WO2023210722A1 - 免疫機能活性化剤、ワクチンアジュバントおよび免疫誘導方法 - Google Patents

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WO2023210722A1
WO2023210722A1 PCT/JP2023/016572 JP2023016572W WO2023210722A1 WO 2023210722 A1 WO2023210722 A1 WO 2023210722A1 JP 2023016572 W JP2023016572 W JP 2023016572W WO 2023210722 A1 WO2023210722 A1 WO 2023210722A1
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administration
particles
immune function
derived
immunity
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亮 鈴木
大樹 小俣
理紗 宗像
悠乃 鈴木
桂一 小泉
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学校法人帝京大学
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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants

Definitions

  • the present invention provides an immune function activator whose active ingredient is particles made of cell wall-derived polysaccharide with a maximum diameter of 1 to 800 nm, a vaccine adjuvant containing the above immune function activator, and administration of the above immune function activator.
  • the present invention relates to an immunity induction method comprising steps.
  • the present invention can enhance the induction of both humoral immunity and cell-mediated immunity.
  • the active ingredient is derived from cell walls (derived from natural products), and it is effective for consumers.
  • the present invention provides an immune function activator that can give a sense of security, a vaccine adjuvant containing the above immune function activator, and a method for inducing immunity, which includes a step of administering the above immune function activator.
  • the present inventors first investigated substances obtained from natural products.
  • particles made of cell wall-derived polysaccharides and having a maximum diameter in the range of 1 to 800 nm can enhance the induction of humoral immunity and cell-mediated immunity.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • An immune function activator comprising particles having a maximum diameter in the range of 1 to 800 nm as an active ingredient, the particles comprising a cell wall-derived polysaccharide.
  • the immune function activator according to [1] wherein the particles are derived from at least one selected from the group consisting of licorice, yeast, and lactic acid bacteria.
  • the immune function activator according to [1] or [2] which is used in infectious disease treatment and/or cancer immunotherapy.
  • [5] Administered by at least one method selected from the group consisting of subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, pulmonary administration, intravascular administration, nasal administration, and oral administration [1] to [4] The immune function activator according to any one of.
  • a vaccine adjuvant comprising particles having a maximum diameter in the range of 1 to 800 nm as an active ingredient, the particles comprising a polysaccharide derived from a cell wall.
  • the vaccine adjuvant according to [6] which is administered by at least one method selected from the group consisting of subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, pulmonary administration, intravascular administration, nasal administration, and oral administration. .
  • An immunity induction method comprising the step of administering the immune function activating agent according to any one of [1] to [5].
  • the step of administering the immune function activator is at least one administration selected from the group consisting of subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, pulmonary administration, intravascular administration, nasal administration, and oral administration.
  • the immune function activating agent of the present invention has a high inducing effect on both humoral immunity and cell-mediated immunity, and the synergistic effect of both allows it to exhibit higher immune function activation. Furthermore, since the active ingredients are derived from natural products, it is possible to give the user a greater sense of security.
  • the vaccine adjuvant of the present invention can enhance immune function activity (immunogenicity) by using it together with an antigen. Furthermore, the immunity induction method of the present invention is safe and easy to use because the effects of humoral immunity and cell-mediated immunity can be obtained through simple steps.
  • FIG. 1 is a diagram showing a transmission electron micrograph of particles that are an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the particle size distribution of particles derived from licorice, which is an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the particle size distribution of yeast-derived particles according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the particle size distribution of particles derived from lactic acid bacteria, which is an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of a cell experiment (dendritic cell maturation) on the licorice-derived particles (CD40).
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of a cell experiment (dendritic cell maturation) on the licorice-derived particles (CD80).
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of cell experiments (dendritic cell maturation) on the licorice-derived particles (CD86). 7 is a diagram showing a comparison of the results of FIGS. 5, 6, and 7.
  • FIG. It is a figure showing the analysis results of a cell experiment (maturation of dendritic cells) for the particles derived from lactic acid bacteria (CD40).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of an animal experiment (subcutaneous immunization: antigen-specific antibody production) for the licorice-derived particles (total IgG).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of an animal experiment (subcutaneous immunization: antigen-specific antibody production) for the licorice-derived particles (IgG 1 ).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of an animal experiment (subcutaneous immunization: antigen-specific antibody production) for the licorice-derived particles (IgG 2c ).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of animal experiments (subcutaneous immunization: antigen-specific antibody production) for the licorice-derived particles (Examples 8 and 9). It is a figure showing the results of an animal experiment (subcutaneous immunization: antigen-specific antibody production) for the yeast-derived particles (OVA 1 ⁇ g). It is a figure showing the results of an animal experiment (subcutaneous immunization: antigen-specific antibody production) for the above-mentioned yeast-derived particles (OVA 10 ⁇ g).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of an animal experiment (subcutaneous immunization: T cell response) against the licorice-derived particles. It is a figure showing the results of an animal experiment (subcutaneous immunization: T cell response) against the above yeast-derived particles (OVA 1 ⁇ g). It is a figure showing the results of an animal experiment (subcutaneous immunization: T cell response) against the above yeast-derived particles (OVA 10 ⁇ g).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of an animal experiment (subcutaneous immunization: induction of antitumor immunity 1) for the licorice-derived particles (Example 15).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of an animal experiment (subcutaneous immunization: induction of antitumor immunity 1) for the licorice-derived particles (Comparative Example 16).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of an animal experiment (subcutaneous immunization: induction of antitumor immunity 1) for the licorice-derived particles (Comparative Example 17).
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of an animal experiment (subcutaneous immunization: induction of antitumor immunity 2) for the licorice-derived particles (E.G7-OVA cells).
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of an animal experiment (subcutaneous immunization: induction of antitumor immunity 2) for the licorice-derived particles (MC38 cells).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of an animal experiment (nasal immunization: antigen-specific antibody production) for the licorice-derived particles (total IgG).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of an animal experiment (nasal immunization: induction of antitumor immunity 1) for the licorice-derived particles (Example 17).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of an animal experiment (nasal immunization: induction of antitumor immunity 1) for the licorice-derived particles (Comparative Example 20).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of an animal experiment (nasal immunization: induction of antitumor immunity 1) for the licorice-derived particles (Comparative Example 21).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of an animal experiment (nasal immunization: induction of antitumor immunity 2) for the licorice-derived particles (E.G7-OVA cells).
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of an animal experiment (nasal immunization: induction of antitumor immunity 2) for the licorice-derived particles (MC38 cells).
  • the immune function activator of the present invention is composed of cell wall-derived polysaccharides and contains particles having a maximum diameter in the range of 1 to 800 nm as an active ingredient.
  • the immune function activator of the present invention can be widely used in the medical field, health promotion field, etc., and can be particularly effectively used in infectious disease treatment and cancer immunotherapy.
  • the concept also includes antiallergic agents and immunomodulators.
  • the active ingredient refers to an ingredient that can provide the effect of the present invention, ⁇ immune function activation'', and even if it is an ingredient that has the effect of ⁇ immune function activation'', its It does not include ingredients that are blended at concentrations that are ineffective.
  • the particles are composed of polysaccharides derived from cell walls, and the cell walls are found in cells of organisms belonging to the plant kingdom, fungi kingdom, protist kingdom, prokaryotes, and the like.
  • the above-mentioned organisms include primitive plants, ascomycetes, basidiomycetes, bacteria, etc., which are raw materials for crude drugs, and among them, licorice (Glycyrrhiza uralensis), ginger (Zingiber officinale), yeast, lactic acid bacteria, etc. is preferred.
  • polysaccharides examples include cellulose, hemicellulose, pectin, and the like.
  • constituent sugars of the polysaccharide include glucose, xylose, galactose, fucose, cellotriose, cellotetraose, xylan, arabinose, mannose, rhamnose, and the like.
  • the particles that are the active ingredient of the present invention have a maximum diameter of 1 to 800 nm, more preferably 10 to 800 nm, still more preferably 30 to 500 nm, even more preferably 40 to 300 nm, and a shape of The shapes are spherical, ellipsoidal, and disk-shaped (like red blood cells), but are not limited thereto, and spherical shapes are preferred.
  • the "maximum diameter of a particle” refers to the diameter when the particle is spherical, and the maximum length when the particle has another shape.
  • the diameter of the particles can be determined, for example, by dispersing the obtained particles in ultrapure water and measuring the dispersion using a dynamic light scattering method. When particle diameter is measured using dynamic light scattering, the calculated average particle diameter is the maximum diameter of the particle, and it is sufficient that the calculated average particle diameter is within the range specified by the maximum diameter. .
  • the above-mentioned particles usually have a shape as shown by the symbol A in the electron microscope image of FIG. 1, and preferably have a spherical shape.
  • the above-mentioned sphere includes not only a true sphere but also shapes such as an ellipsoid.
  • Particle A in FIG. 1 is derived from licorice, and the negatively stained particle A was photographed using a transmission electron microscope.
  • the structure can be seen as a two-layer structure, a double-layer structure, a multi-layer structure, or a multi-layer structure. From this, it is considered that the particles that are the active ingredient of the present invention have different electron densities at least in the outermost layer and in the inside.
  • the particles that are the active ingredient of the present invention have good dissolution resistance and dispersibility in both aqueous and oil-based liquids, and have particularly high dispersibility in aqueous liquids. Moreover, its excellent dispersibility is maintained for a long period of time.
  • the dispersibility of the particles can be determined, for example, by dispersing the obtained particles in ultrapure water, photographing the dispersion using a transmission electron microscope, and observing the degree of dispersion. Further, by comparing the above-mentioned dispersion with that after storage for a certain period of time, the degree of retention of dispersibility can be determined.
  • the particles that are the active ingredient of the present invention have excellent pressure resistance and heat resistance, and there is almost no change in particle size when pressurized to at least 2 atmospheres or heated to 121°C.
  • the pressure resistance and heat resistance of particles can be determined, for example, by measuring the particle size distribution using dynamic light scattering for particles dispersed in ultrapure water and particles contained in this dispersion liquid under pressure and heat. This can be determined from the fact that the particle size distribution does not change between the two when calculated and compared.
