CN111909268A - 低免疫原性低ADCC/CDC功能抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060及其应用 - Google Patents

低免疫原性低ADCC/CDC功能抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及低免疫原性低ADCC/CDC功能抗TNF‑α人源化单克隆抗体TCX060及其应用。本发明提供抗TNF‑α人源化单克隆抗体TCX060，为将赛妥珠单克隆抗体经如下改造得到：(1)去除PEG修饰；(2)改造为人IgG1亚型全长抗体；(3)在CDR3和CH2区之间插入柔性氨基酸片段。TCX060与人TNF‑α结合的亲和力与赛妥珠相近，可特异性地阻断TNF‑α与细胞表面TNF受体结合，其ADCC/CDC功能与PEG化赛妥珠单克隆抗体相近，但免疫原性显著低于赛妥珠单克隆抗体，在去除ADCC/CDC功能的同时减少抗体在体内产生免疫原性的风险，具有优异的应用价值。

Description

低免疫原性低ADCC/CDC功能抗TNF-α人源化单克隆抗体 TCX060及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及低免疫原性低ADCC/CDC功能抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060及其应用。
背景技术
肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种由免疫细胞分泌、在炎症和免疫应答中自然分泌的细胞因子。研究显示，TNF-α在多种慢性疾病(如克罗恩氏病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎等)的患者体内含量有上调的趋势(例如，在类风湿性关节炎(RA)患者的滑膜液中，TNF-α水平升高)，并在病理性炎症和关节破坏等过程中发挥重要作用。人TNF-α分子量为17kDa，在体内可以单体或三聚体形式存在，其活性形式为三聚体。TNF-α通过与细胞表面受体p55和p75相互作用以发挥生物活性功能。目前，一般采用单克隆IgG抗体或者可溶性的TNF-α受体中和体内的TNF-α。
目前市售的以TNF-α为靶点的单克隆抗体主要包括依那西普、英孚利昔、阿达木和赛妥珠等，其中依那西普是由两条人TNF-α受体(p75)偶联到Fc端的融合蛋白；英孚利昔是人源化的TNF-α鼠单克隆抗体，阿达木单克隆抗体是人源化的TNF-α抗体。利用放射性标记的TNF-α进行结合能力测定，结果表明：英孚利昔能够结合单体(无活性)及三聚体(有活性)类型的可溶TNF-α；依那西普更倾向于结合有活性的聚体形式的TNF-α及TNF-β，而阿达木单克隆抗体则只结合TNF-α，而不结合TNF-β。
由Celltech UCB公司研发的赛妥珠(Certolizumab)是一种人源化单克隆抗体，可特异性地与TNF-α结合并阻断其与细胞表面TNF受体p55和p75的相互作用。但Certolizumab单克隆抗体在宿主体内的免疫原性较强，高达23％以上的患者使用该单克隆抗体会发生免疫反应。免疫反应可能引起免疫复合物介导的抗体或片段从循环中清除，并导致反复投药不适用于治疗，从而降低患者的治疗效益且限制抗体的再投予。同时，原研赛妥珠需要与免疫抑制剂连用，使得其产生副作用的风险大大增高。然而，目前尚没有关于低免疫原性TNF-α的抗体的报道。因此，亟需开发具有较高亲和力和特异性且具有较低的ADCC/CDC功能和免疫原性的TNF-α的抗体。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供低多聚体、低免疫原性、低ADCC/CDC功能的抗TNF-α人源化单克隆抗体、其制备方法及其应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明通过利用商业化的DNAStarTM软件对赛妥珠单克隆抗体的氨基酸序列进行分析，结果发现未经PEG修饰的赛妥珠单克隆抗体的氨基酸原始序列的免疫原性很低，但是，经PEG化的赛妥珠单克隆抗体可能导致多聚体的产生，进而导致免疫原性提高，即PEG化虽然降低了ADCC/CDC功能，但是却导致免疫原性的问题。在上述分析的基础上，本发明在赛妥珠单克隆抗体序列的基础上改造单克隆抗体序列，以获得在维持赛妥珠较高的TNF-α结合亲和力和特异性的同时，降低其多聚体产生和免疫原性以及ADCC/CDC功能，具体改造包括：
首先，为降低赛妥珠单克隆抗体的多聚体和免疫原性，去除赛妥珠单克隆抗体的PEG修饰，然而，去除PEG修饰的抗体的ADCC/CDC功能提高；
进一步地，基于抗体诱导ADCC/CDC的作用机理，将赛妥珠单克隆抗体改造为人IgG1全长抗体。在此基础上，利用Pymol等蛋白结构分析软件对抗体结构进行分析，在抗体可变区与恒定区之间寻找相对柔性的区域进行柔性氨基酸的插入改造；最终通过在抗体的重链CDR3区和CH2区之间插入一段柔性氨基酸片段，切断抗体可变区在结合抗原后产生的机械应力传递，使抗体的重链恒定区与Fc受体和/或补体结合位点无法充分暴露，从而弱化抗体与NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等表达IgG Fc受体的杀伤细胞或补体结合，进而使得抗体无法诱导或降低诱导ADCC和CDC的信号。
