JP2019502692A - 抗ｔｌ１ａ／抗ｔｎｆ−アルファ二重特異性抗原結合タンパク質及びその使用 - Google Patents

抗ｔｌ１ａ／抗ｔｎｆ−アルファ二重特異性抗原結合タンパク質及びその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αに対する二重特異性抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を含めた、ＴＬ１Ａに結合する抗原結合タンパク質に関する。そのような二重特異性抗体は、四量体免疫グロブリン型式で存在することができ、ここでは、抗体の１つの重鎖−軽鎖対がＴＬ１Ａに対するものであり、もう１つがＴＮＦ−αに対するものである。二重特異性抗原結合タンパク質はＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体に含まれてもよく、ここでは、１つの抗原に対する従来の四量体抗体が、もう１つの抗原に対する１対の単鎖Ｆｖユニットに融合している。二重特異性抗原結合タンパク質はＩｇＧ−Ｆａｂ融合体に含まれてもよく、ここでは、１つの抗原に結合するＦａｂ分子が、もう１つの抗原に対する従来の四量体抗体の各重鎖に融合している。本発明は、さらに、抗ＴＬ１Ａ結合タンパク質及び抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α抗原結合タンパク質の使用に、並びにそれらの医薬製剤に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年９月１５日に出願された出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２００６号、並びに２０１５年１２月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／２６８，４３２号及び２０１６年５月６日に出願された第６２／３３３，０６３号の利益を主張する。前述の出願のそれぞれは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は生物製剤に関し、特に、治療的抗原結合タンパク質、その使用方法、その医薬組成物及びその製造方法に関する。特に、本発明は、サイトカインのＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αに結合することができる治療的抗原結合タンパク質に関する。
配列表の簡単な説明
本明細書に開示される核酸及び／またはアミノ酸配列を含む、配列番号１から配列番号２１３６までを含む「Ａ−１９３７−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題する配列表が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。配列表は、本明細書において、ＥＦＳを介してＡＳＣＩＩテキスト型式で提出され、それにより、紙及びそのコンピュータ可読形態の両方を構成する。配列表は、ＰａｔｅｎｔＩｎを使用して２０１６年１１月２２日に最初に作成され、３．４５ＭＢのサイズである。
サイトカインは、免疫系に関する様々な生物学的作用を媒介する、可溶性の小さなタンパク質である。そのような生物学的作用としては、免疫細胞の増殖、発生、分化及び／または遊走の誘導、多くの細胞型の成長及び分化の制御、免疫細胞の局部的または全身的な集積を介する炎症反応、並びに宿主防御作用が挙げられる。例えば、Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：７８３（１９９０）、Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：３１１（１９９１）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７６：２４１（１９９４）を参照されたい。そのような免疫作用は、自己免疫障害（例えば、多発性硬化症）及びがん／新生物疾患の場合のように、その作用が過剰な及び／または慢性の炎症を導く場合、病理学的帰結をもたらし得る。Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（２００１）、ｖｏｎ Ａｎｄｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４３：１０２０（２０００）、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４５：３４０（２００１）、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４：２２１（２００６）、Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｓ．，１３０：１（２００６）。
ＴＬＩＡ（ＴＮＦＳＦ１５）は、Ｔ細胞活性化に関与するＴＮＦ−αファミリーのメンバーである、サイトカインである（Ｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．２０１５ Ｓｅｐ，９８（３）：３３３−４５）。これは、ＴＮＦＲＳＦ２５としても知られる細胞死受容体３（ＤＲ３）に対するリガンドである。ＴＬ１Ａは、単球、樹状細胞及び内皮細胞において低い基底レベルで主に発現しているが、免疫複合体及びサイトカイン及び微生物の刺激後に、強く誘導される。複数のゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）によって、ＴＬ１Ａの一塩基多型（ＳＮＰｓ）が、様々な民族集団においてクローン病と関係があることが示された。さらに、ＴＬ１Ａ炎症性腸疾患（ＩＢＤ）リスクＳＮＰｓは、クローン病の重症度と関係があることが報告された（Ｈｉｒａｎｏ，ＩＢＤ１９：５２６，２０１３）。前臨床研究において、ＴＬ１Ａタンパク質治療は、大腸炎易発性のｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて大腸炎の発生を悪化させたが、野生型マウスでは悪化させなかった。全体的に見て、ヒトゲノムのデータ及び前臨床大腸炎モデルのデータは、ＴＬ１ＡがＩＢＤの発生で重要な役割を果たし、その阻害がＩＢＤの治療に有利であろうことを示す。
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）は、様々な生理的及び病的プロセスの制御に関与するサイトカインである（Ｂｕｅｔｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｓｕｐｐｌ．５７：１６−２１，１９９９）。これは、腫瘍退縮、敗血症性ショック、悪液質並びにいくつかの炎症性及び自己免疫性状態に関与する。Ｆｒａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊｕｎｅ １９８５），“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｃＤＮＡ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１２）：４４１７−２９、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｒｉｌ １９８８），“Ａ ｎｏｖｅｌ ｆｏｒｍ ｏｆ ＴＮＦ−α／ｃａｃｈｅｃｔｉｎ ｉｓ ａ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＴＮＦ−α，“Ｃｅｌｌ ５３（１）：４５−５３。ＴＮＦ−α阻害剤は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎、強直性脊椎炎、尋常性乾癬、クローン病及び潰瘍性大腸炎を治療するために承認された治療剤のクラスである（Ｓｅｔｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．２００９；６４７：３７−５１）。ＴＮＦ−α阻害剤としては、エタネルセプト、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、インフリキシマブ及びゴリムマブが挙げられる。
およそ５０％の患者がＴＮＦ阻害剤による治療に応答する。しかし、これらの患者のおよそ４０％しか、１年の治療の後に応答を維持しない。したがって、持続的応答をともなう大きな効果量を有する治療剤に対する強い要求がある。本発明者らは、複数の炎症経路、例えばＴＮＦ及びＴＬ１Ａの標的化は、安全性プロファイルが予測された、より大きな効果量をおそらく達成すると仮定する。
Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：７８３（１９９０） Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：３１１（１９９１） Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７６：２４１（１９９４） Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（２００１） ｖｏｎ Ａｎｄｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４３：１０２０（２０００） Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４５：３４０（２００１） Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４：２２１（２００６） Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｓ．，１３０：１（２００６） Ｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．２０１５ Ｓｅｐ，９８（３）：３３３−４５ Ｂｕｅｔｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｓｕｐｐｌ．５７：１６−２１，１９９９ Ｆｒａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊｕｎｅ １９８５），"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｃＤＮＡ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，"Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１２）：４４１７−２９ Ｋｒｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｒｉｌ １９８８），"Ａ ｎｏｖｅｌ ｆｏｒｍ ｏｆ ＴＮＦ−α／ｃａｃｈｅｃｔｉｎ ｉｓ ａ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＴＮＦ−α，"Ｃｅｌｌ ５３（１）：４５−５３ Ｓｅｔｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．２００９；６４７：３７−５１
本発明は、ＴＬ１Ａに特異的に結合する、抗原結合タンパク質、特に、完全ヒト抗体の開発に関する。好ましい抗原結合タンパク質は、ヒト及びカニクイザルのＴＬ１Ａの両方に強い結合親和性を有し、ＴＬ１Ａ媒介性ＮＦ−ｋＢ活性化及びＴ細胞活性化をブロックする。これらの抗原結合タンパク質は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）並びに他の自己免疫性及び炎症性状態の治療のための治療剤として使用される可能性がある。
本発明は、さらに、二重特異性抗原結合タンパク質、特に、二重特異性抗体に関する。本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＴＬ１Ａ結合物及びＴＮＦ−α結合物を含む。ＴＬ１Ａブロッキングタンパク質及びＴＮＦ−αブロッキングタンパク質は、サイトカインのＩＦＮγ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＩＬ−１０の誘導の阻害を測定する研究において、異なる効果を有する。ＴＬ１Ａは、インビボでＴ細胞活性化を誘導するが、ＴＮＦ−αは誘導しない。ＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αは、ヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）の異なる細胞型においてＮＦ−κＢを誘導する。ＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αは、ヒトＰＢＭＣにおいて異なるサイトカインをさらに誘導する。ＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αは、異なる細胞型においてではあるが、一部の同じ遺伝子を誘導する（全血においてＴＬ１Ａによって誘導され、ＮＣＭ４６０細胞においてＴＮＦ−αによって誘導される、１６種の重複する遺伝子；全血においてＴＬ１Ａによって誘導され、ＰＢＭＣにおいてＴＮＦ−αによって誘導される、１３種の重複する遺伝子）。ＴＬ１Ａと炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の強い遺伝的関連があり、抗ＴＮＦ剤は、ＩＢＤの治療について臨床的に検証されている。したがって、そのような二重特異性抗原結合タンパク質は、ＩＢＤ並びに他の自己免疫性及び炎症性状態の治療に有用である。これら及び他の理由で、ＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αに特異的に結合する二重特異性抗原結合タンパク質に利点がある。
そのような二重特異性抗原結合タンパク質に対する１つの型式は、ヘテロ二量体の免疫グロブリン（ヘテロＩｇ）である。そのようなヘテロＩｇ抗原結合タンパク質は、ＴＬ１Ａに対する１つの重鎖−軽鎖対、及びＴＮＦ−αに対する別の対を有する。
そのような二重特異性抗原結合タンパク質の別の型式は、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子である。ＩｇＧ−ｓｃＦｖでは、１つの標的に特異的に結合する抗体の各重鎖は、もう１つの標的に特異的に結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）に連結している。ＳｃＦｖ部分は、ＩｇＧ部分の重鎖に、直接的にまたはペプチドリンカーを介して、連結することができる。ＩｇＧ−ｓｃＦｖ型式では、ＩｇＧはＴＬ１Ａに対するものであり、ｓｃＦｖ部分はＴＮＦ−αに対するものであり、または逆もまた同様である。ＩｇＧ−ｓｃＦｖ型式の二重特異性抗原結合タンパク質は、その標的抗原の両方に対して二価であるという利点がある。
そのような二重特異性抗原結合タンパク質のさらなる型式は、ＩｇＧ−Ｆａｂ分子である。この型式では、抗原結合タンパク質は、１つの標的に結合するＦａｂ分子が別の標的に結合するＩｇＧ分子の各重鎖に融合しているような構造を有する。Ｆａｂ部分の１つの鎖は、直接的にまたはペプチドリンカーを介して、ＩｇＧ部分の重鎖のＣ末端に連結することができる。得られた分子は、四価且つ二重特異性であるという利点がある。ＩｇＧ−Ｆａｂ型式のすべてのバリエーションは、好ましくは、以下の表２１．２Ａ及び２１．２ＢのＣＤＲ配列を含む。ＩｇＧ−Ｆａｂ分子の好ましい重鎖及び軽鎖配列を以下の表２１．１に示す。
二重特異性抗原結合タンパク質の他の型式も本発明の範囲内である。そのような型式の１つはＩｇＧ−Ｆａｂ分子である。この型式では、１つの標的に特異的に結合する抗体の各重鎖が、もう１つの標的に特異的に結合するＦａｂ断片に連結している。ＩｇＧ−Ｆａｂ型式では、ＩｇＧはＴＬ１Ａに対するものであり、Ｆａｂ部分はＴＮＦ−αに対するものであり、または逆もまた同様である。ＩｇＧ−Ｆａｂ型式の二重特異性抗原結合タンパク質は、その標的抗原の両方に対して二価であるという利点を有する。本発明の範囲内の二重特異性抗原結合タンパク質の他の型式を以下に記載する。
本発明は、本発明のＴＬ１Ａ特異的な抗原結合タンパク質をコードする単離核酸、並びにその核酸を含むベクター、そのベクターを含む宿主細胞並びにＴＬ１Ａ特異的な抗原結合タンパク質の製造及び使用方法にも関する。
本発明は、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質をコードする単離核酸、並びにその核酸を含むベクター、そのベクターを含む宿主細胞並びに二重特異性抗原結合タンパク質の製造及び使用方法にも関する。
他の実施形態では、本発明は、ＴＬ１Ａ特異的な抗原結合タンパク質、二重特異性抗原結合タンパク質を含む組成物及び抗ＴＬ１Ａまたは二重特異性抗原結合タンパク質を含むキット並びに抗ＴＬ１Ａまたは二重特異性抗原結合タンパク質を含む製造品を提供する。
本明細書に記載のＴＬ１Ａ特異的な抗原結合タンパク質及び二重特異性抗原結合タンパク質は、ＴＬ１Ａと関係がある状態、及び／または二重特異性抗原結合タンパク質の場合には、ＴＮＦ−αと関係がある状態の治療のための医薬組成物または医薬の製造で使用することができる。したがって、本発明はまた、ＴＬ１Ａ特異的な抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質及び医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明は、さらに、ＴＬ１Ａ特異的な抗原結合タンパク質を使用する治療方法に関する。本発明のＴＬ１Ａ特異的な抗原結合タンパク質は、炎症誘発性サイトカインＴＬ１Ａの阻害に有用である。この抗体は、ＴＬ１Ａの炎症誘発性作用を低減する、制限する、中和する、またはブロックするのに使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＬ１Ａ特異的な抗原結合タンパク質を使用する、ＩＢＤ及び他の自己免疫性または炎症性状態の治療に関する。
本発明は、さらに、二重特異性抗原結合タンパク質を使用する治療方法に関する。本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、炎症誘発性サイトカイン、ＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αの阻害に有用である。二重特異性結合タンパク質は、ＴＬ１Ａの炎症誘発性作用を低減する、制限する、中和する、またはブロックするのに使用することができる。同様に、本明細書の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＴＮＦ−αの炎症誘発性作用を低減する、制限する、中和する、またはブロックするのに使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＬ１Ａ特異的／ＴＮＦ特異的な抗原結合タンパク質を使用する、ＩＢＤ及び他の自己免疫性または炎症性状態の治療に関する。
抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α二重特異性抗原結合タンパク質を生成するのに使用される４種の二重特異性ヘテロＩｇ型式の概略図である。示すように、１つの抗原に対する重鎖は、異なる抗原に対する重鎖にジスルフィド結合している。各抗原に対する軽鎖は、対応する抗原に対する重鎖にジスルフィド結合している。図１は、好ましい実施形態を示し、この実施形態では、重鎖及び軽鎖は、重鎖と軽鎖の正確な結合を助けるための電荷変異を含む。各鎖内の電荷対変異の位置を示すために、及び本明細書全体にわたるすべての配列について、Ｋａｂａｔ−Ｅｕナンバリング方式が使用される。このＩｇＧ様二重特異性抗原結合タンパク質型式は、２つの異なる軽鎖及び２つの異なる重鎖を含むヘテロ四量体である。ＨＣ１及びＬＣ１は、それぞれ、１つのＦａｂ結合アームの重鎖及び軽鎖を指し、ＨＣ２及びＬＣ２は、それぞれ、第２のＦａｂ結合アームの重鎖及び軽鎖を指す。例えば、概略図では、ＨＣ１及びＬＣ１は抗ＴＬ１Ａ受容体結合アームに対応し、ＨＣ２及びＬＣ２は抗ＴＮＦ−α結合アームに対応する。しかし、２つの結合アームは、ＨＣ１及びＬＣ１が抗ＴＮＦ−α結合アームに対応し、ＨＣ２及びＬＣ２が抗ＴＬ１Ａ受容体結合アームに対応するように、スイッチすることができる。 抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α二重特異性抗原結合タンパク質を生成するのに使用されるＩｇＧ−ｓｃＦｖ型式の概略図である。示すように、この構造体は、１つの抗原に対する完全な四量体ＩｇＧを組み入れる。グリシン−セリンリンカーによって互いに連結している第２の抗体由来の可変ドメインを含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、ペプチドリンカーを介して第１の抗体の重鎖のカルボキシル末端に融合して、改変重鎖を生成する。ｓｃＦｖ内の可変ドメインのＶＨ−ＶＬ配向を示すが、可変ドメインは、ＶＬ−ＶＨ配向を構成することもできる。完全な分子は、第１の抗体由来の２つの重鎖（しかし１つはユニークな重鎖配列である）及び２つの軽鎖（しかし１つはユニークな軽鎖配列である）を含む多量体である。 抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−αヘテロ−ＩｇのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティークロマトグラフィーを示す図である。これは、抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−αヘテロ−Ｉｇの代表的なＦＰＬＣプロテインＡ親和性捕獲クロマトグラムを示す。タンパク質を１００ｍＭ酢酸のステップグラジエント（伝導率：黒色トレース、破線）、ｐＨ３．６で溶出し、Ａ２８０（黒色トレース、実線）に基づいてプールした。 抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−αヘテロ−Ｉｇの代表的なＦＰＬＣ ＳＰ高速セファロース精製クロマトグラムを示す図である。タンパク質を漸増塩グラジエント（伝導率：黒色トレース、破線）で溶出し、Ａ２８０溶出プロファイル（黒色トレース、実線）及び画分のＣａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ分析に基づいてプールした。 抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−αヘテロ−Ｉｇの代表的なＦＰＬＣ ＳＰ高速セファロース精製クロマトグラムを示す図である。タンパク質を漸減硫酸アンモニウムグラジエント（伝導率：黒色トレース、破線）で溶出し、Ａ２８０溶出プロファイル（黒色トレース、実線）及び画分のＣａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ分析に基づいてプールした。 ＴＬ１Ａ／ＴＮＦ−αヘテロ−ＩｇのＣａｌｉｐｅｒ解析を示す図である。これは、抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−αヘテロ−Ｉｇの非還元及び還元Ｃａｌｉｐｅｒ解析を示す。 抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−αヘテロ−ＩｇのＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す図である。これは、１ｍｌ／分での、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．９における、Ｓｅｐａｘ Ｚｅｎｉｘ−Ｃ ＳＥＣ−３００カラム（７．８×３００ｍｍ）に注入した、３０μｇの抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−αヘテロ−Ｉｇ最終生成物に対するサイズ排除クロマトグラフィーを示し、これは、２８０ｎｍの吸光度（黒色トレース）で観察した。 非還元ヘテロ−Ｉｇ（理論的質量：１４５４９５Ｄａ）のＬＣ−ＭＳを示す図である。図８は、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２３０ ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計を備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ８カラム（２．１×５０ｍｍ ３．５μｍ）並びに０．１％ＴＦＡ及び９０％ｎ−プロパノール／０．１％ＴＦＡの移動相（それぞれ、移動相Ａ及びＢ）を使用する、逆相ＨＰＬＣグラジエントから溶出した、２０μｇの非還元抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−αヘテロ−Ｉｇの質量分析を示す。 １００ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ８における３０分間の制限リジルエンドプロテイナーゼＣ消化後の、２０μｇのＴＬ１Ａ／ＴＮＦ−αヘテロ−Ｉｇの質量分析を示す図である。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ８カラム（２．１×５０ｍｍ ３．５μｍ）並びに０．１％ＴＦＡ及び９０％ｎ−プロパノール／０．１％ＴＦＡの移動相（それぞれ、移動相Ａ及びＢ）並びにＡｇｉｌｅｎｔ ６２３０ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計による質量検出を使用して、逆相ＨＰＬＣを行った。ＴＬ１Ａ Ｆａｂ、ＴＮＦ Ｆａｂ及びＦｃに対する理論的質量は、それぞれ４７３５０Ｄａ、４８００２Ｄａ及び５０１７５Ｄａである。 抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α ＩｇＧ−ｓｃＦｖのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティークロマトグラフィーを示す図である。これは、抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α ＩｇＧ−ｓｃＦｖの代表的なＦＰＬＣプロテインＡ親和性捕獲クロマトグラムを示す。タンパク質を１００ｍＭ酢酸のステップグラジエント、ｐＨ３．６で溶出し、Ａ２８０（黒色トレース）に基づいてプールした。 抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α ＩｇＧ−ｓｃＦｖのＳＰセファロース高速クロマトグラフィーを示す図である。これは、抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α ＩｇＧ−ｓｃＦｖの代表的なＦＰＬＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００精製クロマトグラムを示す。タンパク質を緩衝液の定組成グラジエントで溶出し、Ａ２８０溶出プロファイル（黒色トレース）及び画分のＳＥ−ＨＰＬＣ分析に基づいてプールした。 抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α ＩｇＧ−ｓｃＦｖの非還元及び還元Ｃａｌｉｐｅｒ解析を示す図である。 抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α ＩｇＧ−ｓｃＦｖのＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す図である。これは、１ｍｌ／分での、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．９における、Ｓｅｐａｘ Ｚｅｎｉｘ−Ｃ ＳＥＣ−３００カラム（７．８×３００ｍｍ）に注入した、３０μｇの抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α ＩｇＧ−ｓｃＦｖ最終生成物のサイズ排除クロマトグラフィーを示し、これは、２８０ｎｍの吸光度で観察した。 ＩｄｅＳプロテアーゼ消化したＩｇ−ｓｃＦｖを示す図である。これは、０．１％ＴＦＡ及び９０％ｎ−プロパノール／０．