  • the particles that are the active ingredient of the present invention have excellent cold resistance and drying resistance, and there is almost no change in particle size when cooled to -50 to -80°C and dried.
  • the cold resistance and drying resistance of particles include, for example, particles dispersed in ultrapure water, and those obtained by freeze-drying this dispersion (-50°C) and dispersing the dried product again in ultrapure water.
  • the particle size distribution is calculated using a dynamic light scattering method, and when the two are compared, discrimination can be made based on the fact that the particle size distribution does not change. Further, even if the particles contained in the above freeze-dried product were stored at -80°C for 7 days and then dispersed in ultrapure water, there was no change in the particle size distribution.
  • the particles that are the active ingredient of the present invention can be produced, for example, by a method comprising a step of dissolving cell walls and a step of separating the particles from the lysate obtained by the step.
  • Examples of the step of dissolving the cell wall include heat treatment, ultrasonic treatment, treatment with degrading enzymes, alkaline decomposition treatment, and the like. These can be used alone or in combination. Among these, from the viewpoint of efficiency and health considerations, heat treatment and treatment with degrading enzymes are preferred, and heat treatment is particularly preferred.
  • Examples of the above-mentioned heat treatment include immersing an organism having a cell wall in a liquid and heating the organism together with the liquid to dissolve the components constituting the cell wall in the liquid to obtain a dissolved product.
  • an organism having a cell wall is prepared as a material. This living organism may be in any state, but from the viewpoint of efficiency, it is preferably dried and crushed.
  • the organism prepared above is immersed in a separately prepared liquid and heated, usually at 60° C. or higher, for 3 minutes or more to obtain a dissolved product. Note that there is a tendency that the longer the heating time, the higher the yield.
  • liquid liquids used as various solvents such as water and alcohol may be used alone or in combination of two or more. However, considering that the particles will be administered subcutaneously, nasally, orally, water or an aqueous liquid is preferably used from the viewpoint of health considerations.
  • dissolving the components constituting the cell wall refers to disrupting the structure of the cell wall by separating the basic skeleton and the substrate, etc., and forming a system in which the components are dispersed in the liquid. It also includes dispersing polysaccharide, which is one of the components, in a liquid by, for example, decomposing it into smaller pieces.
  • the step of separating the particles, which are the active ingredients of the present invention, from the lysate obtained in the above step includes, for example, centrifugation, filter filtration, ultrafiltration, ultracentrifugation, and the like.
  • a more suitable one is used depending on the type of organism having a cell wall to be used as the material.
  • centrifugation and filter filtration are preferred from the viewpoint of ease of operation, and it is preferred to use a combination of these from the viewpoint of increasing the degree of purification.
  • the above-mentioned centrifugation includes, for example, a method of centrifuging the lysate at 10,000 to 1,000,000 x g and collecting the supernatant (crude separation step). Furthermore, in order to further increase the degree of purification, for example, the supernatant may be filtered through a filter with a pore size of 0.22 to 0.45 ⁇ m to obtain a filtrate (precision separation step).
  • the particles that are the active ingredients of the present invention can be produced using methods that aim to replace the terminal molecules of components constituting cell walls, such as cellulose (e.g., methods using caustic soda, hydrochloric acid, etc.). ), it is also highly safe.
  • the immune function activator of the present invention has the thus obtained particles derived from natural products as an active ingredient, and may consist only of particles or may contain other ingredients. It may be something that you have.
  • ingredients used together with the particles include, for example, ingredients with pharmacological effects, additives, and the like.
  • additives include bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, humectants, colorants, and fragrances. , chelating agents, etc.
  • the immune function activator of the present invention can induce the maturation of dendritic cells, it can more efficiently enhance both humoral immunity and cell-mediated immunity.
  • the immune function activator of the present invention can induce antigen-specific IgG production, as well as CD8 + T cell responses and anti-tumor immunity. Through the synergistic effect of these, immune function activation can be achieved more effectively.
  • the route of administration of the immune function activator of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect is obtained, and the administration route may be either enteral or parenteral administration.
  • enteral administration include nasal administration, oral administration, tube feeding, and enema administration.
  • parenteral administration include intravenous administration, transarterial administration, transpulmonary administration, intravascular administration, intramuscular administration, intracardiac administration, subcutaneous administration, intradermal administration, and intraperitoneal administration.
  • subcutaneous administration or nasal administration is used as the administration route, an immune response can be induced more reliably.
  • the immune function activator of the present invention can be used in any form, including oral and parenteral formulations.
  • oral dosage forms include tablets (including orally disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, troches, jelly drops, etc.), pills, granules, fine granules, powders, and hard capsules. , soft capsules, dry syrups, liquids (including drinks, suspensions, and syrups), and jelly preparations.
  • parenteral preparation forms examples include injection preparations (intravenous injections, intravenous injections, intramuscular injections, subcutaneous injections, intradermal injections, etc.), external preparations (ointments, poultices, lotions, etc.) , suppository inhalers, eye drops, eye ointments, nasal drops, ear drops, liposomes, etc.
  • the immune function activator of the present invention can be used in compositions such as food additives, food compositions (including health foods, health promoters, and nutritional supplements (supplements, etc.)), cosmetics, etc. It can also be used as a component.
  • the shape of the food additives etc. may be, for example, tablets (orally disintegrating tablets), Chewable tablets, effervescent tablets, troches, jelly drops, etc.), pills, granules, fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, dry syrups, liquids (suspensions, syrups) ), jelly preparations, etc.
  • the food composition may be in the form of, for example, a liquid, gel, or solid food, drink (e.g., juice, soft drink, tea, soup, etc.). (soy milk, etc.), salad oil, dressing, yogurt, jelly, pudding, furikake, powdered milk for infants, cake mix, dairy products (e.g., powder, liquid, gel, solid, etc.), bread, confectionery (e.g., cookies, etc.) etc.
  • the vaccine adjuvant of the present invention is composed of cell wall-derived polysaccharide particles whose maximum diameter is in the range of 1 to 800 nm as an active ingredient.
  • the above-mentioned particles are the same as those explained for the immune function activating agent of the present invention, and exhibit the same effects.
  • the above-mentioned vaccine adjuvant usually refers to a substance that, when used in combination with an antigen, increases its antigenicity and facilitates the induction of an immune response. That is, vaccines that are injected after purifying some of the antigen components are generally less effective and require the use of an adjuvant. Furthermore, recent vaccine development has not only targeted infectious diseases, but also non-infectious diseases such as cancer, Alzheimer's disease, lifestyle-related diseases such as diabetes and hypertension, pollen and food allergies, and autoimmune diseases. It has become. However, the targets of vaccines aimed at the above-mentioned non-infectious diseases usually cannot induce an immune response, making it difficult to obtain the desired effects. Therefore, there is a need for the development of an adjuvant that can induce a strong immune response even when the non-infectious diseases mentioned above are targeted for vaccination.
  • the vaccine adjuvant of the present invention meets the above-mentioned needs, and can not only be used in vaccines to be inoculated by purifying some antigen components, but also to enhance the induction of humoral immunity and/or cell-mediated immunity. As a result, a strong immune response can be induced even when vaccines target non-infectious diseases such as those mentioned above.
  • the vaccine adjuvant of the present invention may be administered by any method as long as it facilitates the induction of an immune response, but subcutaneous or nasal administration is preferable, since systemic immunity and mucosal immunity can be induced with minimal invasion. Therefore, nasal administration is preferred.
  • the immunity induction method of the present invention has a step of administering the above-mentioned immune function activating agent, and the step of administering the above-mentioned immune function activating agent includes administering the above-mentioned immune function activating agent for a certain period of time. After the time has elapsed, a step of further administering and adding the above-mentioned immune function activating agent is included.
  • the immune function activator may be administered by any method in the step of administering the immune function activator as long as an immune response can be induced.
  • the pellets remaining on the bottom of the container were redispersed with ultrapure water and mixed in the above manner.
  • dialysis was performed in ultrapure water for one day using a dialysis membrane with a molecular weight cutoff (MWCO) of 50 kDa, and the product was freeze-dried.
  • MWCO molecular weight cutoff
  • the particle size distribution of the obtained particles is shown in FIG. 2, and the recovered amount, average particle diameter, polydispersity index, and zeta potential are shown in Table 1 below.
  • yeast-derived particles 100 g of yeast (dried product) was placed in 1 L of ultrapure water, heated at 90° C. for 3 hours, allowed to cool, and then centrifuged at 12,300 ⁇ g for 30 minutes to remove the coarse fraction. The supernatant was collected and centrifuged again at 140,000 xg for 60 minutes. The supernatant was removed, and the pellet, which was an aggregate of particles remaining on the bottom of the container, was redispersed with ultrapure water and freeze-dried.
  • the particle size distribution of the obtained particles is shown in FIG. 3, and the recovered amount, average particle diameter, and polydispersity index are shown in Table 2 below.
  • the particle size distribution of the obtained particles is shown in FIG. 4, and the recovered amount, average particle diameter, and polydispersity index are shown in Table 3 below.
  • the particles obtained above were first subjected to a cell experiment using a mouse dendritic cell line (DC2.4 cells) to examine the maturation of dendritic cells.
  • animal experiments subcutaneous immunization
  • antigen-specific antibody production was investigated for the particles obtained above, and the following items were investigated: antigen-specific antibody production, cell response, and induction of anti-tumor immunity (1) and (2).
  • Each experiment was conducted under the following conditions.
  • a mouse dendritic cell line in which nothing was allowed to act was designated as Comparative Example 1A, and 100 ⁇ g/mL of the licorice decoction (before various purifications) obtained in the above licorice-derived particle production process was made to act.
  • the expression level of each maturation marker was measured in the same manner as in Example 1 using Comparative Example 1B as Comparative Example 1B and Reference Example 1 on which 0.1 ⁇ g/mL of lipopolysaccharide (LPS) was applied as a positive control.
