CN1717248A

CN1717248A - 热休克蛋白的肿瘤内给药和细胞毒素剂的联合肿瘤疗法

Info

Publication number: CN1717248A
Application number: CNA028299914A
Authority: CN
Inventors: 黄雪芬
Original assignee: Baiou Technology Information Consulting Service Shanghai Co ltd
Current assignee: Baiou Technology Information Consulting Service Shanghai Co ltd
Priority date: 2002-12-04
Filing date: 2002-12-04
Publication date: 2006-01-04
Also published as: AU2002349478A1; WO2004050112A1

Abstract

本发明公开了一种治疗肿瘤的组合物、药盒和方法。该方法包括将Hsp蛋白或表达Hsp的构建物施用进入肿瘤以表达热休克蛋白，并且共施用细胞毒素剂，从而造成杀灭肿瘤和诱导全身的肿瘤特异性应答。

Description

热休克蛋白的肿瘤内给药和细胞毒素剂的联合肿瘤疗法技术领域

本发明总体涉及将 Hsp蛋白，或包含表达 HSP或共表达 HSP和自杀基因的构建物施用于入肿瘤，并共施用细胞毒素剂以杀灭肿瘤，从而诱导全身的抗肿瘤应答的方法、药盒和组合物。背景技术

通常，实体瘤是通过联合使用手术、化疗和放疗进行治疗的。然而，这些治疗方法都不理想，因为放疗和化疗会造成不良的副作用，而且某些肿瘤如脑瘤不能手术治疗。免疫治疗，包括肿瘤疫苗，是一种有前途的肿瘤治疗方法。因为肿瘤是由随机遗传突变程度很高的克隆化细胞群构成（估计每个肿瘤细胞有 11， 000 个突变），因此来自突变的和共有的肿瘤抗原的抗原肽能潜在地诱导特异性抗肿瘤的免疫力。然而，尽管有这种免疫原性，但是肿瘤细胞通常不能刺激免疫应答。抗原提呈细胞 (APC)对抗原提呈的不足，导致了免疫系统不能产生有效的抗肿瘤免疫应答。因此，提高 APC对肿瘤抗原的提呈作用是一种提高肿瘤疫苗效能的诱人方法。

热休克蛋白（HSP)能够广泛地伴随和提呈广谱的肿瘤抗慮， '并在抗肿瘤免疫应答的诱导中起关键作用。 HSP与抗原肽形成复合物，并且通过其受体例如 CD91 介导的摄入作用，得以进入树突状细胞 (DC)的 I类和 II类 MHC抗原加工途径，从而引发 CD8+ 和 CD4+T 细胞应答 [Binder, R. J.，Blachere，N. .， and Srivastava, P. K.， Heat shock protein-chaperoned peptides but not free peptides introduced into the cytosol are presented efficiently by major histocompatibility complex I molecules, Journal of Biological Chemistry- 276： 17163-71, 2001 ； Srivastava, P. K. Immunotherapy of human cancer : lessons from mice, Nature Immunology. 1 : 363 - 6， 2000. ]。 HSP还弓 |发先天免疫，其特征是树突状细胞释放 IL-12等细胞因子，从而激活自然杀伤 (NK)细胞和其他免疫细胞 [Multhoff, G.， Mizzen, L.， Winchester, C. C.， Milner, C. M.， Wenk, S.， Eissner, G.， Kampinga, H. H. , Laumbacher, B.， and Johnson, J. Heat shock protein 70 (Hsp70) stimulates proliferation and cytolytic activity of natural killer cells, Experimental Hematology. 27 : 1627- 36， 1999]。 HSP 除了作为细胞因子将免疫细胞引向肿瘤之外，还通过上调 DC上的共刺激性和抗原确认本提呈分子，其中包括 B7- 1，B7- 2和 II类 MHC分子，将成熟信号传递给 DC [A_Sea， A.， Kraeft, S. K.， Kurt-Jones, E. A.， Stevenson, M. A.， Chen, L. B.， Finberg, R. W.， Koo， G. C.， and Calderwood, S. K. HSP70 stimulates cytokine production through a CD14 - dependant pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine, Nature Medicine. 6： 435-42, 2000. ]。

已经开发了有数种基于 HSP的疫苗来增强抗肿瘤应答，其中包括单个个体的肿瘤的 HSP蛋白疫苗，或抗原 - HSP融合 DNA或蛋白 [Chen, C. H. T. - L. W.， Chien-Fu Hung, Yanqin Yang, Richard A. Young, Drew M. Pardoll, and T-C. Wu Enhancement of DNA vaccine potency by linkage of antigen gene to an HSP70 gene, Cancer Research. 60 : 1035-42， 2000]。 HSP蛋白质疫苗已在动物中广泛测试，并且最近还在临床实验中测试 [Janetzki, S.， Schaed, S.， Panageas, K. S.， Wang, S.， Williams, L.， Meyers, M. , Butterworth, L.， Livingston, P. 0.， Chapman, P. B.， and Houghton, A. N. Immunization of cancer patients with autologous cancer- derived heat shock protein gp96 preparations： a pilot study, International Journal of Cancer. 87 : 391-8, 2000] , 其中 HSP是从肿瘤细胞中纯化的，然后被施用回同一病人。然而，这种方法有许多局限。因为 HSP所引发的是针对所分离的肿瘤的特异性免疫，且由于突变抗原肽的独特性，因此必须分别地从病人肿瘤样品中产生，这使得 HSP疫苗难以建立可再生产的治疗标准。此外， HSP疫苗还难以摧毁大肿瘤。抗原- HSP融合 DNA或蛋白质疫苗可以克服某些局限，但是这些方法不有效，因为它们只能提高针对一种或少数几种共有肿瘤抗原的免疫应答。

