JPH0383579A - イヌ×マウスヘテロハイブリドーマおよびイヌ免疫グロブリンλ鎖の定常領域をコードする遺伝子断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＆夏上立剋且豆１ 本発明は、イヌ免疫グロブリンを産生ずる新規なイヌ×
マウスヘテロハイブリドーマ、およびこのハイブリドー
マを用いたイヌ免疫グロブリン遺伝子の調製法、さらに
イヌ免疫グロブリンの定常領域をコードする遺伝子断片
に関する。

免机曵１遣 イヌはベットとして昔から人間に愛着のある動物である
が、近年の欧米では、　「伴侶、仲間、相棒としての動
物Ｊ　　（Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ　５ｐｅｃｉｅｓ）と称
され、人間社会の一員としての地位を獲得しつつある。

また、警察犬、盲導犬などのように必要不可欠な動物と
しても貢献している。一方では、医学、薬学、畜産学、
獣医学から心理学にいたる実験動物としての貢献度は従
来から大きなものであったが、近年では医薬品の効果検
定や安全性試験にｍｉｎＸｍａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｄ
ｏｇなどの呼称のもとて更に貢献度が高まっている。い
ずれの場合にも当然の事として、これらのイヌの疾病、
特に伝染病に関するより確実な知識がますます必要とな
り、その診断、治療、予防のための方法が確立される事
が要求されている。

イヌのウィルス性疾患は多く、なかでもイヌジステンパ
ーウィルス、イヌパルボウイルス、イヌ伝染性肝炎ウィ
ルス等の疾患は急性で致死率が高い、予防としてのワク
チンは開発されているものの、感染・発症したイヌの治
療法としては、抗生物質、サルファ剤等の二次細菌感染
予防の対症療法しかないこと等、現在の治療法には問題
を残している。従来より治療法として高度免疫血清や血
清由来の免疫グロブリンが使用され有効な実績を残して
きた。しかし、現在では、動物愛護思想の高まりと共に
、イヌ血清原料の入手が困難になりこの治療法は使いた
くとも使用できない状況になっている。従って、従来の
高度免疫血清に代わって感染ウィルスを中和できるモノ
クローナル抗体が出来れば、これらウィルス性疾患の治
療に大きく貢献することが可能である。

覧東技薯 上記のような高度免疫血清の代替品として、ウィルス中
和活性を有するモノクローナル抗体の使用が考えられる
。モノクローナル抗体作製に関する基本的な技術は、こ
れまでに主としてマウス型モノクローナル抗体において
確立されている。ハイブリドーマ等の細胞が産生ずるモ
ノクローナル抗体は大量にしかも半永久に得られ、原料
不足の問題を解消できうる。しかし、ここにおけるモノ
クローナル抗体は、副作用（マウスモノクローナル抗体
をイヌに使用した場合、異種タンパクとしてアナフィラ
キシ−ショックや血清病などの副作用を起こすことが考
えられる）をなくす意味から、従来のマウスモノクロー
ナル抗体ではなくイヌモノクローナル抗体でなければな
らない。

これらのイヌウィルス性疾患の治療薬としてのイヌモノ
クローナル抗体の作製法には次のようなものが考えられ
る。（１）イヌ×イヌハイブリドーマを用いる方法、（
２）ある種のウィルス及び化学薬剤等でトランスフオー
ムさせたイヌリンパ球を用いる方法、（３〉イヌ×マウ
スヘテロハイブリドーマを用いる方法、（４）イヌ×マ
ウスヘテロハイブリドーマを親株としたイヌ×（イヌ×
マウス〉ハイブリドーマを用いる方法、（５）キメラモ
ノクローナル抗体（抗原と結合する可変（Ｖ）領域はウ
ィルス中和活性を有するマウスモノクローナル抗体から
、抗原性あるいは免疫原性及び生理活性に関与する定常
（Ｃ）領域はイヌモノクローナル抗体からなる、マウス
（Ｖ）−イヌ（Ｃ）キメラモノクローナル抗体）を遺伝
子組換えで作製する方法、等であるが、これらのいずれ
の方法に関しても成功例は一切報告されていない。

ここで、（１）については融合効率が低いことや適当な
ミエローマ親株がないこと、（２）についてはヒトの場
合のＥＢウィルスに相当する適当なウィルスや適当な化
学薬剤がないこと、さらに、＜３）　（４）の方法では
ヒト型モノクローナル抗体作製例から考えて、目的のイ
ヌ型モノクローナル抗体を高効率に得るまでには多くの
困難が予想される（例えば、安定性の問題等〉、従って
、（５）のキメラモノクローナル抗体法がより実現性の
高い方法であると考えられる。

このキメラモノクローナル抗体は、可変（ｖ）領域の原
料となるマウスモノクローナル抗体を産生ずるマウス×
マウスハイブリドーマからクローニングしたその■遺伝
子と、定常（Ｃ）領域の原料となるイヌモノクローナル
抗体を産生ずるイヌ抗体産生細胞からクローニングした
Ｃ遺伝子とを結合させたマウス（Ｖ）−イヌ（Ｃ）キメ
ラ抗体遺伝子を含むプラスミドベクターを、動物細胞（
例えば、マウスミエローマ）宿主中で発現させ、その培
養上清中に得られるものである。ヒトにおいてはすてに
キメラ抗体に関するいくつかの報告が見受けれる（特開
昭６０＝１５５１３２号、特開昭６１−４７５００号〉
。

このようにイヌキメラ抗体の作製には、目的の抗原と結
合能を持つ抗体分子の可変（Ｖ）領域のアミノ酸配列を
コードする遺伝子とイヌ免疫グロブリンの定常（Ｃ）領
域のアミノ酸配列をコードする遺伝子が必要となる。キ
メラ抗体の可変（Ｖ）領域遺伝子は、前述した種々のイ
ヌウィルス等に対して中和活性を有するマウスモノクロ
ーナル抗体を産生ずる細胞から得られるもので、この細
胞は従来のマウス×マウスハイブリドーマ法で比較的容
易に作製することが出来る。しかしながら、キメラ抗体
の定常領域遺伝子となるイヌ免疫グロブリンＣ領域遺伝
子については現在のところ全くその構造が知られておら
ず、遺伝子もクローニングされていない、従って、イヌ
キメラ抗体を作製するためには、イヌ免疫グロブリンの
定常（Ｃ）領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子を見
いだすことが非常に重要な要素となっている。

また、前述の（１）から〈４）までの方法は目的の特異
性をもったモノクローナル抗体を作るには多くの問題点
があるが、（５）のキメラ抗体作製のための有効な材ｆ
ｌ（細胞株）を提供することが可能である。

すなわち、イヌ免疫グロブリンを産生している細胞であ
れば、その特異性に関係なく、キメラ抗体を作製するた
めのイヌ免疫グロブリン遺伝子のＣ領域を提供する好ま
しい材料となり得るがらである。

