CN1261808A - 向多细胞真核生物的细胞中转移核酸的改进方法和用于实施该方法的组合 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及向多细胞真核生物细胞中体内转移核酸或与提高转移效率的物质结合之核酸的改善的方法,还涉及用于基因治疗应用的核酸与本发明转移方法的组合。

Description

向多细胞真核生物的细胞中转移核酸的改进方法 和用于实施该方法的组合
本发明涉及利用1到600V/cm的弱电场向多细胞真核生物的细胞中体内转移核酸或与提高转移效率的物质结合之核酸的显著改善的方法，还涉及用于基因治疗应用的核酸与本发明转移方法的组合。
基因向特定细胞中的转移是基因治疗的基础。然而，一个问题是向待处理的宿主细胞中引入足量的核酸；实际上该核酸(一般为目的基因)应在转染的细胞中表达。在此方面采用的一种方法是核酸在病毒载体中、尤其在反转录病毒、腺病毒或腺伴随病毒中的整合。这些系统利用病毒发展的细胞侵入机制，以及对抗降解的保护。然而，该方法也存在问题。特别是产生易于在宿主生物中传播的传染性病毒颗粒的危险，以及对于反转录病毒载体而言，插入诱变的危险。此外，治疗性基因或疫苗基因在病毒基因组中的插入能力仍然是有限的。
在任何情况下，要发展可用于基因治疗的病毒载体必需借助于缺陷病毒及互补细胞系的复杂技术。
另一种方法(Wolf等人，科学(Science)247，1465-68，1990；Davis等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93，7213-18，1996)包括向肌肉或血流中施用一种质粒型核酸，无论其是否与利于其转染的化合物连接，如蛋白质、脂质体、荷电脂或阳离子聚合物如聚乙烯亚胺，它们是很好的体外转染剂(Behr等人，美国国家科学院院报86，6982-6，1989；Felgner等人，美国国家科学院院报84，7413-7，1987；Boussif等人，美国国家科学院院报92，7297-301，1995)。
关于肌肉，自从Wolff等人的最初发表内容显示肌肉组织中摄入以游离质粒形式注射的DNA的能力(Wolf等人，科学(Science)247，1465-68，1990)，许多研究者设法改进该方法(Manthorpe等人，1993，人类基因治疗(Human Gene Ther.)4，419-431；Wolff等人，1991，生物技术(BioTechniques)11，474-485)。从这些试验中已显现某些趋势，特别是：
·机械手段的应用，其通过将DNA吸附于球上然后推动至组织(“基因枪”)使DNA进入细胞内(Sanders Williams等人，1991，美国国家科学院院报88，2726-2730；Fynan等人，1993，生物技术11，474-485)。已证明这些方法在接种策略中是有效的，但只接触表面组织层。对于肌肉而言，其应用需要外科方法来提供与肌肉的接近，因为颗粒不能穿过皮肤组织；
·DNA的注射，其不再为游离质粒形式，但与能用作载体的分子连接，以利于复合物进入细胞。在其它许多转染方法中使用的阳离子脂迄今为止已证明是令人失望的，因为那些已试验的脂证明抑制转染(Schwartz等人，1996，基因治疗(Gene Ther.)405-411)。对于阳离子肽和聚合物同样如此(Manthorpe等人，1993，人类基因治疗4，419-431)。有利组合的唯一例子似乎是聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮与DNA的混合物。这些组合产生的增强相对于裸DNA注射只达到10倍以下(Mumper等人，1996，药物研究(PharmaceuticalResearch)13，701-709)；
·对注射溶液的组织的预处理，试图增强DNA扩散和/或稳定性(Davis等人，1993，人类基因治疗4，151-159)或促进核酸的进入，例如，细胞增殖或再生现象的诱导。该处理尤其涉及局部麻醉剂或心脏毒素、血管收缩剂、内毒素或其它分子的应用(Manthorpe等人，1993，人类基因治疗4，419-431；Danko等人，1994，基因治疗1，114-121；Vitadello等人，1994，人类基因治疗5，11-18)。这些预处理方案难以控制，尤其是丁哌卡因，为了有效必须以非常接近致死剂量的浓度使用。试图增强扩散的高渗蔗糖的预注射不能提高肌肉中的转染水平(Davis等人，1993)。
已通过单独使用质粒DNA或通过与合成载体连接体内转染了其它组织(Cotten和Wagner的综述(1994)，生物技术的当前观点(Current Opinion in Biotechnology)4，705；Gao和Huang(1995)，基因治疗，2，710；Ledley(1995)，人类基因治疗6，1129)。研究的主要组织是肝脏、呼吸道上皮、血管壁、中枢神经系统和肿瘤。在所有这些组织中，证实转基因表达水平太低以至于不能预见治疗性应用(例如，对于肝脏，见Chao等人(1996)，人类基因治疗7，901)，尽管最近对于血管壁中的质粒DNA转移有一些令人鼓舞的结果(Iires等人(1996)，人类基因治疗7，959和989)。在脑中转移效率很低，如同在肿瘤中一样(Schwartz等人，1996，基因治疗3，405；Lu等人，1994，癌症基因治疗(Cancer GeneTherapy)1，245；Son等人，美国国家科学院院报91，12669)。
电穿孔，或者用来透化细胞的电场的应用，通常在体外使用以促进培养细胞中的DNA转染。但迄今认为该现象的产生依赖于一种阈值依赖性效应，而且对于动物细胞，在大约800-1200伏特/cm的相对高强度的电场下才能观察到电透化作用。也建议在体内进行该技术，以便增强抗肿瘤剂如博来霉素在人实体瘤中的效能(美国专利号5,468,228，L.M.Mir)。应用极短持续时间(100微秒)的脉冲，这些电条件(800-1200伏特/cm)很好地适用于小分子的细胞内转移。应用这些条件(100微秒的脉冲)不引起核酸向肝脏中体内转移的增强，与无电脉冲时的DNA注射相比，证明低于1000伏特/cm的电场完全无效甚至是抑制性的(专利WO 97/07826和Heller等人，FEBSLetters，389，225-8，1996)。
此外，对于体内应用，该技术存在困难，因为如此强度的电场的使用能引起或多或少的组织损伤，这在癌症患者肿瘤治疗中不是一个问题，但当向非肿瘤组织的组织中施用核酸时就可能是一种主要缺点。
尽管引用的所有研究提到需要高电场(大约1000伏特/cm)才能在体内有效，但最意外地和引人注目地，申请者现在证明，通过对组织施以低强度(如100-200伏特/cm)及相对长持续时间的电脉冲，充分提高了核酸向组织中的体内转移，而没有不当的影响。此外，申请者发现，根据本发明的方法显著降低了在DNA转移的现有技术中观察到的转基因表达的高变异性。
因此，本发明涉及一种体内核酸转移的方法，其中通过向组织中直接施用或通过局部或全身施用使组织细胞接触待转移的核酸，并且通过对所述组织施加一次或多次强度为1-600伏特/cm的电脉冲来确保转移。
根据一个优选的方案，本发明的方法用于这样的组织，其中的细胞具有特别的几何形状如大尺寸细胞和/或细长细胞和/或对动作电位天然产生反应的细胞和/或具有特定形态的细胞。
优选地，场强在200-600伏/cm之间，施加的总持续时间大于10毫秒。所用的脉冲数例如为1-100000个脉冲，脉冲频率在0.1-1000赫兹之间。优选脉冲频率在0.2-100赫兹之间。还可以以不规则的方式发送脉冲，描述场强随时间变化的函数可以是可变的。例如，发送的电场可以是如下组合的结果：强度＞400V/cm(优选500-800V/cm之间)、单位持续时间短(＜1msec)的至少一个电场，接着是一个或多个较弱强度(例如＜400V/cm，优选＜200V/cm)、单位持续时间较长(＞1msec)的脉冲。描述场强随时间变化的函数的积分大于1kV×msec/cm。根据本发明的一个优选方案，该积分大于或等于5kV×msec/cm。
根据本发明的一种优选实施方案，脉冲的场强为约500伏特/cm(即±10％，优选±5％)。
电脉冲选自方波脉冲、产生指数衰减波、短时振荡单极波、短时振荡双极波或其它波形的电场。根据本发明的一种优选实施方案，电脉冲为方波脉冲。
可通过本领域已知的任何方法来进行电脉冲的施用，例如：
·置于待处理的组织两侧的外部电极系统，特别是，与皮肤接触的非侵入性电极，
·植入组织中的电极系统，
·支持核酸和电场的同时施用的电极/注射器系统。
在本发明范围内，术语“应用一个或多个电脉冲的DNA或核酸转移”、以及术语“电转移”或“电转染”应认为是等同的，都指通过施加电场或在电场存在下核酸或DNA的转移。
对于体内进行的施用，有时必须借助于中间产物以确保非侵入性外部电极的电连续性。例如，这包括一种凝胶形式的电解质。
