JP7300008B2 - 低免疫原性かつ低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能の抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０およびその使用 - Google Patents

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本願は、２０１９年５月７日に出願された中国特許出願第２０１９１０３７６２２３．０号の優先権を主張し、その開示内容全体を援用により本願に組み込む。

本発明は、バイオテクノロジー分野に関するものであり、特に、低免疫原性かつ低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能の抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０およびその使用に関するものである。

腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）は、免疫細胞から分泌され、炎症と免疫応答で自然に分泌されるサイトカインである。研究によると、ＴＮＦ－αはさまざまな慢性疾患（例えば、クローン病、多発性硬化症、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎など）の患者の体内で、含有量が高くなる傾向があり（たとえば、関節リウマチ（ＲＡ）患者の滑液において、ＴＮＦ－αのレベルが上昇する）、病理学的炎症と関節破壊などの過程で重要な役割を果たすものである。ヒトＴＮＦ－αの分子量は１７ｋＤａであり、単量体または三量体として体内に存在し、その活性型は三量体である。ＴＮＦ－αは、細胞表面の受容体ｐ５５およびｐ７５と相互作用することによりその生物学的活性を発揮する。現在、モノクローナルＩｇＧ抗体または可溶性ＴＮＦ－α受容体を用いて、体内のＴＮＦ－αを中和するのが一般的である。

現在市販されているＴＮＦ－αを標的とするモノクローナル抗体には、主にエタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、およびセルトリズマブが含まれ、そのうち、エタネルセプトは２本のヒトＴＮＦ－α受容体（ｐ７５）がＦｃ末端に結合してなる融合蛋白質であり、インフリキシマブはヒト化ＴＮＦ－αマウスモノクローナル抗体であり、アダリムマブはヒト化ＴＮＦ－α抗体である。放射性標識されたＴＮＦ－αを利用して結合能を測定した結果、インフリキシマブは単量体（活性なし）タイプおよび三量体（活性あり）タイプの可溶性ＴＮＦ－αと結合でき、エタネルセプトは活性のある多量体形式のＴＮＦ－αおよびＴＮＦ－βと結合する傾向があり、アダリムマブはＴＮＦ－αにのみ結合し、ＴＮＦ－βに結合しない。

Ｃｅｌｌｔｅｃｈ ＵＣＢ社によって開発されたセルトリズマブ（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ）は、ＴＮＦ－αに特異的に結合し、ＴＮＦ－αと細胞表面のＴＮＦ受容体ｐ５５およびｐ７５との相互作用を遮断するヒト化モノクローナル抗体である。ただし、Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂモノクローナル抗体の宿主体内での免疫原性が高く、当該モノクローナル抗体を使用する場合、免疫反応を引き起こす患者は２３％にも達している。免疫反応により、免疫複合体が媒介する抗体またはフラグメントが循環から排除され、繰り返し投与する必要が生じ、治療に適さなくなり、これによって患者の治療効果が低下し、抗体の再投与が制限される可能性がある。同時に、セルトリズマブの先発医薬品は免疫抑制剤と併用する必要があり、これにより副作用のリスクが大幅に高まる。しかし、今までのところ、免疫原性の低いＴＮＦ－α抗体に関する報告はない。したがって、比較的高い親和性と特異性を有し、かつ、比較的低いＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能と免疫原性を備えるＴＮＦ－α抗体を開発することが強く求められている。

従来技術に存在する課題を解決するために、本発明は、低多量体、低免疫原性、および低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能の抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体、その調製方法およびその使用を提供することを目的とする。

上記の目的を実現するための本発明の技術案は下記の通りである。

本発明は、セルトリズマブモノクローナル抗体のアミノ酸配列を、商業化されたＤＮＡＳｔａｒＴＭソフトウェアで分析したところ、ＰＥＧ修飾されていないセルトリズマブモノクローナル抗体のアミノ酸配列の免疫原性が非常に低い一方で、ＰＥＧ化されたセルトリズマブモノクローナル抗体が多量体の産生を引き起こす恐れがあり、それにより免疫原性が向上すること、つまり、ＰＥＧ化によってＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能が低下するが、免疫性の問題が生じることを見出した。上記の分析に基づいて、本発明は、セルトリズマブの比較的高いＴＮＦ－αとの結合親和性および特異性を維持するとともに、その多量体の産生、免疫原性およびＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低下させるために、セルトリズマブモノクローナル抗体の配列に基づいて、モノクローナル抗体の配列を改変した。具体的な改変は、下記のことを含む。