因此，本领域迫切需要开发新的有效治疗肿瘤的方法。发明概述

本发明的目的就是提供一种有效治疗肿瘤的新方法、药盒和组合物。在本发明的第一方面，提供了一种药盒，它含有：

(a)第一组合物，该组合物含有药学上可接受的载体，以及 Hsp蛋白和 /或表达 Hsp的构建物，所述的构建物含有与表达调控序列可操作性连接的 Hsp的编码序列；

(b) 第二组合物，该组合物含有细胞毒素剂。

在一优选例中，所述的第二组合物在施用第一组合物之前、同时或之后施用。在另一优选例中，所述构建物选自下组：复制缺陷型病毒、表达载体、 RNA分子、 DNA分子，及其组合。

在另一优选例中，复制缺陷型病毒选自下组：复制缺陷型腺病毒、疱疹单纯病毒 (HSV)、水泡性口炎病毒 (VSV)、新城疫病毒 (NDV)及其组合。

在另一优选例中，所述的构建物还含有与表达调控序列可操作性连接的自杀基因。更佳地，所述的自杀基因选自下组： HSV胸腺嘧啶激酶 (TK)和胞嘧啶脱氨酶 (CD) 基因。

在另一优选例中，所述的 HSP 是选自下组生物体的 Hsp : 人、结核杆菌 iM. Tuberculosis)，麻风分支杆菌 0¾ Ze rae人克氏锥虫 ( ja;3osd¾z73 cii/z人恶性

falciparum), 非人灵长动物、小鼠，及其组合。更佳地，所述的 HSP选自下组: HSP70、 HSP96、 HSP90、 HSP20、及其组合。

在另一优选例中，所述的细胞毒素剂选自- i) . 化疗剂：顺铂、抗代谢物、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、氨基蝶呤； ii) .自杀基因的毒素剂： GCV、环磷酰胺、阿糖胞苷、 5-氟胞嘧啶； iii) . 源自植物、真菌和细菌的细胞毒素：假单胞菌外毒素、皂草素 ( saporin) 、蓖麻蛋白、白树因（gelonin) 、白喉毒素、核糖核酸酶，或表达上述细胞毒素的表达载体；

iv) . 放射性同位素；

V) . 激素 /类固醇的抑制物：羟基氟他胺、来曲唑；

vi)上述（i) _ (v)的组合。

在本发明的第二方面，提供了一种组合物，它含有

(:0.· Hsp蛋白和 /或表达 Hsp的构建物，所述的构建物含有与表达调控序列可操作性连接的 Hsp的编码序列；

(ii)细胞毒素剂；和

(iii)药学上可接受的载体。

在本发明的第三方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：

(a)给个体施用第一组合物，该组合物含有药学上可接受的载体，以及 Hsp 蛋白和 /或表达 Hsp的构建物，所述的构建物含有与表达调控序列可操作性连接的 Hsp的编码序列；

(b)给个体原位或全身地施用第二组合物，该组合物含有细胞毒素剂和药学上可接受的载体，其中所述的第二组合物在施用第一组合物之前、同时或之后施用。

在一优选例中，所述的第一和第二组合物的施用方式包括局部施用（如瘤内）、粘膜施用、静脉内施用或腹腔内施用。

在本发明的第四方面，提供了一种 Hsp蛋白或表达 Hsp的构建物在制备治疗肿瘤药物中用途，所述的药物被肿瘤内施用于对象，并且与细胞毒素剂联用。附图简述

图 1.表达 HSP的质粒和表达 HSV- TK的质粒的示意图。其中，质粒 pCMV- HSP 含有处于 CMV启动子和 SV40聚腺苷酸化序列（SV40 poly (A) )控制下的 HSP70。质粒 pCMV- TK含有处于 CMV启动子和 SV40聚腺苷酸化序列（SV40 poly (A) )控制下的 HSV-TK基因。

图 2.共表达 Hsp和 TK的载体示意图。质粒 pCMV- Hsp- TK含有处于 CMV启动子和 SV40聚腺苷酸化序列（SV40 poly (A) )控制下的 HSP70和 HSV- TK，其中 HSP70 和 HSV- ΤΚ由 IERS序列相连。

图 3.表达 Hsp70 的复制缺陷型腺病毒的示意图。复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失） Ad-HSP70在 E1区含有处于 CMV启动子和 SV40聚腺苷酸化序列（SV40 poly (A) ) 控制下的人 Hsp70基因。

图 4.共表达 Hsp70和 TK的复制缺陷型腺病毒的示意图。复制缺陷型（E1和 E3缺失） Ad- HSP70, 在 E1区含有处于 CMV启动子和 SV40 poly (A)控制下的、与 IERS序列相连的人 Hsp70基因和 HSV- TK基因。

图 5.共表达 Hsp70和 TK的复制缺陷型腺病毒插入基因的片段的示意图。图 6. Hsp70和 TK蛋白的表达。用共表达 Hsp70和 TK的腺病毒（Ad- Hsp_TK) 或空载体（Ad-null)感染 Hep3B癌细胞。 48小时后，用 ³⁵S-甲硫氨酸（methionine) 同位素标记及免疫沉淀， SDS- PAGE胶显示高水平的 TK和 Hsp70 (泳道 B和 C)蛋白表达。 Ad- null感染细胞（泳道 A)未见 Hsp70与 TK表达。

图 7. Ad- Hsp- TK病毒的局部肿瘤注射抑制远端肿瘤生长。 CT26 (结肠癌）肿瘤细胞（2xl0⁶)被皮下接种在小鼠的右侧，当肿瘤生长至直径 3-5厘米时，将 Ad Hsp-TK, Ad-TK,及 PBS (5xl0⁸pfu/小鼠）连续 3天每天一次注入瘤内。用 Ad- Hsp- TK 及 Ad-TK治疗的小鼠用 GCV (10mg/g小鼠体重）每天腹腔内注射 2次，共 5天。 2 周后，用 lxl0⁶ CT26细胞在小鼠左侧接种。图中显示，鼠接受 Ad-Hsp- TK瘤内治疗后，抑制了再接种肿瘤的生长。发明详述