本发明的第一个目的是提供一种抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060，其为将Certolizumab单克隆抗体经如下改造得到：
(1)去除PEG修饰；
(2)通过添加经改造的人IgG1亚型抗体的重链恒定区改造为人IgG1亚型全长抗体；
(3)在得到的人IgG1亚型全长抗体的重链CDR3和CH2区之间插入柔性氨基酸片段；
所述Certolizumab单克隆抗体的轻链全长序列和重链可变区序列分别如SEQ IDNO.1所示和SEQ ID NO.2所示；
所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060具有结合人TNF-α并阻断人TNF-α与TNF受体结合的功能。
上述步骤(3)中，在得到的人IgG1亚型全长抗体的CDR3和CH2区之间插入柔性氨基酸片段，可以阻断抗体可变区同恒定区之间的应力传递，使得抗体的Fc受体和/或补体结合位点无法充分暴露，进而有效降低抗体的ADCC/CDC效应。
为能够更好地阻断抗体可变区在结合抗原后产生的机械应力传递，作为优选，所述柔性氨基酸片段的插入位置为如SEQ ID NO.3所示序列的第237位与第238位氨基酸之间。所述柔性氨基酸片段含有一个或多个甘氨酸或丝氨酸。
进一步优选地，所述柔性氨基酸片段的序列为GGGS、GGSGGS或GSGSGS。
作为本发明的一种优选实施方式，所述柔性氨基酸片段的插入位置为如SEQ IDNO.3所示序列的第237位与第238位氨基酸之间；所述柔性氨基酸片段的序列为GGGS。
本发明对基于上述改造得到的抗TNF-α人源化单克隆抗体的重链进行大量筛选，获得了在免疫原性和ADCC/CDC功能方面性能最优的抗TNF-α人源化单克隆抗体的重链，其全长序列如SEQ ID NO.4所示或为如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能多肽的氨基酸序列。
本发明中，上述“经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的蛋白的氨基酸序列”是指在一个或多个氨基酸残基处不同于所示的序列但保留所得到的分子的生物学活性的序列，其可为具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的重链全长的“保守修饰的变体”或经“保守的氨基酸取代”改造得到的，“保守修饰的变体”或经“保守的氨基酸取代”是指本领域技术人员已知的氨基酸取代，进行这种取代通常不改变所得到的分子的生物学活性。一般而言，本领域技术人员公认在多肽非必需区的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性。示例性取代优选依照表1所示的取代进行：
表1示例性保守氨基酸取代表
原残基 保守取代
Ala(A) Gly,Ser
Arg(R) Lys,His
Asn(N) Gln,His
Asp(D) Glu,Asn
Cys(C) Ser,Ala
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp,Gln
Gly(G) Ala
His(H) Asn,Gln
Ile(I) Leu,Val
Lys(K) Arg,His
Met(M) Leu,Ile,Tyr
Phe(F) Tyr,Met,Leu
Pro(P) Ala
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr,Phe
Tyr(Y) Trp,Phe
Val(V) Ile,Leu
上述序列如SEQ ID NO.4所示的重链可以与经过改造或未经改造的Certolizumab单克隆抗体的轻链组合，有效降低未经PEG化的Certolizumab单克隆抗体的ADCC/CDC功能，同时具有较低的免疫原性。
通过对具备上述轻链和重链全长序列的单克隆抗体进行筛选，本发明得到1个最优的轻链和重链全长组合构成的人TNF-α单克隆抗体TCX060，其重链全长氨基酸序列如SEQID NO.4所示，轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该单克隆抗体保留了Certolizumab抗体的抗原结合位点，与Certolizumab抗体具有相近的表达量，并且与人TNF-α结合的亲和力与Certolizumab抗体相近，可特异性地阻断TNF-α与细胞表面TNF受体p55和p75的结合；其ADCC/CDC功能与PEG化的Certolizumab抗体相近，但与Certolizumab抗体相比，该单克隆抗体具有更低的免疫原性。
本发明的第二个目的在于提供编码所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060的基因。
编码抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060的基因包括任何编码本发明提供的抗TNF-α人源化单克隆抗体的重链或轻链的核酸；根据密码子的简并性，其可以为根据任何宿主密码子偏好性进行密码子优化获得的编码所述轻链和重链全长氨基酸序列的核酸。
作为优选，上述基因中，编码重链全长的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码轻链全长的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第三个目的在于提供包含编码所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060的基因的生物材料。