まず、セルトリズマブモノクローナル抗体の多量体と免疫原性を低下させるために、セルトリズマブモノクローナル抗体のＰＥＧ修飾を除去する。しかしながら、ＰＥＧ修飾が除去された抗体は、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能が向上する。

さらに、抗体がＡＤＣＣ／ＣＤＣを媒介する作用機序に基づいて、セルトリズマブモノクローナル抗体をヒトＩｇＧ１全長抗体に改変する。これに基づいて、Ｐｙｍｏｌなどのタンパク質構造分析ソフトウェアで抗体の構造を分析し、抗体の可変領域と定常領域との間で、比較的柔軟な領域を探し、柔軟なアミノ酸の挿入による改変を行う。最後に、抗体の重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に柔軟なアミノ酸フラグメントを挿入することで、抗体の可変領域が抗原と結合した後に生じるメカニカルストレスの伝達を遮断し、抗体の重鎖の定常領域と、Ｆｃ受容体および／または補体との結合部位を十分に露出させず、それによって、抗体と、ＮＫ細胞、マクロファージおよび好中球などのＩｇＧ Ｆｃ受容体を発現するキラー細胞との結合、または補体との結合を弱め、抗体がＡＤＣＣ、ＣＤＣを誘導できないようにするか、もしくはＡＤＣＣ、ＣＤＣを誘導するシグナルを低減させる。

本発明の第１の目的は、Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂモノクローナル抗体を下記のように改変することによって得られる抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０であって、前記Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂモノクローナル抗体の軽鎖の全長配列および重鎖の可変領域の配列がそれぞれ、配列番号１および配列番号２が示すとおりであり、ヒトＴＮＦ－αに結合し、ヒトＴＮＦ－αとＴＮＦ受容体との結合を遮断する機能を有する、抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０を提供することである。
（１）ＰＥＧ修飾を除去する。
（２）改変されたヒトＩｇＧ１サブタイプの抗体の重鎖の定常領域を追加することにより、ヒトＩｇＧ１サブタイプの全長抗体に改変する。
（３）得られたヒトＩｇＧ１サブタイプの全長抗体の重鎖ＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に柔軟なアミノ酸フラグメントを挿入する。

上記のステップ（３）では、得られたヒトＩｇＧ１サブタイプの全長抗体のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に柔軟なアミノ酸フラグメントを挿入すると、抗体の可変領域と定常領域との間のストレスの伝達を遮断し、抗体のＦｃ受容体および／または補体との結合部位を十分に露出させず、抗体のＡＤＣＣ／ＣＤＣ効果を効果的に低下させることができる。

抗体の可変領域が抗原と結合した後に生じるメカニカルストレスの伝達をよりよく遮断するために、好ましくは、前記柔軟なアミノ酸フラグメントの挿入位置は、配列番号３が示す配列の２３７番目のアミノ酸と２３８番目のアミノ酸との間である。前記柔軟なアミノ酸フラグメントは、グリシンまたはセリンを１つまたは複数含む。

さらに好ましくは、前記柔軟なアミノ酸フラグメントの配列は、ＧＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳまたはＧＳＧＳＧＳである。

本発明の好ましい実施形態として、前記柔軟なアミノ酸フラグメントの挿入位置は、配列番号３が示す配列の２３７番目のアミノ酸と２３８番目のアミノ酸との間であり、前記柔軟なアミノ酸フラグメントの配列はＧＧＧＳである。

本発明では、上記の改変に基づいて得られた抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体の重鎖に対して多数のスクリーニングを行うことで、免疫原性およびＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能における性能が最も優れる抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体の重鎖を得ており、その全長配列は配列番号４が示すとおりであるか、または、配列番号４が示すアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入により得られる同じ機能を有するポリペプチドのアミノ酸配列である。

本発明において、上記「１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入により得られる同じ機能を有するタンパク質のアミノ酸配列」とは、１つまたは複数のアミノ酸残基が、示されている配列と異なるが、得られる分子の生物学的活性が保持された配列を意味し、配列番号４が示すアミノ酸配列の重鎖の全長を有する「保存的に修飾された変異体」、または「保存的アミノ酸置換」により改変されたものであってもよく、「保存的に修飾された変異体」または「保存的アミノ酸置換」は、当業者にとって既知のアミノ酸置換を指し、このような置換を行う場合、通常、得られる分子の生物学的活性は変化しない。一般的に言えば、当業者は、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないことを認識している。例示的な置換は、好ましくは、表１に示される置換に従って実施する。