免皿曵且旬 このような状況にあって、本発明者らは、イヌ免疫グロ
ブリンを産生しているイヌ式マウスヘテロハイブリドー
マを作製することに成功した。さらにこの細胞からイヌ
免疫グロブリンの定常領域のアミノ酸配列をコードして
いる遺伝子を単離することに成功した。また、さらにイ
ヌ免疫グロブリンの定常領域をコードする遺伝子断片の
塩基配列の解析により、イヌ免疫グロブリンλ鎖定常領
域特有のアミノ酸配列を見いだし本発明を完成するに至
った。

すなわち、本発明は、これまでに−切報告されていない
イヌ免疫グロブリン産生イヌ×マウスヘテロハイブリド
ーマを提供することを目的とする。

さらに、本発明のもうひとつの目的は、これまでに−切
遺伝子解析がなされていないイヌ免疫グロブリン遺伝子
λ鎖の定常領域をコードするＤＮＡ断片を提供するもの
である。さらに、本発明は、イヌモノクローナル抗体を
構成するイヌ免疫グロブリンλ鎖の定常領域をコードす
るＤＮＡ断片を提供するものであり、このＤＮＡ断片を
用いて作られるイヌキメラ抗体は、イヌの疾病、特に伝
染病に対して副作用のない診断薬、治療薬・予防薬への
応用を可能にするものである。

新規なイヌ免疫グロブリンＣ領域遺伝子を単離する方法
としては、主として２つの方法が考えられる。

ひとつは、イヌ細胞の染色体ＤＮＡがら常法［例えば、
Ｔ、　Ｍａｎ１ａｔｉｓ″Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ”　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂ、　（１９８２）参照］に従ってライブラリーを構
築しＣ領域遺伝子をクローニングする方法であり、もう
一方は、イヌ細胞のメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ＾）
を材料として常法［例えば、Ｄ、　Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ
編集”ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｏｌ、　Ｉ　”　Ｉ
ＲＬ　ｐｒｅｓｓ　（１９８５）］によりｃＤＮＡを合
成してライブラリーを構築しＣ領域遺伝子をクローニン
グする方法である。

いずれの場合にしても、イヌ型の抗体蛋白を産生してい
る細胞を材料にしてクローニングすることがクローニン
グ効率の面からも望ましく、特に後者のメツセンジャー
ＲＮ＾からｃＤＮＡを合成する方法においては必須の条
件となる。このような抗体産生細胞を確立する方法とし
て次に示すようないくつかの方法が考えられる。■イヌ
×イヌハイブリドーマを作る方法、■ある種のウィルス
及び化学薬剤等でイヌリンパ球をトランスフオームさせ
る方法、■イヌ×マウスヘテロハイブリドーマを作る方
法、■イヌ×マウスヘテロハイブリドーマを親株とした
イヌ×（イヌ×マウス〉ハイブリドーマを用いる方法、
等である。しかしながら、従来技術の説明の欄でも示し
た通り、■、■の方法では現実には非常に難しく、■の
方法においても■のイヌ式マウスヘテロハイブリドーマ
が必要となり、結論的には■のイヌ×マウスヘテロハイ
ブリドーマを得ることが重要な鍵となる。

以下、イヌ×マウスヘテロハイブリドーマの調製法につ
いて詳細に説明する。まず、イヌに免疫を行い、イヌ抗
体の産生に関するリンパ球を活性化する。免疫方法は、
アジュバント免疫のみの非特異免疫、あるいは、イヌジ
ステンパーウィルス粒子（または精製抗原〉、イヌバル
ボウイルス粒子（又は精製抗原〉、イヌ伝染性肝炎ウィ
ルス粒子（又は精製抗原〉等の特異抗原（アジュバント
混合液）を用いた特異免疫のいずれも可能である。非特
異免疫又は特異免疫したイヌより、ｎ臓、又はリンパ節
を得る。これらの牌臓、又はリンパ節がら得られた各リ
ンパ球を単離し、培簑浮遊液とした後、ホークライード
マイトジェン（ＰＷＭ）のようなリンパ球活性化物質を
加えて活性化する。この時、ＰｗＭと共に前記ウィルス
抗原を加えて、特異免疫を増強させることも可能である
。このようにして得られたイヌリンパ球を回収し、この
リンパ球と親株であるマウス骨髄腫細胞（マウスＢＡＬ
Ｂ／ｃに由来するＸ６３−Ａｇ８−６．５．３、Ｐ３−
Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ、ＳＰ２１０Ａｇ１２等の骨髄ｌ
ｌｌ１Ｍ胞）とを融合剤を加えて融合し、イヌ×マウス
ハイブリドーマを形成させる。融合方法は、公知の如何
なる方法でもよいが融合剤として、ボリエチレングリコ
ール等を例示することが出来る。

融合したハイプリドーマの選択は、例えば、３７°Ｃ１
５％ＣＯ２存在下でグルタミン添加ＲＰ）４１１６４０
＋　１０％牛脂児血清＋ＨＡＴ（ヒボキサンチン＋アミ
ノプテリン＋チミジン〉のようなＨＡＴ！！択培地で達
成される。

イヌＩｇＧ抗体を産生じているバイプリドーマは、例え
ば、抗イヌＩｇＧ抗体をコーティングしたプレートを用
いたサンドイッチェンザイムイムノアッセイ（ＨＩＡ）
法、ラジオイムノアッセイ（ＲＴＡ）法等により測定し
て確認できる。また、前記のような特異抗原に対して特
異性を有するイヌＩｇＧ抗体（特異イヌ贈Ｇ抗体）を産
生しているハイプリドーマも、特異抗原をコーティング
したプレートを用いたＨＩＡ法又はＨＩＡ法により測定
して確認できる。かくして、選別されたイヌＩｇＧ抗体
又は特異的イヌＩｇＧ抗体産生のイヌ×マウスハイブリ
ドーマは、限界希釈法により単一クローン化され、単一
のイヌＩｇＧモノクローナル抗体を産生ずる単一クロー
ンとして確立される。さらに安定な抗体産生クローンを
確立するためには、早い時期にこのクローニング操作を
数回、繰り返し行うことが必要である。このような方法
により本発明者らは、イヌモノクローナル抗体を産生し
ているイヌ×マウスヘテロハイブリドーマＣＭ−８１，
８２およびＳ６の確立に成功した。このようなイヌ×マ
ウスヘテロハイブリドーマの好ましい一例として、出願
人は、ＣＭ−８６（微工研菌寄第１０（１７６号）細胞
を微工研に寄託している。この細胞は、本発明の以下の
遺伝子調製に用いる最も望ましい細胞株として挙げられ
る。

マウスやヒトの場合、免疫グロブリン遺伝子は抗原との
結合部位である可変領域（Ｖ領域〉遺伝子と補体や特定
の細胞と相互作用等に関与した生理活性をもつ定常領域
（Ｃ領域）３！１伝子により形成されていることがよく
知られている。さらに、■領域遺伝子は、数あるＶ遺伝
子断片群、Ｄ遺伝子断片群（Ｌ鎖ではまだ見つかってい
ない〉及びＪ遺伝子断片群の中からそれぞれ１個が選ば
れこの順序で並んで結合することによって形成される。

