JPWO2010109924A1 - Lh型二重特異性抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
[態様1]N末端からC末端の順に抗ヒト上皮細胞成長因子受容体1抗体528のL鎖のヒト型化可変領域(5L)及び抗CD3抗体OKT3のH鎖のヒト型化可変領域(OH)を含んで成る第一のポリペプチドと、N末端からC末端の順に抗CD3抗体OKT3のL鎖のヒト型化可変領域(OL)及び抗ヒト上皮細胞成長因子受容体1抗体528のH鎖のヒト型化可変領域(5H)を含んで成る第二のポリペプチドから構成されることを特徴とする、ダイアボディ型二重特異性抗体。
[態様2]抗ヒト上皮細胞成長因子受容体1抗体528のH鎖のヒト型化可変領域(5H)及びL鎖のヒト型化可変領域(5L)、並びに、抗CD3抗体OKT3のH鎖のヒト型化可変領域(OH)及びL鎖のヒト型化可変領域(OL)を含み、以下のいずれかの構造:
(i)(5LOH)−(ペプチドリンカー)−(OL5H)又は(OL5H)−(ペプチドリンカー)−(5LOH);
(ii)(5LOH)及び(OL5H)の2種類の一本鎖ポリペプチドから構成されるヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体がいずれか一方の一本鎖ポリペプチドによりヒンジ領域を介してヒト抗体の2つのFc領域に結合して成る抗体;
(iii)(5LOH)−(ペプチドリンカー)−(OL5H)又は(OL5H)−(ペプチドリンカー)−(5LOH)から成る一本鎖ポリペプチドがヒンジ領域を介してヒト抗体の2つのFc領域に結合して成る抗体;
を有するヒト型化高機能性二重特異性抗体。
[態様3](ii)の構造を有する態様2記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体であって、該ヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体がプロテアーゼ切断部位を介してヒンジ領域に結合していることを特徴とする、前記ヒト型化高機能性二重特異性抗体。
[態様4](iii)の構造を有する態様2記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体であって、一本鎖ポリペプチドがプロテアーゼ切断部位を介してヒンジ領域に結合していることを特徴とする、前記ヒト型化高機能性二重特異性抗体。
[態様5]各一本鎖ポリペプチドにおけるL鎖のヒト型化可変領域とH鎖のヒト型化可変領域がペプチドリンカーで連結されている、態様1又は2記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
[態様6]
抗ヒト上皮細胞成長因子受容体1抗体528のL鎖のヒト型化可変領域(5L)、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体1抗体528のH鎖のヒト型化可変領域(5H)、抗CD3抗体OKT3のL鎖のヒト型化可変領域(OL)、及び、抗CD3抗体OKT3のH鎖のヒト型化可変領域(OH)が、夫々、配列番号2,4,6及び8で示されるアミノ酸配列から成る、態様1〜5のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
[態様7]態様1ないし6のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチド。
[態様8]態様7に記載の一本鎖ポリペプチドをコードする核酸分子。
[態様9]態様1ないし6のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を構成する2種類の一本鎖ポリペプチドを共にコードする核酸分子。
[態様10]態様8又は69記載の核酸分子を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクター。
[態様11]共発現ベクターである、態様10記載のベクター。
[態様12]プラスミドベクターである、態様10又は11記載のベクター。
[態様13]態様10ないし12のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
[態様14]原核細胞である態様13記載の宿主細胞。
[態様15]大腸菌である態様14記載の宿主細胞。
[態様16]態様1ないし6のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の製造方法であって、態様1315のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し該二重特異性抗体を構成する2種類の一本鎖ポリペプチドを発現させ、該ポリペプチドを回収・精製し、該2種類の一本鎖ポリペプチドを会合させ、形成された二重特異性抗体を分離・回収することから成る、前記方法。
[態様17]原核細胞が大腸菌であり、2種類の一本鎖ポリペプチドを大腸菌の培養培地上清、ペリズマ画分、菌体内可溶性画分、又は、菌体内不溶性画分から回収する、態様16記載の製造方法。
[態様18]態様1ないし6のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の製造方法であって、態様11記載の共発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し該二重特異性抗体を構成する2種類の一本鎖ポリペプチドを発現させ、該形質転換菌内でダイアボディ型二重特異性抗体を形成せしめ、形成された二重特異性抗体を分離・回収することから成る、前記方法。
[態様19]態様3又は4に記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体をプロテアーゼで消化することによりFc領域及びヒンジ領域を切断することから成る、夫々、5LOH及びOL5Hの二種類のポリペプチドから構成されるヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体、又は態様2記載の(i)の構造を有するヒト型化高機能性二重特異性抗体の製造方法。
