JPH03123489A - イヌ免疫グロブリンκ鎖の定常領域をコードする遺伝子断片およびマウス×イヌキメラ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １１旦立■且上！ 本発明は、イヌの疾病、特に伝染病の診断、治療及び予
防に期待できる新規なイヌモノクローナル抗体に関する
。さらに詳細にはイヌモノクローナル抗体を構成するイ
ヌ免疫グロブリンに鎖の定常領域をコードする遺伝子断
片およびこれを利用したマウス×イヌキメラ抗体に関す
る。

ｌ肌り１盪 イヌはペットとして昔から人間に１着のある動物である
が、近年の欧米では、　「伴侶、仲間、相棒としての動
物Ｊ　　（Ｃｏａ＋ｐａｎｉｏｎ　５ｐｅｃｉｅｓ）と
称され、人間社会の一員としての地位を獲得しつつある
。

また、警察犬、盲導犬等のように人間社会に必要不可欠
な動物としても貢献している。もう一方では、医学、薬
学、畜産学、獣医学から心理学にいなる実験動物として
の貢献度は従来から大きなものであったが、近年では医
薬品の効果検定や安全性試験にＳＰＦ犬などの呼称のも
とて更に貢献度が高まっている。いずれの場合にも当然
の事として、これらのイヌの疾病、特に伝染病に関する
より確実な知識がますます必要となり、その診断、治療
、予防のための方法が確立される事が要求されている。

イヌのウィルス性疾患は多く、なかでもイヌジステンパ
ーウィルス、イヌバルボウイルス、イヌ伝染性肝炎ウィ
ルス等の疾患は急性で致死率が高い、予防としてのワク
チンは開発されているものの、感染・発症したイヌの治
療法としては、抗生物質、サルファ剤等の二次細菌感染
予防の対症療法しかないこと等、現在の治療法には問題
を残している。従来より治療法として高度免疫血清や血
清由来の免疫グロブリンが使用され有効な実績を残して
きた。しかし、現在では、動物愛護思想の高まりと共に
、イヌ血清原料の入手が困難になりこの治療法は使いた
くとも使用できない状況になっている。従って、従来の
高度免疫血清に代わって感染ウィルスを中和できるモノ
クローナル抗体が出来れば、これらウィルス性疾患の治
療に大きく貢献することが可能である。

従来技術 上記のような高度免疫血清の代替品として、ウィルス中
和活性を有するモノクローナル抗体の使用が考えられる
。モノクローナル抗体作製に関する基本的な技術は、こ
れまでに主としてマウス型モノクローナル抗体において
確立されている。ハイブリドーマ等の細２　／、：産生
ずるモノクローナル抗体は大量にしかも半永久に得られ
、原料不足の問題を解消できうる。しがし、ここにおけ
るモノクローナル抗体は、副作用（マウスモノクローナ
ル抗体をイヌに使用した場合、異種タンパクとしてアナ
フィラキシ−ショックや血清病などのα１作用を起こす
ことが考えられる）をなくす意味がら、従来のマウスモ
ノクローナル抗体ではなくイヌモノクローナル抗体でな
ければならない。

これらのイヌウィルス性疾患の治療薬としてのイヌモノ
クローナル抗体の作製法には次のようなものが考えられ
る。（１）イヌ×イヌハイブリドーマを用いる方法、（
２）ある種のウィルス及び化学薬剤等でトランスフオー
ムさせたイヌリンパ球を用いる方法、（３）イヌ×マウ
スヘテロハイブリドーマを用いる方法、（４）イヌ×マ
ウスヘテロハイプリドーマを親株としたイヌ×（イヌ×
マウス）ハイブリドーマを用いる方法、（５）キメラモ
ノクローナル抗体［抗原と結合する可変（’／）領域は
ウィルス中和活性を有するマウスモノクローナル抗体か
ら、抗原性あるいは免疫原性及び生理活性に関与する定
常（Ｃ）領域はイヌモノクローナル抗体からなる、マウ
ス（Ｖ）−イヌ（Ｃ）キメラモノクローナル抗体］を遺
伝子組換えで作製する方法、等であるが、これらの方法
による成功例は一切報告されていない。

ここで、（１）については融合効率が低いことや適当な
ミエローマ親株がないこと、（２）についてはヒトの場
合のＨＢウィルスに相当する適当なウィルスや適当な化
学薬剤がないこと、さらに、（３）　（４）の方法では
ヒト型モノクローナル抗体作製例から考えて、目的のイ
ヌ型モノクローナル抗体を高効率に得るまでには多くの
困難が予想される（例えば、安定性の問題等）、従って
、（５）のキメラモノクローナル抗体法がより実現性の
高い方法であると考えられる。