さらに、各クラスのＣ領域遺伝子とクラススイッチによ
り結合し、発現系の免疫グロブリン遺伝子となる。［利
根用進Ｎａｔｕｒｅ、　３０７．　ｐ５７５　（１９８
３）；本庶佑、　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１．　Ｐ４９９　（１９８３）参照
］、すなわち、活性型の発現可能な（ｍＲＮ＾に転写さ
れ、さらに蛋白質に翻訳されている〉Ｃ領域遺伝子であ
れば、免疫グロブリン遺伝子の特徴である遺伝子の再配
列を終えているはずである。そこで、抗体産生細胞とそ
の親株の染色体ＤＮＡを用いて、常法［例えば、　Ｔ。

Ｍａｎｔａｔｉｓ　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ”　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｔｎｇＢａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
、　　（１９８２）参照］に従ってサザンハイプリダイ
ゼーションを行い、抗体産生細胞に特異的な免疫グロブ
リン遺伝子を同定すれば、Ｃ領域遺伝子を含む免疫グロ
ブリン遺伝子を決定することが出来る。このようにイヌ
抗体産生細胞を用いれば、より速く目的の抗体遺伝子を
同定することが出来る。

目的の遺伝子を染色体ＤＮＡから調製した場合には、遺
伝子の中にイントロンと呼ばれる介在配列を含んでいる
。

抗体遺伝子を単離するためには、前述の２つのクローニ
ング方法におけるスクリーニングの方法として、王とし
て３つの方法が可能である。■；　イヌ抗体産生ＩＩｌ
胞の産生ずる抗体蛋白を精製し、これを材料にこの蛋白
質のアミノ酸配列を解析し、このアミノ酸配列に相当す
る核酸塩基配列を合成して、スクリーニング（ハイブリ
ダイゼーション）のプローブとする方法、■；すでに報
告されているマウス及びヒトの免疫グロブリン遺伝子の
遺伝子断片、あるいはその核酸塩基配列［例えば、坂野
ら、Ｎ＆ｔｕｒｅ、　　２８６．　　ｐ６７６、　　（
１９８０）；　ＩＥ、　Ｆ、、　　１Ａａｘら、　ＪＢ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５６．　ｐ５１１６．　（１
９８１）；　Ｊ、　Ｗ、Ｅｌｌｉｓｏｎら、　　Ｎｕｃ
、　　Ａｃ１ｄｓ、　　　Ｒｅｓ、、　　　１０．　　
　ｐ４０７１．（１９８２）　　；　　ＰＡ、　ｌ１ｅ
ｉｔｅｒら、Ｃｅ１１．　２２．　ｐ１９７　（１９８
０）］を参照して合成したＤＮＡ等をプローブに用いて
クロスハイブリダイゼーションによりスクリーニングす
る方法、■；　λｇｔｌ１等の発現ベクターに組み込ま
れたイヌ抗体遺伝子を大腸菌あるいは動物細胞において
発現させ、発現産物をイヌ抗体蛋白に対して作られた抗
血清（あるいはモノクローナル抗体〉を用いてスクリー
ニングする方法である。　　ｃＤＮＡクローニング法で
は■■■のいずれの方法も使用可能であり、染色体ｔｌ
Ｎ＾ｌＮ−クローニング法■の方法が使用可能である。

このようにしてクローニングされたイヌ免疫グロブリン
のＣ領域をコードする遺伝子断片の配列と、他の動物種
の免疫グロブリンのＣ領域遺伝子の配列とを比較し遺伝
子解析を行った結果、イヌ免疫グロブリンＣ領域をコー
ドする本発明の遺伝子断片は、λ鎖に属する遺伝子断片
であることが分かった。

免疫グロブリンのλ鎖としては、すでにヒト［Ｐ。

＾、ｔ（ｉｅｔｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ、２９４．ｐ５
３６　　（１９８１＞；　　Ｇ、Ｆ。

＋１ｏ１１ｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ、　２９６．　ｐ３２
１　（１９８２）］及びマウス［Ｂ、Ｂｌｏ＠ｂｅｒｇ
ら、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ！３＾
、７９゜ｐ５３０　　（１９８２）；　　Ｊ、Ｍｉｌｌ
ｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ、２９５．ｐ４２８（１９８２
）］で発見され、さらに、他の動物種のλ鎖では、ウサ
ギ［ｔｌｕｖｏｉｓｉｎ、ＭＲ，Ｍ、ら、Ｊ、　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、　、　１３６、ｐ４２９７−４３０２　（１
９８６）］、等が報告されているが、本発明に記載して
いるイヌλ鎖及びそれらをコードするアミノ酸配列、核
酸塩基配列については一切その報告例はなく、本発明に
より初めて開示されるものである。

このようにして本発明で得られた、イヌ免疫グロブリン
λ鎖定常領域をコードするＤ？ｌＡ断片の塩基配列を解
析し、該定常領域のアミノ酸配列を見いだし、これをこ
れまでに報告されているヒト、マウス、ウサギ等の免疫
グロブリンλ鎖定常領域のアミノ酸配列と比較検討した
ところ、イヌ免疫グロブリンλ鎮定常銀域に特異的なア
ミノ酸配列として、該λ鎖定常領域ポリペプチドのＮ末
端側から最初のシスティンのＮ末端側のアミノ酸配列が
下記（＾）のアミノ酸配列であることが見いだされた。

（＾）　　−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ｘｘｘ−ｘｘｘ−ｘｘｘ
−ｘｘｘ−ｘｘｘ−ｘｘｘ−Ｃｙｓ−（ＸＸχは任意の
アミノ酸残基） 本発明者らは、本発明により解析されたイヌの免疫グロ
ブリンλ鎖定常領域のアミノ酸配列、本発明者らが別途
解析したネコの免疫グロブリンス鎖定常ｍ域のアミノ酸
配列およびこれまでに解析されている種々の動物の免疫
グロブリンλ鎖定常領域のアミノ酸配列を比較すること
により、上記のシスティンのＮ末端側に存在する一ｃ＋
ｙ−Ａｌａ−の領域は、イヌ、マウス、ヒト等の種の違
いによっていずれも異なるアミノ酸配列となっている領
域であることを見いだした。また、同時にこの領域は、
例えばヒトのλ鎖定常領域のアミノ酸配列としては、サ
ブタイプ間で極めてよく保存されていることも見いだし
、今回本発明により明らかにされた上記の配列は、イヌ
免疫グロブリンλ鎖定常領域特有の配列であると推測さ
れた。尚、本発明においてクローニングされたこの領域
のアミノ酸配列は下記の通りであり、このアミノ酸配列
（Ｂ）がイヌ免疫グロブリンλ鎖定常領域に存在する特
有のアミノ酸配列の好ましい一例として挙げられる。