[態様20] 態様1ないし6のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
[態様21]腫瘍細胞を排除する、殺傷する、傷害する及び/又は減少せしめるためのものであることを特徴とする態様20記載の医薬組成物。
[書類名] 要約書
[課題]二重特異性抗体の更なる高機能化によって、投与量の軽減による低コスト化など、医薬品としての付加価値を高める新たなダイアボディ型二重特異性抗体及びその製造方法を提供すること。
[解決手段]各ポリペプチドにおいてL鎖がN末側にあること(LH型)を特徴とするヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体(LH型ダイアボディ型二重特異性抗体)及び該LH型ダイアボディ型二重特異性抗体を含むヒト型化高機能性二重特異性抗体、該二重特異性抗体を構成する2種類の一本鎖ポリペプチドを共にコードする核酸分子、該核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを含む、該抗体の製造方法。
尚、本発明LH型BsAbに含まれるペプチドリンカーは、例えば1〜20個のアミノ酸からなるポリペプチドであってよく、好ましくは1〜15個のアミノ酸からなるポリペプチド、さらに好ましくは2〜10個のアミノ酸からなるポリペプチドが挙げられる。
本発明のLH型ダイアボディ型二重特異性抗体を以下の概要で調製した。
発現ベクターは既に開発されているEGFR及びCD3を標的としたヒト型化ダイアボディ型発現ベクター(特許文献1、及び特許文献2の参考例1〜4)を基に以下の通り作製した。
E-Fプライマーを用いPCR法によりヒト型化OL(以下hOL)を、G-Hプライマーを用いヒト型化5H(以下h5H)をそれぞれ増幅後、得られたPCR産物を混合し、さらにE-Hプライマーを用いてPCR増幅を行った。得られたPCR産物を制限酵素NcoIとSacIIで消化し、pRAベクターに挿入することで、SGGGGをリンカー配列として有するLH型ダイアボディを構成するヘテロscFvの1つhOLh5Hを発現させるためのベクターpRA-hOLh5Hを作製した。
さらに、I-Jライマーを用いPCR法によりh5LhOHを増幅後、得られたPCR産物を制限酵素SpeIとBamHIで消化し、pRA-hOLh5H中のhOLh5Hの後方に挿入することで、本発明のLH型ヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体の製造用の共発現ベクターを構築した(図1)。
それぞれ、C末端側には検出のためのc-mycペプチドタグ、並びに精製のためのHis-tagが並列に導入されている。
B 5LSG4: 5'-CTGGCCACCGCCACCAGATTTAATTTCCACTTTGGTGCCACCGCC-3'〔配列番号:10〕
C SG4OH: 5'-AAATCTGGTGGCGGTGGCCAGGTGCAACTGGTGCAGAGCGGC-3'〔配列番号:11〕
D OH-SacII:5'-NNNNAGCCGCGGAGCTAACGGTCACCGGGGTGCCCTGGCC-3'〔配列番号:12〕
E NcoI-OL:5'-NNNNCCATGGCCGATATTCAGATGACCCAGAGCCCG-3'〔配列番号:13〕
F OLSG4:5'-CTGGCCACCGCCACCAGAGGTAATCTGCAGTTTGGTACCCTG-3'〔配列番号:14〕
G SG45H: 5'-ACCTCTGGTGGCGGTGGCCAGGTGCAACTGGTTCAGAGCGGC-3'〔配列番号:15〕
H 5H-Sac II: 5'-NNNNAGCCGCGGAGCTCACGGTAACCAGCGTACC-3'〔配列番号:16〕
I SpeI-pel-B:5'-ACTAGTTATTTCAAGGAGACAGTCATAATG-3'〔配列番号:17〕
J His-BamHI: 5'-CACCATCATCACCACCATTAATAGCGGATTC-3'〔配列番号:18〕
特許文献2の実施例1に記載の方法(第一〜三の型)に準じて上記各配列及び適当なPCRプライマーを用いてLH型高機能性二重特異性抗体(Ex3 scDb-Fc)用の発現ベクターを作製し、次いで、特許文献2の実施例2に準じてCHO細胞を宿主として用いてEx3 scDb-Fcを調製した。但し、まず、第一の型であるLH型高機能性二重特異性抗体(LH型Ex3 scDb)として、(5LOH)の上流にペプチドリンカーを介して(OL5H)を挿入することによって、(N末側)(OL5H)−(ペプチドリンカー)−(5LOH)(C末側)の構成を有するEx3 scDbを作製し、これに基づきEx3 scDb-Fcを作製した。その結果、精製後の抗体収量は培養液1Lあたり約1mgであった。
実施例1で作製した本発明のLH型ダイアボディ型二重特異性抗体及び実施例2で作製したLH型高機能性二重特異性抗体について、以下の概要で細胞増殖阻害試験(MTS アッセイ)を実施した。
更に、同様の方法でTFK-1の増殖に対する阻害作用をLH型Ex3とLH型Ex3 scDb-Fcとで比較した。その結果、LH型Ex3 scDb-FcはLH型Ex3よりも更に顕著な細胞傷害活性を有することが示された(図7)。
(注) MTS 試薬 (CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega社製) 、PMS(CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay,Promega 社製)
Claims (21)