このキメラモノクローナル抗体は、可変（Ｖ）領域の原
料となるマウスモノクローナル抗体を産生ずるマウス×
マウスハイブリドーマがらクローニングしたそのＶ遺伝
子と、定常（Ｃ）領域の原料となるイヌモノクローナル
抗体を産生ずるイヌ抗体産生細胞からクローニングした
Ｃ遺伝子とを結合させたマウス（ｖ）−イヌ（Ｃ）キメ
ラ抗体遺伝子を含むプラスミドベクターを、動物細胞（
例えば、マウスミエローマ）宿主中で発現させ、その培
養上清中に得られるものである。ヒトにおいてはすてに
キメラ抗体に関するいくつかの報告が見受けられる（特
開昭６０−１５５１３２号、特開昭６１−４７５００号
）。

このようにイヌキメラ抗体の作製には、目的の抗原と結
合能を持つ抗体分子の可変（■）領域のアミノ酸配列を
コードする遺伝子とイヌ免疫グロブリンの定常（Ｃ）領
域のアミノ酸配列をコードする遺伝子が必要となる。キ
メラ抗体の可変（Ｖ）領域遺伝子は、前述した種々のイ
ヌウィルス等に対して中和活性を有するマウスモノクロ
ーナル抗体を産生ずる細胞から得られるもので、この細
胞は従来のマウス×マウスハイブリドーマ法で比較的容
易に作製することが出来る。しかしながら、キメラ抗体
の定常領域遺伝子となるイヌ免疫グロブリンＣ領域遺伝
子については現在のところ全くその構造が知られておら
ず、遺伝子もクローニングされていない、従って、イヌ
キメラ抗体を作製するためには、イヌ免疫グロブリンの
定常（Ｃ）領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子を見
いだすことが非常に重要な要素となっている。

発旦眩Ｌｌ的 このような状況にあって、本発明者らは、イヌ免疫グロ
ブリンの定常領域をコードしている遺伝子を単離すべく
研究を重ねた結果、これを単離することに成功した。す
なわち、本発明はこれまでに一切報告されていないイヌ
免疫グロブリンに鎖の定常領域をコードする遺伝子を提
供するものであり、これによりイヌキメラ抗体の作製を
可能にするものである０本発明のイヌ免疫グロブリンに
鎖をコードする遺伝子を用いて作られたイヌキメラ抗体
は、イヌの疾病、特に伝染病に対して副作用のない診断
薬、治療−薬・予防薬への応用を可能にするものである
。

免疫グロブリンのに鎖としては、すでにヒト及びマウス
［Ｐ、　Ａ、　Ｈｉｅｔｅｒら、Ｃｅ１１．２２．　ｐ
１９７　（１９８０）；　　Ｈ，５ａｋａｎｏら、　Ｎ
ａｔｕｒｅ　　２８０．　　ｐ２８８−２９４　　（１
９７９）］で発見され、さらに、他の動物種のに鎖では
、ラビット［Ｌ、　Ｅｍｏｒ　ｉｎｅら、Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、ＵＳＡ。

８０、　ｐ５７０９−５７１３　（１９８３）］、等が
報告されている。

しかしながら、本発明の対象となるイヌの免疫グロブリ
ンに鎖の遺伝子については、これまでには何等解析がな
されたという報告はない。

一方、イヌの免疫グロブリンＬ鎖のタイプは、主として
λ鎖であることが判っている［　Ｌ、　Ｈｏｏｄら、Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑ
ｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　３２゜ｐ１３３−１４６　（
１９６７）］、　　このために鎖を発現しているリンパ
球は非常に少ないと考えられ、抗体産生細胞のメツセン
ジャーＲＮＡからｃＤＮＡクローニング法により目的の
遺伝子を得ることは困難であると考えられな、しかしな
がら、遺伝子組換えによりマウスＸイヌキメラ抗体を作
る場合には、Ｌ鎖可変領域の遺伝子として、通常マウス
由来のに鎖の可変領域遺伝子を用いることがら、イヌの
免疫グロブリンＬ鎖のに鎖定常領域の遺伝子を得ること
が必要となる。

本発明者らは、イヌ肝臓細胞の染色体ＤＮＡがち、種々
のプローブ並びに種々のハイブリダイゼーションの条件
を用いて、目的のイヌ免疫グロブリンに鎖定常領域をコ
ードする遺伝子断片を単離すべく研究を重ねたところ、
イヌ免疫グロブリン定常領域をコードすると思われる遺
伝子断片を得ることに成功した。