核酸能通过任何合适的方法施用，但优选地是直接向组织中体内注射，或通过另一种局部的或全身的途径施用特别是借助于导管，该途径使核酸出现在施加电场的部位。如前所述，可用容许或有利于转移的试剂施用核酸。特别地，这些核酸可游离于溶液中或与合成试剂连接或由病毒载体携带。合成试剂可以是专业人员所知的脂类或聚合物，乃至使在靶组织膜上的固定成为可能的导向元件。在这些元件中，可提及携带糖、肽、抗体或激素受体。
可以想象，在本发明的这些条件下，核酸的施用可以先于、同时乃至晚于电场的施加。
因此本发明也涉及一种核酸和一种强度为1-600伏特/cm的电场的组合产品，体内向哺乳动物细胞(特别是人细胞)中同时、分开或时间上交错地施用。场强优选地为200-600伏特/cm，更优选地，场强为约500伏特/cm。
根据本发明的方法可用于基因治疗，即，其中转移基因的表达且基因的调节或阻断可以确保特定疾病的治疗。
优选地以基因治疗为目的处理组织细胞，它使以下方面成为可能：
·细胞自身功能异常的矫正(例如，用于治疗与遗传缺陷有关的疾病，如黏稠物阻塞症)；
·转基因产生的营养因子、神经营养因子和血管生成因子，对组织或器官的血管形成或神经分布的保护和/或再生；
·组织向分泌器官的转化，该器官分泌导致治疗效果的产物，如基因自身的产物(例如，血栓形成和止血调节因子、营养因子、激素)，或者如通过加入治疗性基因在组织中合成的活性代谢物；或
·疫苗或免疫刺激剂的应用。
本发明的另一个目的在于将电场的电脉冲与为了任意施用方式而配制的含有核酸的组合物相结合，使之可以通过局部、皮肤、口、阴道、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下、眼内、经皮途径等进入组织。优选本发明的药物组合物含有一种药学可接受的载体，其用于可注射的制剂，特别是，用于对希望的器官直接注射，或者用于其它任何施用方式。它尤其可包括无菌等渗溶液或干燥的特别是冻干的组合物，视情况而定，在后者中加入无菌水或生理血清可产生可注射溶液。用于注射的核酸剂量以及施用次数和注射体积适应于不同的参数，特别适应于施用方法、有关病理学、待表达的基因乃至寻求的治疗持续时间。
核酸可以是合成或生物合成来源的，或者从病毒或原核细胞或源于单细胞生物(例如酵母)或多细胞生物的真核细胞中提取。它们可完全地或部分地与来源生物和/或合成系统的成分一起施用。
核酸可以是脱氧核糖核酸或核糖核酸。它可包括天然或人工来源的序列，特别是基因组DNA、cDNA、mRNA、tRNA和rRNA、杂交序列或合成或半合成的寡核苷酸序列，无论修饰与否。这些核酸的获得可通过专业人员已知的任何方法，特别是通过筛选文库、通过化学合成乃至通过混合方法，包括经筛选文库获得的序列的化学或酶修饰。它们可被化学修饰。
特别地，核酸可以是有义或反义的或具有催化性质的DNA或RNA，如核酶。“反义”是指一种核酸具有与靶序列互补的序列，例如，通过与靶序列杂交而阻断其表达的mRNA序列。“有义”是指一种核酸具有与靶序列同源或相同的序列，例如，与蛋白质转录因子连接并且参与特定基因表达的序列。根据一种优选实施方案，核酸含有一种目的基因和支持该目的基因表达的元件。核酸片段便利地为质粒的形式。
脱氧核糖核酸可以是单链或双链，如短寡核苷酸或较长的序列。它们可携带治疗性基因、调节转录或复制的序列或与其它细胞成分结合的区域，等等。根据本发明，“治疗性基因”特别是指编码一种RNA或编码一种具有治疗效果的蛋白质产物的任何基因。编码的蛋白质产物可以是蛋白质、肽，等等。该蛋白质产物可与靶细胞同源(即，当不表现病理时在靶细胞中正常表达的产物)。在此情况下，例如，转基因表达可能克服细胞中的不充分表达或由于修饰引起的无活性或弱活性蛋白质的表达，或者也可能超量表达该蛋白质。治疗性基因也可编码具有提高的稳定性、改进的活性等的细胞蛋白质突变体。此蛋白质产物同样可与靶细胞异源。在此情况下，例如，表达的蛋白质可以完善或引入一种在细胞中缺陷的活性(酶缺陷的治疗)，或者有可能对抗一种病理，或者刺激免疫应答，例如用于治疗肿瘤。还可以是自杀基因(疱疹病毒的胸苷激酶)，用于治疗癌或再狭窄。
在本发明意义下的治疗性产品中，更特别地可以举出编码下列产品的基因：
-酶，如α-1-抗胰蛋白酶、蛋白酶(金属蛋白酶、尿激酶、uPA、tPA…链激酶)、裂解前体并释放活性物质的蛋白酶(ACE、ICE等)、或它们的拮抗剂(TIMP-1，组织纤溶酶原激活物抑制剂PAI、TFPI)，
-血衍生物，如参与凝血的因子：第VII、VIII、IX因子、补体因子、凝血酶，
-激素、或参与激素合成途径的酶、或参与激素合成或排泄或分泌之调节的因子，如胰岛素、胰岛素样因子(IGF)、或生长激素、ACTH、性激素合成酶，
-淋巴因子和细胞因子：白介素，趋化因子(CXC和CC)，干优素，TNF，TGF，趋化性因子或激活物如MIF、MAF、PAF、MCP-1，eotaxine、LIF等(法国专利No.9203120)，
-生长因子，例如IGF、EGF、FGF、KGF、NGF、PDGF、PIGF、HGF、增殖蛋白，
-血管生成因子，如VEGF或FGF、促血管生成素(angiopoietine)1或2、内皮素，
-神经递质合成中的酶，
-营养因子，特别是用于治疗神经变性疾病、损及神经系统的创伤或视网膜变性的神经营养因子，例如神经营养蛋白家族的成员如NGF、BDNF、NT3、NT4/5、NT6、它们的衍生物和相关基因，CNTF家族的成员如CNTF、axokine、LIE及它们的衍生物，IL6和其衍生物，心营养蛋白(cardiotrophine)及其衍生物，GDNF及其衍生物，IGF家族的成员如IGF-1、IFGF-2和其衍生物，FGF家族的成员如FGF1、2、3、4、5、6、7、8、9和它们的衍生物，TGFβ，
-骨生成因子
-造血因子，如促红细胞生成素、GM-CSF、M-CSF、LIF等，
-细胞骨架蛋白，如肌营养不良蛋白或小肌营养不良蛋白(法国专利No.9111947)，自杀基因(胸苷激酶、胞苷脱氨酶、细胞色素P450的酶)，血红蛋白或其他转运蛋白的基因，
-参与脂类代谢的蛋白质的相应基因，选自载脂蛋白A-I、A-II、A-IV、B、C-1、C-II、C-III、D、E、F、G、H、J和apo(a)的一种载脂蛋白类型，代谢酶，例如：脂肪酶、脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶、卵磷脂胆固醇酰基转移酶、7-a-胆固醇羟化酶、磷脂酸磷酸酶，乃至脂类转移蛋白质，如胆固醇酯转移蛋白质和磷脂转移蛋白，HDL结合蛋白，乃至选自例如LDL受体、乳糜微粒残余物受体和清除子受体等的一种受体。可进一步加入瘦素(leptin)来治疗肥胖症，
-调节血压的因子，如参与NO代谢的酶，血管紧张素，缓激肽，加压素，ACE，肾素，编码前列腺、血栓烷或腺苷合成或放大机制的酶，腺苷受体，激肽释放酶，kallistatine，ANP，ANF，利尿剂或尿分泌抑制剂，参与组胺、5-羟色胺、儿茶酚胺、神经肽等介质的合成、代谢或放大的因子，
-抗血管生成因子，如Tie-1和Tie-2的配体、制管张素、ATF因子、纤溶酶原衍生物、内皮素、血小板反应蛋白1和2、PF-4、干扰素α或β、白介素12、TNFα、尿激酶受体、flt1、KDR、PAI1、PAI2、TIMP1、催乳素片段，
-抗凋亡的保护因子，如AKT家族，
-可诱导细胞死亡的蛋白质，它们可以是本身作为caspase的活性形式，或是需要由其他因子激活的“前药”形式，或激活前药从而引起细胞死亡的蛋白质，如疱疹病毒的胸苷激酶，脱胺酶，特别可用于抗癌的治疗，
-参与细胞间接触和粘着的蛋白质：VCAM、PECAM、ELAM、ICAM、整联蛋白、cathenine，
-细胞外基质的蛋白质，
-参与细胞迁移的蛋白质，
-信号传导型蛋白质，FAK类、MEKK、p38激酶、酪氨酸激酶、丝氨酸-苏氨酸激酶，
-参与细胞周期调节的蛋白质(p21，p16，细胞周期蛋白等)可阻断细胞周期并有时可诱导凋亡的显性失活突交或衍生蛋白质，
-转录因子：jun，fos，AP1，p53…及p53信号级联中的蛋白质，
-细胞结构的蛋白质，如中间丝(波形蛋白、结蛋白、角蛋白)、肌营养不良蛋白、参与收缩和控制肌肉收缩的蛋白质，特别是参与钙代谢和细胞中钙流动的蛋白质(SERCA等)。
在通过配体受体系统起作用的蛋白质中，预期使用配体或受体(例如FGF-R，VEGF-R等)。还可以举出编码配体或受体蛋白(特别是上述蛋白)的片段或突变体的基因，其具有高于整个蛋白的活性，或具有拮抗活性，甚至相对于原蛋白是“显性失活的”(例如抑制循环蛋白出现的受体片段，与诱导这些片段分泌(相对于细胞膜中的锚)的序列相连或否，或改变这些配体受体系统的细胞内运输以使某元件无法出现的其他系统)，或甚至具有与全蛋白完全不同的活性(例如ATF)。
在可由组织分泌的其它蛋白质或肽中，重要地是强调抗体、单链抗体的可变片段(ScFv)或具有识别能力的其它任何抗体片段，用于免疫治疗，例如，传染病、肿瘤和自身免疫病如胰岛硬化症(抗独特型抗体)的治疗，以及与促炎细胞因子如IL1和TNFa结合的ScFv，用于类风湿性关节炎的治疗。非限制性的其它目的蛋白质是：可溶性受体，例如，用于抗HIV治疗的CD4可溶性受体或TNF可溶性受体、用于治疗类风湿性关节炎的可溶性TNFa受体或IL1可溶性受体和用于治疗肌无力的乙酰胆碱可溶性受体；底物肽或酶抑制剂，乃至受体激动剂或拮抗剂肽或粘着蛋白，例如，用于治疗哮喘、血栓症、再狭窄、转移瘤或炎症；以及人工的、嵌合的或截短的蛋白质。在重要的目的激素中，可以举出对于糖尿病的胰岛素，生长激素和降钙素。还可以举出能够诱导抗肿瘤免疫或刺激免疫应答的蛋白质(IL2，GM-CSF，IL12等)。最后可以举出减弱TH1细胞应答的细胞因子如IL-4、IL-10和IL-13。