本发明人经过广泛而深入的研究，发现将 Hsp蛋白和 /或表达 Hsp的遗传构建物与细胞毒素剂联用，可以在需要肿瘤治疗的个体中引发引发抑制局部性和转移性肿瘤的抗肿瘤免疫应答，从而有效地治疗肿瘤。在此基础上完成了本发明。如本文所用，术语 "构建物"和 "遗传构建物"可互换使用，指含有 Hsp编码序列的核酸分子，它包括表达载体、质粒、病毒 (优选复制缺陷型病毒）、 R A分子、 DNA分子。构建物还含有表达调控序列，用于表达与其操作性相连的 Hsp和 /或自杀基因。通常，构建物中可含有一个或多个 (如 1-5个) Hsp编码序列和自杀基因。 -当含有多个 Hsp或自杀基因时，各 Hsp可相同或不同，各自杀基因也可相同或不同。

如本文所用，术语 "复制缺陷型病毒"定义为因为某些病毒复制所必需的基因发生缺失或突变而不能在肿瘤细胞中复制的病毒。复制缺陷型病毒的例子包括复制缺陷型疱疹单纯病毒- 1 (HSV) , 水泡性口炎病毒 (VSV)，新城疫病毒 (NDV)，和腺病毒 (Ad)。

如本文所用，术语"表达载体"可以是双链或单链，并且可以是 RNA或 DNA。通常，核酸仅含有一个编码本文所限定的多肽的序列，但是核酸也可含有 2、 3、 4或更多个各自编码本文所限定的多肽的序列。

如本文所用，术语"热休克蛋白"定义为一族具有 ATP酶活性的高度保守的分子。它们存在于所有的原核生物和大多数的真核细胞的区室中。在有应力和无应力条件下， Hsp的表达在蛋白质代谢中起重要作用，包括在蛋白质重新折叠、膜转运和降解错误折叠的表达构件中起作用。 Hsp蛋白的制剂，包括衍生自肿瘤细胞和病毒感染细胞的 hsp70和 grp94/gp96，能够引发细胞的免疫力。 HSP蛋白可以从表达 HSP的转导细胞和肿瘤细胞中纯化。

Hsp蛋白制剂的免疫原性归功于结合于 hsp的免疫原性肽。 Hsp陪伴抗原肽进入抗原提呈细胞，可能使肽能够进入 I类和 Π类 MHC途径，从而被负载在 I类和 II类 MHC分子上，在此它们被呈递给 CD8+细胞毒性 T细胞和 CD4+T-辅助细胞。此夕卜， HSP 还为树突状细胞 (DC)的成熟提供了 "危险"信号，这是 T-细胞活化中至关重要的步骤。

用于本发明的热休克蛋白没有特别限制，可以来自各种来源。代表性例子包括来源于人的 HSP (包括人 HSP70、 HSP96、 HSP90、 HSP20和其他的人 HSP：)、来源于病原体的 Psp，包括结核杆菌 ( ^berci^^is入麻风分支杆菌 (He rae ^氏锥虫 {Tryanosoma cruzi) , 恶性疟原虫（^a^Oi/iw/H fkZci araW和其他病原体；或者来源于其他物种（包括非人灵长动物、小鼠等）的 HSP。在美国专利 6，399，069 (Srivastava等人)等众多专利中有 hsp70， hsp90, gp96等热休克蛋白的描述。在本发明中， Hsp蛋白不仅包括天然存在的或野生型的 Hsp，还包括 Hsp变异体，尤其是仅在保守替换和 /或修饰中有差异的变异体。

如本文所用， "自杀基因"指任何表达细胞毒性分子或其前体的基因，自杀基因的表达会导致细胞死亡。自杀基因的代表性例子包括 (但并不限于）： HSV胸腺嘧啶激酶（TK)、细胞色素 Ρ450 (Manome et al. (1996) Gene Therapy 3 : 513-520) , 人脱氧胞苷激酶（Manome et al. (1996) Nature Medicine 2 (5) : 567- 573)和胞嘧啶脱氨酶（CD)基因（Dong et al. (1996) Human Gene Therapy 7 : 713-720)。表达这些基因的细胞会对相对无毒性的物质变得敏感，例如 GCV (HSV-TK) , 环磷酰胺 (细胞色素 P450 2B1) , 阿糖胞苷（人脱氧胞苷激酶)或 5-氟胞嘧啶 (胞嘧啶脱氨酶）" 。

对于可用于本发明的各种 Hsp以及自杀基因的 DNA序列，可以根据公开的序列，合成引物，以常规方法抽提的 DNA或 RNA为模板，或者以可购得的含有有关基因的质粒或文库为模板，通过 PCR或 RT- PCR等常规技术而获得。还可以通过人工合成的方法直接合成这些基因。此外，可以通过定点诱变等常规技术将保守性替换等突变引入各基因。

以 HSV-TK为例，它早已被定位、克隆和测序（EMBL HEHSVLTK, Accession

X03764, EMBL HEHS07, Accession V00466)。 HSV- TK基因可从自然来源（例如 I 型或 II型单纯疱疹病毒的基因组）获得。 HSV- TK还可从含 HSV- TK基因的质粒 HSBV-106 (可从 Gibco， Gaithersburg, Md购得）。此外， HSV- TK的寡核苷酸也可人工合成。