（Ｂ）　　−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ
−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ｖ＆１−Ｃｙｓ−本発明のイヌ×マ
ウスヘテロハイブリドーマは、上記（Ａ）または（Ｂ）
のアミノ酸配列を有するλ鎖Ｃ領域ペプチドを含むイヌ
免疫グロブリンを産生ずることを特徴とする。さらに、
本発明のイヌ免疫グロブリンλ鎖定常領域をコードする
遺伝子断片においても、上記（Ａ）または（Ｂ）のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をその一部に有するこ
とを特徴とする。このような上記のλ鎖に含まれるアミ
ノ酸配列は、イヌ免疫グロブリンλ鎖のＣ領域を決定す
る重要なアミノ酸配列と考えられ、本発明により初めて
明らかにされた。また、イヌλ鎖の定常領域ポリペプチ
ドのＣ末端から２番目のシスティンのＮ末端１１１１１
個目から９個目のアミノ酸配列においても、前記と同様
に、イヌ、ネコ等の種の違いによりアミノ酸配列が変化
する領域と思われ、本発明のイヌ免疫グロブリンλ鎮定
常領域では、−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−をその特有の
配列として有することが見いだされた。このようなイヌ
免疫グロブリンλ鎖のＣ領域をコードする遺伝子として
、第７図のアミノ酸配列をコードする遺伝子断片がその
好ましい一例として挙げられる。また、そのような遺伝
子の具体的核酸塩基配列の一例としては、第６図に示さ
れた塩基配列が挙げられる。このような本発明の遺伝子
断片は、イヌ抗体産生細胞由来のものに限らず、イヌ肝
臓等の細胞等から調製されたものも含む、しかしながら
、前述の抗体産生細胞（イス×マウスヘテロハイブリド
ーマ）を用いれば、抗体遺伝子をより迅速に同定するこ
とが可能になり、Ｃ領域遺伝子のクローニングをより容
易に行うことが出来る。また、本発明のλ鎖遺伝子を用
いてイヌ染色体ＤＮＡとサザンハイブリダイゼーション
を行った結果、本発明のλ鎖以外に、同じイヌλ鎖に属
している他のサブタイプのＣ領域遺伝子がいくつか存在
していることが示された。ヒトとマウスの例［Ｐ、＾、
　Ｈｉｅｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　２９４．　ｐ５３
６（１９８１）；　　Ｇ、Ｆ、Ｈｏ１ｌｉｓら、　Ｎａ
ｔｕｒｅ、　　２９６．　　ｐ３２１（１９８２）：　
　Ｂ、ＢＩｏｍｌ＋ｅｒｇら、　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ
ｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

ｔｌｓＡ、７９．　　ｐ５３０　　（１９８２）；　　
ｔ＋、Ｍｉｌｌｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ。

２９５、　ｐ４２８　（１９８２）］からも、イヌλ鎖
にもいくつかのサブタイプが存在すると思われる０本発
明のイヌ免疫グロブリンλ鎖の定常領域をコードする遺
伝子断片は、このようなサブタイプの異なるアミノ酸配
列をコードする遺伝子断片をも包含するものである。こ
のようなサブタイプの異なるｃ３Ｈ伝子のクローニング
は、本発明に開示されている塩基配列の一部をプローブ
として用いて行うことも可能である。

本発明のイヌ免疫グロブリンλ鎖のＣ領域遺伝子を直接
用いてマウス−イヌキメラ抗体を作製することが出来る
が、さらに本発明の中で開示されている塩基配列の一部
をプローブとして、染色体ＤＮＡライブラリィからジェ
ノミックな免疫グロブリンλ鎖Ｃ領域遺伝子をクローニ
ングし、これを用いてキメラ抗体を作製することも出来
る。キメラ抗体の作製方法はすでにマウス−ヒトキメラ
抗体で示された方法［液通ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ、　４７．　ｐ９９９−１００５．　　（１９
８７）］に準じて行うことが出来る。すなわち、キメラ
抗体遺伝子は、基本的にＶ領域遺伝子とＣ領域遺伝子の
２種類の遺伝子断片を結合させることにより構築される
。さらに、遺伝子の単離法に応じて、主として２つの結
合の組合せがある。すなわち、染色体ＤＮＡから単離し
たＶとＣ領域遺伝子、ｃＤＮＡから単離したＶとＣ領域
遺伝子の組合せである。

例えば、マウス染色体ＤＮＡから単離したＶ領域遺伝子
を、イヌ染色体ＤＮＡから単離したＣ領域遺伝子と結合
させた場合、マウスＶ領域遺伝子には発現に必要なプロ
モーターやエンハンサ−等の発現調節領域を含んでいる
ことが好ましい、ただし、プロモーターやエンハンサ−
等はマウス由来である必要はなく、イヌ由来でもヒト由
来でもウィルス由来でも差しつかえない、また、プロモ
ーターはＶ領域の５′上流域に位置し、エンハンサ−は
Ｖ領域遺伝子とＣ領域遺伝子の間に位置するのが好まし
いが、エンハンサ−については必ずしもこの位置に限定
されるものではない、一方、マウスｃＤＮＡから単離し
たＶ領域遺伝子を、イヌｃＤＮＡから単離したＣｇ域遺
伝子と結合させる場合、その結合部分は適当な制限酵素
サイトや、必要であれば適当な合成リンカ−を用いて、
■領域遺伝子のコードしているアミノ酸配列とぐ領域遺
伝子のコードしているアミノ酸配列がずれないよう、ま
たＶ領域アミノ酸配列とＣ領域アミノ酸配列が変化しな
いよう結合しなければならない、さらに、動物細胞中で
発現を可能にするための適当なプロモーターやエンハン
サ−等の発現調節領域を遺伝子の５゛上流域に付加して
やる必要がある。このようにして作製したキメラ抗体遺
伝子を、例えば、ｐＳＶ２−ｇｐｔ［Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌ
ｉｇａｎら、ｆ’ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ、　７８．　ｐ２０２７　（１９８１）
］、ｐｓ＋／２−ｎｅｏ［Ｐ、　　Ｊ、５ｏｕｔｈｅｒ
ｎら、　Ｊ、　　Ｍｏ１．　　＾Ｐｐ１Ｇｅｎｅｔ、、
　１．　ｐ３２７　（１９８２＞］等の選択マーカーの
付いた適当なベクタープラスミドに、あるいは、宿主細
胞内でプラスミド状態で増殖できるウィルス遺伝子の一
部（パピローマウィルスなど）を持ったベクタープラス
ミドに、１（鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子を別々に、あるいは
同時に組み込み、キメラ抗体遺伝子プラスミドを構築す
ることが望ましい、マウス−イヌキメラ抗体を得るため
には、このようにして調製されたキメラ抗体遺伝子を含
むプラスミドを用いて宿主動物細胞を形質転換すること
が必要である。宿主動物細胞としては、不死化されたマ
ウス及び他の動物細胞、好ましくはＢリンパ系細胞株［
例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８−６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ
　１５８０）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ・１　（ＡＴＣＣＣ
ＲＬ　１５９７）、Ｐ３／ＮＳＩ／Ｉ　Ａｇ４−１　（
ＡＴＣＣＣＲＬ１８）、５ｐ２１０−Ａｇ１２（ＡＴＣ
ＣＣＲＬ　１５８１）等の形質、ｍａｗ、ハイブリドー
マ］である。　　Ｄ？ｌＡによる細胞の形質転換方法と
しては、ＩＩＥＡＥ−デキストラン法、燐酸カルシウム
共沈降法、プロドブロスト融合法、エレクトロポレーシ
ョン法等の方法［例えば、ＢＤ、　　Ｈａｍｅｓら編ａ
”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌ
ａｔｉｏｎ”　ＩＲＬ　Ｐ’ｒｅｓｓ　（１９８４）参
照］があり、いずれの方法でもよい。１１鎖とＬ鎖のキ
メラ抗体遺伝子を同時に持つプラスミドで形質転換を行
う場合には選択マーカーは１種類でよいが、Ｉ（ｇＩＬ
鎖別々の場合には２種類のマーカーが必要である。この
場合には、１つのプラスミドで形質転換を行った後に、
さらにもう一方のプラスミドで形質転換を行う二重形質
転換法を用いるのが好ましい、このようにして形質転換
された細胞を通常のハイブリドーマと同じ適当な条件下
（ｆＭえば、１０％牛脂児血清を含むＲＰ１４１１６４
０培地中〉で培養すれば、この細胞から通常のハイブリ
ドーマの産生ずる抗体と同様にキメラ抗体が分泌産生さ
れる。このキメラ抗体は通常の抗体と同様な方法により
精製することが出来る。