１％ＴＦＡの移動相（それぞれ、移動相Ａ及びＢ）を用いるＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢカラム（２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ）による逆相ＨＰＬＣ分離、並びにＡｇｉｌｅｎｔ ６２３０ ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計による検出を使用する、２０μｇのＩｇ−ｓｃＦｖの質量分析を示す。 ＴＬ１ＡのＳＮＰｓの遺伝子型判定を示す図である。発現との潜在的なＴＬ１Ａ遺伝子型の関連を評価するために、ＱｉａｇｅｎのＧｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｔｉｓｓｕｅキットを使用して、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を健常なＰＢＭＣドナーから単離した。ＬｉｆｅＴｅｃｈのｒｓ７８４８６４７、ｒｓ６４７８１０９、ｒｓ６４７８１０８及びｒｓ３８１０９３６アッセイに関するＴａｑＭａｎ ＳＮＰ遺伝子型判定アッセイ並びにＢｉｏ−ＲａｄドロップレットデジタルＰＣＲプラットフォームに対する標準的なプロトコールを使用して、ゲノムＤＮＡを遺伝子型判定した。リスクアレルのみが４つすべての遺伝子型判定されたＳＮＰｓ（ｒｓ７８４８６４７、ｒｓ６４７８１０９、ｒｓ６４７８１０８及びｒｓ３８１０９３６）に存在する場合、ドナーをホモ接合型リスクハプロタイプと考えた。非リスクアレルのみが４つの遺伝子型判定されたＳＮＰｓに存在する場合、ドナーをホモ接合型非リスクハプロタイプと考えた。４つすべての遺伝子型判定されたＳＮＰｓにリスク及び非リスクアレルの両方が存在する場合、ドナーをヘテロ接合型ハプロタイプと考えた。「組換え型」と考えたドナーは、ｒｓ７８４８６４７、ｒｓ６４７８１０９及びｒｓ６４７８１０８にホモ接合型リスクアレルのみを有していたが、ｒｓ３８１０９３６ではヘテロ接合型（リスク及び非リスクアレルが存在）であった。 図１６Ａ及び１６Ｂは、ヘテロ接合型ＰＢＭＣのＡＥＩ研究における、非リスクアレルよりも高い、ＴＬ１Ａリスクアレルの倍数誘導を示す図である。基底レベルにおけるまたは様々な時点での免疫複合体刺激後のヘテロ接合型ＰＢＭＣにおける、リスクアレルの使用対非リスクアレルの使用の頻度を、同義ＳＮＰ（ｒｓ３８１０９３６）アレル特異的蛍光プローブを使用して、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって調べた。アレル発現比は、リスクアレルのコピー／ｍｌを非リスクアレルのコピー／ｍｌで割ることによって計算した。各アレルの全コピー数をｃＤＮＡの投入量（コピー／ｎｇ）で正規化し、各時点における各アレルの倍数誘導を、目的の時点におけるコピー／ｎｇをベースライン（０時間）におけるコピー／ｎｇで割ることによって計算した。 プロモーター及びイントロン中のＴＬ１ＡのＳＮＰｓがアレル発現の不均衡な制御に寄与することを示す図である。本発明者（ら）は、ｒｓ７８４８６４７、ｒｓ６４７８１０９及びｒｓ６４７８１０８におけるリスクアレルに対してホモ接合型であるが、ｒｓ６４７８１０９と同義ＳＮＰ ｒｓ３８１０９３６の間の組換えがおそらく原因で、ｒｓ３８１０９３６においてヘテロ接合型である、少数のドナーを特定した。ヘテロ接合型ドナーのＰＢＭＣまたは組換え型ドナーのＰＢＭＣにおけるリスクアレルの使用対非リスクアレルの使用の頻度を、同義ＳＮＰ（ｒｓ３８１０９３６）アレル特異的蛍光プローブを使用して、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって調べた。ヘテロ接合型ドナーと比較して、免疫複合体刺激の前または後のこれらの組換え型個体において、アレル発現不均衡は検出されなかった。 図１８Ａ及び１８Ｂは、ＴＬ１ＡリスクＳＮＰｓが発現定量的形質遺伝子座（ｅＱＴＬ）と関連することを示す図である。ホモ接合型ＴＬ１Ａリスクアレル、ホモ接合型非リスクアレルまたはヘテロ接合型アレルを有するＰＢＭＣドナーを、免疫複合体で処理した。各ドナーにおけるＴＬ１Ａ（ＴＮＦＳＦ１５）の全発現をデジタルＰＣＲによって決定した。手短に述べると、各試料由来のｃＤＮＡをｄｄＰＣＲ（商標）Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及びＰｒｉｍｅＴｉｍｅ（登録商標）ｑＰＣＲアッセイＩＤ Ｈｓ．ＰＴ．５６ａ．４１００３９７０と混合した。ＱＸ１００（商標）ドロップレットジェネレーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ドロップレットを各反応について生成し、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で温度サイクルにかけた。増幅に続いて、ドロップレットの蛍光をＱＸ１００（商標）ドロップレットリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で読み取った。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してデータを解析し、ＴＬ１Ａのコピー／μｌを決定し、投入ｃＤＮＡの量（コピー／ｎｇ）に対して正規化した。スチューデントのｔ検定を使用して、異なるＴＮＦＳＦ１５ハプロタイプ間のＴＬ１Ａ発現レベルの差に対するＰ値を決定した。基底レベルでは、ＴＬ１ＡリスクＳＮＰｓに対してホモ接合型のドナー由来のＰＢＭＣは、非リスクホモ接合型ドナーと比較して低いＴＬ１Ａ ｍＲＮＡを有する。しかし、免疫複合体刺激後は、ＴＬ１ＡリスクＳＮＰｓに対してホモ接合型のドナー由来のＰＢＭＣは、非リスクホモ接合型ドナーと比較して高いＴＬ１Ａ発現を有する。 図１９Ａ及び１９Ｂは、ＴＬ１Ａ同義ＳＮＰのアレル発現不均衡の細胞型特異的制御を示す。様々なドナー由来のＨＵＶＥＣ細胞を、以前に記載されているように遺伝子型判定した。様々なドナー由来の遺伝子型判定したＨＵＶＥＣ細胞を、様々な時点でＩＬ−１で処理した。各アレルの全コピー数を、以前に記載されているように測定した。アレル発現比は、リスクアレルのコピー／ｍｌを非リスクアレルのコピー／ｍｌで割ることによって計算した。ＩＬ−１処理の有無にかかわらず、ＨＵＶＥＣ細胞においてアレル発現不均衡は観察されなかった。 図２０Ａ及び２０Ｂは、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて、抗ＴＬ１Ａモノクローナル抗体による予防的処理が自発的な大腸炎の発生を阻害したことを示す図である。マウス（ｎ＝１０、６〜７週齢）をランダム化して異なる群にし、８週にわたって、５００μｇの抗マウスＴＬ１Ａ抗体、抗ＩＬ２３ｐ１９抗体、抗マウスＩＬ１７ＲＡ抗体またはマウスアイソタイプコントロールで週１回腹腔内的に処理したか、週１回、処理をしなかった。臨床的疾患活性を肛門炎症及び便の硬さを評価することによってモニターした。腸の切片を組織病理解析にかけた。統計解析は、ｍＩｇＧ１群と比較して、Ｄｕｎｅｔｔ法を用いる一元配置ＡＮＯＶＡを使用して行った。 図２１Ａ及び２１Ｂは、ｍｄｒ１ａ＋マウスにおいて、ＴＬ１Ａが大腸炎を悪化させたことを示す図である。６〜８週齢のＭｄｒ１ａ−／−マウスまたは野生型コントロールマウスを、４週にわたって、１５０μｇの組換えｍＦｃ−ＴＬ１Ａ融合タンパク質で週１回またはアイソタイプコントロールで週３回、腹腔内的に処理した。先に記載されているように、臨床的疾患活性を肛門炎症及び便の硬さを評価することによってモニターした。４週間の処理後、マウスを屠殺し、腸の切片を組織病理解析にかけた。統計解析は、ｍＩｇＧ１群と比較して、Ｄｕｎｅｔｔ法を用いる一元配置ＡＮＯＶＡを使用して行った。 図２２Ａ〜２２Ｆは、Ｆｃ−ＴＬ１Ａチャレンジｍｄｒ１ａ−／−マウス由来の粘膜固有層における炎症細胞の増大を示す図である。６〜８週齢のＭｄｒ１ａ−／−マウスまたは野生型コントロールマウスを、４週にわたって、１５０μｇの組換えｍＦｃ−ＴＬ１Ａ融合タンパク質で週１回、またはアイソタイプコントロールで週３回、腹腔内的に処理した。粘膜固有層のリンパ球を単離し、表面抗原について染色し、ＦＡＣＳによって解析した。Ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおけるＴＬ１Ａチャレンジは、粘膜固有層における炎症細胞の増大をもたらした。 図２２Ａ〜２２Ｆは、Ｆｃ−ＴＬ１Ａチャレンジｍｄｒ１ａ−／−マウス由来の粘膜固有層における炎症細胞の増大を示す図である。６〜８週齢のＭｄｒ１ａ−／−マウスまたは野生型コントロールマウスを、４週にわたって、１５０μｇの組換えｍＦｃ−ＴＬ１Ａ融合タンパク質で週１回、またはアイソタイプコントロールで週３回、腹腔内的に処理した。粘膜固有層のリンパ球を単離し、表面抗原について染色し、ＦＡＣＳによって解析した。Ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおけるＴＬ１Ａチャレンジは、粘膜固有層における炎症細胞の増大をもたらした。 図２２Ａ〜２２Ｆは、Ｆｃ−ＴＬ１Ａチャレンジｍｄｒ１ａ−／−マウス由来の粘膜固有層における炎症細胞の増大を示す図である。６〜８週齢のＭｄｒ１ａ−／−マウスまたは野生型コントロールマウスを、４週にわたって、１５０μｇの組換えｍＦｃ−ＴＬ１Ａ融合タンパク質で週１回、またはアイソタイプコントロールで週３回、腹腔内的に処理した。粘膜固有層のリンパ球を単離し、表面抗原について染色し、ＦＡＣＳによって解析した。Ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおけるＴＬ１Ａチャレンジは、粘膜固有層における炎症細胞の増大をもたらした。 図２３Ａ〜２３Ｅは、マウスにおける、ＴＬ１Ａ及びＴＮＦチャレンジによる異なるサイトカイン誘導を示す図である。ＴＬ１Ａ及びＴＮＦチャレンジが同様のまたは異なる薬力学的効果をもたらすかどうかを評価するために、５００μｇ／マウスの抗マウスＴＬ１Ａ、抗マウスＴＮＦ−αまたはＰＢＳでＣ５７Ｂｌ／６マウス（８週、雌）に最初に腹腔内注射した。４時間後、次いで、１００μｇ／マウスのＴＬ１Ａまたは１０μｇ／マウスのＴＮＦ−αでマウスをチャレンジしたか、チャレンジしなかった。２４時間後に、血清を収集した。サイトカインをＭＳＤによって測定した（ＩＬ−２２はＥＬＩＳＡによって測定した）。 図２３Ａ〜２３Ｅは、マウスにおける、ＴＬ１Ａ及びＴＮＦチャレンジによる異なるサイトカイン誘導を示す図である。ＴＬ１Ａ及びＴＮＦチャレンジが同様のまたは異なる薬力学的効果をもたらすかどうかを評価するために、５００μｇ／マウスの抗マウスＴＬ１Ａ、抗マウスＴＮＦ−αまたはＰＢＳでＣ５７Ｂｌ／６マウス（８週、雌）に最初に腹腔内注射した。４時間後、次いで、１００μｇ／マウスのＴＬ１Ａまたは１０μｇ／マウスのＴＮＦ−αでマウスをチャレンジしたか、チャレンジしなかった。２４時間後に、血清を収集した。サイトカインをＭＳＤによって測定した（ＩＬ−２２はＥＬＩＳＡによって測定した）。 図２３Ａ〜２３Ｅは、マウスにおける、ＴＬ１Ａ及びＴＮＦチャレンジによる異なるサイトカイン誘導を示す図である。ＴＬ１Ａ及びＴＮＦチャレンジが同様のまたは異なる薬力学的効果をもたらすかどうかを評価するために、５００μｇ／マウスの抗マウスＴＬ１Ａ、抗マウスＴＮＦ−αまたはＰＢＳでＣ５７Ｂｌ／６マウス（８週、雌）に最初に腹腔内注射した。４時間後、次いで、１００μｇ／マウスのＴＬ１Ａまたは１０μｇ／マウスのＴＮＦ−αでマウスをチャレンジしたか、チャレンジしなかった。２４時間後に、血清を収集した。サイトカインをＭＳＤによって測定した（ＩＬ−２２はＥＬＩＳＡによって測定した）。 図２４Ａ〜２４Ｆは、ヒトＰＢＭＣにおけるＴＬ１Ａ及びＴＮＦ処理による異なるサイトカイン誘導を示す図である。ヒトの血液から新しく単離したＰＢＭＣを、１００ｎｇ／ｍｌのヒトＴＬ１ＡまたはＴＮＦ−αの存在下で、培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５×１０−５Ｍの２−ＭＥ及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ１６４０）中で培養した。７２時間後に、上清を収集した。上清中のサイトカインをＭＳＤによって測定した（ＩＬ−２２はＥＬＩＳＡによって測定した）。 図２４Ａ〜２４Ｆは、ヒトＰＢＭＣにおけるＴＬ１Ａ及びＴＮＦ処理による異なるサイトカイン誘導を示す図である。ヒトの血液から新しく単離したＰＢＭＣを、１００ｎｇ／ｍｌのヒトＴＬ１ＡまたはＴＮＦ−αの存在下で、培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５×１０−５Ｍの２−ＭＥ及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ１６４０）中で培養した。７２時間後に、上清を収集した。上清中のサイトカインをＭＳＤによって測定した（ＩＬ−２２はＥＬＩＳＡによって測定した）。 本発明内の抗ＴＬ１Ａ抗ＴＮＦ−α二重特異性抗原結合タンパク質についての二重特異性ＩｇＧ−Ｆａｂ型式の概略図である。この型式では、改変重鎖を生成するために、第２の抗体由来のＦａｂ断片の１つのポリペプチド鎖（例えば、重鎖（ＶＨ２−ＣＨ１）が、ペプチドリンカーを介して、第１の抗体の各重鎖のカルボキシル末端に融合している。完全な分子は、２つの改変重鎖、第１の抗体由来の２つの軽鎖及び第２の抗体由来のＦａｂ断片のもう半分を含む２つのポリペプチド鎖（例えば、軽鎖（ＶＬ２−ＣＬ））を含むホモ六量体である。正確な重鎖−軽鎖対形成を促進するために、電荷対変異（丸によって表される）を第１の抗体（Ｆａｂ１）及び／または第２の抗体（Ｆａｂ２）のＦａｂ領域に導入することができる。 免疫グロブリンドメインクロスオーバーを使用する、本発明内の抗ＴＬ１Ａ抗ＴＮＦ−α二重特異性抗原結合タンパク質についての、二重特異性ＩｇＧ−Ｆａｂ型式の概略図である。ＩｇＧ−Ｆａｂ型式のこのバリエーションでは、改変重鎖を生成するために、第２の抗体由来のＦａｂ断片の１つのポリペプチド鎖（例えば、重鎖（ＶＨ２−ＣＨ１）が、ペプチドリンカーを介して、第１の抗体のＣＨ１ドメインの代わりにＣＬを含む重鎖のカルボキシル末端に融合している。このようにして、Ｆａｂ１のＣＨ１及びＣＬドメインは「スワップされる」。本明細書では、このスワップは、Ｆａｂ１スワップまたはＮ末端スワップと称される。完全な分子は、２つの改変重鎖、ＣＬドメインの代わりにＣＨ１ドメインを含む第１の抗体由来の２つの軽鎖及び第２の抗体由来のＦａｂ断片のもう半分を含む２つのポリペプチド鎖（例えば、軽鎖（ＶＬ２−ＣＬ））を含むホモ六量体である。正確な重鎖−軽鎖対を促進するために、電荷対変異（丸によって表される）を第１の抗体（Ｆａｂ１）及び／または第２の抗体（Ｆａｂ２）のＦａｂ領域に導入することができる。（ｉ）Ｆａｂ２のＣＨ１及びＣＬドメインが、Ｆａｂ１のこれらの代わりにスワップされている（Ｆａｂ２スワップまたはＣ末端スワップと本明細書で言及する）、または（ｉｉ）Ｆａｂ１のＣＨ１及びＣＬドメインの両方がスワップされ、且つＦａｂ２のＣＨ１及びＣＬドメインがスワップされている（二重スワップと本明細書で言及する）ＩｇＧ−Ｆａｂ分子は、示されないが、本発明の範囲内である。 ドメインスワッピング型式に基づいてＩｇＧ−Ｆａｂの発現力価を比較する図である。 電荷対変異（複数可）のタイプに基づいてＩｇＧ−Ｆａｂの発現力価を比較する図である。 ドメインスワッピング型式に基づいてＩｇＧ−Ｆａｂの純度を比較する図である。 ドメインスワッピング型式に基づいてＩｇＧ−Ｆａｂの抗ＴＬ１Ａ効力を比較する図である。 ドメインスワッピング型式に基づいてＩｇＧ−Ｆａｂの抗ＴＮＦ−α効力を比較する図である。 電荷対変異（複数可）のタイプに基づいてＩｇＧ−Ｆａｂの抗ＴＬ１Ａ効力を比較する図である。 電荷対変異（複数可）のタイプに基づいてＩｇＧ−Ｆａｂの抗ＴＮＦ−α効力を比較する図である。
用語の定義
以下の説明では、いくつかの用語が広範に使用される。本発明を理解しやすくするために、以下の定義を提供する。
別段の指定がない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」は互換的に使用され、１つまたは複数を意味する。
本明細書で使用する場合、「結合物」は、特定の標的抗原に特異的に結合する任意の単量体または多量体のタンパク質またはタンパク質断片を意味する。用語「結合物」には、限定されないが、抗体及びその結合部分、例えば免疫学的に機能的な断片が含まれる。ペプチボディ及びペプチドは、結合物の他の例である。本明細書で使用する場合、抗体または免疫グロブリン鎖（重鎖もしくは軽鎖）結合物の「免疫学的に機能的な断片」（または、単に「断片」）という用語は、全長鎖中に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠くが、依然として抗原に特異的に結合することができる抗体の部分（どのようにその部分が得られたか、または合成されたかを問わない）を含む、結合物の種である。そのような断片は、標的抗原に結合し、所与のエピトープへの結合について、インタクトな抗体を含めた他の結合物と競合することができるという点において、生物学的に活性である。いくつかの実施形態では、断片は中和断片である。いくつかの実施形態では、断片は、標的抗原（ＴＬ１ＡまたはＴＮＦ−α）とその受容体の間の相互作用をブロックする、またはその相互作用の可能性を低減することができる。一態様では、そのような断片は、全長の軽鎖または重鎖中に存在する少なくとも１つのＣＤＲを保持し、いくつかの実施形態では、単一の重鎖及び／または軽鎖またはそれらの一部を含む。これらの生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ法によって生成することができ、またはインタクトな抗体を含めた結合物の酵素的もしくは化学的切断によって生成することができる。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片としては、限定されないが、Ｆａｂ、ダイアボディ（同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成させるには短すぎる短いペプチドリンカーを介して結合している、軽鎖可変ドメインと同じポリペプチド上の重鎖可変ドメイン）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体及び単鎖抗体が挙げられ、これは、ヒト、マウス、ラット、ラクダ科動物またはウサギを含むが、これらに限定されない任意の哺乳類供給源に由来し得る。さらに、本明細書に開示される結合物の機能的部分、例えば、１つまたは複数のＣＤＲは、二機能性治療特性を持つ、または長期の血清半減期を有する、体内の特定の標的に向けられる治療剤を作出するために、第２のタンパク質または小分子に共有結合できることが意図される。当業者が認識するように、結合物は非タンパク質成分を含むことができる。本開示のいくつかのセクションでは、結合物の例は、「数字／文字／数字）」（例えば、２３Ｂ３）によって本明細書で命名され、いくつかの結合物は、さらなる文字／数字の組み合わせ（例えば、ＶＨ４）によって、さらに特定される。これらの場合では、正確な名前は特定の抗体を示す。すなわち、２３Ｂ３と命名された結合物は、２３Ｂ３ＶＨ４と命名された抗体とある程度の配列同一性を有し得るが、（本明細書で、これらが同じであると明確に教示されない限り）この抗体と同じではない。
「ＴＬ１Ａ結合物」は、ヒトＴＬ１Ａに特異的に結合する結合物、すなわち、ヒトＴＬ１Ａが標的抗原である、結合物である。
「ＴＮＦ−α結合物」は、ヒトＴＮＦ−αに特異的に結合する結合物、すなわち、ヒトＴＮＦ−αが標的抗原である、結合物である。
「抗原結合タンパク質」は、それが結合する別の分子（抗原）に強い親和性を有する抗原結合領域または抗原結合部分を含む、タンパク質またはポリペプチドを指す。抗原結合タンパク質は、抗体、ペプチボディ、抗体断片、抗体誘導体、抗体類似体、融合タンパク質、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含めた抗原受容体を包含する。
「抗体」（Ａｂ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体及び抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで生成され、骨髄腫によって増大したレベルで生成される。したがって、本明細書で使用する場合、用語「抗体」または「抗体ペプチド（複数化）」は、インタクトな抗体、特異的結合について本明細書で開示する抗体と競合する抗体、または特異的結合についてインタクトな抗体と競合するそれらの抗原結合性断片を指し、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体及び二重特異性抗体を含む。ある種の実施形態では、抗原結合性断片は、例えば組換えＤＮＡ法によって生成される。追加的な実施形態では、抗原結合性断片はインタクトな抗体の酵素的または化学的切断によって生成される。抗原結合性断片としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及び単鎖抗体が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「単離抗体」は、特定され、その天然環境の成分から分離及び／または回収された、抗体を指す。その天然環境の夾雑成分は、抗体にとって診断的または治療的使用を妨げると思われる物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含み得る。好ましい実施形態では、（１）ローリー法によって決定した場合に、抗体に関して９５重量％を超える、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシーケネーターを使用して、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分である程度まで、または（３）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用して、還元もしくは非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで、抗体は精製される。単離抗体は、組換え細胞内のインサイチュでの抗体を含み、これは、抗体の天然環境の少なくとも１種の成分が存在しないからである。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
用語「アゴニスト」は、別の分子の活性、活性化または機能を増大させる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、大分子または小分子（１０ｋＤ未満）を含めた任意の化合物を指す。
用語「アンタゴニスト」は、別の分子の活性、活性化または機能を低下させる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、大分子または小分子（１０ｋＤ未満）を含めた任意の化合物を指す。
抗原または他のポリペプチドの「結合（ｂｉｎｄ（ｉｎｇ））」という用語には、限定されないが、受容体への本発明のリガンドポリペプチドの結合、リガンドへの本発明の受容体ポリペプチドの結合、抗原またはエピトープへの本発明の抗体の結合、抗体への本発明の抗原またはエピトープの結合、抗イディオタイプ抗体への本発明の抗体の結合、リガンドへの本発明の抗イディオタイプ抗体の結合、受容体への本発明の抗イディオタイプ抗体の結合、リガンド、受容体または抗体などへの本発明の抗抗イディオタイプ抗体の結合が含まれる。
「二重特異性」抗原結合タンパク質は、第１の目的の標的分子に特異的に結合する第１の抗原結合タンパク質（例えば、抗体）と第２の目的の標的分子に特異的に結合する第２の抗原結合タンパク質（例えば、抗体）の両方に由来する結合物を有する分子である。二重特異性抗原結合タンパク質は、限定されないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含めた様々な方法によって、生成することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３１５−３２１（１９９０）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい。図１及び２に示す形式の分子は、本定義に従う二重特異性抗原結合タンパク質である。本定義内の二重特異性抗原結合タンパク質の様々なさらなる型式は、ＷＯ２０１４／１５９７２５、ＷＯ２０１３／０４１６８７、米国特許第８，９４５，５５３号、米国特許第８，９４５，５５３号、米国特許第８，２５８，２６８号、米国特許出願第２０１２／０１９５９００号、国際特許出願ＷＯ２０１２／０８８３０２、米国特許仮出願第６２／２１８，９７７号、Ｆｉｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｌｅｇｅｒ（２００７），Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４：３−１４、ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ２１（８）：３９１−７、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８−４４、Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１（１１）：６２１−３１、Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１０），Ｂｉｏｄｒｕｇｓ ２４（２）：８９−９８、Ｃｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｂａｔｙ（２００９），ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４１６１／ｍａｂｓ．１．６．１００１５、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１２），ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４１６１／ｍａｂｓ．４．２．１９０００、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−８、Ｓｐｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５），６７：９５−１０６，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｉｍｍ．２０１５．０１．００３、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−８、Ｓｐｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５），ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｉｍｍ．２０１５．０１．００３、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ，（１９９６），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：６１７、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ（２０１０），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１９６３７、Ｄａｖｉｓ（２０１０），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． ＆ Ｓｅｌ．２３：１９５、ＤｉＧｉａｍｍａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８９９：１４５，２０１２）、Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２１９：Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０８：１１１８７、Ｒｅｇｕｌａ ｅｔ ａｌ，米国特許出願第２０１０／０３２２９３４号、Ｂｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３：１６１０、米国特許出願第２０１１／００７６７２２号、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：８３８４に開示されており、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