上記配列、例えば、配列番号４が示す配列の重鎖は、改変または非改変のＣｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂモノクローナル抗体の軽鎖と組み合わせることができ、ＰＥＧ化されていないＣｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂモノクローナル抗体のＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を効果的に低下させるとともに、比較的低い免疫原性を有する。

上記の軽鎖および重鎖の全長配列を有するモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、本発明は、最も優れる軽鎖および重鎖の全長の組み合わせから構成されるヒトＴＮＦ－αモノクローナル抗体ＴＣＸ０６０を得ており、その重鎖の全長アミノ酸配列は配列番号４が示すとおりであり、軽鎖の全長アミノ酸配列は配列番号１が示すとおりであり、当該モノクローナル抗体は、Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ抗体の抗原との結合部位を保留しており、Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ抗体と近い発現量を有し、また、ヒトＴＮＦ－αとの結合親和性がＣｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ抗体と近似しており、ＴＮＦ－αと細胞表面のＴＮＦ受容体ｐ５５およびｐ７５との結合を特異的に遮断できる。そのＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能はＰＥＧ化されたＣｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ抗体と近似しているが、Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ抗体と比較して、当該モノクローナル抗体はより低い免疫原性を有する。

本発明の第２の目的は、抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０をコードする遺伝子を提供することである。

抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０をコードする遺伝子は、本発明で提供される抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体の重鎖または軽鎖をコードする任意の核酸を含み、コドンの縮退によれば、任意の宿主のコドンバイアスに従ってコドン最適化を行うことにより得られた、前記軽鎖および重鎖の全長アミノ酸配列をコードする核酸であってもよい。

好ましくは、前述の遺伝子において、重鎖の全長をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５が示すとおりであり、軽鎖の全長をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６が示すとおりである。

本発明の第３の目的は、前記抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０をコードする遺伝子を含む生物学的材料を提供することである。

前記生物学的材料は、発現カセット、ベクター、宿主細胞、人工細菌または細胞株を含む。

本発明の第４の目的は、前記重鎖の全長および軽鎖の全長をコードする遺伝子を発現することにより実現される、前記抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０の調製方法を提供することである。

本発明の一実施形態として、前記抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０の調製方法は、以下のステップを含む。
（１）前記抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体の重鎖の全長遺伝子と軽鎖の全長遺伝子を合成する。
（２）上記の合成遺伝子を発現ベクターに接続する。
（３）上記の抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体の重鎖の全長遺伝子および軽鎖の全長遺伝子が接続された発現ベクターを形質転換法により宿主細胞に導入する。
（４）前記抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体を安定して発現する宿主細胞をスクリーニングし、前記宿主細胞を培養して、抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体を発現させる。
（５）抽出および精製して、抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体を得る。

本発明の第５の目的は、ヒトＴＮＦ－αを標的とする医薬品の調製における、前記抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０、前記抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０をコードする遺伝子、または前記遺伝子を含む生物学的材料の使用を提供する。

好ましくは、前記ヒトＴＮＦ－αを標的とする医薬品は、腫瘍、炎症または自己免疫疾患を予防または治療するための医薬品である。

前記疾患は、クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎、活動性強直性脊椎炎などを含むが、これらに限定されない。

本発明の第６の目的は、ヒトＴＮＦ-α検出試薬の調製における、前記抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０、前記抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０をコードする遺伝子、または前記遺伝子を含む生物学的材料の使用を提供することである。

本発明の第７の目的は、前記抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０を含む医薬品または検出試薬を提供することである。

前記抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０を含む前記医薬品はまた、他の薬学的に許容される有効成分または賦形剤を含んでもよい。

本発明の有益な効果は下記のとおりである。

本発明では、セルトリズマブモノクローナル抗体に基づき、人工的改変により抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体を得ており、本発明で提供されるヒト化抗ＴＮＦ－αモノクローナル抗体は、セルトリズマブモノクローナル抗体と同じＴＮＦ－α抗原への結合部位を有するが、その抗体のコンフォメーションおよび免疫原性などの性質はセルトリズマブと異なる。本発明で提供されるヒト化抗ＴＮＦ－αモノクローナル抗体ＴＣＸ０６０は、セルトリズマブモノクローナル抗体の抗原に対する親和性および特異性を保持しており、それにより媒介されるＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能は、ＰＥＧ化されたセルトリズマブモノクローナル抗体と近似しているが、その免疫原性はセルトリズマブより著しく低くなっている。同時に、本発明で提供されるヒト化抗ＴＮＦ－αモノクローナル抗体の製造プロセスは、より簡易である。より低い免疫原性は、体内での抗体の免疫原性によって引き起こされる免疫反応による医薬品の副作用のリスクを低減させるとともに、免疫原性の低下により、本発明で提供されるヒト化抗ＴＮＦ－αモノクローナル抗体から調製される抗体医薬品の体内での半減期が延長され、抗体医薬品ＡＤＡによる薬効の低下が大幅に回避される一方で、抗体医薬品の使用量を減らして治療費を削減することができる。さらに、抗ＴＮＦ－αモノクローナル抗体医薬品と免疫抑制剤との併用モードを回避し、抗ＴＮＦ－αモノクローナル抗体医薬品の単回投与の効果を実現し、免疫抑制剤との併用による副作用を排除して、医薬品の使用の安全性を向上させることができる。本発明で提供されるヒト化抗ＴＮＦ－αモノクローナル抗体ＴＣＸ０６０は、極めて大きな応用の可能性および価値を有し、理想的な生物学的標的治療用抗体として期待されている。