上述和下述的众多实例说明本发明电场应用的潜在范围。
治疗性核酸也可以是一种基因或反义序列，其在靶细胞中的表达使可以控制细胞的基因表达和mRNA转录。例如，根据欧洲专利号140,308所述的方法，这些序列可在靶细胞中转录成与细胞mRNA互补的RNA，从而阻断其蛋白质翻译。治疗性基因也包括编码核酶的序列，其能选择性地破坏靶RNA(欧洲专利号321,201)。
如上所述，核酸也可含有一种或多种编码抗原性肽的基因，它能在人或动物中引起免疫应答。在该特定实施方案中，本发明因而可应用于人或动物、尤其针对微生物、病毒或癌症进行疫苗接种或免疫治疗性治疗。特别地，可包括EB病毒、HIV病毒、乙型肝炎病毒(欧洲专利号185,573)、伪狂犬病毒、“合胞体形成病毒”、其它病毒的特异抗原肽，乃至特异的肿瘤抗原如MAGE蛋白(欧洲专利号259,212)或能刺激抗肿瘤反应的抗原，如细菌热激蛋白。
核酸优选地也包括支持和/或有助于治疗性基因和/或编码抗原肽的基因在组织中表达的序列。它可包含这样的序列，当这些序列能在转染的细胞中起作用时，天然地负责所考虑的基因表达的序列。也可包含不同来源的序列(负责其它蛋白质的表达，乃至合成的序列)。特别地，它可含有真核或病毒基因启动子序列。例如，可含有来源于希望转染的细胞基因组的启动子序列。在真核启动子中，可使用诱导或阻抑基因转录的任何启动子或衍生序列，其可为特异性或非特异性的，强或弱的。特别涉及普遍存在的启动子(HPRT、波形蛋白、α-肌动蛋白、微管蛋白等)，治疗性基因的启动子(MDR，CFTR等型)，组织特异性启动子(结蛋白、肌球蛋白、肌酸激酶、磷酸甘油酸激酶基因的启动子)或激素起反应的启动子(如类固醇激素受体、视黄酸受体等)，或由抗生素(四环素、纳巴霉素等)调节的启动子，对饮食制度起反应的启动子如对纤维食物(fibrate)反应的启动子或对其它天然或合成分子反应的其它启动子。同样可含有来源于病毒基因组的启动子序列。就此而论，例如，可提到腺病毒EIA基因、MLP基因的启动子，或来自病毒CMV、RSV、SV40等基因组的启动子。可以是可诱导的或可抑制的启动子。此外，通过添加活化、调节、允许条件性表达、暂时表达、组织特异性表达或集中表达等的序列，可修饰这些表达序列。
此外，尤其在治疗性基因之上游，核酸也可含有引导合成的治疗性产物进入靶细胞分泌管的信号序列。该信号序列可以是治疗性产物的天然信号序列，但也可包括其它任何功能性信号或人工信号序列。核酸也可含有引导合成的治疗性产物进入特定细胞区室的信号序列，如过氧化物酶体、溶酶体、线粒体，用于治疗例如线粒体遗传病。
McKusick，V.A.(《人类孟德尔式遗传，常染色体显性、常染色体隐性和X-连锁表型目录》(Mendelian Inheritance in man，catalogs of autosomal dominant，autosomal recessive，andX-1inked phenotypes)第8版，Johns Hopkins University Press(1988))和Stanbury，J.B.等人(《遗传性疾病的代谢基础》(The metabolic basis of inherited disease)第5版，McGraw-Hill(1983))已经叙述了其它目的基因。这些目的基因包括与氨基酸、脂类和其它细胞成分代谢有关的蛋白质。
因而可非限定性地提及与糖类代谢疾病有关的基因，例如：果糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1，6-二磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸酶、溶酶体α-1，4-葡糖苷酶、淀粉-1，6-葡糖苷酶、淀粉-(1，4：1，6)-转葡糖苷酶、肌磷酸化酶、肌果糖磷酸激酶、磷酸化酶-b-激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、丙酮酸脱氢酶复合体的所有酶、丙酮酸羧化酶、2-酮戊二酸乙二醛酶羧化酶和D-甘油酸脱氢酶。
也可提及：
-与氨基酸代谢疾病有关的基因，例如：苯丙氨酸羟化酶、二氢生物蝶呤合成酶、酪氨酸氨基转移酶、酪氨酸酶、组氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸酶、谷胱甘肽合成酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、鸟氨酸-δ-氨基转移酶、氨甲酰磷酸合成酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、L-赖氨酸脱氢酶、L-赖氨酸酮戊二酸还原酶、缬氨酸转氨酶、亮氨酸异亮氨酸转氨酶、支链2-酮酸脱羧酶、异戊酰辅酶A脱氢酶、酰基辅酶A脱氢酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶、乙酰乙酰辅酶A 3-酮硫解酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、ATP：钴胺素腺苷转移酶、二氢叶酸还原酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、胱硫醚β-合成酶、肌氨酸脱氢酶复合体、属于甘氨酸分解系统的蛋白质、β-丙氨酸转氨酶、血清肌肽酶和大脑高肌肽酶。
-与脂肪和脂肪酸代谢疾病有关的基因，例如：脂蛋白脂肪酶、载脂蛋白C-II、载脂蛋白E、其它载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶、LDL受体、肝甾醇羟化酶和“植烷酸”α-羟化酶。
-与溶酶体缺陷症有关的基因，例如：溶酶体α-L-艾杜糖醛酸酶(iduronidase)、溶酶体艾杜糖醛酸硫酸酯酶、溶酶体肝素N-硫酸酯酶、溶酶体N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶、乙酰辅酶A：溶酶体α-葡糖胺N-乙酰基转移酶、溶酶体N-乙酰基-α-D-葡糖胺6-硫酸酯酶、溶酶体半乳糖胺6-硫酸硫酸酯酶、溶酶体β-半乳糖苷酶、溶酶体芳基硫酸酯酶B、溶酶体β-葡糖醛酸酶、N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶、溶酶体α-D-甘露糖苷酶、溶酶体α-神经氨酸酶、溶酶体天冬氨酰氨基葡糖苷酶、溶酶体α-L-岩藻糖苷酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酸性神经酰胺酶、溶酶体鞘磷脂酶、溶酶体葡糖脑苷脂酶和溶酶体半乳糖脑苷脂酶、溶酶体半乳糖苷神经酰胺酶、溶酶体芳基硫酸酯酶A、α-半乳糖苷酶A、溶酶体酸性β-半乳糖苷酶和溶酶体氨基己糖苷酶A的α链。
也可非限制性地提及与类固醇和脂类代谢疾病有关的基因、与嘌呤和嘧啶代谢疾病有关的基因、与卟啉和血红素代谢疾病有关的基因、与结缔组织、肌肉和骨代谢疾病有关的基因，以及与血液和生血器官、肌肉(肌病)、神经系统(神经退化病)或循环系统(例如，局部缺血和狭窄的治疗)疾病有关的基因，和参与线粒体遗传病的基因。
在根据本发明的方法中，核酸可与可以增强基因转移的任何类型的载体或这些载体的任意组合相连接，例如，非限制地，连接至载体如病毒、合成或生物合成的物质(例如，脂类、多肽、糖苷或聚合物)，或抛射射或否的球上。也可将核酸注射入组织中，该组织已经受一种目的在于增强基因转移的处理，例如，在局部或全身应用中药理学性质的处理，或酶、透化(表面活性剂的使用)、外科、机械、热或物理处理。
基因治疗中使用电转移的优点在于与使用局部和靶向电场有关的局部处理所提供的安全性。
由于与使用弱电场有关的安全性，可对心肌应用本发明进行心脏病的治疗，例如，同时使用适配的除颤仪。通过抑制平滑肌细胞增殖的基因的表达，如GAX蛋白，本发明也可用于再狭窄的治疗。
对组织体内施加的低强度、长持续时间的电场组合，可增强核酸的转染，而不引起明显的组织恶化。这些结果提高了使用核酸的基因治疗中DNA转移的效率。
因此，本发明方法使得第一次可以预期在基因治疗中产生生理性和/或治疗性剂量的物质，在组织中或分泌在邻近组织中或在血流或淋巴循环中。此外，本发明第一次使表达的转基因有效量的精细调节和控制成为可能，这是根据调节被转染组织的体积的可能性，通过调节待转染组织体积的可能性，例如利用多个施用位点，或通过调节电极数量、形状、表面和排列的可能性。补充控制元件起因于调节转染率的可能性，这种调节是通过改变场强、脉冲的数量、持续时间和频率以及根据现有技术对核酸施用的量和体积的改变。于是能获得与希望的组织内产生或分泌相当的转染水平。最后，与体内基因转移的化学或病毒方法相比，该方法使得安全性提高，在化学或病毒方法中无法完全消除和控制到达非靶器官的器官中。实际上，根据本发明的方法使得可以控制被转染组织的局部化(与经受局部电脉冲组织的体积密切相关)，并因此带来通过组织的完全或部分切除而回到原始状态的可能性，这是可能的，因为该组织不是必需的或能再生，例如肝脏或肌肉。使用上的这种较大灵活性使根据动物种(人和兽医应用)、患者年龄及他或她的生理和/或病理状况优化方法成为可能。
