JP2811089B2 - イヌ×マウスヘテロハイブリドーマおよびイヌ免疫グロブリンλ鎖の定常領域をコードする遺伝子断片 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、イヌ免疫グロブリンを産生する新規なイヌ
×マウスヘテロハイブリドーマ、およびこのハイブリド
ーマを用いたイヌ免疫グロブリン遺伝子の調製法、さら
にイヌ免疫グロブリンの定常領域をコードする遺伝子断
片に関する。

発明の背景 イヌはペットとして昔から人間に愛着のある動物であ
るが、近年の欧米では、「伴侶、仲間、相棒としての動
物」（Companion species）と称され、人間社会の一員
としての地位を獲得しつつある。また、警察犬、盲導犬
などのように必要不可欠な動物としても貢献している。
一方では、医学、薬学、畜産学、獣医学から心理学にい
たる実験動物としての貢献度は従来から大きなものであ
ったが、近年では医薬品の効果検定や安全性試験にmini
mal disease dogなどの呼称のもとで更に貢献度が高ま
っている。いずれの場合にも当然の事として、これらの
イヌの疾病、特に伝染病に関するより確実な知識がます
ます必要となり、その診断、治療、予防のための方法が
確立される事が要求されている。

イヌのウイルス生疾患は多く、なかでもイヌジステン
パーウイルス、イヌパルボウイルス、イヌ伝染性肝炎ウ
イルス等の疾患は急性で致死率が高い。予防としてのワ
クチンは開発されているものの、感染・発症したイヌの
治療法としては、抗生物質、サルファ剤等の二次細菌感
染予防の対症療法しかないこと等、現在の治療法には問
題を残している。従来より治療法として高度免疫血清や
血清由来の免疫グロブリンが使用され有効な実績を残し
てきた。しかし、現在では、動物愛護思想の高まりと共
に、イヌ血清原料の入手が困難になりこの治療法は使い
たくとも使用できない状況になっている。従って、従来
の高度免疫血清に代わって感染ウイルスを中和できるモ
ノクローナル抗体が出来れば、これらウイルス性疾患の
治療に大きく貢献することが可能である。

従来技術 上記のような高度免疫血清の代替品として、ウイルス
中和活性を有するモノクローナル抗体の使用が考えられ
る。モノクローナル抗体作製に関する基本的な技術は、
これまでに主としてマウス型モノクローナル抗体におい
て確立されている。ハイブリドーマ等の細胞が産生する
モノクローナル抗体は大量にしかも半永久に得られ、原
料不足の問題を解消できうる。しかし、ここにおけるモ
ノクローナル抗体は、副作用（マウスモノクローナル抗
体をイヌに使用した場合、異種タンパクとしてアナフィ
ラキシーショックや血清病などの副作用を起こすことが
考えられる）をなくす意味から、従来のマウスモノクロ
ーナル抗体ではなくイヌモノクローナル抗体でなければ
ならない。

これらのイヌウイルス性疾患の治療薬としてのイヌモ
ノクローナル抗体の作製法には次のようなものが考えら
れる。（１）イヌ×イヌハイブリドーマを用いる方法、
（２）ある種のウイルス及び化学薬剤等でトランスフォ
ームさせたイヌリンパ球を用いる方法、（３）イヌ×マ
ウスヘテロハイブリドーマを用いる方法、（４）イヌ×
マウスヘテロハイブリドーマを親株としたイヌ×（イヌ
×マウス）ハイブリドーマを用いる方法、（５）キメラ
モノクローナル抗体（抗原と結合する可変（Ｖ）領域は
ウイルス中和活性を有するマウスモノクローナル抗体か
ら、抗原性あるいは免疫原性及び生理活性に関与する定
常（Ｃ）領域はイヌモノクローナル抗体からなる、マウ
ス（Ｖ）−イヌ（Ｃ）キメラモノクローナル抗体）を遺
伝子組換えで作製する方法、等であるが、これらのいず
れの方法に関しても成功例は一切報告されていない。

ここで、（１）については融合効率が低いことや適当
なミエローマ親株がないこと、（２）についてはヒトの
場合のEBウイルスに相当する適当なウイルスや適当な化
学薬剤がないこと、さらに、（３）（４）の方法ではヒ
ト型モノクローナル抗体作製例から考えて、目的のイヌ
型モノクローナル抗体を高効率に得るまでには多くの困
難が予想される（例えば、安定性の問題等）。従って、
（５）のキメラモノクローナル抗体法がより実現性の高
い方法であると考えられる。

このキメラモノクローナル抗体は、可変（Ｖ）領域の
原料となるマウスモノクローナル抗体を産生するマウス
×マウスハイブリドーマからクローニングしたそのＶ遺
伝子と、定常（Ｃ）領域の原料となるイヌモノクローナ
ル抗体を産生するイヌ抗体産生細胞からクローニングし
たＣ遺伝子とを結合させたマウス（Ｖ）−イヌ（Ｃ）キ
メラ抗体遺伝子を含むプラスミドベクターを、動物細胞
（例えば、マウスミエローマ）宿主中で発現させ、その
培養上清中に得られるものである。ヒトにおいてはすで
にキメラ抗体に関するいくつかの報告が見受けれる（特
開昭60−155132号、特開昭61−47500号）。

このようにイヌキメラ抗体の作製には、目的の抗原と
結合能を持つ抗体分子の可変（Ｖ）領域のアミノ酸配列
をコードする遺伝子とイヌ免疫グロブリンの定常（Ｃ）
領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子が必要となる。
キメラ抗体の可変（Ｖ）領域遺伝子は、前述した種々の
イヌウイルス等に対して中和活性を有するマウスモノク
ローナル抗体を産生する細胞から得られるもので、この
細胞は従来のマウス×マウスハイブリドーマ法で比較的
容易に作製することが出来る。しかしながら、キメラ抗
体の定常領域遺伝子となるイヌ免疫グロブリンＣ領域遺
伝子については現在のところ全くその構造が知られてお
らず、遺伝子もクローニングされていない。従って、イ
ヌキメラ抗体を作製するためには、イヌ免疫グロブリン
の定常（Ｃ）領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子を
見いだすことが非常に重要な要素となっている。