このようにして単離された遺伝子断片の塩基配列から予
測されるアミノ酸配列と、他の動物種の免疫グロブリン
のＣ領域遺伝子の配列とを比較し遺伝子解析を行った結
果、本発明により得られた遺伝子断片は、に鎖に属する
免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子断片である
ことが判明した。

本発明のイヌ免疫グロブリンに鎖の定常領域をコードす
る遺伝子断片は、１０９個のアミノ酸からなるイヌ免疫
グロブリンに鎖定常領域ペプチドをコ−卜するＤＮＡ配
列であり、定常領域のカルボキシ末端から５個のアミノ
酸配列が、−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｐ
であることがその特徴として挙げられる。すなわち、こ
れまでに報告されているヒトやマウスのに鎖定常領域の
アミノ酸配列では、カルボキシ末端がＣｙｓ　（システ
ィン）となっていることが知られており、本発明で得ら
れたイヌ免疫グロブリンに鎖定常領域遺伝子のように、
カルボキシ末端側に存在するＣｙｓのＣ末端側に、さら
に４つのアミノ酸が続くようなアミノ酸配列からなる定
常領域はこれまでに報告がなく、本発明のイヌ免疫グロ
ブリンに鎖定常領域に特徴的な配列であると言える。

さらに本発明のイヌ免疫グロブリンに鎖定常領域をコー
ドする遺伝子は、下記に示された制限酵素切断地図によ
り示される遺伝子断片を有する。

本発明のイヌ免疫グロブリンに鎖定常領域をコートする
遺伝子のうち、その好ましい一例を示すと、下記に示す
アミノ酸配列をコードする遺伝子断片が挙げられる。

ＡＳｎ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｖ
ａｌ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ＧｌｎＰｒｏ　Ｓｅｒ
　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｈｌｓ　Ｔｈｒ　
Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＡｌａＳｅｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｃｙ
ｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ
　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｌｅ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔ
ｒｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ＧｌｙＶａｌ　Ｉｌｅ
　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｇｌｎ　
Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　ＶａｌＴｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ａｓ
ｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ
　ＬｅｕＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｍ
ｅｔ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　ＴｙｒＬｅｕ
　Ｓｅｒ　ｔ（ｉｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ
　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　ＴｈｒＨｉｓ　Ｌｙｓ　Ｓ
ｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｉ
ｅ　ＬｙＳＳｅｒＰｈｅ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇ
ｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｓｐこのよ
うなアミノ酸配列もしくはこれをコードする核酸塩基配
列については一切その報告例はなく、本発明により初め
て開示されたものである。

尚、本発明のイヌ免疫グロブリンに鎖定常領域をコード
する遺伝子断片は、上記のアミノ酸配列をコードする遺
伝子断片のみに限られず、部分的にアミノ酸が置換され
ているアロタイプの異なる遺伝子をも包含する。このよ
うなアロタイプの異なる遺伝子が存在することは、ヒト
、ラビット等の免疫グロブリンに鎖の遺伝子解析におい
て１ケ所〜数カ所のアミノ酸が異なるペプチドをコード
する遺伝子が存在することが報告されていることからも
予想される。

また、本発明のイヌ免疫グロブリンに鎖のＣ領域をコー
ドする遺伝子の具体的核酸塩基配列の一例としては、第
４図に示された塩基配列が挙げられる。

本発明のイヌ免疫グロブリンに鎖のＣ領域遺伝子を直接
用いてマウス−イヌキメラ抗体を作製することが出来る
が、さらにこれをプローブにイヌ抗体産生細胞のｃＤＮ
Ａライブラリィ−から免疫グロブリンに鎖Ｃ領域ｃＤＮ
Ａをクローニングし、これを用いてキメラ抗体を作製す
ることも出来る。キメラ抗体の作製方法はすでにマウス
−ヒトキメラ抗体で示された方法［液通ら、Ｃａｎｃｅ
ｒ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ、　４７．　ｐ９９９−１００５　
（１９８７）］に準じて行うことが出来る。すなわち、
キメラ抗体遺伝子は、基本的にＶ領域遺伝子とＣ領域遺
伝子の２種類の遺伝子断片を結合させることにより横築
される。さらに、遺伝子の単離法に応じて、主として２
つの結合の組合せがある。すなわち、染色体ＤＮＡから
単離したＶとＣ領域遺伝子、ｃＤＮ＾から単離したＶと
Ｃ領域遺伝子の組合せである。