本発明であるイヌ免疫グロブリンλ鎖Ｃ領域をコードす
る遺伝子を用いて、上述のようにして得られるマウス−
イヌキメラ抗体は、イヌの疾病に対して、これまでにな
かった実質的に有効な診断、予防及び治療剤となりうる
ちのである。さらに、本発明により提供されるイヌ免疫
グロブリンをコートする遺伝子断片は、イヌ免疫グロブ
リンλ鎖のＣ領域の特異的アミノ酸配列もしくはＤＮＡ
配列を開示するものであり、今後、さらに同じλ鎖に属
する他のサブタイプのＣ領域遺伝子を単離することを可
能にするものである。

次に、その実施例を示すが本発明は何等これに限定され
るものではない。

まず、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ：デイフコ
社製）５−をピーグル犬に皮下及び腹腔内注射して、非
特異免疫を行った。さらに、２〜３週間の間隔で同操作
を数回繰り返して免疫を増強した。このようにして免疫
したピーグル大より、最終免疫２〜３週間後に肺臓及び
リンパ節を得た。これらの脛臓及びリンパ節を１００Ｉ
ＬＩのペニシリン（萬有製薬社製〉−ストレプトマイシ
ン（明治製菓製〉を補充したＲＰＭ１１６４０培地（日
永製薬社製）中でよく洗浄し、その後ＲＰＭＩ−１６４
０中で細片に砕き、ピンセットでさらに細かくし、ピペ
ッティングにて細胞浮遊液とした０次いで、赤血球除去
液にて赤血球を除き、数回の遠心処理後、イヌリンパ球
を得た。ピーグル犬−顧の脛臓からは１〜３Ｘ　１０”
細胞側、リンパ節からは１〜３Ｘ１０＠ｉ［ｌｌｌｌｆ
ａ個のリンパ球が得られた。さらに、これらのリンパ球
をＬ−グルタミン（フローラボラトソイ社製〉添加ＲＰ
Ｍ１１６４０＋　１０％牛脂児血清（ハイクローン社製
〉の完全培地に５〜ＩＯＸ　１０’細胞／−にて懸濁し
、２．５μ９／−量のホークライードマイトジェン（Ｐ
ＷＭ：ギブコ社製〉を加え、３７℃、５％Ｃｏｔ存在下
で、２〜５日間刺激培養し活性化した。

マ　　ス 本発明に使用した骨髄腫細胞は、すてにケーラーらが、
Ｎａｔｕｒｅ、　２５６．　ｐ４９５　（１９７５）及
びＥｕｖ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６．　ｐ２９２　（１９７６＞に記
載しているマウスＢ＾ＬＩＩ／ｃ由来の骨髄ｌｉｍ胞系
で、特に、亜株）Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３及びＰ３
−Ｘ６３−Ａｇ８−０１．　ＳＰ２１０Ａｇ１２ｒある
。

これらをグルタミン添加ＲＰＭ１１６４０＋１０％牛脂
児血清の完全培地にて増殖培養し、融合直前に回収し、
ＲＰＭ１１６４０培地で２回洗浄後、同培地に再混濁し
、融合に用いた。

・　パ　　　マ　　ス　　　　　　　　　　　　　　　
　４前記のイヌリンパ球混濁液とマウス骨髄腫細胞混濁
液とを混合しくイヌリンパ球：骨髄腫細胞＝１０：１又
は５；１の割合、イヌリンパ球＝　ＬＸ　１０＠又は２
×１０＠細胞ｌ１ｌ）、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分
離Ｌ）’？細胞ベレットにＲＰＭ１１６４０で希釈した
４５％ポリエチレングリコール液（シグマ社製ｐＨ７，
６分子量３６５０、又はセルバ社製ｐｆ１７．６分子量
４０００）　１−を室温にて１分間で加えた。３７℃、
５〜１０分間靜置し装後、４０−のＲＰＭ１１６４０を
６分間かけて加え、細胞を静かに再混濁し、融合を停止
した０次いで、細胞を１１０００ｒｐ、１０分間遠心分
離し、上清を吸引除去した後、グルタミン添加ＲＰ１４
１１６４０＋　１０％牛脂児血清＋ＨＡＴ（Ｉ［：ヒボ
キサンチン１３．０μ９／−１Ａニアミノプテリン０．
１８μ９／−５Ｔ：チミジン３．８７μｇ／−全てシグ
マ社！！Ｊ）にリンパ球濃度として２〜ＩＯＸ　１０％
細胞個／ｄに再混濁せしめた。これを９６六マイクロタ
イタープレート中に２００Ｊ　／穴として分注し、３７
℃、５％Ｃｏ２存在下にて培養した。５〜７日後、同培
地で５０％培地交換を行い、さらに、融合後１０〜２８
日後にかけて、５〜６回の培地交換を繰り返した。かく
して、ハイブリドーマのみが増殖し、スクリーニングア
ッセイが出来るまで培養を継続した。