与病毒法相比，根据本发明的方法进一步第一次使转染大的核酸成为可能，就转基因的大小而言，病毒法受壳体大小的的限制。这种可能性对于极大型基因如肌营养不良蛋白或含内含子和/或大型调节元件的基因的转移是必要的，例如，对于激素的生理调节性产生是必要的。这种可能性是酵母附加体或人工染色体或微型染色体的转移所必需的。
下列实施例用于以非限制性方式说明本发明。
在这些实施例中参照下列附图：
图1：高场强电脉冲对小鼠颅侧胫骨肌中质粒DNA pXL2774转染的影响；平均值±SEM。
图2：中场强电脉冲对小鼠颅侧胫骨肌中质粒DNA pXL2774转染的影响；平均值±SEM。
图3：弱场强及不同持续时间的电脉冲对小鼠颅侧胫骨肌中质粒DNA pXL2774转染的影响；平均值±SEM。
图4：弱场强及不同持续时间的电脉冲对小鼠颅侧胫骨肌中质粒DNA pXL2774转染的影响；平均值±SEM。
图5：低电场强度时小鼠颅侧胫骨肌中质粒DNA pXL2774电转移的效率；平均值±SEM。
图6：质粒pXL3031和pXL3010的图谱。
实施例1：现有技术条件下进行的实验，其中电场显示对转染的抑制
试验了标准电穿孔条件，例如已在上文讨论的文献中所用的条件，发现其引起横纹肌中核酸(质粒DNA)转移的低效率甚至抑制。
             材料与方法：一般操作条件
在本实施例中使用了下列产品：
DNA pXL2774(专利PCT/FR96/01414)是含有萤光素酶报道基因的质粒DNA。其它产品可在市场供应商处获得：氯胺酮、噻拉嗪、生理盐水(NaCl 0.9％)。
使用一种示波器和一种商品化电脉冲发生器(矩形或方形)(Electropulsateur PS 15，Jouan，法国)。所用的电极是间距5.3mm的不锈钢板式电极。
在C57Bl/6小鼠中进行本实验。在实验前随机分配来自不同笼子的小鼠(“随机化”)。
用氯胺酮和噻拉嗪的混合物麻醉小鼠。借助于Hamilton注射器纵向穿过皮肤向左爪和右爪的颅侧胫骨肌中注射质粒溶液(30μl的0.9％NaCl中的500μg/ml溶液)。用导电凝胶覆盖两个电极，将注射的爪置于电极之间并与后者接触。
注射一分钟后通过方形脉冲发生器垂直于肌肉轴施加电脉冲。示波器控制所释放脉冲的单位为伏特的强度(实施例中所示的值代表最大值)、单位为毫秒的持续时间和单位为赫兹的频率，该频率为1Hz。释放8次连续脉冲。
为了评价肌肉的转染，质粒施用7天后使小鼠安乐死。然后取下左爪和右爪的颅侧胫骨肌，称重，置于裂解缓冲液中并研磨。离心获得的悬液以便获得澄清的上清液。借助于商品化发光计对10ml上清液进行萤光素酶活性的测定，该发光计中自动向溶液中加入底物。对于施用总容量悬液的肌肉，发光反应的强度以RLU(相对发光单位)表示。每个条件实验10个点：5只动物双侧注射。用非参数检验进行统计学比较。
                   结果与讨论
标度为线性或对数的两幅图说明了结果。
在第一种实验中，测试了800-1200伏特/cm的电场的作用，这是用于肿瘤电穿孔的条件(Mir等人，欧洲癌症杂志(Eur.J.Cancer)27，68，1991)。
根据图1观察到，相对于无电脉冲时注射DNA的对照组：
·有1200伏特/cm和0.1msec持续时间的8次脉冲时，萤光素酶活性的平均值低得多；
·有1200伏特/cm和1msec的脉冲时，三只动物死亡，萤光素酶活性的平均值低得多；
·有800伏特/cm和1msec的脉冲时，萤光素酶活性的平均值也显著降低。
大多数经受电场作用的肌肉都有可见的改变(脆并且外观苍白)。
实施例2：中等电场下核酸的电转移
用C57B1/6小鼠进行本实验。除脉冲的电场强度及其持续时间外，实验条件同实施例1。
结果显示于图2中。再现了实施例1的结果，即，在肌肉中检测到800伏特/cm、1msec持续时间的一系列8次脉冲对萤光素酶活性的抑制作用。应用600伏特/cm的电场，观察到肌肉组织的相同抑制与相同变化。然而，十分明显和惊人地，电压的降低有可能不再明显地改变肌肉，而且，在400和200伏特/cm时，肌肉的转染水平平均高于对未经受电场的肌肉所获得的水平。应当指出，与对照组(不经受电场)相比，在200伏特/cm时萤光素酶活性值的离散显著降低(SEM＝平均值的20.59％，相比而言无电场时为43.32％(图2A))。
实施例3：利用弱场强脉冲的核酸点转移实验，显示对转基因表达的很强刺激
用C57B1/6小鼠进行本实验。除脉冲的电场强度及其持续时间及在DNA注射后释放脉冲25秒这一事实外，实验条件同前述实施例。
结果显示于图3中。由200伏特/cm下5msec的脉冲持续时间开始，用100伏特/cm下20msec的脉冲持续时间，转基因表达的萤光素酶平均值明显增高。
本实验也清楚地显示，当使用200和100伏特/cm的电压时，通过肌肉中的DNA电转染获得的萤光素酶活性平均值是电脉冲持续时间的函数。也发现，对于电转染的肌肉组，值的离散显著降低(图3A)。无电脉冲时(对照)，SEM为平均值的77.43％，而在5msec的脉冲时间、200伏特/cm的电场条件下，相对SEM降至14％，在20msec的脉冲时间、200伏特/cm的电场条件下降至41.27％，对于100伏特/cm时的电转移为30％-48％。
在本实验的最佳条件下，与无电脉冲时注射的对照相比，转基因表达增强了89.7倍。
实施例4：在200V/cm下肌肉中的核酸电转移实验，显示转基因表达增强200倍
应用可变持续时间的200伏特/cm的电脉冲，在DBA2小鼠中进行本实验。本实验的其它条件与实施例3相同。
本实施例证实，在200伏特/cm下，当脉冲持续时间从5msec延长到更长持续时间时，萤光素酶活性的转染增强(图4和图5)。同样，观察到SEM所表示的个体间变异性相对于未电转染的对照的降低。对于对照，SEM的相对值等于35％，对于1、5、10、15、20和24msec的脉冲系列，分别为25％、22％、16％、18％和26％。
在本实验所用的最佳条件下，与无电脉冲时注射的对照相比，转基因表达增强了205倍。
实施例5：根据“脉冲次数×场强×每个脉冲的持续时间”乘积变化的核酸电转移效率
图5例证了相当于“脉冲数×场强×每个脉冲持续时间”乘积的参数的重要性。实际上，该参数对应于依赖时间的描述电场变化的函数的积分。
图5中的数据来自实验2、3和4的过程中获得的结果，评价了200V/cm和100V/cm的电场强度或无电场。数据显示，转染效率随暴露于电场的总持续时间与场强的乘积而升高。“电场×脉冲总持续时间”乘积的值超过1kV×msec/cm时，获得核酸转移的刺激效果。根据一种优选实施方案，“电场×脉冲总持续时间”乘积的值超过或等于5kV×msec/cm时，得到刺激。
在以下的实施例中，对不同的肿瘤试验了根据本发明方法的核酸电转移，这些肿瘤要么是人源的并植入裸鼠(免疫缺陷性)中，要么是鼠源的并植入C57B1/6小鼠(免疫完全的)中。实施例6：在人肺肿瘤H1299中的核酸电转移实验
在18-20克雌性裸鼠中进行实验。用20mm3的H1299肿瘤移植物单侧植入小鼠中。这些肿瘤生长达到200-300mm3的体积。按肿瘤大小将小鼠分类，分成均匀的组。用氯胺酮和塞拉嗪的混合物麻醉小鼠。用Hamilton注射器纵向向肿瘤中心注射质粒溶液(40μl在20mM NaCl、5％葡萄糖中的250μg/ml DNA溶液)。在肿瘤的侧面涂以导电凝胶，将肿瘤置于两个电极之间。电极为间隔0.45-0.7cm的不锈钢板式电极。使用商品化示波器和电脉冲发生器(矩形或方形波)(法国Jouan的Electro-Pulsateur PS15)。
在此实施例中使用质粒pXL3010(图6)，其含有萤光素酶(胞浆)编码基因。质粒pXL3031是载体pXL2774(WO97/10343)的衍生物，其中已插入来自pGL3 basic(Genebank：CVU47295)编码修饰的Photinus pyralis萤光素酶的基因luc+，处于来自人巨细胞病毒(hCMV IE，Genebank HS5IEE)早熟区的启动子和SV40病毒(Genebank SV40CG)晚期区的聚腺苷酸化信号的控制之下。
在注射后20-30秒用一个方形脉冲发生器施加电脉冲。用示波器控制所发送脉冲的强度(伏特)、持续时间(毫秒)和频率(赫兹)为：200-800V/cm，2msec和1赫兹。
为了评价肿瘤转染，在注射质粒2天后对小鼠(每个条件10只小鼠)实施安乐死。将取出的肿瘤称重并在裂解缓冲液中研碎。将所得悬液离心以获得上清液。用商品化发光计(在其中自动加入底物)在10μl上清液中测定萤光素酶活性。结果以每个肿瘤的总RLU(相对光单位)表示。