如本文所用，术语" Hsp诱导剂 "定义为诱导 Hsp表达的分子，例如 15-脱氧 _Δ¹²' ¹⁴- 前列腺素 J或任何 Hsp表达的诱导剂。

如本文所用，术语"细胞毒素剂"定义为任何能杀灭肿瘤细胞的化学试剂、生物试剂或放射性物质。细胞毒素剂的作用是杀灭部分肿瘤细胞，释放出肿瘤抗原。这些抗原与热休克蛋白形成复合物，从而有效地激发免疫应答。细胞毒素剂包括以下几类物质：

i) . 化疗剂：顺铂、抗代谢物、氟尿嘧啶、甲氨蝶吟、氨基蝶呤； ii) .自杀基因的毒素剂： 9-1, 3-二羟-2-丙氧甲基鸟嘌呤(6(^)，环磷酰胺，阿糖胞苷、 5-氟胞嘧啶；

iii) . 源自植物、真菌和细菌细胞毒素：假单胞菌外毒素、皂草素、蓖麻蛋白、白树因、白喉毒素、和核糖核酸酶。或表达上述细胞毒素的表达载体 (病毒载体、 RNA或 DNA) ;

iv) . 放射性同位素：如 _X光， γ-射线以及注射入肿瘤内的放射性同位素； v) . 激素和类固醇的抑制剂：激素依赖性的癌症可以用抑制激素功能的物质加以杀灭。因为雄激素是维持前列腺癌细胞所需要的，因此脱离雄激素被用于治疗前列腺癌病人。羟基氟他胺 (Hydroxyflutamide, HF)作为抗雄激素药可用于阻断前列腺癌生长。抑制雌激素生物合成的来曲唑 (Letrozole或 Femara) 可用于治疗妇女的雌激素依赖性乳腺癌。

vi)上述（i) - (V)的组合。

如本文所用，术语"抗原"定义为引发免疫应答的分子。免疫应答可以涉及抗体的产生，或特异性免疫活性细胞的激活，或者两者。抗原可以衍生自生物体、蛋白质 / 抗原的亚基、灭活的或无活性的全细胞或裂解物。

如本文所用，术语"癌症"定义为侵犯其他细胞的恶性细胞肿瘤 (肿瘤）。例子包括

(但并不限于）：乳房癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌和肺癌等。

如本文所用，术语"表达"定义为在启动子驱动下，某一核苷酸序列的转录和翻译。如本文所用，术语 "表达调控序列"定义为实现外源基因表达所需的核苷酸序列，主要指启动子。

如本文所用， "可操作性连接 (operably linked to) "指这样一种状况，即线性 DNA序列的某些部分能够影响同一线性 DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽 DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽 (分泌前导序列) DNA就是可操作地连于多肽 DNA; 如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般， "操作性连接"意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

如本文所用，术语"启动子 "定义为调节特定核苷酸序列转录的核苷酸序列区域。术语启动子包括增强子、沉默子、和其他顺式作用的调控元件。

如本文所用，术语 "T细胞"定义为衍生自胸腺的、参与各自细胞介导的免疫反应的细胞。 ' 简而言之，本发明提供了在肿瘤内表达 HSP构建物或直接注射 Hsp蛋白，然后在需要肿瘤治疗的个体中引发全身性的抗肿瘤应答的方法、药盒和组合物。在本发明中，通过施用（优选瘤内注射) Hsp蛋白和 /或表达 HSP (更佳地，共表达 HSP 和自杀基因）的复制缺陷型腺病毒或表达载体并且共施用细胞毒素剂，从而在局部肿瘤中表达 HSP并在病人中引发抑制局部和转移性肿瘤的抗肿瘤免疫应答。

在一优选例中，产生了表达人 HSP70 的复制缺陷型腺病毒 (Ad)。在实施本发明时，这种将表达 HSP的腺病毒直接施用入肿瘤 (与细胞毒素剂一起）的疗法，可诱导特异性的抗肿瘤免疫力，导致摧毁局部的和转移性的肿瘤。

在本发明的另一优选例中，还提供了将共表达 HSP和自杀基因 (如 TK)的腺病毒直接施用入肿瘤，然后施用 GCV的疗法。该疗法也可诱导对受感染肿瘤细胞的特异性杀灭作用以及抗肿瘤抗原的免疫力，从而导致摧毁局部的和转移性的肿瘤。

在本发明中，还可以用病毒或非病毒载体或 DNA或 RNA来表达 HSP，或共表达 HSP和自杀基因。本发明的疗法不仅可以与其他形式的免疫疗法联用，例如施用细胞因子和传统中药，还可以与其他疗法 (如放射性疗法)结合。

此外，在本发明中，还可将表达 Hsp的构建物 /Hsp蛋白，与 Hsp诱导剂（如 15- 脱氧- Δ¹²， ¹⁴-前列腺素 J)一起施用。

在一优选例中，自杀基因 HSV-TK被用于制备共表达 HSP和 ΤΚ，从而增强免疫应答的腺病毒。细胞毒素剂， 9-1, 3-二羟 -2-丙氧甲基鸟嘌呤 (GCV)被用于杀灭表达 ΤΚ 的细胞。

在一优选例中，细胞毒素剂顺铂被用于诱导杀灭局部的肿瘤细胞，以增强肿瘤抗原的释放和免疫应答。或者，任何能够杀灭肿瘤细胞的化学和生物分子都可用于该疗法。

本发明的药盒或组合物通常包含 Hsp蛋白和 /或表达 HSP或共表达和自杀基因的构建物，以及细胞毒素剂，它们可摧毁肿瘤和释放肿瘤抗原，并且诱导全身的抗肿瘤免疫应答。

在一具体例子中，复制缺陷型病毒是腺病毒。复制缺陷型腺病毒，如 E1和 E3 区缺失的腺病毒，已经广泛在动物模型和临床试验中用于表达肿瘤治疗有关的基因。在具体实例中，复制缺陷型腺病毒含有编码人 hsp70，或人 Hsp70和 HSV- TK的核酸，该核酸与 IRES序列相连并处于复制缺陷型腺病毒中启动子的转录控制下。