また、前述の（１）から（４）までの方法は目的の特
異性をもったモノクローナル抗体を作るには多くの問題
点があるが、（５）のキメラ抗体作製のための有効な材
料（細胞株）を提供することが可能である。すなわち、
イヌ免疫グロブリンを産生している細胞であれば、その
特異性に関係なく、キメラ抗体を作製するためのイヌ免
疫グロブリン遺伝子のＣ領域を提供する好ましい材料と
なり得るからである。

発明の目的 このような状況にあって、本発明者らは、イヌ免疫グ
ロブリンを産生しているイヌ×マウスヘテロハイブリド
ーマを作製することに成功した。さらにこの細胞からイ
ヌ免疫グロブリンの定常領域のアミノ酸配列をコードし
ている遺伝子を単離することに成功した。また、さらに
イヌ免疫グロブリンの定常領域をコードする遺伝子断片
の塩基配列の解析により、イヌ免疫グロブリンλ鎖定常
領域特有のアミノ酸配列を見いだし本発明を完成するに
至った。

すなわち、本発明は、これまでに一切報告されていな
いイヌ免疫グロブリン産生イヌ×マウスヘテロハイブリ
ドーマを提供することを目的とする。さらに、本発明の
もうひとつの目的は、これまでに一切遺伝子解析がなさ
れていないイヌ免疫グロブリン遺伝子λ鎖の定常領域を
コードするDNA断片を提供するものである。さらに、本
発明は、イヌモノクローナル抗体を構成するイヌ免疫グ
ロブリンλ鎖の定常領域をコードするDNA断片を提供す
るものであり、このDNA断片を用いて作られるイヌキメ
ラ抗体は、イヌの疾病、特に伝染病に対して副作用のな
い診断薬、治療薬・予防薬への応用を可能にするもので
ある。

発明の構成及び効果 新規なイヌ免疫グロブリンＣ領域遺伝子を単離する方
法としては、主として２つの方法が考えられる。ひとつ
は、イヌ細胞の染色体DNAから常法［例えば、T.Maniati
s“Molecular Cloning"Cold Spring Harbor Lab.（198
2）参照］に従ってライブラリーを構築しＣ領域遺伝子
をクローニングする方法であり、もう一方は、イヌ細胞
のメッセンジャーRNA（mRNA）を材料として常法［例え
ば、D.M.Glover編集“DNA cloning Vol.I"IRL press（1
985）］によりcDNAを合成してライブラリーを構築しＣ
領域遺伝子をクローニングする方法である。

いずれの場合にしても、イヌ型の抗体蛋白を産生して
いる細胞を材料にしてクローニングすることがクローニ
ング効率の面からも望ましく、特に後者のメッセンジャ
ーRNAからcDNAを合成する方法においては必須の条件と
なる。このような抗体産生細胞を確立する方法として次
に示すようないくつかの方法が考えられる。イヌ×イ
ヌハイブリドーマを作る方法、ある種のウイルス及び
化学薬剤等でイヌリンパ球をトランスフォームさせる方
法、イヌ×マウスヘテロハイブリドーマを作る方法、
イヌ×マウスヘテロハイブリドーマを親株としたイヌ
×（イヌ×マウス）ハイブリドーマを用いる方法、等で
ある。しかしながら、従来技術の説明の欄でも示した通
り、、の方法では現実には非常に難しく、の方法
においてものイヌ×マウスヘテロハイブリドーマが必
要となり、結論的にはのイヌ×マウスヘテロハイブリ
ドーマを得ることが重要な鍵となる。

以下、イヌ×マウスヘテロハイブリドーマの調製法に
ついて詳細に説明する。まず、イヌに免疫を行い、イヌ
抗体の産生に関するリンパ球を活性化する。免疫方法
は、アジュバント免疫のみの非特異免疫、あるいは、イ
ヌジステンパーウイルス粒子（または精製抗原）、イヌ
パルボウイルス粒子（又は精製抗原）、イヌ伝染性肝炎
ウイルス粒子（又は精製抗原）等の特異抗原（アジュバ
ント混合液）を用いた特異免疫のいずれも可能である。
非特異免疫又は特異免疫したイヌより、脾臓、又はリン
パ節を得る。これらの脾臓、又はリンパ節から得られた
各リンパ球を単離し、培養浮遊液とした後、ポークウイ
ードマイトジェン（PWM）のようなリンパ球活性化物質
を加えて活性化する。この時、PWMと共に前記ウイルス
抗原を加えて、特異免疫を増強させることも可能であ
る。このようにして得られたイヌＢリンパ球を回収し、
このリンパ球と親株であるマウス骨髄腫細胞（マウスBA
LB/cに由来するX63−Ag8−6.5.3、P3−X63−Ag8−U1、S
P2/0Ag12等の骨髄腫細胞）とを融合剤を加えて融合し、
イヌ×マウスハイブリドーマを形成させる。融合方法
は、公知の如何なる方法でもよいが融合剤として、ポリ
エチレングリコール等を例示することが出来る。融合し
たハイブリドーマの選択は、例えば、37℃、５％CO₂存
在下でグルタミン添加RPMI1640＋10％牛胎児血清−HAT
（ヒポキサンチン＋アミノプテリン＋チミジン）のよう
なHAT選択培地で達成される。イヌIgG抗体を産生してい
るハイブリドーマは、例えば、抗イヌIgG抗体をコーテ
ィングしたプレートを用いたサンドイッチエンザイムイ
ムノアッセイ（EIA）法、ラジオイムノアッセイ（RIA）
法等により測定して確認できる。また、前記のような特
異抗原に対して特異性を有するイヌIgG抗体（特異イヌI
gG抗体）を産生しているハイブリドーマも、特異抗原を
コーティングしたプレートを用いたEIA法又はRIA法によ
り測定して確認できる。かくして、選別されたイヌIgG
抗体又は特異的イヌIgG抗体産生のイヌ×マウスハイブ
リドーマは、限界希釈法により単一クローン化され、単
一のイヌIgGモノクローナル抗体を産生する単一クロー
ンとして確立される。さらに安定な抗体産生クローンを
確立するためには、早い時期にこのクローニング操作を
数回、繰り返し行うことが必要である。このような方法
により本発明者らは、イヌモノクローナル抗体を産生し
ているイヌ×マウスヘテロハイブリドーマCM−S1,S2お
よびS6の確立に成功した。このようなイヌ×マウスヘテ
ロハイブリドーマの好ましい一例として、出願人は、CM
−S6（微工研菌寄第10076号）細胞を微工研に寄託して
いる。この細胞は、本発明の以下の遺伝子調製に用いる
最も望ましい細胞株として挙げられる。