例えば、マウス染色体ＤＮＡから単離したＶ領域遺伝子
を、イヌ染色体ＤＮＡから単離したＣ領域遺伝子と結合
させた場合、マウスＶ領域遺伝子には発現に必要なプロ
モーターやエンハンサ−等の発現調節領域を含んでいる
ことが好ましい、ただし、プロモーターやエンハンサ−
等はマウス由来である必要はなく、イヌ由来でもヒト由
来でもウィルス由来でも差しつかえない、また、プロモ
ーターはＶ領域の５゛上流域に位置し、エンハンサ−は
■領域遺伝子とＣ領域遺伝子の間に位置するのが好まし
いが、エンハンサ−については必ずしもこの位置に限定
されるものではない、一方、マウスｃＤＮＡから単離し
たＶ領域遺伝子を、イヌｃＤＮＡがら単離したＣ領域遺
伝子と結合させる場合、その結合部分は適当な制限酵素
サイトや、必要であれば適当な合成リンカーを用いて、
■領域遺伝子のコードしているアミノ酸配列とＣ領域遺
伝子のコードしているアミノ酸配列がずれないよう、ま
た■領域アミノ酸配列とＣ領域アミノ酸配列が変化しな
いよう結合しなければならない、さらに、動物細胞中で
発現を可能にするための適当なプロモーターやエンハン
サ−等の発現調節領域を遺伝子の５′上流域に付加して
やる必要がある。このようにして作製したキメラ抗体遺
伝子を、例えば、ｐｓＶ２−ｇｐｔ［Ｒ，Ｃ，１４ｕｌ
ｌ１ｇａｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　　＾ｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、　　ＵＳＡ、　　７８．ｐ２０２７　　（１９８
１）コ、ｐＳｖ２−ｎｅｏ［Ｐ、Ｊ、５ｏｕｔｈｅｒｎ
ら、　Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、。

１、　ｐ３２７　（１９８２）］等の選択マーカーの付
いた適当なベクタープラスミドに、あるいは、宿主細胞
内でプラスミド状態で増殖できるウィルス遺伝子の一部
（パピローマウィルスなど）を持ったベクタープラスミ
ドに、■鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子を別々に、あるいは同時
に組み込み、キメラ抗体遺伝子プラスミドを構築するこ
とが望ましい、マウス−イヌキメラ抗体を得るためには
、このようにして調製されたキメラ抗体遺伝子を含むプ
ラスミドを用いて宿主動物細胞を形質転換することが必
要である。

宿主動物細胞としては、不死化されたマウス及び他の動
物細胞、好ましくはＢリンパ系細胞株［例えば、Ｐ３Ｘ
６３Ａｇ８−６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８０）、
Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５９７）
、Ｐ３／ＮＳＩ／Ｉ　Ａｇ４−１　（ＡＴＣＣＣＲＬ１
８）、５Ｐ２１０−Ａｇ１２　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５
８１）等の形質細胞腫、ハイブリドーマ］である。　　
ＤＮＡによる細胞の形質転換方法としては、ＤＥＡＥ−
デキストラン法、燐酸カルシウム共沈降法、プロドブロ
スト融合法、エレクトロポレーション法等の方法［例え
ば、Ｂ、　Ｄ、ｌｌａｍｅｓらＭ４集＋Ｔｒａｎｓｃｒ
ｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”ｌＲ
Ｌ　Ｐｒｅｓｓ（１９８４）参照］があり、いずれの方
法でもよい、　ＨＭとＬ鎖のキメラ抗体遺伝子を同時に
持つプラスミドで形質転換を行う場合には選択マーカー
は１種類でよいが、Ｈ鎖り鎖別々の場合には２種類のマ
ーカーが必要である。この場合には、１つのプラスミド
で形質転換を行った後に、さらにもう一方のプラスミド
で形質転換を行う二重形質転換法を用いるのが好ましい
、このようにして形質転換された細胞を通常のハイブリ
ドーマと同じ適当な条件下（例えば、１０％牛脂児血清
を含むＲＰＭ１１６４０培地中）で培養すれば、この細
胞から通常のハイブリドーマの産生ずる抗体と同様にマ
ウス−イヌキメラ抗体が分泌産生される。このキメラ抗
体は通常の抗体と同様な方法により精製することが出来
る。

本発明により提供されるイヌ免疫グロブリンをコードす
る遺伝子断片は、イヌ免疫グロブリンに鎖のＣ領域の特
異的アミノ酸配列もしくはＤＮＡ配列を開示するもので
あり、この遺伝子を用いて、上述のようにして得られる
マウス−イヌキメラ抗体は、イヌの疾病に対して、これ
までになかった実質的に有効な診断、予防及び治療剤と
なりうるものである。

