CN1264599A - 辅酶nad及其组合物在细胞保护药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开辅酶NAD及其组合物在细胞保护药物中的应用。NAD能够促进人体内红细胞的生成,与化疗同时应用可改善贫血状态。该酶能预防正常组织细胞免受化学和辐射损伤以及凋亡产生。NAD处理的H22细胞具有较强免疫原性,能激发机体产生特异性抗肿瘤免疫,是一种良好的肿瘤疫苗,其抗肿瘤效应是由表达在肿瘤细胞膜上的HSP70蛋白所介导。NAD有增强胃粘液屏障,促进溃疡愈合作用。NAD有抗氧化和抗衰老,保护细胞膜并预防细胞的坏死和突变以及防治肝纤维化作用。

Description

辅酶NAD及其组合物在细胞保护药物中的应用。

本发明公开辅酶NAD及其组合物在细胞保护药物中的应用，辅酶NAD及其组合物可用于骨髓的保护，放化疗的保护，提高放化疗治疗强度，改善患者生存质量，提高免疫功能，用于促进溃疡愈合以及防治肝纤维化。

肿瘤患者的造血机制和造血环境存在着缺陷和紊乱，因此，大部分患者存在着不同程度的贫血，而化疗又能加重贫血。我们既往研究表明，作为辅酶NAD能够促进人体内红细胞的生成，与化疗同时应用可改善贫血状态，保证化疗顺利进行，提高生存质量。包括肿瘤在内的任何影响造血环境及血细胞生成因子的疾病都可以造成血细胞减少，红细胞减少则造成贫血。肿瘤本身及与肿瘤相关的并发症都可以直接或间接地导致贫血。细胞毒性化疗药物对红细胞生成过程有许多负面影响，主要包括多能干细胞坏死、红细胞前体细胞坏死、红细胞前体细胞细胞周期的阻滞和延迟、EPO的水平下降或功能减退、成熟红细胞的氧化、骨髓发育不良及化疗药物相关性水钠潴留等。在化疗药物中，环磷酰胺、马法兰及其它烷化剂等非细胞周期特异性药物的使用与贫血的关系最为明显，特别是当大剂量长期使用这些药物时可以导致多能干细胞的进行性损耗，烷化剂及VP16和VCR等的长期使用还可以导致骨髓发育不良。化疗药物的上述作用经常导致骨髓修复障碍，进而出现长期贫血。化疗药物可以通过抑制多能干细胞及红细胞前体细胞的增殖造成贫血，某些化疗药物通过氧化效应导致多能造血干细胞、红细胞前体细胞及成熟红细胞的氧化坏死，PDD、MMC等化疗药物可以造成肾脏损伤或微血管内凝血导致贫血。化疗药物还可以导致体内EPO生成减少或破坏EPO功能。目前所知，抗癌药物、放射线和化学战剂对肾脏、肝脏、神经系统和粘膜上皮等均有毒性。这些毒性限制抗癌药物和放疗的治疗强度，明显地影响生存质量及威胁生命。改善治疗的方法包括提高恶性细胞的对化疗的敏感性或降低化疗药物对正常组织的毒性，发展保护正常组织(不保护恶性细胞)免受损伤的药物。由于抗肿瘤药物对靶细胞的非特异性，正常组织细胞亦受到杀伤，因此如何避免化疗中正常细胞受损伤和明确参与修复DNA损伤的机制具有重要的临床治疗意义。近年来国内外研究表明：辐射、生物和化学毒素等均能引起细胞DNA损伤，诱导人正常细胞发生凋亡，造成机体正常生理功能紊乱和破坏。许多现代战伤的病理机制涉及异常的细胞凋亡/死亡过程，其诱发的缺血、缺氧、中毒及氧化应激等可导致心、脑、肝等多种组织细胞的凋亡和坏死，并继而引起多种并发症的发生，基于上述凋亡线粒体机制的揭示，人们正从新的角度探寻有效控制细胞凋亡/死亡的战略，如Ca²⁺螯合剂，自由基清除剂及环孢素A等能够阻抑线粒体渗透性转换抑制细胞死亡。国外对于急性放射病的预防，主要采用化学药物、中草药、生物制剂等基抗放用作用机制也互不相同，例如保护靶细胞分子的巯基，清除自由基，稳定DNA结构等，虽体外实验和动物模型的研究已发现为数颇多的有效辐射防护剂，但由于药物毒性等原因很少用于人体。NAD是细胞能量代谢所必需的辅酶，在启动生物体氧化还原反应和调节细胞膜糖蛋白受体表达起重要作用。目前国内外尚未见辅酶NAD用于抗细胞损伤的研究报道。