マウスやヒトの場合、免疫グロブリン遺伝子は抗原と
の結合部位である可変領域（Ｖ領域）遺伝子と補体や特
定の細胞と相互作用等に関与した生理活性をもつ定常領
域（Ｃ領域）遺伝子により形成されていることがよく知
られている。さらに、Ｖ領域遺伝子は、数あるＶ遺伝子
断片群、Ｄ遺伝子断片群（Ｌ鎖ではまだ見つかっていな
い）及びＪ遺伝子断片群の中からそれぞれ１個が選ばれ
この順序で並んで結合することによって形成される。さ
らに、各クラスのＣ領域遺伝子とクラススイッチにより
結合し、発現系の免疫グロブリン遺伝子となる。［利根
川進,Nature,307,p575（1983）；本庶佑,Annual Rev.Im
munol.1,p499（1983）参照］。すなわち、活性型の発現
可能な（mRNAに転写され、さらに蛋白質に翻訳されてい
る）Ｃ領域遺伝子であれば、免疫グロブリン遺伝子の特
徴である遺伝子の再配列を終えているはずである。そこ
で、抗体産生細胞とその親株の染色体DNAを用いて、常
法［例えば、T.Maniatis“Molecular Cloning"Cold Spr
ing Harbor Lab.（1982）参照］に従ってサザンハイブ
リダイゼーションを行い、抗体産生細胞に特異的な免疫
グロブリン遺伝子を同定すれば、Ｃ領域遺伝子を含む免
疫グロブリン遺伝子を決定することが出来る。このよう
にイヌ抗体産生細胞を用いれば、より速く目的の抗体遺
伝子を同定することが出来る。目的の遺伝子を染色体DN
Aから調製した場合には、遺伝子の中にイントロンと呼
ばれる介在配列を含んでいる。

抗体遺伝子を単離するためには、前述の２つのクロー
ニング方法におけるスクリーニングの方法として、主と
して３つの方法が可能である。；イヌ抗体産生細胞の
産生する抗体蛋白を精製し、これを材料にこの蛋白質の
アミノ酸配列を解析し、このアミノ酸配列に相当する核
酸塩基配列を合成して、スクリーニング（ハイブリダイ
ゼーション）のプローブとする方法、；すでに報告さ
れているマウス及びヒトの免疫グロブリン遺伝子の遺伝
子断片、あるいはその核酸塩基配列［例えば、坂野ら、
Nature,286,p676,（1980）;E.E.Maxら、J.Biol.Chem.,2
56,p5116,（1981）;J.W.Ellisonら、Nuc.Acids.Res.,1
0,p4071,（1982）;P.A.Heiterら、Cell,22,p197（198
0）］を参照して合成したDNA等をプローブに用いてクロ
スハイブリダイゼーションによりスクリーニングする方
法、；λgt11等の発現ベクターに組み込まれたイヌ抗
体遺伝子を大腸菌あるいは動物細胞において発現させ、
発現産物をイヌ抗体蛋白に対して作られた抗血清（ある
いはモノクローナル抗体）を用いてスクリーニングする
方法である。cDNAクローニング法ではのいずれの
方法も使用可能であり、染色体DNAクローニング法では
の方法が使用可能である。

このようにしてクローニングされたイヌ免疫グロブリ
ンのＣ領域をコードする遺伝子断片の配列と、他の動物
種の免疫グロブリンのＣ領域遺伝子の配列とを比較し遺
伝子解析を行った結果、イヌ免疫グロブリンＣ領域をコ
ードする本発明の遺伝子断片は、λ鎖に属する遺伝子断
片であることが分かった。免疫グロブリンのλ鎖として
は、すでにヒト［P.A.Hieterら、Nature,294,p536（198
1）;G.F.Hollisら、Nature,296,p321（1982）］及びマ
ウス［B.Blombergら、Natl.Acad.Sci.USA,79,p530（198
2）;J.Millerら、Nature,295,p428（1982）］で発見さ
れ、さらに、他の動物種のλ鎖では、ウサギ［Duvoisi
n,MR.M.ら、J.Immunol.,136、p4297−4302（1986）］、
等が報告されているが、本発明に記載しているイヌλ鎖
及びそれらをコードするアミノ酸配列、核酸塩基配列に
ついては一切その報告例はなく、本発明により初めて開
示されるものである。

このようにして本発明で得られた、イヌ免疫グロブリ
ンλ鎖定常領域をコードするDNA断片の塩基配列を解析
し、該定常領域のアミノ酸配列を見いだし、これをこれ
までに報告されているヒト、マウス、ウサギ等の免疫グ
ロブリンλ鎖定常領域のアミノ酸配列と比較検討したと
ころ、イヌ免疫グロブリンλ鎖定常領域に特異的なアミ
ノ酸配列として、該λ鎖定常領域ポリペプチドのＮ末端
側から最初のシステインのＮ末端側のアミノ酸配列が下
記（Ａ）のアミノ酸配列であることが見いだされた。

