-IO/MPLA疫苗观察结果如图4中D所示，结果显示原子力显微镜更为精细地观察到了NE-IO/MPLA的外观形貌，可见NE-IO/MPLA呈球状，表面光滑，大小在20nm左右，同时分散性良好且无聚集成团现象。

以上结果基本表明NE-IO/MPLA疫苗外观为表面光滑的球状结构，大小在20nm左右，分散性良好，具有较好的质量特征。

实施例4、NE-IO/MPLA的细胞毒性检测

将BEAS-2B细胞计数并以完全培养基调整浓度后铺入平底96孔板中，每孔100μL含1×10⁴个细胞，于37℃，含5％二氧化碳细胞培养箱中培养24小时。随后每孔加入10μL不同浓度的NE-IO/MPLA、NE-I/MPLA及OEP溶液(NE-IO/MPLA和NE-I/MPLA分别稀释20、40、80、160及320倍，对应OEP根据摩尔比计算浓度分别为74.5μg/mL、37.25μg/mL、18.63μg/mL、9.31μg/mL及4.66μg/mL)，继续培养24小时。最后每孔加入10μL CCK-8溶液，于37℃孵育1小时后以iMark微孔板酶标仪检测其450nm吸光度值。

细胞活性计算：细胞活性(cell viability，％)＝(处理组OD₄₅₀/对照组OD₄₅₀)×100％

数据均采用GraphPad Prism 5.0软件进行分析。数据表示为平均值±SD或平均值±SEM。两组数据之间的差异采用非配对t检验；其余数据差异采用单因素方差分析检验，组间差异采用Newman-Keuls检验。P值<0.05被认为是具有统计学差异的。

计算结果如图5所示，结果显示，不同稀释倍数的NE-IO/MPLA(20、40、80、160及320倍)处理后的BEAS-2B细胞活性分别为：91.37±2.26、100.96±4.53、103.29±2.567、96.67±5.58及94.79±8.48，均大于90％。表明在大于等于20倍稀释条件下，NE-IO/MPLA疫苗对BEAS-2B细胞无明显毒性。同时OEP水溶液及NE-I/MPLA的结果与上述结果类似。

上述结果显示，NE-IO/MPLA疫苗或NE-I/MPLA载体在稀释20倍以上的条件下，对BEAS-2B细胞无明显细胞毒性，初步表明NE-IO/MPLA细胞毒性较小，适宜进行后续试验研究。

实施例5、NE-IO/MPLA的保护效果评价

(1)荷瘤模型构建

构建本荷瘤模型多采用每只小鼠皮下注射1×10⁵至1×10⁶个细胞E.G7细胞(E.G7细胞是一种C57BL/6小鼠淋巴瘤细胞EL4来源的细胞，通过稳转质粒pAc-neo-OVA_258-276使其具有表达OVA_258-276肽段的能力)，因此拟先行摸索接种细胞量。选择1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶三个剂量组。

E.G7细胞用细胞培养瓶培养扩增后收集，1000rpm/min离心5分钟，弃去上清，以RPMI1640培养基调整为1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷三个浓度，小鼠经异氟烷麻醉后将右侧肩背部毛剃光，皮下分别注射100μL不同浓度的E.G7细胞。分别在第6、9、12、15及18天记录肿瘤的长和宽，计算肿瘤体积。同时记录小鼠生存率。出于人道考虑，若小鼠肿瘤体积超过3000mm³时，则处死小鼠。

肿瘤体积的计算公式为：Volume＝π/6×L×W²，其中L为肿瘤的长，W为肿瘤的宽。

结果显示，在接种后第5天时，高、中剂量组已能看到较明显瘤体，低剂量组的瘤体尚不明显；而高、中、低三个剂量组在第9天均能看到明显成瘤，瘤体基本呈圆球状，长于接种部位皮下。其中高、中剂量组的瘤体较明显，低剂量组的较小。

综合考虑到模型的稳定性，以及预防性、治疗性效果评价的免疫策略，高剂量组由于肿瘤增长过快，小鼠死亡过快，因此较不适宜作为评价模型；低剂量组小鼠由于肿瘤生长缓慢，并且30天内仍有存活，实验周期过长，可能会使得治疗、预防效果不便于观察。因此，选择皮下接种5×10⁵个E.G7细胞作为后续评价保护效果的荷瘤模型。