  • LPS lipopolysaccharide
  • yeast-derived particles [Examples 2 and 3, Comparative Example 2 and Reference Example 2] As Examples 2 and 3, the yeast-derived particles obtained above were allowed to act on a mouse dendritic cell line (DC2.4 cells 5 x 10 5 cells/2 mL) at the concentrations shown in Table 4 below, and incubated at 37°C. After culturing for 24 hours, the expression levels of dendritic cell maturation markers CD40, CD80, and CD86 were measured. On the other hand, Comparative Example 2 is a mouse dendritic cell line in which nothing was applied, and Reference Example 2 is a positive control in which 0.1 ⁇ g/mL of lipopolysaccharide (LPS) was applied. The expression level of each maturation marker was measured in the same manner as in 3. These results were analyzed by flow cytometry, and the expression rates of each maturation marker are also shown in Table 4 below.
  • a mouse dendritic cell line DC2.4 cells 5 x 10 5 cells/2 mL
  • LPS lipopolysacchari
  • Example 7 Animal experiment (subcutaneous immunization): Antigen-specific antibody production> (2-1) Particles derived from licorice [Example 7, Comparative Examples 4 and 5] As Example 7, a mouse (C57BL/6J, 6 weeks old, female) was subcutaneously immunized on the back of a mouse (C57BL/6J, 6 weeks old, female) with 100 ⁇ g of the licorice-derived particles obtained above and 100 ⁇ g of the model antigen chicken ovalbumin (OVA).
  • OVA model antigen chicken ovalbumin
  • antigen-specific IgG could be induced by immunization using a combination of antigen and licorice-derived particles. Further, based on the contents shown in FIGS. 11 and 12, subclass analysis of the induced total IgG was performed, and induction of antigen-specific IgG 1 and IgG 2C was observed. On the other hand, when immunized with antigen alone, Th2 type immune response was dominant (see Comparative Example 5). Thus, it was revealed that Example 7 is useful as an immune function activator capable of efficiently inducing a Th1 type immune response. Incidentally, antigen information presented by antigen-presenting cells, mainly dendritic cells, is transmitted to T cells and induces antigen-specific acquired immunity.
  • antigen-presenting cells mainly dendritic cells
  • the above-mentioned acquired immunity is divided into humoral immunity and cell-mediated immunity.
  • Humanmoral immunity aims to produce antibodies against targets (pathogens, cancer cells, etc.), and cell-mediated immunity is the action of cytotoxic T cells. Aims to eliminate the target of action based on direct injury to the target. Therefore, it is desirable that the immune function activator be capable of inducing both humoral immunity and cell-mediated immunity.
  • IgG 2c is an antibody produced in response to cell-mediated immunity (Th1) type cytokines among antibodies.
  • Example 8 is a sample immunized in the same manner as in Example 7 except that the amount of OVA used as the antigen was changed to 1 ⁇ g, and a sample immunized in the same manner as in Example 7 except that the amount of OVA was changed to 10 ⁇ g.
  • total IgG was measured in the same manner as in Example 7. The results are shown in FIG. 13 together with the total IgG of Example 7 and Comparative Example 4.
  • an antigen amount of 1 ⁇ g induced antibody production equivalent to an antigen amount of 100 ⁇ g it was found that even an antigen amount of 1 ⁇ g induced antibody production equivalent to an antigen amount of 100 ⁇ g. It is preferable that the dose of antigens derived from pathogens or cancer cells during immunization be as small as possible from the viewpoints of preparation time, economic costs, safety, and the like.
  • the immune function activator of the present invention is superior in terms of time, economic cost, and safety because even 1 ⁇ g, which suppresses the amount of antigen to one-hundredth, yields the same antibody titer as 100 ⁇ g, and high immune function is observed. I can see that it is something.
  • Example 10 OVA 1 ⁇ g
  • a sample was immunized in the same manner except that yeast-derived particles were not used, as Comparative Example 6, and a sample that was not immunized at all as Comparative Example 7.
  • Reference Example 3 was prepared by using 1 mg of an aluminum hydroxide/magnesium hydroxide preparation (manufactured by Thermo Scientific, Inc., Impact Alum Adjuvant) (hereinafter referred to as "Alum”) as a positive control instead.
  • Al aluminum hydroxide/magnesium hydroxide preparation
  • Example 11 a sample was immunized in the same manner except that no yeast-derived particles were used, and this was designated as Comparative Example 8, and a sample that was not immunized at all was designated as Comparative Example 9, and yeast-derived particles were Reference Example 4 was prepared using Alum (1 mg) as a positive control instead of .
  • the antibody titers of these were measured in the same manner as in Examples 10 and 11, and the total IgG antibody titers are also shown in FIGS. 14 and 15. Note that individuals with an antibody titer of 5 or less are calculated as 5.
  • both Examples showed a significant increase in antibody titer compared to the Comparative Example, regardless of whether the antigen amount was 1 ⁇ g or 10 ⁇ g. .
  • These antibody titers were equivalent to those of the positive control Alum, and both were found to have a high antibody production enhancing effect.
  • splenocytes were stimulated under the conditions shown in (a) to (d) below, and the amount of IFN- ⁇ in the cell supernatant was measured by ELISA after 3 days. The results are also shown in FIG. (a) OVA 10 ⁇ M (b) OVA-derived MHC class I epitope peptide (SL8) 100 nM (c) OVA-derived MHC class I epitope peptide (SL8) 10 ⁇ M (d) No stimulation (non)
  • Example 12 As shown in FIG. 16, higher IFN- ⁇ production was observed in Example 12 than in Comparative Examples 10 and 11 in both restimulations, indicating that it was possible to induce particularly antigen-specific CD8 + T cell responses.
  • stimulation with OVA-derived MHC class I epitope peptide (SL8) can specifically activate CD8 + T cells
  • the immune function activator of the present invention also has excellent effects on cell-mediated immunity. It can be said that it plays.
  • Yeast-derived particles [Examples 13 and 14, Comparative Examples 12 to 15 and Reference Examples 5 and 6] As Examples 13 and 14, 100 ⁇ g of the yeast-derived particles obtained above and 1 ⁇ g (Example 13) or 10 ⁇ g (Example 14) of OVA were added to the dorsal region of a mouse (C57BL/6J, 6 weeks old, female). were immunized subcutaneously. The above subcutaneous immunization was performed again 7 days later (number of subcutaneous immunizations: 2 times in total), and splenocytes were collected 7 days after the last subcutaneous immunization.
  • Comparative Example 12 is a sample in which no immunization was performed in Example 13, and Comparative Example 13 is a sample that was immunized in the same manner except that yeast-derived particles were not used.
  • Reference Example 5 used Alum (1 mg) as a positive control.
  • Comparative Example 14 is a sample in which no immunization was performed in Example 14, and Comparative Example 15 is a sample that was immunized in the same manner except that yeast-derived particles were not used.
  • Reference Example 6 used Alum (1 mg) as a positive control. The splenocytes were collected in the same manner as in Examples 13 and 14, respectively.
  • splenocytes were stimulated under the conditions shown in (a) to (d) below, and the amount of IFN- ⁇ in the cell supernatant was measured by ELISA after 3 days. The results were also shown in FIGS. 17 and 18.
  • (a) OVA 10 ⁇ M (b) OVA-derived MHC class I epitope peptide (SL8) 0.1 ⁇ M (c) OVA-derived MHC class I epitope peptide (SL8) 10 ⁇ M (d) No stimulation (non)
  • Example 13 higher T cell responses than in Comparative Examples 12 and 13 were observed upon restimulation with 10 ⁇ M OVA upon immunization with 1 ⁇ g OVA. Furthermore, as shown in FIG. 18, in Example 14, high CD8 + T cell responses were observed upon immunization with OVA (10 ⁇ g) and upon restimulation with any SL8. Since these T cell responses were not observed in Reference Examples 5 and 6, they can be said to be one of the useful effects of the immune function activating agent of the present invention.
  • Example 15 Animal experiment (subcutaneous immunization): Induction of antitumor immunity (1)> [Example 15] As Example 15, a mouse (C57BL/6J, 6 weeks old, female) was subcutaneously immunized with 100 ⁇ g of the licorice-derived particles obtained above together with 100 ⁇ g of OVA on the back of a mouse (C57BL/6J, 6 weeks old, female). The above subcutaneous immunization was performed again 7 days later (number of subcutaneous immunizations: 2 times in total), and 7 days after the last subcutaneous immunization, an OVA-expressing lymphoma cell line (E.G7-OVA) was placed on the back of the mouse. 1 ⁇ 10 6 cells were transplanted, and changes in tumor volume (mm 3 ) with the number of days after transplantation were measured. The measured results are shown in FIG. 19.
  • E.G7-OVA OVA-expressing lymphoma cell line
  • Comparative Example 16 was a sample that was immunized in the same manner except that licorice-derived particles were not used, and Comparative Example 17 was a sample that was not immunized at all, and changes in tumor volume were measured in the same manner as in Example 15.
  • the results of Comparative Example 16 are shown in FIG. 20, and the results of Comparative Example 17 are shown in FIG.
  • Example 15 tumor engraftment and growth were not observed in all mice (rejection rate 5/5). It can be said that the effectiveness of the system has been recognized. On the other hand, in Comparative Examples 16 and 17, an increase in tumor volume was observed as shown in FIG. 20 (rejection rate 0/5) and FIG. 21 (rejection rate 1/5).
  • mice that rejected the cancer cells in Example 15 rejected the cancer cells again when the cancer cells were retransplanted 70 days later. It can be said that induction of immunological memory in cells was observed.
  • the mice that rejected the OVA-expressing lymphoma cell line (E.G7-OVA) transplanted in Example 15 did not reject the colon cancer cell line (MC38).
  • the mice that rejected the OVA-expressing lymphoma cell line (E.G7-OVA) transplanted in Example 15 rejected the OVA-expressing lymphoma cell line (E.G7-OVA) again. Therefore, it can be said that the effect of enhancing the immune response by the immune function activator of the present invention is antigen-specific and cell-specific, and does not induce immune responses other than the target of action.