在此实施例中，进行了两个系列实验以确定电场强度对人肺肿瘤H1299中的转染效率的影响。第一系列中，试验了200-500伏/cm的电场强度。在第二系列中，试验了400-800伏/cm的电场强度。
    实验1     实验2
 伏/cm   均值     SEM     均值     SEM
    0     32,8     ±6,8     44,7     ±10,2
    200     129,7     ±39,1
    300     585,0     ±134,8
    400     5266,6     ±1473,8     8488,2     ±3881,7
    500     14201,6     ±6162,6
    600     7401,0     ±5323,1
    800     11884,1     ±4048,3
表1：不同电场强度的电脉冲对人H1299肿瘤(非小细胞肺癌)中质粒pXL3031 DNA转染的影响；每个肿瘤萤光素酶活性RLU的均值±SEM。条件：电场强度(V/cm)如表中所示的20msec、1Hz频率的8次脉冲。
从表1中看出，与注射DNA而无电脉冲的对照组相比，在200-400V/cm间基因转移随电场强度提高，直至500V/cm时达到相应于最大转染的平台。在更高电压下(600-800V/cm)下，有皮肤或较深处的烧伤，但不降低转基因的表达。
在H1299肺肿瘤中经电转移获得的基因转移提高约240-320倍。实施例7：在人结肠肿瘤HT29中的核酸电转移实验
该实验在18-20克雌性裸鼠中进行。将20mm3 HT29肿瘤移植物单侧植入小鼠中。这些肿瘤生长达到100-200mm3的体积。根据肿瘤大小将小鼠分类，分成均匀的组。除所用的电极间距(0.45cm)外，实验条件与实施例6的相同。两个独立系列实验的结果示于表2中。
    实验1     实验2
  伏/cm     均值     SEM     均值     SEM
    0     4,0     ±1,8     0,6     ±0,3
    400     16,0     ±5,4
    500     14,1     ±7,6     5,5     ±3,6
    600     24,2     ±9,2     14,6     ±6,4
表2：不同电场强度的电脉冲对人HT29肿瘤(结肠腺癌)中质粒pXL3031 DNA转染的影响；每个肿瘤的萤光素酶活性的RLU均值±SEM。条件：电场强度(V/cm)如表中所示的20msec、1Hz频率的8次脉冲。
与无电转移的对照组相比，施加600V/cm强度的电场可达到最佳转染率，而无论无电转移的转染基础水平如何。转染分别改善约6-23倍，相对地与400-600V/cm的相似。实施例8：在鼠纤维肉瘤中的核酸电转移实验
在18-20克的C57B1/6小鼠中进行本实验。将100μl无血清MEM培养基中的1×106LPB细胞单侧植入到小鼠中。这些肿瘤生长达到100-200mm3的体积。按肿瘤大小将小鼠分类，分成均匀的组。实验条件与实施例6的相同。
两个独立系列实施的结果示于表3中。
    实验1     实验2
  伏/cm   均值     SEM     均值     SEM
    0     0,6     ±0,3     0,4     ±0,1
    300     26,3     ±14,8     11,6     ±4,6
    400     42,5     ±31,2     10,4     ±3,5
    500     17,0     ±12,8     6,0     ±1,8
    600     11,0     ±7,1
表3：不同场强的电脉冲对鼠纤维肉瘤中质粒pXL3031 DNA转移的影响；每个肿瘤中萤光素酶活性RLU的均值±SEM。条件：电场强度(V/cm)如表中所示的20msec、1Mz频率的8次脉冲。
与无电转移的对照组相比，施加300-600V/cm强度的电场可提高基因转移约30-70倍，而无论所施加的电压如何。实施例9：在鼠黑素瘤B16中的核酸电转移实验
在18-20克的C57 B1/6小鼠中进行该实验。将20mm3的B16肿瘤移植物单侧植入到小鼠中。这些肿瘤生长达到200-300mm3的体积。按肿瘤大小对小鼠分类，分成均匀的组。
本实验的操作条件与实施例6的相同。
结果示于表4中。
    实验1
    伏/cm     均值     SEM
    0     1,3     ±0,7
    300     14,3     ±7,6
    500     32,2     ±12,6
    600     17,2     ±6,2
表4：不同场强的电脉冲对鼠黑素瘤B16中质粒pXL3031 DNA转移的影响；每个肿瘤中萤光素酶活性RLU的均值±SEM。条件：电场强度(V/cm)如表中所示的20msec、1Mz频率的8次脉冲。
与无电转移的对照组相比，施加500V/cm强度的电场可以提高基因转移约24倍。实施例10：鼠3LL肿瘤中核酸电转移的实验
在18-20克的C57B/6小鼠中进行该实验。将20mm3的3LL肿瘤移植物单侧植入小鼠中。
植入后5天获得30mm3大小的转染肿瘤。本实验的操作条件与实施例6的相同。结果示于表5中。
  伏/cm     均值     SEM
    0     0,1     ±0,04
    300     3,7     ±2,9
    500     470,5     ±237,6
    600     53,3     ±23,9
表5：不同场强的电脉冲对鼠肺癌3LL中质粒pXL3031 DNA转移的影响；每个肿瘤中萤光素酶活性RLU的均值±SEM。条件：电场强度(V/cm)如表中所示的20msec、1Mz频率的8次脉冲。
施加500V/cm强度的电场可以提高转基因表达3885倍。
考虑到这些肿瘤在只注射而无电转移时很难被DNA转染这一事实，这些结果是令人注目的。实施例11：在人肺肿瘤H1299中的核酸电转移实验，对分泌型人碱性磷酸酶的血浆分泌的影响
在本实施例中，所用的pXL3010 DNA(图6)是含有分泌型人胎盘碱性磷酸酶编码基因的质粒DNA。
质粒pXL3010是衍生自ColE1的一种载体，其中已引入了来自pSEAP-basic(Clontech，Genebank：CVU09660)的分泌型碱性磷酸酶的编码基因，处于来自pCDNA3质粒(Lnvitrogen，荷兰)的CMV启动子和来自SV40病毒(Genebank SV40CG)晚期区的多聚苷酸化信号的控制之下。
在18-20克的裸鼠上进行本实验。将20mm3的H1299肿瘤移植物单侧植入在小鼠中。这些肿瘤生长达到200-300mm3的体积。按肿瘤大小将小鼠分类，分成均匀的组。
在实施例6的条件下进行肿瘤的转染，但只有一个条件，即500V/cm，2msec及1Hz。
利用Phospha-light试剂盒(Tropix)在有或无电转移存在下的转染之后D1、D2和D8天在血浆中进行碱性磷酸酶的定量测定。结果示于表6中。
    血浆中的碱性磷酸酶
  取样 0伏/cm(均值+/-SEM) 500伏/cm(均值+/-SEM)
    D1     1,42±0,07     8,90±1,74
    D2     1,40±0,01     9,04±1,55
D8 1,31±0,01 1,67±0,12
表6：不同强度的电脉冲对在人H1299肿瘤中质粒pXL3010 DNA转染后外源蛋白-分泌型人碱性磷酸酶-分泌的影响；碱性磷酸酶(ng/ml)的均植±SEM。条件：电场强度(V/cm)如上表所示的20毫秒及1赫兹频率的8次脉冲。
在实施例6-11中所示的结果一起说明，在本发明方法的条件下核酸的电转移可以在不同类型的肿瘤中显著提高转基因的表达水平。另外，对于编码分泌型蛋白的转基因，通过电转移进行质粒的肿瘤内施用可显著提高分泌蛋白的血浆浓度。
实施例12：电脉冲持续时间提高的影响
本实施例证明可以在实施例4的实验值范围内延长脉冲的单位持续时间。
本实验在C57B1/6小鼠中进行。所用质粒是质粒pXL2774，施用的DNA量为15μg。用于发送持续时间大于20毫秒的电脉冲的电脉冲仪是一种商品电脉冲仪(Gentronics，T820型，美国，San Diego，CA)。电脉冲的次数和持续时间是可变的，但场强为恒定的200V/cm；本实验的其他条件与实施例1所述的相同。结果示于表7中。
脉冲持续时间(msec) 0 1 5 10 20 30 40 50 60 80
  试验A8次脉冲 11±5 39±6  211±26  288±46   1158±238   1487±421  2386±278
  试验A4次脉冲 11±5 26.8±6  123±17  246±32  575±88   704±130  3440±1077
  试验B4次脉冲 15±8  2885±644   2626±441   1258±309