次に、その実施例を示すが本発明はこれに限定されるも
のではない。

イヌに鎖遺伝子をクロスハイブリダイゼーション法によ
りクローニングするために、ヒトに鎖とのクロスハイブ
リダイゼーションの条件を検討した。ここで使用したヒ
トＣに領域を含んだ遺伝子は、ヒト培養細胞ＡＲＨ７７
株［ＡＴＣＣＣＲＬ　１６２１コよりクローニングされ
たものであり、乳用大学・生体防御医学研究所・渡邊武
教授より分与されたものである［１藤ら、Ｇｅｎｅ、　
３３．　ｐ１８１　（１９８５）；画材ら、Ｃａｎｅｅ
ｒ　Ｒｅｓ、、　４７．　ｐ９９９　（１９８７）参照
］、このヒトＣに遺伝子より、Ｃにエクソンを含むＥｃ
ｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を切り出し、プローブとして使
用した。

イヌ肝臓細胞より、Ｎ、　Ｂ１１ｎとり、　　Ｗ、　　
５ｔａｆｆｏｒｄの方法［Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒ
ｅｓ、、　３．　ｐ２３０３　（１９７６）］に従って
染色体ＤＮＡを単離し、各染色体ＤＮＡｌ０μ９を制限
酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造製；以下本実施例で使用した試
薬は、特に断りのない限り宝酒造あるいは東洋紡製を使
用した）で切断する。制限酵素切断ＤＮＡを電気泳動で
０．７％アガロースゲルに展開し、ニトロセルロースメ
ンブレンフィルター（Ｓ＆Ｓ社製：　ＢＡ　８５）に転
写後、ヒトＣに領域を含んだ［３２Ｐ］標識ＤＮＡプロ
ーブとサザンハイプリダイゼーションを行った。サザン
ハイプリダイゼーションの条件は、６ｘＳＳＣ［０，０
９Ｍ　ＮａｔＣａｌｌｓＯ７＋　２Ｈ２０，０゜９ＭＮ
ａＣ］］、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ［同位化学］、０．５％
ＳＤＳ　［バイオ・ラッド］の溶液中で６５℃−晩行っ
た。フィルターの最終的な洗浄条件は、０．１ｘＳＳＣ
１０，１％ＳＤＳの溶液中で４５℃、１５分間行った。

このフィルターをオートラジオグラフィーにかけた結果
は、第１図に示すように約５ｋｂの単一バンドを形成し
た。分子のサイズはλフアージＤＮＡを旧ｎｄｍで切断
したマーカーＤＮＡによって算出した。この５ｋｂのＤ
ＮＡ断片にはイヌに鎖遺伝子が含まれていると思われた
ので、これをクローニングするターゲットとした。

に イヌ肝臓の染色体ＤＮＡ１００μｑをＥｃｏＲＩで完全
消化した後、この５ｋｂに相当するＤＮＡ断片をしよ糖
密度勾配遠心［しよ糖１０−４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）、
２６０００ｒｐｍ、１８時間、１５℃］により調製した
０次にこのＤＮＡ断片とλｇｔｌ　１ベクターＤＮＡ　
（ストラタジーン社）のＥｃｏＲＩアームとをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼにより連結させ、ストラタジーン社のキット
を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングを行い、イ
ヌ肝臓細胞のに鎖遺伝子ライブラリィを得た。このライ
ブラリィから、ヒトＣにプローブを用いて前述のクロス
ハイブリダイゼーションと同じ条件でプラークハイブリ
ダイゼーション［Ｗ、Ｄ、Ｂｅｎｔｏｎ、　Ｒ，Ｗ、Ｄ
ａｖｉｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９６．　ｐ１８０（
１９７７）］を行い、イヌＣに鎖エクソンを含むクロー
ンＤＥに５ａを選択した。このクローンの制限酵素切断
点地図を第３図に示す、このクローンのＥｃｏＲＩ挿入
断片をＴｈｏａ＋ａｓと１）ａｖｉｓの方法［Ｍ、　Ｔ
ｈｏｍａｓ、　Ｒ。

Ｗ、　Ｄａｖｉｓ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　
９１．　ｐ３１５　（１９７４）参照］によりファージ
ＤＮＡより単離し、さらにｐＵｃ１８ベクターのＨｃｏ
ＲＩサイトにサブクローニングした。

ＤＢ／ｃａ　　　いｔ゛　　　　　　−口折 初めにこのＤＥに５ａを用いたサザンプロット分析を行
った。イヌ肝臓細胞の染色体ＤＮＡｌ０μ９を制限酵素
ＥｃｏＲＩで切断し、このＤＮＡを電気泳動で０．７％
アガロースゲルに展開し、ナイロンメンブレンフィルタ
ー（シーンスクリーンプラス、ＨＥＮ・リサーチプロダ
クト）に転写後、イヌＣ／１−鎖領域を含んだ［１２ｐ
］標識ＤＥに５ａプローブとサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行った。サザンハイプリダイゼーションの方法は
シーンスクリーンプラスに付属していたマニュアルのプ
ロトコールに従った。検出されたバンドのパターンを、
以前行ったヒトＣに鎖プローブを用いたクロスハイブリ
ダイゼーションのパターンと比較した結果、全く同じ位
置（約５ｋｂ＞にバンドがみとめられた０分子サイズは
λフアージＤＮＡを旧ｎｄｍで切断したマーカーＤＮＡ
によって算出した。