  • the particles were proven to activate immune function. Therefore, the immune function activator having the above-mentioned particles as an active ingredient is derived from cell walls (derived from natural products) and can enhance the induction of both humoral immunity and cell-mediated immunity. It has both efficacy and safety for the human body.
  • Example 16 Animal experiment (nasal immunization): Antigen-specific antibody production>
  • a mouse C57BL/6J, 6 weeks old, female was intranasally immunized with the licorice-derived particles (100 ⁇ g) and OVA (100 ⁇ g) obtained above.
  • the above nasal immunization was performed again 7 days later (number of nasal immunizations: 2 times in total), blood was collected 7 days after the last nasal immunization, and the total IgG antibody titer was measured.
  • Comparative Example 18 is a sample in which no immunization was performed in Example 16, and Comparative Example 19 is a sample that was immunized in the same manner except that licorice-derived particles were not used.
  • the IgG antibody titer is shown in FIG. 24.
  • Example 16 As shown in FIG. 24, the antibody titer in Example 16 is significantly increased compared to Comparative Examples 18 and 19. From this, it is recognized that the immune function activating agent of the present invention has a high antibody production enhancing effect even in nasal immunization.
  • Example 17 Animal experiment (nasal immunization): Induction of antitumor immunity (1)> [Example 17] A mouse (C57BL/6J, 6 weeks old, female) was intranasally immunized with the licorice-derived particles (100 ⁇ g) and OVA (100 ⁇ g). The above nasal immunization was performed again 7 days later (number of nasal immunizations: 2 times in total), and 7 days after the last nasal immunization, the OVA-expressing lymphoma cell line (E.G7 - OVA) was transplanted at 1 ⁇ 10 6 cells, and changes in tumor volume (mm 3 ) with the number of days after transplantation were measured. The measured results are shown in FIG. 25.
  • E.G7 - OVA OVA-expressing lymphoma cell line
  • Comparative Example 20 was a sample that was immunized in the same manner except that licorice particles were not used, and Comparative Example 21 was a sample that was not immunized at all, and changes in tumor volume (mm 3 ) were measured in the same manner as in Example 17. .
  • the results of Comparative Example 20 are shown in FIG. 26, and the results of Comparative Example 21 are shown in FIG. 27.
  • E.G7-OVA OVA-expressing lymphoma cell line
  • the mice that rejected the cancer cells in Example 17 rejected the cancer cells again when the cancer cells were retransplanted 70 days after the transplantation, so the immune function activation of the present invention
  • the drug has been shown to induce immune memory against cancer cells even after nasal immunization.
  • the mice that rejected the cancer cells in Example 17 did not reject the colon cancer cell line (MC38) that did not express OVA. From this, it can be said that the effect of enhancing the immune response by nasal immunization of the immune function activating agent of the present invention is antigen-specific and cell-specific, and does not induce immune responses other than the target of action.
  • an immune function activating agent containing the above particles as an active ingredient is also effective in nasal immunization.
  • nasal administration it can also be said to be effective through transmucosal administration, such as through the vagina, eyes, and oral cavity. That is, the immune function activator of the present invention can induce an immune response not only in the systemic immunity but also in the mucosal surface, and can be expected to be effective against pathogens that infect via the mucosal surface.
  • nasal immunization is non-invasive and can reduce medical waste, so it has practical advantages.
  • the immune function activator of the present invention is industrially useful as an immune function activator that is both effective in activating the immune function and safe for the human body.
  • the vaccine adjuvant of the present invention is industrially useful as a vaccine adjuvant used for cancer immunotherapy as well as various infectious diseases.
  • the immunity induction method of the present invention is industrially useful because it is highly safe for the human body and requires only simple steps.

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Abstract

体液性免疫および細胞性免疫のいずれの誘導をも増強することができ、有効成分が細胞壁由来（天然物由来）である免疫機能活性化剤、ワクチンアジュバントおよび上記免疫機能活性化剤を投与する工程を有する免疫誘導方法を提供するため、本発明の免疫機能活性化剤は、最大径が１～８００ｎｍの範囲にある粒子を有効成分とし、前記粒子が細胞壁由来の多糖類からなる。

Description

免疫機能活性化剤、ワクチンアジュバントおよび免疫誘導方法
　本発明は、細胞壁由来の多糖類からなる最大径が１～８００ｎｍの粒子を有効成分とする免疫機能活性化剤、上記免疫機能活性化剤を有するワクチンアジュバント、上記免疫機能活性化剤を投与する工程を有する免疫誘導方法に関する。
　感染症治療や、がん免疫療法等の医療分野においては、従来、免疫賦活活性を向上させるために、様々な予防法および治療方法が検討されており、例えば、特許文献１では、細胞性の免疫の誘導作用が高い免疫賦活剤が提案されている。また、これらの医療分野においては、その予防法や治療方法に用いるアジュバントについても、現在までに様々なものが開発されている。このような状況下において、免疫機能活性化の有効性と、人体に対する安全性を兼ね備える免疫機能活性化剤のさらなる開発が望まれている。
特開２０２０－０９０４４５号公報
　そこで、本発明ではこのような背景下において、体液性免疫および細胞性免疫のいずれの誘導をも増強することができ、しかも、有効成分が細胞壁由来（天然物由来）であり、消費者に対して安心感を与えることができる免疫機能活性化剤、上記免疫機能活性化剤を有するワクチンアジュバントおよび上記免疫機能活性化剤を投与する工程を有する免疫誘導方法を提供する。
