CN102844663A - 基于巨细胞病毒的免疫原性制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用重组的复制缺陷型巨细胞病毒(CMV)在受试者中产生长期的、重复刺激的基于T细胞的免疫应答的方法，例如，对抗由巨细胞病毒表达的异源抗原的免疫应答。进一步涉及使用重组的复制缺陷型CMV作为抗癌的免疫原性制剂的方法。

Description

基于巨细胞病毒的免疫原性制剂
技术领域
本发明涉及使用重组的复制缺陷型巨细胞病毒(CMV)在受试者中产生长期的、永久激活的基于T细胞的免疫应答的方法，例如抗由巨细胞病毒表达的异源抗原的免疫应答。本发明进一步涉及使用重组的复制缺陷型CMV作为抗癌的免疫原制剂的方法。
政府支持的声明
本发明是利用NIH授予的基金号RO1AI 47206和21CA12718和国防部授予的基金号BC084377的政府资助完成的。政府对本发明具有一定的权利。
背景技术
虽然肿瘤和病毒免疫学之间有明显的相似性(parallel)，但是在其领域它们的差异更加显著。病毒通常是具有强力的免疫原性的、激活先天免疫“危险”信号(例如，Toll样受体信号转导)和呈现丰富的外来抗原。肿瘤通常最多包含突变的或过表达的自身蛋白作为抗原，并可能引起免疫耐受而不是免疫激活。因此，肿瘤疫苗的目的之一是诱使免疫系统来治疗肿瘤，就好像它是病毒而不是无害的自身组织。鉴于发现表观肿瘤根除后肿瘤可以作为微转移或癌症干细胞持续存在，特别希望的是产生稳定的和长效的免疫应答。这些细胞自己可能很少分裂，因此在放疗和化疗中存活。然而，他们的后代是具有致命的肿瘤产生能力的典型的癌细胞。由于癌症干细胞可以保持休眠数月或数年，肿瘤疫苗接种的另一个目的是在消除最初的肿瘤负荷之后长时间内提供警醒的免疫监视。在理想的情况下，这种免疫监视涉及CD8+T细胞，该细胞可以巡视组织以检测微转移，而不是等待肿瘤被传递到引流淋巴结。
肿瘤表位的弱免疫原性及免疫系统通常由免疫耐受而非通过启动强力的效应子应答对他们作出响应的事实阻碍了成功的肿瘤免疫治疗。理想的免疫治疗肿瘤疫苗会引发(a)稳定的、(b)有效的、(c)抵抗免疫耐受的发生、(d)长效的及(e)在最初的肿瘤控制之后对于抗复发和转移的“免疫监视”任务有效的免疫应答。由巨细胞病毒(CMV)感染引发的稳定的终身免疫应答和CMV克服自体耐受性的能力表明CMV可以是理想的肿瘤免疫治疗的疫苗载体。
CMV是疱疹病毒家族β亚类的成员。它是建立终身的潜伏性或持续性感染的大的(包含230kb基因组)、双链DNA病毒。在发达国家如美国，约70％的人口感染了CMV。与γ疱疹病毒例如Epstein-Barr病毒和卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒相反，CMV为非转化的和非致癌的。减毒的CMV活疫苗(基于缺乏一部分CMV基因组的人类CMVTowne病毒株)已经于II期和III期的安全性和有效性临床试验中通过皮下注射施用于超过800名受试者(Arvin等.，Clin.Infect.Dis.39：233-239，2004)。虽然这种疫苗被认为是完全安全的，但它不是完全有效的。最近，为试图增加其疗效，替换了Towne疫苗株中缺失的一些基因。该疫苗已经在II期的安全性研究中进行了测试，并被认为是安全的(Arvin等，Clin.Infect.Dis.39：233-239，2004)。
已在几份报告中证明了活的、重组的CMV产生抗重组抗原的免疫应答的能力(Hansen等，Nat.Med.15：293-299，2009；Karrer等，J.Virol.78：2255-2264，2004)。此外，最近已证明，经工程化以表达自身蛋白的重组的有复制能力的CMV会产生抗表达该自身蛋白的细胞的长效的、基于CD8+T细胞的免疫力(Lloyd等，Biol.Reprod.68：2024-2032，2003)。由于大多数的肿瘤抗原是过表达的自身蛋白，该结果为使用CMV载体诱导对肿瘤的免疫应答的概念提供了支持。
最值得注意的是，Hanson等使用表达SIV抗原的重组猕猴CMV来免疫猕猴抗SIV(Hansen等，Nat.Med.15：293-299，2009)。该免疫诱导大量对外周组织中的SIV特异性的激活的“效应子记忆”CD8+T细胞，这在为时多年的整个研究中是持续的。明显的是，免疫的猴子受到SIV激发的实质保护，这是由于激活的效应子记忆T细胞的存在。该研究还表明，对CMV的预先存在的免疫力并没有阻止重组CMV诱导新的免疫应答的能力。
尽管减毒的CMV活疫苗是表观安全的，但对基于CMV的活疫苗的策略仍然保持明显关注。虽然在健康个体中CMV感染通常是完全无症状的，但在免疫抑制个体(如艾滋病患者、器官移植接受者或在子宫内感染的婴儿)中可能会产生问题。此外，基于CMV的肿瘤疫苗的潜在接受者可能是或者可能变成免疫缺陷的，从而显著限制了活的CMV肿瘤疫苗的使用。因此，存在着在免疫受损个体中完全安全的CMV疫苗载体的持续需要。
发明概述
本文公开的是令人惊讶地发现，完全不能在细胞间传播的复制缺陷型CMV能够在受试者体内产生长期的免疫应答。因此，本文所描述的是在受试者体内产生长期的重复刺激的抗异源抗原的免疫应答的方法。该方法包括通过腹膜内或静脉内施用向受试者施用(例如，以单一剂量)包含编码异源抗原的异源核酸的重组的复制缺陷型巨细胞病毒，由此在受试者体内建立病毒潜伏，该潜伏导致对抗该抗原的重复刺激的免疫应答。在特定的实施例中，刺激的免疫应答是抗细菌、真菌、病毒或肿瘤源的多肽的。
还描述了被诊断患有癌症的受试者的治疗方法，包括对受试者施用一种化疗或免疫抗癌试剂或者化疗和免疫抗癌试剂的组合；并且通过腹膜内或静脉内施用向相同的受试者施用包含编码源自癌症的异源抗原的异源核酸的重组的复制缺陷型巨细胞病毒，由此在受试者体内建立病毒潜伏，该潜伏导致抗癌症的刺激的免疫力。
通过参照附图的下面的详细的描述，本发明的上述的和其它的目标、特征和优势将变得更加明白。
附图简要说明
图1是CMV感染后随着时间的推移，比较病毒滴度和CMV-反应性T细胞的曲线图。
图2显示了由MCMV-IE2-ova疫苗和B16-D5-ova肿瘤激发诱发的免疫应答。A)在用MCMV-ova或仅载体接种6个月后的外周血中，卵清蛋白肽SIINFEKL的细胞内细胞因子染色(ICS)分析测量值直接在体外测定。上图：用SIINFEKL刺激。下图：无肽。B)如在A中测定的外周血中SIINFEKL特异性反应的ICS测量值，作为接种6个月后但在肿瘤激发之前和在肿瘤激发之后17天，6只接种的小鼠中总CD8+T细胞的百分数。C)在接种小鼠和对照小鼠中肿瘤发展的过程，显示为在接种后的指定天数保持无肿瘤的小鼠的百分比。大多数动物在产生可触知的肿瘤的七天内死亡。一只接种的小鼠(图2B中的#4)保持无瘤。
图3为显示MCMV-感染的B6小鼠中T细胞应答的一对图。在感染的急性期(之后7天)和慢性期(之后7天)中C57BL/6小鼠的感染诱导了可重复的免疫优势层级。
图4是一系列显示用具有复制能力的MCMV感染的小鼠中CD8+T细胞记忆扩张(memory inflation)的图。在第0周用MCMV感染C57BL/6小鼠(n-5)。在感染后指定周，由尾部放血获得外周血并通过四聚体染色测定对于三个MCMV表位(m139、m38和IE3)的反应。以血液中总CD8+淋巴细胞的百分比对表位特异性的反应作图。符号表示动物个体；线表示平均值。未感染对照的背景四聚体染色＜0.2％。
图5是一系列显示用复制缺陷型MCMV感染的小鼠中CD8+T细胞的记忆放大的图。A)用野生型MCMV感染的小鼠用实心圆表示和用复制缺陷型ΔgL MCMV感染的小鼠用空心圆表示。每条线代表在指定时间点分析的单个小鼠。数据以通过四聚体染色评定的外周血中总CD8+T细胞的％作图。B)在用指定的肽刺激T细胞后，来自野生型和ΔgL感染的小鼠的CD8+T细胞的代表性FACS图。评估T细胞在感染后25周的IFN-γ产生(Y-轴)和KLRG-1表达(X-轴)。C)感染后20周来自野生型和ΔgL感染的小鼠的抗原特异性细胞的代表性FACS图显示CD8表达(X-轴)和四聚体染色(Y-轴)，以表明四聚体结合的T细胞如何被分选的。另外的FACS图显示在四聚体阳性T细胞分选后的KLRG-1表达(X-轴)和CD127表达(IL-7Rα，Y-轴)。
图6是一系列显示在足垫中皮下感染后，由野生型MCMV或ΔgL复制缺陷型MCMV诱发的免疫应答的图。通过如图5A所示的四聚体染色测定外周血中T细胞随着时间的反应。实心圆表示野生型感染的小鼠。空心圆代表ΔgL感染的小鼠。各条线代表在指定的感染后时间进行测试的单个动物。
图7是显示用野生型或ΔgL MCMV感染的存在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的脾脏中在感染后的各个不同时间点存在的病毒基因组数目的图。Balb/c-SCID小鼠在第0天用不同量的野生型病毒或1x105pfu的ΔgL病毒感染。各组中任何成员表现出疾病迹象时，对该组动物进行处死。用ΔgL病毒感染的小鼠在感染后六周内从未表现出疾病迹象。
序列表
在所附的序列表中列出的核酸和/或氨基酸序列显示使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示，如37 C.F.R.1.822中所规定的。只显示各核酸序列的一条链，但应理解对显示链的任何引用包括互补链。在所附的序列表中：
SEQ ID NO：1是MCMV E1的代表性探针的核酸序列。
SEQ ID NO：2和3(分别)是MCMV E1的代表性正向和反向引物的核酸序列。
详细描述
I.缩略词
Figure BPA00001618564400061
II. 术语
除非另有说明，根据常规的用法使用技术术语。分子生物学常用术语的定义可以在Benjamin Lewin，Genes V，published by OxfordUniversity Press，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(eds.)，TheEncyclopedia of Molecular Biology，published by Blackwell Science Ltd.，1994(ISBN 0-632-02182-9)和Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biologyand Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，published by VCHPublishers，Inc.，1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。
为了便于考察本发明的各种实施方案，下面提供了特定术语的解释：
施用：活性化合物或组合物的施用可以通过本领域技术人员已知的任何途径进行。施用可以是局部或全身的。局部(local)施用的实施例包括，但不限于，局部(topical)施用、皮下施用、肌肉内施用、鞘内施用、心包内施用、眼内施用、局部眼部施用或通过吸入施用于鼻粘膜或肺部。此外，局部施用包括通常用于全身施用的施用途径，如静脉内和腹膜内途径，例如，通过定向血管内施用到达供给特定器官的动脉。因此，在特定实施方案中，当这种施用是靶向于供给特定器官的脉管系统时，局部施用包括动脉内施用和静脉内施用。局部施用还包括将活性化合物或试剂引入到可植入装置或结构中，如血管支架或其它储库，为了其在延长的时间段内释放活性剂和化合物以获得持续的治疗效果。
全身施用包括设计为通过循环系统将活性化合物或组合物广泛分布于整个身体的任何施用途径。因此，全身施用包括但不限于，腹膜内、动脉内和静脉内施用。当局部施用、皮下施用、肌肉内施用或通过吸入施用涉及通过循环系统在整个身体内的吸收和分布时，全身施用还包括，但并不限于，这种局部施用、皮下施用、肌内施用或通过吸入施用。