本発明者らは、本発明により解析されたイヌの免疫グ
ロブリンλ鎖定常領域のアミノ酸配列、本発明者らが別
途解析したネコの免疫グロブリンλ鎖定常領域のアミノ
酸配列およびこれまでに解析されている種々の動物の免
疫グロブリンλ鎖定常領域のアミノ酸配列を比較するこ
とにより、上記のシステインのＮ末端側に存在する−Gl
y−Ala−の領域は、イヌ、マウス、ヒト等の種の違いに
よっていずれも異なるアミノ酸配列となっている領域で
あることを見いだした。また、同時にこの領域は、例え
ばヒトのλ鎖定常領域のアミノ酸配列としては、サブタ
イプ間で極めてよく保存されていることも見いだし、今
回本発明により明らかにされた上記の配列は、イヌ免疫
グロブリンλ鎖定常領域特有の配列であると推測され
た。尚、本発明においてクローニングされたこの領域の
アミノ酸配列は下記の通りであり、このアミノ酸配列
（Ｂ）がイヌ免疫グロブリンλ鎖定常領域に存在する特
有のアミノ酸配列の好ましい一例として挙げられる。

本発明のイヌ×マウスヘテロハイブリドーマは、上記
（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有するλ鎖Ｃ領域
ペプチドを含むイヌ免疫グロブリンを産生することを特
徴とする。さらに、本発明のイヌ免疫グロブリンλ鎖定
常領域をコードする遺伝子断片においても、上記（Ａ）
または（Ｂ）のアミノ酸配列をコードするDNA配列をそ
の一部に有することを特徴とする。このような上記のλ
鎖に含まれるアミノ酸配列は、イヌ免疫グロブリンλ鎖
のＣ領域を決定する重要なアミノ酸配列と考えられ、本
発明により初めて明らかにされた。また、イヌλ鎖の定
常領域ポリペプチドのＣ末端から２番目のシステインの
Ｎ末端側11個目から９個目のアミノ酸配列においても、
前記と同様に、イヌ、ネコ等の種の違いによりアミノ酸
配列が変化する領域と思われ、本発明のイヌ免疫グロブ
リンλ鎖定常領域では、−Pro−Asp−Lys−をその特有
の配列として有することが見いだされた。このようなイ
ヌ免疫グロブリンλ鎖のＣ領域をコードする遺伝子とし
て、第７図のアミノ酸配列をコードする遺伝子断片がそ
の好ましい一例として挙げられる。また、そのような遺
伝子の具体的核酸塩基配列の一例としては、第６図に示
された塩基配列が挙げられる。このような本発明の遺伝
子断片は、イヌ抗体産生細胞由来のものに限らず、イヌ
肝臓等の細胞等から調製されたものも含む。しかしなが
ら、前述の抗体産生細胞（イヌ×マウスヘテロハイブリ
ドーマ）を用いれば、抗体遺伝子をより迅速に同定する
ことが可能になり、Ｃ領域遺伝子のクローニングをより
容易に行うことが出来る。また、本発明のλ鎖遺伝子を
用いてイヌ染色体DNAとサザンハイブリダイゼーション
を行った結果、本発明のλ鎖以外に、同じイヌλ鎖に属
している他のサブタイプのＣ領域遺伝子がいくつか存在
していることが示された。ヒトとマウスの例［P.A.Hiet
erら、Nature,294,p536（1981）;G.F.Hollisら、Natur
e,296,p321（1982）;B.Blombergら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,79,p530（1982）;J.Millerら、Nature,295,p428
（1982）］からも、イヌλ鎖にもいくつかのサブタイプ
が存在すると思われる。本発明のイヌ免疫グロブリンλ
鎖の定常領域をコードする遺伝子断片は、このようなサ
ブタイプの異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子断片
をも包含するものである。このようなサブタイプの異な
るＣ遺伝子のクローニングは、本発明に開示されている
塩基配列の一部をプローブとして用いて行うことも可能
である。

本発明のイヌ免疫グロブリンλ鎖のＣ領域遺伝子を直
接用いてマウス−イヌキメラ抗体を作製することが出来
るが、さらに本発明の中で開示されている塩基配列の一
部をプローブとして、染色体DNAライブラリィからジェ
ノミックな免疫グロブリンλ鎖Ｃ領域遺伝子をクローニ
ングし、これを用いてキメラ抗体を作製することも出来
る。キメラ抗体の作製方法はすでにマウス−ヒトキメラ
抗体で示された方法［渡辺ら、Cancer Research,47,p99
9−1005,（1987）］に準じて行うことが出来る。すなわ
ち、キメラ抗体遺伝子は、基本的にＶ領域遺伝子とＣ領
域遺伝子の２種類の遺伝子断片を結合させることにより
構築される。さらに、遺伝子の単離法に応じて、主とし
て２つの結合の組合せがある。すなわち、染色体DNAか
ら単離したＶとＣ領域遺伝子、cDNAから単離したＶとＣ
領域遺伝子の組合せである。