70年代初人们发现，用抗肿瘤药物处理的肿瘤细胞去免疫动物，能使其获得特异性的抗肿瘤免疫。丝裂霉素C(MMC)是目前临床上常用的一种抗肿瘤药物，而NAD是细胞能量代谢所必需的辅酶，不仅能直接作用于肿瘤细胞核中的DNA，起抑制或杀伤肿瘤的作用，而且能提高肿瘤细胞的免疫原性，增强机体对其的杀伤活性，但对后者所涉及的分子基础目前尚不清楚。有文献报道，HSP70蛋白可携带多种抗原多肽，起到抗原提呈分子的作用。而多种刺激因素，包括化疗药物，能诱导和改变肿瘤细胞浆内及胞膜HSP70蛋白的合成及分布。因此，NAD药物单独或联合热休克处理的H22细胞，其胞膜HSP70蛋白表达的变化以及药物处理后的H22细胞免疫C57BL/6小鼠抗肿瘤的保护效应，为进一步阐明抗肿瘤药物，尤其是NAD处理肿瘤细胞后提高免疫原性的机理及新型瘤苗的研制提供理论依据。

消化性溃疡易复发，难防止。因此，消化性胃溃疡的治疗关键就在于防止复发。大鼠乙酸胃溃疡具有反复再发的特点，且与人的胃溃疡在形态结构上十分相似。选用此模型，用NAD治疗30d，探讨NAD的近期疗效和停药后的远期效果以及与胃粘膜表面凝胶的厚度和溃疡边缘胃粘膜细胞增殖的关系。约有5％～10％的人胃粘膜反复发生溃疡。对抗消化性溃疡药物的评价既要重视近期疗效，又要重视防止复发的远期效果。大鼠乙酸胃溃疡具有反复再发的特点，且与人的胃溃疡在形态结构上十分相似。1969年Takagi复制出大鼠乙酸胃溃疡模型，其自然愈合过程是：溃疡制成后的d1～d30溃疡急速愈合而UI迅速降低，此时为溃疡的急性期；d31后溃疡愈合逐渐缓慢而溃疡UI缓慢降低，至d80 UI最低，此时为缓慢愈合期；d81后溃疡UI逐渐升高，d120～d140后UI升高明显，此时复发率也最高，而后又逐渐降低，到d160又达到最低水平。d81～d160为复发期。NAD具有显著的抗大鼠实验性胃溃疡的作用，并在临床上取得了明显的疗效，但对溃疡的复发尚未进行深入的研究，作者选用大鼠乙酸胃溃疡模型，用NAD治疗30d，探讨NAD治疗急性期大鼠乙酸胃溃疡的疗效和停药后防止复发的远期效果。结果表明NAD有促进溃疡愈合、防止溃疡复发的作用，且优于西咪替丁。NAD能促进溃疡边缘胃粘膜细胞DNA的合成和逆转细胞凋亡，形成新生的胃粘膜细胞，使溃疡得以修复，同时促进了胃粘膜细胞分泌粘液，加强了二道屏障防御有害因子的作用。

肝纤维化是由于肝细胞损伤，肝脏细胞外间质(ECM)尤其是胶原的合成增加，降解减少或二者兼有所造成的。迄今尚无特效的抗肝纤维化药物。NAD在细胞质中有抗氧化作用，清除脂质过氧自由基和羟自由基，使细胞免受自由基的破坏，从而保护细胞膜并预防细胞的坏死和突变。本实验旨在评价NAD对实验性大鼠肝纤维化的防治作用。NAD抗纤维化作用机制可能为：①能清除脂质氢过氧自由基和羟自由基，从而保护细胞膜功能及预防细胞的坏死和突变。NAD缺乏可导致肝组织中(GPX)活性降低，活化分子氧产生超氧离子(O)，使内质网膜上的多价不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，从而破坏肝细胞膜性结构，导致肝功能障碍，肝细胞破坏纤维组织形成。补NAD后(GPX)酶活性加强，对肝细胞损伤有保护作用，从而预防和治疗肝纤维化。②通过免疫系统(B-淋巴细胞，T-淋巴细胞，巨噬细胞等)中的GPX，控制H2O2的释放来调节杀伤作用和保护自身。NAD的抗大鼠肝纤维化作用与秋水仙碱相似，提示NAD是抗肝纤维化的有效药物。