(2)实验分组及疫苗配制

根据实验研究的需要分为5个组，每组8只小鼠，分组及疫苗配制方法如下：

PBS组：PBS溶液。

NE-I/MPLA组：不含OEP的纳米乳原液。

MPLA+OEP组：MPLA与OEP物理混合的水溶液，终浓度分别为1mg/mL及4mg/mL。

NE-I/MPLA+OEP组：NE-I/MPLA纳米乳原液，与OEP物理混合(即纳米乳不负载OEP)，OEP终浓度为4mg/mL。

NE-IO/MPLA组：NE-IO/MPLA原液。

(3)小鼠免疫方法

通过吸入异氟烷将小鼠进行麻醉，在通过将上述各组对应成分滴入鼻腔的方式免疫小鼠，每侧鼻腔各10μL，每只小鼠共20μL。滴入完成后将小鼠头向上方竖起静置10秒，将小鼠放回鼠笼，每日观察小鼠体征。

(4)小鼠免疫程序

对于预防性效果评价，在第0天、7天、14天经滴鼻方式免疫小鼠3次，在末次免疫后第7天对每只小鼠皮下接种5×10⁵个E.G7细胞。接种细胞后在第6、9、12、15及18天记录肿瘤的长和宽，计算肿瘤体积。同时记录小鼠生存率。

对于治疗性效果评价，在第0天对每只小鼠皮下接种5×10⁵个E.G7细胞，同时进行第一次免疫，同时在第7天、14天加强免疫两次。

(5)BEAS-2B细胞对NE-IO/MPLA摄取能力检测

使用FITC标记的IO制备NE-IO/MPLA。

将灭菌后的细胞爬片置入12孔板中，每孔铺入5×10⁵个BEAS-2B细胞，使用RPMI1640完全培养基，置于37℃含5％二氧化碳细胞培养箱中培养24小时。

弃去原有培养基，每孔加入1mL新鲜完全培养基，随后每孔加入20μL FITC标记的NE-IO/MPLA或FITC标记的OEP水溶液，使得各组OEP的终浓度一致。置于37℃含5％二氧化碳细胞培养箱中培养1.5小时。

随后弃去孔内液体，使用1mL PBS洗涤3次，然后每孔加入500μL 4％多聚甲醛溶液，避光固定20分钟。再次用1mL PBS洗涤3次，每孔滴入50μL DAPI染色液避光染色10分钟，1mL PBS洗涤5次。吸干液体后取出爬片，滴上1滴防淬灭封片液装片。立即使用LSM 780共聚焦显微镜观察。

另有一组不加爬片，培养及刺激条件与上述完全一致，孵育培养1小时后弃去培养基，胰酶消化下细胞后采用流式细胞术检测FITC阳性细胞比例。

结果显示，空白对照背景干净，只见被DAPI染料染为蓝色的细胞核；P22组可见少量细胞质区有零星FITC绿色荧光信号，使用FITC标记的OEP与BEAS-2B细胞共孵育可有少量表位肽被细胞所摄取；NE-IO/MPLA组可见多数细胞的胞质区有较强的FITC绿色荧光信号，表明大量的NE-IO/MPLA负载的表位肽被BEAS-2B细胞摄取，细胞摄取NE-IO/MPLA的效率很高(图6中A)。

流式细胞术对FITC信号阳性的细胞进行定量，并计算各组FITC阳性细胞占比，空白对照组、OEP组以及NE-IO/MPLA组结果分别为：1.19±0.64％、14.44±9.47％和68.83±5.45％。NE-IO/MPLA组FITC阳性细胞的比例显著高于OEP组(P<0.001)，说明NE-IO/MPLA有效地促进了人支气管上皮细胞BEAS-2B对OEP的摄取效率，大大提高了OEP的递送效率(图6中B)。