用語「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する、抗原の部分を指す。したがって、用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ−細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基から成り、通常、特定の三次元構造特性及び特定の荷電特性を有する。より具体的には、本明細書で使用する場合、用語「ＩＬ−１７エピトープ」、「ＴＮＦ−αエピトープ」及び／または「ＴＮＦ−α／ｐ１９エピトープ」は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはマウスまたはヒトにおいて抗原性または免疫原性活性を有する、対応するポリペプチドの部分を指す。免疫原活性を有するエピトープは、動物において抗体反応を誘発する、例えば、ＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７ＦまたはＴＮＦ−α／ｐ１９ポリペプチドの部分である。抗原活性を有するエピトープは、当技術分野で周知である任意の方法によって、例えば、イムノアッセイ、プロテアーゼ消化、結晶解析法またはＨＩＤ交換によって確認する場合に、抗体が免疫特異的に結合する、例えば、ＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７ＦまたはＴＮＦ−α／ｐ１９ポリペプチドの部分である。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。そのようなエピトープは性質上直鎖状でもよく、または不連続なエピトープでもよい。したがって、本明細書で使用する場合、用語「立体構造エピトープ」は、連続した一連のアミノ酸以外の抗原のアミノ酸の間の空間的関係によって形成される、不連続なエピトープを指す。
用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子に実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドから成るタンパク質を指す。免疫グロブリンの１つの形態は、抗体の基本構造単位を構成する。この形態は四量体であり、免疫グロブリン鎖の２つの同一対から成り、各対は１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する。各対では、軽鎖及び重鎖の可変領域が抗原への結合に一緒に関与し、定常領域が抗体のエフェクター機能に関与する。
全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは約２１４アミノ酸）は、ＮＨ２−末端（約１１０アミノ酸）において可変領域遺伝子にコードされ、ＣＯＯＨ−末端においてカッパまたはラムダ定常領域遺伝子にコードされる。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄまたは約４４６アミノ酸）は、同様に、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）及び前述の他の定常領域遺伝子のうちの１つ（約３３０アミノ酸）にコードされる。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥと定義する。軽鎖及び重鎖内で、可変領域及び定常領域は、約１２個またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合しており、重鎖は、約１０個またはそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。（一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９）），Ｃｈａｐｔｅｒ７を参照されたい（すべての目的のために参照によりその全体が組み込まれる）。
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖可変領域は、３つの超可変領域によって中断されている「フレームワーク」領域から成る。したがって、用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する、抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））及び／または「高頻度可変ループ」由来のアミノ酸残基（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む（これらの両方とも、参照により本明細書に組み込まれる）。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。したがって、「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に同一（約８５％またはそれ以上、通常、９０〜９５％またはそれ以上）であるフレームワーク領域である。成分の軽鎖と重鎖の複合フレームワーク領域である、抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲの配置及び整列に役立つ。ＣＤＲは、主として、抗原のエピトープへの結合に関与する。したがって、用語「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域及び非ヒト（通常、マウスまたはラット）の免疫グロブリン由来の１つまたは複数のＣＤＲを含む免疫グロブリンを指す。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合は、これは、ヒト免疫グロブリン定常領域に実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％またはそれ以上同一でなければならない。したがって、おそらくＣＤＲを除いて、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分に実質的に同一である。さらに、最適な抗原−結合親和性及び特異性を保持するように、ヒトフレームワーク領域中の１つまたは複数の残基を、親配列に復帰変異させることができる。このようにして、親抗体の結合特性を保持しながら、その免疫原性を最小限にするために、非ヒト親抗体由来のある種のフレームワーク残基がヒト化抗体中に保持される。本明細書で使用する場合、用語「ヒトフレームワーク領域」は、そのような復帰変異を有する領域を含む。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖及びヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。例えば、ヒト化抗体は、上記で定義されたような典型的なキメラ抗体を包含しないと思われ、例えば、これは、キメラ抗体の可変領域の全体が非ヒトであるからである。
本明細書で使用する場合、用語「改変重鎖」は、免疫グロブリン重鎖、特にヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２重鎖及び機能的抗体断片（例えば、ＦａｂもしくはｓｃＦｖ）またはその一部（例えば、免疫グロブリン軽鎖もしくはＦｄ断片）を含み、該断片またはその一部が、そのＮ末端で、場合によりペプチドリンカーを介して重鎖のＣ末端に融合している、融合タンパク質を指す。
用語「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域及び非ヒト、例えば、マウス、ラットまたはウサギの免疫グロブリン由来の１つまたは複数のＣＤＲを含む免疫グロブリンを指す。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合は、これは、ヒト免疫グロブリン定常領域に実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％またはそれ以上同一でなければならない。したがって、おそらくＣＤＲ及びおそらくフレームワーク領域中の少数の復帰変異アミノ酸残基（例えば、１〜１５残基）を除いて、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分に実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖及びヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。例えば、ヒト化抗体は、上記で定義されたような典型的なキメラ抗体を包含しないと思われ、例えば、これは、キメラ抗体の可変領域の全体が非ヒトであるからである。
用語「ヒト抗体」及び「完全ヒト抗体」はそれぞれ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１つもしくは複数のヒト免疫グロブリンについて遺伝子組換えの動物から単離した抗体を含めた、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有し、内在性の免疫グロブリンを発現しない抗体、例えば、ＸＥＮＯマウス抗体及び米国特許第５，９３９，５９８号においてＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによって記載されているような抗体を指す。
用語「遺伝子改変抗体」は、アミノ酸配列が天然抗体のものから変えられた抗体を意味する。抗体の生成に組換えＤＮＡ法が関連するため、自然抗体で見出されるアミノ酸の配列に制限される必要はなく、所望の特性を得るように抗体を再設計することができる。考えられるバリエーションは多く、例えば可変性領域及び／または定常領域の１つだけまたは少数のアミノ酸を変更することから完全再設計の範囲にわたる。定常領域における変更は、一般に、補体結合、膜との相互作用及び他のエフェクター機能などの特性を向上させるまたは変化させるために行われる。可変領域における変更は、抗原結合特性を向上させるために行われる。
「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖並びに１つの重鎖のＣＨ１及び可変領域から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖及びＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間により多くの定常領域を含む１つの重鎖を含み、その結果、２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成することができる。
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの軽鎖及びＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に定常領域の一部を含む２つの重鎖を含み、その結果、２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。
用語「天然Ｆｃ」は、単量体形態であろうと多量体形態であろうと、全抗体の消化によって生じる非抗原結合性断片の配列を含む分子または配列を指す。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン供給源は好ましくはヒト起源のものであり、免疫グロブリンのうちのいずれかであってもよいが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４が好ましい。天然Ｆｃは、共有結合性結合（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有結合性結合によって二量体または多量体の形態に連結され得る単量体ポリペプチドで構成されている。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて、１〜４の範囲にわたる。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化によって生じるジスルフィド結合した二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１−９を参照されたい）。本明細書で使用する場合、用語「天然Ｆｃ」は、単量体形態、二量体形態及び多量体形態の総称である。
用語「Ｆｃ変異体」は、天然Ｆｃから改変されているが、サルベージ受容体、ＦｃＲｎに対する結合部位を依然として含む、分子または配列を指す。国際出願ＷＯ９７／３４６３１（１９９７年９月２５に公開）及びＷＯ９６／３２４７８は、例示的Ｆｃ変異体及びサルベージ受容体との相互作用を記載し、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化されている分子または配列を含む。さらに、天然Ｆｃは除去されてもよい部位含み、これは、こうした部位が本発明の融合分子に必要とされない構造的特徴または生物活性を提供するからである。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択宿主細胞との不適合性、（３）選択宿主細胞における発現時のＮ末端の不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすまたは関与する１つまたは複数の天然Ｆｃ部位または残基を欠く分子または配列を含む。Ｆｃ変異体は、以下に、さらに詳細に記載される。
用語「Ｆｃドメイン」は、上記で定義された、天然Ｆｃ及びＦｃ変異体の分子及び配列を包含する。Ｆｃ変異体及び天然Ｆｃと同様に、用語「Ｆｃドメイン」は、全抗体から消化されたか、他の方法で生成されたかに関わらず、単量体形態または多量体の分子を含む。
ＦｃドメインまたはＦｃドメイン含有分子に適用する場合、用語「多量体」は、共有結合的に、非共有結合的に、または共有結合的相互作用及び非共有結合的相互作用の両方によって結合した、２つ以上のポリペプチド鎖を有する分子を指す。ＩｇＧ分子は、一般的には、二量体を形成し、ＩｇＭは五量体を形成し、ＩｇＤは二量体を形成し、ＩｇＡは単量体、二量体、三量体または四量体を形成する。多量体は、Ｆｃの天然Ｉｇ供給源の配列、及び得られる活性を活用することによって、またはそのような天然Ｆｃを誘導体化（以下で定義される）することによって、形成することができる。
ＦｃドメインまたはＦｃドメイン含有分子に適用する場合、用語「二量体」は、共有結合的または非共有結合的に結合した２つのポリペプチド鎖を有する分子を指す。したがって、本発明の範囲内の例示的二量体は、図２に示す通りである。
用語「Ｆｖ断片」及び「単鎖抗体」は、重鎖と軽鎖の両方からの抗体可変領域を含むが、定常領域を欠くポリペプチドを指す。全抗体のように、これは、特定の抗原に選択的に結合することができる。分子量がわずか約２５ｋＤａであるので、Ｆｖ断片は、２つの重鎖タンパク質及び２つの軽鎖から成る一般的な抗体（１５０〜１６０ｋＤ）よりはるかに小さく、さらにＦａｂ断片（約５０ｋＤａ、１つの軽鎖及び半分の重鎖）よりも小さい。
「単一ドメイン抗体」は、単一ドメインＦｖユニット、例えば、ＶＨまたはＶＬから成る抗体断片である。全抗体のように、これは、特定の抗原に選択的に結合することができる。分子量がわずか１２〜１５ｋＤａであるので、単一ドメイン抗体は、２つの重鎖タンパク質及び２つの軽鎖から成る一般的な抗体（１５０〜１６０ｋＤａ）よりはるかに小さく、さらに、Ｆａｂ断片（約５０ｋＤａ、１つの軽鎖及び半分の重鎖）並びに単鎖可変断片（約２５ｋＤａ、２つの可変ドメイン、１つは軽鎖由来、１つは重鎖由来）よりも小さい。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物に見出される重鎖抗体から作り出された。単一ドメイン抗体の大抵の研究が、現在、重鎖可変ドメインに基づくが、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖に由来するナノボディが標的エピトープに特異的に結合することも示された。
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって生成される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物またはファージのクローンを含めた単一クローンに由来する抗体を指し、それが生成される方法を指すものではない。
いくつかの実施形態では、抗ＴＬ１Ａ結合ドメインが由来する抗ＴＬ１Ａ抗原結合タンパク質、二重特異性抗原結合タンパク質またはこれらのいずれかの機能的断片は、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドと比較して、ヒトＴＬ１Ａを選択的に阻害する。抗体またはその機能的断片は、特定の受容体の阻害アッセイにおける抗体のＩＣ５０が、別の「参照の」リガンドまたは受容体の阻害アッセイにおけるＩＣ５０よりも少なくとも５０倍低い場合に、他の受容体またはリガンドと比較して、特定の受容体またはリガンドを「選択的に阻害する」。「ＩＣ５０」は、生物学的または生化学的な機能の５０％阻害を達成するのに必要とされる用量／濃度である。放射性リガンドに関しては、ＩＣ５０は、放射性リガンドの特異的結合の５０％を置き換える競合リガンドの濃度である。任意の特定の物質またはアンタゴニストのＩＣ５０は、用量応答曲線を作成し、特定の機能アッセイにおいて、アゴニスト活性を反転させることに対する様々な濃度の薬物またはアンタゴニストの効果を調べることによって、決定することができる。ＩＣ５０値は、アゴニストの最大生物学的応答の半分を阻害するのに必要とされる濃度を決定することによって、所与のアンタゴニストまたは薬物について計算することができる。したがって、任意の抗ＴＬ１Ａ抗体またはその機能的断片のＩＣ５０値は、以下の実施例１４に記載されているアッセイなどの任意の機能アッセイにおいて、ヒトＴＬ１Ａ受容体を活性させる際のＴＬ１Ａの最大生物学的応答の半分を阻害するのに必要とされる抗体または断片の濃度を決定することによって、計算することができる。特定のリガンドまたは受容体を選択的に阻害する抗体またはその機能的断片は、リガンドまたは受容体に対する中和抗体または中和断片と理解される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＴＬ１Ａ結合ドメインが由来する抗ＴＬ１Ａ抗体またはその機能的断片は、ヒトＴＬ１Ａの中和抗体または断片である。
任意の抗ＴＬ１Ａ抗体またはその機能的断片の可変領域またはＣＤＲ領域は、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質のうちのいずれかの抗ＴＬ１Ａ結合物を構築するのに使用することができる。同様に、任意の抗ＴＮＦ−α抗体またはその機能的断片の可変領域またはＣＤＲ配列は、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質のうちのいずれかの抗ＴＮＦ−α結合物を構築するのに使用することができる。例えば、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＴＬ１Ａ結合ドメインは、その内容全体を参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８２０，７９８号、米国特許出願第２００８／０００３２２１号、米国特許第８，２６３，７４３号、米国特許出願第２０１１／０２１７３１０号、米国特許出願第２０１２／０２６３７１８号、米国特許出願第２０１４／０３０８２７１号、ＷＯ２０１２／１６１８５６、ＷＯ２０１３／０４４２９８、ＷＯ２００５／０１８５７１、米国特許出願第２０１４／０１２０１０９号、米国特許第６，５２１，４２２号、米国特許出願第２０１４／０２５５３０２号、及び米国特許出願第２０１５／０１３２３１１号に記載されている抗ヒトＴＬ１Ａ抗体のうちのいずれかのＶＨ及び／もしくはＶＬ領域または１つもしくは複数のＣＤＲを含むことができる。いくつかの実施形態では、抗ＴＬ１Ａ結合物が由来する抗ＴＬ１Ａ抗体は、今述べた参考文献のうちの１つに記載されているヒト抗ＴＬ１Ａ抗体の１つもしくは複数、または以下に記載のヒト抗ＴＬ１Ａ抗体の１つもしくは複数をクロスブロックする。用語「クロスブロックする（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋ）」、「クロスブロックされる（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｅｄ）」及び「クロスブロッキング（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）」は、本明細書で互換的に使用されて、標的（例えば、ヒトＴＬ１Ａ）への他の抗体または結合断片の結合を妨げる、抗体の能力を意味する。抗体または結合断片が、別のものが標的（例えば、ヒトＴＬ１Ａ）に結合するのを妨げることができる程度、したがって、クロスブロックすると言うことができるかどうかは、競合結合アッセイを使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、クロスブロッキング抗体またはその結合断片は、参照抗体のヒトＴＬ１Ａ結合を、約４０％から１００％、例えば約６０％から約１００％、特に好ましくは約７０％から１００％、さらに特に好ましくは約８０％から１００％低減する。クロスブロッキングを検出するのに特に適した定量的アッセイは、表面プラスモン共鳴技術を使用して相互作用の程度を測定するＢｉａｃｏｒｅ装置を使用する。別の適切な定量的クロスブロッキングアッセイは、抗体間の競合を、ヒトＴＬ１Ａへのその結合の点から測定するために、ＦＡＣＳベースのアプローチを使用する。そのようなクロスブロッキングに関する例示的アッセイは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１５／０１３２３１１号の実施例２の段落［０９２２］〜［０９２４］に見られる。
用語「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成される断片、並びにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用及びエキソヌクレアーゼ作用のうちのいずれかによって生成される断片などのポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのアルファ−鏡像異性型）または両方の組み合わせである単量体から成り得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分及び／またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に変化があり得る。糖修飾としては、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン及びアジド基との１つもしくは複数のヒドロキシル基の置き換えが挙げられ、または糖をエーテルもしくはエステルとして官能化することができる。さらに、糖部分全体を立体的及び電子的に類似した構造体、例えば、アザ糖及び炭素環糖類似体と置き換えることができる。塩基部分の修飾の例としては、アルキル化されたプリン及びピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジンまたは他の周知の複素環置換体が挙げられる。ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似型によって、核酸単量体を連結することができる。ホスホジエステル結合の類似型としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホルアミデートなどが挙げられる。用語「核酸分子」は、ポリアミド骨格に結合した天然に存在するまたは修飾された核酸塩基を含む、いわゆる「ペプチド核酸」も含む。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
用語「核酸分子の相補体」は、参照ヌクレオチド配列と比べた場合に、相補的ヌクレオチド配列及び逆配向を有する、核酸分子を指す。
用語「縮重ヌクレオチド配列」は、ポリペプチドをコードする参照核酸分子と比べた場合に、１つまたは複数の縮重コドンを含むヌクレオチド配列を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なるトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵ及びＧＡＣトリプレットは、それぞれＡｓｐをコードする）。
「単離核酸分子」は、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムＤＮＡから分離された、増殖因子をコードするＤＮＡ分子は、単離ＤＮＡ分子である。単離核酸分子の別の例は、生物のゲノムに組み込まれていない、化学合成された核酸分子である。特定の種から分離された核酸分子は、その種の染色体の完全なＤＮＡ分子よりも小さい。
「核酸分子コンストラクト」は、天然に存在しない配置で結合され、並べられた核酸のセグメントを含むようにヒトの介入によって改変された、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子である。
「相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）」は、逆転写酵素によってｍＲＮＡ鋳型から形成される一本鎖ＤＮＡ分子である。一般的には、ｍＲＮＡの一部に相補的なプライマーが逆転写の開始に用いられる。当業者は、そのような一本鎖ＤＮＡ分子及びその相補ＤＮＡ鎖から成る二本鎖のＤＮＡ分子を指すのにも用語「ｃＤＮＡ」を使用する。用語「ｃＤＮＡ」は、ＲＮＡ鋳型から合成されたｃＤＮＡ分子のクローンも指す。
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。一般的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位の近位にある、遺伝子の５’非コード領域に位置する。転写開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列を特徴とすることが多い。これらのプロモーターエレメントとしては、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化特異的エレメント（ＤＳＥ；ＭｃＧｅｈｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７：５５１（１９９３））、サイクリックＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、血清応答エレメント（ＳＲＥ；Ｔｒｅｉｓｍａｎ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．，１：４７（１９９０））、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）並びに他の転写因子の結合部位、例えば、ＣＲＥ／ＡＴＦ（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１９９３８（１９９２））、ＡＰ２（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：２５７２８（１９９４））、ＳＰ１、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ；Ｌｏｅｋｅｎ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．，３：２５３（１９９３））及びオクタマー因子が挙げられる（一般に、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．（１９８７）、及びＬｅｍａｉｇｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０３：１（１９９４））を参照されたい）。プロモーターが誘導性プロモーターである場合は、誘導剤に反応して転写速度が増大する。これに対して、プロモーターが構成的プロモーターである場合は、転写速度は誘導剤によって調節されない。抑制プロモーターも知られている。