本发明的目的是提供可作为一种细胞损伤的保护剂，用于细胞损伤修复，调节免疫功能，促进溃疡愈合以及防治肝纤维化的有效药物。

我们的研究表明NAD能预防正常组织细胞免受化学和辐射损伤，细胞DNA损伤与凋亡产生相关。该酶能阻断凋亡分子Caspase-3和Caspase-8表达，阻止细胞色素C从线粒体释放到胞浆，抑制凋亡时线粒体膜电位下降和游离钙离子升高，降低ROS释放。辅酶NAD能促进正常细胞增殖生长，并能通过上调bcl-2基因表达和下调p53基因表达抑制凋亡。NAD通过影响凋亡相关基因c-myc、c-erbB-2、c-fos、fas和cyclin的表达保护细胞DNA损伤的修复机制。正常组织细胞NAD浓度明显高于肿瘤组织，可以达到利用正常组织和肿瘤组织之间NAD浓度的差别，可以达到正常组织细胞免受放化疗损伤而又不影响放化疗最佳疗效的目的。该辅酶能保护骨髓三系造血干细胞，可与造血克隆刺激因子联合应用，即能刺激造血又能保护造血干细胞免受放化疗毒性损伤，是骨髓的保护因子。该酶可作为化学和辐射损伤的保护剂，提高放化疗治疗强度，改善患者生存质量。NAD是一种良好的免疫增强剂，能激发机体产生特异性抗肿瘤免疫。NAD有增强胃粘液和黏膜屏障，降低幽门螺杆菌感染发生率，促进溃疡愈合作用。NAD有抗氧化作用，保护细胞膜并预防细胞的坏死和突变以及能防治肝纤维化。其特征为溶于生理盐水的有效浓度是80～2000ug/ml，在赋形剂中有效比例是40～95％。辅酶NAD及其组合物，其特征为溶于生理盐水中的最佳浓度是300～550ug/ml，在赋形剂中的最佳比例是30～40％。辅酶NAD及其组合物，其特征为最佳作用时间是出现细胞损伤前10至32小时足量给予。辅酶NAD及其组合物可用于骨髓的保护，放化疗的保护，提高放化疗治疗强度，改善患者生存质量，提高免疫功能，用于促进溃疡愈合以及防治肝纤维化。本发明具有如下优点：1.本发明从基因和蛋白分子水平阐明了NAD的抗凋亡调控机制，为细胞凋亡的逆转和细胞DNA损伤修复提供了新的理论和实验基础。2.发现一种保护正常组织细胞免受化学物理等因素损伤的独特辅酶NAD。3.发现NAD具有参与调节免疫功能，提高机体抗自由基和抗衰老的能力。4.辅酶NAD及其组合物可用于促进溃疡愈合，改善肝功能，防治肝纤维化的功能。

以下所述的实例详细说明了本发明实施例1实验材料：人正常细胞株：L02肝细胞株、SL-7肾细胞株和MEF肺泡内皮细胞株均在本室置37℃、5％CO₂饱和湿度的二氧化碳培养箱中细胞加入含10％灭活胎牛血清、1.2％谷氨酰胺、1％青链霉素的RPMI-1640培养液传代培养。主要试剂：NAD、顺铂、阿霉素、鱼藤酮、PARP多抗、细胞色素C单抗、抗细胞周期蛋白A单抗6E6、抗细胞周期蛋白B₁单抗V152、抗细胞周期蛋白D₁单抗DCS-6、抗p53蛋白单抗D0-7、抗c-myc蛋白单抗C-33、抗bcl-2蛋白单抗124、荧光染色探针(PI、Rhodamin 123、Fluo-3-AM、Snalf-Calcein-1、H₂DCF、Hoechest 33342)、Tunel凋亡检测试剂盒、RT-PCR反应试剂。实验方法：1.MTT比色法检测1.1 NAD对PC12细胞增殖活性的影响