この結果より、イヌＣに領域遺伝子は、他にサブタイプ
をもたない１種類の遺伝子であることが推定された。こ
れはヒト及びマウスの例［Ｐ、　Ａ、　Ｈ４ｅｔｅｒら
、　Ｃｅ１１．　２２．　　ｐ１９７　　（１９８９）
；　　Ｅ、Ｅ、Ｍａｘら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７６、
　ｐ３４５０　（１９７９）コからも示唆されている。

次にノーザンプロット分析を行った。ハイブリダイゼー
ションに使用したＲＮＡはイヌｌｆｆ１ｌｉ細胞から全
ＲＮＡをグアニジウムチオシアネート法［Ｊ１４゜Ｇｈ
ｉｎｇｖｉｎら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　１
８．ｐ５２９４　　（１９７９）］により分離し、さら
にオリゴｄＴカラム（ファルマシア）を用いてポリＡ＋
ＲＮＡに精製したものである。このＲＮＡ２μ９を電気
泳動により３％ホルムアルデヒドを含む０．７５％アガ
ロースゲルに展開し、ナイロンメンブレンフィルター（
シーンスクリーンプラス）に転写後、［３２ｐ］標１Ｄ
ＥＫ５ａプローブとノーザンハイブリダイゼーションを
行った。ノーザンハイブリダイゼーションの方法はシー
ンスクリーンプラスに付属のマニュアルのプロトコール
に従った。このプローブにより約１．３ｋｂの位置にバ
ンドが検出された（第２図）、このサイズはマウス及び
ヒトで知られている免疫グロブリンに鎖遺伝子のサイズ
とほぼ同じである。

これら２つの結果より、このＤＢに５ａは機能的なイヌ
Ｃに領域を含む活性な遺伝子であることが推定された。

４　ＤＥにａ　　　　　　　　≧ノ イヌＣに領域の核酸塩基配列を調べるために、クローン
Ｄｌｌｉに５ａよりＣに領域を含む約２．ＯｋｂのＤＮ
Ａ断片（Ｐｓｌ断片）を単離し、ｐＵｃ１８ベクターの
ｐｓｔｌサイトに再クローニングした。このプラスミド
を常法［例えば、Ｔ、Ｍ、ｘｎｉａｔｉｓ　−Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、　　（１９８２）参照］に従
って大量に調製し、さらにこのＰｓｔ　Ｉ断片からＰｓ
ｔｌ−ｔ（ａｅｍ、Ｈａｅｍ　−Ｒｓａｌ、　　Ｒｓａ
ｌ−Ｒｓａｌ、Ｒｓａｌ−Ｈａｅｍの各小ＤＮＡ断片を
調製した。これらの各小断片をＴ４−ＤＮＡポリメレー
スを用いて切断面を平滑末端に変えた後、Ｍ１３ｍｐ１
９ベクターのＳｍａ　Ｉサイトに宝ライゲーションキッ
トを用いて挿入した。東洋紡インストラクトマニュアル
の方法に従い、ＪＭＩＯＩのコンピテント細胞を調製し
、Ｃに領域遺伝子を挿入したＭ１３ｍｐ１９ＤＮ＾で形
質転換させ、−重鎖ＤＮＡを抽出精製した。さらにこの
−重鎖ＤＮＡの核酸塩基配列決定は、タカラＭ１３シー
クエンシングキットと富士・ジェンサー・ゲル・システ
ムを用いて行った。核酸塩基配列決定を行った方向は第
３図に示す、核酸塩基配列決定の結果、１つのエクソン
からなるＣに遺伝子が確認された。第４図にその結果を
示す、さらに、この核酸塩基配列を基にアミノ酸に変換
したところ、この遺伝子がオープンリーディングフレー
ムをとり、疑似遺伝子でないことが示されたく第５図）
。

このＤＥに５ａの核酸塩基配列を基に遺伝子解析ソフト
（Ｇｅｎｅｔｙｘ：ソフトウェア開発社製）を用いて、
ＬＡＳＬとＥＭＢＬのデータベースをホモロジー検索し
たところ、ヒト及びマウスの免疫グロブリンに鎖と高い
ホモロジーを示し、免疫グロブリンに鎖遺伝子以外の遺
伝子とはホモロジーは示さなかった。