动物：活的多细胞脊椎动物或无脊椎生物体，包括，例如，哺乳动物和鸟类的一类。术语哺乳动物包括人类和非人类的哺乳动物。术语“灵长类动物”包括人类和非人类灵长动物。“非人类灵长动物”是猿类灵长动物，例如猴类、黑猩猩、猩猩、狒狒和猕猴。类似地，术语“受试者”包括人类和兽医学受试者，如非人类灵长动物。
抗体：免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，例如，包含特异性结合抗原(与抗原免疫反应)的抗原结合位点的分子。
天然存在的抗体(例如，IgG、IgM、IgD)包含四条多肽链，通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。然而，已证明，抗体的抗原结合功能可以通过自然存在的抗体的片段执行。因此，这些抗原结合片段也意图被该术语“抗体”所指称。包含在术语抗体中的结合片段的非限制性实例包括(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段，(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，Nature 341：544-546，1989)；(v)分离的互补决定区(CDR)，和(vi)F(ab’)2片段，包含由在铰链区的二硫键连接的两个Fab片段。
免疫球蛋白和其特定变体是已知的并且许多已在重组细胞培养物中制备(例如，见美国专利No.4,745,055；美国专利No.4,444,487；WO88/03565；EP 0256654；EP 0120694；EP 0125023；Faoulkner等，Nature298：286，1982；Morrison，J.Immunol.123：793，1979；Morrison等，Ann Rev.Immunol 2：239，1984)。
抗原：可以刺激哺乳动物中产生抗体或T细胞应答的物质，包括被注入或被吸收到哺乳动物体内的组合物。抗原与特定的体液或细胞免疫的产物反应，包括那些由异源免疫原诱导的免疫。术语“抗原”包括所有相关的抗原性表位。在一个实例中，抗原是癌抗原。靶抗原是期望针对该抗原的免疫反应以例如达到治疗效果(如肿瘤消退)的抗原。
抗原特异性T细胞：识别特定抗原的CD8+或CD4+淋巴细胞。一般地，抗原特异性T细胞特异性地结合MHC分子呈递的特定抗原，但不结合相同MHC呈递的其他抗原。
癌症：已经发生了分化缺失、生长速度增加、侵袭周围组织和能够转移的特征性间变的恶性肿瘤。
cDNA(互补DNA)：缺乏内部的非编码片段(内含子)和转录调控序列的一段DNA。cDNA也可以包含负责相应的RNA分子中的翻译调控的非翻译区(UTR)。cDNA通常是在实验室中由从细胞中提取的信使RNA的逆转录而合成的。
CMV(巨细胞病毒)：疱疹病毒家族的β亚类的成员。巨细胞病毒是大的(包含230千碱基对的基因组)、双链DNA病毒，具有宿主范围特异性的变异体MCMV(鼠CMV)和HCMV(人类CMV)。
化疗：在癌症治疗中，化疗是指使用一种或多种试剂杀死快速增殖的细胞(如肿瘤或癌细胞)或减缓其复制。在特定的实例中，化疗是指施用一种或多种抗肿瘤药物以明显降低受试者体内肿瘤细胞的数量，如降低至少50％。细胞毒性的抗肿瘤化疗剂包括，但不限于：5-氟尿嘧啶(5-FU)、咪唑硫嘌呤、环磷酰胺(如，Cytoxan
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)、抗代谢物(如氟达拉滨)和其他抗肿瘤药物，如依托泊甙、阿霉素、氨甲喋呤、长春新碱、卡铂、顺铂和紫杉烷类化合物(如紫杉醇)。
化疗剂：用于治疗以异常的细胞生长或过度增生为特征的疾病的试剂。这些疾病包括癌症、自身免疫性疾病以及以增生性生长为特征的疾病(如牛皮癣)。本领域技术人员可以很容易地识别化疗剂(例如，见Slapak和Kufe，Principles of Cancer Therapy，Chapter 86 inHarrison′s Principles of Internal Medicine，14th edition；Perry等，Chemotherapy，Ch.17 in Abeloff，Clinical Oncology 2nd ed.，
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2000Churchill Livingstone，Inc；Baltzer L，Berkery R(eds)：Oncology PocketGuide to Chemotherapy，2nd ed.St.Louis，Mosby-Year Book，1995；FischerDS，Knobf MF，Durivage HJ(eds)：The Cancer Chemotherapy Handbook，4th ed.St.Louis，Mosby-Year Book，1993)。化疗剂的实例包括的ICL-诱导剂，如美法兰(AlkeranTM)、环磷酰胺(CytoxanTM)、顺铂(PlatinolTM)和白消安(BusilvexTM，MyleranTM)。
消减或耗尽：降低某些事物的质量、数量或强度。
在一个实例中，疗法(如本文中所提供的方法)消减了肿瘤(如肿瘤大小、肿瘤数目、肿瘤转移、肿瘤复发或其组合)或一种或多种与肿瘤相关的症状，例如与不存在该疗法时的反应相比较。在特定的实例中，疗法在治疗后降低了肿瘤大小、肿瘤数目、肿瘤转移、肿瘤复发或其组合，例如降低至少10％、至少20％、至少50％或甚至至少90％。
DNA(脱氧核糖核酸)：DNA是构成大多数生物体的遗传物质的长链聚合物(一些病毒具有核糖核酸(RNA)组成的基因)。DNA聚合物的重复单元是四种不同的核苷酸，其各包含结合到磷酸基团所连接的脱氧核糖的四种碱基(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T))中的一种。
除非另外说明，任何提及的DNA分子意图包括该DNA分子的互补序列。除本文中要求单链性质的情况外，DNA分子，尽管仅描述或表示为单链，包括双链DNA分子的两条链。因此，指称的编码特定蛋白质或其片段的核酸分子包括正义链和其互补链。例如，由公开的核酸分子的互补序列生成探针或引物是适当的。
缺失：DNA序列的去除，而去除的序列任一侧的区域被接合在一起。
有效量：足以在所治疗的受试者中获得希望的效果的量。组合物(例如疫苗)的有效量可以在疗程中作为单一剂量或几个剂量施用。然而，化合物的有效量将依赖于应用的化合物、所治疗的受试者、病患的严重程度和类型以及化合物的施用方式。
编码：如果在其天然状态中或当通过本领域技术人员已知的方法操作时，多核苷酸可以被转录和/或翻译以产生mRNA和/或多肽或其片段，则说该多核苷酸编码多肽。
表位：抗原决定簇。它们是分子上具有抗原性的特定化学基团或肽序列，从而它们诱发特异性免疫应答。例如，表位可以是由重组的复制缺陷型CMV疫苗传递给细胞的核酸表达的肿瘤衍生的多肽。作为由该疫苗诱发的免疫应答的部分而产生的抗体结合特定的肿瘤衍生的抗原性表位。
表达：核酸翻译成蛋白质，例如编码肿瘤抗原的mRNA翻译成蛋白质。
表达调控序列：调节其可操作地连接的异源核酸序列的表达的核酸序列，例如在CMV基因组中剪接的并编码可操作地连接于表达调控序列的抗原性蛋白质的异源多核苷酸的表达。当表达调控序列控制和调节核酸序列的转录和(适宜时)翻译时，表达调控序列可操作地与核酸序列连接。因此，表达调控序列可以包括适当的启动子、增强子、转录终止子、蛋白编码基因前面的起始密码子(ATG)、内含子的剪接信号、允许适当的mRNA翻译的该基因正确阅读框的维持和终止密码子。术语“调控序列”意图包括至少其存在可以影响表达的组件，并且还可以包括其存在是有利的额外组件，例如，前导序列和融合伴体序列。表达调控序列可以包括启动子。
启动子是足以指导转录的最小序列。还包括足以使得启动子依赖的基因表达具有对于细胞类型特异性、组织特异性或外部信号或试剂可诱导性的控制的那些启动子元件，这样的元件可以位于基因的5′或3′区域。包括组成型和诱导型启动子(参见例如，Bitter等，Methods inEnzymology 153：516-544，1987)。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，如λ噬菌体的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等等。在一个实施方案中，当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用源自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(如逆转录病毒长末端重复序列；腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。也可以使用通过重组DNA或合成技术生成的启动子以用于核酸序列的转录。
可以将多核苷酸插入到包含有利于宿主中插入的遗传序列的有效转录的启动子序列表达载体中，包括病毒载体。表达载体通常含有复制起点、启动子以及允许转化的细胞进行表型选择的特定核酸序列。
基因表达：核酸转录单元(包括，例如基因组DNA或cDNA)的编码信息被转化成细胞的可操作的、不可操作的或结构的部分的过程，通常包括蛋白质的合成。基因表达可能受到外部信号的影响，例如，受试者接触抑制基因表达的试剂。基因的表达也可能在从DNA到RNA再到蛋白质的途径中的任何位置受到调节。例如，通过作用于转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子(如mRNA)的降解的控制，或通过在蛋白质合成之后特定蛋白质分子的激活、失活、区室化或降解或通过其组合方式进行基因表达的调控。可以在RNA水平或蛋白质水平和利用本领域已知的任何方法，包括Northern印迹、RT-PCR、Western印迹或者体外、原位或体内蛋白质活性分析，测定基因表达。
核酸的表达可以与对照状态相比而调节，如在对照时间点(例如，影响所观察的核酸调控的物质或试剂施用前)或在对照细胞或受试者中。这种调节包括但不限于超表达，表达不足或表达抑制。此外，可以理解，核酸表达的调节可以与所编码的蛋白质或甚至不是由该核酸编码的蛋白质的调节相关且事实上可以引起所编码的蛋白质或甚至不是由该核酸编码的蛋白质的调节。
异源的：正常情况下不会在邻近第二序列处发现的序列类型。在一个实施方案中，该序列是来自与第二序列不同的遗传来源，如病毒或其他生物体。
增殖性疾病：以失控的细胞增殖为特征的疾病或障碍。增殖性疾病包括但不限于恶性和非恶性肿瘤。
免疫原性肽：包含等位基因特异性基序或其它序列如N-末端重复的肽，以使得该肽结合MHC分子并诱导对抗该免疫原性肽来源的抗原的细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)反应或B细胞反应(例如抗体的生成)。
在一个实施方案中，使用序列基序或其它方法鉴别免疫原性肽，如本领域中已知的神经网络或多项式确定(polynomial determination)。通常情况下，使用算法来确定肽的“结合阈值”以选择赋予其以特定亲和力结合的高可能性并为免疫原性的那些肽。算法是基于对在特定位置的特定氨基酸的MHC结合的效应、对在特定位置的特定氨基酸的抗体结合的效应或对包含基序的肽中特定置换的结合的效应。在免疫原性肽的情况中，“保守的残基”是在肽中的特定位置以显著高于按随机分布预期的频率出现的残基。在一个实施方案中，保守的残基是MHC结构可以提供与免疫原性肽的接触点的残基。
免疫反应性条件：包括指允许产生对抗抗原的抗体以结合该表位达到明显地高于与基本上所有其它表位的结合和/或往基本上排除与基本上所有其它表位的结合的条件。免疫反应性条件取决于抗体结合反应的形式，且通常是那些应用在免疫分析方案中或体内遇到的条件。在该方法中使用的免疫反应性条件是“生理条件”，其包括指活体哺乳动物或哺乳动物细胞体中典型的条件(如温度、摩尔渗透压浓度、pH值)。虽然认识到，某些器官经历极端条件，但有机体内和细胞内环境正常为约pH值7(如从pH 6.0至8.0，更通常为pH 6.5至7.5)、含水作为主要溶剂和存在于0℃以上和50℃以下的温度。摩尔渗透压浓度处于支持细胞生存和增殖的范围内。