(6)整合素抗体阻断实验

使用FITC标记的IO制备NE-IO/MPLA。

在12孔板中每孔铺入5×10⁵个BEAS-2B细胞，使用RPMI 1640完全培养基，置于37℃含5％二氧化碳细胞培养箱中培养24小时。

弃去原有培养基，每孔加入1mL新鲜完全培养基，其中阻断组培养基根据文献报道加入抗integrin α3、抗integrin α1及抗integrinβ1抗体，终浓度均为50μg/mL；对照组培养基含纯化的正常小鼠IgG抗体，终浓度为150μg/mL。置于37℃含5％二氧化碳细胞培养箱中培养1小时，随后弃去培养基，每孔加入1mL新鲜完全培养基。每孔加入20μL FITC标记的NE-IO/MPLA或FITC标记的OEP水溶液，使得各组OEP的终浓度一致。置于37℃含5％二氧化碳细胞培养箱中培养1.5小时。弃去培养基，胰酶消化下细胞后采用流式细胞术检测FITC阳性细胞比例。结果如图7所示，结果显示OEP组经PBS、同型抗体以及整合素抗体阻断处理的FITC阳性BEAS-2B细胞比例分别为18.81±3.40％、18.96±6.64％以及19.49±7.79％，几种处理组间无统计学差异。而NE-IO/MPLA组经PBS、同型抗体以及整合素抗体阻断处理的FITC阳性BEAS-2B细胞比例分别为66.68±4.64％、66.47±2.67％以及54.87±3.27％，整合素抗体阻断组的FITC阳性细胞比例显著低于PBS及同型抗体对照组(P<0.01)。上述结果说明IKVAV对整合素的结合参与到了增强BEAS-2B细胞对OEP的摄取。阻断整合素后BEAS-2B细胞对NE-IO/MPLA的摄取率依旧高于游离OEP(P<0.001)，表明纳米乳也是促进上皮细胞摄取抗原肽的关键因素。

(7)NE-IO/MPLA免疫后抗体亚型检测

将末次免疫一周后小鼠全血4℃2000rpm离心15分钟，分离血清，采用ELISA检测小鼠血清中总IgA、IgG、IgG1、IgG2a的水平，结果如图8所示。结果显示，PBS组、NE-I/MPLA组、MPLA+OEP组、NE-I/MPLA+OEP组以及NE-IO/MPLA组均未检测到各型特异性抗体，没有特异性抗体应答。由于OEP是一个CD8⁺T细胞免疫优势表位肽，因此理论上免疫后不会产生高水平的特异性抗体应答，实验结果与之相符。

(8)免疫后小鼠脾细胞刺激细胞因子检测

将末次免疫后1周小鼠的脾脏取出用于脾细胞刺激，随后检测刺激后上清的Th1型细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ以及Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-6的丰度。脾细胞的处理以及刺激的方法如下：

(1)将取出小鼠的脾脏加入5mL不完全DMEM/F12培养基，使用200目组织筛研磨，获得单细胞悬液，1000rpm离心5分钟，弃去上清。

(2)每管加入5mL红细胞裂解液重悬，室温裂解红细胞5分钟，之后加入10mL PBS中和后，1000转5分钟，弃去上清。

(3)使用5mL不完全DMEM/F12培养基重悬洗涤细胞，1000转5分钟离心，弃去上清，重复2次。

(4)使用RF-10培养基重悬计数并调整细胞浓度，随后进行铺板。

(5)在24孔板中每孔加入500μL细胞悬液，含有5×10⁶个脾细胞。

(6)铺好的板中加入经除菌过滤的1000μg/mL的OEP水溶液，使OEP的终浓度为10μg/mL。37℃含有5％二氧化碳的培养箱中培养刺激96小时。

(7)吸取培养上清，1500rpm离心10分钟，小心吸取上清，-80℃保存。

(8)以Bio-Plex Pro Mouse Cytokine GrpIPanel 23-plex液相悬浮芯片检测上述细胞因子丰度。

Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-6浓度的检测结果如图9中A至C所示，PBS对照组、OEP+MPLA组、NE-I/MPLA+OEP载体表位肽物理混合组以及NE-IO/MPLA组IL-4的浓度分别为38.83±30.42pg/mL、33.66±13.51pg/mL、43.29±11.64pg/mL、56.89±11.67pg/mL；IL-5的浓度分别为59.28±25.22pg/mL、46.33±22.34pg/mL、37.81±20.71pg/mL、44.73±17.01pg/mL；IL-6的浓度分别为147.8±79.07pg/mL、122±46.48pg/mL、186.4±81.9pg/mL、240.7±63.38pg/mL。各组3个Th2型细胞因子的水平均较低，基本与PBS对照组一致，处于基线水平，表明NE-IO/MPLA免疫后引起的应答不是Th2型免疫应答，此结果与上一部分未检测到各型特异性抗体结果相符。