例えば、マウス染色体DNAから単離したＶ領域遺伝子
を、イヌ染色体DNAから単離したＣ領域遺伝子と結合さ
せた場合、マウスＶ領域遺伝子には発現に必要なプロモ
ーターやエンハンサー等の発現調節領域を含んでいるこ
とが好ましい。ただし、プロモーターやエンハンサー等
はマウス由来である必要はなく、イヌ由来でもヒト由来
でもウイルス由来でも差しつかえない。また、プロモー
ターはＶ領域の５′上流域に位置し、エンハンサーはＶ
領域遺伝子とＣ領域遺伝子の間に位置するのが好ましい
が、エンハンサーについては必ずしもこの位置に限定さ
れるものではない。一方、マウスcDNAから単離したＶ領
域遺伝子を、イヌcDNAから単離したＣ領域遺伝子と結合
させる場合、その結合部分は適当な制限酵素サイトや、
必要であれば適当な合成リンカーを用いて、Ｖ領域遺伝
子のコードしているアミノ酸配列とＣ領域遺伝子のコー
ドしているアミノ酸配列がずれないよう、またＶ領域ア
ミノ酸配列とＣ領域アミノ酸配列が変化しないよう結合
しなければならない。さらに、動物細胞中で発現を可能
にするための適当なプロモーターやエンハンサー等の発
現調節領域を遺伝子の５′上流域に付加してやる必要が
ある。このようにして作製したキメラ抗体遺伝子を、例
えば、pSV2−gpt［R.C.Mulliganら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,78,p2027（1981）］、pSV2−neo［P.J.Southern
ら、J.Mol.Appl.Genet.,1,p327（1982）］等の選択マー
カーの付いた適当なベクタープラスミドに、あるいは、
宿主細胞内でプラスミド状態で増殖できるウイルス遺伝
子の一部（パピローマウイルスなど）を持ったベクター
プラスミドに、Ｈ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子を別々に、ある
いは同時に組み込み、キメラ抗体遺伝子プラスミドを構
築することが望ましい。マウス−イヌキメラ抗体を得る
ためには、このようにして調製されたキメラ抗体遺伝子
を含むプラスミドを用いて宿主動物細胞を形質転換する
ことが必要である。宿主動物細胞としては、不死化され
たマウス及び他の動物細胞、好ましくはＢリンパ系細胞
株［例えば、P3X63Ag8・653（ATCC CRL 1580）、P3X63A
g8U・１（ATCC CRL 1597）、P3/NS1/1 Ag4−１（ATCC C
RL18）、Sp2/0−Ag12（ATCC CRL 1581）等の形質細胞
腫、ハイブリドーマ］である。DNAによる細胞の形質転
換方法としては、DEAE−デキストラン法、燐酸カルシウ
ム共沈降法、プロトプロスト融合法、エレクトロポーレ
ーション法等の方法［例えば、B.D.Hamesら編集“Trans
cription and Translation“IRL Press（1984）参照］
があり、いずれの方法でもよい。Ｈ鎖とＬ鎖のキメラ抗
体遺伝子を同時に持つプラスミドで形質転換を行う場合
には選択マーカーは１種類でよいが、Ｈ鎖Ｌ鎖別々の場
合には２種類のマーカーが必要である。この場合には、
１つのプラスミドで形質転換を行った後に、さらにもう
一方のプラスミドで形質転換を行う二重形質転換法を用
いるのが好ましい。このようにして形質転換された細胞
を通常のハイブリドーマと同じ適当な条件下（例えば、
10％牛胎児血清を含むRPMI1640培地中）で培養すれば、
この細胞から通常のハイブリドーマの産生する抗体と同
様にキメラ抗体が分泌産生される。このキメラ抗体は通
常の抗体と同様な方法により精製することが出来る。

本発明であるイヌ免疫グロブリンλ鎖Ｃ領域をコード
する遺伝子を用いて、上述のようにして得られるマウス
−イヌキメラ抗体は、イヌの疾病に対して、これまでに
なかった実質的に有効な診断、予防及び治療剤となりう
るものである。さらに、本発明により提供されるイヌ免
疫グロブリンをコードする遺伝子断片は、イヌ免疫グロ
ブリンλ鎖のＣ領域の特異的アミノ酸配列もしくはDNA
配列を開示するものであり、今後、さらに同じλ鎖に属
する他のサブタイプのＣ領域遺伝子を単離することを可
能にするものである。

次に、その実施例を示すが本発明は何等これに限定さ
れるものではない。

実施例 （１）イヌモノクローナル抗体産生細胞の作製 免疫及びイヌリンパ球の調製 まず、完全フロイントアジュバント（CFA:ディフコ社
製）5mlをビーグル犬に皮下及び腹腔内注射して、非特
異免疫を行った。さらに、２〜３週間の間隔で同操作を
数回繰り返して免疫を増強した。このようにして免疫し
たビーグル犬より、最終免疫２〜３週間後に脾臓及びリ
ンパ節を得た。これらの脾臓及びリンパ節を100IUのペ
ニシリン（萬有製薬社製）−ストレプトマイシン（明治
製菓製）を補充したRPMI1640培地（日水製薬社製）中で
よく洗浄し、その後RPMI−1640中で細片に砕き、ピンセ
ットでさらに細かくし、ピペッティングにて細胞浮遊液
とした。次いで、赤血球除去液にて赤血球を除き、数回
の遠心処理後、イヌリンパ球を得た。ビーグル犬一頭の
脾臓からは１〜３×10⁹細胞個、リンパ節からは１〜３
×10⁹細胞個のリンパ球が得られた。さらに、これらの
リンパ球をＬ−グルタミン（フローラボラトリィ社製）
添加RPMI1640＋10％牛胎児血清（ハイクローン社製）の
完全培地に５〜10×10⁵細胞/mlにて懸濁し、2.5μg/ml
量のポークウイードマイトジェン（PWM:ギブコ社製）を
加え、37℃、５％CO₂存在下で、２〜５日間刺激培養し
活性化した。

マウス骨髄腫細胞の調製 本発明に使用した骨髄腫細胞は、すでにケーラーら
が、Nature,256,p495（1975）及びEuv.J.Immunol,6,p29
2（1976）に記載しているマウスBALB/c由来の骨髄腫細
胞系で、特に、亜株のX63−Ag8−6.5.3及びP3−X63−Ag
8−U1,SP2/0Ag12である。これらをグルタミン添加RPMI1
640＋10％牛胎児血清の完全培地にて増殖培養し、融合
直前に回収し、RPMI1640培地で２回洗浄後、同培地に再
混濁し、融合に用いた。