免疫应答：免疫力的变化，例如免疫系统中的细胞如B细胞、T细胞、巨噬细胞、单核细胞或多形核细胞对于受试者体内免疫原性试剂的反应。这些反应可以是对于特定抗原特异性的(“抗原特异性应答”)。在特定的实例中，免疫应答是T细胞应答，如CD4+应答或CD8+应答。在另一实例中，应答是B-细胞应答，并且导致针对该免疫原性试剂的特异性抗体的产生。
在一些实例中，这样的免疫应答为受试者提供了针对免疫原性试剂或免疫原性试剂源的保护。例如，该应答可以治疗患有肿瘤的受试者，例如通过干扰肿瘤的转移或减少肿瘤的数目或大小。免疫应答可以是主动的且涉及受试者免疫系统的刺激或是由被动获得性免疫产生的反应。“重复刺激的”免疫应答是由宿主体内抗原的重复产生导致的免疫系统的周期性的和重复性刺激引起的长期免疫应答。
在特定的实例中，提高或增强的免疫应答是受试者抵抗疾病(如肿瘤)的能力的提高。
免疫力：在接触免疫原性试剂时能够激活保护性应答的状态。保护性应答可以是抗体介导的或免疫细胞介导的，并可以被指向特定的病原体或肿瘤抗原。免疫力可以主动获得的(如通过暴露于免疫原性试剂，无论是天然的或以药物组合物的形式)或被动获得的(如通过施用抗体或体外刺激的和扩增的T细胞)。
在特定的实例中，通过表达特定抗原(如肿瘤抗原)的复制缺陷型CMV的腹膜内或静脉内施用获得免疫力。
免疫疗法：引发对抗靶抗原产生的免疫应答的方法。基于细胞介导的免疫应答的免疫疗法包括产生对于产生特定抗原决定簇的细胞的细胞介导的应答，而基于体液免疫应答的免疫疗法包括生成对于产生特定抗原决定簇的病毒的特异性抗体。在特定的非限制性实例中，细胞介导的免疫应答是用表达肿瘤抗原的重组复制缺陷型CMV感染受试者而产生的。
传染病：由病原体如真菌、寄生虫、细菌或病毒引起的疾病。
干扰素-γ(IFN-γ)：由T淋巴细胞响应于特定抗原或促有丝分裂刺激而产生的蛋白质。包括天然存在的IFN-γ肽和核酸分子及保持全部或部分IFN-γ生物活性的IFN-γ片段和变体。IFN-γ的序列是公开可得的(例如，示例性的IFN-γmRNA序列可从GenBank登录号：BC070256、AF506749和J00219获得，并且示例性的IFN-γ蛋白质序列可从GenBank登录号：CAA00226、AAA72254和0809316A获得)。
测量功能性IFN-γ的方法是已知的，且包括但不限于：免疫分析方法。例如，识别IFN-γ的抗体可公开获得使得允许使用ELISA和流式细胞术检测产生IFN-γ的细胞。另一种方法是测量由激活的T细胞杀灭肿瘤靶标的水平的细胞毒性分析(例如，参阅Hu等，J.Immunother.27：48-59，2004和Walker等，Clin.Cancer Res.10：668-80，2004)。
抑制或治疗疾病：抑制疾病或病症的充分发展或复发，例如，在处于患癌症(如黑色素瘤)风险中或被诊断患有癌症(如黑色素瘤)的受试者中。“治疗”是指在疾病或病理状态已经开始发生后减轻疾病或病理状态的迹象或症状的治疗性干预。术语“减轻”涉及疾病或病理状态时是指任何可观察到的有益的治疗效果。有益效果可以，例如，通过易感受试者中疾病的临床症状的延迟发作或复发、疾病的一些或所有临床症状的严重程度下降、较慢的疾病进展、转移数目的减少、受试者的总体健康和身体状况的改善或者通过本领域中公知的对于特定疾病特异性的其它参数来证明。“预防性”治疗是为了降低发生病理状态的风险而施用于没有表现出疾病迹象或只表现出早期迹象的受试者的治疗。
分离的：“分离的”生物组分(如核酸分子、蛋白质或细胞器)已经基本上从该组分天然存在的有机体细胞中的其他生物组分分离或纯化出来，例如其他的染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器。已被“分离的”核酸和蛋白质包括用标准的纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语也包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸。
突变：DNA序列的任何变化，例如在基因或染色体中。在某些情况下，突变会改变特性或性状(表型)，但是并非总是如此。突变的类型包括碱基置换点突变(例如，转换或颠换)、缺失和插入。错义突变是将不同的氨基酸引入到所编码的蛋白质的序列中的突变；无义突变是引入新的终止密码子的突变。在插入或缺失的情况下，突变可以整码突变(未改变整体序列的框架)或移码突变，其可能导致大量密码子的错读(且通常由于在替代阅读框中终止密码子的存在而导致编码产物的异常终止)。一种特别的缺失突变是所谓的“基因敲除突变”，它基本上除去基因的所有编码序列或以其他方式使得它不能作为产生信使转录本的模板。
术语突变特别地包括在特定个体中由体细胞突变产生的而非组成型的变异体，例如仅在病变细胞中发现的变异体。这样的体细胞获得变异的实例包括通常导致涉及癌症发生的各种基因的功能改变的点突变。该术语也包括组成型存在的DNA改变，它以容易证明的方式改变了编码蛋白质的功能，并且可以由受影响者的孩子遗传下去。在这方面，该术语与多态性重叠，但一般是指在家族的过去几代人中发生并且不在人群中广泛传播的组成型变化的亚集。
在特定的实例中，突变是灭活的，从而天然基因的功能被完全破坏。
核酸分子：核苷酸的聚合形式，其可包括RNA、cDNA、基因组DNA及其合成形式和混合聚合的正义链和反义链。核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。本文所用的核酸分子与核酸和多核苷酸是同义的。核酸分子通常是至少10个碱基的长度，除非另有规定。该术语包括单链和双链形式。多核苷酸可以包括通过天然存在的核苷键和/或非天然存在的化学连接体连接到一起的天然存在的和修饰的核苷酸中的任一种或两者。
核酸分子可被化学地或生物化学地修饰或可以含有非天然的或衍生的核苷酸碱基，这可以为本领域技术人员很容易地理解。这些修饰包括，例如标记、甲基化、用类似物替代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰，如不带电的键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧链部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和修饰的键(例如，α-异头核酸等)。术语核酸分子也包括任何拓扑构象，包括单链、双链、局部双联体、三联体、发夹结构、环状和扣锁构象。还包括模拟多聚核苷酸通过氢键和其它化学相互作用结合指定序列的能力的合成分子。这种分子在本领域中是已知的，且包括，例如，在分子骨架中肽键替换磷酸酯键的那些。
除非另有说明，按正义方向书写的多核苷酸序列的左手端是5′端，序列的右手端是3′端。此外，以正义方向书写的多核苷酸序列的左手方向称为5′方向，而多核苷酸序列的右手方向称为3′方向。另外，除非另有说明，本文中各个核苷酸序列作为脱氧核糖核苷酸的序列给出。然而，意图的是给定的序列按照对于多核苷酸的组成适当的方式解释：例如，如果分离的核酸是由RNA构成的，则给定序列应该是尿苷取代胸苷的核糖核苷酸。
反义核酸是具有与第二核酸分子(例如，mRNA分子)序列互补的序列的核酸(如RNA或DNA寡核苷酸)。反义核酸将以高亲和力与第二核酸序列特异性结合。例如，如果第二核酸序列是mRNA分子，则反义核酸与mRNA分子的特异性结合可以防止或减少mRNA翻译成所编码的蛋白质或缩短mRNA的半衰期，并由此抑制所编码的蛋白质的表达。
核苷酸：“核苷酸”包括，但不限于，包含连接到糖上的碱基(如嘧啶、嘌呤或其合成的类似物)或连接到氨基酸上的碱基(如在肽核酸中(PNA))的单体。核苷酸是多核苷酸中的单体。核苷酸序列是指多核苷酸中的碱基序列。
寡核苷酸：寡核苷酸是通过天然的磷酸二酯键连接的多个结合的核苷酸，长度在大约6个到大约300个核苷酸之间。寡核苷酸类似物是指与寡核苷酸功能相似但具有非天然存在的部分的化合物部分。例如，寡核苷酸类似物可以含有非天然存在的部分，例如改变的糖部分或糖间连接，如硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸。天然存在的多核苷酸的功能类似物可以结合RNA或DNA，并且包括肽核酸(PNA)分子。
特定的寡核苷酸和寡核苷酸类似物可以包括长度最多达约200个核苷酸的线性序列，例如，至少6个碱基，例如至少8个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个或甚至200个碱基长，或约6个到约50个碱基，例如约10-25个碱基，如12、15或20个碱基的序列(如DNA或RNA)。
可操作地连接：当第一核酸序列处于与第二核酸序列功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。比如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。一般来说，可操作地连接的DNA序列是连续的，且在必需结合两个蛋白质编码区域的情况中，是在同一阅读框中的。
开放阅读框：一系列编码氨基酸的核苷酸三联体，没有任何内部的终止密码子。这些序列通常可翻译成肽。
药学上可接受的载体：本发明使用的药学上可接受的载体是常规的。Martin，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.出版，Easton，PA，19th Edition，1995描述了适用于本文公开的核苷酸和蛋白质的药物递送的组合物和制剂。
一般情况下，载体的性质将依赖于所采用的特定施用方式。例如，肠道外制剂通常包括可注射的流体，包括药学上和生理上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等等作为媒介。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的非毒性固体载体可以包括，例如，药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性的载体，用于施用的药物组合物可以含有少量无毒的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
空斑形成单位(PFU)：病毒剂量的测量度，由其在感受的补充(complementing)细胞系上形成空斑的能力测定。
多肽：其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体，优选L-光学异构体。本文所用的术语多肽或蛋白质包括任何氨基酸序列，并包括如糖蛋白的修饰序列。术语多肽特别地意图涵盖天然存在的蛋白质以及重组或合成产生的那些蛋白质。
术语多肽片段是指表现出至少一个有用的表位的多肽部分。短语“多肽的功能性片段”是指保持该片段所来源的多肽的活性或者活性的可测量部分的所有多肽片段。例如，片段在大小上可以是小到能够结合抗体分子的表位的多肽片段和能够参与细胞内表型改变的特征性诱导或程序化的大多肽。表位是能够结合响应于与抗原的接触而产生的免疫球蛋白的多肽区域。因此，含有胰岛素生物活性的较小肽或胰岛素的保守变异体作为有用的包括在内。
提供了功能相似的氨基酸的保守氨基酸置换表是本领域技术人员熟知的。以下六组是被认为是彼此的保守置换的氨基酸的实例：
1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸I，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
在某些情况下，导致氨基酸变化的cDNA序列的变异(无论是保守的还是非保守的)被最小化以保持所编码蛋白质的功能和免疫学同一性。可以通过确定它是否被抗体识别来评估蛋白质的免疫学同一性；被这种抗体识别的变异体是免疫学保守的。任何cDNA序列变异体优选引入不超过20个，优选少于10个氨基酸置换到编码的多肽中。变异体氨基酸序列可以与天然氨基酸序列，例如，80％、90％或者甚至95％或98％相同。用于确定同一性百分比的程序和算法可以在NCBI网站是找到。