「調節エレメント」は、コアプロモーターの活性をモジュレートするヌクレオチド配列である。例えば、調節エレメントは、特定の細胞、組織またはオルガネラにおいて排他的または優先的に転写を可能にする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含むことができる。これらのタイプの調節エレメントは、通常は、「細胞特異的」、「組織特異的」または「オルガネラ特異的」様式で発現する遺伝子と関係がある。
「エンハンサー」は、転写開始部位に対するエンハンサーの距離または配向を問わず、転写の効率を増大させるタイプの調節エレメントである。
「異種ＤＮＡ」は、所与の宿主細胞内に天然に存在しないＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の集団を指す。特定の宿主細胞に対して異種性のＤＮＡ分子は、宿主ＤＮＡが非宿主ＤＮＡ（すなわち、外来性ＤＮＡ）と結合してさえすれば、宿主細胞種に由来するＤＮＡ（すなわち、内在性ＤＮＡ）を含むことができる。例えば、転写プロモーターを含む宿主ＤＮＡセグメントに作動可能に連結されているポリペプチドをコードする非宿主ＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子である考えられる。逆に、異種ＤＮＡ分子は、外来性プロモーターと作動可能に連結されている内在性遺伝子を含むことができる。別の例示として、野生型細胞に由来する遺伝子を含むＤＮＡ分子は、そのＤＮＡ分子が野生型遺伝子を欠く変異細胞に導入される場合、異種ＤＮＡであると考えられる。
「発現ベクター」は、宿主細胞で発現される遺伝子をコードする核酸分子である。一般的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子及び転写ターミネータを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下に置かれ、そのような遺伝子は、プロモーター「に作動可能に連結されている」と言われる。同様に、調節エレメントがコアプロモーターの活性をモジュレートする場合、調節エレメント及びコアプロモーターは作動可能に連結されている。
「組換え宿主」は、異種核酸分子、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターを含む細胞である。本文脈では、組換え宿主の例は、発現ベクターから本発明のアンタゴニストを生成する細胞である。その一方、そのようなアンタゴニストは、前記アンタゴニストの「天然供給源」であり、且つ発現ベクターを欠く細胞によって生成され得る。
用語「アミノ末端」及び「カルボキシル末端」は、ポリペプチド内の位置を示すために、本明細書で使用される。文脈が許す場合、これらの用語は、近似または相対位置を示すために、ポリペプチドの特定の配列または部分に関して使用される。例えば、ポリペプチド内で参照配列に対してカルボキシル末端に位置するある配列は、参照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端にあるとは限らない。
「融合タンパク質」は、少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質である。例えば、融合タンパク質は、親和性マトリックスと結合するポリペプチドと融合したＩＬ−１７ＲＡポリペプチドの少なくとも一部を含むことができる。そのような融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーを使用して大量のＩＬ−１７Ａを単離する手段を提供する。
用語「受容体」は、「リガンド」と呼ばれる生理活性分子に結合する細胞関連タンパク質を示す。この相互作用は、細胞に対するリガンドの作用を伝える。受容体は、膜結合型、サイトゾル型または核型でもよく、単量体（例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、ベータ−アドレナリン受容体）または多量体（例えば、ＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリスロポエチン受容体及びＩＬ−６受容体）でもよい。膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン及び典型的にはシグナル伝達に関与する細胞内エフェクタードメインを含むマルチドメイン構造を特徴とする。ある種の膜結合受容体では、細胞外リガンド結合ドメイン及び細胞内エフェクタードメインは、完全な機能的受容体を含む別々のポリペプチドに位置する。一般に、受容体へのリガンドの結合が、受容体のコンホメーション変化をもたらし、これが、細胞中のエフェクタードメインと他の分子（複数可）の間の相互作用を引き起こし、次にこれが、細胞の代謝を変化させる。受容体−リガンド相互作用に関連付けられることが多い代謝イベントとしては、遺伝子の転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックＡＭＰ生成の増大、細胞性カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解及びリン脂質の加水分解が挙げられる。
用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。例えば、構造遺伝子の場合には、発現は、ｍＲＮＡへの構造遺伝子の転写及び１つまたは複数のポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を含む。
用語「相補体／抗相補対」は、適切な条件下で非共有結合的に結合した安定な対を形成する、同一でない部分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン（またはストレプトアビジン）は、相補／抗相補体対のプロトタイプのメンバーである。他の例示的相補体／抗相補体対としては、受容体／リガンド対、抗体／抗原（またはハプテンまたはエピトープ）対、センス／アンチセンスポリヌクレオチド対などが挙げられる。相補体／抗相補体対のその後の解離が望ましい場合は、相補体／抗相補体対は、好ましくは１０９Ｍ−１未満の結合親和性を有する。
「検出可能な標識」は、抗体部分にコンジュゲートして、診断に有用な分子を生成することができる、分子または原子である。検出可能な標識の例としては、キレート剤、光活性薬剤、放射性同位体、蛍光性薬剤、常磁性イオンまたは他のマーカー部分が挙げられる。
用語「アフィニティータグ」は、第２のポリペプチドに結合して、第２のポリペプチドの精製または検出をもたらす、または基質への第２のポリペプチドの結合に対する部位をもたらすことができるポリペプチドセグメントを示すために、本明細書で使用される。原則的に、抗体または他の特異的結合剤が利用可能な任意のペプチドまたはタンパク質をアフィニティータグとして使用することができる。アフィニティータグとしては、ポリヒスチジントラクト、プロテインＡ（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，４：１０７５（１９８５）、Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８：３（１９９１））、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ， ６７：３１（１９８８））、Ｇｌｕ−Ｇｌｕアフィニティータグ（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：７９５２（１９８５））、サブスタンスＰ、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド（Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４（１９８８））、ストレプトアビジン結合ペプチド、または他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインが挙げられる。一般に、Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２：９５（１９９１）を参照されたい。アフィニティータグをコードするＤＮＡ分子は、商業的供給業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）から入手可能である。
用語「酸性残基」は、酸性基を含む側鎖を有するアミノ酸残基を指す。例示的酸性残基としては、Ｄ及びＥが挙げられる。
用語「アミド残基」は、酸性基のアミド誘導体を含む側鎖を有するアミノ酸を指す。例示的残基としては、Ｎ及びＱが挙げられる。
用語「芳香族残基」は、芳香族基を含む側鎖を有するアミノ酸残基を指す。例示的芳香族残基としては、Ｆ、Ｙ及びＷが挙げられる。
用語「塩基性残基」は、塩基性基を含む側鎖を有するアミノ酸残基を指す。例示的塩基性残基としては、Ｈ、Ｋ及びＲが挙げられる。
用語「親水性残基」は、極性基を含む側鎖を有するアミノ酸残基を指す。例示的親水性残基としては、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｎ及びＱが挙げられる。
用語「非官能性残基」は、酸性基、塩基性基または芳香族基を欠く側鎖を有するアミノ酸残基を指す。例示的非機能性アミノ酸残基としては、Ｍ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ及びノルロイシン（Ｎｌｅ）が挙げられる。
Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤのＥＵインデックス及びＡＨｏナンバリング方式（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２００１），Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．８；３０９（３）：６５７−７０）の両方を、本発明で使用することができる。いずれかのシステムを使用して、所与の抗体のアミノ酸の位置並びにＣＤＲ及びＦＲを特定することができる。例えば、ＥＵの重鎖位置３９、４４、１８３、３５６、３５７、３７０、３９２、３９９及び４０９は、ＡＨｏの重鎖位置４６、５１、２３０、４８４、４８５、５０１、５２８、５３５及び５５１と等しい。同様に、ＥＵの軽鎖位置３８、１００及び１７６は、それぞれ、ＡＨＯの軽鎖位置４６、１４１及び２３０と等しい。以下の表（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、例えば、ＩｇＧ−Ｆａｂ二重特異性抗原結合タンパク質の正確なアセンブリーを支援するために、電荷位置のｖ１、ｖ２及びｖ３バージョンに対するナンバリング位置間の同等性を示す。
Figure 2019502692
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本発明の二重特異性抗原結合タンパク質型式
本発明の一態様は、新規なＴＬ１Ａ特異的な抗原結合タンパク質及び抗体に関する。そのような抗体は、ＴＬ１Ａの生物活性の阻害による治療に適している当技術分野で既知の及び以下で本明細書に記載される状態を治療するのに有用である。
本発明の別の態様は、１つの軽鎖−重鎖対がＴＬ１Ａに特異的に結合し、別の軽鎖−重鎖対がＴＮＦ−αに結合する、二重特異性抗原結合タンパク質に関する。そのような二重特異性抗原結合タンパク質は、全抗体（図１を参照されたい）またはＦ（ａｂ’）２断片であり得る。本発明のこの態様では、ＴＬ１Ａ結合物はＴＬ１Ａに対して一価であり、ＴＮＦ−α結合物はＴＮＦ−αに対して一価である。
別の二重特異性抗原結合タンパク質の実施形態では、ＴＬ１Ａ結合物及びＴＮＦ−α結合物は、ＩｇＧ−ｓｃＦｖと本明細書で言及する全体構造で配置される。本実施形態では、第１の結合物は、抗体の構造、すなわち、免疫グロブリン鎖の２つの対を有する（各対は、１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する）。第２の結合物は、１対のＦｖユニットの構造を含み、すなわち、対の各メンバーが、単鎖として直列に連結した、重鎖由来の可変ドメイン及び軽鎖由来の可変ドメインを有する。ＩｇＧ−ｓｃＦｖ構成では、各Ｆｖユニットは、第１の結合物の重鎖定常ドメイン（Ｆｃ）のＣ末端に共有結合している（図２を参照されたい）。各Ｆｖユニットは、第１の結合物のＦｃドメインに直接的にまたはリンカーを介して連結することができる。本発明のこの実施形態では、各結合物は、その標的抗原に対して二価である。好ましい実施形態では、ＴＬ１Ａ結合物は抗体の構造を有し、ＴＮＦ−α結合物は１対のＦｖユニットの構造を有する。
本発明は、さらに、正確な重鎖−重鎖及び重鎖−軽鎖対形成を支援する変異を有する二重特異性抗体に関する。そのような変異は、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，５９２，５６２、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２００６／１０６９０５、ＷＯ２０１４／４０８２１７９、ＷＯ２０１４／０８１９５５、Ｓｐｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５），ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｉｍｍ．２０１５．０１．００３に記載されている。
本発明は、さらに、当技術分野で既知の他の二重特異性抗原結合タンパク質型式で配置されるＴＬ１Ａ結合物及びＴＮＦ−α結合物に関する。特に、本発明は、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／１５９７２５、ＷＯ２０１３／０４１６８７、米国特許第８，９４５，５５３号、米国特許第８，９４５，５５３号、米国特許第８，２５８，２６８号、米国特許出願第２０１２／０１９５９００号、国際特許出願ＷＯ２０１２／０８８ ３０２、米国特許仮出願第６２／２１８，９７７号、Ｆｉｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｌｅｇｅｒ（２００７），Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４：３−１４、ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ２１（８）：３９１−７、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８−４４、Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１（１１）：６２１−３１、Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１０），Ｂｉｏｄｒｕｇｓ ２４（２）：８９−９８、Ｃｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｂａｔｙ（２００９），ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４１６１／ｍａｂｓ．１．６．１００１５、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１２），ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４１６１／ｍａｂｓ．４．２．１９０００、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−８、Ｓｐｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５），ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｉｍｍ．２０１５．０１．００３、２００９年７月１６日に公開されたＷＯ２００９／０８９００４、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−８、Ｓｐｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５），ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｉｍｍ．２０１５．０１．００３、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ，（１９９６），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：６１７、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ（２０１０），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１９６３７、Ｄａｖｉｓ（２０１０），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ． ＆ Ｓｅｌ．２３：１９５、ＤｉＧｉａｍｍａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８９９：１４５，２０１２）、Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２１９：Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０８：１１１８７、Ｒｅｇｕｌａ ｅｔ ａｌ，米国特許出願第２０１０／０３２２９３４号、Ｂｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３：１６１０、米国特許出願第２０１１／００７６７２２号、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：８３８４に記載されている形式のＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−α結合物に関する。
好ましい実施形態
抗原結合タンパク質及び結合物のアミノ酸配列は、好ましくは、ＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αに対するヒト及び／またはヒト化のモノクローナル抗体の配列に基づく。本発明は、以下に記載される好ましい配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列も含む。以下の表に示されるアミノ酸配列は、任意の形式の二重特異性抗原結合タンパク質を含めた本発明の抗原結合タンパク質にとって好ましい。
ＴＬ１Ａ特異的な抗原結合タンパク質
ＴＬ１Ａ特異的な抗原結合タンパク質及び抗原結合物は、好ましくは、本明細書に開示される好ましいＴＬ１Ａ抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。表Ａは、それらが由来した好ましい抗体と並んで、好ましいＣＤＲ配列を示す。全体を通して、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は軽鎖ＣＤＲを指し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は重鎖ＣＤＲを指す。全体を通して、各配列に対する配列識別番号（配列番号）は、表の配列の後の括弧内に示す。
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前述の配列のそれぞれは、配列表のその直前の核酸配列にコードされる。全体を通して、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３由来の配列が好ましい。
本発明の抗原結合タンパク質では、異性化部位を避けるのが好ましい。２アミノ酸配列のＤＧ、ＤＨ、ＤＳ及びＤＴは、既知の異性化部位である。本発明は、ＣＤＲの配列を含めた供給源抗体配列が異性化部位を排除するように改変されている、抗原結合タンパク質にも関する。それを考慮して、本発明は、ＨＣＤＲ２が、配列ＶＩＳＹＤＸＮＮＫＬＹＴＤＸＶＫＧ（配列番号２０４）を有する、供給源抗体３Ｃ６由来のＨＣＤＲ２の改変形態であり、各Ｘが、独立に、Ｇ、Ｈ、ＳまたはＴ以外の残基（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、ＷまたはＹ）であり、Ａが好ましい、抗原結合タンパク質に関する。本発明は、さらに、ＨＣＤＲ２が供給源抗体３Ｃ６由来のＨＣＤＲ２の改変形態であり、ここでは、異性化部位を除去して配列ＶＩＳＹＥＧＮＮＫＬＹＴＥＳＶＫＧ（配列番号６７８）を生じるように酸性残基ＤがＥと置き換えられている、抗原結合タンパク質に関する。本発明は、さらに、ＨＣＤＲ３が、配列ＥＤＧＤＸＹＹＲＹＧＭＤＶ（配列番号６７６）を有する、供給源抗体２３Ｂ３由来のＨＣＤＲ３の改変形態である、抗原結合タンパク質に関する。本発明は、さらに、酸性残基ＤをＥと置き換えることによって供給源抗体２３Ｂ３由来のＨＣＤＲ３の異性化部位が除去され、配列ＥＥＧＥＳＹＹＲＹＧＭＤＶ（配列番号６５７）を生じる、抗原結合タンパク質に関する。
本発明の抗原結合タンパク質では、脱アミド部位を避けることが好ましい。２アミノ酸配列のＮＧ、ＮＨ、ＮＳ及びＮＴは既知の脱アミド部位である。本発明は、ＣＤＲの配列を含めた供給源抗体配列が、脱アミド部位を排除するように改変されている、抗原結合タンパク質にも関する。脱アミド部位を排除するための１つの方法は、部位ＮＧ、ＮＨ、ＮＳ及びＮＴの第２のアミノ酸残基をＧ、Ｈ、Ｓ、またはＴ以外の残基（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、またはＹ）と置き換えることである。脱アミド部位を排除するための好ましい方法は、ＮＧ、ＮＨ、ＮＳ及びＮＴのＮをＱと置き換えることである。それを考慮して、本発明は、表Ａに列挙されるものに加えて、以下の配列を有する抗原結合タンパク質に関する。
ＬＣＤＲ３は、供給源抗体３Ｃ６由来の配列の改変に基づく配列ＬＱＨＱＳＹＰＰＴ（配列番号６３１）を有し得る。
ＨＣＤＲ１は、供給源抗体２３Ｂ３ＶＨ４由来の配列の改変に基づく配列ＴＱＳＶＡＷＮ（配列番号６３２）を有し得る。
ＨＣＤＲ２は、それぞれ供給源抗体９Ｃ８及び３Ｂ３由来の配列の改変に基づく、配列ＹＩＹＹＳＧＱＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号６３３）またはＥＩＱＨＡＧＱＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号６７７）を有し得る。
本発明の抗原結合タンパク質は、さらに、酸性残基の別の酸性残基との置換、アミド残基の別のアミド残基との置換（芳香族残基、塩基性残基、親水性残基、非官能性残基、中性極性残基及び極性疎水性残基についても同様である）から生じ得る。供給源抗体のＣＤＲの非官能性残基のそのような置換は、各Ｘが独立に、Ｍ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ，またはＬである、表Ｂに示す本発明の配列をもたらす。
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表Ａに示す抗体に関連するＣＤＲ生殖系列配列を含む抗原結合タンパク質も好ましい。そのような配列を表Ｃに示す。
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表Ｄに示すように、好ましい抗ＴＬ１Ａ抗体の可変ドメイン配列を含む抗原結合タンパク質がさらに好ましい。全体を通して、表Ｄに示すような「ＶＨ」は重鎖の可変ドメインを指し、「ＶＬ」は軽鎖の可変ドメインを指す。本発明内の分子は、安定性もしくは他の機能性またはホットスポットの除去のために、トランケーションまたは置換を含めた改変を表Ｄに示す配列に組み込むことができる（アミノ酸の化学的または物理的改変）。表Ｄに示す配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する分子も本発明内に含まれる。
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前述のポリペプチドのそれぞれは、配列表のポリペプチド配列の直前のヌクレオチド配列を有する核酸にコードされる。抗体９Ｃ８及び３Ｂ３由来の配列が好ましい。
表Ｅに示す完全な抗ＴＬ１Ａ抗体配列が、抗ＴＬ１Ａ抗体にとって好ましい。ＬＣは抗体軽鎖を指し、ＨＣは重鎖を指す。表Ｅの軽鎖及び重鎖配列のいずれかまたは両方と少なくとも９０％の配列同一性を有する分子も本発明内に包含される。
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表Ｅのアミノ酸配列のそれぞれは、配列表中のその直前の核酸配列にコードされる。抗体９Ｃ８及び３Ｂ３由来の配列が好ましい。
前述の抗ＴＬ１Ａ抗体配列は、本明細書に記載のいずれか形式の二重特異性抗原タンパク質で使用することができる。好ましくは、そのような配列は、本明細書で記載されるヘテロＩｇ抗原結合タンパク質及びＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗原結合タンパク質で使用される。
ヘテロＩｇ二重特異性抗原結合タンパク質
本発明は、ＴＬ１Ａ特異的結合物を含む、図１に示すヘテロＩｇ二重特異性抗原結合タンパク質にさらに関する。構造的に、ヘテロＩｇ二重特異性抗原結合タンパク質は、以下を含む。
（ａ）ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメイン、異なる抗原（例えば、ＴＮＦ−α）に対する重鎖可変ドメイン及び異なる抗原に対する結合物の軽鎖可変ドメインとは別の軽鎖に含まれた、ＴＬ１Ａ結合物の軽鎖可変ドメイン、
（ｂ）ＴＬ１Ａ結合物の軽鎖可変ドメイン、異なる抗原に対する重鎖可変ドメイン及び異なる抗原に対する軽鎖可変ドメインとは別の重鎖に含まれた、ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメイン、
（ｃ）前記異なる抗原に対する軽鎖ドメイン、ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメイン及びＴＬ１Ａ結合物の軽鎖可変ドメインとは別の重鎖に含まれた、異なる抗原に対する重鎖可変ドメイン、
（ｄ）ＴＬ１Ａ結合物の軽鎖可変ドメインを含む軽鎖に共有結合している、ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメインを含む重鎖、
（ｅ）異なる抗原に対する軽鎖可変ドメインを含む軽鎖に共有結合している、前記異なる抗原に対する重鎖可変ドメインを含む重鎖、並びに
（ｆ）異なる抗原に対する重鎖可変ドメインを含む重鎖に共有結合している、ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメインを含む重鎖。
そのようなヘテロＩｇ二重特異性抗体については、表Ａに列挙されるＣＤＲの１つまたは複数を含むために、ＴＬ１Ａ特異的結合物が好ましい。表Ｄの可変領域ドメインを用いることができるが、ＴＬ１Ａ結合物が、ヘテロＩｇ二重特異性抗原結合タンパク質の正確なアセンブリーを助ける荷電アミノ酸を含むことが好ましい（図１を参照されたい）。ヘテロＩｇ二重特異性抗体にとって好ましい可変領域配列を表Ｆに示す。前の場合と同様に、表ＦのＶＬは軽鎖可変領域を指し、ＶＨは重鎖可変領域を示す。配列表の配列番号を表Ｆの各配列の後に示す。
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表Ｆのポリペプチドのそれぞれは、配列表のポリペプチド配列の直前の配列を有する核酸にコードされる。
ＴＮＦ特異的結合物を有する、好ましくはＴＬ１Ａ特異的結合物をともなうヘテロＩｇＧ分子は、本発明の範囲内である。ＴＮＦ特異的結合物は、好ましくは、抗体３．２（以下に記載）、２３４（以下に記載）、セルトリズマブ、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ及び参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２８５，２６９号に開示されている抗体のＣＤＲまたは可変ドメインの１つまたは複数の配列を含む。本明細書全体を通して、「セルトリズマブ」は、セルトリズマブペゴルに由来する可変領域配列を有する抗体を指す。そのようなＣＤＲに基づく好ましい配列を表Ｇに示す。