本発明の実施例２のセルトリズマブモノクローナル抗体をコードする遺伝子および本発明で提供されるＨ２Ｌ０モノクローナル抗体をコードする遺伝子の、発現ベクターの二重消化の電気泳動の結果を示す図である。そのうち、ａはセルトリズマブモノクローナル抗体の軽鎖Ｌ０プラスミドのＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによる二重消化の結果であり、左から右へのレーンはそれぞれ、消化前のプラスミド、消化後のプラスミドおよびＤＮＡマーカーであり、ｂは、本発明で提供されるモノクローナル抗体ＴＣＸ０６０の重鎖Ｈ２プラスミドのＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩによる二重消化の結果であり、左から右へのレーンはそれぞれ、消化前のプラスミド、消化後のプラスミド、およびＤＮＡマーカーである。 本発明の実施例４におけるモノクローナル抗体ＴＣＸ０６０のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。左から右へのレーンは順に、発現が見られた培養上清、マーカー、および精製された抗体である。 本発明の実施例５におけるモノクローナル抗体ＴＣＸ０６０の親和性ＥＣ_５０を示す図である。そのうち、Ｈ２Ｌ０は、ＴＣＸ０６０を表す。 本発明の実施例５におけるモノクローナル抗体ＴＣＸ０６０のＴＮＦ－αが媒介する細胞毒性実験の結果を示す。そのうち、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂはアダリムマブの先発医薬品を表し、Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂはセルトリズマブの先発医薬品を表し、Ｈ２Ｌ０は本発明の抗体であるＴＣＸ０６０ Ｈ２Ｌ０を表す。 本発明の実施例６におけるモノクローナル抗体ＴＣＸ０６０のマウスＡＤＡ評価の結果を示す図である。そのうち、Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ Ｄａｙ ０、Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ Ｄａｙ ７、Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ Ｄａｙ １４はそれぞれ、セルトリズマブの先発医薬品の免疫前、免疫後の７日目および免疫後の１４日目の血清サンプルを表し、Ｈ２Ｌ０ Ｄａｙ ０、Ｈ２Ｌ０ Ｄａｙ ７、Ｈ２Ｌ０ Ｄａｙ １４はそれぞれ、本発明の抗体医薬品ＴＣＸ０６０ Ｈ２Ｌ０の免疫前、免疫後の７日目および免疫後の１４日目の血清サンプルを表す。

以下、実施例を組み合わせて、本発明の好ましい実施形態を詳しく説明する。なお、以下の実施例は、説明のために例示されたものであり、本発明の範囲を限定するためのものではないことを理解されたい。当業者は、本発明の趣旨および本質から逸脱しない限り、本発明に対して様々な修正および置換を行うことができる。

特に断りがない限り、下記の実施例で使用される実験方法は、いずれも常法である。

特に断りがない限り、下記の実施例で使用される材料、試薬などは、いずれも商業ルートから入手できる。

実施例１ 免疫原性が低減された低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能のＣｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂモノクローナル抗体の分析と設計
本発明では、セルトリズマブモノクローナル抗体の元の配列を、商業化されたＤＮＡＳｔａｒＴＭソフトウェアで分析・評価したところ、セルトリズマブモノクローナル抗体の先発医薬品の配列の免疫原性が非常に低いことを示すことが明らかとなった。このことから、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を除去するために、セルトリズマブモノクローナル抗体の先発医薬品に対してＰＥＧ化を行った後、抗体の多量体が増加し、その結果、薬物のＡＤＡが２３％にも達していると推測される。したがって、セルトリズマブモノクローナル抗体の先発医薬品のＰＥＧ修飾を除去しながら、そのＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低下させる必要がある。元のセルトリズマブの軽鎖の全長および重鎖の可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１および配列番号２が示すとおりである。