ハイブリドーマの増殖が充分に進行したことを確認し、
イヌ！ｇＧ抗体を産生しているクローンを検出するため
、スクリーニングアッセイを行った。

スクリーニングアッセイは、エンザイムイムノアッセイ
（Ｅｌ、Ａ）にて行った。即ち、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体
（カッペル社製）をコーティング、し、牛アルブミン（
シグマ社製）で非特異吸着を阻止した９６穴プレートを
作製し、ハイブリドーマ培養プレートの各式からの培養
上清を５０−加え、３７℃、１〜２時間インキュベート
した後、ＰＢＳ−Ｔ［０，０１％Ｔｗｅｅｎ　（片山化
学社製〉、０、ＯＩＭ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、　　ｐＨ
７，２，０，１５Ｍ　ＮａＣ１］にて４回洗浄し、ペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗イヌＩｇＧ抗体くカッベル社製
　１００００倍希釈〉を５０Ｊ添加、３７℃、１時間イ
ンキュベートした。その後ＰＢＳ−Ｔにて５回洗浄し、
ＴＭＢＺ基質溶液（ＴＭＢＺ：　同上化学社製０．４■
／ｄ、過酸化水素水：三菱瓦斯化学社製０．００６％）
を５０−添加して発色させた。　　１０〜１５分後、０
、３ＮＨ２ＳＯ４（片山化学社製）５０Ａを加えて反応
を停止し、これらの発色程度を分光光度計（波長＝４５
０〉にて測定した。このようにして選別したイヌＩｇＧ
産生穴中のハイブリドーマを限界希釈法にて単一クロー
ン化くクローニング）を行った。クローンが９６穴プレ
ートの各式に増殖してきた後に、イヌＩｇＧ産生クロー
ンを検出するために、前記と同様のエンザイムイムノア
ッセイ（ＥＩＡ）を行った。このクローング操作を少な
くとも３回以上繰り返して、安定にイヌＩｇＧを産生ず
るイヌ×マウスハイブリドーマクローンを得た。さらに
、このハイブリドーマクローンを順次拡張培養し、グル
タミン添加Ｒｆ’Ｍ　１１６４０＋■＾Ｔ＋　１０％Ｉ
）ＭＳＯ（和光純薬）ノ１ｌｌｌｌｌｔ＆ｉ用培ｔｆｉ
にて、液体窒素中に凍結保存した。

確立されたイヌ×マウスハイブリドーマは、ＥＩＡ法に
よるイヌ抗体産生量測定の結果、１年以上の長期にわた
って、イヌＩｇＧモノクローナル抗体を１、Ｏ〜３．０
μ９／−の量で安定に産生しており、抗体産生能におい
て何ら異常が認められないことを確認している。

確立されたイヌ×マウスハイブリドーマが産生ずるイヌ
モノクローナル抗体は、免疫沈降法［免疫実験操作法　
日本免疫学会１　　参照］により、イヌＩｇＧであるこ
とが明らかになった。この抗体はヤギ抗マウス１ｇ抗血
清及びヤギ抗ヒトＩｇ抗血清とは全く沈降物を形成せず
、ヤギ抗イヌＩｇＧ抗血清とのみ沈降物を形成すること
から、該モノクローナル抗体は、イヌＩｇＧ抗体である
と判断される。さらに、該モノクローナル抗体が完全な
イヌ型モノクローナル抗体であることを証明するために
、免疫沈降法より感度の高いＥＩＡ法を用いて精査した
。その結果、該モノクローナル抗体は、いずれも抗イヌ
ＩｇＧ抗体とのみ特異的に反応し、抗ヒトＩｇＧ抗体及
び抗マウスＩｇＧ抗体とは反応しないことにより、イヌ
ＩｇＧ抗体であることが証明されたく第１図）、さらに
、ウェスタンプロットアッセイ法［免疫実＠操作法日本
免疫学会編　参照］により、該モノクローナル抗体は抗
体の重１（Ｈ鎖〉フラグメント、軽鎖〈Ｌ鎖）フラグメ
ント共に抗イヌＩｇＧ抗体とのみ特異的に反応し、抗ヒ
トＩｇ（４ｋ、抗？　ｆｙ　スＩｇＧ抗体）−ハＨ１ｍ
、ＬＭフラグメント共に全く反応しないこと、さらに、
該モノクローナル抗体のＨ鎖、Ｌ鎖フラグメントは、標
準イヌＩｇＧ抗体のＨ鎖、Ｌ鎖フラグメントと分子量的
に同一のものであることから、イヌＩｇＧ抗体のＩ＋鎖
、Ｌ鎖フラグメントを有する完全なイヌＩｇＧモノクロ
ーナル抗体であることが証明されたく第２図〉。

又、該ハイブリドーマクローンの細胞質内蛍光抗体染色
アッセイ法［免疫実験操作法　日本免疫学会編　参照］
により、細胞質内イヌＩｇＧ抗体の合成を調べた結果、
いずれのクローンも抗イヌＩｇＧ抗体でのみ特異的に細
胞質内染色され、他の抗ヒトＩｇＧ抗体及び抗マウスＩ
ｇＧ抗体では染色されないことにより、該ハイブリドー
マクローンは、その細胞質内において完全なイヌＩｇＧ
モノクローナル抗体を合成していることが証明された。

このようなイヌモノクローナル抗体を産生ずるイヌ×マ
ウスヘテロハイブリドーマＣＭ、３６４１１１胞は、微
工研菌寄第１００７６号として本出願人より寄託されて
いる。この細胞を以下に述べる実験に使用した。

ｃＤＮＡ−−１ ヘテロハイブリドーマＣＭ−８６細胞から全ＲＮ＾をグ
アニジウムチオシアネート法（Ｊ、　Ｍ、　Ｇｈｉｎｇ
ｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒｙ、　　１８．
　ｐ５２９４　（１９７９）１により分離し、さらにオ
リゴｄＴカラム（ファルマシア）を用いてポリＡ＋ＲＮ
Ａに精製した。この精製ポリＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡ合
戊システムプラス（アマジャム）を用いてＣ１４−８６
細胞のｃＤＮＡを合成した０合成したｃＤＮＡのＥｃｏ
ＲＩサイトをＥｃｏＲＩメチレース（宝酒造二以下本実
施例で使用した試薬は、特に断りのない限り宝酒造製か
東洋紡製を使用した〉を用いてメチル化した後、７４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いてＥｃｏＲＩリンカ−を付加した。

さらにこのｃＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化し
、バイオゲル＾５０謝カラム（バイオ・ラッド）を用い
てＥｃｏＲＩリンカ−の付加したｃＤＮＡを精製した０
次にこのｃＤＮＡとλｇｔｌ　１ベクターＤＮＡ　（ス
トラタジーン社）のＥＣＱＲＩアームとをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼにより連結させ、ストラタジーン社のキットを用
いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングを行い、ＣＭ−
３６＋ｔ［胞のｃＤＮＡライブラリィを得た。

上述のように構築したＣＭ−３６細胞のｃＤＮＡライブ
ラリィから、１枚のＬＢプレート（１，５Ｘ　Ｂａｃｔ
ｏ−ａｇａｒ（ジフコ社ＩＫ＞、　１％Ｂａｃｔｏ−ｔ
ｒｙｐｔｏｎｅ　（ジフコ社ｔＪ）、　０．５％Ｂａｃ
ｔｏ−ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　（ジフコ社製）、
０．２５％ＮａＣ１（和光純薬）、　ｐｌ！７．５の入
った角２号シャーレ（栄研器財社製）］当たり５０００
０個のλｇｔｌｌプラークが出来るように大腸菌ｙ１０
９０にファージを感染させて播き、４２℃で３時間培養
する。その後、１０ｍＭ　ＩＰＴＧ　　（和光純薬）を
染み込ませたニトロセルロースフィルター（ＮＣ７イル
ター：　３＆Ｓ社製　Ｃｏｄｅ　Ｂ＾８５）をがぶせ、
さらに３７℃で４時間培養を続ける。その後ＮＣフィル
ターをプレートからはがし、Ｗバッファー［ＷＢ：　７
ｍＭＴｒｉｓ　ｐＨ７，２，１５０園Ｍ　ＮａＣ１，０
，００５％　Ｔｗｅｅｎ２０］で洗い、ＢＬＯＴＴＯ［
５％スキムミルク、　　ｌ０ＪＡ／１００ｄ　Ａｎｔｉ
ｆ。