表7：萤光素酶活性的均值+/-SEM，单位为百万RLU/肌肉，每组N＝10。电转移条件：200V/cm场强，8或4次脉冲(单位持续时间可变)，1Hz频率。
随着延长脉冲的单位持续时间提高了转基因的表达(对于200V/cm的场强，8个脉冲的系列至少可达40毫秒，4个脉冲的系列至少可达50毫秒)。本实施例表明最佳脉冲持续时间依赖于所用的脉冲数，脉冲的单位持续时间可达到至少80毫秒，这一持续时间值不是限制性的。
实施例13：随脉冲数而变的电转染效率
本实施例证明增加脉冲数对核酸转染效率的影响。
本实验在C57B1/6小鼠中进行。所用质粒是质粒pXL2774，施用的DNA量为15μg。电脉冲的次数是可变的，每个脉冲的持续时间为20毫秒，场强为200V/cm。本实验的其他条件与实施例1所述的相同。结果示于表8中。
脉冲数     0     1     2     4    6     8   12 16
总RLU     70±56   147±26   281±46   439±50  678±129   819±73   929±169 890±137
表8：平均萤光素酶表达±S.E.M.，单位为百万RLU每一肌肉；每一组N＝10。条件：200V/cm场强；20毫秒，1Hz频率，脉冲数可变。
观察到，施加单一脉冲就大大提高萤光素酶的表达，随着脉冲数继续提高。因此，所释放每个脉冲的数量变化看来是调节核酸转移效率和调节转基因表达水平的工具。
还证实反应的变异性降低，相对于施加电转移的所有组的均值SEM值的降低证明了这一点。
实施例14：电脉冲频率提高的影响
本实施例显示，提高脉冲频率可意外地增强转染效率。另外从临床角度看，提高频率应可以提高患者的舒适度，缩短总的治疗时间。
本实验在C57B1/6小鼠中进行。所用质粒是质粒pXL2774，施用的DNA量为15μg。电脉冲的频率是可变的(从0.1到4赫兹)，每个脉冲的持续时间为20毫秒，场强为200V/cm。本实验的其他条件与实施例1所述的相同。结果示于表9中。
  频率(赫兹) 0 0.1 0.2 0.5 1 2 3 4
  试验A8次脉冲   5±2   54±13   95±16   405±60   996±156   1528±257
  试验A4次脉冲   114±14   163±24   175±26   337±53   587±90
  试验B8次脉冲  21±14   1294±189   2141±387  3634±868  2819±493
  试验B4次脉冲   1451±228   1572±320  1222±126  2474±646
表9：单位为百万RLU每一肌肉的平均萤光素酶活性±S.E.M.；每组N＝10。条件：电场强度200V/cm；脉冲时间20msec的8或4个脉冲，频率可变。
在表9中实验“A”所得的结果证明，高频率(≥1Hz)比低频率更有效，低频率相应于两个连续脉冲之间的时间长(10秒相当于0.1Hz)。在所实验值的范围内，即4个脉冲的0.1到4赫兹，8个脉冲的0.1到3赫兹，转染效率随着频率增加。
实施例15：应用随时间指数递减变化的电场的效果
本实施例显示应用指数降低的变化电场对核酸转移效率的影响。
在本实验中使用C57B1/6小鼠。
在本实验中使用质粒pXL3031。质粒pXL3031(图12)是由质粒pXL2774(WO97/10343)衍生的一种载体，其中引入来自pGL3basic(Genbank：CVU47295)的编码修饰的Photinus pyralis萤光素酶(胞浆)的基因luc+，使之位于来自人巨细胞病毒早熟区的启动子(CMV-IE，Genbank HS5IEE)和源自SV40病毒晚期区的多腺苷酸化信号(Genbank SV4CG)的控制之下。注射的DNA量为10μg。
所有的电脉冲发生器(Equibio电脉冲发生器，EasyjectT Plus型，Kent，UK)，可释放随时间变化指数递减的电场脉冲。施加电压为指数峰值电压。第二种可调节的参数是电容(单位为μF)，其可改变所释放能量的量和指数的时间常数。结果示于表10中。
Capa μF150  Capa μF300 Capa μF450  Capa μF600  Capa μF1200  Capa μF2400  Capa μF3000
  40V/cm     1,23   11
 100V/cm     16,5     2,8     6,5   23,9
 150V/cm     1,8     3,5     6,1
 200V/cm     5,1     15,8     18,8     121,5   189,7
 300V/cm     32,1     90,5   48,7     760,4     56,2
 400V/cm     795
 600V/cm     62
 800V/cm     3,1     1,1
表10：应用指数递减的脉冲所获得的表达(萤光素酶活性)提高倍数。以施用质粒pXL3010而无电转移的萤光素酶活性为参照计算提高倍数。(提高倍数的均值，每种条件N＝4到6)。
作为比较，在相同实验中在200V/cm、每次20msec的8次脉冲、频率为1Hz的方波脉冲电场存在下，pXL3010转移获得的表达提高倍数为44。
这些结果显示，可以使用方形的或强度随时间递减的电脉冲。另外，在后一情况下，在弱电场高电容(例如，200V/cm，3000μ法拉的电容)或高电场低电容(例如，400V/cm，300μ法拉的电容)可获得表达的显著提高。
实施例16：一次短高压脉冲与几次长低压脉冲的组合效果
本实施例显示，在本实验中释放的电场可以是一种组合，该组合包括至少一次短时如50或100μs的500-800V/cm的电场，和至少一次较长时间如长于1ms最高可达90ms的弱电场(＜100V/cm)。
此处的弱电场值为80V/cm，以1Hz的4次脉冲施加，每次持续时间90ms。对于该实验，使用两种电脉冲发生器。先由一种然后由另一种仪器施加电脉冲，手工操作在少于一秒钟之内进行转换。
使用的质粒是质粒pXL3031，注射的DNA量为3μg。电场强度如表11所报告；本实验的其他条件与实施例1所述的相同。
    电场施加条件     实验1(3μg pXL3031)     实验2(3μg pXL3031)
    对照(不施加电场)     320±126     75±27
    A1：500V/cm，1×0.1msec        -     169±63
    A3：800V/cm，1×0.1msec     416±143     272±84
    B：80V/cm，4×90msec，1Hz     1282±203   362,21±85,17
    条件：A1，随后B        -     1479±276
    条件：A3，随后B     3991±418     1426±209
    条件：B，随后A3        -     347±66
表11：单位为百万RLU每一肌肉的平均萤光素酶活性±S.E.M.；每组N＝10块肌肉。
综合了两个系列实验结果的表11显示，一个高电压的短脉冲或弱电压的四个连续的长脉冲与注射pXL3031但不施加电场的对照组相比几乎不改善转染。当弱电场脉冲在高电场脉冲之前施加时情况也一样。
相反，在第二系列实验中，高电压短脉冲之后接着弱电压的四个连续的长脉冲的组合很显著地提高了DNA的转移效率。
实施例1和2中获得的结果显示，施加频率为1Hz、单位持续时间为1msec的600、800或1200V/cm的8次脉冲，导致肌肉损伤和抑制转染。实施例10中获得的结果显示，在特定条件下，使用高压电场而不引起损伤是可能的。确实，对肌肉的肉眼检查未能证明任何可见的变化。使用短时间的高压电场，随后较长时间的弱电场，提供了调节DNA转移效率的另一种方法。
实施例17：相对于电场施加时间的质粒注射时间的作用
本实施例证明，可在电场施加至少30分钟前、甚至长至一小时之前向施用核酸。
本实验使用C57B1/6小鼠。使用的质粒是质粒pXL2774，施用的DNA量是15μg或1.5μg。DNA注射之后或之前施加下列条件下电场：200V/cm；20msec持续时间的8次脉冲；1Hz的频率。其它条件如实施例1所述。对照鼠接受质粒注射但不经受电脉冲。结果示于表12中。表12A：无电场时注射DNA
  实验1pXL2774(15μg) 实验2pXL2774(15μg) 实验3pXL2774(1.5μg)   实验4pXL2774(15μg) 实验5pXL2774(1.5μg)
    对照   7±4   8±6  0.4±0.2   22±15   1±1
12B：电场施加前注射DNA
    时间   实验1   实验2   实验3   实验4   实验5
  -120分钟   20±5   2±1
  -60分钟   106±22   10±3
  -30分钟   303±36  237±61     7±3   184±22   15±4
  -5分钟   410±7
  -60秒   253±51