　しかるに、本発明者等はかかる事情に鑑み、まず、天然物から得られる物質の検討を行った。なかでも、近年見出された、天然物から得られる粒径の小さい粒子に様々な特性があることに着目し、さらに研究を重ねた。その結果、天然物のなかでも、細胞壁由来の多糖類からなる最大径が１～８００ｎｍの範囲にある粒子が、体液性免疫および細胞性免疫の誘導を増強することができることを見出した。
　即ち、本発明の要旨は、次のとおりである。
［１］　最大径が１～８００ｎｍの範囲にある粒子を有効成分とする免疫機能活性化剤であって、前記粒子が細胞壁由来の多糖類からなるものである免疫機能活性化剤。
［２］　前記粒子が甘草、酵母、乳酸菌からなる群から選ばれる少なくとも一つを由来とするものである［１］記載の免疫機能活性化剤。
［３］　感染症治療および／またはがん免疫療法において用いられるものである［１］または［２］記載の免疫機能活性化剤。
［４］　体液性免疫および／または細胞性免疫を誘導するものである［１］～［３］のいずれかに記載の免疫機能活性化剤。
［５］　皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経肺投与、血管内投与、経鼻投与、経口投与からなる群から選ばれる少なくとも一つの投与法で投与される［１］～［４］のいずれかに記載の免疫機能活性化剤。
［６］　最大径が１～８００ｎｍの範囲にある粒子を有効成分とするワクチンアジュバントであって、前記粒子が細胞壁由来の多糖類からなるものであるワクチンアジュバント。
［７］　皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経肺投与、血管内投与、経鼻投与、経口投与からなる群から選ばれる少なくとも一つの投与法で投与される［６］記載のワクチンアジュバント。
［８］　［１］～［５］のいずれかに記載の免疫機能活性化剤を投与する工程を有する免疫誘導方法。
［９］　前記免疫機能活性化剤を投与する工程が、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経肺投与、血管内投与、経鼻投与、経口投与からなる群から選ばれる少なくとも一つの投与法により前記免疫機能活性化剤を投与するものである［８］記載の免疫誘導方法。
　本発明の免疫機能活性化剤は、体液性免疫および細胞性免疫のいずれについても誘導作用が高く、両者の相乗効果によって、より高い免疫機能活性化を発揮することができる。また、有効成分が天然物由来であり、使用者に対してより安心感を与えることができる。
　そして、本発明のワクチンアジュバントは、抗原とともに用いることで免疫機能活性（免疫原性）を高めることができる。
　さらに、本発明の免疫誘導方法は、簡便な工程を経由するだけで体液性免疫および細胞性免疫の効果が得られるため、安全で使い勝手がよい。
本発明の一実施の形態である粒子の透過型電子顕微鏡写真を示した図である。 本発明の一実施の形態である甘草由来の粒子の粒度分布を示した図である。 本発明の一実施の形態である酵母由来の粒子の粒度分布を示した図である。 本発明の一実施例の形態である乳酸菌由来の粒子の粒度分布を示した図である。 上記甘草由来の粒子に対する細胞実験（樹状細胞の成熟化）の結果を示した図である（ＣＤ４０）。 上記甘草由来の粒子に対する細胞実験（樹状細胞の成熟化）の結果を示した図である（ＣＤ８０）。 上記甘草由来の粒子に対する細胞実験（樹状細胞の成熟化）の結果を示した図である（ＣＤ８６）。 図５，図６、図７の結果を対比して示した図である。 上記乳酸菌由来の粒子に対する細胞実験（樹状細胞の成熟化）の解析結果を示した図である（ＣＤ４０）。 上記甘草由来の粒子に対する動物実験（皮下免疫：抗原特異的な抗体産生）の結果を示した図である（トータルＩｇＧ）。 上記甘草由来の粒子に対する動物実験（皮下免疫：抗原特異的な抗体産生）の結果を示した図である（ＩｇＧ1）。 上記甘草由来の粒子に対する動物実験（皮下免疫：抗原特異的な抗体産生）の結果を示した図である（ＩｇＧ2c）。 上記甘草由来の粒子に対する動物実験（皮下免疫：抗原特異的な抗体産生）の結果を示した図である（実施例８，９）。 上記酵母由来の粒子に対する動物実験（皮下免疫：抗原特異的な抗体産生）の結果を示した図である（ＯＶＡ１μｇ）。 上記酵母由来の粒子に対する動物実験（皮下免疫：抗原特異的な抗体産生）の結果を示した図である（ＯＶＡ１０μｇ）。 上記甘草由来の粒子に対する動物実験（皮下免疫：Ｔ細胞応答）の結果を示した図である。 上記酵母由来の粒子に対する動物実験（皮下免疫：Ｔ細胞応答）の結果を示した図である（ＯＶＡ１μｇ）。 上記酵母由来の粒子に対する動物実験（皮下免疫：Ｔ細胞応答）の結果を示した図である（ＯＶＡ１０μｇ）。 上記甘草由来の粒子に対する動物実験（皮下免疫：抗腫瘍免疫の誘導１）の結果を示した図である（実施例１５）。 上記甘草由来の粒子に対する動物実験（皮下免疫：抗腫瘍免疫の誘導１）の結果を示した図である（比較例１６）。 上記甘草由来の粒子に対する動物実験（皮下免疫：抗腫瘍免疫の誘導１）の結果を示した図である（比較例１７）。 上記甘草由来の粒子に対する動物実験（皮下免疫：抗腫瘍免疫の誘導２）の結果を示した図である（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞）。 上記甘草由来の粒子に対する動物実験（皮下免疫：抗腫瘍免疫の誘導２）の結果を示した図である（ＭＣ３８細胞）。 上記甘草由来の粒子に対する動物実験（経鼻免疫：抗原特異的な抗体産生）の結果を示した図である（トータルＩｇＧ）。 上記甘草由来の粒子に対する動物実験（経鼻免疫：抗腫瘍免疫の誘導１）の結果を示した図である（実施例１７）。 上記甘草由来の粒子に対する動物実験（経鼻免疫：抗腫瘍免疫の誘導１）の結果を示した図である（比較例２０）。 上記甘草由来の粒子に対する動物実験（経鼻免疫：抗腫瘍免疫の誘導１）の結果を示した図である（比較例２１）。 上記甘草由来の粒子に対する動物実験（経鼻免疫：抗腫瘍免疫の誘導２）の結果を示した図である（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞）。 上記甘草由来の粒子に対する動物実験（経鼻免疫：抗腫瘍免疫の誘導２）の結果を示した図である（ＭＣ３８細胞）。
　以下、本発明について具体的に説明する。
　ただし、本発明は、次に説明する実施形態に限定されるものではない。
　また、本発明において「Ｘ～Ｙ」（Ｘ，Ｙは任意の数字）と表現する場合、特にことわらない限り「Ｘ以上Ｙ以下」の意と共に、「好ましくはＸより大きい」または「好ましくはＹより小さい」の意も包含する。
　そして、「Ｘおよび／またはＹ（Ｘ，Ｙは任意の構成）」とは、ＸおよびＹの少なくとも一方を意味するものであって、Ｘのみ、Ｙのみ、Ｘ及びＹ、の３通りを意味するものである。
＜免疫機能活性化剤＞
　本発明の免疫機能活性化剤は、細胞壁由来の多糖類からなり、最大径が１～８００ｎｍの範囲にある粒子を有効成分とするものである。そして、本発明の免疫機能活性化剤は、医療分野および健康増進分野等に広く用いることができ、なかでも、感染症治療、がん免疫療法において効果的に用いることができる。また、抗アレルギー剤、免疫調整剤も含む概念である。
　なお、本発明において、有効成分とは、本発明の効果である「免疫機能活性化」が得られる成分を意味するものであり、仮に「免疫機能活性化」効果がある成分であってもその効果が得られない程度の濃度で配合される成分は含まれない。
　まず、本発明の有効成分である粒子について説明する。上記粒子は、細胞壁由来の多糖類からなり、上記細胞壁は、植物界に属する生物、菌界に属する生物、原生生物界に属する生物、原核生物界に属する生物等の細胞にみられる。上記生物として、好ましくは、生薬の原材料となる基原植物、子のう菌、担子菌、細菌等があげられ、なかでも、カンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ　ｕｒａｌｅｎｓｉｓ）、ショウキョウ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、酵母、乳酸菌等が好ましい。
　上記多糖類としては、例えば、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン等があげられる。上記多糖類の構成糖としては、例えば、グルコース、キシロース、ガラクトース、フコース、セロトリオース、セロテトラオース、キシラン、アラビノース、マンノース、ラムノース等があげられる。
　本発明の有効成分である粒子は、最大径が１～８００ｎｍであり、１０～８００ｎｍであることがより好ましく、さらに好適には３０～５００ｎｍであり、さらに好適には４０～３００ｎｍであり、形状は、球体、楕円体、円盤型（赤血球のような形状）であるがこれに限定されず、中でも球体が好ましい。そして、本発明において「粒子の最大径」とは、粒子が球体である場合にはその直径をいい、その他の形状である場合には、その最大長をいう。粒子の径は、例えば、得られた粒子を超純水に分散させ、その分散液を、動的光散乱法を用いて測定することができる。動的光散乱法を用いて粒子径を測定した場合、算出された平均粒子径をその粒子の最大径とし、算出された平均粒子径が、最大径で規定される範囲に入っていればよい。
　上記粒子は、通常、図１の電子顕微鏡画像において符号Ａで示すような形状をしており、好ましくは球体の形状をしている。上記球体には、真球だけでなく、楕円体等の形状も含まれる。図１の粒子Ａは甘草を由来とするものであり、ネガティブ染色した粒子Ａを、透過型電子顕微鏡で撮影したものである。
　上記粒子Ａは、電子顕微鏡で観察した際、その構造が、２層構造、２重膜構造、多層構造、多重膜構造にも見える。このことより、本発明の有効成分である粒子は、少なくとも最外層と内部とは異なる電子密度を有していると考えられる。
　本発明の有効成分である粒子は、水系および油系のいずれの液体に対する耐溶解性を有し分散性がよく、なかでも水系の液体に対する分散性が高い。また、その優れた分散性が長期間保たれる。上記粒子の分散性は、例えば、得られた粒子を超純水に分散させ、その分散液を透過型電子顕微鏡で撮影し、その分散の程度を観察することにより判別することができる。また、上記分散液を一定期間保存後のものと対比することにより、分散性保持の程度を判別することができる。
　本発明の有効成分である粒子は、耐圧性および耐熱性に優れ、少なくとも２気圧までの加圧、１２１℃までの加熱により粒子径の変化がほぼない。粒子の耐圧性、耐熱性は、例えば、超純水に分散させた粒子と、この分散液を加圧および加熱したものとに含まれる粒子について、それぞれ動的光散乱法で粒子径の分布を算出し、両者を対比したときに、両者において粒子径の分布が変動していないことから判別することができる。
　本発明の有効成分である粒子は、耐寒性および耐乾燥性に優れ、－５０～－８０℃までの冷却、乾燥により粒子径の変化がほぼない。粒子の耐寒性および耐乾燥性は、例えば、超純水に分散させた粒子と、この分散液を凍結乾燥（－５０℃）し、その乾燥物を再度超純水に分散させたものに含まれる粒子について、それぞれ動的光散乱法で粒子径の分布を算出し、両者を対比したときに粒子径の分布が変動していないことから判別することができる。また、上記凍結乾燥物を－８０℃で７日間保存後、超純水に分散させたものに含まれる粒子を、同様に対比させても粒子径の分布の変動はない。
　本発明の有効成分である粒子は、例えば、細胞壁を溶解する工程と、該工程により得られた溶解物から粒子を分離する工程とを備える方法により製造することができる。
　上記細胞壁を溶解する工程としては、例えば、加熱処理、超音波処理、分解酵素による処理、アルカリ分解処理等があげられる。これらは単独でもしくは組み合わせて用いることができる。なかでも、効率化と健康面への配慮の点から、加熱処理、分解酵素による処理が好ましく、とりわけ加熱処理が好ましい。