PC12细胞传代接种于96孔板，密度为1.5-4.5×10³/孔，加入含浓度为10-500μg/ml NAD的培养液培养48-72小时后检测。1.2 顺铂对PC12细胞的细胞毒性作用

PC12细胞传代接种于96孔板，加入含浓度为0.01、0.1、1.0mg/ml顺铂的培养液培养24小时后检测。1.3 NAD预防顺铂对PC12细胞的毒性作用

PC12细胞分别加入含浓度500μg/ml NAD和不含NAD的培养液培养48小时后，在加入含浓度为0.01、0.1、1mM顺铂的培养液继续培养10小时后检测。2.流式细胞术检测

PC12细胞传代后分两组，一组加入含0.3mg/ml顺铂培养液，另一组加入不含顺铂培养液，培养12小时后，含顺铂组细胞以5×10⁶/ml重新接种，分别加入含500μg/ml NAD和不含NAD培养液继续培养48小时后，胰酶消化，0.5％多聚甲醛固定，0.1％Triton-100增加细胞膜通透性，细胞以2.5×10⁵/300μl分管，洗涤，离心，弃上清，各管分别加入抗细胞周期蛋白A单抗6E6，抗细胞周期蛋白B₁单抗V152，抗细胞周期蛋白D₁单抗DCS-6，抗p53蛋白单抗D0-7，抗c-myc蛋白单抗C-33，抗bcl-2蛋白单抗124，抗c-erbB-2蛋白单抗NCL-CB11，抗c-fos蛋白单抗UB-06341，混匀，37℃孵育1小时，洗涤离心，各管加入50μl标记FITC的抗鼠二抗或抗兔二抗，37℃孵育30分钟，洗涤离心，振荡悬于PBS液，流式细胞术检测PC12存活和凋亡细胞的荧光强度。4.碘化丙啶(PI)染色

收集不同因素处理的10⁶个PC12细胞，离心后PBS液洗涤，加入冰冷的70％乙醇固定，PBS液洗涤，加入PI荧光染液(50μg/mlPI，10μg/ml RNA酶)4℃避光孵育30分钟，流式细胞仪分析DNA荧光强度，细胞凋亡时直方图出现亚二倍体峰。5.透射电镜观察

按上述条件培养处理的PC12细胞，用细胞刮从培养瓶刮下，琼脂预包埋法制样，2.5％戊二醛前固定，1％锇酸后固定，按常规漂洗、脱水、渗透和环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸钠和柠檬酸铅染色，透射电镜观察摄片。

结果：NAD组中PC12细胞增殖活性上升，NAD组细胞凋亡率较顺铂组明显下降，顺铂组出现明显明显凋亡形态改变，凋亡时细胞主要阻滞在G₁期伴细胞周期蛋白D₁高表达，p53、bcl-2、c-erbB-2、c-myc、细胞周期蛋白A、B₁表达分别下降32.2％、42.1％、29.3％、46.2％、45.9％、74.8％；后再予NAD处理48小时，bcl-2和细胞周期蛋白B₁表达明显上升，与对照组比较，NAD处理组p53蛋白表达下降31.2％，NADH组中c-myc、c-erbB-2蛋白表达下降，c-fos蛋白表达上升。NAD不但促进细胞增殖，而且通过bcl-2蛋白上调和细胞周期蛋白D₁、c-fos和下调p53解救顺铂诱导的凋亡损伤。实施例2：1.Tunel和Hoechest 33342双染检测细胞凋亡

4％多聚甲醛固定细胞30分钟，PBS液洗涤后，加入0.1％Tritox-100和0.1％柠檬酸钠通透，PBS′液再洗涤，加入含有末端脱氧核苷酸转移酶和荧光标记液的Tunel反应液避光孵育，洗涤后再加入Hoechest 33342孵育，PBS液洗涤后在荧光显微镜下观察分析。2.激光共聚焦显微镜检测细胞胞浆钙离子、pH、ROS和线粒体膜电位改变

培养细胞以10⁴个接种petri培养皿中央盖玻片，待细胞贴壁后，PBS缓冲液漂洗，各皿分别加入荧光染料Rhodamin 123、Fluo-3-AM、Snalf-Calcein-1、H₂DCF在激光共聚焦显微镜检测细胞胞浆钙离子、pH、ROS和线粒体膜电位改变。3.Caspase-3和Caspase-8检测