所述生物材料包括表达盒、载体、宿主细胞、工程菌或细胞系。
本发明的第四个目的在于提供所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060的制备方法，其通过表达所述编码重链全长和轻链全长的基因实现。
作为本发明的一种实施方式，所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060的制备方法包括如下步骤：
(1)合成所述抗TNF-α人源化单克隆抗体的重链全长基因和轻链全长基因；
(2)将上述合成基因连接至表达载体；
(3)将连接有上述抗TNF-α人源化单克隆抗体的重链全长基因和轻链全长基因的表达载体转化至宿主细胞；
(4)筛选获得稳定表达所述抗TNF-α人源化单克隆抗体的宿主细胞，培养所述宿主细胞，表达抗TNF-α人源化单克隆抗体；
(5)提取纯化获得抗TNF-α人源化单克隆抗体。
本发明的第五个目的在于提供所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060或编码所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060基因或含有所述基因的生物材料在制备以人TNF-α为靶标的药物中的应用。
优选地，所述以人TNF-α为靶标的药物为预防或治疗肿瘤、炎症或自身免疫性疾病的药物。
所述的疾病包括但不限于克罗恩病、类风湿关节炎、银屑病关节炎、活动性强直性脊柱炎等。
本发明的第六个目的在于提供所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060或编码所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060基因或含有所述基因的生物材料在制备人TNF-α检测试剂中的应用。
本发明的第七个目的在于提供包含所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060的药物或检测试剂。
所述包含所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060的药物还可以包含其它药学领域允许的有效成分或辅料。
本发明的有益效果在于：
本发明在赛妥珠单克隆抗体的基础上通过人工改造获得抗TNF-α人源化单克隆抗体，本发明提供的人源化抗TNF-α单克隆抗体与赛妥珠单克隆抗体具有相同的TNF-α抗原结合位点，但其抗体构象以及免疫原性等性质与赛妥珠不同。本发明提供的人源化抗TNF-α单克隆抗体TCX060保留了赛妥珠单克隆抗体的抗原亲和力和特异性，且其诱导ADCC/CDC功能与PEG化的赛妥珠单克隆抗体相近，但其免疫原性显著低于赛妥珠单克隆抗体；同时，本发明提供的人源化抗TNF-α单克隆抗体的生产工艺更加简化。更低的免疫原性将降低人体内由抗体免疫原性引起的免疫反应导致的药物副作用风险，同时，免疫原性的降低一方面延长了由本发明提供的人源化抗TNF-α单克隆抗体制备的抗体药的体内半衰期，更大程度地避免了抗体药ADA引起的药效降低；一方面可减少抗体药用量从而降低治疗成本；另一方面可摆脱抗TNF-α单克隆抗体药与免疫抑制剂联合给药的模式，实现抗TNF-α单克隆抗体药单独给药的效果，去除与免疫抑制剂联用所带来的副作用，提高用药安全性。本发明提供的人源化抗TNF-α单克隆抗体TCX060具有极大的应用潜力和价值，有望成为理想的生物靶向治疗抗体。
附图说明
图1为本发明实施例2中赛妥珠单克隆抗体编码基因及本发明提供的H2L0单克隆抗体编码基因的表达载体双酶切鉴定电泳结果图，其中，a为赛妥珠单克隆抗体的轻链L0质粒Hind III和EcoRⅠ双酶切结果，泳道从左到右分别为：酶切前质粒、酶切后质粒及DNAmarker；b为本发明提供的单克隆抗体TCX060的重链H2质粒Hind III和EcoRⅠ双酶切结果，泳道从左到右分别为：酶切前质粒、酶切后质粒及DNA marker。
图2为本发明实施例4中单克隆抗体TCX060的SDS-PAGE电泳图，泳道从左到右依次为：表达上清、Marker、纯化抗体。
图3为本发明实施例5中单克隆抗体TCX060的亲和力EC50；其中H2L0代表TCX060。
图4为本发明实施例5中单克隆抗体TCX060的TNF-α介导的细胞杀伤实验结果；其中，Adalimumab代表阿达木原研药，Certolizumab代表赛妥珠原研药，H2L0代表本发明抗体TCX060 H2L0。
图5为本发明实施例6中单克隆抗体TCX060的小鼠ADA评价结果；其中，Certolizumab Day 0、Certolizumab Day 7、Certolizumab Day 14分别代表赛妥珠原研药免疫前，免疫后第7，第14天血清样本，H2L0 Day 0、H2L0 Day 7、H2L0 Day 14分别代表本发明抗体药物TCX060 H2L0免疫前，免疫后第7，第14天血清样本。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1低ADCC/CDC功能的降低免疫原性的Certolizumab单克隆抗体的分析及设计
本发明通过利用商业化的DNAStarTM软件对赛妥珠单克隆抗体的原始序列进行分析评价，分析结果显示，原研赛妥珠单克隆抗体序列的免疫原性很低。由此推测，在原研赛妥珠单克隆抗体进行为去除ADCC/CDC功能而进行的PEG化后，使得抗体的多聚体增加，进而导致了药物的ADA高达23％。因此，需要对原研赛妥珠单克隆抗体进行去除PEG化修饰，同时降低其ADCC/CDC功能。原始赛妥珠的轻链全长和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