ａｍＡ］に４℃で一晩浸す０次に１０μ９／−抗イヌＩ
ｇＧ抗体くカッペル社製）［１％Ｅ、ｃｏｌｌライセー
ド（バイオラット社製）で４℃−挽込１１！］の入った
ＢＬＯＴＴＯに交換し、室温で２時間反応させる。ＶＢ
で５回洗浄した後、５０００倍希釈したペルオキシダー
ゼ標識ヤギＩｇＧ抗体くカッベル社製）［１％Ｂ、　ｃ
ｏＩｉライセード（バイオラット社ｇりで４℃−挽込理
］の入ったインキュベーションバッファー　［ＰＢＳ　
ｐ［（７，２，０，００５％Ｔｗｅｅｎ２０．１％ＢＳ
＾］に浸け、室温で２晴間反応させる。ＶＢで５回洗浄
した後、５％ＨＲＰ　ｃｏｌｏｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ　ｒｅａｇｅｎｔ（バイオラッド社製）と０．５％
Ｈ２Ｏ２（和光純薬）を含んだ発色液に浸し、発色させ
た。　　ＮＣフィルター上で発色したプラークに対応す
るファージを選び、クローニングを重ねた。このように
して抗イヌ！ｇＧ抗体と反応するクローンを選択し、最
終的に３６−６１を得た。このクローンは約０．７ｋｂ
のサイズで、後述する核酸塩基配列分析の結果から、免
疫グロブリンλ鎖に属する遺伝子であると思われた。そ
の制限酵素切断点地図を第３図に示す、このクローンの
ＥｃｏＲＩ挿入断片をＴｈｏｍａｓとＤａｖｉｓの方法
［Ｍ、　Ｔｈ。

ｗａｓとＲ，Ｗ、　　Ｄａｖｉｓ、　　Ｊ、　　Ｍｏ１
．　　Ｂｉｏｌ、、　　９１．　　ｐ３１５（１９７４
）参照］によりファージＤＮＡより単離し、さらにｐｕ
ｃｔｓベクターのＥｃｏＲＩサイトにサブクローニング
した。

初めにこの３６−６１を用いたサザンプロット分析を行
った。イヌ肝臓細胞の染色体ＤＮＡｌ０μ９を制限酵素
ＥｃｏＲＩで切断し、このＤＮＡを電気泳動で０．７％
アガロースゲルに展開し、ナイロンメンブレンフィルタ
ー（シーンスクリーンプラス、ＮＥＷ・リサーチ・プロ
ダクトンに転写後、イヌＣλ鎖領域を含んだ［’Ｑ］Ｉ
識５６−６１１０−ブとサザンハイプリダイゼーション
を行った。サザンハイプリダイゼーションの方法はシー
ンスクリーンプラスに付属していたマニュアルのプロト
コールに従った０分子サイズはλフアージＤＮＡを旧ｎ
ｄｌｌｌで切断したマーカーＤＮＡによって算出した。

結果は、第４図に示すように、バンドが約２〜２０ｋｂ
まで色々なサイズにわたって検出された。このことはイ
ヌＣλ領域遺伝子が１種類のサブタイプだけでないこと
を示唆している。

又、Ｃλ領領域１種類でないことはヒト及びマウスの例
［Ｐ、　Ａ、旧ｅｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　２９４．
　ｐ５３６　（１９８１）；　　Ｇ、Ｆ、Ｈｏ１ｌｉｓ
ら、　Ｎａｔｕｒｅ、２９６．ｐ３２１　　（１９８２
）：Ｂ、Ｂｌｏｉｂｅｒｇら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、５ｃｌＵＳ＾、７９ｐ５３　　（１９８２）
；Ｊ、Ｍｉｌｌｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ、２９５．　　
ｐ４２８（１９８２）１からも推定できる。さらに野生
のマウスではＣλ領域遺伝子が増幅していることが知ら
れており　　［Ｃ，Ｌ、　　　５ｃｏｔｔら、　　Ｎａ
ｔｕｒｅ、　　　３００．　　　ｐ７５７　　　（１９
８２）］このイヌＣλ領域遠伝子も同様に増幅を受けて
いることが考えられる。

次にノーザンプロット分析を行った。ハイブリダイゼー
ションに使用したＲＮＡはイヌ牌ｍ細胞及びＣＭ−３６
４（Ｂ胞から全ＲＮＡをグアニジウムチオシアネート法
［Ｊ、　Ｈ，Ｇｈｌｎｇｗｉｎら、Ｂｔｏｃｈｅ＋１Ｘ
ｓｔｒｙ、　　１８．　　ｐ５２９４（１９７ｇ）　コ
により分離し、さらにオリゴｄＴカラム（ファルマシア
）を用いてポリＡ＋ＲＮＡに精製したものである。この
ＲＮＡ２ｔｔｇを電気泳動により３％ホルムアルデヒド
を含む０．７５％アガロースゲルに展開し、ナイロンメ
ンブレンフィルター（シーンスクリーンプラス〉に転写
後、［１”Ｐ］Ｉ［識３６−６１１０−ブとノーザンハ
イブリダイゼーションを行った。ノーザンハイブリダイ
ゼーションの方法はシーンスクリーンプラスに付属のマ
ニュアルのプロトコールに従った。その結果、両方の細
胞ともこのプローブにより約１．３ｋｂの位置にバンド
が検出されたく第５図〉。

このサイズはマウス及びヒトで知られている免疫グロブ
リンλ鎖遺伝子のサイズとほぼ同じである。

これら２つの結果より、このＳ６−６１遺伝子はｍ　ｊ
ｆｆｌ的なイヌＣλ領域を含む活性な遺伝子であること
が推定された。

− ３６−６１の核酸塩基配列を調べるために、３６−６１
から、　ＥｃｏＲＩ　−５ａｃ　Ｉ、　　Ｓａｃ　Ｉ　
−Ａｃｅロ　、　Ａｃｅ　１ｌ−ＥｃｏＲＩ、ＨｃｏＲ
Ｉ　−Ｈｈａ　Ｉ　、　　Ｓｔｕ　ｌ　−ＥｃｏＲｌの
各小ＤＮＡ断片を調製した（第３図）、これらの各小断
片をＴ４−ＤｔｌＡボリメレースを用いて切断面を平滑
末端に変えた後、Ｍ１３−Ｐ１９ベクターのＳ鳳ａＩサ
イトに宝ライゲーションキットを用いて挿入した。東洋
紡インストラクトマニュアルの方法に従い、ＪＭＩＯＩ
のコンピテント細胞を調製し、Ｃλ遺伝子を挿入したＭ
１３ｍｐ１９　ＤＮＡで形質転換させ、−本ｇＤＮＡを
抽出精製した。さらにこの−重鎖ＤＮＡの核酸塩基配列
決定は、タカラＭ１３シークエンスキットと富士・ジェ
ンサー・ゲル・システムを用いて行った。核酸塩基配列
を行った方向は第３図に示す、核酸塩基配列決定の結果
、ｖＪＣの各領域からなるイヌλｆａ３！！伝子が１認
された。