细胞离心后加入冰冷的裂解液冰育10分钟，取上清加入2×反应液DEVD-pNA和IETD-pNA后37℃水浴1小时，置紫外分光光度计405nm检测。4.Western Blot检测凋亡前后PARP和细胞色素C表达变化

培养细胞加入蛋白处理提取液，将样品超声粉碎后，65℃水浴15分钟，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜至NC膜，用1％封闭液封闭，分别各加入PARP多抗(1∶1000)和细胞色素C单抗(1∶200)孵育，TBST缓冲液洗涤，加入二抗孵育，TBST缓冲液洗涤，行AP底物显色反应。5.RT-PCR检测凋亡前后P53、Bcl-2、Fas和β-actin表达变化

培养细胞加入Tripure提取试剂和氯仿，12000g离心15分钟，取无色上清，加入异丙醇，12000g离心10分钟，取RNA沉淀，75％酒精洗涤后，真空干燥，加入DEPC水；逆转录反应：RNA 5μl OligdT 1μl DEPC水6.5μl 5×RT buffer 4μl 10×dNTP 2μl Rnasin0.5μl M-Mlv 1μl，置37℃孵育1小时；PCR反应：cDNA 5μl10×dNTP 5μl 10×buffer 5μl Tag酶2U各引物2μlDEPC水32μl，将反应管置PCR仪93℃变性45秒53℃退火45秒72℃延伸45秒，共35个循环，最后72℃延伸300秒，各取8μl PCR产物上样后1.5％琼脂糖凝胶电泳。

结果：在荧光显微镜下，活细胞核呈弥漫均匀荧光，出现凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状荧光。低剂量放疗和化疗处理组细胞胞浆内钙离子、pH、ROS明显升高，线粒体膜电位明显下降，而NAD保护组未见胞浆内钙离子、pH、ROS升高，线粒体膜电位无明显变化。低剂量放疗和化疗处理组凋亡早期出现Caspase-3和Caspase-8上升，而NAD能阻断凋亡分子Caspase-3和Caspase-8表达，阻止PARP分子断裂成为活性分子和细胞色素C从线粒体释放到胞浆。辅酶NAD能通过上调bcl-2基因表达和下调p53基因表达抑制凋亡。实施例3：

60例贫血的肿瘤患者随机分为非化疗组(NOCTX)、不含顺铂的化疗组(CTX-NOPLAT)及含顺铂的化疗组(CTX-PLAT)。将以上3组患者又随机分为NAD治疗组和安慰剂治疗组。NOCTX组NAD的用量为10mg/日，每日3次，连用8周；CTX组NAD的用量为10mg/日，每日3次，连用8周。结果发现，各组NAD治疗者的红细胞比容(Hct)和血红蛋白(Hb)值明显高于安慰剂治疗组(P＜0.01)，有效率分别为40.0％、56.1％和58.3％，而且CTX组接受NAD治疗者的输血依赖性明显低于安慰剂治疗者(P＜0.01)。的依赖性分别为26％和56％。

骨髓干细胞通过Ficoll及离心400×g 20分钟分离，洗涤后用含20％自身血浆的TC199培养液悬浮，调整细胞浓度至10⁶/ml，后用500μg/ml NAD在37℃共同孵育10小时，再用不同浓度的化疗药孵育12小时，每个点接种3个直径为35厘米的培养皿；PCM-CFU-GM(2×10⁵MNCs/ml)即在含胎盘条件培养液的琼脂中的CFU-GM，在培养10天后计数，长期培养的干细胞及计数根据Sutherland等建立的方法。在凋亡早期，当细胞尚未出现形态学改变时，伴随DNA断裂的积聚，细胞内NAD含量急剧下降，NAD是许多细胞脱氢酶的辅酶，是细胞进行一切生命活动的重要还原能，其损耗是导致细胞走向死亡的致命因素。外源性补充NAD增加PC12细胞生长活性，并能抑制放疗和顺铂引起的DNA细胞损伤，修复损伤细胞和促进细胞分化。正常组织细胞NAD浓度明显高于肿瘤组织，可以达到利用正常组织和肿瘤组织之间NAD浓度的差别，可以达到正常组织细胞免受放化疗损伤而又不影响放化疗最佳疗效的目的。不同剂量的顺铂和阿霉素对12例正常骨髓于细胞进行体外处理，并测定其PCM-CFU-GM的LD₉₅，发现在处理前经过NAD孵育组LD₉₅明显增加，显示NAD明确的保护效果。实施例4：