まず、セルトリズマブモノクローナル抗体の先発医薬品からＰＥＧ修飾を除去し、ヒトＩｇＧ１サブタイプの完全抗体への改変を行い、これに基づき、得られたヒトＩｇＧ１サブタイプの完全抗体の可変領域と定常領域との間で比較的柔軟な領域を探し、柔軟な領域に柔軟なアミノ酸配列を挿入することにより、抗体の可変領域が抗原に結合した後に生じるメカニカルストレスの伝達を遮断し、抗体の重鎖の定常領域とＦｃ受容体および／または補体との結合部位を十分に露出させず、抗体と、ＮＫ細胞、マクロファージ、および好中球などのＩｇＧ Ｆｃ受容体を発現するキラー細胞との結合、または、補体との結合を弱め、ＡＤＣＣとＣＤＣを誘導できないようにするか、又はＡＤＣＣとＣＤＣを誘導するシグナルを低減した。Ｐｙｍｏｌソフトウェアによる分析により、上記のセルトリズマブのヒトＩｇＧ１サブタイプの完全抗体の重鎖ＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に柔軟なアミノ酸配列を挿入すると、抗体が抗原に結合した後の抗体の可変領域と定常領域との間のストレスの伝達をよりよく遮断し、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を低下させながら、抗体の多量体の形成を有意に増加させないことができると確認した。大量の配列分析、構造のシミュレーション・予測により、重鎖配列が配列番号３が示すとおりであるセルトリズマブのヒトＩｇＧ１サブタイプの完全抗体を確定し、配列番号３が示す配列の２３７番目のアミノ酸と２３８番目のアミノ酸の間に、柔軟なアミノ酸配列ＧＧＧＳを挿入することで、改変後のヒトＩｇＧ１サブタイプの完全抗体の重鎖Ｈ２が得られ、その配列が配列番号４が示すとおりであると確定した。異なる軽鎖と重鎖を組み合わせることにより得られるモノクローナル抗体の全体的な性能を初歩的に評価することで、最終的に、軽鎖Ｌ０（セルトリズマブの元の軽鎖配列、配列番号１）と重鎖Ｈ２（配列番号４）からなる抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体Ｈ２Ｌ０を得た。当該モノクローナル抗体をＴＣＸ０６０と命名した。

実施例２ 抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０の発現ベクターの構築
実施例１で得られた抗ＴＮＦ－α完全ヒト化モノクローナル抗体Ｈ２Ｌ０の重鎖および軽鎖の全長アミノ酸配列、ならびに宿主のコドンバイアスに基づき、重鎖Ｈ２および軽鎖Ｌ０をコードするヌクレオチド配列を設計し（そのうち、Ｌ０のヌクレオチド配列は配列番号６が示すとおりであり、Ｈ２のヌクレオチド配列は配列番号５が示すとおりである）、軽鎖配列の両側の酵素切断部位をＨｉｎｄＩＩＩ＋ＥｃｏＲＩとし、重鎖配列の両側の酵素切断部位をＨｉｎｄＩＩＩ＋ＥｃｏＲＩとし、酵素切断部位を有する重鎖の全長配列および軽鎖の全長配列をＧＥＮＥＷＩＺ，Ｉｎｃ．に送り、全遺伝子配列を合成してもらい、合成に使用された接続ベクターはｐＵＣ５７である。ｐＥＥ１２．４（重鎖発現用）とｐＥＥ６．４（軽鎖発現用）を発現ベクターとし、上記の発現ベクターと合成された遺伝子配列に対してそれぞれ対応する二重消化を行い、消化により得られた標的遺伝子と発現ベクターをそれぞれアガロースゲル電気泳動により分離してから、ターゲットバンドを切り取り、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで回収し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼシステムに従って１６℃で一晩連結させた後、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体に対してＰＣＲ、プラスミド抽出および配列決定を行い、重鎖Ｈ２と軽鎖Ｌ０の全長遺伝子をそれぞれ有する発現ベクターを得た。セルトリズマブの先発医薬品を対照とし、セルトリズマブの先発医薬品の重鎖Ｈ０（配列番号２が示す配列）を有するｐＥＥ１２．４発現ベクターを構築し、構築方法は重鎖Ｈ２の発現ベクターと同じであった。