在一具体例子中，编码人 hsp70处于表达质粒中启动子的转录控制之下。 "启动子"指被细胞的合成机制或引入的合成机制所识别的，引发基因的具体转录所需的 DNA序列。对启动子组织结构的绝大多数知识，来自于对数种病毒启动子的分析，包括 CMV， HSV胸腺嘧啶激酶 (tk)和 SV40早期转录单元的启动子。这些研究再加上最近工作，已表明启动子由离散的功能模块构成，每个模块由约 7-20bp的 DNA构成并含有一个或多个转录活化子或抑制子蛋白的识别位点。其他的启动子元件，即增强子，调节转录起始的频率。通常，它们位于起始位点上游 30- llObp的区域，尽管最近已表明一些启动子还含有位于起始位点下游的功能元件。在启动子元件之间的间距是灵活的，因此当各元件被反向或相对于另一者移动时仍保留启动子功能。在 tk启动子中，启动子元件间的间隔可以增加至 50bp以内，且不会发生活性下降。取决于启动子，已表明各元件可以共协作地或独立地起作用，从而激活转录。

启动子可以是与基因或序列天然相连的启动子，如可以通过分离位于编码区域和 /或外显子上游的 5'非编码区域而获得的启动子。这样的启动子被称为 "内源的"。类似地，增强子可以是与核酸序列天然相连的增强子，位于该序列的下游或上游。或者，将核酸编码区域置于重组或异源启动子的控制之下可获得某些益处，重组或异源启动子指在自然环境中通常并不与核酸序列相连的启动子。重组的或异源的增强子也指在自然环境中通常并不与核酸序列相连的增强子。这些启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，从其他原核生物、病毒或真核生物细胞中分离出的启动子或增强子，以及并不 "天然存在"的启动子或增强子（即含有不同转录调控区域的不同元件、和 /或含有改变表达的突变形式）。除了人工合成地产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以用重组克隆和 /或核酸扩增技术 (包括 PCR)来产生这些序列。此外，在例如线粒体、叶绿体等无核细胞器中找到的序列转录和 /或表达的控制序列也可使用，这也在本发明构思之中。

在本发明中的代表性启动子序列是立即早期巨细胞病毒（CMV)启动子序列。该启动子序列是强的组成型启动子序列，它能够驱动与其操作性相连的任何核酸序列的高水平表达。然而，其他组成型启动子序列也可以使用，其中包括（但并不限于）：猿病毒 40 (SV40)早期启动子，小鼠乳腺瘤病毒 (MMTV)，人免疫缺损病毒 (HIV)长末端重复序列（LTR)启动子， Moloney病毒启动子，禽白细胞病毒启动子， Epstein Barr病毒立即早期启动子， Rous 肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，其中包括（但并不限于）：肌动蛋白启动子，肌球蛋白启动子，血红蛋白启动子，和肌肉肌酸启动子。此外，本发明还不局限于仅使用组成型启动子。诱导型启动子也是本发明构思的一部分。在本发明中使用诱导型启动子，提供了一个分子开关，该开关能够在需要表达时开启与其操作性相连的核酸序列表达，或者在不需要表达时关闭该表达。诱导型启动子的例子包括（但并不限于）：金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子、和四环素启动子。此外，本发明还包括使用使用组织特异性启动子，该启动子仅在所需的组织中有活性。组织特异性启动子是本领域中众所周知的，其中包括 (但并不限于) HER-2启动子， E2F启动子，胰岛素启动子，和 PSA相关启动子序列。

对于 Hsp表达，通常包含聚腺苷酸化信号以便使转录物适当地聚腺苷酸化。聚腺苷酸化信号的性质据信对本发明的成功实施并不是关键的，并且可以采用任何这样的序列。优选的例子包括 SV聚腺苷酸化信号、 LTR聚腺苷酸化信号、和 /或牛生长因子聚腺苷酸化信号，这些信号都是方便的并且可以在不同的靶细胞中很好地起作用。还可作为表达盒元件的是转录终止位点。这些元件可用于增强信息水平和 /或减少读码超出表达盒而进入其他序列的情况。

值得注意的是，在本发明中，对于正确的蛋白质表达而言，并不需要复制缺陷型病毒载体整合到宿主细胞的基因组中。相反，表达载体可以以附加体形式存在于所需细胞中。例如，存在某些细胞类型，在这些细胞中表达载体并不需要复制就可以表达所需的蛋白。这些细胞是那些通常不复制的细胞，如肌肉细胞，但仍然完全能够表达基因。表达载体可以被引入非分裂的细胞并在表达载体不复制的情况下表达所编码的蛋白质。

在一具体例子中，杀灭局部肿瘤和诱导免疫应答的方法包括步骤：将表达 Hsp 的复制缺陷型病毒直接或间接地施用入生物体的肿瘤。大量研究已表明，抗肿瘤免疫应答可以通过共施用细胞因子或表达细胞因子的载体而得以加强。熟练的技术人员会轻易地认识到，细胞因子的核苷酸序列和 HSP的核苷酸序列可以被整合在一个表达载体中，这样就不必使用两个独立的载体。 '