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表Ｇのポリペプチドのそれぞれは、配列表のポリペプチドの配列の直前の配列を有する核酸にコードされる。表Ｇの配列は、任意の二重特異性抗原結合タンパク質型式、好ましくはヘテロＩｇまたはＩｇＧ−ｓｃＦｖ型式で、及び好ましくはＴＬ１Ａ抗原結合物とともに使用することができる。
二重特異性抗原結合タンパク質のＴＮＦ結合物は、より好ましくは、選択された抗ＴＮＦ抗体の可変領域の配列を含む。そのような可変領域の配列を表Ｈに記載する。前の場合と同様に、ＶＬは軽鎖の可変領域を指し、ＶＨは重鎖の可変領域を指す。本発明は、さらに、表Ｈに示す配列のいずれかに少なくとも約９０％同一である配列を有する分子を包含する。
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前述のポリペプチドのそれぞれは、配列表のポリペプチド配列の直前のヌクレオチド配列を有する核酸にコードされる。
好ましい抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦヘテロＩｇＧ二重特異性抗体を表Ｉに示す。ヘテロＩｇ分子の名称は、ヘテロＩｇ分子を構築するのに使用される親抗体に対する前述の名称に基づく。例えば、「セルトリズマブ／３Ｂ３変異体」と命名された分子は、本明細書でセルトリズマブ及び３Ｂ３変異体と命名された抗体由来の配列を有するポリペプチドを用いる。前の場合と同様に、ＶＬは軽鎖の可変領域を指し、ＶＨは重鎖の可変領域を指す。そのような分子は、「Ｃクランプ」、すなわち、安定化のためにさらなるジスルフィド結合をもたらすように配列中に置換されたシステイン分子を含むことができる。そのようなシステイン置換は、好ましくは、Ｋａｂａｔのナンバリング方式においてＶＨの位置４４及びＶＬの１００のＶＬ−ＶＨ境界面に導入される。安定性のために、または他の機能性を導入するために、さらなる置換を行うことができる。本発明の実施形態は、表Ｉに示す配列のいずれかに少なくとも９０％の配列同一性を有する分子を含む。
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前述のポリペプチドのそれぞれは、配列表のポリペプチドのアミノ酸配列の直前のヌクレオチド配列を有する核酸にコードされる。
表Ｊは、本発明による好ましいヘテロＩｇ二重特異性抗原結合タンパク質の完全な軽鎖及び重鎖配列を列挙する。列挙される配列は、列挙される組み合わせであるかどうかを問わず、すべてのヘテロＩｇ分子にとって好ましい。列挙される組み合わせがさらに好ましい。分子名中の「Ｖａｒ」は変異体を指す。そのような分子は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年７月１６日に公開されたＷＯ２００９／０８９００４に記載されているように、アセンブリーを助けるための電荷変異体を含むことができる。
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前述のポリペプチドのそれぞれは、表Ｊ−１に記載される場合を除いて、配列表のポリペプチドのアミノ酸配列の直前のヌクレオチド配列を有する核酸にコードされる。
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ＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗原結合タンパク質
ＩｇＧ−ｓｃＦｖ抗原結合タンパク質は、図２に示す構造を有する。そのような分子は、抗体の重鎖及び軽鎖（分子のＩｇＧ部分）を含み、これは、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子の第１の抗原結合物を含む。そのような分子は、ｓｃＦｖ、すなわち、第２の抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを１つの鎖内に有する融合タンパク質をさらに含む。分子のこのｓｃＦｖ部分は、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子の第２の抗原結合物を含む。ｓｃＦｖ部分は、分子のＩｇＧ部分の各重鎖に融合している。
本明細書では、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ抗原結合タンパク質は、抗ＴＬ１Ａ結合物、特に、上記の抗ＴＬ１Ａ結合物のアミノ酸配列を含む。好ましいＩｇＧ−ｓｃＦｖ抗原結合タンパク質は、表Ａ、Ｂ及びＣに記載されている抗ＴＬ１Ａ ＣＤＲの配列を含み、表Ａのものが最も好ましい。より好ましいＩｇＧ−ｓｃＦｖ抗原結合タンパク質は、表Ｄの抗ＴＬ１Ａ可変ドメイン配列を含む。表Ｅの完全な抗体配列を有するＩｇＧ−ｓｃＦｖ抗原結合タンパク質も好ましい。
本明細書は、さらに、抗ＴＮＦ−α抗原結合物を含む、好ましくは表Ｇに記載されているＣＤＲ配列を含む、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子に関する。表Ｈに記載されている抗ＴＮＦ−α可変ドメインの配列を含むＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子がさらに好ましい。表Ｋに記載されている抗ＴＮＦ−α抗体の完全なアミノ酸配列を含むＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子がさらに好ましい。
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表Ｋのアミノ酸配列のそれぞれは、配列表中のその直前の核酸配列にコードされる。
ある種の実施形態では、ＩｇＧ部分の重鎖は、ペプチドリンカーを介してｓｃＦｖ部分と融合している。ある種の実施形態では、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）６及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６から成る群から選択される配列を含む。
表Ｌ及びＭに開示されている重鎖及び軽鎖配列を有するＩｇＧ−ｓｃＦｖ抗原結合タンパク質がさらに好ましい。表Ｌ及びＭの重鎖配列は、分子のＩｇＧ部分の重鎖に融合した、分子のＳｃＦｖ部分を含む。これらの表の左列の分子名では、第１の抗体の名前は、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子が言及される抗体の完全な重鎖及び軽鎖配列を含むように分子のＩｇＧ部分を特定する。第２の抗体の名前は、重鎖配列が上記で開示した重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン配列を含むように分子のＳｃＦｖ部分を特定する。したがって、「アダリムマブＩｇＧ−９Ｃ８ ｓｃＦｖ」は、抗体９Ｃ８の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインに融合した、アダリムマブの軽鎖及びアダリムマブの重鎖を含む。表Ｌ及びＭの分子名の「ＣＣ」はシステインクランプを指し、その名称にＣＣを含む分子は、さらなるシステインジスルフィド結合を有するように改変されている。そのようなシステイン置換は、好ましくは、Ｋａｂａｔのナンバリング方式でＶＨの位置４４及びＶＬの１００のＶＬ−ＶＨ境界面に導入される。表Ｌの「Ｖａｒ」は、変異体を意味する。
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表Ｌのポリペプチドのそれぞれは、配列表のポリペプチド配列の直前のヌクレオチド配列を有する核酸にコードされる。
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表Ｍのポリペプチドのそれぞれは、配列表のポリペプチド配列の直前のヌクレオチド配列を有する核酸にコードされる。
ＩｇＧ−Ｆａｂ二重特異性抗原結合タンパク質
ＩｇＧ−Ｆａｂ型式では、二重特異性の多価抗原結合タンパク質は、（ｉ）第１の抗体由来の第１の重鎖（ＶＨ２−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む第１のポリペプチドであって、改変重鎖を形成するために、第１の重鎖が、そのカルボキシル末端で（場合により、ペプチドリンカーを介して）第２の抗体のＶＨ２−ＣＨ１ドメインを含むポリペプチドに融合している、第１のポリペプチド、（ｉｉ）第１の抗体由来の軽鎖（ＶＬ１−ＣＬ）を含む第２のポリペプチド、及び（ｉｉｉ）第２の抗体のＶＬ２−ＣＬドメインを含む第３のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第１と第２のポリペプチドの間で、第１の抗体のＣＬ及びＣＨ１ドメインをスイッチする（「スワップする」）ことができる。そのような実施形態では、第２のポリペプチドはＶＬ１−ＣＨ１を含み、一方で第１のポリペプチドは、ＶＨ１−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ２−ＣＨ１を含み、ＶＨ１−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３は、場合によりペプチドリンカーを介してそのＣ末端でＶＨ２−ＣＨ１に融合している。第３のポリペプチドはＶＬ２−ＣＬを含む。あるいは、いくつかの実施形態では、第１と第３のポリペプチドの間で、第２の抗体のＣＬ及びＣＨ１ドメインをスイッチすることができる。そのような実施形態では、第３のポリペプチドはＶＬ２−ＣＨ１を含み、一方で第１のポリペプチドは、ＶＨ１−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ２−ＣＬを含み、ここでは、ＶＨ１−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ１は場合によりペプチドリンカーを介してそのＣ末端でＶＨ２−ＣＬに融合している。第２のポリペプチドはＶＬ１−ＣＬを含む。さらに別の実施形態では、両方の抗体のＣＬ及びＣＨ１ドメインは、第１と第２と第３のポリペプチドの間でスイッチされる。そのような実施形態では、第１のポリペプチドはＶＨ１−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ２−ＣＬを含み、ＶＨ１−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３は、場合により、そのＣ末端でＶＨ２−ＣＬに融合しており、第２のポリペプチドはＶＬ１−ＣＨ１を含み、第３のポリペプチドはＶＬ２−ＣＨ１を含む。第１の抗体がＴＬ１Ａ結合物を含み、第２の抗体がＴＮＦ−α結合物を含むそのようなＩｇＧ−Ｆａｂ分子は、本発明の範囲内である。同様に、第１の抗体がＴＮＦ−α結合物を含み、第２の抗体がＴＬ１Ａ結合物を含むそのようなＩｇＧ−Ｆａｂ分子も本発明の範囲内である。最後の２つのセンテンスと同じ意味を持つ表現は、第１の抗体がＴＬ１Ａ結合物またはＴＮＦ−α結合物の１つを含み、第２の抗体がもう１つを含む、である。
本発明内のＩｇＧ−Ｆａｂ型式の一態様では、二重特異性の四価抗原結合タンパク質は、ａ）第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第１の重鎖が、そのＣ末端を介して第２の抗体の第２の重鎖（ＶＨ２）を含む部分のＮ末端に融合しており、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合する第１の抗体の第１の重鎖（ＶＨ１）、ｂ）ａ）の第１の抗体の２つの軽鎖、及びｃ）ａ）の第２の抗体の２つの軽鎖を含む。本発明内では、第１の抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合することができ、第２の抗体はＴＮＦ−αに特異的に結合することができ、または逆もまた同様である。
本発明内のＩｇＧ−Ｆａｂ型式の別の態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、（ｉ）第１の軽鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＬ１）及び第１の重鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＨ１）を含む、第１の抗原に特異的に結合する第１の結合ドメイン、（ｉｉ）第２の軽鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＬ２）及び第２の重鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＨ２）を含む、第２の抗原に特異的に結合する第２の結合ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンＦｃ領域を含み、ここでは、結合ドメインの１つがＦｃ領域のアミノ末端に位置し、もう１つの結合ドメインがＦｃ領域のカルボキシル末端に位置し、カルボキシル末端結合ドメインがＦａｂであり、ペプチドリンカーを介してＦｃ領域のカルボキシル末端に融合しており、ＦａｂがＦａｂのＶＨ領域のアミノ末端を介してＦｃ領域に融合している。本発明内では、第１の抗原はＴＬ１Ａでもよく、第２の抗原はＴＮＦ−αでもよく、または逆もまた同様である。
ＩｇＧ−Ｆａｂ型式の別の態様では、二重特異性の四価抗原結合タンパク質は、以下を含む。
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第１の重鎖が、そのＣ末端を介して第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に融合しており、ＶＨ２が、そのＣ末端を介して第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に融合しており、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合し、以下のｉ）、ｉｉ）である、第１のポリペプチド。
ｉ）ＶＨ１または第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３から成る群から選択される残基に荷電した（例えば、正に荷電した）アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
ｉｉ）ＶＨ２または第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３に対応する残基から成る群から選択される残基に荷電した（好ましくは上記のｉ）のものと逆に荷電した）アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここでは、電荷は、第１の重鎖のＶＨ１または第１のＣＨ１の置換される残基の逆である。
ｂ）ａ）の第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、第１の軽鎖が第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、位置３８の電荷が、位置３９の、第１の重鎖のＶＨ１または第１のＣＨ１の置換される残基の逆であり、位置１００の電荷が、位置４４の、第１の重鎖のＶＨ１または第１のＣＨ１の置換される残基の逆であり、位置１７６の電荷が、位置１８３の、第１の重鎖のＶＨ１または第１のＣＨ１の置換される残基の逆である、第２のポリペプチド。
ｃ）ａ）の第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、第２の軽鎖が第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、ＶＬ２または第２のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、位置３８の電荷が、位置３９の、第２の重鎖のＶＨ２または第２のＣＨ１の置換される残基の逆であり、位置１００の電荷が、位置４４の、第２の重鎖のＶＨ２または第２のＣＨ１の置換される残基の逆であり、位置１７６の電荷が、位置１８３の、第２の重鎖のＶＨ２または第２のＣＨ１の置換される残基の逆である、第３のポリペプチド。
本発明内では、上記の副段落ａ）の第１の抗原はＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αの１つでもよく、第２の抗原はもう１つでもよい。この同じ結合特異性を述べる別の方法は、副段落ａ）の第１の抗体がＴＬ１Ａ結合物またはＴＮＦ−α結合物の１つを含み、第２の抗体がもう１つを含むと、述べることである。
カルボキシル末端結合ドメインがＦａｂ断片である本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のいくつかの実施形態では、Ｆｃ領域のアミノ末端（すなわち、アミノ末端結合ドメイン）に位置する結合ドメインもＦａｂ断片である。アミノ末端のＦａｂ断片を、本明細書に記載のペプチドリンカーまたは免疫グロブリンヒンジ領域を介して、Ｆｃ領域のアミノ末端に融合させることができる。いくつかの実施形態では、アミノ末端のＦａｂ断片は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域を介して、Ｆｃ領域のアミノ末端に結合している。他の実施形態では、アミノ末端のＦａｂ断片は、ヒトＩｇＧ２のヒンジ領域を介して、Ｆｃ領域のアミノ末端に結合している。一実施形態では、アミノ末端のＦａｂ断片は、ＦａｂのＣＨ１領域のカルボキシル末端を介して、Ｆｃ領域に融合している。
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、第１の標的に特異的に結合する第１の抗体を含み、この場合、第２の標的に特異的に結合する第２の抗体由来のＦａｂ断片の１つのポリペプチド鎖（例えば、重鎖（ＶＨ２−ＣＨ１））は、第１の抗体の重鎖のカルボキシル末端に融合している。そのような実施形態の二重特異性抗原結合タンパク質は、第２の抗体由来のＦａｂ断片のもう半分（例えば、軽鎖（ＶＬ２−ＣＬ））を含むポリペプチド鎖も含む。この型式を「ＩｇＧ−Ｆａｂ」型式と本明細書で言及し、このタイプの分子の一実施形態を模式的に図２５に示す。したがって、ある種の実施形態では、本発明は、二重特異性の多価抗原結合タンパク質を含み、これは、（ｉ）第１の抗体由来の軽鎖、（ｉｉ）改変重鎖を形成するために、重鎖が、そのカルボキシル末端でペプチドリンカーを介して、第２の抗体のＶＨ−ＣＨ１ドメインを含む第１のポリペプチドに融合している、第１の抗体由来の重鎖、及び（ｉｉｉ）第２の抗体のＶＬ−ＣＬドメインを含む第２のポリペプチドを含む。二量体化される場合は、二重特異性抗原結合タンパク質は、２つの改変重鎖、第１の抗体由来の２つの軽鎖及び第２の抗体由来のＦａｂ断片のもう半分（Ｆｄ断片）を含む２つのポリペプチド鎖を含む、ホモ六量体である。一実施形態では、重鎖のカルボキシル末端に融合している第１のポリペプチドは第２の抗体由来のＶＨ及びＣＨ１ドメインを含み、第２のポリペプチドは第２の抗体由来のＶＬ及びＣＬドメインを含む。
ある種の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、（ｉ）第１の標的抗原に特異的に結合する第１の結合ドメイン、（ｉｉ）第２の標的抗原に特異的に結合する第２の結合ドメイン、及び（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンＦｃ領域を含み、ここでは、結合ドメインの１つがＦｃ領域のアミノ末端に位置し、もう１つの結合ドメインがＦｃ領域のカルボキシル末端に位置する。いくつかのそのような実施形態では、第１及び第２の結合ドメインのそれぞれは、免疫グロブリン可変領域を含む。例えば、ある種の実施形態では、第１の結合ドメインは、抗第１標的抗原抗体由来の第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１の重鎖可変領域（ＶＨ１を）含み、第２の結合ドメインは、抗第２標的抗原抗体由来の第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含む。
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質のある種の実施形態では、Ｆｃ領域のアミノ末端（すなわち、アミノ末端結合ドメイン）に位置する結合ドメインは、本明細書に記載のペプチドリンカーを介して、または免疫グロブリンヒンジ領域を介して、Ｆｃ領域のアミノ末端に融合したＦａｂ断片である。「免疫グロブリンヒンジ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインを結合するアミノ酸配列を指す。ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域は、一般に、約Ｇｌｕ２１６または約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０までのアミノ酸配列と定義される。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を同じ位置に置くことによって、ＩｇＧ１配列と整列させることができ、当業者が決定することができる。いくつかの実施形態では、アミノ末端結合ドメインは、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域を介して、Ｆｃ領域のアミノ末端に結合している。他の実施形態では、アミノ末端結合ドメインは、ヒトＩｇＧ２のヒンジ領域を介して、Ｆｃ領域のアミノ末端に結合している。一実施形態では、アミノ末端結合ドメイン（例えば、Ｆａｂ断片）はＦａｂのＣＨ１領域のカルボキシル末端を介して、Ｆｃ領域に融合している。
本発明の抗原結合タンパク質のいくつかの実施形態では、Ｆｃ領域のカルボキシル末端（すなわち、カルボキシル末端結合ドメイン）に位置する結合ドメインはＦａｂ断片である。そのような実施形態では、Ｆａｂは、ペプチドリンカーを介して、Ｆａｂ断片のＶＨ領域のアミノ末端を介して、Ｆｃ領域のカルボキシル末端（例えば、ＣＨ３ドメインのカルボキシル末端）に融合または結合している。したがって、一実施形態では、Ｆａｂは、ＦａｂのＶＨ領域のアミノ末端を介してＦｃ領域に融合しており、その結果、得られた融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ペプチドリンカー、ＶＨ領域及びＣＨ１領域を含む。
ある種の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質の第１の重鎖は、ペプチドリンカーを介して、ＶＨ２に融合している。ある種の実施形態では、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）６及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６から成る群から選択される配列を含む。これらの配列は、以下のように記載することもできる。
ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号６７３）、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６９５）、
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７０３）、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７２９）、
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７３５）、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８２５）、
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号９３７）、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９３９）、
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号９４１）、及び
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９４５）。
Ｆｃ領域をカルボキシル末端のＦａｂに結合するペプチドリンカーは、本明細書に記載のペプチドリンカーのうちのいずれかであり得る。特定の実施形態では、Ｆｃ領域をカルボキシル末端のＦａｂ断片に結合するペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸の長さである。他の実施形態では、Ｆｃ領域をカルボキシル末端のＦａｂ断片に結合するペプチドリンカーは、少なくとも８アミノ酸の長さである。Ｆｃ領域をカルボキシル末端のＦａｂ断片に結合するのに特に適したペプチドリンカーは、グリシン−セリンリンカー、例えば（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎ（ここでは、ｘ＝３または４であり、ｎ＝２、３、４、５または６である）である。一実施形態では、Ｆｃ領域をカルボキシル末端のＦａｂ断片に結合するペプチドリンカーは、Ｌ１０（Ｇ４Ｓ）２リンカーである。別の実施形態では、Ｆｃ領域をカルボキシル末端のＦａｂ断片に結合するペプチドリンカーは、Ｌ９またはＧ３ＳＧ４Ｓリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号９４６）である。
鎖変異
特定の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、エフェクター機能を除去するように改変された、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。そのような改変ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、置換Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃを含む。そのような実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｎ２９７Ｇ（ＳＥＦＬ２スキャフォールドとして知られる）置換を含むこともできる。
好ましい実施形態は、ヘテロＩｇＧ二重特異性抗原結合タンパク質の正確なアセンブリーを助けるための変異を重鎖及び軽鎖にさらに含む。ホモ二量体形成の排除のためにヘテロ二量体形成を促進するアプローチは、静電的ステアリングメカニズムの利用を必要とする（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８５：１９６３７−１９６４６を参照されたい）。このアプローチは、静電引力を引き起こす逆の電荷を介して２つの異なる重鎖が結合するように、各重鎖のＣＨ３ドメインにおいて荷電残基を導入または利用することを含む。同一の重鎖のホモ二量体化は、同一の重鎖は同じ電荷を有し、それによって反発するので、好ましくない。この同じ静電的ステアリング技法は、結合面において正確な軽鎖−重鎖対に逆の電荷を有する残基を導入することによって、非同種重鎖との軽鎖の誤対合を防ぐのに使用することができる。ヘテロ二量体及び正確な軽鎖−重鎖対形成を促進するための静電的ステアリング技法及び適切な電荷対変異はＷＯ２００９／０８９００４及びＷＯ２０１４／０８１９５５に記載されており、これらの両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質が、第１の標的抗原に特異的に結合する第１の抗体由来の第１の軽鎖（ＬＣ１）及び第１の重鎖（ＨＣ１）、並びに第２の標的に特異的に結合する第２の抗体由来の第２の軽鎖（ＬＣ２）及び第２の重鎖（ＨＣ２）を含むヘテロ二量体抗体である実施形態では、ＨＣ１またはＨＣ２は、正に荷電したアミノ酸を負に荷電したアミノ酸と置き換えるために、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むことができる。例えば、一実施形態では、ＨＣ１のＣＨ３ドメインまたはＨＣ２のＣＨ３ドメインは、ＣＨ３ドメインの対応する位置（複数可）で、野生型ヒトＩｇＧのアミノ酸配列中の１つまたは複数の正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン、ヒスチジン及びアルギニン）が、１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）と置き換えられるように、野生型ＩｇＧのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。これら及び他の実施形態では、３７０、３９２及び４０９（ＥＵナンバリングシステム）から選択される１つまたは複数の位置のアミノ酸（例えば、リジン）は、負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）と置き換えられる。アミノ酸配列中のアミノ酸置換は、一般的には、本明細書において、特定の位置におけるアミノ酸残基の１文字略語、それに続く、目的の元の配列に対する数的アミノ酸位置、次いでそれに続く、置換アミノ酸残基の１文字記号を用いて命名される。例えば、「Ｔ３０Ｄ」は、目的の元の配列に対するアミノ酸位置３０におけるアスパラギン酸残基によるスレオニン残基の置換を表す。別の例の「Ｓ２１８Ｇ」は、目的の元のアミノ酸配列に対するアミノ酸位置２１８におけるグリシン残基によるセリン残基の置換を表す。