イヌリンパ球とマウス骨髄腫細胞との細胞融合 前記のイヌリンパ球混濁液とマウス骨髄腫細胞混濁液
とを混合し（イヌリンパ球：骨髄腫細胞＝10:1又は5:1
の割合、イヌリンパ球＝１×10⁸又は２×10⁸細胞個）、
1500rpm、５分間遠心分離した細胞ペレットにRPMI1640
で希釈した45％ポリエチレングリコール液（シグマ社製
pH7.6分子量3650、又はセルバ社製pH7.6分子量4000）1m
lを室温にて１分間で加えた。37℃、５〜10分間静置し
た後、40mlのRPMI1640を６分間かけて加え、細胞を静か
に再混濁し、融合を停止した。次いで、細胞を1000rp
m、10分間遠心分離し、上清を吸引除去した後、グルタ
ミン添加RPMI1640＋10％牛胎児血清＋HAT（H:ヒポキサ
ンチン13.0μg/ml、A:アミノプテリン0.18μg/ml、T:チ
ミジン3.87μg/ml全てシグマ社製）にリンパ球濃度とし
て２〜10×10⁵細胞個/mlに再懸濁せしめた。これを96穴
マイクロタイタープレート中に200μ／穴として分注
し、37℃、５％CO₂存在下にて培養した。５〜７日後、
同培地で50％培地交換を行い、さらに、融合後10〜28日
後にかけて、５〜６回の培地交換を繰り返した。かくし
て、ハイブリドーマのみが増殖し、スクリーニングアッ
セイが出来るまで培養を継続した。

ハイブリドーマのスクリーニングアッセイ及びクロー
ニング ハイブリドーマの増殖が充分に進行したことを確認
し、イヌIgG抗体を産生しているクローンを検出するた
め、スクリーニングアッセイを行った。スクリーニング
アッセイは、エンザイムイムノアッセイ（EIA）にて行
った。即ち、ヤギ抗イヌIgG抗体（カッペル社製）をコ
ーティングし、牛アルブミン（シグマ社製）で非特異吸
着を阻止した96穴プレートを作製し、ハイブリドーマ培
養プレートの各穴からの培養上清を50μ加え、37℃、
１〜２時間インキュベートした後、PBS−Ｔ［0.01％Twe
en（片山化学社製）、0.01M Phosphate、pH7.2、0.15M
NaCl］にて４回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗イ
ヌIgG抗体（カッペル社製 10000倍希釈）を50μ添
加、37℃、１時間インキュベートした。その後PBS−Ｔ
にて５回洗浄し、TMBZ基質溶液（TMBZ:同仁化学社製0.4
mg/ml、過酸化水素水：三菱瓦斯化学社製0.006％）を50
μ添加して発色させた。10〜15分後、0.3N H₂SO₄（片
山化学社製）50μを加えて反応を停止し、これらの発
色程度を分光光度計（波長:450）にて測定した。このよ
うにして選別したイヌIgG産生穴中のハイブリドーマを
限界希釈法にて単一クローン化（クローニング）を行っ
た。クローンが96穴プレートの各穴に増殖してきた後
に、イヌIgG産生クローンを検出するために、前記と同
様のエンザイムイムノアッセイ（EIA）を行った。この
クローニング操作を少なくとも３回以上繰り返して、安
定にイヌIgGを産生するイヌ×マウスハイブリドーマク
ローンを得た。さらに、このハイブリドーマクローンを
順次拡張培養し、グルタミン添加RPMI−1640＋HAT＋10
％DMSO（和光純薬）の細胞凍結用培地にて、液体窒素中
に凍結保存した。

確立したハイブリドーマクローン及びその産生するイ
ヌIgGモノクローナル抗体の性状 確立されたイヌ×マウスハイブリドーマは、EIA法に
よるイヌ抗体産生量測定の結果、１年以上の長期にわた
って、イヌIgGモノクローナル抗体を1.0〜3.0μg/mlの
量で安定に産生しており、抗体産生能において何ら異常
が認められないことを確認している。

確立されたイヌ×マウスハイブリドーマが産生するイ
ヌモノクローナル抗体は、免疫沈降法［免疫実験操作法
日本免疫学会編 参照］により、イヌIgGであること
が明らかになった。この抗体はヤギ抗マウスIg抗血清及
びヤギ抗ヒトIg抗血清とは全く沈降物を形成せず、ヤギ
抗イヌIgG抗血清とのみ沈降物を形成することから、該
モノクローナル抗体は、イヌIgG抗体であると判断され
る。さらに、該モノクローナル抗体が完全なイヌ型モノ
クローナル抗体であることを証明するために、免疫沈降
法より感度の高いEIA法を用いて精査した。その結果、
該モノクローナル抗体は、いずれも抗イヌIgG抗体との
み特異的に反対し、抗ヒトIgG抗体及び抗マウスIgG抗体
とは反応しないことにより、イヌIgG抗体であることが
証明された（第１図）。さらに、ウエスタンブロットア
ッセイ法［免疫実験操作法 日本免疫学会編 参照］に
より、該モノクローナル抗体は抗体の重鎖（Ｈ鎖）フラ
グメント、軽鎖（Ｌ鎖）フラグメント共に抗イヌIgG抗
体とのみ特異的に反応し、抗ヒトIgG抗体、抗マウスIgG
抗体とはＨ鎖、Ｌ鎖フラグメント共に全く反応しないこ
と、さらに、該モノクローナル抗体のＨ鎖、Ｌ鎖フラグ
メントは、標準イヌIgG抗体のＨ鎖、Ｌ鎖フラグメント
と分子量的に同一のものであることから、イヌIgG抗体
のＨ鎖、Ｌ鎖フラグメントを有する完全なイヌIgGモノ
クローナル抗体であることが証明された（第２図）。
又、該ハイブリドーマクローンの細胞質内蛍光抗体染色
アッセイ法［免疫実験操作法 日本免疫学会編、参照］
により、細胞質内イヌIgG抗体の合成を調べた結果、い
ずれのクローンも抗イヌIgG抗体でのみ特異的に細胞質
内染色され、他の抗ヒトIgG抗体及び抗マウスIgG抗体で
は染色されないことにより、該ハイブリドーマクローン
は、その細胞質内において完全なイヌIgGモノクローナ
ル抗体を合成していることが証明された。このようなイ
ヌモノクローナル抗体を産生するイヌ×マウスヘテロハ
イブリドーマCM−S6細胞は、微工研条寄第2946号（原寄
託：微工研菌寄第10076号）として本出願人より寄託さ
れている。この細胞を以下に述べる実験に使用した。