Th1型细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ浓度的检测结果如图9中D到F所示，PBS对照组、OEP+MPLA组、NE-I/MPLA+OEP载体表位肽物理混合组以及NE-IO/MPLA组IL-2的浓度分别为20.33±0.24pg/mL、26.31±3.165pg/mL、29436±20467pg/mL、125407±35204pg/mL，NE-IO/MPLA组显著高于PBS对照组和OEP+MPLA组(P<0.001)，同时也显著高于NE-I/MPLA+OEP组(P<0.01)；TNF-α的浓度分别为3.68±1.68pg/mL、4.95±0.81pg/mL、44.31±6.88pg/mL、47.37±19.48pg/mL，NE-IO/MPLA组和NE-I/MPLA+OEP组显著高于PBS对照组和OEP+MPLA组(P<0.01)；IFN-γ的浓度分别为0.81±0.45pg/mL、0.44±0.22pg/mL、397.6±183.3pg/mL、691.2±100.7pg/mL，NE-IO/MPLA组显著高于PBS对照组和OEP+MPLA组(P<0.001)，NE-I/MPLA+OEP组也显著高于PBS对照组和OEP+MPLA组(P<0.01)，此外，NE-IO/MPLA组显著高于NE-I/MPLA+OEP组(P<0.05)。

以上结果主要说明：(1)NE-IO/MPLA免疫后不引起Th2型免疫应答，主要引起Th1型免疫应答。(2)单独使用OEP+MPLA鼻内接种免疫小鼠并不能有效引起Th1型免疫应答。(3)使用NE-I/MPLA+OEP免疫小鼠可以引起较弱的Th1型免疫应答，强度不如NE-IO/MPLA疫苗。

上述结果验证了OEP+MPLA单独免疫小鼠不能引起有效的保护性免疫，NE-I/MPLA+OEP免疫虽然具有一定的保护效果，但其效果显著弱于NE-IO/MPLA组。

(9)OEP特异性CD8⁺T细胞检测

将末次免疫后1周小鼠的脾脏取出用于脾细胞刺激，随后检测OEP特异性CD8⁺T细胞在总CD8⁺T细胞中的比例。脾细胞的处理以及刺激的方法如下：

(1)将取出小鼠的脾脏加入5mL不完全DMEM/F12培养基，使用200目组织筛研磨，获得单细胞悬液，1000rpm离心5分钟，弃去上清。

(2)每管加入5mL红细胞裂解液重悬，室温裂解红细胞5分钟，之后加入10mL PBS中和后，1000转5分钟，弃去上清。

(3)使用5mL不完全DMEM/F12培养基重悬洗涤细胞，1000转5分钟离心，弃去上清，重复2次。

(4)使用RF-10培养基重悬计数并调整细胞浓度，随后进行铺板。

(5)在24孔板中每孔加入500μL细胞悬液，含有5×10⁶个脾细胞。

(6)铺好的板中加入经除菌过滤的1000μg/mL的OEP水溶液，使OEP的终浓度为10μg/mL。37℃含有5％二氧化碳的培养箱中培养刺激96小时。

(7)收集细胞，1500rpm，离心5分钟，弃去上清，加入1mL PBS重悬洗涤，重复三次。

(8)每个样本使用100μLStaining Buffer重悬，加入10μL T-Select H-2Kb OVA四聚体，4℃避光孵育30分钟。1500rpm离心5分钟，弃去上清，重新用100μL Staining Buffer重悬细胞后以FACSVerse流式细胞仪进行检测。

结果如图10所示。结果显示，PBS对照组、MPLA+OEP组、NE-I/MPLA+OEP载体表位肽物理混合组以及NE-IO/MPLA组中抗原特异性CD8⁺T细胞在CD8⁺T细胞中的比例分别为0.11±0.09％、0.28±0.22％、0.62±0.39％及1.25±0.68％，MPLA+OEP组和NE-I/MPLA+OEP组较PBS对照组稍有升高但无统计学差异，而NE-IO/MPLA组显著高于PBS组和MPLA+OEP组(P<0.01)，证明NE-IO/MPLA免疫后能够诱导较强的细胞免疫应答及免疫记忆。

进一步通过体外CTL试验来反应特异性CTL应答对E.G7细胞的清除作用。我们通过末次免疫后一周的小鼠脾细胞与5M浓度CFSE标记的E.G7细胞(即CFSE^high)混合，相互作用24小时后加入等量的0.5M浓度CFSE标记的E.G7细胞(即CFSE^low)作为内参，通过流式细胞术检测CFSE^high细胞的比例，比例越低则证明被清除的越多，即CTL反应越强。