ある種の実施形態では、ヘテロ二量体抗体のＨＣ１またはＨＣ２は、負に荷電したアミノ酸を正に荷電したアミノ酸と置き換えるために、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むことができる。例えば、一実施形態では、ＨＣ１のＣＨ３ドメインまたはＨＣ２のＣＨ３ドメインは、ＣＨ３ドメインの対応する位置（複数可）で、野生型ヒトＩｇＧのアミノ酸配列の１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸が、１つまたは複数の正に荷電したアミノ酸と置き換えられるように、野生型ＩｇＧのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。これら及び他の実施形態では、ＣＨ３ドメインの３５６、３５７及び３９９（ＥＵナンバリングシステム）から選択される１つまたは複数の位置のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）が、正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン、ヒスチジン及びアルギニン）と置き換えられる。
特定の実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、位置３９２及び４０９に負に荷電したアミノ酸（例えば、Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ置換）を含む第１の重鎖並びに位置３５６及び３９９に正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ置換）を含む第２の重鎖を含む。他の特定の実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、位置３９２、４０９及び３７０に負に荷電したアミノ酸（例えば、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｄ置換）を含む第１の重鎖並びに位置３５６、３９９及び３５７に正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ置換）を含む第２の重鎖を含む。関連した実施形態では、第１の重鎖は抗第１標的抗原抗体由来であり、第２の重鎖は抗第２標的抗原抗体由来である。
特定の重鎖とその同種の軽鎖の結合を容易にするために、重鎖と軽鎖の両方は、相補的なアミノ酸置換を含むことができる。本明細書で使用する場合、「相補的なアミノ酸置換」は、もう１つの鎖の負に荷電したアミノ酸置換と対になった、１つの鎖内の正に荷電したアミノ酸に対する置換を指す。例えば、いくつかの実施形態では、重鎖は、荷電アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、対応する軽鎖は、荷電アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここでは、重鎖に導入された荷電アミノ酸は、軽鎖に導入されたアミノ酸の逆の電荷を有する。ある種の実施形態では、ＬＣ１／ＨＣ１の結合面で、１つまたは複数の正に荷電した残基（例えば、リジン、ヒスチジンまたはアルギニン）を第１の軽鎖（ＬＣ１）に導入することができ、１つまたは複数の負に荷電した残基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）をコンパニオン重鎖（ＨＣ１）導入することができ、一方で、ＬＣ２／ＨＣ２の結合面で、１つまたは複数の負に荷電した残基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）を第２の軽鎖（ＬＣ２）に導入することができ、１つまたは複数の正に荷電した残基（例えば、リジン、ヒスチジンまたはアルギニン）をコンパニオン重鎖（ＨＣ２）に導入することができる。静電的な相互作用は、境界面の逆の荷電残基（極性）を引き寄せるので、ＬＣ１をＨＣ１と対形成させ、ＬＣ２をＨＣ２と対形成させる。境界面で同じ荷電残基（極性）を有する重／軽鎖対（例えば、ＬＣ１／ＨＣ２及びＬＣ２／ＨＣ１）は反発し、望まれないＨＣ／ＬＣ対形成を抑制する。
これら及び他の実施形態では、重鎖のＣＨ１ドメインまたは軽鎖のＣＬドメインは、野生型ＩｇＧのアミノ酸配列の１つまたは複数の正に荷電したアミノ酸が１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸と置き換えられるように、野生型ＩｇＧのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。あるいは、重鎖のＣＨ１ドメインまたは軽鎖のＣＬドメインは、野生型ＩｇＧのアミノ酸配列の１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸が１つまたは複数の正に荷電したアミノ酸と置き換えられるように、野生型ＩｇＧのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｌ１２８、Ａ１４１、Ｌ１４５、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｈ１６８、Ｆ１７０、Ｐ１７１、Ｖ１７３、Ｑ１７５、Ｓ１７６、Ｓ１８３、Ｖ１８５及びＫ２１３から選択されるＥＵ位置にある、ヘテロ二量体抗体の第１及び／または第２の重鎖のＣＨ１ドメイン中の１つまたは複数のアミノ酸は、荷電アミノ酸と置き換えられる。ある種の実施形態では、負または正に荷電したアミノ酸との置換に対する重鎖残基はＳ１８３（ＥＵナンバリングシステム）である。いくつかの実施形態では、Ｓ１８３は正に荷電したアミノ酸で置換される。代替の実施形態では、Ｓ１８３は負に荷電したアミノ酸で置換される。例えば、一実施形態では、Ｓ１８３は、第１の重鎖において負に荷電したアミノ酸で置換され（例えば、Ｓ１８３Ｅ）、Ｓ１８３は、第２の重鎖において正に荷電したアミノ酸で置換される（例えば、Ｓ１８３Ｋ）。
軽鎖がカッパ軽鎖である実施形態では、Ｆ１１６、Ｆ１１８、Ｓ１２１、Ｄ１２２、Ｅ１２３、Ｑ１２４、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｎ１３７、Ｎ１３８、Ｑ１６０、Ｓ１６２、Ｔ１６４、Ｓ１７４及びＳ１７６から選択される位置（カッパ軽鎖におけるＥＵナンバリング）にある、ヘテロ二量体抗体の第１及び／または第２の軽鎖のＣＬドメインの１つまたは複数のアミノ酸は、荷電アミノ酸と置き換えられる。軽鎖がラムダ軽鎖である実施形態では、Ｔ１１６、Ｆ１１８、Ｓ１２１、Ｅ１２３、Ｅ１２４、Ｋ１２９、Ｔ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｓ１３７、Ｅ１６０、Ｔ１６２、Ｓ１６５、Ｑ１６７、Ａ１７４、Ｓ１７６及びＹ１７８から選択される位置（ラムダ鎖におけるＥＵナンバリング）にある、ヘテロ二量体抗体の第１及び／または第２の軽鎖のＣＬドメインの１つまたは複数のアミノ酸は、荷電アミノ酸と置き換えられる。いくつかの実施形態では、負または正に荷電したアミノ酸との置換に対する残基は、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかのＣＬドメインのＳ１７６（ＥＵナンバリングシステム）である。ある種の実施形態では、ＣＬドメインのＳ１７６は、正に荷電したアミノ酸と置き換えられる。代替の実施形態では、ＣＬドメインのＳ１７６は、負に荷電したアミノ酸と置き換えられる。一実施形態では、Ｓ１７６は、第１の軽鎖において正に荷電したアミノ酸で置換され（例えば、Ｓ１７６Ｋ）、Ｓ１７６は、第２の軽鎖において負に荷電したアミノ酸で置換される（例えば、Ｓ１７６Ｅ）。
ＣＨ１及びＣＬドメインにおける相補的なアミノ酸置換に加えてまたはその代わりとして、ヘテロ二量体抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域は、荷電アミノ酸を導入するために、１つまたは複数の相補的なアミノ酸置換を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の重鎖のＶＨ領域または軽鎖のＶＬ領域は、野生型ＩｇＧのアミノ酸配列の１つまたは複数の正に荷電したアミノ酸が１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸と置き換えられるように、野生型ＩｇＧのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。あるいは、重鎖のＶＨ領域または軽鎖のＶＬ領域は、野生型ＩｇＧのアミノ酸配列の１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸が１つまたは複数の正に荷電したアミノ酸と置き換えられるように、野生型ＩｇＧのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。
ＶＨ領域内のＶ領域境界面残基（すなわち、ＶＨ領域とＶＬ領域のアセンブリーを媒介するアミノ酸残基）は、ＥＵ位置１、３、３５、３７、３９、４３、４４、４５、４６、４７、５０、５９、８９、９１及び９３を含む。ＶＨ領域内のこれらの境界面残基の１つまたは複数は、荷電した（正または負に荷電した）アミノ酸で置換され得る。ある種の実施形態では、第１及び／または第２の重鎖のＶＨ領域のＥＵ位置３９にあるアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸、例えば、リジンに置換される。代替の実施形態では、第１及び／または第２の重鎖のＶＨ領域のＥＵ位置３９にあるアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸、例えば、グルタミン酸に置換される。いくつかの実施形態では、第１の重鎖のＶＨ領域のＥＵ位置３９にあるアミノ酸は負に荷電したアミノ酸に置換され（例えば、Ｇ３９Ｅ）、第２の重鎖のＶＨ領域のＥＵ位置３９にあるアミノ酸は正に荷電したアミノ酸に置換される（例えば、Ｇ３９Ｋ）。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の重鎖のＶＨ領域のＥＵ位置４４にあるアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸、例えばリジンに置換される。代替の実施形態では、第１及び／または第２の重鎖のＶＨ領域のＥＵ位置４４にあるアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸、例えばグルタミン酸に置換される。ある種の実施形態では、第１の重鎖のＶＨ領域のＥＵ位置４４にあるアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸に置換され（例えば、Ｇ４４Ｅ）、第２の重鎖のＶＨ領域のＥＵ位置４４にあるアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸に置換される（例えば、Ｇ４４Ｋ）。
ＶＬ領域内のＶ領域境界面残基（すなわち、ＶＨ領域とＶＬ領域のアセンブリーを媒介するアミノ酸残基）は、ＥＵ位置３２、３４、３５、３６、３８、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５７、５８、８５、８７、８９、９０、９１及び１００を含む。ＶＬ領域内の１つまたは複数の境界面残基は、荷電アミノ酸、好ましくは、同種の重鎖のＶＨ領域に導入されるものと逆の電荷を有するアミノ酸で置換され得る。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の軽鎖のＶＬ領域のＥＵ位置１００にあるアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸、例えばリジンに置換される。代替の実施形態では、第１及び／または第２の軽鎖のＶＬ領域のＥＵ位置１００にあるアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸、例えばグルタミン酸に置換される。ある種の実施形態では、第１の軽鎖のＶＬ領域のＥＵ位置１００にあるアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸に置換され（例えば、Ｇ１００Ｋ）、第２の軽鎖のＶＬ領域のＥＵ位置１００にあるアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸に置換される（例えば、Ｇ１００Ｅ）。
ある種の実施形態では、本発明のヘテロ二量体抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖並びに第１の軽鎖及び第２の軽鎖を含み、第１の重鎖は、位置４４（ＥＵ）、１８３（ＥＵ）、３９２（ＥＵ）及び４０９（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第２の重鎖は、位置４４（ＥＵ）、１８３（ＥＵ）、３５６（ＥＵ）及び３９９（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第１及び第２の軽鎖は、位置１００（ＥＵ）及び１７６（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、ここでは、アミノ酸置換はこれらの位置に荷電アミノ酸を導入する。関連した実施形態では、第１の重鎖の位置４４（ＥＵ）にあるグリシンはグルタミン酸と置き換えられ、第２の重鎖の位置４４（ＥＵ）にあるグリシンはリジンと置き換えられ、第１の軽鎖の位置１００（ＥＵ）にあるグリシンはリジンと置き換えられ、第２の軽鎖の位置１００（ＥＵ）にあるグリシンはグルタミン酸と置き換えられ、第１の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）にあるセリンはリジンと置き換えられ、第２の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）にあるセリンはグルタミン酸と置き換えられ、第１の重鎖の位置１８３（ＥＵ）にあるセリンはグルタミン酸と置き換えられ、第１の重鎖の位置３９２（ＥＵ）にあるリジンはアスパラギン酸と置き換えられ、第１の重鎖の位置４０９（ＥＵ）にあるリジンはアスパラギン酸と置き換えられ、第２の重鎖の位置１８３（ＥＵ）にあるセリンはリジンと置き換えられ、第２の重鎖の位置３５６（ＥＵ）にあるグルタミン酸はリジンと置き換えられ、及び／または第２の重鎖の位置３９９（ＥＵ）にあるアスパラギン酸はリジンと置き換えられる。
他の実施形態では、本発明のヘテロ二量体抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖並びに第１の軽鎖及び第２の軽鎖を含み、第１の重鎖は、位置１８３（ＥＵ）、３９２（ＥＵ）及び４０９（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第２の重鎖は、位置１８３（ＥＵ）、３５６（ＥＵ）及び３９９（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第１及び第２の軽鎖は、位置１７６（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、ここでは、アミノ酸置換はこれらの位置に荷電アミノ酸を導入する。関連した実施形態では、第１の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）にあるセリンはリジンと置き換えられ、第２の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）にあるセリンはグルタミン酸と置き換えられ、第１の重鎖の位置１８３（ＥＵ）にあるセリンはグルタミン酸と置き換えられ、第１の重鎖の位置３９２（ＥＵ）にあるリジンはアスパラギン酸と置き換えられ、第１の重鎖の位置４０９（ＥＵ）にあるリジンはアスパラギン酸と置き換えられ、第２の重鎖の位置１８３（ＥＵ）にあるセリンはリジンと置き換えられ、第２の重鎖の位置３５６（ＥＵ）にあるグルタミン酸はリジンと置き換えられ、及び／または第２の重鎖の位置３９９（ＥＵ）にあるアスパラギン酸はリジンと置き換えられる。
さらに他の実施形態では、本発明のヘテロ二量体抗体は、第１の重鎖及び第２の重鎖並びに第１の軽鎖及び第２の軽鎖を含み、第１の重鎖は、位置１８３（ＥＵ）、３９２（ＥＵ）、４０９（ＥＵ）及び３７０（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第２の重鎖は、位置１８３（ＥＵ）、３５６（ＥＵ）、３９９（ＥＵ）及び３５７（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、第１及び第２の軽鎖は、位置１７６（ＥＵ）にアミノ酸置換を含み、ここでは、アミノ酸置換はこれらの位置に荷電アミノ酸を導入する。関連した実施形態では、第１の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）にあるセリンはリジンと置き換えられ、第２の軽鎖の位置１７６（ＥＵ）にあるセリンはグルタミン酸と置き換えられ、第１の重鎖の位置１８３（ＥＵ）にあるセリンはグルタミン酸と置き換えられ、第１の重鎖の位置３９２（ＥＵ）にあるリジンはアスパラギン酸と置き換えられ、第１の重鎖の位置４０９（ＥＵ）にあるリジンはアスパラギン酸と置き換えられ、第１の重鎖の位置３７０（ＥＵ）にあるリジンはアスパラギン酸と置き換えられ、第２の重鎖の位置１８３（ＥＵ）にあるセリンはリジンと置き換えられ、第２の重鎖の位置３５６（ＥＵ）にあるグルタミン酸はリジンと置き換えられ、第２の重鎖の位置３９９（ＥＵ）にあるアスパラギン酸はリジンと置き換えられ、及び／または第２の重鎖の位置３５７（ＥＵ）にあるグルタミン酸はリジンと置き換えられる。
ヘテロ二量体抗体の正確なアセンブリーを促進するために、上記の電荷対変異の１つまたは複数を含むように、定常ドメインのいずれかを改変することができる。
本発明のヘテロ二量体抗体は、重鎖（複数可）及び／または軽鎖（複数可）を含む抗体であって、例えば、抗体を発現する宿主細胞のタイプに起因する翻訳後修飾が原因で、重鎖及び軽鎖のいずれか１つに関して、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸残基がＮ末端またはＣ末端または両方から欠けている抗体も包含する。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、抗体重鎖からＣ末端リジンを頻繁に切断する。
正確な重鎖−軽鎖対形成を促進するために、本明細書に記載の電荷対変異または相補的なアミノ酸置換を第１の抗体（Ｆａｂ１）または第２の抗体（Ｆａｂ２）のＦａｂ領域に導入することができる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆａｂ１のＶＬドメインのＥＵ位置３８にあるアミノ酸は負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸）と置き換えられ、Ｆａｂ１のＶＨドメインのＥＵ位置３９にあるアミノ酸は正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン）と置き換えられる。他の実施形態では、Ｆａｂ１のＶＬドメインのＥＵ位置３８にあるアミノ酸は正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン）と置き換えられ、Ｆａｂ１のＶＨドメインのＥＵ位置３９にあるアミノ酸は負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸）と置き換えられる。ある種の実施形態では、Ｆａｂ２のＶＬドメインのＥＵ位置３８にあるアミノ酸は負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸）と置き換えられ、Ｆａｂ２のＶＨドメインのＥＵ位置３９にあるアミノ酸は正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン）と置き換えられる。他の実施形態では、Ｆａｂ２のＶＬドメインのＥＵ位置３８にあるアミノ酸は正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン）と置き換えられ、Ｆａｂ２のＶＨドメインのＥＵ位置３９にあるアミノ酸は負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸）と置き換えられる。
第２の抗体由来のＶＨ−ＣＨ１領域（すなわち、Ｆｄ断片）が第１の抗体の重鎖に融合している実施形態では、第１の抗体由来の重鎖はＳ１８３Ｅ変異（ＥＵナンバリング）を含み、第１の抗体由来の軽鎖はＳ１７６Ｋ変異（ＥＵナンバリング）を含み、第２の抗体由来の軽鎖はＳ１７６Ｅ変異（ＥＵナンバリング）を含み、第２の抗体由来のＦｄ領域（これは、第１の抗体由来の重鎖のＣ末端に融合している）はＳ１８３Ｋ変異（ＥＵナンバリング）を含む。他の実施形態では、第１の抗体由来の重鎖はＧ４４Ｅ変異（ＥＵ）及びＳ１８３Ｅ変異（ＥＵナンバリング）を含み、第１の抗体由来の軽鎖はＧ１００Ｋ変異（ＥＵ）及びＳ１７６Ｋ変異（ＥＵナンバリング）を含み、第２の抗体由来の軽鎖はＧ１００Ｅ変異（ＥＵ）及びＳ１７６Ｅ変異（ＥＵナンバリング）を含み、第２の抗体由来のＦｄ領域（これは、第１の抗体由来の重鎖のＣ末端に融合している）はＧ４４Ｋ変異（ＥＵ）及びＳ１８３Ｋ変異（ＥＵナンバリング）を含む。前述の例の電荷は、対応する軽鎖または重鎖の電荷も逆転する限り、逆転させることができ、その結果、正確な重／軽鎖対が逆の電荷を有する。
一実施形態では、本発明は、以下を含む二重特異性の四価抗原結合タンパク質に関する。
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第１の重鎖が、そのＣ末端を介して第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に融合しており、ＶＨ２が、そのＣ末端を介して第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に融合しており、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合しており、以下のｉ）、ｉｉ）である、第１のポリペプチド。
ｉ）ＶＨ１または第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３から成る群から選択される残基に荷電した（例えば、正に荷電した）アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
ｉｉ）ＶＨ２または第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３に対応する残基から成る群から選択される残基に逆に荷電した（例えば、負に荷電した）アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
ｂ）ａ）の第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、第１の軽鎖が第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、第２のポリペプチド。
ｃ）ａ）の第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、第２の軽鎖が第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、第３のポリペプチド。
本発明内では、上記の副段落ａ）の第１の抗原はＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αの１つでもよく、第２の抗原はもう１つでもよい。この同じ結合特異性を述べる別の方法は、副段落ａ）の第１の抗体がＴＬ１Ａ結合物またはＴＮＦ−α結合物の１つを含み、第２の抗体がもう１つを含むと、述べることである。
ＶＨ２及び第２のＣＨ１ドメインに関係する場合、「に対応する」は、リンカーが存在しない場合、ＶＨ２及び第２のＣＨ１ドメインのアミノ酸残基が第１の重鎖のＣ末端から数えられることを意味する。ペプチドリンカーが存在する場合、ＶＨ２及び第２のＣＨ１ドメインのアミノ酸残基はペプチドリンカーのＣ末端から数えられる。いずれの場合も、アミノ酸残基は第１の重鎖のＮ末端から数えられない。むしろ、ＶＨ２及び第２のＣＨ１ドメインについては、ＶＨ２ドメインの第１のアミノ酸残基を起点として数える。アミノ酸残基の計数は、ＥＵまたはＡＨｏの規則を使用して行う。
ある種の実施形態では、ａ）ＶＨ１または第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｑ３９Ｋ、Ｇ４４Ｋ及びＳ１８３Ｋから成る群から選択される変異を含み、ｂ）ＶＨ２または第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｑ３９Ｅ、Ｇ４４Ｅ及びＳ１８３Ｅから成る群から選択される変異を含み、ｃ）ＶＬ１または第１のＣＬドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｑ３８Ｅ、Ｇ１００Ｅ及びＳ１７６Ｅから成る群から選択される変異を含み、ｄ）ＶＬ２または第２のＣＬドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｑ３８Ｋ、Ｇ１００Ｋ及びＳ１７６Ｋから成る群から選択される変異を含む。
ある種の実施形態では、ａ）ＥＵナンバリングを使用して、ＶＨ１はＱ３９Ｋ変異を含み、第１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ変異を含み、ｂ）ＥＵナンバリングを使用して、ＶＨ２はＱ３９Ｅ変異を含み、第２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ変異を含み、ｃ）ＥＵナンバリングを使用して、ＶＬ１はＱ３８Ｅ変異を含み、第１のＣＬドメインは、Ｓ１７６Ｅ変異を含み、ｄ）ＥＵナンバリングを使用して、ＶＬ２はＱ３８Ｋ変異を含み、第２のＣＬドメインは、Ｓ１７６Ｋ変異を含む。
ある種の実施形態では、ａ）第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵナンバリングを使用してＧ４４Ｋ及びＳ１８３Ｋ変異を含み、ｂ）第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ４４Ｅ及びＳ１８３Ｅ変異を含み、ｃ）第１のＣＬドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ１００Ｅ及びＳ１７６Ｅ変異を含み、ｄ）第２のＣＬドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ１００Ｋ及びＳ１７６Ｋ変異を含む。
一実施形態では、本発明は、以下を含む、二重特異性の四価抗原結合タンパク質に関する。
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第１の重鎖が、そのＣ末端を介して第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に融合しており、ＶＨ２が、そのＣ末端を介して第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に融合しており、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合しており、以下のｉ）、ｉｉ）である、第１のポリペプチド。