（２）cDNAライブラリィの構築 ヘテロハイブリドーマCM−S6細胞から全RNAをグアニ
ジウムチオシアネート法［J.M.Ghingwinら、Biochemist
ry,18,p5294（1979）］により分離し、さらにオリゴdT
カラム（ファルマシア）を用いてポリＡ＋RNAに精製し
た。この精製ポリＡ＋RNAからcDNA合成システムプラス
（アマシャム）を用いてCM−S6細胞のcDNAを合成した。
合成したcDNAのEcoR IサイトをEcoR Iメチレース（宝酒
造：以下本実施例で使用した試薬は、特に断りのない限
り宝酒造製か東洋紡製を使用した）を用いてメチル化し
た後、T4DNAリガーゼを用いてEcoR Iリンカーを付加し
た。さらにこのcDNAを制限酵素EcoR Iで完全消化し、バ
イオゲルA50mカラム（バイオ・ラッド）を用いてEcoR I
リンカーの付加したcDNAを精製した。次にこのcDNAとλ
gt11ベクターDNA（ストラタジーン社）のEcoR Iアーム
とをT4DNAリガーゼにより連結させ、ストラタジーン社
のキットを用いて、in vitroパッケージングを行い、CM
−S6細胞のcDNAライブラリィを得た。

（３）抗イヌIgG抗体によるイヌ免疫グロブリン遺伝子
のスクリーニング 上述のように構築したCM−S6細胞のcDNAライブラリィ
から、１枚のLBプレート［1.5％Bacto−agar（ジフコ社
製）,1％Bacto−tryptone（ジフコ社製）,0.5％Bacto−
yeast extract（ジフコ社製）,0.25％NaCl（和光純
薬）,pH7.5の入った角２号シャーレ（栄研器財社製）］
当たり50000個のλgt11プラークが出来るように大腸菌y
1090にファージを感染させて播き、42℃で３時間培養す
る。その後、10mM IPTG（和光純薬）を染み込ませたニ
トロセルロースフィルター（NCフィルター:S＆Ｓ社製
Code BA85）をかぶせ、さらに37℃で４時間培養を続け
る。その後NCフィルターをプレートからはがし、Ｗバッ
ファー［WB:7mM Tris pH7.2,150mM NaCl,0.005％ Tween
20］で洗い、BLOTTO［５％スキムミルク,10μ/100ml
Antifo amA］に４℃で一晩浸す。次に10μg/ml抗イヌIg
G抗体（カッペル社製）［１％ E.coliライセート（バイ
オラッド社製）で４℃一晩処理］の入ったBLOTTOに交換
し、室温で２時間反応させる。WBで５回洗浄した後、50
00倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギIgG抗体（カッ
ペル社製）［１％E.coliライセート（バイオラッド社
製）で４℃一晩処理］の入ったインキュベーションバッ
ファー［PBS pH7.2,0.005％Tween20,1％BSA］に浸け、
室温で２時間反応させる。WBで５回洗浄した後、５％ H
RP color development reagent（バイオラッド社製）と
0.5％ H₂O₂（和光純薬）を含んだ発色液に浸し、発色さ
せた。NCフィルター上で発色したプラークに対応するフ
ァージを選び、クローニングを重ねた。このようにして
抗イヌIgG抗体と反応するクローンを選択し、最終的にS
6−61を得た。このクローンは約0.7kbのサイズで、後述
する核酸塩基配列分析の結果から、免疫グロブリンλ鎖
に属する遺伝子であると思われた。その制限酵素切断点
地図を第３図に示す。このクローンのEcoR I挿入断片を
ThomasとDavisの方法［M.ThomasとR.W.Davis,J.Mol.Bio
l.,91,p315（1974）参照］によりファージDNAより単離
し、さらにpUC18ベクターのEcoR Iサイトにサブクロー
ニングした。

（４）S6−61を用いたサザンブロット及びノーザンブロ
ット分析 初めにこのS6−61を用いたサザンブロット分析を行っ
た。イヌ肝臓細胞の染色体DNA10μｇを制限酵素EcoR I
で切断し、このDNAを電気泳動で0.7％アガロースゲルに
展開し、ナイロンメンブレンフィルター（ジーンスクリ
ーンプラス、NEN・リサーチ・プロダクト）に転写後、
イヌＣλ鎖領域を含んだ［³²P］標識S6−61プローブと
サザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブ
リダイゼーションの方法はジーンスクリーンプラスに付
属していたマニュアルのプロトコールに従った。分子サ
イズはλファージDNAをHind IIIで切断したマーカーDNA
によって算出した。結果は、第４図に示すように、バン
ドが約２〜20kbまで色々なサイズにわたって検出され
た。このことはイヌＣλ領域遺伝子が１種類のサブタイ
プだけでないことを示唆している。又、Ｃλ領域が１種
類でないことはヒト及びマウスの例［P.A.Hieterら、Na
ture,294,p536（1981）;G.F.Hollisら、Nature,296,p32
1（1982）;B.Blombergら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,
p53（1982）;J.Millerら、Nature,295,p428（1982）］
からも推定できる。さらに野生のマウスではＣλ領域遺
伝子が増幅していることが知られており［C.L.Scott
ら、Nature,300,p757（1982）］このイヌＣλ領域遺伝
子も同様に増幅を受けていることが考えられる。

次にノーザンブロット分析を行った。ハイブリダイゼ
ーションに使用したRNAはイヌ脾臓細胞及びCM−S6細胞
から全RNAをグアニジウムチオシアネート法［J.M.Ghing
winら、Biochemistry,18,p5294（1979）］により分離
し、さらにオリゴdTカラム（ファルマシア）を用いてポ
リＡ＋RNAに精製したものである。このRNA2μｇを電気
泳動により３％ホルムアルデヒドを含む0.75％アガロー
スゲルに展開し、ナイロンメンブレンフィルター（ジー
ンスクリーンプラス）に転写後、［³²P）標識S6−61プ
ローブとノーザンハイブリダイゼーションを行った。ノ
ーザンハイブリダイゼーションの方法はジーンスクリー
ンプラスに付属のマニュアルのプロトコールに従った。
その結果、両方の細胞ともこのプローブにより約1.3kb
の位置にバンドが検出された（第５図）。このサイズは
マウス及びヒトで知られている免疫グロブリンλ鎖遺伝
子のサイズとほぼ同じである。