上記の重鎖および軽鎖の全長遺伝子を有する発現ベクターの二重消化の電気泳動の結果を図１に示す。

実施例３ 抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０の一過性発現
実施例２で得られた、重鎖Ｈ２、Ｈ０および軽鎖Ｌ０の全長遺伝子をそれぞれ有する大腸菌ＤＨ５α株を培養し、培養物を回収して、Ｑｉａｇｅｎ ＵｌｔｒａＰｕｒｅプラスミドＤＮＡ精製キットで、重鎖と軽鎖の全長遺伝子を有する発現ベクターを抽出・精製した。上記の精製されたプラスミドＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のリポソーム法キットを使用して２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションの方法はキットの説明書を参照した。

トランスフェクションにより得られた陽性細胞で抗体を発現させ、重鎖と軽鎖の組み合わせがＨ２Ｌ０であるモノクローナル抗体ＴＣＸ０６０の発現量を表２に示す。

上記の発現により得られた抗体Ｈ２Ｌ０に対して、ＴＮＦ－αをプレコーティングする実験を行い、モノクローナル抗体Ｈ２Ｌ０をＴＮＦ－αでプレーコーティングされた９６ウェルプレートに添加し、間接ＥＬＩＳＡにより、分泌された抗体のＴＮＦ－αとの結合活性を初歩的に評価した。試験結果を表３に示す。ＮＣは陰性対照としての抗体希釈液である。

表３の結果は、Ｈ２Ｌ０の組み合わせに対応するモノクローナル抗体ＴＣＸ０６０が発現していることを示しており、表３の結果は、モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０がＴＮＦ－αを識別できることを表している。

実施例４ 抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０の発現および精製
実施例３の検出結果に基づき、重鎖と軽鎖の組み合わせがＨ２Ｌ０であるモノクローナル抗体ＴＣＸ０６０の発現ベクターに対して、安定的遺伝子導入を行った。

一過性トランスフェクション法により２９３F細胞をトランスフェクションし、珠海ガイ瑞社の２９３培地とトランスフェクション試薬を使用して、トランスフェクション後の７日目に細胞培養上清を回収した。

モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０（Ｈ２Ｌ０の組み合わせ）とセルトリズマブモノクローナル抗体の先発医薬品（Ｈ０Ｌ０）の培養上清を直接分離し、ＧＥ社のＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸを使用して精製を行った。実験プロセスの詳細については、ＵＣＢ社の説明書を参照した。ＵＶ分光光度計を用いて精製された製品に対して定量検出を行い、計算式は下記のとおりである。
濃度計算：収集した溶出ピークのＯＤ_２８０を読み取った後、濃度を計算する。抗体濃度＝ＯＤ_２８０／１．４。

抗体精製後、検証のため、ＳＤＳ－ＰＡＧｅ電気泳動を行い、結果を図２に示す。電気泳動の結果は、精製された抗体の純度が８０％以上であり、かつ、バンドが比較的単一で、濃度が同等であり、後の実験に使用できることを示した。

実施例５ 抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０の生物学的活性の測定
１．親和性評価
本実施例では、間接ＥＬＩＳＡにより、抗体のＥＣ５０を測定し、抗体の親和性を評価した。

実験方法は下記のとおりである。ＰＢＳで抗原であるＴＮＦ－α（Ｎｅａｒｓｈｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を１μｇ／ｍｌに希釈し、希釈された抗原を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、蓋をし、４℃で一晩おいた。ウェル内の液体を振り棄て、ＰＢＳで、２００μｌ／ウェルで３回洗浄し、軽くたたいて乾燥させた。５％ミルク－ＰＢＳを２００μｌ／ウェルで１時間密封し、１５分ごとに軽く叩いた。ウェル内の液体を振り棄て、ＰＢＳで、２００μｌ／ウェルで１回洗浄し、軽くたたいて乾燥させた。精製された抗体を０～１０μｇ／ｍｌの濃度勾配で加え（抗体名については表４を参照してください）、５％ミルク－ＰＢＳを１００μｌ／ウェルで希釈し、１時間インキュベートし、１５分ごとに軽くたたいた。ウェル内の液体を振り棄て、ＰＢＳで２００μｌ／ウェルで３回洗浄し、軽くたたいて乾燥させた。二次抗体を加え、５％ミルク－ＰＢＳで、１００μｌ／ウェルで希釈し、１時間インキュベートし、１５分ごとに軽くたたいた。ＴＭＢ基質を室温で予熱しながら、マイクロプレートリーダーを起動して予熱した。ＰＢＳで、２５０μｌ／ウェルで５回洗浄し、最初の３回は５分間、後の２回は１０分間洗浄し、軽くたたいて乾燥させた。ＴＭＢ基質Ａ、Ｂをそれぞれ５０μｌ／ウェルで加え、室温で２０分間発色させ、スキャナーを使用して写真をスキャンして記録し、５０μｌ／ウェルの停止液を加え、マイクロプレートリーダーを使用してＯＤ_４５０を読み取った。実験データを表４と図３に示す。