本领域技术人员会认识到，本发明的复制缺陷型病毒可用于肿瘤治疗。对于肿瘤治疗，熟练技术人员会知道，被使用的复制缺陷型病毒必须含有可操作地连于启动子的 Hsp基因。合适的话，可以用各给药途径领域所已知的方法，将载体配制成固体、半固体、液体或气体形式制剂。本领域已知的手段可用于在组合物达到靶器官之前防止组合物被释放和吸收，或者用于确保定时释放组合物。选用的药学上可接受的形式应不使本发明的组合物无效。在药物剂型中，组合物可以单独使用，或者与其他药物活性化合物合适地联用或组合。必须施用足量的含有治疗性核酸序列的病毒，从而提供药理上有效量的基因产物。表达热休克蛋白的复制缺陷型病毒可单独施用，或者与其他各种不同佐剂配制在一起。表达热休克蛋白的复制缺陷型病毒可局部、粘膜、静脉内或腹腔内给药。

此外，实际的剂量和方案可变化，这取决于组合物是否与其他药物组合物联合施用，或取决于个体间在药物动力学、药物配置、和代谢等方面的差异。此外，对于每个细胞的载体添加量，会随着插入载体的治疗性基因的长度和稳定性以及序列的性质而有所变化。具体而言，它是一个需要实验确定的参数，并且可以随与本发明方法本质无关的非因素而变化。本领域技术人员可以轻易地根据具体情况的紧急性而作出必要的调整。

通常， Hsp蛋白的施用量为 1-200 ug/mm³肿瘤，较佳地 5- 100 ug/mm³肿瘤。表达 Hsp的构建物的施用量为 10³- 10¹¹个 Hsp编码序列拷贝 /mm³肿瘤，较佳地 1χ10⁴-1χ10⁹ Hsp编码序列拷贝 /mm³肿瘤，更佳地 lxlO⁵- lxlO¹¹ Hsp编码序列拷贝 /mm³ 肿瘤。此外，施用量也可用 "pfu/个肿瘤"表示。以表达 Hsp的腺病毒为例，其施用量为 lxlO⁷- 5xl0¹³pfu/个肿瘤，较佳地 5xl0⁷- lxl0¹²pfu/个肿瘤。

至于细胞毒素剂的施用量，可以按它们的常规用量使用。通常为 0. 01-200 mg/g 肿瘤，或 0. 001- 50mg/kg体重。例如，顺铂的用量为 0. 2- 2mg/g肿瘤，较佳地为 0. 5- 1. 5mg/g肿瘤。 GCV的用量为 5- 50mg/kg体重，较佳地为 20- 50mg/kg体重。

尽管这些物质可以单独施用，但优选地是将它们以药物制剂形式给药。本发明的制剂包括至少一种如上所述的活性成分，以及一种或多种药学上可接受的载体，和任选的其他治疗成分。载体必须是"药学上可接受的"，即必须与制剂中的其他成分相容且对受体无害，例如脂质体。合适的脂质体包括，例如含带正电荷的脂质 N - [1 - (2, 3-二油酰氧)丙基] -N, N, N-三乙基铵 (D0TMA)的脂质体，含二油酰磯脂酰乙醇胺 (DOPE)的脂质体，和含 3β-[Ν - (Ν'， N' -二甲基氨基乙烷) -氨甲酰]胆固醇 (DC- Choi)的脂质体。

制剂包括适用于口服、直肠、鼻、局部 (包括口腔和舌下），阴道或肠胃外 (包括皮下，肌内，静脉内，皮内，鞘内和硬脑膜外)给药的制剂。制剂可方便地以单位剂型形式存在，并且可用药物领域熟知的任何方法制备。这些方法包括步骤：将活性成分与作为一种或多种辅助成分的载体混合在一起。通常，制剂的制备是通过将活性成分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀雨紧密地混合在一起，然后如果需要，对产品进行成型。

本发明的适合口服的制剂，可以作为硬胶囊、胶囊或片剂等独立单元形式存在，每个含有预定量的活性成分；或作为粉末或颗粒；或作为在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油型液态乳剂或油包水型液态乳剂存在。活性成分还可以丸剂、药糖剂或糊剂形式存在。

本发明的药物，可以用任何适合所治疗的病症的途径，施用于包括人在内的哺乳动物。合适的途径包括口服、直肠、鼻、局部 (包括瘤内、口腔和舌下），阴道或肠胃外 (包括皮下，肌内，静脉内，皮内，鞘内和硬脑膜外)给药。优选瘤内给药。应理解，优选的途径会随例如受体的状况和待治疗的类型而变化。因此，已有的肿瘤可以全身治疗，或者选用直接将载体或细胞输送到病损部位的途径。预防性处理的目的是刺激可能会受靶肿瘤影响的组织的保护性免疫。

在优选例中，将表达 Hsp的构建物所导致的局部 HSP表达的免疫调节作用与细胞毒素剂的杀肿瘤作用相结合，不仅使肿瘤抗原通过与 Hsp形成复合物而被有效地提呈给各种免疫细胞，还给生物体提供了局部危险信号（local danger signal)。这样，在病人中诱导局部性抗肿瘤免疫应答和全身性的针对转移性肿瘤的抗肿瘤活性，从而达到有效治疗肿瘤的效果。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例 1

制备表达 Hsp70的复制缺陷型腺病毒构建物

参见图 1和图 3。表达 Hsp70的复制缺陷型腺病毒载体的 E1区被 Hsp70表达盒替换，该表达盒含有人热休克蛋白 70 (HSP70)的完整编码序列，该编码序列由 CMV-IE启动子驱动的，转录方向平行于腺病毒 El 0RF转录方向。