  -20秒   492±122  201±43     9±3   123±23   12±2
12C：电场施加后注射DNA
  时间   实验1   实验2   实验3   实验4   实验5
  +10秒     7±7
  +20秒   11±6   0.4±0.1
  +60秒   8±7     17±15
表12：萤光素酶活性的平均值±S.E.M.，单位为百万RLU每块肌肉。每组N＝10。
施加电场的过程中DNA的存在是电转染效率的一个条件。令人注目的是，可以在电场施加前至少30分钟甚至一小时注射质粒(实验4和5)，不会显著改变表达水平。对每一肌肉注射15μg质粒和低10倍剂量即1.5μg观察到相似的结果。
这些结果尤其允许设想，在施加电场之前在肌肉中于不同的时间进行相同或不同质粒的多次注射。还可以在肌肉广泛的区域中多次注射，随后对待处理的整个注射区施加系列电脉冲。
实施例18：促红细胞生成素(EPO)编码基因的转移
对C57B1/6小鼠在颅侧胫骨肌中单侧注射质粒pXL3348。质粒pXL3348(图16)来源于质粒pXL2774，其中引入了鼠促红细胞生成素基因(NCBI：193086)，并置于来自人巨细胞病毒早熟区(hCMV IE)的启动子和SV40病毒晚期区(Genebank SV4CG)的多腺苷酸化信号控制之下。
电转移条件如下：200V/cm、20msec的8次脉冲、1Hz的频率。质粒DNA注射后立即施加电场。
D7时红细胞生成素的血清水平(mIU/ml) D24时红细胞生成素的血清水平(mIU/ml)
    质粒   电转移-   电转移+   电转移-   电转移+
  pXL3348(1μg)     0     3.0±1.6     0   1.12±0.8
  pXL3348(10μg)   0.9±0.9     61.8±15.8     0   74.1±28.9
  pUC19(1μg)     0     0
  D7时样品血细胞比容％   D24时样品血细胞比容％
    质粒   电转移 -   电转移 +   电转移  -   电转移 +
  pXL3348(1μg)   38.5±0.5   35.0±3.6   50.8±2.3   81±0.5
  pXL3348(10μg)   32.0±3.2   26.0±4.1   69.0±5.1   83.0±1.0
  pUC19(1μg)   30.8±2.3   43.2±0.9
表13：平均值±S.E.M.；N＝4-5。
在D17和D24，电转移施用1μg pXL3348，观察到血中促红细胞生成素量的非常显著的增加。另外，促红细胞生成素升高的生理效应到D7是很显著的(85％)，表现为血细胞比容的升高，甚至在用少量质粒时(1μg)也是如此。
实施例19：疫苗转基因的电转移效果
本实施例证明，本发明方法还可用于转移编码目的疫苗多肽的基因。
用9周龄雌性Balb/c小鼠进行本实验。所用的电极是间距5mm的不锈钢板式电极。VR-HA是一种含有流感病毒(A/PR/8/34株)血凝素基因的质粒DNA。VRgB是一种含有人巨细胞病毒(Towne株)糖蛋白B(gB)基因的质粒DNA。
纵向穿过皮肤向颅侧胫骨肌中单侧注射质粒溶液(50μl 20μg/ml或200μg/ml于NaCl 0.9％中的溶液)。注射质粒后20秒钟，通过方形脉冲发生器垂直于肌肉轴施加电脉冲(电场强度200V/cm、持续时间为20毫秒的8个连续脉冲，频率为1Hz)。
为了评价免疫应答的刺激，按照下列免疫方案：
D0→采集免疫前血清标本
D1→第一次注射，有或无电转移
D21→采集免疫血清标本
D22→强化注射，有或无电转移
D42→采集免疫血清标本
D63→采集免疫血清标本
血清标本采自眼眶后窦。用ELISA测定特异性抗体的量。用单侧注射的10只动物在10个点测试每一实验条件。
表14A中显示针对流感血凝素的抗体效价的结果。
  电转移   D0     D21     D42     D63
VR-HA(1μg)VR-HA(1μg)(p)     -+   ＜50＜50   132±7391121±1237(0,0135) 1201±438010441±7819(0,0022)  1314±24818121±5619(0,0033)
VR-HA(10μg)VR-HA(10μg)(p)     -+   ＜50＜50   781±6664153±2344(0,0002) 5113±1601574761±89228(0,0005) 4673±823841765±52361(0,0007)
表14a：在不存在或存在电脉冲时，1μg或10μg DNA(VR-HA)注射后获得的针对流感血凝素的抗体效价。该结果是每组10只动物的几何平均值(对于注射1μg DNA并暴露于电脉冲的组为8只动物，在D63取样)±标准误。通过用非参数曼-惠特尼检验两两比较有电脉冲和无电脉冲的注射组，获得值(p)。
这些结果显示，在用电脉冲处理的组中针对流感血凝素的抗体效价提高大约10倍。实际上，在电脉冲存在下接受1μg DNA的小鼠比接受10μg DNA但无电脉冲处理的小鼠具有略高的平均抗体效价。
表14B显示针对人巨细胞病毒糖蛋白B的抗体效价的结果。
电转移 D0  D21  D42  D63
VR-gB(10μg)VR-gB(10μg)(p)     -+ ＜50＜50  73±138200±119(0.0558) 755±17663057±1747(0.0108) 809±13632112±1330(0.0479)
表14B：在不存在或存在电脉冲时，10μg DNA(VR-gB)注射后获得的针对人巨细胞病毒糖蛋白B的抗体效价。该结果是每组10只动物的几何平均值(有电脉冲的注射组动物为9只)±标准误。通过用非参数曼-惠特尼检验两两比较在有电脉冲和无电脉冲存在下的注射组，获得值(p)。
这些结果显示，用电脉冲处理的组中到第42天抗人巨细胞病毒糖蛋白B抗体的效价升高了4倍。还注意到用电脉冲处理的动物组的变异系数平均小三倍。

Claims (85)

1.一种向多细胞真核生物的细胞中体内转移核酸的方法，其中通过直接向组织施用或通过局部或全身施用使该组织细胞与待转移的核酸接触，并且通过对所述组织施加一次或多次强度为1-600伏特/cm的电脉冲来确保转移。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述组织的细胞具有特别的几何形状(大尺寸和/或细长和/或对动作电位天然产生反应和/或具有特定的形态。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于电场强度为200-600伏特/cm。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于电场强度为约500伏特/cm。
5.根据权利要求1-4任一项的方法，其特征在于施加电场的总持续时间长于10毫秒。
6.根据权利要求1-5任一项的方法，其特征在于向组织施加的电场包括一个或多个规则频率的脉冲。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于向组织施加的电场包括0.1-1000赫兹频率的1-100000次脉冲。
8.根据权利要求1-5任一项的方法，其特征在于这些电脉冲以彼此之间不规则的方式释放，而且描述依赖于脉冲时间的场强的函数是可变的。
9.根据权利要求1-8任一项的方法，其特征在于描述电场随时间变化的函数的积分超过1kV·msec/cm。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于所述积分超过或等于5kV·msec/cm。
11.根据权利要求1-10任一项的方法，其特征在于电脉冲选自方波脉冲，产生指数衰减波、短时振荡单极波和短时振荡双极波或其他波形的电场。
12.根据权利要求1-11任一项的方法，其特征在于电脉冲包括方波脉冲。
13.根据权利要求1-12任一项的方法，其特征在于电脉冲是利用置于组织两侧或与皮肤接触的电极来施加的。
14.根据权利要求1-12任一项的方法，其特征在于电脉冲是利用引入待处理组织中的电极来施加的。
15.根据权利要求1-14任一项的方法，其特征在于将核酸注射入组织中。
16.根据权利要求1-14任一项的方法，其特征在于核酸通过系统途径注射。
17.根据权利要求16的方法，其特征在于核酸通过动脉内或静脉内途径注射。
18.根据权利要求1-14任一项的方法，其特征在于核酸通过局部、皮肤、口、阴道、鼻内、皮下、或眼内途径施用。
19.根据权利要求1-18任一项的方法，其特征在于核酸存在于一种组合物中，后者还含有用于不同给药途径的药物可接受的赋形剂。
20.根据权利要求19的组合物，它适于胃肠外给药。
21.根据权利要求1-20任一项的方法，其特征在于核酸是脱氧核糖核酸。
22.根据权利要求1-20任一项的方法，其特征在于核酸是核糖核酸。
23.根据权利要求1-22任一项的方法，其特征在于核酸是合成或生物合成来源的，或者从病毒或原核生物或单细胞或多细胞真核生物中提取的。