上記の結果は、モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０のヒトＴＮＦ－αに対する親和性が、セルトリズマブの先発医薬品のヒトＴＮＦ－αに対する親和性よりわずかに高いことを示した。

２．細胞毒性実験
ＣＣＫ－８キットを用いて、マウス線維芽細胞株Ｌ９２９に対してアポトーシスの検出を行った。具体的な手順は下記のとおりである。

１００μｌの３倍に段階希釈されたモノクローナル抗体（１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地で希釈）を９６ウェルプレートに加え（モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０の添加濃度は、ＦＤＡに記載されたセルトリズマブに関する当該実験のＩＣ_５０に準拠して、上下３～５段階の濃度をそれぞれ設定した）、その後、最終濃度が５００ｐｇ／ｍｌとなるよう、５０μｌのｒｈＴＮＦ－α（１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地で希釈）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。最終濃度１μｇ／ｍｌのアクチノマイシン－Ｄを含む５０μｌのＬ９２９細胞を５×１０^４／ウェルで各ウェルに加えた。３７℃のインキュベーターで一晩インキュベートした（１８～２４時間）。対照には、陰性対照と陽性対照が含まれ、陰性対照ではＲＰＭＩ－１６４０と細胞のみを加え、陽性対照ではｒｈＴＮＦαと細胞のみを加え、前記ｒｈＴＮＦαは２ｎｇ／ｍｌから８．２ｐｇ／ｍｌまでの濃度勾配で加えた。各ウェルに２０μＬのＣＣＫ８溶液を加え（ＯＤの読み取りに影響を与えないように、ウェル内に気泡が発生しないように注意）、培養プレートを３７℃のインキュベーターで１～４時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。ＯＤ値を一時的に測定しない場合、各ウェルに１０μＬの０．１Ｍ ＨＣｌ溶液または１％ｗ／ｖ ＳＤＳ溶液を加え、培養プレートに蓋をし、室温条件で暗所にて保存すればよい。２４時間以内に測定すれば、吸光度は変化しない。

さまざまな濃度での抗体の細胞死滅率とＩＣ５０を計算した。
計算式：(モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０処理細胞－ＴＮＦ－α処理細胞）／ＴＮＦ－α処理細胞×１００％。

実験結果を図４に示す。ＩＣ５０データを表５に示す。ＴＣＸ０６０（Ｈ２Ｌ０）のＩＣ５０は、アダリムマブの先発医薬品と同等であり、ＴＣＸ０６０（Ｈ２Ｌ０）のＩＣ５０はセルトリズマブよりも低くなっている。

実施例６ 抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０の免疫原性の評価
マウスの体内で抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０の免疫実験を行い、ＴＣＸ０６０の免疫原性を解析した。詳細は下記のとおりである。
（１）基本免疫：ＴＣＸ０６０（Ｈ２Ｌ０）、セルトズマブの先発医薬品およびフロイント完全アジュバントを同体積で混合して完全に乳化し、注射箇所を分け、Ｂａｌｂ／ｃマウス１匹あたりの１回の注射量を７０μｇとして、皮下注射した。
（２）追加免疫：追加免疫では、抗原とフロイント不完全アジュバントのエマルジョンを使用した。