Ad_HSP70的产生是通过将从质粒 pH2. 3 (ATCC 57494, 美国典型培养物保藏中心（ATCC) )获得的 HI- Seal片段形式人 HSP70 ,克隆入腺病毒穿梭质粒 pAVC3 [Lozi er, J. N.， Yankaskas, J. R.， Ramsey, W. J.， Chen, L. , Ber Schneider, H. , and Morgan, R. A. Gut epithelial cells as targets for gene therapy of hemophilia, Human Gene Therapy. 8 : 1481-90， 1997. ]的 Banm-Pmei位点。在随后步骤中，按以前所述的方法 [Prevec， L. and Graham, F. L. Methods for construction of adenovirus vectors, Molecular Biotechnology. 3 : 207- 20, 1995] , 得到 pAVC3. HSP70。 Ad- HSP70通过 pJM17 ( Quantum Biotechnologies, J2C. )和 pAVC3. HSP70在 293细胞中的同源重组而得以拯救。 Ad. HSP70在 293细胞中繁殖，通过 2轮 CsCl密度离心而纯化，用 1500 mL含 1 mmol/L MgCl tl 10% 甘油的 PBS在 4。C，在 Slide- A- Lyzer 盒（Pierce公司）中进行透析 4次（每次 1 小时），然后贮藏在 -80°C。通过测量 260nm处的吸光度而确定病毒的浓度，并通过 293细胞上的噬菌斑分析估测效价。病毒效价为 2- 8xl0^1Q噬斑形成单位 (pfu) /毫升，颗粒：噬斑比约为 30-80 : 1。对于噬斑纯化的 Ad. HSP70制剂中是否存在能复制的腺病毒，通过感染 A549细胞进行评估。在感染后 21天没有发生指示细胞的裂解，从而排除了存在的可能性。实施例 2

制备表达 TK的复制缺陷型腺病毒构建物参见图 1。按实施例 1相同的方法制备表达 TK的复制缺陷型腺病毒构建物。不同点在于用 TK表达盒替换 Hsp70表达盒。

表达 TK的复制缺陷型腺病毒载体的 E1区被 TK表达盒替换，该表达盒含有 HSV- TK的完整编码序列，该编码序列由 CMV-IE启动子驱动的，转录方向平行于腺病毒 El 0RF转录方向。

HSV-TK 基因是以包含 TK 基因的腺病毒 Ad- TK (Chen S. et al. PNAS 91 : 3054， 1994)为模板，通过 PCR扩增获得的。引物序列：上游引物： ACT GCG GCC GCA GCT TCG TAC CCC TGC (SEQ ID NO : 1)，下游引物： AGT TCT AGA CTC GAG TCA GTT AGC CTC CCC CAT (SEQ ID NO : 2)。使用 PE公司的 PCR仪，反应条件是：每个反应的引物终浓度是 30pM， dNTP为 lOOmM, 模板 DNA为 100ng， Taq DNA聚合酶为 2. 5个单位。其他反应条件依照 GeneAmp DNA扩增试剂盒中的使用说明进行，每个反应总体积为 100微升。每份反应混合物上覆盖以 75微升矿物油。扩增共进行 30个循环，每一循环包括变性步骤 92°C 1分钟，退火步骤 50°C 1分钟，延长步骤 72°C 2分钟。反应结束后，使用 Qiagen公司的 PCR产物纯化试剂盒纯化所得产物。该 PCR扩增的 HSV- TK基因为 1132 bp，含有 Nhel和 Xhol的位点。该基因用 Nhel和 Xhol双酶切，然后克隆至 pRc/CMV载体（InVitrogen, Inc. )和 Ad- Easy 载体 (Quantum Biotechnologies, Inc. )。实施例 3

构建共表达 HSP和 TK的复制缺陷型腺病毒

参见图 2和图 4。一种简便 (AdEasy)的腺病毒生产方法用于 HSP和 TK腺病毒的构建及生产。人类可诱导的 HSP70 cDNA是从所述实施例 1中的质粒 pH2. 3 (ATCC 57494)作为模板，通过 PCR扩增获得。上游引物序列为： GGT ATG GAA GAT CCC TCG AGA TC (SEQ ID N0 : 3) , 下游引物序列为： TA CTA ATC TAC CTC CTC AAT GGT GGG (SEQ ID NO : 4)。使用 PE公司的 PCR仪，反应条件与实施例 2中的条件相同。反应结束后，使用 Qiagen公司的 PCR产物纯化试剂盒纯化所得产物。将如实施例 2中制备的 TK基因和 HSP70 基因的的 DNA 片段分别克隆入 Ad- Easy 载体（Quantum Biotechnologies, Inc. )中多克隆位点中的 Nhel和 Xhol的位点。通过 Ad- Easy 试剂盒（Quantum Biotechnologies, Inc. ) , 产生重组的 Ad- HSP- TK病毒。

病毒 Ad_HSP-TK中 CMV启动子、 Hsp编码序列、 IRES和 TK等元件的连接示意图见图 5。具体序列见 SEQ ID NO: 5。实施例 4

复制缺陷型 Ad-Hsp和 Ad-Hsp- TK表达 Hsp

人肿瘤细胞 Hep3B被接种在 6孔板上，用感染复数 (M0I)为 10的 Ad- HSP、 Ad- HSP-TK或 Ad-阴性对照感染。在病毒感染后 48小时，通过放射性标记和免疫沉淀 /SDS-PAGE检测到 HSP70的病毒。

如图 6所示，在感染 Ad-HSP- TK的细胞中有高水平的 HSP70和 TK表达 (泳道 B 和 0，在感染 Ad-HSP70的细胞中有高水平的 HSP70表达 (未示出）。但是在 Ad_阴性对照感染的细胞中仅有低水平的 HSP70表达 (泳道 A)。实施例 5

Ad-HSP-TK和细胞毒素剂 (GCV)抑制远端肿瘤的生长

在同系的 BALB/c小鼠上进一步评价 Ad- HSP- TK对 CT26肿瘤的治疗效果。 BALB/c来自于 Charles River (Wilmington, MA, USA) ₀ 所有动物实验都经动物关心和使用委员会（Animal Care and Use Committee)批准。将动物分成 3组，第一和第二组作为实验组，第三组作为对照组。每组 6~8只小鼠，将小鼠用 CT26肿瘤细胞 (2xl0⁶)在小鼠肋部进行皮下注射。