蛋白质：由基因表达并由氨基酸组成的生物分子，特别是多肽。
纯化的：术语“纯化的”不要求绝对的纯度；相反，它意图作为相对的概念。因此，例如，纯化的蛋白质制剂是其中所指的蛋白质比在细胞或生产反应室(适当的情况下)中的自然环境中的蛋白质纯度更高的蛋白质。
重组体：重组核酸是具有不是天然存在的序列或具有由两个另外分离的序列片段人工组合而成的序列的核酸。这种人工组合可以通过化学合成完成，或更常用的是，通过人工操作分离的核酸片段完成，例如，通过遗传工程技术。
序列同一性：两个核酸序列或两个氨基酸序列之间的相似性以序列之间的相似度来表示，或者称为序列同一性。经常以同一性百分比的形式测量序列同一性(或相似性或同源性)；百分比越高，两个序列越相似。
用于比较的序列比对方法是本领域中公知的。各种程序和比对算法描述在：Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482，1981)；Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443，1970)；Pearson和Lipman(PNAS USA 85：2444，1988)；Higgins和Sharp(Gene，73：237-244，1988)；Higgins和Sharp(CABIOS 5：151-153，1989)；Corpet等(Nuc.Acids Res.16：10881-10890，1988)；Huang等(Comp.Appls Biosci.8：155-165，1992)和Pearson等(Meth.Mol.Biol.24：307-31，1994)中。Altschul等(Nature Genet.，6：119-129，1994)提供了序列比对方法和同源性计算的详细描述。
比对工具ALIGN(Myers和Miller，CABIOS 4：11-17，1989)或LFASTA(Pearson和Lipman，1988)可以被用来进行序列的比较(InternetProgram
Figure BPA00001618564400201
1996，W.R.Pearson and the University of Virginia，fasta20u63version 2.0u63，发布日期December 1996)。ALIGN比较相互之间的整个序列，而LFASTA进行局部相似性区域的比较。这些比对工具及其各自的教程在NCSA网站是通过互联网提供。或者对于超过约30个氨基酸的氨基酸序列的比较，可以利用使用设置在默认参数(空隙存在代价11，和每残基空隙代价1)的默认BLOSUM62矩阵的Blast2序列函数。在比对短肽(少于大约30个氨基酸)时，应该使用Blast 2序列函数进行比对，采用设置为默认参数(开放 空隙9，延伸空隙 罚分)的PAM30矩阵。BLAST序列比较系统可，例如，从NCBI网站获得；也参见Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990；Gish.& States，NatureGenet.3：266-272，1993；Madden等Meth.Enzymol.266：131-141，1996；Altschul等，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997和Zhang & Madden，Genome Res.7：649-656，1997。
蛋白质的直系同源通常特征在于使用设置为默认参数的ALIGN进行与定蛋白质的氨基酸序列的全长比对具有大于75％的序列同一性。与参考序列具有甚至更大相似性的蛋白质当通过这一方法评估时会显示出更高的同一性百分比，如至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少98％的序列同一性。此外，可以对公开的肽的特定结构域的全长进行序列同一性比较。
当明显小于完整序列的序列进行序列同一性的比较时，同源序列将通常在10-20个氨基酸的短窗口上具有至少80％的序列同一性，并且根据他们与参照序列的相似性可以具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性。在这样的短窗口上的序列同一性可使用LFASTA确定，方法描述地NCSA网站。本领域技术人员将会理解，所提供的这些序列同一性范围仅作为指导，获得落在提供的范围以外的强显著同源序列是完全有可能的。
两个核酸分子密切相关的另一种可选的指示是在严格条件下这两个分子彼此杂交。严格条件是序列依赖性的，且在不同的环境参数下是不同的。一般而言，严格条件被选择为在确定的离子强度和pH值下低于特定序列的热熔点I约5℃至20℃。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在确定的离子强度和pH条件下)核酸杂交的条件和严格性计算可以在Sambrook等(Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，New York，1989)和Tijssen(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology Part I，Ch.2，Elsevier，New York，1993)中找到。
产生特定的严格性程度的杂交条件会随着选择的杂交方法的特性和杂交的核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(特别是Na+浓度)将决定杂交的严格性，虽然所耗费时间也影响严格性。关于获得特定的严格性程度所需的杂交条件的计算由Sambrook等(ed.)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989，chapters 9 and 11描述，其在此引入作为参考。下面是一组示例性的杂交条件：
非常高的严格性(检测具有90％同一性的序列)
杂交：5x SSC，在65℃下16小时
洗涤两次：2xSSC，在室温(RT)每次15分钟
洗涤两次：0.5xSSC，在65℃下每次20分钟，
高严格性(检测具有80％同一性或更高的序列)
杂交：5x-6x SSC，在65-70℃下16-20小时
洗涤两次：2x SSC，在室温(RT)每次5-20分钟
洗涤两次：0.5x SSC，在65℃下每次30分钟，
低严格性(检测具有大于50％同一性的序列)
杂交：6xSSC，在室温至55℃下16-20小时
洗涤至少两次：2x-3xSSC室温至55℃下每次20-30分钟。
未显示出高的同一性程度的核酸序列由于遗传密码的简并性仍然可能编码相似的氨基酸序列。可以理解，核酸序列中的变化可以利用这种简并性造成以产生编码基本相同的蛋白质的多个核酸序列。
可特异性地杂交和特异性互补是表明足够程度的互补性以使得在寡核苷酸(或它的类似物)与DNA或RNA靶标之间发生稳定和特异性地结合的术语。寡核苷酸或寡核苷酸类似物不需要与可特异性杂交的的靶序列100％互补。当寡核苷酸或类似物与靶DNA或RNA分子的结合干扰了靶DNA或RNA的正常功能，且有足够程度的互补性以在需要特异性结合的条件下(例如在体内测定或系统的情况中的生理条件下)避免寡核苷酸或类似物与非靶序列的非特异性结合时，寡核苷酸或类似物是可特异性杂交的。这种结合被称为特异性杂交。
受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，包括人类和非人类的哺乳动物的一大类。此术语包括已知和未知的个体，因此操作受试者样品的人员不需要知道受试者是谁或者甚至样品是从那里获得的。
靶序列：“靶序列”是与治疗有效的寡核苷酸或寡核苷酸类似物杂交时导致表达的抑制的ssDNA、dsDNA或RNA的一部分。可以使用反义或正义分子靶向于dsDNA的一部分，因为这两者都会干扰dsDNA的该部分的表达。反义分子可以结合正链，而反义分子可以结合负链。因此，靶序列可以是ssDNA、dsDNA以及RNA。
转化的：转化的细胞是已通过分子生物学技术引入核酸分子的细胞。如本文所使用，术语转化包括可以用于将核酸分子引入到这种细胞中的所有技术，包括病毒载体转染、质粒载体转化及通过电穿孔、脂质体转染和粒子枪加速引入裸DNA。
肿瘤：赘生物。该术语包括实体肿瘤和血液肿瘤。
血液肿瘤的实例包括，但不限于：白血病，包括急性白血病(如急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、急性骨髓性白血病及粒细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(例如慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、骨髓发育异常综合征、和骨髓发育不良、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如霍奇金氏病、所有非霍奇金淋巴瘤形式)、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症和重链病。
实体肿瘤如肉瘤和癌瘤的实例包括但不限于：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管细胞癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、膀胱癌、黑色素瘤和CNS肿瘤(如神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤(craniopharyogioma)、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、少突胶质细胞瘤、听神经瘤、脑脊膜瘤(menangioma)、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
肿瘤相关抗原或肿瘤抗原(TAA)：可以刺激肿瘤特异性T细胞限定免疫应答或对于肿瘤细胞的抗体的肿瘤抗原。免疫原性组合物，如癌症疫苗，可以包含一种或多种TAA。
在足以…的条件下：是用来描述允许所需活性的任何环境的短语。
疫苗：可施用于哺乳动物(如人类)以赋予针对疾病或其它病理状态的免疫力(如主动免疫力)的免疫原性组合物。疫苗可预防性或治疗性地使用。因此，疫苗可以降低患病(如肿瘤或病理性感染)的可能性或降低疾病或病症的症状的严重程度、限制的疾病或病症(如肿瘤或病理性感染)的发展或限制疾病或病症(如肿瘤)的复发。在特定的实施方案中，疫苗是表达异源抗原(如来源于肺、前列腺、卵巢、乳腺、结肠、子宫颈、肝脏、肾脏、骨或黑色素瘤的的肿瘤的肿瘤相关抗原)的复制缺陷型CMV。
载体：特定序列的核酸分子可以整合到载体中，该载体然后被引入到宿主细胞中，从而产生转化的宿主细胞。载体可以包括使它能够在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制起点。载体还可以包含一个或多个选择标记基因和本领域中已知的其他遗传元件，包括指导核酸表达的启动子元件。载体可以是病毒载体，如CMV载体。病毒载体可以由野生型或减毒病毒(包括复制缺陷型病毒)构建。
在特定的非限制性实例中，病毒载体是缺少必需的糖蛋白(如gB、gD、gH或gL)的复制缺陷型CMV。
载体也可能是非病毒载体，包括任何本领域已知的质粒。
病毒：在活细胞内部繁殖的微观感染性生物体。病毒基本上由蛋白质外壳(衣壳)包围的单核酸的核心组成，并仅在活细胞内部具有复制能力。“病毒复制”是由至少一个生命周期的存在产生额外的病毒颗粒。病毒可以破坏宿主细胞的正常功能，导致该细胞以病毒确定的方式运转。例如，病毒感染可能导致细胞在未感染细胞通常不产生细胞因子或对细胞因子作为响应时产生细胞因子或对细胞因子作为响应。