これら２つの結果より、このS6−61遺伝子は機能的な
イヌＣλ領域を含む活性な遺伝子であることが推定され
た。

（５）S6−61の核酸塩基配列とアミノ酸配列 S6−61の核酸塩基配列を調べるために、S6−61から、
EcoR I−Sac I、Sac I−Acc II、Acc II−EcoR I、EcoR
I−Hha I、Stu I−EcoR Iの各小DNA断片を調製した
（第３図）。これらの各小断片をT4−DNAポリメレース
を用いて切断面を平滑末端に変えた後、M13 mp19ベクタ
ーのSma Iサイトに宝ライゲーションキットを用いて挿
入した。東洋紡インストラクトマニュアルの方法に従
い、JM101のコンピテント細胞を調製し、Ｃλ遺伝子を
挿入したM13mp19 DNAで形質転換させ、一本鎖DNAを抽出
精製した。さらにこの一本鎖DNAの核酸塩基配列決定
は、タカラM13シークエンスキットと富士・ジェンサー
・ゲル・システムを用いて行った。核酸塩基配列を行っ
た方向は第３図に示す。核酸塩基配列決定の結果、VJC
の各領域からなるイヌλ鎖遺伝子が確認された。第６図
にその結果を示す。さらに、この核酸塩基配列を基にア
ミノ酸に変換したところ、この遺伝子がオープンリーデ
ィングフレームをとり、疑似遺伝子でないことが示され
た（第７図）。尚、出願人は、このDNA断片を組み込ん
だベクターにより形質転換された大腸菌Escherichia co
li CCL−S661（微工研菌寄第10941号）を寄託してい
る。

このS6−61の核酸塩基配列をもとに遺伝子解析ソフト
（Genetyx Ver.6;ソフトウエア開発社製）を用いて、L
ASLとEMBLのデータベースをホモロジー検索したとこ
ろ、ヒト免疫グロブリンλ鎖と一番高いホモロジーを示
し、免疫グロブリンλ鎖遺伝子以外の遺伝子とはホモロ
ジーは示さなかった。S6−61遺伝子のＣλ領域とマウス
及びヒトのＣλ領域をホモロジー比較すると、核酸レベ
ルでマウスとは75.2％、ヒトとは84.8％であり、アミノ
酸レベルでマウス73.1％、ヒトとは84.6％であった。

以上の結果より、S6−61遺伝子は間違いなくイヌλ鎖
に属する遺伝子であり、マウス−イヌキメラ抗体作製を
可能にする遺伝子である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明で作成されたイヌ×マウスハイブリド
ーマの産生するIgGが、イヌ型モノクローナル抗体であ
ることを確認した抗イヌ抗体を用いたEIAの結果を示
す。 第２図は、本発明で作成されたイヌ×マウスハイブリド
ーマの産生するIgGが、イヌ型モノクローナル抗体であ
ることを確認した抗イヌ抗体を用いたウエスタンブロッ
トの結果を示す。 第３図は、本発明においてクローニングされたイヌ免疫
グロブリンλ鎖定常領域をコードするDNA断片（S6−6
1）の制限酵素切断地図および塩基配列解析を行った領
域（→）を示す。 第４図は、本発明においてクローニングされたイヌ免疫
グロブリンλ鎖定常領域をコードするDNA断片（S6−6
1）とイヌ肝臓細胞染色体DNA（EcoR I消化）のサザンハ
イブリダイゼーションの模式図である。 第５図は、本発明においてクローニングされたイヌ免疫
グロブリンλ鎖定常領域をコードするDNA断片（S6−6
1）とCM−S6細胞のポリＡ＋RNA（レーン１）またはイヌ
脾臓ポリＡ＋RNA（レーン２）とのノーザンハイブリダ
イゼーションの模式図である。 第６図は、本発明においてクローニングされたDNA断片
（S6−61）中に存在するイヌ免疫グロブリンλ鎖定常領
域をコードするDNA塩基配列を示す。 第７図は、本発明においてクローニングされたDNA断片
（S6−61）中にコードされるイヌ免疫グロブリンλ鎖定
常領域の全アミノ酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】イヌ免疫グロブリンを産生するイヌ×マウ
   スヘテロハイブリドーマ。
2. 【請求項２】該イヌ免疫グロブリンのＬ鎖のクラスがλ
   である前記第（１）項記載のハイブリドーマ。
3. 【請求項３】該λ鎖の定常領域ポリペプチドが、下記の
   （ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチド
   である前記第（２）項記載のハイブリドーマ。 （ａ）下記のアミノ酸配列からなるポリペプチド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
   ミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列か
   らなり、かつイヌ免疫グロブリンλ鎖定常領域の機能を
   有するポリペプチド
4. 【請求項４】イヌ免疫グロブリンを産生するイヌ×マウ
   スヘテロハイブリドーマのポリＡ＋RNAからcDNAを合成
   し、これを発現ベクターに組み込み宿主細胞で発現さ
   せ、抗イヌ免疫グロブリン抗体を用いて形質転換体をス
   クリーニングすることを特徴とするイヌ免疫グロブリン
   遺伝子の調製法。
5. 【請求項５】以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを
   コードするDNA配列を含有する遺伝子断片。 （ａ）下記のアミノ酸配列からなるイヌ免疫グロブリン
   λ鎖の定常領域ポリペプチド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
   ミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列か
   らなり、かつイヌ免疫グロブリンλ鎖定常領域の機能を
   有するポリペプチド。
6. 【請求項６】以下の（ａ）又は（ｂ）のDNA配列を含む
   遺伝子断片。 （ａ）下記の塩基配列からなるDNA。 （ａ）（ａ）の塩基配列からなるDNAに対して相補的なD
   NAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
   つイヌ免疫グロブリンλ鎖定常領域の機能を有するポリ
   ペプチドをコードするDNA。