- N末端からC末端の順に抗ヒト上皮細胞成長因子受容体1抗体528のL鎖のヒト型化可変領域(5L)及び抗CD3抗体OKT3のH鎖のヒト型化可変領域(OH)を含んで成る第一のポリペプチドと、N末端からC末端の順に抗CD3抗体OKT3のL鎖のヒト型化可変領域(OL)及び抗ヒト上皮細胞成長因子受容体1抗体528のH鎖のヒト型化可変領域(5H)を含んで成る第二のポリペプチドから構成されることを特徴とする、ダイアボディ型二重特異性抗体。
- 抗ヒト上皮細胞成長因子受容体1抗体528のH鎖のヒト型化可変領域(5H)及びL鎖のヒト型化可変領域(5L)、並びに、抗CD3抗体OKT3のH鎖のヒト型化可変領域(OH)及びL鎖のヒト型化可変領域(OL)を含み、以下のいずれかの構造:
(i)(5LOH)−(ペプチドリンカー)−(OL5H)又は(OL5H)−(ペプチドリンカー)−(5LOH);
(ii)(5LOH)及び(OL5H)の2種類の一本鎖ポリペプチドから構成されるヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体がいずれか一方の一本鎖ポリペプチドによりヒンジ領域を介してヒト抗体の2つのFc領域に結合して成る抗体;
(iii)(5LOH)−(ペプチドリンカー)−(OL5H)又は(OL5H)−(ペプチドリンカー)−(5LOH)から成る一本鎖ポリペプチドがヒンジ領域を介してヒト抗体の2つのFc領域に結合して成る抗体;
を有するヒト型化高機能性二重特異性抗体。 - (ii)の構造を有する請求項2記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体であって、該ヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体がプロテアーゼ切断部位を介してヒンジ領域に結合していることを特徴とする、前記ヒト型化高機能性二重特異性抗体。
- (iii)の構造を有する請求項2記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体であって、一本鎖ポリペプチドがプロテアーゼ切断部位を介してヒンジ領域に結合していることを特徴とする、前記ヒト型化高機能性二重特異性抗体。
- 各一本鎖ポリペプチドにおけるL鎖のヒト型化可変領域とH鎖のヒト型化可変領域がペプチドリンカーで連結されている、請求項1又は2記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
- 抗ヒト上皮細胞成長因子受容体1抗体528のL鎖のヒト型化可変領域(5L)、抗ヒト上皮細胞成長因子受容体1抗体528のH鎖のヒト型化可変領域(5H)、抗CD3抗体OKT3のL鎖のヒト型化可変領域(OL)、及び、抗CD3抗体OKT3のH鎖のヒト型化可変領域(OH)が、夫々、配列番号2,4,6及び8で示されるアミノ酸配列から成る、請求項1〜5のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 請求項1ないし6のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチド。
- 請求項7に記載の一本鎖ポリペプチドをコードする核酸分子。
- 請求項1ないし6のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を構成する2種類の一本鎖ポリペプチドを共にコードする核酸分子。
- 請求項8又は69記載の核酸分子を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクター。
- 共発現ベクターである、請求項10記載のベクター。
- プラスミドベクターである、請求項10又は11記載のベクター。
- 請求項10ないし12のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
- 原核細胞である請求項13記載の宿主細胞。
- 大腸菌である請求項14記載の宿主細胞。
- 請求項1ないし6のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の製造方法であって、請求項1315のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し該二重特異性抗体を構成する2種類の一本鎖ポリペプチドを発現させ、該ポリペプチドを回収・精製し、該2種類の一本鎖ポリペプチドを会合させ、形成された二重特異性抗体を分離・回収することから成る、前記方法。
- 原核細胞が大腸菌であり、2種類の一本鎖ポリペプチドを大腸菌の培養培地上清、ペリズマ画分、菌体内可溶性画分、又は、菌体内不溶性画分から回収する、請求項16記載の製造方法。
- 請求項1ないし6のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の製造方法であって、請求項11記載の共発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し該二重特異性抗体を構成する2種類の一本鎖ポリペプチドを発現させ、該形質転換菌内でダイアボディ型二重特異性抗体を形成せしめ、形成された二重特異性抗体を分離・回収することから成る、前記方法。
- 請求項3又は4に記載のヒト型化高機能性二重特異性抗体をプロテアーゼで消化することによりFc領域及びヒンジ領域を切断することから成る、夫々、5LOH及びOL5Hの二種類のポリペプチドから構成されるヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体、又は請求項2記載の(i)の構造を有するヒト型化高機能性二重特異性抗体の製造方法。
- 請求項1ないし6のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
- 腫瘍細胞を排除する、殺傷する、傷害する及び/又は減少せしめるためのものであることを特徴とする請求項20記載の医薬組成物。
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