ＤＢに５ａ３ｆｔ伝子のＣに領域とマウス及びヒトのＣ
に領域をホモロジー比較すると、核酸レベルでマウスと
は７０．０％、ヒトとは７０．１％であり、アミノ酸レ
ベルでマウスとは５９．０％、ヒトとは５９．６％であ
った。

以上の結果より、ＤＢＫ５ａ遺伝子は間違いなくイヌに
鎖に属する遺伝子であり、マウス−イヌキメラ抗体の作
製を可能にする遺伝子であると思われた。尚、本発明者
らは、このような本発明のイヌ免疫グロブリンに鎖の定
常領域をコードする遺伝子断片ＤＥに５ａが組み込まれ
ているベクターを有する大腸菌を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ　ＣＣＸ−ＤＥＫ５Ａとして微工研菌寄
第１０９８６号として寄託している。

抗ＣＰＶ抗体産生ハイブリドーマＪＰ２（γ１．に）よ
り染色体ＤＮＡを単離し、染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　１００μ
ｇを制限酵素旧ｎｄＩ［［で切断する０次にこのＤＮＡ
断片とλＬ４７ベクターＤＮＡ　（ストラタジーン）を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結させ、ＪＰ２細胞の染色
体ＤＮＡライブラリィを得た。このライブラリィから、
プラークハイブリダイゼーション法［Ｗ、　Ｄ、　Ｂｅ
ｎｔｏｎ、Ｒ，Ｗ、　Ｄａｖｉｓ、　　５ｃｉｅｎｃｅ
、　１９６．　　（ｐ１８０　（１９７７）参照コによ
りマウスＪにプローブを用いて抗ＣＰ■抗体の■に領域
遺伝子を含むクローンＪＰ２ｇＬ４１１を選択した。

第６図はその制限酵素切断点地図である。この遺伝子断
片より■にエクソン部分を含んだＢａｍｌｌｌＨｉｎｄ
ｍ断片を調製し、以下のイヌ−マウスキメラ抗体り鎖遺
伝子の材料とした。

（４）で得られたプラスミドＰＤＨに５ａＰｓｔを旧ｎ
ｄｌＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、ネコ免疫グロブリン
Ｃに鎖遺伝子を含む２ｋｂの旧ｎｄＩＩＩ　−ＥｃｏＲ
Ｉ　ＤＮＡ断片を調製した。

一方、（５）で得られたマウス免疫グロブリンＶに鎖遺
伝子を含むプラスミドｐＪＰ２ｇＬ４１１をＢａｎ旧及
び旧ｎｄ■で切断し、４゜４ｋｂのマウス免疫グロブリ
ンＶに−Ｊに領域遺伝子を得た。これらの遺伝子を、Ｅ
ｃｏＲＩ及びＢａ＋ｕ旧で切断したｐｓＶｌ−ｎｅｏベ
クター［Ｐ、　Ｊ、　５ｏｕｔｈｅｒｎら、　Ｊ、Ｍｏ
１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、、　　ｌ、　　ｐ３２７　
　（１９８２）コ　ともに宝ライゲーションキットを用
いて連結し、プラスミドｐｓＶ２−ＰＬＤＣにを得た０
次に、ヒトγ鎖のエンハンサ−領域を含む１．　Ｏｋｂ
のＥｃｏＲＩ−Ｅｃｏ旧ＤＮＡ断片　［Ｔ、１１．Ｒａ
ｂｂｉｔｓら、　Ｎａｔｕｒｅ　　３０６．　　ｐ８０
６　　（１９８３）］の両端をＴ４−ＤＮＡポリメラー
ゼを用いて平滑末端に変え、宝ライゲーションキットを
用いてこの両端にＢａａ旧リンカ−（宝社製）を連結し
、両端がＢａａ旧サイトに変更されたヒトγ鎖エンハン
サ−領域遺伝子を得た。この遺伝子を前述のプラスミド
ｐＳＶ２−ＰＬＤＣｐｃのＢａｍ旧サイトに挿入しプラ
スミドｐｓＶ２−ＥＰＬＤＣにを作製した。（第７図）