第６図にその結果を示す、さらに、この核酸塩基配列を
基にアミノ酸に変換したところ、この遺伝子がオープン
リーディングフレームをとり、疑似遺伝子でないことが
示されたく第７図〉、尚、出願人は、このＩＩＮＡ断片
を組み込んだベクターにより形質転換された大腸菌　Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈＬａ　ｃｏｌｉ　ＣＣＬ−３６６１＜
微工研菌寄第１０９４１号）を寄託している。

この８６−６１の核酸塩基配列をもとに遺伝子解析ソフ
ト（Ｇｅｎｅｔｙｘ　　Ｖｅｒ、６；　　ソフトウェア
開発社製）を用いて、ＬＡＳＬとＥＭＢＬのデータベー
スをホモロジー検索したところ、ヒト免疫グロブリンλ
鎖と一番高いホモロジーを示し、免疫グロブリンλ鎖遺
伝子以外の遺伝子とはホモロジーは示さなかった。

５６−６１３１を伝子の０人領域とマウス及びヒトのＣ
λ領領域ホモロジー比較すると、核酸レベルでマウスと
は７５．２％、ヒトとは８４．８％であり、アミノ酸レ
ベルでマウス７３．１％、ヒトとは８４，６％であった
。

以上の結果より、５６−６１３１を伝子は間違いなくイ
ヌ入鎖に属する遺伝子であり、マウス−イヌキメラ抗体
作製を可能にする遺伝子である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明で作成されたイヌ×マウスハイブリド
ーマの産生ずるＩｇＧが、イヌ型モノクローナル抗体で
あることを確認した抗イヌ抗体を用いたＥＩＡの結果を
示す。 第２図は、本発明で作成されたイヌ×マウスハイブリド
ーマの産生ずる１ｇＧが、イヌ型モノクローナル抗体で
あることを確認した抗イヌ抗体を用いたウェスタンプロ
ットの結果を示す。 第３図は、本発明においてクローニングされたイヌ免疫
グロブリン人鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片（３６
−６１）の制限酵素切断地図および塩基配列解析を行っ
た領域く→）を示す。 第４図は、本発明においてクローニングされたイヌ免疫
グロブリンλ鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片（８６
−６１）とイヌ肝ｌｌＩ細胞染色体ＤＮＡ　（ＥｃｏＲ
Ｉ消化〉のサザンハイブリダイゼーションの模式図であ
る。 第５図は、本発明においてクローニングされたイヌ免疫
グロブリンλ鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片（Ｓ６
−６１　）とＣＭ−３６細胞のポリＡ＋ＲＮ＾（レーン
１）またはイヌ牌臓ポリ＾＋ＲＮＡ　（レーン２）との
ノーザンハイブリダイゼーションの模式図である。 第６図は、本発明においてクローニングされたＤＮＡ断
片（８６−６１）中に存在するイヌ免疫グロブリン人鎖
定常領域をコードするＤＮＡ塩基配列を示す。 第７図は、本発明においてクローニングされたＤＮＡ断
片（８６−６１＞中にコードされるイヌ免疫グロブリン
λ鎖定常領域の全アミノ酸配列を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）イヌ免疫グロブリンを産生するイヌ×マウスヘテ
   ロハイブリドーマ。 （２）該イヌ免疫グロブリンのＬ鎖のクラスがλである
   前記第（１）項のハイブリドーマ。 （３）該λ鎖の定常領域ポリペプチドのＮ末端側から最
   初のシステインのＮ末端側のアミノ酸配列が下記のアミ
   ノ酸配列である前記第（２）項のハイブリドーマ。 −Ｇｌｙ−Ａｌａ−ｘｘｘ−ｘｘｘ−ｘｘｘ−ｘｘｘ−
   ｘｘｘ−ｘｘｘ−Ｃｙｓ−（ｘｘｘは任意のアミノ酸残
   基） （４）該システインのＮ末端側の配列が、下記のアミノ
   酸配列である前記第（３）項のハイブリドーマ。 −Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−
   Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−（５）該λ鎖の定常領域ポリ
   ペプチドのＣ末端から２番目のシステインのＮ末端側１
   １個目〜９個目のアミノ酸配列が、−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−
   Ｌｙｓ−である前記第（２）項のハイブリドーマ。 （６）該λ鎖の定常領域ポリペプチドのアミノ酸配列が
   、下記のアミノ酸配列である前記第（２）項記載のハイ
   ブリドーマ。 −Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−
   Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐ
   ｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
   ｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
   −Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−
   Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔ
   ｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅ
   ｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ
   −Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−
   Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａ
   ｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅ
   ｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ
   −Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−
   Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖ
   ａｌ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈ
   ｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ
   −Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ（７）イヌ
   免疫グロブリンを産生するイヌ×マウスヘテロハイブリ
   ドーマのポリＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これを
   発現ベクターに組み込み宿主細胞で発現させ、抗イヌ免
   疫グロブリン抗体を用いて形質転換体をスクリーニング
   することを特徴とするイヌ免疫グロブリン遺伝子の調製
   法。 （８）イヌ免疫グロブリンλ鎖の定常領域をコードする
   ＤＮＡ配列を含有する遺伝子断片。 （９）該λ鎖の定常領域ポリペプチドのＮ末端側から最
   初のシステインのＮ末端側のアミノ酸配列が下記のアミ
   ノ酸配列である前記第（８）項の遺伝子断片。 −Ｇｌｙ−Ａｌａ−ｘｘｘ−ｘｘｘ−ｘｘｘ−ｘｘｘ−
   ｘｘｘ−ｘｘｘ−Ｃｙｓ−（ｘｘｘは任意のアミノ酸残
   基） （１０）該λ鎖の定常領域ポリペプチドのＮ末端側から
   最初のシステインのＮ末端側のアミノ酸配列が下記のア
   ミノ酸配列である前記第（９）項の遺伝子断片。 −Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−
   Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−（１１）定常領域ポリペプチ
   ドのＣ末端から２番目のシステインのＮ末端側１１個目
   から９個目のアミノ酸配列が、−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｙ
   ｓ−である前記第（８）項の遺伝子断片。 （１２）定常領域ポリペプチドが下記のアミノ酸配列で
   ある前記第（８）項の遺伝子断片。 −Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−
   Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐ
   ｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
   ｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
   −Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−
   Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔ
   ｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅ
   ｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ
   −Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−
   Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａ
   ｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅ
   ｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ
   −Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−
   Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖ
   ａｌ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈ
   ｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ
   −Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ（１３）下
   記のＤＮＡ配列を含む前記第（１０）項記載の遺伝子断
   片。 【遺伝子配列があります】 （１４）下記のＤＮＡ配列を含む前記第（１２）項記載
   の遺伝子断片。 【遺伝子配列があります】