首先对原研赛妥珠单克隆抗体去除PEG修饰，并进行人IgG1亚型全抗体改造，在此基础上，通过在改造获得的人IgG1亚型全抗体的可变区与恒定区之间寻找相对柔性的区域，通过在柔性区域插入柔性氨基酸序列，切断抗体可变区结合抗原后产生的机械应力传递，使得抗体重链恒定区与Fc受体和/或补体结合位点不能充分暴露出来，降低抗体与NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等表达IgG Fc受体的杀伤细胞结合或和补体的结合，使得抗体无法诱导或减弱诱导ADCC和CDC的信号。通过Pymol软件分析确定在上述赛妥珠人IgG1亚型全抗体的重链CDR3与CH2区之间插入一段柔性氨基酸序列可以更好地阻断抗体结合抗原后抗体可变区及恒定区间的应力传递，在降低ADCC/CDC功能的同时不会显著增加抗体多聚体的形成。通过大量的序列分析、结构模拟预测，确定了重链序列如SEQ ID NO.3所示的赛妥珠人IgG1亚型全抗体，并确定通过在如SEQ ID NO.3所示序列的第237位与第238位氨基酸之间插入柔性氨基酸序列GGGS，得到改造后的人IgG1亚型全抗体的重链H2，其序列如SEQID NO.4所示；通过对不同的轻链和重链组合得到的单克隆抗体的综合性能进行初步评价，最终得到由轻链L0(赛妥珠原始轻链序列，SEQ ID NO.1)和重链H2(SEQ ID NO.4)组成的抗TNF-α人源化单克隆抗体H2L0。将该单克隆抗体命名为TCX060。
实施例2抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060的表达载体的构建
根据实施例1得到的抗TNF-α全人源化单克隆抗体H2L0的重链和轻链全长的氨基酸序列以及宿主的密码子偏好性，设计编码重链H2和轻链L0的核苷酸序列(其中L0的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)，设计轻链序列两侧的酶切位点为Hind III+EcoR I，设计重链序列两侧的酶切位点为Hind III+EcoR I，将携带酶切位点的重链全长和轻链全长序列送交金唯智公司合成全基因序列，合成所用的连接载体为pUC57。以pEE12.4(用于重链表达)及pEE6.4(用于轻链表达)为表达载体，将上述表达载体与合成的基因序列分别进行相应的双酶切，将酶切得到的目的基因和表达载体分别进行琼脂糖凝胶电泳分离，随后切下目的条带并用Qiagen Gel Extraction Kit回收，按T4 DNA酶连接体系，16℃过夜连接，然后转化大肠杆菌DH5α，对得到的转化子进行PCR鉴定和质粒提取、序列测定，得到分别携带重链H2和轻链L0全长基因的表达载体。以原研赛妥珠作为对照，构建携带原研赛妥珠重链H0(序列如SEQ ID NO.2所示)的pEE12.4表达载体，构建方法与重链H2的表达载体相同。
携带上述重链和轻链全长基因的表达载体的双酶切鉴定电泳结果如图1所示。
实施例3抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060的瞬时表达
将实施例2获得的分别携带重链H2、H0和轻链L0的全长基因的表达载体的大肠杆菌DH5α菌株进行培养，收获培养物，用Qiagen UltraPure质粒DNA纯化试剂盒抽提纯化携带重链和轻链全长基因的表达载体。将上述纯化的质粒DNA采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒转染293F细胞，转染方法参照试剂盒说明书。
将转染获得的阳性细胞进行抗体的表达，重链轻链组合为H2L0的单克隆抗体TCX060的表达量如表2所示。
表2单克隆抗体TCX060的表达量检测结果(mg/L)
Figure BDA0002471993610000101
对上述表达获得的抗体H2L0进行预包TNF-α实验，将单克隆抗体H2L0加入预包有TNF-α的96孔板中，采用ELISA间接法，初步评价分泌抗体结合TNF-α的活性。检测结果如表3所示。NC为以抗体稀释液作为阴性对照。
表3单克隆抗体TCX060的活性评价结果
赛妥珠原研药 H2L0
EC50(M) 9.374e-011 2.464e-011
表3结果显示，H2L0组合所对应的单克隆抗体TCX060得到了表达，表3结果表明，单克隆抗体TCX060可识别TNF-α。
实施例4抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060的表达与纯化
根据实施例3的检测结果，将重链轻链组合H2L0的单克隆抗体TCX060的表达载体进行稳定转染。
采用瞬时转染方法转染293F细胞，使用珠海恺瑞公司的293培养基及转染试剂，于转染后第七天收集细胞培养上清
将单克隆抗体TCX060(H2L0组合)及原研赛妥珠单克隆抗体(H0L0)的培养上清直接分离，并利用GE公司的MabSelect Sure LX进行纯化，实验过程详见UCB公司说明书，纯化后产品利用紫外分光光度计进行定量检测，计算公式如下：
浓度计算：将收集的洗脱峰读OD280后，计算浓度。抗体浓度＝OD280/1.4。
抗体纯化后进行SDS-PAGE电泳验证，结果如图2所示，电泳结果表明，纯化抗体的纯度超过80％以上，且条带相对单一，浓度相当，可进行后期的实验。