当皮下注射的肿瘤生长到最大直径 5毫米时，将第一组每只动物 (右侧）的瘤内接种 Ad- HSP- TK (5xl0⁸PFU)，连续三天每天一次。并用 GCV (10mg/g小鼠体重），每天腹腔内注射 2次，共 5天。将第二组每只动物右侧的瘤内接种 Ad- TK (5xl0⁸PFU)，连续三天每天一次，并同样用 GCV治疗。将第三组小鼠每只动物右侧的瘤内接种 PBS。

肿瘤体积用卡尺测量，如果小鼠垂死或其肿瘤直径超过 12毫米，手术切除肿瘤。 2周后，用 1 X 10⁶个 CT26细胞在小鼠左侧接种。然后观察接种肿瘤生长情况。

用 Ad-HSP-TK瘤内注射，引起非常显著的抗肿瘤效果，对称端非注射侧的肿瘤生长明显受到抑制。然而注射 Ad-TK或 PBS对非注射侧的肿瘤都没有影响（图 7)。这些结果表明，重组的 Ad- HSP-TK通过表达 HSP70/TK能够激发强的免疫应答，从而抑制了远端肿瘤的生长。实施例 6

Ad-HSP和细胞毒素剂 (顺铂)在小鼠模型中对远端肿瘤生长的抑制作用

已发现，鼠结肠直肠癌细胞系 CT26对腺病毒感染敏感。该细胞的免疫原性低并且不会诱导可检测的肿瘤特异性 CTL。

当两侧的皮下肿瘤的最大直径达到约 0. 5厘米时，在第 0天，在右侧肿瘤，对小鼠进行单侧肿瘤内接种 Ad- Hsp或 Ad-阴性对照载体（lxl0⁶PFU)，或 PBS缓冲液 (空白对照），然后在第 7天进行第二次接种 (每组 6只)和使用 2 mg/kg剂量的顺铂。对于两侧含 CT26肿瘤的同基因的 BALB/c小鼠，对其一侧肿瘤进行接种，而另一侧肿瘤 (对侧的)则不接种。在用 Ad- Hsp进行免疫接种，与空白对照相比，接种的肿瘤和未接种的对侧肿瘤都表现出肿瘤生长的显著下降。用 Ad- Hsp进行免疫接种，能比 Ad - 阴性对照载体接种更有效地抑制两侧的肿瘤生长。实施例 7

HSP蛋白和细胞毒素剂 (顺铂)在小鼠模型中对远端肿瘤生长的抑制作用

重复实施例 6 的实验，不同点在于用纯化的 Hsp70 蛋白（20ug/mm³肿瘤)代替 Ad- Hsp。

与空白对照 (PBS缓冲液)相比，用 Hsp蛋白进行免疫接种，接种的肿瘤和未接种的对侧肿瘤都表现出肿瘤生长的显著下降。

Claims

权利要求

1. 一种药盒，其特征在于，它含有：

(a)第一组合物，该组合物含有药学上可接受的载体，以及 Hsp蛋白和 /或表达 Hsp的构建物，所述的构建物含有与表达调控序列可操作性连接的 Hsp的编码

5 序列；

(b) 第二组合物，该组合物含有细胞毒素剂和药学上可接受的载体。
2.如权利要求 1所述的药盒，其特征在于，所述的第二组合物在施用第一组合物之前、同时或之后施用。
3. 如权利要求 1所述的药盒，其特征在于，所述构建物选自下组：复制缺陷型 10 病毒、表达载体、 RNA分子、 DNA分子，及其组合。
4. 如权利要求 3所述的药盒，其特征在于，复制缺陷型病毒选自下组：复制缺陷型腺病毒、疱疹单纯病毒 (HSV)、水泡性口炎病毒 (VSV)、新城疫病毒 (NDV)及其组合。
5.如权利要求 1所述的药盒，其特征在于，所述的构建物还含有与表达调控序 15 列可操作性连接的自杀基因。
6.如权利要求 1所述的药盒，其特征在于， HSP是选自下组生物体的 Hsp: 人、结核杆菌（ Tuberculosis) , 麻风分支杆菌 0¾ Leprae)，氏锥虫（ Tryanosoma cruzi) , H疟、A PlasinocI m falciparum)、非人灵长动物、小鼠，及其组合。
7.如权利要求 1所述的药盒，其特征在于， HSP选自下组： HSP70, HSP96、 HSP90、 20 HSP20、及其组合。
8. 如权利要求 1所述的药盒，其特征在于，所述的细胞毒素剂选自下组： i) . 化疗剂：顺铂、抗代谢物、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、氨基蝶呤； i i) .自杀基因的毒素剂： GCV、环磷酰胺、阿糖胞苷、 5-氟胞嘧啶； ii i) . 源自植物、真菌和细菌的细胞毒素：假单胞菌外毒素、皂草素、蓖麻 25 蛋白、白树因、白喉毒素、核糖核酸酶，或表达上述细胞毒素的表达载体； iv) . 放射性同位素；

V) . 激素 /类固醇的抑制物：羟基氟他胺、来曲唑；

vi)上述（i ) - (V)的组合。
9. 如权利要求 5所述的药盒，其特征在于，所述的自杀基因选自下组： HSV胸 30 腺嘧啶激酶 (TK)、细胞色素 Ρ450、人脱氧胞苷激酶和胞嘧啶脱氨酶 (CD)基因。
10.—种组合物，其特征在于，它含有：

(i) . Hsp蛋白和 /或表达 Hsp的构建物表达 Hsp的构建物，所述的构建物含有与 ' 表达调控序列可操作性连接的 Hsp的编码序列；

(ii)细胞毒素剂；和

35 (iii)药学上可接受的载体。