在“裂解性”或“急性”病毒感染中，病毒基因组被复制并且表达，从而生成病毒衣壳产生必需的多肽。成熟的病毒粒子脱离宿主细胞，从而导致细胞裂解。特定病毒种也可以交替进入“溶源性”或“潜伏性”感染。在潜伏确定时，病毒基因组复制，但不产生衣壳蛋白和组装成病毒颗粒。
除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。单数术语“一”，“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文清楚地说明并非如此。类似地，除非上下文另外明确指出，词语“或”意在包括“和”。因此，“包括A或B”意指包括A或者B或者A和B。要进一步理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基的大小或氨基酸的大小及所有分子量或分子质量值是近似的，并提供用于说明。尽管类似或等同于本文所描述的那些方法和材料的方法和材料可以用在本发明的实施和测试中，但是合适的方法和材料在下面进行描述。所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献的全部内容通过引用并入本文作为参考。在存在矛盾的情况下，以本说明书为主，包括术语的解释。
III.几个实施方案的概述
本文所描述的是在受试者体内产生对抗异源抗原的长期重复刺激的免疫应答的方法：包括通过腹膜内或静脉内施用(例如，单次施用)向受试者施用重组的复制缺陷型巨细胞病毒(包含编码该抗原的异源核酸)，由此在受试者体内建立病毒潜伏，该潜伏导致对抗该抗原的重复刺激的免疫应答。在特定的实施方案中，重复刺激的免疫应答包括CD8+T细胞免疫应答。在其它实施方案中，异源抗原包括细菌、真菌、病毒或肿瘤源的多肽。在进一步的示例性实施方案中，肿瘤源的多肽是癌抗原。
在再进一步的实施例中，重组的复制缺陷型巨细胞病毒包含失活的gB、gD、gH或gL糖蛋白基因，如通过敲除突变而失活的gL糖蛋白。
在特定的实施方案中，编码该抗原的核酸可操作地与组成型启动子连接。在其它实施方案中，编码该抗原的核酸可操作地与诱导型启动子连接。
在所描述方法的一些实施方案中，重组的复制缺陷型巨细胞病毒是鼠巨细胞病毒。在其它实施方案中，重组的复制缺陷型巨细胞病毒是人巨细胞病毒，如CMV的AD169、Davis、Toledo和Towne株。
本文还描述了已被诊断患有癌症的受试者的治疗方法，包括：向受试者施用一种化疗药物或免疫抗癌剂或者化疗药物或免疫抗癌剂的组合；和通过腹膜内或静脉内施用向该受试者施用重组的复制缺陷型巨细胞病毒(包含编码源自该癌症的异源抗原的异源核酸)，由此在受试者体内建立病毒潜伏，从而产生对抗该癌症的重复刺激的免疫。
在这些方法的特定实施方案中，重复刺激的免疫力包括CD8+T细胞免疫应答。在其它实施方案中，重组的复制缺陷型巨细胞病毒包含失活的gB、gD、gH或gL糖蛋白基因，如通过敲除突变而灭活的gL糖蛋白。
在一些实施方案中，重组的复制缺陷型巨细胞病毒是人巨细胞病毒，如CMV的AD169、Davis、Toledo和Towne株。
而在另外的实施例中，所描述的治疗已被诊断为患有癌症的受试者的方法还包括对受试者进行放射治疗。
IV.使用复制缺陷型CMV产生长期的重复刺激免疫应答
CMV感染在可通过病毒滴度和宿主免疫应答的显著变化区分的两个明显不同的阶段中进行(图1)。与其它病毒种的感染相似，初始CMV滴度在感染的急性期急剧上升，表明病毒的复制和细胞裂解。同样地，宿主免疫应答急剧提高，如由CMV-反应性T细胞的百分比所显示的。虽然这种CMV-触发的免疫应答引起急性感染的消除，但CMV没有从宿主中根除。相反，病毒在特定的细胞类型中建立潜伏，包括内皮细胞和CD34+造血干细胞(HSC)(Sissons等，Journal of Infection44：73-77，2002)。在潜伏感染期间，病毒滴度通常低于检测限。在健康个体中，急性CMV感染的偶尔复发被相当大百分比的CMV-反应性的记忆T细胞快速清除。事实上，已证明，在初始急性感染后，在小鼠和人体中对CMV作出反应的CD8+T细胞发生了“记忆扩张”，占据宿主生命期CD8+T细胞记忆空间的约10％(Karrer等，J.Immunol.170：2022-2029，2003；Sylwester等，J.Exp.Med.202：673-685，2005；Gillespie等，J.Virol.74：8140-8150，2000)。这些“扩张的”的CMV特异性记忆T细胞的大部分具有一个组织巡逻效应子记忆表型和直接效应子能力(Bitmansour等，J.Immunol.169：1207-1218，2002)。这些细胞的大数量和直接效应子能力表明，他们被重复刺激。这归因于CMV重复发生小的迅速受到控制的活性病毒感染复发的事实(Wherry和Ahmed，J.Virol.78：5535-5545，2004)。因此，目前的观点是认为重复刺激的表型不可避免地与具有复制能力的病毒关联。
本文公开的令人惊讶的观察显示，当通过单一腹膜内或静脉内剂量施用于受试者时，复制缺陷型CMV完全不能产生感染性病毒颗粒，因而不能在细胞间扩散，但能诱发CD8+T细胞记忆扩张，指示了重复刺激的存在。用该方法诱导的T细胞具有组织运输、效应子记忆表型并且能够提供在组织中对抗抗原的直接保护。
对免疫力低下的个体施用以具有复制能力的CMV为载体的疫苗的内在危险是众所周知的。因此本领域的技术人员将认识到本文中描述的完全复制无能的CMV可以产生CMV-反应性CD8+T细胞免疫应答的意外发现的益处，和该发现可以如何用于开发普遍安全的以CMV为载体的免疫原性组合物。
因此，本文提供了重组的复制缺陷型CMV病毒载体，其编码作为免疫刺激剂(例如，疫苗)以诱发对异源抗原的长期的重复刺激的免疫应答的异源抗原。这些工程化的免疫刺激病毒可以用于，例如，诱发根据插入到病毒载体中的异源抗原对抗细菌、原生动物、真菌和病毒病原体以及对抗肿瘤的长期的重复刺激免疫应答。
本文描述了在受试者中产生对抗异源抗原的长期的重复刺激免疫应答的方法。该方法涉及一次性腹腔内或静脉内施用重组的复制缺陷型CMV，其包含编码该异源抗原的异源多核苷酸。这种一次性施用足以重复刺激免疫系统以引起对抗该抗原的长期的基于激活的CD8+T细胞的免疫力，并通过扩展而对抗表达该抗原的病原体或肿瘤。
复制缺陷型CMV
本文描述的方法采用完全不能在初始宿主细胞中扩散的CMV。因此，本文考虑使用可以建立潜伏期并由此提供对于免疫系统的重复刺激(即使以该载体的单次施用)但不能产生感染性病毒颗粒的任何无复制能力的CMV。在特定的非限制性实施例中，CMV是复制缺陷的，因为它包含失活的(例如，敲除的)gB、gD、gH或gL糖蛋白基因。在其他实施例中，CMV包含生成感染性病毒颗粒所必需的多个失活的关键基因(其可以包括或不包括一个或多个糖蛋白基因)。
本领域熟知产生失活基因突变(包括但不限于“敲除”突变)的方法(Ausubel等(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterScience出版，2009(ISSN 1934-3639))。突变核酸的这样一种方法是克隆该核酸或其部分，通过定点或随机诱变改变核酸的序列和将突变的核酸重新引入到病毒基因组中，例如通过同源重组。
灭活关键CMV复制基因的另一种方法是通过删除该基因的基因组存在拷贝的全部或部分。在一个实施例中，整个基因被缺失(即敲除突变)，该缺失以基本上不可能回复到该基因的功能性形式的方式发生。在另一个实施方案中，产生部分缺失。在另一个实施方案中，编码对于多肽的功能必需的氨基酸残基的核酸部分(例如，对于与gH的相互作用必需的那些gL氨基酸)缺失。
在特定的实施例中，关键CMV复制蛋白如gB、gD、gH或gL糖蛋白通过基因的敲除缺失而灭活。使用gL糖蛋白作为说明性实例，靶基因的缺失可以按如下步骤进行：分离CMV gL基因序列(例如，通过病毒DNA的扩增)并将其插入到克隆载体中，包括gL基因本身的编码序列上游和下游的一部分核酸序列。然后在体外将基因的编码区从载体删除，留下足够长度的5′和3′侧翼序列以允许与病毒基因组中天然存在的基因进行同源重组。然后将修饰的载体转化进入CMV感染细胞，在该细胞中该敲除突变经由侧翼区域的同源重组整合到CMV基因组中。另一种方法使用修饰的载体转化表达在细菌人工染色体(BAC)中的CMV基因组的细菌细胞(Borst等，Current Protocols inImmunology，Ch.10，Unit 10.32，Wiley InterScience出版，2009(ISSN1934-3671))。然后将重组BAC转染到感受细胞中以允许生成重组病毒。这些方法生成其中gL基因已被删除，并且只能通过补充缺失的gL(如通过注入同时表达gL蛋白的宿主细胞或在表达gL蛋白的辅助病毒存在下)繁殖的病毒株。在特定的实施方案中，编码失活的靶基因的核酸序列被标记基因如LacZ、荧光素酶或绿色荧光蛋白取代。这样的标记基因不意图引起宿主免疫应答，而是可以被用来识别重组病毒。
另一种使天然存在的基因失活的方法是在原位诱变基因的基因组拷贝，例如，通过使用诱变的寡核苷酸转化感染的细胞(参见例如Storici等，Nature Biotech.19：773-776，2001的方法)。
任何复制缺陷型CMV都被考虑用在本文描述的方法中，同样地，CMV的不同株可以用来生成如本文所述的复制缺陷型CMV载体。在特定实施方案中，CMV是鼠CMV(mCMV)。在其它实施方案中，它是非人类灵长类动物的CMV，如猕猴CMV。在其它实施方案中，它是人CMV(hCMV)。在再其它的实施例中，复制缺陷型CMV是基于CMV的AD169、Davis、Toledo和Towne株或由其衍生的任何人CMV。
异源抗原
本文描述的方法涉及使用复制缺陷型CMV载体作为免疫原性组合物的基础以在受试者中产生对抗由CMV载体表达的异源抗原的长期的重复刺激的免疫应答。这种长期的免疫应答产生的同时产生如本文所述的针对病原体或肿瘤的直接保护(借助CTL杀伤作用)以及终身免疫力。
在所描述的方法中所使用的异源抗原是由整合到复制缺陷型CMV的基因组中的异源多核苷酸编码的抗原性多肽。在特定的实施例中，抗原性多肽来源于细菌、真菌或原生动物细胞、病毒或肿瘤细胞。该多肽可以是有利地作为抗原使用以刺激免疫应答的任何事物，虽然考虑到引起对抗特定抗原的长期的免疫应答的益处会受到该选择的影响。
抗原性多肽序列可以具有足以引起免疫应答的任何长度。在特定的实施例中，该多肽的长度是至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个氨基酸或更长。类似地，为维持对抗细菌、原生动物、真菌、病毒或肿瘤的免疫应答的特异性，抗原性多肽的序列同一性不必与天然多肽的序列同一性相同。本领域技术人员会认识到，多肽的序列可以在保持其抗原特异性(即，激以仍然提供对于天然蛋白的反应性的抗原反应的能力)的同时发生明显的改变。因此，在特定的实施例中，抗原性多肽与其所来源的多肽至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。在特定的实施例中，多肽是在不同的物种中存在的(异种的)宿主多肽的类似物。
在特定的实施例中，抗原是源自病原生物体如细菌、真菌、原生动物或病毒的多肽。
细菌病原体包括，但不限于：结核分枝杆菌、炭疽芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌。真菌病原体包括，但不限于：曲霉、念珠菌、球虫、隐球菌、地丝菌、组织浆菌、小孢子虫和肺囊虫。原生动物病原体包括，但不限于：疟原虫和利什曼原虫。病毒性病原体包括但不限于：乳腺病毒、沙粒病毒、诺如病毒(Norovirus)、冠状病毒、环曲病毒(Torovirus)、马尔堡病和其他出血热病毒如埃博拉病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、水痘病毒、流感病毒、乳头状瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、痘病毒包括天花病毒、慢病毒如HIV、FIV和SIV。