实施例5抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060的生物活性测定1、亲和力评价
本实施例利用ELISA间接法测抗体EC50评价抗体亲和力。
实验方法如下：用PBS将TNF-α(购自近岸科技有限公司)稀释抗原到1μg/ml；将稀释好的抗原按100μl/孔加到96孔板中，加盖，4℃过夜；甩去孔内液体，用PBS洗三次，200ul/孔，拍干；用5％牛乳-PBS 200μl/孔封闭1h，每15min轻拍；甩去孔内液体，用PBS洗一次，200μl/孔，拍干；分梯度加入纯化抗体(0-10μg/ml)，抗体名称见表4，5％牛乳-PBS稀释，100μl/孔，孵育1h，每15min轻拍；甩去孔内液体，用PBS洗三次，200μl/孔，拍干；加二抗，5％牛乳-PBS稀释，100μl/孔，孵育1h，每15min轻拍；预热TMB底物于室温，同时开启酶标仪预热；PBS洗5次，250μl/well，前三次5min，后两次10min，拍干；TMB底物A、B各加50μl/孔，室温显色20min；使用扫描仪将图片扫描记录，加入终止液50μl/孔，使用酶标仪读取OD450。实验数据见表4和图3。
表4单克隆抗体TCX060的EC50检测结果
Figure BDA0002471993610000111
以上结果表明：单克隆抗体TCX060对人TNF-α的亲和力较原研赛妥珠对人TNF-α的亲和力略高。
2、细胞毒作用实验
利用CCK-8试剂盒对小鼠成纤维细胞株L929进行细胞凋亡的检测。
具体操作步骤如下：
在96孔板中加入100μl三倍梯度稀释的单克隆抗体(RPMI-1640培养基含10％FBS稀释)(单克隆抗体TCX060的加入浓度依照FDA中提及的关于赛妥珠的该实验的IC50分别设置上下3-5个梯度浓度)，随后加入50μl终浓度为500pg/ml的rhTNF-α(RPMI-1640培养基含10％FBS稀释)，室温孵育30min。向每孔加入50μl L929细胞5×104/孔,包含终浓度为1μg/ml的放线菌素-D。37℃培养箱孵育过夜培养(18-24h)。对照包括阴性对照和阳性对照，阴性对照只加入RPMI-1640及细胞，阳性对照只加入rhTNFα及细胞，rhTNFα浓度从2ng/ml到8.2pg/ml梯度。向每孔加入20μL CCK8溶液(注意不要在孔中生成气泡，以免影响OD值的读数)。将培养板在37℃培养箱内孵育1-4h。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1％w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
计算抗体在不同浓度下的细胞杀伤率和IC50。
计算公式：(单克隆抗体TCX060处理细胞-TNF-α处理细胞)/TNF-α处理细胞×100％。
实验结果见图4。IC50数据如表5所示，TCX060(H2L0)的IC50与阿达木原研药相当，TCX060(H2L0)的IC50与赛妥珠相比更低。
表5单克隆抗体TCX060的IC50检测结果
TA001(阿达木原研药) Q002(赛妥珠) TCX060 H2L0
IC50(M) 1.478e-008 1.305e-006 ～4.249e-008
实施例6抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060的免疫原性评价
在小鼠体内进行抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060的免疫实验，分析TCX060的免疫原性，具体如下：
1)基础免疫：将TCX060(H2L0)和赛妥珠原研药与福氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，每只Balb/c小鼠每次注射量为70μg。
2)加强免疫：加强免疫采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。
上述实验完成后进行ELISA检测试验，实验方法如下：用PBS将TCX060(H2L0)或赛妥珠原研药稀释到1μg/ml；将稀释好的抗原按100μl/孔加到96孔板中，加盖，4℃过夜；甩去孔内液体，用PBS洗三次，200ul/孔，拍干；用5％牛乳-PBS 200μl/孔封闭1h，每15min轻拍；甩去孔内液体，用PBS洗一次，200μl/孔，拍干；分梯度加入免疫后不同天不同稀释比例的血清样本(1:500/1:1000/1:5000/1:10000/1:50000)，5％牛乳-PBS稀释，100μl/孔，孵育1h，每15min轻拍；甩去孔内液体，用PBS洗三次，200μl/孔，拍干；加二抗，5％牛乳-PBS稀释，100μl/孔，孵育1h，每15min轻拍；预热TMB底物于室温，同时开启酶标仪预热；PBS洗5次，250μl/well，前三次5min，后两次10min，拍干；TMB底物A、B各加50μl/孔，室温显色20min；使用扫描仪将图片扫描记录，加入终止液50μl/孔，使用酶标仪读取OD450。
结果见图5，结果表明，本发明的抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060H2L0同赛妥珠单抗相比，血清中的抗体滴度显著降低，因此H2L0相比于赛妥珠单抗，其免疫原性得到了有效的降低。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京天成新脉生物技术有限公司