雄性SD大鼠36只，体重115±10克，随机分为5组：对照组，5Gy单次照射组，8Gy单次照射组，4Gy/次×2分次照射组，NAD保护组，每组8只。对照组动物按常规饲养，实验组动物置于20cm×20cm×6cm有机玻璃鼠盒内。采用60COγ线全身照射，剂量率0.9Gy/min，照射时间安排在下午5时，2天完成，分次照射组在第1天和第2天照射，单次照射组在第2天照射。分别于TBI后第3天和第7天检查各组动物的外周血像，第7天查肝肾功能及将动物脱颈臼处死后取其心、肺、肝，肾和胸椎骨髓作常规病理制片及病理组织学检查。采用不同的全身照射剂量及分割照射方式，观察大鼠的近期效应，以选择较佳NAD给药方案。外周血白细胞数在照射后第3天即明显下降(59.8％)，而NAD组仅下降15.3％；至第7天才明显恢复，肝肾功能基本正常。本实验观察到，随着剂量的增加，对心、肺、肝和骨髓的损伤亦随之增加。分次照射与单次照射比较，对肺的损伤较轻，而对骨髓的损伤则略重。从肺、肝，肾和胸椎骨髓作常规病理制片及病理组织学检查发现NAD组分次照射对肺的损伤较小，对骨髓的损伤明显减轻。说明NAD具有很好的抗辐射损伤效应。实施例5

用免疫荧光法和流式细胞仪检测不同因素处理的小鼠肝癌H22细胞膜HSP70蛋白表达的变化，并用处理后的H22细胞作为抗原进行体内抗肿瘤免疫保护实验。结果各实验组H22细胞胞膜HSP70蛋白的表达率及表达强度均较对照组细胞有显著增加(P＜0.001)。表达率以NAD和丝裂霉素处理组细胞为最高，达95.1％，而热休克能进一步增加胞膜HSP70蛋白的表达强度。用NAD处理的H22细胞免疫C57BL/6小鼠能诱导出特异性抗肿瘤免疫，该作用可部分被抗HSP70分子的单抗阻断。肿瘤发生率在NAD诱导组、单抗阻断组及阴性对照组小鼠中分别为27.3％(3/11)、50.0％(5/10)、100.0％(10/10)。攻击后第28天小鼠平均瘤重分别为(0.17±0.33)g、(0.66±0.77)g和(1.11±0.58)

g。结论NAD处理的H22细胞具有较强免疫原性，能激发机体产生特异性抗肿瘤免疫，是一种良好的肿瘤疫苗。其抗肿瘤效应是或部分是由表达在肿瘤细胞膜上的HSP70蛋白所介导。实施例6