在其他实施例中，由复制缺陷型CMV携带的异源多核苷酸编码来源于肿瘤的多肽。肿瘤可以是任何类型的细胞增殖性疾病或病症的结果，且还可以是良性的或恶性的。在特定的实施例中，肿瘤是癌性的。这样的肿瘤可以是任何类型的癌症，包括但不限于：白血病包括急性白血病(如急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、急性骨髓性白血病及成髓细胞、早幼粒细胞、骨髓单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、骨髓发育异常综合征和骨髓发育不良、真性红细胞增多症、淋巴瘤(诸如霍奇金氏病、非霍奇金淋巴瘤的所有形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特巨球蛋白血症和重链病。实体肿瘤(如肉瘤和癌瘤)的实例，包括但不限于：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、癌汗腺、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、膀胱癌、黑色素瘤和CNS肿瘤(如神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑脊膜瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
可以由所描述的方法的异源多核苷酸编码的抗原性肿瘤源多肽包括也被称为肿瘤相关抗原(TAA)的多肽及由其衍生的多肽。已经确认了许多TAA。这些包括但不限于：人端粒酶逆转录酶(hTERT)、存活素、MAGE-1、MAGE-3、人绒毛膜促性腺激素、癌胚抗原、甲胎蛋白、胰癌胚抗原、MUC-1、CA125、CA 15-3、CA19-9、CA 549、CA195、前列腺特异性抗原、前列腺特异性膜抗原、Her2/neu、gp-100、trp-2、突变体K-ras蛋白、突变体p53、截断表皮生长因子受体、嵌合蛋白质sup.p210BCR-ABL；人乳头状瘤病毒的E7蛋白和Epstein-Barr病毒的EBNA3蛋白(这些TAA及其它蛋白在Novellino等，CancerImmunology and Immunotherapy，54：187-207，2005中描述，在此通过引用引入本文)。
普通技术人员会认识到，本文讨论的示例性异源多肽的列表既不是穷尽的也不是有意用于限制的。因此，应该认识到本文中所提供的方法可用于有利于以产生长期的自身启动免疫力的任何多肽的表达，并因此用于与该多肽相关的免疫刺激。
CMV潜伏和异源抗原的表达
除了其他细胞类型，CMV在CD34+造血干细胞(HSC)中建立潜伏(Sinclair，J.Clin.Virol.41：180-185，2008 and Mocarski等，Cytomegaloviruses：Molecular Biology and Immunology.M.J.Reddehase，ed.，Caister Academic Press出版，Wymondham，U.K.，pp.464-482，2006)。虽然CMV不包含任何已知的潜伏特异性基因，CMV基因组终生保持在HSC中。本文提供了令人惊讶的观察结果，即复制缺陷型CMV可引发长期的重复刺激的免疫应答，这表明作为HSC分裂的后代，寄宿于其中的CMV基因组也被复制并传递给子细胞而没有产生感染性病毒颗粒。尽管不希望被单一的理论约束，据认为HSC作为宿主的(或其他细胞作为宿主的)潜伏是复制缺陷型CMV维持和刺激记忆扩张的能力的可能解释。随着HSC分化成成熟的单核细胞和树突状细胞，CMV重激活并在3个基因种类的受控级联中完全地表达全数基因：即刻早期(IE)、早期(E)、晚期(L)(Mocarski和Courcelle，Fields Virology，Vol.2.D.M.Knipe和P.M.Howley，eds.，LippincottWilliams and Wilkins出版，Philadelphia，p.2629-2674，2001)。然而，潜伏感染的细胞也可能发生其中只有IE基因被表达的异常终止的复制循环(Reddehase等，Journal of Clinical Virology 25 Suppl 2：S23-36，2002；Kurz等，Journal of Virology 71：2980-2987，1997；Kurz等，Journal ofVirology 73：8612-8622，1999)。异常终止的重激活远比完全的复制循环更常见。因此，免疫系统在所有抗原呈递细胞最有效能的环境中反复暴露于IE抗原。
在本文描述的免疫刺激方法中，编码抗原的异源多核苷酸插入到复制缺陷型CMV基因组(CMV载体)中。生成重组病毒载体的方法是本领域中公知的(参见Ausubel等(eds.)，Current Protocols in MolecularBiology，Wiley InterScience出版，2009(ISSN 1934-3639)和(Borst等，Current Protocols in Immunology，Ch.10，Unit 10.32，Wiley InterScience出版，2009(ISSN 1934-3671)。用于将异源多核苷酸插入到病毒基因组中的一种这样的方法是克隆足够长的5′和3′病毒基因组侧翼序列之间的目标多核苷酸以允许与天然存在的病毒基因组序列进行同源重组。然后所得的靶向载体被作为BAC转化到表达CMV基因组的细菌细胞中，在其中该多核苷酸通过侧翼区域中的同源重组整合到病毒基因组中。
异源多核苷酸可以与驱动引起免疫应答的异源抗原表达的任何启动子可操作地连接到。多核苷酸可以通过将多核苷酸插入到病毒基因组中的方式或在克隆多核苷酸的过程中与这种启动子可操作地连接。在特定的实施例中，启动子可以是CMV启动子，如CMV主要即刻早期启动子(MIEP)。在鼠IE启动子之后表达的表位在小鼠中引发的免疫显性的扩张的T细胞应答(Karrer等，J.Immunol.170：2022-2029，2003；Munks等，J.of Immunol.177：450-458，2006；Holtappels等，J.Virol.74：11495-11503，2000和Karrer等，J.Virol.78：2255-2264，2004)。在人类中类似地，IE编码的表位在潜伏感染期间具有不成比例的优势(Sylwester等，J.Exp.Med.202：673-68，2005)。
在其它实施方案中，异源多核苷酸连续地招募细胞转录机制并启动转录的组成型启动子可操作地连接(Fitzsimons等，Methods.28：227-236，2002)。在特定的实施例中，异源多核苷酸与强组成型启动子如人延伸因子1α(EF1-a)启动子可操作地连接(参见Kim等，Exp.Mol.Med.，37：36-44，2005)。在其他实施例中，异源多核苷酸与需要特定的条件或其他因素以起动转录的诱导型启动子可操作地连接(Guo等，TrendsMol Med.14：410-418，2008)。
构建重组病毒载体的详细方法在美国专利公开2005/0118192和美国专利公开2008/0044384中有描述，这两者都通过引用并入本文。
V.免疫原性制剂
在所描述的方法的特定实施例中，包含编码抗原的异源多核苷酸的重组复制缺陷型CMV是施用给受试者的免疫原性制剂。免疫原性制剂一般包含一种或多种药物组合物。免疫原性制剂一般被描述在，例如，M.F.Powell and M.J.Newman，eds.，“Vaccine Design(the subunit andadjuvant approach)，”Plenum Press(NY，1995)中。
虽然不是产生本文描述的长期的重复刺激的免疫应答必需的，但是免疫原性制剂可任选地包含免疫刺激剂例如佐剂。佐剂可以包括，但不限于，CpG寡核苷酸或者细胞因子如GM-CSF或白细胞介素-12或者抗体如抗-CTLA4。
在特定的实施例中，免疫原性制剂可以包含药学上可接受的载体。虽然本领域的普通技术人员已知的任何合适的载体可以应用于本发明的免疫原性制剂中，但是载体的类型根据施用方式变化。用于实施所描述的方法的免疫原性制剂被配制用于静脉内或腹膜内施用。在普通的贮存和使用条件下，这些制剂可包含防腐剂以防止微生物的生长。
适合于注射的免疫原性制剂的药物形式包括无菌水溶液或分散液。所有情况中，该形式必须是无菌的且必须是达到容易通过注射器的程度的流体。免疫原性制剂在制造和贮存条件下也必须是稳定的和必须保持对抗微生物如细菌和真菌的污染作用。
这类制剂也可以包含缓冲剂(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、糖类(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、赋予制剂与受体的血液等渗、低渗或弱高渗性的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。可选地，本发明中使用的免疫原性制剂可以配制为冻干产物。
根据接受治疗的受试者的状态，必然会出现剂量的一些差异。在任何情况下，负责给药的人员确定个体受试者的合适剂量。合适的剂量是当如上所述施用时能够激发高于基线(即，未治疗)水平的对抗病毒加载的异源抗原的免疫应答的免疫原性制剂的量。在某些实施例中合适剂量范围为从1千到1千万空斑形成单位。
可以监测免疫原性制剂的响应，例如，通过测量存在于病人体内的异源抗原反应性T细胞的百分比或响应于抗原的γIFN产生的刺激。随着长期的重复刺激免疫力的产生，对免疫原性制剂的响应在免疫原性制剂施用后数周或数年是可测量的。
与与未接种的患者相比，使用用于实施本文描述的方法的免疫原性制剂还应该能够在接种疫苗的患者中引起导致临床结果改善(例如，更频繁的缓解(完全或部分)或者更长的无疾病生存)的免疫应答。
在特定的实施例中，可以通过在不存在可检测的病毒的情况下检测宿主体内的CMV基因组DNA(例如，通过病毒DNA的PCR扩增)来确定是否建立潜伏(见Liu等，J.Virol.82：10922-10931，2008)。本领域的技术人员已知其他检测或确定潜伏的方法。
VI.癌症治疗的组合方法
用完全不能在细胞之间扩散的CMV载体产生长期的重复刺激的免疫应答的能力对癌症治疗是有益的。放疗和化疗治疗旨在直接杀死快速分裂的细胞。然而，许多微小转移不是快速分裂的而因此在这些治疗中生存下来。类似地，许多免疫的(例如基于抗体的)治疗方法是短效的，因而不能完全根除受试者体内的所有癌细胞。
本文所描述的方法的特定实施方案解决了传统癌症治疗的不足。该实施方案包括对受试者施用一种化疗剂或免疫抗癌剂或放射治疗或其组合；并且通过腹膜内或静脉内施用对受试者施用包含编码源自癌症的异源抗原的异源核酸的重组复制缺陷型巨细胞病毒，由此在受试者体内建立病毒潜伏，从而重复刺激免疫细胞以产生对抗癌症的长期的免疫力。
任何形式的癌症，如本文所述的那些，可以使用所描述的组合方法治疗。同样，编码任何癌抗原(如本文所述的那些)的多核苷酸可以用来产生所描述的方法的长期的重复刺激的免疫应答。
此外，放射治疗、免疫治疗和化学治疗的方法是本领域公知的(见Abeloff，Clinical Oncology 2nd ed.，2000Churchill Livingstone，Inc)。例如，诊断为患头颈部鳞状细胞癌的受试者施用化疗剂，如顺铂(Cooper等，N.Engl.J.Med.350(19)：1937-1944，2004)。其他类型的癌症也对顺铂治疗产生反应，如睾丸癌、卵巢癌或其他生殖系癌症。
在另一个实施例中，对诊断为患多发性骨髓瘤的受试者施用化疗(ICL诱导)剂，如美法兰。类似的治疗方案可用于患有对美法兰治疗产生反应的其他类型癌症的受试者，如卵巢癌和结直肠癌。