24.根据权利要求23的方法，其特征在于施用的核酸是与来源生物和/或合成系统全部或部分成分结合的。
25.根据权利要求1-24任一项的方法，其特征在于核酸编码RNA或目的蛋白。
26.根据权利要求25的方法，其特征在于RNA是催化的或反义的RNA。
27.根据权利要求25的方法，其特征在于核酸编码选自下组的蛋白质：酶，血衍生物，激素，淋巴因子，生长因子，营养因子，血管生成因子，神经营养因子，骨生长因子，造血因子，凝血因子，抗原和参与氨基酸、脂类和其他细胞必要成分之代谢的蛋白质。
28.根据权利要求27的方法，其特征在于核酸编码血管生成因子VEGF和FGF，神经营养因子BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、FGF1、NT3、NT5，Gax蛋白，治疗糖尿病的胰岛素，生长激素，细胞因子，α-1-抗胰蛋白酶，降钙素，瘦素和载脂蛋白，维生素、激素和神经递质合成中的酶。
29.根据权利要求25的方法，其特征在于核酸编码抗体，单链抗体的可变片段(ScFv)或在免疫治疗中具有识别能力的其他抗体片段，或编码可溶性抗体、受体或粘着蛋白的激动或拮抗性肽、或人工的、嵌合的或截短的蛋白质。
30.根据权利要求29的方法，其特征在于核酸编码抗独特型抗体，CD4受体或TNFα受体或乙酰胆碱受体的可溶性片段。
31.根据权利要求27到30中任一项的方法，其特征在于核酸编码一种治疗性蛋白的前体。
32.根据权利要求1到31中任一项的方法，其特征在于核酸为质粒形式。
33.根据权利要求1到31中任一项的方法，其特征在于核酸含有大型基因和/或内含子和/或大或小的调节元件。
34.根据权利要求1到31中任一项的方法，其特征在于核酸是附加体DNA或酵母的人工染色体或微型染色体。
35.根据权利要求1到34中任一项的方法，其特征在于核酸含有允许和/或有利于转基因在组织中表达的序列。
36.根据权利要求1到35中任一项的方法，其特征在于核酸与可以增强基因转移的任何类型的载体或这些载体的任意组合相连接，例如病毒、合成或生物合成的物质，或抛射或否的球。
37.根据权利要求1到36中任一项的方法，其特征在于组织经过一种旨在改善基因转移的处理，一种经局部或系统施用的药理学性质的处理，或酶、透化、外科、机械、热或物理处理。
38.根据权利要求1到37中任一项的方法，其特征在于可以使组织产生生理和/或治疗剂量的物质，产生在组织细胞中或被分泌出。
39.根据权利要求1到38中任一项的方法，其特征在于可以通过调节被转染组织的体积来调节所表达的转基因量。
40.根据权利要求39的方法，其特征在于可以通过利用多个施用位点来调节被转染组织的体积。
41.根据权利要求1到40中任一项的方法，其特征在于可以通过调节电极的数量、形式、表面和排列，通过改变脉冲的强度、数量、持续时间、频率和形式，及核酸施用得量和体积来调节所表达的转基因量。
42.根据权利要求1到41中任一项的方法，其特征在于可以通过经受局部电脉冲组织的体积来控制所转染组织的局部化。
43.根据权利要求1到42中任一项的方法，其特征在于可以通过切除被转染的组织区域来恢复原始的状态。
44.一种核酸和一种强度为1-600伏特/cm的电场的组合产品，用于体内向组织中同时、分开或时间上交错地施用，用于基于向组织中体内电转移的基因治疗中。
45.根据权利要求44的组合产品，其特征在于电场强度为200-600伏特/cm。
46.根据权利要求44的组合产品，其特征在于电场强度为约500伏特/cm。
47.根据权利要求44-46任一项的组合产品，其特征在于施加电场的总持续时间长于10毫秒。
48.根据权利要求44-47任一项的组合产品，其特征在于向组织施加的电场包括一个或多个规则频率的脉冲。
49.根据权利要求48的组合产品，其特征在于向组织施加的电场包括0.1-1000赫兹频率的1-100000次脉冲。
50.根据权利要求44-47任一项的组合产品，其特征在于这些电脉冲以彼此之间不规则的方式释放，而且描述依赖于脉冲时间的场强的函数是可变的。
51.根据权利要求44-50任一项的组合产品，其特征在于描述电场随时间变化的函数的积分超过1kV·msec/cm。
52.根据权利要求51的组合产品，其特征在于所述积分超过或等于5kV·msec/cm。
53.根据权利要求44-52任一项的组合产品，其特征在于电脉冲选自方波脉冲，产生指数衰减波、短时振荡单极波和短时振荡双极波或其他波形的电场。
54.根据权利要求44-53任一项的组合产品，其特征在于电脉冲包括方波脉冲。
55.根据权利要求44-54任一项的组合产品，其特征在于电脉冲是从外部施加的。
56.根据权利要求44-54任一项的组合产品，其特征在于电脉冲是利用引入组织中的电极来施加的。
57.根据权利要求44-56任一项的组合产品，其特征在于将核酸注射入组织中。
58.根据权利要求44-56任一项的组合产品，其特征在于核酸通过系统途径注射。
59.根据权利要求58的组合产品，其特征在于核酸通过动脉内或静脉内途径注射。
60.根据权利要求44-56任一项的组合产品，其特征在于核酸通过局部、皮肤、口、阴道、鼻内、皮下、或眼内途径施用。
61.根据权利要求44-60任一项的组合产品，其特征在于核酸存在于一种组合物中，后者还含有用于不同给药途径的药物可接受的赋形剂。
62.根据权利要求61的组合物，它适于胃肠外给药。
63.根据权利要求44-62任一项的组合产品，其特征在于核酸是脱氧核糖核酸。
64.根据权利要求44-62任一项的组合产品，其特征在于核酸是核糖核酸。
65.根据权利要求44-64任一项的组合产品，其特征在于核酸是合成或生物合成来源的，或者从病毒或原核生物或单细胞或多细胞真核生物中提取的。
66.根据权利要求65的组合产品，其特征在于施用的核酸是与来源生物和/或合成系统全部或部分成分结合的。
67.根据权利要求44-66任一项的组合产品，其特征在于核酸编码RNA或目的蛋白。
68.根据权利要求67的组合产品，其特征在于RNA是催化的或反义的RNA。
69.根据权利要求67的组合产品，其特征在于核酸编码选自下组的蛋白质：酶，血衍生物，激素，淋巴因子，生长因子，营养因子，血管生成因子，神经营养因子，骨生长因子，造血因子，凝血因子，抗原和参与氨基酸、脂类和其他细胞必要成分之代谢的蛋白质。
70.根据权利要求69的组合产品，其特征在于核酸编码血管生成因子VEGF和FGF，神经营养因子BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、FGF1、NT3、NT5，Gax蛋白，治疗糖尿病的胰岛素，生长激素，细胞因子，α-1-抗胰蛋白酶，降钙素，瘦素和载脂蛋白，维生素、激素和神经递质合成中的酶。
71.根据权利要求67的组合产品，其特征在于核酸编码抗体，单链抗体的可变片段(ScFv)或在免疫治疗中具有识别能力的其他抗体片段，或编码可溶性抗体、受体或粘着蛋白的激动或拮抗性肽、或人工的、嵌合的或截短的蛋白质。
72.根据权利要求71的组合产品，其特征在于核酸编码抗独特型抗体，CD4受体或TNFα受体或乙酰胆碱受体的可溶性片段。
73.根据权利要求69到72中任一项的组合产品，其特征在于核酸编码一种治疗性蛋白的前体。
74.根据权利要求44到73中任一项的组合产品，其特征在于核酸为质粒形式。
75.根据权利要求44到73中任一项的组合产品，其特征在于核酸含有大型基因和/或内含子和/或大或小的调节元件。
76.根据权利要求44到73中任一项的组合产品，其特征在于核酸是附加体DNA或酵母的人工染色体或微型染色体。
77.根据权利要求44到76中任一项的组合产品，其特征在于核酸含有允许和/或有利于转基因在组织中表达的序列。
78.根据权利要求44到77中任一项的组合产品，其特征在于核酸与可以增强基因转移的任何类型的载体或这些载体的任意组合相连接，例如病毒、合成或生物合成的物质，或抛射或否的球。
79.根据权利要求44到78中任一项的组合产品，其特征在于组织经过一种旨在改善基因转移的处理，一种经局部或系统施用的药理学性质的处理，或酶、透化、外科、机械、热或物理处理。
80.根据权利要求44到79中任一项的组合产品，其特征在于可以使组织产生生理和/或治疗剂量的物质，产生在组织细胞中或被分泌出。
81.根据权利要求44到79中任一项的组合产品，其特征在于可以通过调节被转染组织的体积来调节所表达的转基因量。
82.根据权利要求81的组合产品，其特征在于可以通过利用多个施用位点来调节被转染组织的体积。
83.根据权利要求44到82中任一项的组合产品，其特征在于可以通过调节电极的数量、形式、表面和排列，通过改变脉冲的强度、数量、持续时间、频率和形式，及核酸施用得量和体积来调节所表达的转基因量。
84.根据权利要求44到83中任一项的组合产品，其特征在于可以通过经受局部电脉冲组织的体积来控制所转染组织的局部化。
85.根据权利要求44到84中任一项的组合产品，其特征在于可以通过切除被转染的组织区域来恢复原始的状态。
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