在大鼠乙酸胃溃疡急性期用NAD治疗，并与传统的抗溃疡药西咪替丁相对比，采用Kerss法测定胃粘膜表面凝胶厚度，应用传统的体外掺入氚-胸腺嘧啶(3H-TdR)于胃粘膜的放射性自显影方法测定胃粘膜细胞的标记率(LR)，同时观测d5、d30、d126的溃疡指数(UI)、溃疡抑制率(IR)与凝胶的厚度、LR的关系。NAD组的UI低于西咪替丁组(42.3±3.9，3.6±1.2，4.4±2.3；49.1±3.6，5.9±1.4，9.2±1.3，P＜0.01)；西咪替丁组的低于对照组(61.0±3.8，8.9±2.5，12.4±2.4，P＜0.01)；NAD组的IR(％)高于西咪替丁组(31，59，65；19，33，26)；NAD组的凝胶厚度(μm)高于西咪替丁组(45±3，60±3，58±2；36±4，47±4，41±3，P＜0.01)，西咪替丁组的高于对照组(22±6，35±3，28±5，P＜0.01)；NAD组的LR(％)高于西咪替丁组(10.0±0.5，16.2±0.8，15.0±0.6；9.0±0.5，13.9±0.6，10.8±0.7，P＜0.01)、西咪替丁组的高于对照组(6.5±0.7，10.1±0.5，8.0±0.7，P＜0.01)；NAD组d30与d126的UI相比无显著差异。结论NAD有促进溃疡愈合，防止再发的作用，机制是增强了胃粘液屏障和粘膜屏障的作用。实施例7材料和方法1.1  材料  纯系Wistar大鼠雌雄各半，共80只，体重180g～220g，随机分为4组：A正常对照组；B病理模型对照组；C NAD预防治疗组；在尾静脉攻击开始后4wk，NAD溶液灌胃；D秋水仙碱治疗组；造模完成后给秋水仙碱灌胃。1.2  方法  ①免疫致敏阶段(共45d)，于大鼠大腿内侧皮下注射人血白蛋白，4.0mg/只，共4次，第1次加福氏完全佐剂；第2次加福氏不完全佐剂；此阶段结束时取血，测到抗体产生。②尾静脉攻击阶段(共60d)；每周2次尾静脉注射人血白蛋白，从2.5mg/只开始，每周增加0.5mg/只，直至4.0mg/只，然后维持不变，共注射16次。取材及标本处理分别于尾静脉攻击结束时及停止攻击后6wk，12wk共3次开腹取肝中叶组织150mg～200mg。光镜标本甲醛固定，石蜡包埋，常规制片，HE染色，胶原，网状和弹力纤维三联染色后光镜观察。电镜标本经戊二醛，四氧化锇固定后树脂包埋，铀—铅双染色后JEM120 OEt电镜观察。2  结果

胶原纤维增生程度分级标准分为6级。0级：肝组织正常，无胶原纤维增生；I级：少量胶原纤维从汇管区域或中央静脉周围轻度向外延伸；II级：胶原纤维延伸明显，但未包绕整个肝小叶；III级：胶原纤维延伸，互相连接，包绕整个肝小叶；IV级：胶原纤维包绕分割肝小叶，以致正常肝小叶结构破坏，假小叶形成，但以大方形假小叶为主；V级：肝小叶结构完全破坏，假小叶形成，大方形假小叶与小圆形假小叶各占50％；VI级：肝内布满圆形假小叶，假小叶间有粗大增生的胶原纤维。结果 NAD防治组肝脏纤维化的程度(I级2只，II级3只，III级3只，IV级1只)明显低于病理模型组(II级2只，III级3只，IV级5只，V级3只，P＜0.01)，NAD防治组肝脏超微结构的变化也较轻微。NAD对实验性大鼠肝纤维化有一定的预防和治疗作用。

Claims (5)

1.辅酶NAD及其组合物在细胞保护药物中的应用特征在于：

(1)能保护造血干细胞，即能刺激造血又能保护造血干细胞免受放射和化疗毒性损伤，是骨髓的保护因子。

(2)能保护正常组织细胞免受化学和辐射损伤，利用正常组织和肿瘤组织之间NAD浓度的差别，可以达到正常组织细胞免受放化疗损伤而又不影响放化疗最佳疗效的目的，用于肿瘤患者放化疗毒性防治药物。

(3)NAD是一种良好的免疫增强剂，能激发机体产生特异性抗肿瘤免疫。

(4)NAD有增强胃粘液和黏膜屏障，降低幽门螺杆菌感染发生率，促进溃疡愈合作用。

(5)NAD有抗氧化和抗衰老作用，保护细胞膜并预防细胞的坏死和突变以及能防治肝纤维化。

2.按照权力要求1所述的辅酶NAD及其组合物，其特征为溶于生理盐水的有效浓度是80～2000ug/ml，在赋形剂中有效比例是40～95％。

3.按照权力要求1所述的辅酶NAD及其组合物，其特征为溶于生理盐水中的最佳浓度是300～550ug/ml，在赋形剂中的最佳比例是30～40％。

4.按照权力要求1所述的辅酶NAD及其组合物，其特征为最佳作用时间是出现细胞损伤前10至32小时足量给予。

5.按照权力要求1～4所述，辅酶NAD及其组合物可用于骨髓抑制的保护，放化疗的保护及其辅助治疗，改善患者生存质量；用于免疫生物治疗，用于溃疡愈合以及防治肝纤维化。