<120> 低免疫原性低ADCC/CDC功能抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060及其应用
<130> KHP181119096.6
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 2
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Ala Ala
225
<210> 3
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
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305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
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Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 4
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
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340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
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Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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Ser Pro Gly Lys
450
<210> 5
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaggtgcagc tggtcgagtc cggcggagga ctggtccaac ccggtggatc tttaagactg 60
tcttgtgccg cctccggcta cgtcttcacc gactacggaa tgaactgggt gagacaagct 120
cccggtaagg gtttagagtg gatgggctgg atcaacacct atatcggcga gcccatctac 180
gctgactccg tgaagggtcg tttcaccttt tctttagata ccagcaagag caccgcctac 240
ctccagatga actctttaag ggctgaggat acagccgtgt actattgcgc cagaggctac 300
agaagctacg ccatggacta ttggggacaa ggtacactgg ttaccgtgag ctccgcctcc 360
accaaaggtc cctccgtgtt tcctctggcc cccagctcca aaagcacaag cggcggaacc 420
gccgctctgg gatgtctcgt gaaggactat tttcccgagc ccgtgaccgt tagctggaac 480
tccggagctt taacatccgg cgtgcatacc tttcccgctg tgctccagtc cagcggttta 540
tactctttat cctccgtggt gaccgtcccc tccagctctt taggcaccca gacctacatc 600
tgtaatgtga accacaagcc ttccaacacc aaggtggaca agaaagtgga gcccaaaagc 660
tgcgataaaa cccacacttg tcccccttgc cccgctcccg aactgctggg aggaggagga 720
tccggcccct ctgtgttttt attccctcct aaacccaagg acactttaat gatctctcgt 780
acacccgagg tcacatgtgt cgtcgtggac gtgtcccatg aagaccccga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggagt cgaggtgcac aacgccaaaa ccaagcctcg tgaggagcag 900
tacaactcca cctatcgtgt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccaaga ttggctgaac 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaat aaggctttac ccgcccccat cgaaaagacc 1020
atctccaaag ccaagggcca gcccagagag ccccaagttt atactttacc cccctctcgt 1080
gaggagatga ccaagaatca agtttcttta acttgtctgg tcaagggctt ctatccctcc 1140
gacatcgctg tcgagtggga gagcaacggc cagcccgaga ataactataa gaccaccccc 1200