在另一个实施例中，对诊断为患淋巴瘤的受试者施用ICL诱导剂的，如CytoxanTM。淋巴瘤可以是对CytoxanTM治疗产生反应的任何类型的淋巴瘤，如霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。类似的治疗方案可用于患有对CytoxanTM治疗产生反应的其它类型癌症的受试者，如乳腺癌、多发性骨髓瘤、视网膜母细胞瘤、卵巢癌、成神经细胞瘤和白血病(包括急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性髓性白血病)。
在另一个实施例中，需要骨髓移植/预处理(conditioning)以治疗慢性髓性白血病或慢性淋巴细胞性白血病的受试者可以施用白消安。
在上述实施例中的通过化学疗法治疗的癌症可以替代地或附加地使用本领域已知根除受试者的癌症的其它方法治疗。这样的方法包括癌组织的外科手术切除、放射治疗或免疫治疗。
提供下面的实施例来说明某些特定特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为限制所描述的本发明的特定特征或实施方案。
实施例
实施例1：CMV-加载抗原引发的CTL的抗肿瘤效力
在开发有效的抗肿瘤疫苗面临的主要挑战是克服免疫系统不能区分肿瘤和自身蛋白的问题。最近，开发一种可遗传的免疫节育来控制野生小鼠的尝试表明在重组CMV载体中表达的正常自身蛋白有可能成为抗原性的(Lloyd等，Biol.Reprod.68：2024-2032，2003and Redwood等，J.Virol.79：2998-3008，2005)。在该项研究中，鼠透明带3(ZP3)(一种正常小鼠蛋白质)的天然序列在即刻早期2(IE2)启动子之后引入到MCMV中。引人注目的是，在如所观察的时间长度(＞230天)内，该病毒的单次接种使雌性小鼠完全不育。
该实施例证明，当在CMV的情况中表达时，肿瘤表达的自身抗原也成为免疫原性。也证明了CMV载体引发的免疫应答的治疗能力，并表明了CMV载体的抗肿瘤免疫原性制剂的潜在效力。在该实施例中，表达卵清蛋白(ova)的MCMV被用于免疫小鼠，在六个月后测定对卵清蛋白的CD8+T细胞反应。然后，他们用已经被卵清蛋白转染的侵袭性肿瘤激发。
方法
小鼠的感染.对C57BL/6小鼠以每只小鼠106pfu腹膜内注射MCMV-IE2-OVA(Snyder等，Immunity，29：650-659，2009)或对照的野生型MCMV。另外的对照小鼠未感染。六个月后，对小鼠采血用于分析T细胞对OVA的反应，并进行肿瘤激发。
细胞内细胞因子染色.为了制备细胞用于刺激，从小鼠尾静脉取血放入含有12μl肝素的收集管中以防止凝血。将血液转移到14ml管中并向各个样品加入3ml的红细胞裂解缓冲液(150mM NH4Cl，10mMNaHCO3)。混合样品，并在室温下孵育3分钟。在红细胞裂解后，向各管加入9ml的T细胞培养基(RPMI，10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、20mM谷氨酰胺、5x10-5M β-巯基乙醇)并且将细胞在500×g下离心10分钟。通过真空抽吸除去上清，并用250μl新鲜的T细胞培养基重悬细胞沉淀。最后，50μl的T细胞被等分加入到圆底96孔板的重复孔中。为制备用于刺激的肽，在新鲜的T细胞培养基中将指示的肽稀释至2μg/ml(～2μM)(在稀释之前，在-20℃下的100％DMSO中将肽原液保持在2mg/ml)。对于未刺激的孔，向T细胞培养基中加入相同体积的DMSO以代替肽。然后将布雷菲德菌素A(我们使用CD Biosciences公司的Golgi-Plug)在各个肽混合物中稀释至2μg/ml(Golgi-Plug储存管中的1∶500)，并将整个溶液小心混合。为了刺激T细胞，向96孔板中早已存在的50μl外周血细胞中加入50μl肽/Golgi-Plug混合物。轻缓混合样品并在37℃+5％CO2的增湿培养箱中孵育6小时。孵育6小时后，将细胞在冰上冷却5分钟。随后，向各孔加入100μl冰冷的FACS缓冲液(PBS；1％胎牛血清；0.01％叠氮化纳)，并将孔板在4℃下500×g细胞离心3分钟。离心后，倒掉上清液并用冰冷的FACS缓冲液和抗-CD8抗体(克隆53.6-7)的混合物在冰上重悬细胞。将细胞和抗体在4℃孵育过夜。次日早晨，将细胞洗涤3次。每次洗涤包括加入冰冷的FACS缓冲液并在4℃下以500×g离心3分钟。为保持细胞低温，每次离心之间将其保持于冰上。在第三次洗涤之后，在80μl BD Biosciences的Fix/Perm溶液中在4℃下固定细胞10分钟。随后，使用BD Biosciences的1x Perm/洗涤缓冲液洗涤细胞两次(如上所述)以除去任何过量的固定剂。最后，向各个样品中加入于1x Perm/洗涤缓冲液中稀释的抗-IFNγ(克隆XMG1.2)，并在4℃下孵育1小时。IFN-γ染色后，用1x Perm/洗涤缓冲液洗涤细胞3次，在FACS缓冲液中重悬，并在BD FACSCalibur流式细胞仪上进行测定。
肿瘤激发.用表达卵清蛋白和GFP的逆转录病毒载体转染B16黑色素瘤细胞系的侵袭性D5亚克隆。48小时后，通过FACS对细胞进行分选以获得GFP发光细胞。然后对这一细胞群体进行计数和并将20,000个细胞皮下注射到三组动物中各组的侧腹，每组6只动物：(a)未处理的对照动物(b)只用MCMV载体感染的小鼠(c)用MCMV感染的小鼠。每天用卡尺测量可触及肿瘤的直径，直到实验结束或直到小鼠濒死，在这种情况下他们被实施安乐死。
结果
使用在CMV IE2启动子之后表达卵清蛋白(MCMV-ova(Snyder等，Immunity，29：650-659，2009))的重组活MCMV株测试CMV-加载的免疫力发挥抗肿瘤效应了功能的能力。然后测试作为对抗高侵袭性表达卵清蛋白的肿瘤免疫原制剂的这一重组MCMV株。
为了评估CD8+T细胞对MCMV-加载肿瘤抗原的反应，通过单次腹膜内注射对小鼠施用MCMV-ova。六个月后，在正常的C57BL6小鼠的外周血中直接体外检测T细胞对MCMV-加载抗原的应答，不使用转基因的T细胞(图2A和B)。对MCMV-ova疫苗接种后六个月，ova特异性的免疫反应的范围为从1％到24％的CD8+T细胞，并且在6只小鼠中的5只为＞7％。
然后使用B16黑色素瘤的侵袭性亚克隆激发MCMV-ova接种的小鼠，其用表达卵清蛋白的逆转录病毒载体转染以产生D5-OVA。D5-OVA没有被克隆，且激发株系可能已包含一些ova阴性细胞。肿瘤在天然的和载体接种的小鼠中快速生长(图2C)，具有与亲本D5克隆相似的生长动力学。相反，在MCMV-ova免疫的小鼠中，测量在扩增的外周血淋巴细胞中的ova-特异性免疫反应，并且肿瘤的生长明显延迟。一只小鼠从未形成肿瘤。此外，从两只接种的小鼠获得的肿瘤细胞均为抗原逃逸变异体(antigen escape variant)，并且无法刺激ova特异性的B3Z杂交瘤细胞。因此，CMV-加载的免疫反应为这一高度侵袭性肿瘤的免疫逃逸提供了强大的选择性压力，并且在一种情况中提供了完全的保护。
实施例2：复制缺陷型ΔgL MCMV感染引发了持久的免疫原性激发和T细胞记忆扩张
平均而言，人类对于CMV提供其记忆CD8+T细胞区室的10％。近几年的研究已揭示这种非同寻常的对于CMV感染的免疫反应包括几个阶段。在看上去与那些由急性病毒(如牛痘病毒)引发的相似的初始CD8+T细胞反应之后，T细胞对MCMV的反应开始下降到特征性的“记忆”水平(Munks等，J.Immunol.176：3760-3766，2006)。但是，它随后开始被称为“记忆扩张”的显著过程(Karrer等，J.Immunol.170：2022-2029，2003和Munks等，J.Immunol.177：450-458，2006)。对于数个月的时间，CD8T细胞对特定表位的反应在数量上增加，最终在较高的水平达到平台，使得总的CMV特异性反应包含10％和30％之间的CD8+T细胞。
该实施例表明，gL糖蛋白已被删除的复制缺陷型MCMV可以有效地驱动由具有复制能力的CMV引发的免疫应答。复制缺陷型CMV最初用作阴性对照来研究对于记忆扩张的需求，预期它不表达任何抗原且因此没有记忆扩张。显示的结果证明了令人惊讶的相反结果的发现：复制缺陷型病毒事实上继续刺激扩张的T细胞应答。
方法
除非另有规定，方法如实施例1中所描述。用1×105个空斑形成单位的野生型MCMV或复制缺陷型ΔgL MCMV的单次腹膜内注射感染小鼠。通过MHC-四聚体染色(图3、4、5A和5C)和细胞内细胞因子染色(图5B)鉴定抗原特异性T细胞。如以上实施例中所述的进行对抗原特异性T细胞的IFN-γ产生的细胞内细胞因子染色。方案描述如下。
四聚体染色.为了制备细胞，从小鼠尾静脉取血置于含12μl肝素的收集管中以防止凝血。对于所示的3种四聚体中的各种将各只小鼠的50μl全血添加到圆底板的单个孔中。为了制备用于染色的四聚体，合成各种四聚体并通过NIH核心器件用指示的肽加载(见niaid.nih.gov/reposit/tetramer/overview.html)且与APC(别藻蓝蛋白)或PE(藻红蛋白)偶联。以16,100x g对未稀释的四聚体原液离心5分钟以去除任何聚集体。为染色T细胞，各批四聚体已预先滴定以确定最佳的染色浓度，这被认为是1x浓度。离心后，FACS缓冲液中将各四聚体稀释至3.5x浓度(配方见实施例1中)并将20μl的该混合物添加到96孔板的各个血液样品中。在这一点时的最终体积是70μl，且MHC四聚体染色试剂的最终浓度为1x。用四聚体在室温下黑暗中孵育细胞20分钟，然后如上述实施例1中所述用150μl的FACS缓冲液洗涤3次。各次离心后，用移液器小心从细胞去除上清液以避免搅动血液沉淀。第三次洗涤后，用表面标记CD8(克隆53.6-7)、CD127(克隆A7R34)和KLRG-1(克隆2F1)的抗体复染T细胞。用FACS缓冲液稀释抗体并在室温下黑暗中孵育细胞20分钟之前与血液样品混合。表面染色后，用150μl的FACS缓冲液洗涤细胞一次并如上所述小心除去上清液。接着，通过用200μl来自BD Biosciences的1x红细胞裂解缓冲液重悬红细胞使其裂解，在室温下孵育5分钟并以500×g离心。之后，如以上实施例中所述倾倒掉上清液，用FACS缓冲液将细胞再洗涤两次。在大多数情况下，用来自BD Biosciences的80μl Fix/Perm缓冲液将样品固定以在LSR II流式细胞仪上进行分析之前保持细胞形态。
结果
C57BL/6小鼠中CD8T细胞对野生型MCMV的反应
在通过野生型MCMV的腹膜内注射感染的C57BL/6小鼠中测定对MCMV感染的免疫反应。图3显示了感染后7天(图3A)和12周(图3B)CD8+T细胞对病毒蛋白的CMV表位刺激的反应。图3B中所示的产生对m139、M38和IE3的反应是记忆“扩张”的结果。
通过四聚体染色追踪T细胞记忆“扩张”以确定m139、M38和IE3反应性细胞的百分数。图4显示了外周血中反应性细胞的增加和达到平台。
响应于复制缺陷型MCMV感染的CD8+T细胞记忆扩张
使用缺乏编码必需的包膜糖蛋白gL的基因的病毒(由Dr JaneAllen馈赠)测试复制缺陷型CMV引发CD8+T细胞扩张的能力。在ΔgL病毒中，gL基因被lacZ基因替换；且该病毒通过补充细胞系(用gL转染的3T3细胞)上生长而繁殖。虽然该病毒能够复制其基因组，但它根本不能在细胞间扩散。
感染后最多29周，对抗原反应性细胞的四聚体染色测定CD8+T细胞对ΔgL病毒感染的反应。令人惊讶的是，如图5中所示，CD8+T细胞对这种病毒的反应显示特征性的记忆扩张，包括对IE3表位反应的重头晚期表现。反应低于用野生型病毒观察到的反应，但仍然是相当大的。感染后20周，IE3特异性的反应已经积累到外周血中所有CD8+T细胞的1-2％。M38-特异性的和m139-特异性的CD8+T细胞反应保持在相似的水平上(图5A)。
ΔgL感染后积聚的细胞在肽刺激后分泌效应子细胞因子IFN-γ(图5B)，这表明它们具有良好的直接效应子功能。对于这个实验，在感染后25周分析T细胞。在这个实施例中如实施例1中进行了肽刺激和细胞内IFN-γ的检测。此外，“扩张的”T细胞显示出表示感染(CD127lo，KLRG-1hi)后20周重复激活的表型，这类似于由野生型MCMV驱动的T细胞(图5C)。在整个感染的慢性阶段(＞3个月)，“扩张的”T细胞表达类似的表型。这一结果表明，虽然不能复制，这种“死”病毒继续表达病毒蛋白至少6个月。