上記の実験が完了した後、ＥＬＩＳＡ検出試験を行った。実験方法は下記のとおりである。

ＰＢＳでＴＣＸ０６０（Ｈ２Ｌ０）またはセルトリズマブの先発医薬品を１μｇ／ｍｌに希釈し、希釈された抗原を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、蓋をし、４℃で一晩おいた。ウェル内の液体を振り棄て、ＰＢＳで、２００μｌ／ウェルで３回洗浄し、軽くたたいて乾燥させた。５％ミルク－ＰＢＳを２００μｌ／ウェルで１時間密封し、１５分ごとに軽く叩いた。ウェル内の液体を振り棄て、ＰＢＳで、２００μｌ／ウェルで１回洗浄し、軽くたたいて乾燥させた。免疫後の異なる日数で異なる希釈比（１：５００／１：１０００／１：５０００／１：１００００／１：５００００）の血清サンプルを加え、５％ミルク－ＰＢＳで、１００μｌ／ウェルで希釈し、１時間インキュベートして、１５分ごとに軽くたたいた。ウェル内の液体を振り棄て、ＰＢＳで、２００μｌ／ウェルで３回洗浄し、軽くたたいて乾燥させた。二次抗体を加え、５％ミルク－ＰＢＳで、１００μl／ウェルで希釈し、１時間インキュベートして、１５分ごとに軽くたたいた。ＴＭＢ基質を室温で予熱しながら、マイクロプレートリーダーを起動して予熱した。ＰＢＳで、２５０μｌ／ウェルで５回洗浄し、最初の３回は５分間、後の２回は１０分間洗浄し、軽くたたいて乾燥させた。ＴＭＢ基質Ａ、Ｂをそれぞれ５０μｌ／ウェルで加え、室温で２０分間発色させ、スキャナーを使用して写真をスキャンして記録し、５０μｌ／ウェルの停止液を加え、マイクロプレートリーダーを使用してＯＤ_４５０を読み取った。

結果を図５に示す。結果として、本発明の抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０ Ｈ２Ｌ０がセルトリズマブモノクローナル抗体と比較して、血清における抗体の感染価が有意に低下したことを表した。したがって、Ｈ２Ｌ０の免疫原性はセルトリズマブモノクローナル抗体と比較して、効果的に低下した。

上記において、一般的な説明及び具体的な実施形態で本発明を詳しく説明したが、本発明に基づき、いくつかの補正や改善を行い得ることは、当業者にとって明らかである。従って、本発明の趣旨から逸脱しない範疇で行われるこれらの補正や改善は、いずれも本発明の保護しようとする範囲に属する。

本発明は、低免疫原性かつ低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能の抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０およびその使用を提供する。本発明で提供される抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０は、セルトリズマブモノクローナル抗体を下記のように改変することによって得られるものである：（１）ＰＥＧ修飾を除去する；（２）ヒトＩｇＧ１サブタイプの全長抗体に改変する；（３）ＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に柔軟なアミノ酸フラグメントを挿入する。ＴＣＸ０６０は、ヒトＴＮＦ－αとの結合親和性がセルトリズマブと近似しており、ＴＮＦ－αと細胞表面のＴＮＦ受容体との結合を特異的に遮断でき、そのＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能はＰＥＧ化セルトリズマブモノクローナル抗体と近似しているが、免疫原性はセルトリズマブモノクローナル抗体より顕著に低くなっており、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を除去するとともに、抗体が体内で免疫原性を引き起こすリスクを低減でき、良好な経済的価値と使用の見通しを有する。

Claims (11)

1. 抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体であって、
   該抗体はヒトＩｇＧ１サブタイプの全長抗体であり、
   重鎖のＣＤＲ３領域とＣＨ２領域との間に挿入されたアミノ酸フラグメントを含み、
   軽鎖の全長配列および重鎖の可変領域の配列がそれぞれ、配列番号１および配列番号２が示すとおりであり、
   ヒトＴＮＦ－αに結合し、ヒトＴＮＦ－αと、ＴＮＦ受容体との結合を遮断する機能を有することを特徴とする抗体。
2. 前記アミノ酸フラグメントが、配列番号３に示されるアミノ酸配列の２３７番目の後ろに挿入されており、２個以上のグリシンと、１個以上のセリンを含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
3. 前記アミノ酸フラグメントの配列が、ＧＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳ、およびＧＳＧＳＧＳから選択される１種であることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体。
4. 腫瘍、炎症または自己免疫疾患を予防または治療するための医薬品として用いられることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
5. 請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体をコードする遺伝子。
6. 重鎖の全長をコードするヌクレオチド配列が配列番号５が示す通りであり、軽鎖の全長をコードするヌクレオチド配列が配列番号６が示す通りであることを特徴とする、請求項５に記載の遺伝子。
7. 発現カセット、ベクター、宿主細胞、人工細菌または細胞株を含むことを特徴とする、請求項５または６に記載の遺伝子を含む生物学的材料。
8. ヒトＴＮＦ-αを標的とする医薬品の調製における、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体、請求項５または６に記載の遺伝子、もしくは、請求項７に記載の生物学的材料の使用。
9. 前記ヒトＴＮＦ－αを標的とする医薬品が、腫瘍、炎症または自己免疫疾患を予防または治療するための医薬品である、請求項８に記載の使用。
10. ヒトＴＮＦ-α検出試薬の調製における、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体、請求項５または６に記載の遺伝子、もしくは、請求項７に記載の生物学的材料の使用。
11. 請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬品または検出試薬。

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