cccgttctgg acagcgacgg ttcttttttt ttatactcca agctgaccgt ggacaagtcc 1260
agatggcagc aaggtaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggcttt acacaaccac 1320
tacacccaaa agagcctctc tttaagcccc ggtaaa 1356
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<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gacatccaga tgacccagag ccctagctct ttaagcgcca gcgtgggcga tagggtgacc 60
attacttgta aggccagcca gaacgtggga accaatgtgg cttggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaaggcttt aatctacagc gctagctttt tatacagcgg cgtgccctac 180
agatttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttactttaa ccatcagctc tttacagccc 240
gaggacttcg ccacctatta ctgccagcag tacaacatct accccctcac cttcggccaa 300
ggtacaaagg tggagatcaa gaggaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gtttactgaa caacttctac 420
cctagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgctt tacagagcgg caatagccaa 480
gaaagcgtga ccgagcaaga ttccaaggac agcacctact ctttatccag cactttaaca 540
ctcagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgctt gtgaggtgac ccaccaaggt 600
ttaagctccc ccgtgacaaa gagcttcaat aggggcgagt gc 642

Claims (10)

1.一种抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060，其特征在于，其为将Certolizumab单克隆抗体经如下改造得到：
(1)去除PEG修饰；
(2)通过添加经改造的人IgG1亚型抗体的重链恒定区改造为人IgG1亚型全长抗体；
(3)在得到的人IgG1亚型全长抗体的重链CDR3和CH2区之间插入柔性氨基酸片段；
所述Certolizumab单克隆抗体的轻链全长序列和重链可变区序列分别如SEQ ID NO.1所示和SEQ ID NO.2所示；
所述抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060具有结合人TNF-α并阻断人TNF-α与TNF受体结合的功能。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体TCX060，其特征在于，所述柔性氨基酸片段的插入位置为如SEQ ID NO.3所示序列的第237位与第238位氨基酸之间；所述柔性氨基酸片段含有一个或多个甘氨酸和丝氨酸。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体TCX060，其特征在于，所述柔性氨基酸片段的序列为选自GGGS、GGSGGS、GSGSGS中的一种。
4.根据权利要求1～3任一项所述的单克隆抗体TCX060，其特征在于，所述单克隆抗体TCX060的重链全长序列如SEQ ID NO.4所示或为如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能多肽的氨基酸序列。
5.编码权利要求1～4任一项所述单克隆抗体TCX060的基因。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于，编码重链全长的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，编码轻链全长的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
7.包含权利要求5或6所述基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括表达盒、载体、宿主细胞、工程菌或细胞系。
8.权利要求1～4任一项所述单克隆抗体TCX060或权利要求5或6所述基因或权利要求7所述生物材料在制备以人TNF-α为靶标的药物中的应用；
优选地，所述以人TNF-α为靶标的药物为预防或治疗肿瘤、炎症或自身免疫性疾病的药物。
9.权利要求1～4任一项所述单克隆抗体TCX060或权利要求5或6所述基因或权利要求7所述生物材料在制备人TNF-α检测试剂中的应用。
10.包含权利要求1～4任一项所述单克隆抗体TCX060的药物或检测试剂。
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