　上記加熱処理としては、例えば、細胞壁を有する生物を液体に浸漬し、この液体ごとその生物を加熱することにより、細胞壁を構成する成分を液体に溶解させて溶解物を得ることがあげられる。より詳しく説明すると、まず、材料となる、細胞壁を有する生物を準備する。この生物はどのような状態であってもよいが、効率化の点から、乾燥、粉砕されていることが好ましい。上記準備した生物を別途用意した液体に浸漬し、通常、６０℃以上で３分間以上、加熱し、溶解物を得る。なお、加熱時間が長いほど収率が高まる傾向がみられる。上記液体としては、水、アルコール等の各種溶媒として用いられる液体を単独もしくは２種以上混合して用いてもよい。しかし、粒子を、皮下投与、経鼻投与、経口投与等することを考慮すると、健康面への配慮の点から、水もしくは水系の液体が好ましく用いられる。
　なお、上記「細胞壁を構成する成分を溶解させる」とは、基本骨格と基質とを分離する等して細胞壁の構造を崩壊させ、液体中に該成分が分散した系を形成することをいい、該成分のひとつである多糖をサイズの小さいものに分解する等により、液体中に分散させることも含まれる。
　つぎに、上記工程により得られた溶解物から、本発明の有効成分である粒子を分離する工程としては、例えば、遠心分離、フィルターろ過、限外ろ過、超遠心分離等があげられる。これらは、材料となる細胞壁を有する生物の種類等に応じて、より適するものが用いられる。なかでも、操作の容易性の点から、遠心分離、フィルターろ過が好ましく、精製度を高める点から、これらを組み合わせて用いることが好ましい。
　上記遠心分離としては、粒子のサイズにもよるが、例えば、溶解物を１万～１００万×ｇで遠心分離し、その上清を採取する方法があげられる（粗分離工程）。さらに、より精製度を高めるために、例えば、上記上清をポアサイズ０．２２～０．４５μｍのフィルターでろ過し、そのろ液を得るようにしてもよい（精密分離工程）。
　このように、本発明の有効成分である粒子は、細胞壁を構成する成分、例えば、セルロース等に対し、末端分子の置換等を行うことを目的とする手法（例えば、苛性ソーダ、塩酸等を用いる手法）を採用していないため、安全性にも優れている。
　本発明の免疫機能活性化剤は、このようにして得られた、天然物を由来とする粒子を有効成分として有するものであり、粒子のみからなるものであってもよいし、他の成分を有するものであってもよい。
　本発明の有効成分である粒子とともに用いる他の成分としては、例えば、薬理作用を有する成分、添加剤等があげられる。上記添加剤としては、例えば、基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、増粘剤、保湿剤、着色剤、香料、キレート剤等があげられる。
　本発明の免疫機能活性化剤は、樹状細胞の成熟化を誘導することができるため、体液性免疫、細胞性免疫の双方をより効率的に高めることができる。また、抗原特異的ＩｇＧ産生を誘導することができ、また、ＣＤ８+Ｔ細胞応答および抗腫瘍免疫を誘導することができるため、本発明の免疫機能活性化剤は、体液性免疫および細胞性免疫の相乗効果によって、より効果的に免疫機能活性化を図ることができる。
　本発明の免疫機能活性化剤は、所望の効果が得られる限り投与経路は特に制限されず、経腸投与および非経腸投与のいずれであってもよい。
　上記経腸投与としては、例えば、経鼻投与、経口投与、経管栄養、注腸投与等があげられる。上記非経腸投与としては、経静脈投与、経動脈投与、経肺投与、血管内投与、筋肉内投与、心臓内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与等があげられる。
　なかでも、投与経路として、皮下投与、経鼻投与を用いると、より免疫応答をより確実に誘導することができる。
　本発明の免疫機能活性化剤は、任意の形状で用いることができ、経口製剤形態および非経口製剤形態のいずれの形態で用いることができる。
　上記経口製剤形態としては、例えば、錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤等があげられる。
　上記非経口製剤形態としては、例えば、注射用製剤（点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤等）、外用剤（軟膏剤、パップ剤、ローション剤等）、坐剤吸入剤、点眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等があげられる。
　本発明の免疫機能活性化剤は、医薬及び試薬以外にも、例えば食品添加剤、食品組成物（健康食品、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）を包含する）、化粧品などの組成物の成分としても用いることができる。
　本発明の免疫機能活性化剤を、食品添加剤、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）等の成分として用いる場合、上記食品添加物等の形状は、例えば、錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤等とすることができる。
　本発明の免疫機能活性化剤を、食品組成物として用いる場合、上記食品組成物の形状は、例えば、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、飲料（例えば、ジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳等）、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、乳製品（例えば、粉末状、液状、ゲル状、固形状等）、パン、菓子（例えば、クッキー等）等とすることができる。
＜ワクチンアジュバント＞
　本発明のワクチンアジュバントは、細胞壁由来の多糖類からなり、その最大径が１～８００ｎｍの範囲にある粒子を有効成分とするものである。上記粒子は、本発明の免疫機能活性化剤で説明したものと同じであり、同様の効果を奏するものである。
　上記ワクチンアジュバントとは、通常、抗原と併用することにより、その抗原性を高めて免疫応答を誘導しやすくする物質を意味する。
　すなわち、抗原の一部の成分を精製して接種するワクチンは、一般的に効果が弱いため、アジュバントの使用が必要である。
　さらに、近年のワクチン開発は感染症を対象とするだけでなく、がんやアルツハイマー、糖尿病や高血圧の生活習慣病、花粉や食物のアレルギー、自己免疫疾患等の非感染症にまで対象とするようになっている。しかし、上記非感染症を対象とするワクチンのターゲットは、通常、免疫反応が誘導できないため、所望の効果を得ることが困難である。
　よって、上記非感染症をワクチンの対象とした場合でも強い免疫反応を誘導することができるアジュバントの開発が求められている。
　本発明のワクチンアジュバントは、上記の要望に沿うものであり、抗原の一部の成分を精製して接種するワクチンに用いるだけでなく、体液性免疫および／または細胞性免疫の誘導を増強することができるため、上記のような非感染症をワクチンの対象とした場合でも強い免疫反応を誘導することができる。
　本発明のワクチンアジュバントは、免疫応答を誘導しやすくできる限り、どのような方法で投与してもよいが、皮下投与または経鼻投与が好ましく、低侵襲で全身免疫および粘膜免疫の誘導ができる点で、経鼻投与が好ましい。
＜免疫誘導方法＞
　本発明の免疫誘導方法は、上記免疫機能活性化剤を投与する工程を有するものであり、上記免疫機能活性化剤を投与する工程には、上記免疫機能活性化剤を投与した後、一定期間経過後に、さらに上記免疫機能活性化剤を投与して追加する工程が含まれる。
　本発明の免疫誘導方法は、免疫応答を誘導できる限り、上記免疫機能活性化剤を投与する工程において、上記免疫機能活性化剤をどのような方法で投与してもよい。なかでも、投与を簡便に行うことができるとの観点から、上記免疫機能活性化剤を皮下投与または経鼻投与することが好ましく、低侵襲で全身免疫および粘膜免疫の誘導ができる点で、経鼻投与が好ましい。
　以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
　なお、例中、「部」、「％」とあるのは、重量基準を意味する。
　まず、細胞壁を有する生物として、甘草（刻み生薬：栃本天海堂社、トチモトのカンゾウＰ）、酵母（乾燥品：日本ガーリック社、天然ビール酵母）および乳酸菌（粉末：ビオラボ社、乳酸菌粉末ＫＡ－１８）を準備し、以下のとおりに、本発明の有効成分となる粒子を作製した。
［甘草由来の粒子］
　刻み甘草（乾燥品）１００ｇを超純水５００ｍＬに入れて５０分間煮沸し、甘草煎じ液を作製し放冷後、粗大画分除去を目的に２００００×ｇで６０分間遠心分離した。その上清を回収し、ナノ粒子の精製を目的として回収した上清とエタノールを体積比として等量混合し、２００００×ｇで２０分間遠心分離後、上清除去を行なった。上記６０分間遠心分離後の上清とエタノールを体積比で等量混合する工程以降を２回繰り返して実施した後、容器の底面に残ったペレットを超純水で再分散させ、上記で混合したエタノールの除去を目的として分画分子量（ＭＷＣＯ）５０ｋＤａの透析膜を用いて超純水中で１日透析を実施し、凍結乾燥して得た。
　得られた粒子の粒度分布を図２に示し、その回収量、平均粒子径、多分散指数、ゼータ電位を下記の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［酵母由来の粒子］
　酵母（乾燥品）１００ｇを超純水１Ｌに入れて９０℃で３時間加熱し、放冷後、粗大画分除去を目的に１２３００×ｇで３０分間遠心分離を行った。その上清を回収し、再度、１４００００×ｇで６０分間の遠心分離を行った。上清を除去し、容器の底面に残った粒子の集合体であるペレットを超純水で再分散させ、凍結乾燥して得た。
　得られた粒子の粒度分布を図３に示し、その回収量、平均粒子径、多分散指数を下記の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［乳酸菌由来の粒子］
　乳酸菌（粉末）１０ｇを超純水１００ｍＬに入れて９０℃で３時間加熱し、放冷後、粗大画分除去を目的に１２３００×ｇで３０分間遠心分離を行った。その上清を回収し、再度、１４００００×ｇで６０分間の遠心分離を行った。上清を除去し、容器の底面に残った粒子の集合体であるペレットを超純水で再分散させ、凍結乾燥して得た。
　得られた粒子の粒度分布を図４に示し、その回収量、平均粒子径、多分散指数を下記の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記得られた粒子に対し、まず、マウス樹状細胞株（ＤＣ２．４細胞）を用いた細胞実験を行い、樹状細胞の成熟化の検討を行った。ついで、上記得られた粒子に対して動物実験（皮下免疫）を行い、抗原特異的な抗体産生、細胞応答、抗腫瘍免疫の誘導（１），（２）の各項目の検討を行った。各実験はそれぞれ以下の条件で行った。
＜１．細胞実験：樹状細胞の成熟化＞
（１－１）甘草由来の粒子
［実施例１、比較例１および参考例１］
　実施例１として、上記で得られた甘草由来の粒子を１００μｇ／ｍＬとなるよう、マウス樹状細胞株（ＤＣ２．４細胞　５×１０5ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ）に作用させ、３７℃で２４時間培養した後に、樹状細胞の成熟マーカーであるＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６に対する発現量を測定した。
　一方、マウス樹状細胞株に対し何も作用させなかったものを比較例１Ａとし、上記甘草由来の粒子作製工程で得られた甘草煎じ液（各種精製前のもの）１００μｇ／ｍＬを作用させたものを比較例１Ｂとし、ポジティブコントロールとしてリポ多糖（ＬＰＳ）０．１μｇ／ｍＬを作用させたものを参考例１として、実施例１と同様に各成熟マーカーの発現量を測定した。
　これらの結果に対しフローサイトメトリーによる解析を行い、ＣＤ４０に対する結果を図５に、ＣＤ８０に対する結果を図６に、ＣＤ８６に対する結果を図７に示した。また、これらを対比した結果を図８に示した。
（１－２）酵母由来の粒子
［実施例２，３、比較例２および参考例２］