(10)体外CTL实验

体外CTL试验旨在检测免疫后小鼠脾细胞中CTL对E.G7的杀伤作用，本实验参考自Shinichi等的方法。过程如下：

(1)末次免疫后1周的小鼠取脾脏，将取出小鼠的脾脏加入5mL不完全DMEM/F12培养基，使用200目组织筛研磨，获得单细胞悬液，1000rpm离心5分钟，弃去上清。

(2)每管加入5mL红细胞裂解液重悬，室温裂解红细胞5分钟，之后加入10mL PBS中和后，1000转5分钟，弃去上清。

(3)使用5mL不完全DMEM/F12培养基重悬洗涤细胞，1000转5分钟离心，弃去上清，重复2次。

(4)使用RF-10培养基重悬计数并调整细胞浓度。

(5)含5μM或0.5μM CFSE完全培养基避光染E.G7细胞，37℃含5％二氧化碳染1小时，随后1000rpm，离心5分钟，弃去上清，以空白培养基洗3次。高浓度CFSE标记的细胞记为E.G7^high，低浓度CFSE标记的细胞记为E.G7^low。细胞均为临用前现染。

(6)6孔板中加入1×10⁷个处理好的小鼠脾细胞，同时混入1×10⁵个E.G7^high细胞，37℃含5％二氧化碳的细胞培养箱中培养24小时。

(7)培养结束后，每孔加入1×10⁵个E.G7^low细胞作为内参，1000rpm离心5分钟，200μL Staining Buffer重悬后使用FACSVerse流式细胞仪进行检测。

如图11所示，PBS对照组、MPLA+OEP组、NE-I/MPLA+OEP载体表位肽物理混合组以及NE-IO/MPLA组中CFSE^high细胞的比例分别为100.1±3.79％、105.5±4.52％、85.43±4.98％、58.61±5.27％，NE-I/MPLA+OEP显著低于PBS对照组和MPLA+OEP组(P<0.001)，而NE-IO/MPLA组显著低于其余各组(P<0.001)。证明NE-I/MPLA+OEP免疫能够引起较弱的特异性CTL应答，而NE-IO/MPLA免疫后引起的CTL应答最强。

综上所述，NE-IO/MPLA免疫后能引起较强的特异性CTL应答，能有效地对E.G7细胞(即表达OVA_258-276肽段的细胞)进行杀伤和清除。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.棕榈酸修饰的IKVAV在制备疫苗T细胞表位肽偶联剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述表位肽为OVA_257-264表位肽，所述表位肽氨基酸序列为H₂N-SIINFEKL-OH。

3.一种抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗，其特征在于：所述疫苗的表位肽偶联有棕榈酸修饰的IKVAV，所述表位肽为OVA_257-264表位肽，偶联有棕榈酸修饰IKVAV的表位肽序列为C₁₆H₃₁O-A4G3EIKVAV-SGSG-LKEFNIIS-H₂N。

4.根据权利要求3所述的抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗，其特征在于：所述疫苗还包括油相、表面活性剂和免疫佐剂，所述油相为角鲨烯或IPM、所述表面活性剂为吐温-80和吐温60、吐温85，所述佐剂为单磷酰脂质A。

5.根据权利要求4所述的抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗，其特征在于：所述疫苗各组分浓度如下：油相0.06～0.1g/mL、表面活性剂0.2～0.25g/mL和免疫佐剂1～2mg/mL。

6.根据权利要求3所述的抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗，其特征在于：所述棕榈酸修饰的IKVAV偶联OVA_257-264表位肽1～8mg/mL。

7.根据权利要求6所述的抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗，其特征在于：所述棕榈酸修饰的IKVAV偶联OVA_257-264表位肽浓度为4mg/ml。

8.根据权利要求3～7任一项所述的抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗，其特征在于：所述疫苗平均粒径为22.61±0.71nm，包封率为84.07±7.59％。

9.权利要求3～8任一项所述的抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗的制备方法，其特征在于：依次加入油相、表面活性剂、助表面活性剂、偶联有棕榈酸修饰IKVAV的表位肽和水，然后采用低能乳化中的转相法制备纳米乳疫苗。

10.权利要求3～8任一项所述抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗在制备诱导CTL反应有效杀伤和清除表达OVA_258-276肽段细胞的疫苗中的应用。

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