【図面の簡単な説明】

第１図は、イヌ肝臓細胞の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで切断し、これをヒトＣに鎖領域を含んだ［１２
ｐ］標識プローブとサザンハイプリダイゼーションを行
った結果の模式図である。 第２図は、イヌ肺臓細胞から抽出したポリＡ＋ＲＮＡと
［３２ｐ］標ｍＤＥに５ａプローブとのノーザンハイブ
リダイゼーションの模式図である。 第３図は、本発明においてクローニングされたイヌ免疫
グロブリンに鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片（ＤＥ
に５ａ）の制限酵素切断地図および塩基配列解析を行っ
た領域（→）を示す。 第４図は、本発明でクローニングされたＤＮＡ断片ＤＥ
に５ａに存在するイヌ免疫グロブリンに鎖定常領域をコ
ードするＤＮＡ塩基配列を示す。 第５図は、本発明においてクローニングされたＤＮＡ断
片ＤＥに５ａ中にコードされるイヌ免疫グロブリンに鎖
定常領域の全アミノ酸配列を示す。 第６図は、実施例（５）で調製した抗ＣＰＶ抗体のＶに
領域遺伝子を含むクローンＪＰ２ｇＬ４１１の制限酵素
切断点地図を示す。 第７図は、実施例（６）で構築した抗ＣＰｖマウス×イ
ヌキメラ抗体り鎖を発現する遺伝子（ｐＳ■２−ＩＥＰ
ＬＤＣに）の構築図を示す。 図面の浄書 第 図 図面の浄書 第 図 第３ 図 第 図 マウスＬ鎖可賢領域遺伝子 イヌＬｍ定常領域遺伝子 第７図

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）イヌ免疫グロブリンに鎖の定常領域をコードする
   ＤＮＡ配列を有する遺伝子断片
2. （２）該定常領域が１０９個のアミノ酸からなるペプチ
   ドであり、カルボキシ末端側５個のアミノ酸配列が、−
   Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｐである前記第
   （１）項記載の遺伝子断片。
3. （３）該ＤＮＡ配列が下記の制限酵素切断地図で示され
   る制限酵素切断パターンを有するものである前記第（１
   ）項記載の遺伝子断片。 ▲数式、化学式、表等があります▼
4. （４）該定常領域が下記のアミノ酸配列からなる前記第
   （２）項記載の遺伝子断片。 【遺伝子配列があります】
5. （５）該ＤＮＡ配列が下記の塩基配列である前記第（３
   ）項記載の遺伝子断片。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】
6. （６）マウス免疫グロブリンＬ鎖の可変領域をコードす
   る遺伝子断片の３′側にイヌ免疫グロブリンκ鎖の定常
   領域をコードする遺伝子断片を接続したことを特徴とす
   るマウス×イヌキメラ抗体Ｌ鎖をコードする組換えＤＮ
   Ａ分子。
7. （７）該定常領域が１０９個のアミノ酸からなるペプチ
   ドであり、カルボキシ末端側５個のアミノ酸配列が、−
   Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｐである前記第
   （６）項記載の組換えＤＮＡ分子。
8. （８）該定常領域をコードする遺伝子断片が下記の制限
   酵素切断地図で示される制限酵素切断パターンを有する
   ものである前記第（６）項記載の組換えＤＮＡ分子。 ▲数式、化学式、表等があります▼
9. （９）該イヌ免疫グロブリンκ鎖の定常領域が下記のア
   ミノ酸配列からなる前記第（７）項の組換えＤＮＡ分子
   。 【遺伝子配列があります】
10. （１０）イヌ免疫グロブリンに鎖の定常領域をコードす
    る遺伝子断片が下記の塩基配列からなる前記第（８）項
    記載の組換えＤＮＡ分子。 【遺伝子配列があります】
11. （１１）マウス免疫グロブリンＬ鎖の可変領域をコード
    する遺伝子断片の３′側にイヌ免疫グロブリンκ鎖の定
    常領域をコードする遺伝子断片を接続したことを特徴と
    するマウス×イヌキメラ抗体Ｌ鎖をコードする組換えＤ
    ＮＡ分子が組み込まれた培養細胞用発現ベクターによっ
    て形質転換された細胞により発現されたマウス×イヌキ
    メラ抗体Ｌ鎖ペプチド。
12. （１２）該定常領域が１０９個のアミノ酸からなるペプ
    チドであり、カルボキシ末端側５個のアミノ酸配列が、
    −Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｐである前記
    第（１１）項記載のマウス×イヌキメラ抗体Ｌ鎖ペプチ
    ド。
13. （１３）該定常領域をコードする遺伝子断片が下記の制
    限酵素切断パターンのＤＮＡ配列を有する前記第（１１
    ）項記載のマウス×イヌキメラ抗体Ｌ鎖ペプチド。 ▲数式、化学式、表等があります▼
14. （１４）該定常領域が下記のアミノ酸配列であることを
    特徴とする前記第（１２）項記載のマウス×イヌキメラ
    抗体Ｌ鎖ペプチド。 【遺伝子配列があります】