ｉ）ＶＨ１または第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３から成る群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
ｉｉ）ＶＨ２または第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３に対応する残基から成る群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
ｂ）ａ）の第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、第１の軽鎖が第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、第２のポリペプチド。
ｃ）ａ）の第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、第２の軽鎖が第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、第３のポリペプチド。
本発明内では、上記の副段落ａ）の第１の抗原はＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αの１つでもよく、第２の抗原はもう１つでもよい。この同じ結合特異性を述べる別の方法は、副段落ａ）の第１の抗体がＴＬ１Ａ結合物またはＴＮＦ−α結合物の１つを含み、第２の抗体がもう１つを含むと、述べることである。
ある種の実施形態では、ａ）ＶＨ１または第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｑ３９Ｅ、Ｇ４４Ｅ及びＳ１８３Ｅから成る群から選択される変異を含み、ｂ）ＶＨ２または第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｑ３９Ｋ、Ｇ４４Ｋ及びＳ１８３Ｋから成る群から選択される変異を含み、ｃ）ＶＬ１または第１のＣＬドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｑ３８Ｋ、Ｇ１００Ｋ及びＳ１７６Ｋから成る群から選択される変異を含み、ｄ）ＶＬ２または第２のＣＬドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｑ３８Ｅ、Ｇ１００Ｅ及びＳ１７６Ｅから成る群から選択される変異を含む。
ある種の実施形態では、ａ）第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｓ１８３Ｅ変異を含み、ｂ）第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｓ１８３Ｋ変異を含み、ｃ）第１のＣＬドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｓ１７６Ｋ変異を含み、ｄ）第２のＣＬドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｓ１７６Ｅ変異を含む。
ある種の実施形態では、ａ）ＥＵナンバリングを使用して、ＶＨ１はＱ３９Ｅ変異を含み、第１のＣＨ１ドメインはＳ１８３Ｅ変異を含み、ｂ）ＥＵナンバリングを使用して、ＶＨ２はＱ３９Ｋ変異を含み、第２のＣＨ１ドメインはＳ１８３Ｋ変異を含み、ｃ）ＥＵナンバリングを使用して、ＶＬ１はＱ３８Ｋ変異を含み、第１のＣＬドメインはＳ１７６Ｋ変異を含み、ｄ）ＥＵナンバリングを使用して、ＶＬ２はＱ３８Ｅ変異を含み、第２のＣＬドメインはＳ１７６Ｅ変異を含む。
ある種の実施形態では、ａ）第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ４４Ｅ及びＳ１８３Ｅ変異を含み、ｂ）第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ４４Ｋ及びＳ１８３Ｋ変異を含み、ｃ）第１のＣＬドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ１００Ｋ及びＳ１７６Ｋ変異を含み、ｄ）第２のＣＬドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ１００Ｅ及びＳ１７６Ｅ変異を含む。
一実施形態では、本発明は、以下を含む、二重特異性の四価抗原結合タンパク質に関する。
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第１の重鎖が、そのＣ末端を介して第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に融合しており、ＶＨ２が、そのＣ末端を介して第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に融合しており、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合しており、以下のｉ）、ｉｉ）である、第１のポリペプチド。
ｉ）ＶＨ１または第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３から成る群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
ｉｉ）ＶＨ２または第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３に対応する残基から成る群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここでは、電荷は、第１の重鎖のＶＨ１または第１のＣＨ１の置換される残基の逆である。
ｂ）ａ）の第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、第１の軽鎖が第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、第２のポリペプチド。
ここでは、位置３８の電荷が、位置３９の、第１の重鎖のＶＨ１または第１のＣＨ１の置換される残基の逆であり、位置１００の電荷が、位置４４の、第１の重鎖のＶＨ１または第１のＣＨ１の置換される残基の逆であり、位置１７６の電荷が、位置１８３の、第１の重鎖のＶＨ１または第１のＣＨ１の置換される残基の逆である。
ｃ）ａ）の第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、第２の軽鎖が第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、ＶＬ２または第２のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、第３のポリペプチド。
ここでは、位置３８の電荷が、位置３９の、第２の重鎖のＶＨ２または第２のＣＨ１の置換される残基の逆であり、位置１００の電荷が、位置４４の、第２の重鎖のＶＨ２または第２のＣＨ１の置換される残基の逆であり、位置１７６の電荷が、位置１８３の、第２の重鎖のＶＨ２または第２のＣＨ１の置換される残基の逆である。
本発明内では、上記の副段落ａ）の第１の抗原はＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αの１つでもよく、第２の抗原はもう１つでもよい。この同じ結合特異性を述べる別の方法は、副段落ａ）の第１の抗体がＴＬ１Ａ結合物またはＴＮＦ−α結合物の１つを含み、第２の抗体がもう１つを含むと、述べることである。
ある種の実施形態では、ａ）ＥＵナンバリングを使用して、ＶＨ１はＱ３９Ｅ変異を含み、第１のＣＨ１ドメインはＳ１８３Ｋ変異を含み、ｂ）ＥＵナンバリングを使用して、ＶＨ２はＱ３９Ｋ変異を含み、第２のＣＨ１ドメインはＳ１８３Ｅ変異を含み、ｃ）ＥＵナンバリングを使用して、ＶＬ１はＱ３８Ｋ変異を含み、第１のＣＬドメインはＳ１７６Ｅ変異を含み、ｄ）ＥＵナンバリングを使用して、ＶＬ２はＱ３８Ｅ変異を含み、第２のＣＬドメインはＳ１７６Ｋ変異を含む。
ある種の実施形態では、ａ）第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ４４Ｅ及びＳ１８３Ｋ変異を含み、ｂ）第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ４４Ｋ及びＳ１８３Ｅ変異を含み、ｃ）第１のＣＬドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ１００Ｋ及びＳ１７６Ｅ変異を含み、ｄ）第２のＣＬドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ１００Ｅ及びＳ１７６Ｋ変異を含む。
ある種の実施形態では、ａ）ＥＵナンバリングを使用して、ＶＨ１はＱ３９Ｋ変異を含み、第１のＣＨ１ドメインはＳ１８３Ｅ変異を含み、ｂ）ＥＵナンバリングを使用して、ＶＨ２はＱ３９Ｅ変異を含み、第２のＣＨ１ドメインはＳ１８３Ｋ変異を含み、ｃ）ＥＵナンバリングを使用して、ＶＬ１はＱ３８Ｅ変異を含み、第１のＣＬドメインはＳ１７６Ｋ変異を含み、ｄ）ＥＵナンバリングを使用して、ＶＬ２はＱ３８Ｋ変異を含み、第２のＣＬドメインはＳ１７６Ｅ変異を含む。
ある種の実施形態では、ａ）第１のＣＨ１ドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ４４Ｋ及びＳ１８３Ｅ変異を含み、ｂ）第２のＣＨ１ドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ４４Ｅ及びＳ１８３Ｋ変異を含み、ｃ）第１のＣＬドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ１００Ｅ及びＳ１７６Ｋ変異を含み、ｄ）第２のＣＬドメインは、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ１００Ｋ及びＳ１７６Ｅ変異を含む。
一実施形態では、本発明は、以下を含む、二重特異性の四価抗原結合タンパク質を調製する方法に関する。
１）宿主細胞で以下を共発現すること。
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第１の重鎖が、そのＣ末端を介して第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に融合しており、ＶＨ２が、そのＣ末端を介して第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に融合しており、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合しており、以下のｉ）、ｉｉ）である第１のポリペプチドをコードする、第１のポリヌクレオチド。
ｉ）ＶＨ１または第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３から成る群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
ｉｉ）ＶＨ２または第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３に対応する残基から成る群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
ｂ）ａ）の第１の抗体の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、軽鎖が第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む第２のポリペプチドをコードする、第２のポリヌクレオチド。
ｃ）ａ）の第２の抗体の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、軽鎖が第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、正に荷電したアミノ酸を導入するために、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む第３のポリペプチドをコードする、第３のポリヌクレオチド。
２）ポリペプチドが生成されるような条件下で宿主細胞を培養すること。
３）宿主細胞から抗原結合タンパク質を回収すること。
本発明内では、上記の副段落ａ）の第１の抗原はＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αの１つでもよく、第２の抗原はもう１つでもよい。この同じ結合特異性を述べる別の方法は、副段落ａ）の第１の抗体がＴＬ１Ａ結合物またはＴＮＦ−α結合物の１つを含み、第２の抗体がもう１つを含むと、述べることである。
一実施形態では、本発明は、以下を含む、二重特異性の四価抗原結合タンパク質を調製する方法に関する。
１）宿主細胞で以下を共発現すること
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第１の重鎖が、そのＣ末端を介して第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に融合しており、ＶＨ２が、そのＣ末端を介して第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に融合しており、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合しており、以下のｉ）、ｉｉ）である第１のポリペプチドをコードする、第１のポリヌクレオチド。
ｉ）ＶＨ１または第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３から成る群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
ｉｉ）ＶＨ２または第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３に対応する残基から成る群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
ｂ）ａ）の第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、第１の軽鎖が第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、正に荷電したアミノ酸を導入するために、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む第２のポリペプチドをコードする、第２のポリヌクレオチド。
ｃ）ａ）の第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、第２の軽鎖が第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む第３のポリペプチドをコードする、第３のポリヌクレオチド。
２）ポリペプチドが生成されるような条件下で宿主細胞を培養すること。
３）宿主細胞から抗原結合タンパク質を回収すること。
本発明内では、上記の副段落ａ）の第１の抗原はＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αの１つでもよく、第２の抗原はもう１つでもよい。この同じ結合特異性を述べる別の方法は、副段落ａ）の第１の抗体がＴＬ１Ａ結合物またはＴＮＦ−α結合物の１つを含み、第２の抗体がもう１つを含むと、述べることである。
一実施形態では、本発明は、以下を含む、二重特異性の四価抗原結合タンパク質を調製する方法に関する。
１）宿主細胞で以下を共発現すること。
ａ）第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、第１の抗体が第１の抗原に特異的に結合し、第１の重鎖が、そのＣ末端を介して第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に融合しており、ＶＨ２が、そのＣ末端を介して第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に融合しており、第２の抗体が第２の抗原に特異的に結合しており、以下のｉ）、ｉｉ）である第１のポリペプチドをコードする、第１のポリヌクレオチド。
ｉ）ＶＨ１または第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３から成る群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
ｉｉ）ＶＨ２または第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３に対応する残基から成る群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここでは、電荷は、第１の重鎖のＶＨ１または第１のＣＨ１の置換される残基の逆である。
ｂ）ａ）の第１の抗体の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、軽鎖が第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド。
ここでは、位置３８の電荷が、位置３９の、第１の重鎖のＶＨ１または第１のＣＨ１の置換される残基の逆であり、位置１００の電荷が、位置４４の、第１の重鎖のＶＨ１または第１のＣＨ１の置換される残基の逆であり、位置１７６の電荷が、位置１８３の、第１の重鎖のＶＨ１または第１のＣＨ１の置換される残基の逆である。
ｃ）ａ）の第２の抗体の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、軽鎖が第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、正に荷電したアミノ酸を導入するために、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む第３のポリペプチドをコードする、第３のポリヌクレオチド。
ここでは、位置３８の電荷が、位置３９の、第２の重鎖のＶＨ２または第２のＣＨ１の置換される残基の逆であり、位置１００の電荷が、位置４４の、第２の重鎖のＶＨ２または第２のＣＨ１の置換される残基の逆であり、位置１７６の電荷が、位置１８３の、第２の重鎖のＶＨ２または第２のＣＨ１の置換される残基の逆である。
２）ポリペプチドが生成されるような条件下で宿主細胞を培養すること。
３）宿主細胞から抗原結合タンパク質を回収すること。
本発明内では、上記の副段落ａ）の第１の抗原はＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αの１つでもよく、第２の抗原はもう１つでもよい。この同じ結合特異性を述べる別の方法は、副段落ａ）の第１の抗体がＴＬ１Ａ結合物またはＴＮＦ−α結合物の１つを含み、第２の抗体がもう１つを含むと、述べることである。
さらにまたは代わりに、カルボキシル末端のＦａｂ結合ドメインのＣＨ１及びＣＬドメインをスワップすることによって、正確な重鎖−軽鎖対形成を促進することができる。例として、重鎖のカルボキシル末端に融合している第１のポリペプチドは、第２の抗体由来のＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含むことができ、第２のポリペプチドは、第２の抗体由来のＶＨドメイン及びＣＬドメインを含むことができる。別の実施形態では、重鎖のカルボキシル末端に融合している第１のポリペプチドは、第２の抗体由来のＶＨドメイン及びＣＬドメインを含むことができ、第２のポリペプチドは、第２の抗体由来のＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含むことができる。
本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質の重鎖定常領域またはＦｃ領域は、抗原結合タンパク質のグリコシル化及び／またはエフェクター機能に影響を及ぼす、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むことができる。免疫グロブリンのＦｃ領域の機能のうちの１つは、免疫グロブリンがその標的に結合するときに、免疫系に伝達することである。これは、一般に、「エフェクター機能」と称される。伝達によって、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が導かれる。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、免疫系細胞の表面上のＦｃ受容体へのＦｃ領域の結合を介して媒介される。ＣＤＣは、補体系のタンパク質、例えばＣ１ｑとのＦｃの結合を介して媒介される。いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＰ活性及び／または抗原結合タンパク質のクリアランスもしくは半減期を含めたエフェクター機能を増強するために、定常領域に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。エフェクター機能を増強することができる例示的アミノ酸置換（ＥＵナンバリング）としては、限定されないが、Ｅ２３３Ｌ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ｓ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｖ、Ｐ２４７Ｉ、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｙ、Ｒ２９２Ｐ、Ｅ２９４Ｌ、Ｙ２９６Ｗ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｔ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３２６Ｗ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｍ、Ａ３３０Ｆ、Ｉ３３２Ｅ、Ｄ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｖ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ、または前述のうちのいずれかの組み合わせが挙げられる。
他の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、エフェクター機能を低減させるために、定常領域に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。エフェクター機能を低減させることができる例示的アミノ酸置換（ＥＵナンバリング）としては、限定されないが、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓまたは前述のうちのいずれかの組み合わせが挙げられる。
ヘテロＩｇ分子の正確なアセンブリーを助けるための例示的置換を図１に示す。ヘテロＩｇ型式について好ましい置換を図１の（ｖ２）及び表Ｎに示す。表Ｎのすべての位置は、ＥＵナンバリングに従う。
Figure 2019502692
ＩｇＧ−Ｆａｂ型式にとって好ましい荷電アミノ酸、及び図２６に関して本明細書に記載されるＣＨ／ＣＬドメインスワップを表Ｏに示す。表Ｏの「Ｆａｂ１」及び「Ｆａｂ２」は、図２５及び２６に示す通りである。Ｆａｂ１はＩｇＧ−Ｆａｂ分子のＮ末端にあり、Ｆａｂ２はそのＣ末端にある。Ｆａｂの荷電アミノ酸の同一性及び位置は、表Ｏに列挙されるドメインの右側に示す。すべての位置はＥＵナンバリングに従う。
Figure 2019502692
結合親和性及び生物活性
本発明の前述の態様の別の実施形態では、抗ＴＬ１Ａ抗体（もしくは、その抗原結合性断片）またはヘテロＩｇ二重特異性抗原結合タンパク質もしくはＩｇＧ−ｓｃＦｖ抗原結合タンパク質のＴＬ１Ａ結合物は、少なくとも１×１０−１０Ｍ−１、少なくとも５×１０−１０Ｍ−１、少なくとも１×１０−１０Ｍ−１、少なくとも５×１０−１０Ｍ−１、少なくとも８×１０−１０Ｍ−１または少なくとも１×１０−１０Ｍ−１の結合親和性（ＫＤ１）でＴＬ１Ａと結合し、ここでは、結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅなどの表面プラスモン共鳴法によって測定される。より詳細には、本発明は、以下の実施形態に関する。
抗ＴＬ１Ａ抗体（または、その抗原結合性断片）は、抗体が約１〜約５ＫＤ ｐＭの結合親和性でＳＣＭ５センサーチップに固定化される場合に、ヒトＴＬ１Ａに結合し、または、抗体が約１−１０〜約７．５−１０Ｍ−１ＫＤの結合親和性でＳＣＭ５センサーチップに固定化される場合に、カニクイザルＴＬ１Ａに結合する。
ヘテロＩｇ二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＴＮＦ−α結合物は、抗原結合タンパク質が約１−１０〜約５−１０Ｍ−１ＫＤ ｐＭ、好ましくは約１０〜約１２ｐＭの結合親和性でＳＣＭ５センサーチップに固定化される場合に、ヒトＴＮＦ−αに結合する。
ヘテロＩｇ二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＴＬ１Ａ結合物は、抗原結合タンパク質が約２−１０〜約６．５−１０Ｍ−１ＫＤ、好ましくは約１０〜約１１ｐＭの結合親和性でＳＣＭ５センサーチップに固定化される場合に、ヒトＴＬ１Ａに結合する。
ＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗原結合タンパク質の抗ＴＮＦ−α結合物は、抗原結合タンパク質が約４．５−１０〜約７．５−１０Ｍ−１ＫＤ、好ましくは約１０〜約２０ｐｍの結合親和性でＳＣＭ５センサーチップに固定化される場合に、ヒトＴＮＦ−αに結合する。
ＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗原結合タンパク質のＴＬ１Ａ結合物は、抗原結合タンパク質が約１．５〜約１６０ｐＭ ＫＤの結合親和性でＳＣＭ５センサーチップに固定化される場合に、ヒトＴＬ１Ａに結合する。
ＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αの結合に関するさらなる詳細を、以下の実施例１３及び１５に示す。
本発明の前述の態様の別の実施形態では、ＩｇＧ−Ｆａｂ二重特異性抗原結合タンパク質のＴＮＦ−α結合物は、１×１０−１０Ｍ−１、少なくとも５×１０−１０Ｍ−１、少なくとも１×１０−１０Ｍ−１、少なくとも５×１０−１０Ｍ−１、少なくとも８×１０−１０Ｍ−１、または少なくとも１×１０−１０Ｍ−１の結合親和性（ＫＤ１）でＴＮＦ−α三量体に結合し、ここでは、結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅなどの表面プラスモン共鳴法によって測定される。
本発明の前述の態様の他の実施形態では、
抗ＴＬ１Ａ抗体（または、その抗原結合性断片）は、ＴＦ−１ ＮＦ−κＢレポーター細胞株において、約０．０８〜約３ｎＭのＩＣ５０でヒトＴＬ１Ａを中和または阻害し、ＴＦ−１ ＮＦ−κＢレポーター細胞株において、約０．３７５〜約１０ｎＭのＩＣ５０でカニクイザルＴＬ１Ａ ＴＬ１Ａを中和または阻害する。
ヘテロＩｇ二重特異性抗原結合タンパク質のＴＮＦ−α結合物は、ＴＦ−１ ＮＦ−κＢレポーター細胞株において、約５０〜５５０ｐＭ（約５０〜約１１０ｐＭが好ましい）のＩＣ５０で、ヒトＴＮＦ−αを中和または阻害する。
ヘテロＩｇ二重特異性抗原結合タンパク質のＴＬ１Ａ結合物は、ＴＦ−１ ＮＦ−κＢレポーター細胞株において、約４５〜約３５００ｐＭ（約４５〜１９０ｐＭが好ましい）のＩＣ５０で、ヒトＴＬ１Ａを中和または阻害する。
ＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗原結合タンパク質のＴＮＦ−α結合物は、ＴＦ−１ ＮＦ−κＢレポーター細胞株において、約２０〜約７５ｐＭのＩＣ５０で、可溶性ヒトＴＮＦ−αを中和または阻害する。
ＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗原結合タンパク質のＴＬ１Ａ結合物は、ＴＦ−１ ＮＦ−κＢレポーター細胞株において、約１９〜約２００ｐＭのＩＣ５０で、ヒトＴＬ１Ａを中和または阻害する。