因此，当被引入到小鼠中时，一些ΔgL MCMV实现对CD34+HSC的接触是可能的，这维持和支持该病毒基因组。病毒只感染HSC很小的一部分并且不能扩散，且不影响整体的造血。然而，很可能保持在体内，随着“感染”的HSC分化为DC而经历异常终止的重激活，并且在这个过程中刺激免疫应答。
实施例3：缺乏响应于皮下ΔgL MCMV感染的T细胞记忆扩张
如实施例2中所示，CD8+T细胞记忆扩张是由野生型和ΔgLMCMV的小鼠腹膜内感染驱动的。据信，ΔgL MCMV引发长效的自激发的T细胞记忆的能力是建立HSC中的CMV潜伏的结果。因此，使病毒接触到HSC的任何CMV施用(如静脉内施用)都会类似地引发特征性的T细胞记忆扩张。该实施例显示了复制缺陷型MCMV的皮下施用后未能检测到T细胞记忆扩张。
方法
如实施例1和实施例2对小鼠进行感染。然而，在该实施例中，用异氟烷麻醉小鼠，并通过向左后足垫单次注射用野生型或ΔgL MCMV感染小鼠。通过如实施例2所示的随着时间的四聚体染色测定外周血中T细胞对野生型和ΔgL MCMV的反应。
结果
小鼠足垫的皮下感染后，CD8+T细胞对复制缺陷型ΔgL MCMV的反应没有扩张。
在C57BL/6小鼠中测量皮下感染后复制缺陷型MCMV引发记忆“扩张”的能力。如图6中所示，用野生型MCMV通过皮下途径感染的小鼠中抗原特异性CD8+T细胞很容易扩张。实心圆代表野生型感染的小鼠，且各线显示单个小鼠。然而引人注目的是，尽管激发了急性CD8+T细胞应答(在感染后第7天M38-特异性CD8+T细胞是明显的)，用ΔgL病毒的皮下感染未能引发记忆“扩张”。该结果与ΔgLMCMV必须接触特定细胞类型如HSC以维持和驱动T细胞记忆“扩张”的想法一致。因此，这些数据表明，在注射的足垫部位不存在HSC靶。因此，目前认为，系统感染(i..p或i.V.)是使用复制缺陷型CMV作为载体驱动T细胞记忆“扩张”所需要的。
实施例4：复制缺陷型MCMV在严重联合免疫缺陷动物中不能生长
使用有复制能力的病毒作为疫苗载体引起实质的安全问题。如果接种疫苗的个体是或变成免疫抑制的，则病毒在该个人体内的复制和传播可能导致疾病和病态。此外，可能以不受控制的方式扩散到未接种疫苗的人群的任何疫苗可能会带来灾难性的后果，特别是如果该个体的免疫功能低下。然而，复制缺陷型载体缓解了这些问题，因为它不能在个体之间或者在疫苗接种的人体内扩散。该实施例使用重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠表明，ΔgL MCMV是真正复制缺陷的。这些小鼠没有B或T细胞且因此对病毒感染是极为敏感的。
方法
用不同剂量的野生型MCMV的或复制缺陷型ΔgL MCMV通过单次腹膜内注射感染SCID小鼠。通话该病毒在动物组中生长，直到该组中的任何小鼠表现出病态。因此，在所示的实施例中，用10PFU野生型病毒感染的几只小鼠36天后表现出发病的迹象(驼背姿势、竖起皮毛、眼睛红肿和呆滞)，并将该组中的所有小鼠处死。用ΔgL病毒感染的小鼠从来没有表现发病迹象并在感染后42天处死。处死时采集所有的动物脾脏、唾液腺、肝脏和肺并用液氮冷冻。随后，解冻受感染的组织，在1ml新鲜的T细胞培养基中悬浮(见实施例1的方法)，并用钻头通过Dounce均质化破碎。随后将等分的破碎组织冷冻在-80℃下。使用Qiagen的QiaAmp试剂盒单等分的组织收获DNA。为测定样本中存在的MCMV DNA的量，使用TaqMan
Figure BPA00001618564400441
Universal Mastermix(Applied Biosystems)对MCMV E1基因进行定量PCR。引物和探针由Invitrogen和Applied Biosystems分别合成。VICTM荧光报告染料标记的探针：ACTCGAGTCGGACGCTGCATCAGAAT；引物E1 for：TCGCCCATCGTTTCGAGA；引物E1 rev：TCTCGTAGGTCCACTGACGGA。为计算基因组拷贝数，在每个试验中包括标准曲线。对于标准曲线，通过从每管3x105拷贝到3拷贝的十倍稀释滴定包含来自MCMV的E1基因的质粒(pGEM-T-E1)。在Applied Biosystems，7700qPCR仪上采集数据。图中显示的数据来自于感染小鼠的脾。
结果
复制缺陷型MCMV不能在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中生长。
在感染的小鼠的脾脏中存在的病毒量如图7所示。数据表示为每微克总DNA的病毒DNA拷贝数，其表示受感染的器官中病毒的量。各符号代表单个小鼠。实心圆代表野生型MCMV感染的小鼠。当这些小鼠表现明显的发病证据(包括驼背姿势、竖起皮毛、眼睛红肿和呆滞)时停止实验，并采集组织。这一数据清楚地显示，低至10pfu的野生型MCMV可以在SCID小鼠(其没有B细胞或T细胞)中不受抑制地生长。在感染后36天，这些小鼠开始表现出发病迹象，并且在其脾脏中具有大量病毒。然而，用100,000pfu的ΔgL病毒感染的小鼠从未表现出病态并且在感染后42天被处死。在此时，在ΔgL感染动物(空心圆，n＝10)的脾脏中没有可检测的病毒。因此，在这些实验中使用的复制缺陷型ΔgL的感染剂量是制服SCID小鼠所需的野生型病毒的量(10pfu)的10,000倍。阴影区域代表这些实验中的检测极限。包括来自未感染小鼠的脾脏(最右侧的曲线图)用于比较。这些数据表明，即使在严重联合免疫缺陷小鼠中，复制缺陷型病毒也不能生长。
实施例5：响应于静脉内ΔgL MCMV感染的T细胞记忆扩张
该实施例讨论了通过静脉内施用的CMV导致的T细胞记忆扩张的检测。
用实施例2中描述的方法测量使用野生型和ΔgL MCMV静脉内感染的小鼠中的T细胞应答。小鼠通过静脉内注射野生型和ΔgL MCMV进行感染。动物也通过皮下及腹膜内感染作为对照。在感染之前和感染之后渐次地采集外周血样品，并通过所描述的四聚体染色测定CMV肽施用的T细胞反应。
实施例6：复制缺陷型CMV作为载体的抗原引发的CTL抗肿瘤效力
实施例1表明，CMV加载的抗原将引发对抗表达该抗原的细胞的有效免疫反应。另外，如实施例2中所示的，CMV能够重复刺激特征性CD8+T细胞应答而无论病毒在细胞之间扩散的能力。因此，由此得出表达肿瘤抗原的复制缺陷型CMV同样地引发有效监控表达特定病毒加载抗原的肿瘤细胞的存在并破坏该肿瘤细胞的CD8+T细胞反应。
本实施例描述了在受试者体内引发对特定癌抗原具有反应性的长期自激发的免疫应答的方法。还描述了单独或与化学治疗、免疫治疗或基于放射的治疗或组合地治疗已被诊断患有癌症的受试者的方法。
小鼠中的复制缺陷型CMV抗肿瘤免疫刺激制剂
生成缺乏gL的MCMV来表达肿瘤抗原，包括但不限于，trp-2和HER-2/neu。使用这些制剂对小鼠进行腹膜内或静脉内注射，且几个月后用肿瘤激发，例如B16黑色素瘤细胞用于trp-2疫苗和TUBO乳腺癌细胞用于HER-2/neu疫苗。如实施例1中，与对照小鼠比较肿瘤的形成。
或者，缺乏gL但表达卵清蛋白或HER-2/neu的MCMV用来免疫自发形成表达ova和HER-2/neu基因的乳腺肿瘤的转基因小鼠(B6.FVB-Tg(MMTV-neu/OT-I/OT-II)CBnelTg(Trp53R172H)8512Jmr/J)，其可从Jackson实验室(网上见jaxmice.jax.org/strain/007962.html)购买获得。在这些小鼠中，ova和HER-2/neu两者是真正的自身抗原。监测小鼠的肿瘤形成，并与对照小鼠对比。
另一种自发性肿瘤形成的模型是HER-2/neu转基因BALB/c小鼠。使用缺乏gL而表达HER-2/neu的MCMV感染这些小鼠，并监测乳腺肿瘤的自发形成。
人类中的复制缺陷型CMV抗肿瘤免疫刺激制剂
可开发表达一种或多种体液肿瘤抗原如HER-2/neu、MAGE-1、MAGE-A3、trp-1、trp-2、gp100、CEA、MUC-1、PSA或其他肿瘤抗原的缺乏gL的人CMV。产生的复制缺陷型CMV病毒载体制剂最初可以于I期临床试验中施用于患者，例如，传统的化疗和/或放疗治疗失败的患者和患有预后不良的重病的患者。一个实例是患有第4期黑色素瘤的患者。
举例来说，病毒载体制剂可以静脉内施用。然后监测患者中具有一个或多个生物效应的病毒载体的指征，如：(a)其外周血中肿瘤抗原特异性的T细胞的发生，(b)通过成像技术(如MRI)确定肿瘤块的变化，和(c)例如通过临床和实验室评估如血液、肾脏和肾功能检查确定疫苗的副作用。
参照应用了本发明公开的原理的许多可能的实施方案，可以认识到所阐明的实施方案只是本发明的优选实施例，而不应该被视为对本发明范围的限制。相反，本发明的范围是由以下权利要求书所限定的。因此，我们要求了这些权利要求范围和精神内的所有作为我们的发明。
Figure IPA00001618563900011

Claims (20)

1.在受试者体内产生抗异源抗原的长期的、重复刺激的免疫应答的方法，包括：
通过腹膜内或静脉内施用给受试者施用包含编码所述抗原的异源核酸的重组的复制缺陷型巨细胞病毒，由此在受试者体内建立病毒潜伏，从而产生抗该抗原的重复刺激的免疫应答。
2.权利要求1的方法，其中所述重复刺激的免疫应答包括CD8+T细胞的免疫应答。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述异源抗原包括细菌、真菌、病毒或肿瘤源的多肽。
4.权利要求3的方法，其中所述肿瘤源的多肽是癌抗原。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述重组的复制缺陷型巨细胞病毒包含灭活的gB、gD、gH或gL糖蛋白基因。
6.权利要求5的方法，其中所述灭活的基因编码gL糖蛋白。
7.权利要求6的方法，其中所述编码gL糖蛋白的基因是通过敲除突变灭活的。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述编码抗原的核酸可操作地与组成型启动子连接。
9.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述编码抗原的核酸可操作地与诱导型启动子连接。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述重组的复制缺陷型巨细胞病毒是鼠巨细胞病毒。
11.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述重组的复制缺陷型巨细胞病毒是人巨细胞病毒。
12.权利要求11的方法，其中所述人巨细胞病毒选自于AD169、Davis、Toledo和Towne。
13.一种治疗被诊断患有癌症的受试者的方法，包括：
对所述受试者施用一种化疗或免疫抗癌药物或者化疗和免疫抗癌药物的组合；和
通过腹膜内或静脉内施用给受试者施用重组的复制缺陷型巨细胞病毒，该病毒包含编码源自该癌症的异源抗原的异源核酸，由此在受试者体内建立病毒潜伏，从而产生对抗该癌症的重复刺激的免疫力。
14.权利要求13的方法，其中所述重复刺激的免疫力包括CD8+T细胞免疫应答。
15.权利要求14的方法，其中所述重组的复制缺陷型巨细胞病毒包含灭活的gB、gD、gH和gL糖蛋白基因。
16.权利要求15的方法，其中所述灭活的基因编码gL糖蛋白。
17.权利要求16的方法，其中所述编码gL糖蛋白的基因通过敲除突变灭活。
18.权利要求13-17中任一项的方法，其中所述重组的复制缺陷型巨细胞病毒是人巨细胞病毒。
19.权利要求18的方法，其中所述人巨细胞病毒选自于AD169、Davis、Toledo和Towne。
20.权利要求13-19中任一项的方法，还包括对所述受试者施用放射治疗。
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