　実施例２，３として、上記で得られた酵母由来の粒子を下記の表４に示す濃度でマウス樹状細胞株（ＤＣ２．４細胞　５×１０5ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ）にそれぞれ作用させ、３７℃で２４時間培養した後に、樹状細胞の成熟マーカーであるＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６に対する発現量を測定した。
　一方、マウス樹状細胞株に対し何も作用させなかったものを比較例２とし、ポジティブコントロールとしてリポ多糖（ＬＰＳ）０．１μｇ／ｍＬを作用させたものを参考例２として、実施例２，３と同様に各成熟マーカーの発現量を測定した。
　これらの結果に対しフローサイトメトリーによる解析を行い、各成熟マーカーにおける発現率を下記の表４に併せて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（１－３）乳酸菌由来の粒子
［実施例４～６および比較例３］
　実施例４～６として、上記で得られた乳酸菌由来の粒子を１，１０，１００μｇ／ｍＬとなるようマウス樹状細胞株（ＤＣ２．４細胞　５×１０5ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ）にそれぞれ作用させ、３７℃で２４時間培養した後に、樹状細胞の成熟マーカーであるＣＤ４０に対する発現量を測定した。
　一方、マウス樹状細胞株に対し何も作用させなかったものを比較例３として、実施例４～６と同様に各成熟マーカーの発現量を測定した。
　これらの結果に対しフローサイトメトリーによる解析を行い、ＣＤ４０に対する結果を図９に示した。
　図５～９および上記表４に示されるとおり、いずれの実施例も、ポジティブコントロールであるＬＰＳと同等の発現量を示していることから、本発明の免疫機能活性化剤は、抗体産生等の獲得免疫活性化の初発段階に重要である、樹状細胞の成熟化に影響を及ぼすことが認められる。
＜２．動物実験（皮下免疫）：抗原特異的な抗体産生＞
（２－１）甘草由来の粒子
［実施例７、比較例４，５］
　実施例７として、上記で得られた甘草由来の粒子１００μｇおよびモデル抗原のニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）１００μｇをマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、雌）の後背部に皮下免疫した。上記皮下免疫を７日後に再度行い（皮下免疫回数：合計２回）、最後の皮下免疫を行った日から７日後に採血を行い、トータルＩｇＧ、ＩｇＧ1およびＩｇＧ2Cの値（抗体価）を測定した。
　一方、免疫を一切行わなかったものを比較例４とし、甘草由来の粒子を用いなかった以外は実施例７と同様に免疫したものを比較例５とし、実施例７と同様に抗体価を測定した。それらの結果を、トータルＩｇＧについては図１０に示し、ＩｇＧ1については図１１に示し、ＩｇＧ2Cについては図１２に示した。
　図１０に示されるとおり、抗原と甘草由来の粒子を併用し免疫することで抗原特異的なＩｇＧを誘導することができた。また、図１１および図１２に示された内容から、誘導されたトータルＩｇＧのサブクラス解析をしたところ、抗原特異的なＩｇＧ1、ＩｇＧ2Cの誘導が認められた。一方、抗原のみで免疫した場合、Ｔｈ２型免疫応答が優位となった（比較例５参照）。このように、実施例７は、Ｔｈ１型免疫応答を効率よく誘導可能な免疫機能活性化剤として有用であることが明らかとなった。
　ところで、樹状細胞を主とする抗原提示細胞から提示された抗原情報はＴ細胞へと伝達され、抗原特異的な獲得免疫を誘導する。上記獲得免疫は体液性免疫と細胞性免疫に区分され、体液性免疫（Ｔｈ２型）では作用標的（病原体やがん細胞など）に対する抗体産生を狙い、細胞性免疫では細胞傷害性Ｔ細胞による作用標的への直接傷害に基づき作用標的の排除を狙う。よって、免疫機能活性化剤においては体液性免疫および細胞性免疫のどちらも誘導可能であることが望ましい。なお、ＩｇＧ2cは抗体の中でも細胞性免疫（Ｔｈ１）型のサイトカインに応答し産生される抗体である。
（２－２）甘草由来の粒子
［実施例８，９］
　抗原となるＯＶＡの量を１μｇに変更した以外は実施例７と同様にして免疫したものを実施例８とし、ＯＶＡの量を１０μｇに変更した以外は実施例７と同様にして免疫したものを実施例９として、実施例７と同様にトータルＩｇＧを測定した。その結果を、実施例７および比較例４のトータルＩｇＧとともに図１３に示した。
　図１３に示されるように、抗原量が１μｇであっても、抗原量が１００μｇと同等の抗体産生を誘導したことがわかった。病原体やがん細胞由来の抗原は、調製にかかる時間、経済コスト、安全性等の点から、免疫時の投与量は少ないほど望ましい。本発明の免疫機能活性化剤は、抗原量を１００分の一に抑えた１μｇでも１００μｇと同等の抗体価が得られ、高い免疫機能が認められることから、時間、経済コスト、安全性に優れるものであることがわかる。
（２－３）酵母由来の粒子
［実施例１０，１１、比較例６～９および参考例３，４］
　実施例１０，１１として、上記で得られた酵母由来の粒子１００μｇおよびＯＶＡ（１μｇまたは１０μｇ）をマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、雌）の後背部に皮下免疫した。上記皮下免疫を７日後に再度行い（皮下免疫回数：合計２回）、最後の皮下免疫を行った日から７日後に採血を行い、トータルＩｇＧの抗体価を測定した。
　また、上記実施例１０（ＯＶＡ１μｇ）において、酵母由来の粒子を用いなかった以外は同様に免疫したものを比較例６とし、一切の免疫を行わなかったものを比較例７とし、酵母由来の粒子の代わりにポジティブコントロールとして、水酸化アルミニウム・水酸化マグネシウム製剤（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｉｍｊｅｃｔ　Ａｌｕｍ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）（以下「Ａｌｕｍ」とする）１ｍｇを用いたものを参考例３とした。
　さらに、上記実施例１１（ＯＶＡ１０μｇ）において、酵母由来の粒子を用いなかった以外は同様に免疫したものを比較例８とし、一切の免疫を行わなかったものを比較例９とし、酵母由来の粒子の代わりにポジティブコントロールとしてＡｌｕｍ（１ｍｇ）を用いたものを参考例４とした。
　これらについて、実施例１０，１１と同様に抗体価をそれぞれ測定し、トータルＩｇＧの抗体価を図１４，１５に併せて示す。なお、抗体価５以下の個体は５として算出している。
　図１４，１５に示されるとおり、酵母由来の粒子で免疫すると、抗原量１μｇであっても抗原量１０μｇであっても、いずれの実施例も比較例より有意な抗体価の増加を示している。これらの抗体価は、ポジティブコントロールのＡｌｕｍと同等であり、いずれも高い抗体産生増強効果が認められる。
＜３．動物実験（皮下免疫）：Ｔ細胞応答＞
（３－１）甘草由来の粒子
［実施例１２および比較例１０，１１］
　実施例１２として、上記で得られた甘草由来の粒子１００μｇおよびモデル抗原のニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）１００μｇをマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、雌）の後背部に皮下免疫した。上記皮下免疫を７日後に再度行い（皮下免疫回数：合計２回）、最後の皮下免疫を行った日から７日後に脾細胞を回収した。
　一方、上記実施例１２において、一切の免疫を行わなかったものを比較例１０とし、甘草粒子を用いなかった以外は同様に免疫したものを比較例１１として、実施例１２と同様に脾細胞を回収した。
　これらの実施例および比較例に対し、以下の（ａ）～（ｄ）に示す条件で脾細胞に対する刺激をそれぞれ行い、３日後の細胞上清中のＩＦＮ－γ量をＥＬＩＳＡ法で測定し、その結果を図１６に併せて示した。
（ａ）ＯＶＡ１０μＭ
（ｂ）ＯＶＡ由来ＭＨＣクラスＩエピトープペプチド（ＳＬ８）１００ｎＭ
（ｃ）ＯＶＡ由来ＭＨＣクラスＩエピトープペプチド（ＳＬ８）１０μＭ
（ｄ）刺激なし（ｎｏｎ）
　図１６に示されるとおり、実施例１２はいずれの再刺激でも比較例１０，１１よりも高いＩＦＮ－γ産生が認められ、特に抗原特異的なＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘導可能であることがわかった。
　抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞は、抗原の再刺激により活性化してＩＦＮ－γを産生する。特に、ＯＶＡ由来ＭＨＣクラスＩエピトープペプチド（ＳＬ８）による刺激はＣＤ８+Ｔ細胞を特異的に活性化可能であるため、本発明の免疫機能活性化剤は、細胞性免疫に対しても優れた効果を奏するといえる。
（３－２）酵母由来の粒子
［実施例１３，１４、比較例１２～１５および参考例５，６］
　実施例１３，１４として、上記で得られた酵母由来の粒子１００μｇと、ＯＶＡ１μｇ（実施例１３）または１０μｇ（実施例１４）とを、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、雌）の後背部に皮下免疫した。上記皮下免疫を７日後に再度行い（皮下免疫回数：合計２回）、最後の皮下免疫を行った日から７日後に脾細胞を回収した。
　一方、上記実施例１３において、一切の免疫を行わなかったものを比較例１２とし、酵母由来の粒子を用いなかった以外は同様に免疫したものを比較例１３とし、酵母由来の粒子の代わりにポジティブコントロールとしてＡｌｕｍ（１ｍｇ）を用いたものを参考例５とした。
　また、上記実施例１４において、一切の免疫を行わなかったものを比較例１４とし、酵母由来の粒子を用いなかった以外は同様に免疫したものを比較例１５とし、酵母由来の粒子の代わりにポジティブコントロールとしてＡｌｕｍ（１ｍｇ）を用いたものを参考例６とした。
　これらを、実施例１３，１４と同様にして脾細胞をそれぞれ回収した。
　これらの実施例、比較例および参考例に対し、以下の（ａ）～（ｄ）に示す条件で脾細胞に対する刺激をそれぞれ行い、３日後の細胞上清中のＩＦＮ－γ量をＥＬＩＳＡ法で測定し、その結果を図１７，１８に併せて示した。
（ａ）ＯＶＡ１０μＭ
（ｂ）ＯＶＡ由来ＭＨＣクラスＩエピトープペプチド（ＳＬ８）０．１μＭ
（ｃ）ＯＶＡ由来ＭＨＣクラスＩエピトープペプチド（ＳＬ８）１０μＭ
（ｄ）刺激なし（ｎｏｎ）
　図１７に示されるとおり、実施例１３は、ＯＶＡ１μｇ免疫時に、ＯＶＡ１０μＭの再刺激により、比較例１２，１３よりも高いＴ細胞応答が認められた。しかも、図１８に示されるとおり、実施例１４は、ＯＶＡ（１０μｇ）免疫時に、いずれのＳＬ８での再刺激でも高いＣＤ８+Ｔ細胞応答が認められた。これらのＴ細胞応答は、参考例５，６では認められていないことから、本発明の免疫機能活性化剤の有用な効果の一つといえる。
＜４．動物実験（皮下免疫）：抗腫瘍免疫の誘導（１）＞
［実施例１５］
　実施例１５として、上記で得られた甘草由来の粒子１００μｇを、１００μｇのＯＶＡとともに、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、雌）の後背部に皮下免疫した。上記皮下免疫を７日後に再度行い（皮下免疫回数：合計２回）、最後の皮下免疫を行った日から７日後に、上記マウスの後背部にＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）を１×１０6ｃｅｌｌｓを移植し、移植後の経過日数に伴う腫瘍体積（ｍｍ3）の変化を測定した。測定した結果を図１９に示す。
［比較例１６，１７］
　甘草由来の粒子を用いなかった以外は同様に免疫したものを比較例１６とし、一切の免疫を行わなかったものを比較例１７として、実施例１５と同様に腫瘍体積の変化を測定した。比較例１６の結果を図２０に示し、比較例１７の結果を図２１に示す。
　図１９に示されるとおり、実施例１５はすべてのマウスにおいて腫瘍の生着および増殖が認められなかったことから（拒絶率５／５）、本発明の免疫機能活性化剤は、免疫療法におけるアジュバントとしての有効性が認められたといえる。これに対し、比較例１６，１７は、図２０（拒絶率０／５）および図２１（拒絶率１／５）に示されるとおり、腫瘍体積の増加が認められた。
＜５．動物実験（皮下免疫）：抗腫瘍免疫の誘導（２）＞
（５－１）
　実施例１５で用いた、ＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）が生着しなかったマウスに対して、上記ＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）の移植後７０日経過時に、再度、ＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）１×１０6ｃｅｌｌｓを後背部に移植し、免疫記憶の成立を評価した。測定した結果を図２２に示す。
　図２２に示されるとおり、実施例１５でがん細胞を拒絶したマウスは、７０日後のがん細胞再移植において再度がん細胞を拒絶したことから、本発明の免疫機能活性化剤によるがん細胞に対する免疫記憶の誘導が認められたといえる。
（５－２）
　実施例１５で用いた、ＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）が生着しなかったマウスに対して、上記ＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）の移植後７０日経過時に、今度は、大腸がん細胞株（ＭＣ３８）１×１０6ｃｅｌｌｓを後背部に移植し、細胞特異的な免疫記憶の成立を評価した。測定した結果を図２３に示す。
　図２３に示されるとおり、実施例１５で移植されたＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）を拒絶したマウスは、大腸がん細胞株（ＭＣ３８）を拒絶しなかった。
　一方で、図２２に示したとおり、実施例１５で移植されたＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）を拒絶したマウスは、再度ＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）を拒絶していることから、本発明の免疫機能活性化剤による免疫応答の増強効果は、抗原特異的かつ細胞特異的であり、作用標的以外の免疫応答を誘導しないといえる。
　このように、上記粒子は免疫機能を活性化することが証明された。
　よって、上記粒子を有効成分として有する免疫機能活性化剤は、細胞壁由来（天然物由来）であり、体液性免疫および細胞性免疫のいずれの誘導をも増強することができるため、免疫機能活性化の有効性と人体に対する安全性とを兼ね備えたものである。
　さらに、上記得られた粒子に対して動物実験（経鼻免疫）を行い、抗原特異的な抗体産生、抗腫瘍免疫の誘導の各項目の検討を行った。各実験はそれぞれ以下の条件で行った。
＜６．動物実験（経鼻免疫）：抗原特異的な抗体産生＞
［実施例１６］
　実施例１６として、上記で得られた甘草由来の粒子（１００μｇ）およびＯＶＡ（１００μｇ）を、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、雌）に経鼻免疫した。上記経鼻免疫を７日後に再度行い（経鼻免疫回数：合計２回）、最後の経鼻免疫を行った日から７日後に採血し、トータルＩｇＧの抗体価を測定した。
［比較例１８，１９］
　上記実施例１６において、一切の免疫を行わなかったものを比較例１８とし、甘草由来の粒子を用いなかった以外は同様に免疫したものを比較例１９として、実施例１６と同様に測定したトータルＩｇＧの抗体価を図２４に示した。
　図２４に示されるとおり、実施例１６は、比較例１８，１９と比較して抗体価が有意に増加している。このことから、本発明の免疫機能活性化剤は、経鼻免疫においても高い抗体産生増強効果を有すると認められる。
＜７．動物実験（経鼻免疫）：抗腫瘍免疫の誘導（１）＞
［実施例１７］
　上記甘草由来の粒子（１００μｇ）およびＯＶＡ（１００μｇ）をマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、雌）に経鼻免疫した。上記経鼻免疫を７日後に再度行い（経鼻免疫回数：合計２回）、最後の経鼻免疫を行った日から７日後に、上記マウスの後背部にＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）を１×１０6ｃｅｌｌｓ移植し、移植後の経過日数に伴う腫瘍体積（ｍｍ3）の変化を測定した。測定した結果を図２５に示す。
［比較例２０，２１］
　甘草粒子を用いなかった以外は同様に免疫したものを比較例２０とし、一切の免疫を行わなかったものを比較例２１として、実施例１７と同様に腫瘍体積（ｍｍ3）の変化を測定した。比較例２０の結果を図２６に示し、比較例２１の結果を図２７に示す。
　図２５に示されるとおり、実施例１７は、ほとんどのマウスにおいてがん細胞が拒絶されたのに対し（拒絶率４／５）、比較例２０，２１は腫瘍体積が増加した（図２６（拒絶率０／５）および図２７（拒絶率１／５）参照）。このことから、本発明の免疫機能活性化剤は、経鼻免疫においてもがん免疫療法におけるアジュバントとしての有効性が認められるといえる。
＜８．動物実験（経鼻免疫）：抗腫瘍免疫の誘導（２）＞
（８－１）
　実施例１７で用いた、ＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）が生着しなかったマウスに対して、上記ＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）の移植後７０日経過時に、再度、ＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）１×１０6ｃｅｌｌｓを後背部に移植し、その腫瘍体積の測定を経時的に行った（Ｒｅ－ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）。
　対照として、一切の免疫をしていないマウスにＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）１×１０6ｃｅｌｌｓを後背部に移植し、その腫瘍体積の測定を経時的に行った（Ｆｉｒｓｔ－ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）。そして、これらの結果からＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）の移植に対する拒絶率を算出した。その結果を図２８に示す。
（８－２）
　実施例１７で用いた、ＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）が生着しなかったマウスに対して、上記ＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）の移植後７０日経過時に、今度は、大腸がん細胞株（ＭＣ３８）１×１０6ｃｅｌｌｓを後背部に移植し、その腫瘍体積の測定を経時的に行った（Ｒｅ－ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）。
　対照として、一切の免疫をしていないマウスに大腸がん細胞株（ＭＣ３８）１×１０6ｃｅｌｌｓを後背部に移植し、その腫瘍体積の測定を経時的に行った（Ｆｉｒｓｔ－ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）。そして、これらの結果からＯＶＡ発現リンパ腫細胞株（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ）の移植に対する拒絶率を算出した。その結果を図２９に示す。
　図２８に示されるとおり、実施例１７でがん細胞を拒絶したマウスは、移植後７０日経過時のがん細胞再移植において再度がん細胞を拒絶したことから、本発明の免疫機能賦活化剤は、経鼻免疫でもがん細胞に対する免疫記憶の誘導が認められる。
　一方で、図２９に示されるとおり、実施例１７でがん細胞を拒絶したマウスは、ＯＶＡ発現のない大腸がん細胞株（ＭＣ３８）を拒絶しなかった。このことから、本発明の免疫機能活性化剤の経鼻免疫による免疫応答の増強効果は、抗原特異的かつ細胞特異的であり、作用標的以外の免疫応答を誘導しないといえる。
　このように、上記粒子は、経鼻免疫においても免疫機能活性化させることができるため、上記粒子を有効成分とする免疫機能活性化剤は、経鼻免疫においても有効であることが示された。そして、経鼻で効果があれば、同じく経粘膜投与である経腟、目、口腔内等でも効果があるといえる。
　すなわち、本発明の免疫機能活性化剤は、全身免疫だけでなく粘膜面にも免疫応答を誘導可能であり、粘膜面を介して感染するような病原体に対しても効果が期待できる。また、経鼻免疫は、皮下免疫とは異なり、非侵襲的であり、かつ医療廃棄物を少なくできることから、実用面でも利点がある。
　上記実施例においては、本発明における具体的な形態について示したが、上記実施例は単なる例示にすぎず、限定的に解釈されるものではない。当業者に明らかな様々な変形は、本発明の範囲内であることが企図されている。
　本発明の免疫機能活性化剤は、免疫機能活性化の有効性と、人体に対する安全性を兼ね備える免疫機能活性化剤として、産業上有用である。また、本発明のワクチンアジュバントは、各種感染症のほか、がん免疫療法に対して用いられるワクチンアジュバントとして、産業上有用である。そして、本発明の免疫誘導方法は、人体に対する安全性が高く、簡便な工程を経由するだけでよいため、産業上有用である。
Ａ　　粒子

Claims (9)

  1. 　最大径が１～８００ｎｍの範囲にある粒子を有効成分とする免疫機能活性化剤であって、前記粒子が細胞壁由来の多糖類からなるものである免疫機能活性化剤。
  2. 　前記粒子が甘草、酵母、乳酸菌からなる群から選ばれる少なくとも一つを由来とするものである請求項１記載の免疫機能活性化剤。
  3. 　感染症治療および／またはがん免疫療法において用いられるものである請求項１または２記載の免疫機能活性化剤。
  4. 　体液性免疫および／または細胞性免疫を誘導するものである請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫機能活性化剤。
  5. 　皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経肺投与、血管内投与、経鼻投与、経口投与からなる群から選ばれる少なくとも一つの投与法で投与される請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫機能活性化剤。
  6. 　最大径が１～８００ｎｍの範囲にある粒子を有効成分とするワクチンアジュバントであって、前記粒子が細胞壁由来の多糖類からなるものであるワクチンアジュバント。
  7. 　皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経肺投与、血管内投与、経鼻投与、経口投与からなる群から選ばれる少なくとも一つの投与法で投与される請求項６記載のワクチンアジュバント。
  8. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の免疫機能活性化剤を投与する工程を有する免疫誘導方法。
  9. 　前記免疫機能活性化剤を投与する工程が、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経肺投与、血管内投与、経鼻投与、経口投与からなる群から選ばれる少なくとも一つの投与法により前記免疫機能活性化剤を投与するものである請求項８記載の免疫誘導方法。
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