ＴＬ１Ａ阻害及びＴＮＦ−α阻害に関するさらなる詳細を以下の実施例１４及び１６に示す。
イムノコンジュゲート、誘導体、変異体
本発明の抗体及び二重特異性抗体は、単独でまたは治療剤（例えば、細胞毒性剤）とのイムノコンジュゲートとして使用することができる。いくつかの実施形態では、薬剤は化学療法剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は限定されないが、鉛−２１２、ビスマス−２１２、アスタチン−２１１、ヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、イットリウム−９０、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、臭素−７７、インジウム−１１１及び核分裂性核種、例えばホウ素−１０またはアクチニドを含めた、放射性同位体である。他の実施形態では、薬剤は、限定されないが、リシン、アブリン、改変シュードモナスエンテロトキシンＡ、シュードモナス外毒素、カリケアマイシン、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル、ジフテリア毒素などを含めた、毒素または細胞毒性薬である。このような薬剤への抗体のコンジュゲーション方法は文献で既知であり、直接的及び間接的コンジュゲーションを含む。
適切な検出可能分子を、本発明の抗体及び二重特異性抗体に直接的または間接的に結合させることができる。適切な検出可能分子としては、放射性核種、酵素、基質、補助因子、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子などが挙げられる。検出可能なまたは細胞毒性の分子の間接的結合については、検出可能なまたは細胞毒性の分子を相補的／抗相補的対のメンバーとコンジュゲートすることができ、この場合、他のメンバーは結合ポリペプチドまたは抗体部分に結合している。これらの目的のために、ビオチン／ストレプトアビジンは例示的な相補的／抗相補的対である。
本発明の二重特異性抗体及び抗体は、例えば、共有結合が、抗体がそのエピトープへ結合するのを妨げないように、抗体へ任意のタイプの分子を共有結合させることによって改変された、誘導体も含む。適切な誘導体の例としては、限定されないが、フコシル化された、グリコシル化された、アセチル化された、ペグ化された、リン酸化された、またはアミド化された、抗体または二重特異性抗体が挙げられる。本発明の抗体及び二重特異性抗体並びにそれらの誘導体は、既知の保護／ブロッキング基、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への結合などによって、それ自体が誘導体化され得る。本発明のいくつかの実施形態では、抗体または二重特異性抗原結合タンパク質の少なくとも１つの重鎖はペグ化される。いくつかの実施形態では、ペグ化はＮ結合しており、またはアミノ酸（例えば、リジン）の側鎖を介して結合している。
グリコシル化は、抗体、特にＩｇＧ１抗体のエフェクター機能に寄与し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、結合タンパク質のグリコシル化のレベルまたはタイプに影響を及ぼす、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むことができる。ポリペプチドのグリコシル化は、一般的にはＮ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素結合に対する認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位をもたらす。Ｏ結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはスレオニンへの糖のＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用され得る。
ある種の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質のグリコシル化は、１つまたは複数のグリコシル化部位を、例えば結合タンパク質のＦｃ領域に加えることによって、増大する。抗原結合タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、好都合には、上記のトリペプチド配列の１つまたは複数を含むようにアミノ酸配列を変更することによって、達成することができる（Ｎ結合型グリコシル化部位について）。変更は、出発配列に対する、１つもしくは複数のセリンもしくはスレオニン残基の付加、または１つもしくは複数のセリンもしくはスレオニン残基による置換によっても行ことができる（Ｏ結合型グリコシル化部位について）。容易にするために、ＤＮＡレベルでの変化を介して、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基で変異させることによって、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列を変更することができる。
本発明は、炭水化物構造が変化し、その結果エフェクター活性が変化した抗原結合タンパク質の生成も包含し、これには、ＡＤＣＣ活性の向上を示す、フコシル化がないか低減した抗原結合タンパク質が含まれる。フコシル化を低減または排除するための様々な方法が当技術分野で既知である。例えば、ＡＤＣＣのエフェクター活性は、ＦｃγＲＩＩＩ受容体への抗体分子の結合によって媒介され、これは、ＣＨ２ドメインのＮ２９７残基におけるＮ結合型グリコシル化の炭水化物構造に依存することが示されている。非フコシル抗体は、増大した親和性で、この受容体に結合し、ネイティブのフコシル化抗体より効率的に、ＦｃγＲＩＩＩ媒介性エフェクター機能を誘発する。例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされたＣＨＯ細胞における非フコシル抗体の組換え生成は、ＡＤＣＣ活性が１００倍増大した抗体をもたらす（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．８７（５）：６１４−２２，２００４を参照されたい）。例えば、ｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡ処理、酵素（複数可）をノックアウトするように細胞株を操作すること、または選択的グリコシル化阻害剤とともに培養することを介して、フコシル化経路のアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素または他の酵素の活性の低下を介して、同様の効果を達成することができる（Ｒｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１２）：１１１３−２３，１９８９を参照されたい）。いくつかの宿主細胞系統、例えば、Ｌｅｃ１３またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、フコシル化レベルが低い抗体を天然に生成する（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３−４０，２００２ ａｎｄ Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６−７３，２００３を参照されたい）。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞における抗体の組換え生成による二分枝炭水化物のレベルの増大もＡＤＣＣ活性を増大すると判定されている（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６−８０，１９９９を参照されたい）。
他の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質のグリコシル化は、１つまたは複数のグリコシル化部位を、例えば結合タンパク質のＦｃ領域から除去することによって、低下するかまたは排除される。Ｎ結合型グリコシル化部位を排除するまたは変えるアミノ酸置換は、抗原結合タンパク質のＮ結合型グリコシル化を低減または排除することができる。ある種の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、位置Ｎ２９７（ＥＵナンバリング）に、変異、例えば、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇを含む。特定の一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。Ｎ２９７変異を含む分子の安定性を向上させるために、この分子のＦｃ領域をさらに操作することができる。例えば、いくつかの実施形態では、二量体状態でのジスルフィド結合形成を促進するために、Ｆｃ領域の１つまたは複数のアミノ酸がシステインで置換される。したがって、ＩｇＧ１のＦｃ領域のＶ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３またはＩ３３２（ＥＵナンバリング）に対応する残基がシステインで置換され得る。一実施形態では、残基の特定の対がシステインで置換され、その結果、これらはお互いにジスルフィド結合を優先的に形成し、したがって、ジスルフィド結合スクランブリングを制限または防止する。ある種の実施形態では、対としては、限定されないが、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ並びにＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃに変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。そのような実施形態では、Ｆｃ領域はＮ２９７Ｇ変異を含むこともできる。
血清半減期を増大させるための本発明の抗原結合タンパク質の改変も望ましい場合があり、これは、例えば、サルベージ受容体結合エピトープの組み込みもしくは付加（例えば、適切な領域の変異による、もしくは次いで、例えば、ＤＮＡもしくはペプチド合成によって、抗原結合タンパク質にどちらかの端でもしくは中央に融合されるペプチドタグへのエピトープの組み込みによる。例えば、ＷＯ９６／３２４７８を参照されたい）、またはＰＥＧもしくは他の水溶性ポリマー（多糖ポリマーなど）などの分子の付加による。サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃ領域の１つまたは２つのループ由来の任意の１つまたは複数のアミノ酸残基が抗原結合タンパク質の類似した位置に移される領域を構成する。一実施形態では、Ｆｃ領域の１つまたは２つのループ由来の３つ以上の残基が移される。一実施形態では、エピトープは、Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域）のＣＨ２ドメインから得られ、抗原結合タンパク質のＣＨ１、ＣＨ３またはＶＨ領域または１つより多いそのような領域に移される。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから取られ、抗原結合タンパク質のＣＬ領域またはＶＬ領域または両方に移される。Ｆｃ変異体及びサルベージ受容体とのその相互作用の説明について、国際出願ＷＯ９７／３４６３１及びＷＯ９６／３２４７８を参照されたい。
本発明の二重特異性抗体及び抗体は、それらの生物学的特性（例えば、ＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αのそれらの各々の受容体への結合をブロックすること、ＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αの生物活性を阻害すること）を保持する、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または置き換えを有する変異体を含む。当業者は、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または置き換えを有する変異体を生成することができる。これらの変異体は、特に、（ａ）１つまたは複数のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸で置換されている変異体、（ｂ）１つまたは複数のアミノ酸がポリペプチドに付加されたまたはポリペプチドから欠失した変異体、（ｃ）１つまたは複数のアミノ酸が置換基を含む変異体、及び（ｄ）ポリペプチドが、ポリペプチドに有用な特性を与えることができる、融合パートナー、タンパク質タグまたは他の化学的部分などの別のペプチドまたはポリペプチド、例えば、抗体に対するエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分などと融合している変異体を含むことができる。発明の抗体及び二重特異性本抗体は、ある種由来のアミノ酸残基が、保存されたまたは保存されていない位置のいずれかで、別の種の対応する残基と置換されている変異体を含むことができる。別の実施形態では、保存されていない位置のアミノ酸残基は、保存的または非保存的残基で置換されている。遺伝子的（抑制、欠失、変異など）、化学的及び酵素的技法を含めた、これらの変異体を得るための技法は、当業者に既知である。
核酸、ベクター、宿主細胞
本発明は、例えば、本明細書に開示される二重特異性抗体の軽鎖、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、重鎖、重鎖可変領域、重鎖定常領域、リンカー及びありとあらゆる成分並びにそれらの組み合わせを含む本発明の二重特異性抗体をコードする単離核酸も含む。本発明の核酸は、本発明の核酸に、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％の相同性を有する核酸を含む。特定の配列を言及する場合、用語「パーセント類似性」、「パーセント同一性」及び「パーセント相同性」は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＧＣＧ（登録商標）ソフトウェアプログラムで説明されているように使用される。本発明の核酸は相補的核酸も含む。ある場合には、配列は、整列させたときに、完全に相補的（ミスマッチなし）である。他の場合では、配列中に約２０％までのミスマッチが存在し得る。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の抗体の重鎖と軽鎖の両方をコードする核酸が提供される。
本発明の核酸は、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、人工染色体（ＢＡＣ、ＹＡＣ）またはウイルスなどのベクターにクローニングすることができ、これに、加えられた配列またはエレメントの複製を引き起こすように別の遺伝子配列またはエレメント（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を挿入することができる。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、構成的活性型プロモーターセグメント（例えば、限定されないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子もしくはＬＴＲ配列）、または核酸の発現が調節され得る誘導性プロモーター配列、例えば、ステロイド誘導性ｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを含む。本発明の発現ベクターは、さらに、調節配列、例えば配列内リボソーム進入部位を含むことができる。例えばトランスフェクションによって、発現ベクターを細胞に導入することができる。
ＩｇＧ−Ｆａｂ二重特異性抗原結合タンパク質については、３成分のそれぞれをコードする核酸を同じ発現ベクターにクローニングすることができる。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ−Ｆａｂ分子の軽鎖をコードする核酸及び第２のポリペプチド（これは、Ｃ末端のＦａｂドメインのもう半分を含む）をコードする核酸は１つの発現ベクターにクローニングされるが、改変重鎖（重鎖及びＦａｂドメインの半分を含む融合タンパク質）をコードする核酸は第２の発現ベクターにクローニングされる。ある種の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質のすべての成分は、同じ宿主細胞集団から発現される。例えば、１種または複数の成分が別々の発現ベクターにクローニングされるとしても、両方の発現ベクターが宿主細胞にコトランスフェクトされ、その結果、１つの細胞が二重特異性抗原結合タンパク質のすべての成分を生成する。
別の実施形態では、本発明は、以下の作動可能に連結されているエレメントを含む発現ベクターを提供する；転写プロモーター；本発明の二重特異性抗原結合タンパク質、抗体または抗原結合性断片の重鎖をコードする第１の核酸分子；本発明の二重特異性抗原結合タンパク質、抗体または抗原結合性断片の軽鎖をコードする第２の核酸分子；及び転写ターミネーター。別の実施形態では、本発明は、以下の作動可能に連結されているエレメントを含む発現ベクターを提供する；第１の転写プロモーター；本発明の二重特異性抗原結合タンパク質、抗体または抗原結合性断片の重鎖をコードする第１の核酸分子；第１の転写ターミネーター；第２の転写プロモーター；本発明の二重特異性抗原結合タンパク質、抗体または抗原結合性断片の軽鎖をコードする第２の核酸分子；及び第２の転写ターミネーター。
必要に応じて、細胞からの目的のポリペプチドの単離をより容易するために、場合により、発現したポリペプチドが組換え宿主細胞によって分泌され得るように、目的のコード配列に作動可能に連結される分泌シグナルペプチド配列も発現ベクターにコードされ得る。例えば、いくつかの実施形態では、シグナルペプチド配列を、表Ｅ、Ｊ、Ｋ及びＬに列挙されるポリペプチド配列のうちのいずれかのアミノ末端に付加／融合させることができる。ある種の実施形態では、ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号４９９）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが、表Ｄ、Ｉ、Ｊ及びＫのポリペプチド配列のうちのいずれかのアミノ末端に融合している。他の実施形態では、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号５０１）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが、表Ｅ、Ｊ、Ｋ及びＬのポリペプチド配列のうちのいずれかのアミノ末端に融合している。さらに他の実施形態では、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号５０３）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが、表Ｅ、Ｊ、Ｋ及びＬのポリペプチド配列のうちのいずれかのアミノ末端に融合している。前述のシグナルペプチドのそれぞれは、配列表のその直前の配列を有する核酸にコードされる。本明細書に記載のポリペプチド配列のアミノ末端に融合させることができる他の適切なシグナルペプチド配列としては、ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号５０４）、ＭＥＷＴＷＲＶＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳ（配列番号５０５）及びＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号５０６）が挙げられる。他のシグナルペプチドは当業者に既知であり、例えば、特定の宿主細胞において発現を促進または最適化するために、表Ｅ、Ｊ、Ｋ及びＬに列挙されるポリペプチド鎖のうちのいずれかに融合させることができる。
そのようなベクターを含み、重鎖及び軽鎖を発現する組換え宿主細胞も提供される。
抗体生成細胞及び二重特異性抗原結合タンパク質生成細胞は、二重特異性抗原結合タンパク質の型式に応じて、重鎖、軽鎖、重鎖−ｓｃＦｖコンストラクト、重鎖−Ｆａｂ重鎖可変ドメインコンストラクト及びＦａｂ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を含む。そのような核酸は、当技術分野で既知の技法に従って、本発明の抗体または二重特異性抗体を生成するのに使用することができる。一実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖または上記の他のコンストラクトを発現する組換え宿主細胞を培養すること、及び細胞が生成した二重特異性抗原結合タンパク質または抗体を単離することを含む、二重特異性抗原結合タンパク質または抗体を生成する方法を提供する。
組換え宿主細胞は、原核細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞でもよく、または真核細胞、例えば哺乳動物細胞もしくは酵母細胞でもよい。酵母細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞が挙げられる。哺乳動物細胞としては、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ１３８、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ＣＯＳ−７、ＭＤＣＫ、ヒト胎児由来腎臓株２９３、正常なイヌ腎臓細胞株、正常なネコ腎臓細胞株、サル腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ＣＯＳ細胞及び非腫瘍原性マウス筋芽細胞Ｇ８細胞、線維芽細胞株、骨髄腫細胞株、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ３１細胞、マウスセルトリ細胞、ヒト子宮頸管癌細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳房腫瘍細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞及びＦＳ４細胞が挙げられる。本発明の抗体生成細胞及び二重特異性抗原結合タンパク質生成細胞には、任意の既知の昆虫発現細胞株、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞が含まれる。好ましい実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。最も好ましい実施形態では、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。
抗体生成細胞は、好ましくは、ＴＬ１Ａ結合競合物及びＴＮＦ−α結合競合物を実質的に含んでいない。好ましい実施形態では、抗体生成細胞は、約１０重量％未満、好ましくは約５重量％未満、より好ましくは約１重量％未満、より好ましくは約０．５重量％未満、より好ましくは約０．１重量％未満、最も好ましくは０重量％のＴＬ１Ａ結合競合物またはＴＮＦ−α結合競合物を含む。いくつかの実施形態では、生成される抗体及び二重特異性抗体は、ＴＬ１Ａ競合物及びＴＮＦ−α競合物を実質的に含んでいない。好ましい実施形態では、生成される抗体及び二重特異性抗体は、約１０重量％未満、好ましくは約５重量％未満、より好ましくは約１重量％未満、より好ましくは約０．５重量％未満、より好ましくは約０．１重量％未満、最も好ましくは０重量％のＴＬ１Ａ結合競合物とＴＮＦ−αの結合競合物の両方を含む。
精製
抗体精製の方法は当技術分野で既知であり、本発明の抗体及び二重特異性抗体の生成とともに用いることができる。本発明のいくつかの実施形態では、抗体精製の方法は、濾過、親和性カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー及び濃縮を含む。濾過ステップは、好ましくは、限外濾過、より好ましくは限外濾過及び透析濾過を含む。濾過は、好ましくは、少なくとも約５〜５０回、より好ましくは１０〜３０回、最も好ましくは１４〜２７回行う。親和性カラムクロマトグラフィーは、例えば、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓ．）を使用して行うことができる。好ましい実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーステップは、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）−ｖＡカラムクロマトグラフィーを含む。溶媒洗浄剤中で溶出液を洗浄することができる。陽イオン交換クロマトグラフィーとしては、例えば、ＳＰ−セファロース陽イオン交換クロマトグラフィーを挙げることができる。陰イオン交換クロマトグラフィーとしては、例えば、限定されないが、Ｑ−セファロースファストフロー陰イオン交換を挙げることができる。陰イオン交換ステップは、好ましくは非結合性であり、それによって、ＤＮＡ及びＢＳＡを含めた混入物の除去が可能になる。抗体生成物は、好ましくは、例えば、Ｐａｌｌ ＤＶ２０ナノフィルターを使用してナノ濾過される。抗体生成物は、例えば、限外濾過及び透析濾過を使用して濃縮することができる。方法は、さらに、凝集物を除去するために、サイズ排除クロマトグラフィーのステップを含むことができる。精製のさらなるパラメーターを以下の実施例で示す。
当技術分野で既知の他の方法によって、例えば抗体及び抗体断片の化学的結合によって、二重特異性抗体、抗体または抗原結合性断片を生成することもできる。
本発明の単一特異性及び二重特異性抗体の使用
本発明の二重特異性抗体及び単一特異性抗体は、例えば、炎症誘発性サイトカイン、例えば、ＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αの阻害に有用である。本発明の二重特異性抗体及び単一特異性抗体は、治炎症性障害及び自己免疫疾患、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、膀胱症候群／間質性膀胱炎、尿路腸機能障害、敗血症、ブドウ膜炎、脳脊髄炎、重症筋無力症、シェーグレン症候群（ＳＳ）、強皮症、多発性硬化症（ＭＳ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、慢性腎疾患（ＣＫＤ）における炎症、乾癬（Ｐｓｏ）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、骨関節症（ＯＡ）、脊椎関節症、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、アテローム性動脈硬化症、脾腫、慢性腎疾患（ＣＫＤ）における炎症、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）、湿疹性皮膚炎、接触性皮膚炎、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎（ＬＮ）、皮膚エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎疾患、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、微小変化群（リポイドネフローゼ）、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、腎性全身性線維症（ＮＳＦ）、腎性線維化性皮膚症、線維性胆汁うっ滞性肝炎、好酸球性筋膜炎（シュルマン症候群）、硬化性粘液水腫（丘疹性ムチン沈着症）、強皮症、硬化性萎縮性苔癬、炎症性肺傷害、例えば特発性肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気道過敏症、慢性気管支炎、アレルギー性喘息、湿疹、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染症、（例えば、感染、傷害などに由来する）腹膜炎の結果としての腹腔内癒着及び／または膿瘍、ネフローゼ症候群、特発性脱髄性多発ニューロパチー、ギランバレー症候群、移植拒絶、臓器同種移植片拒絶、（例えば、血液、骨髄、腎臓、膵臓、肝臓、同所性肝臓、肺、心臓、腸、小腸、大腸、胸腺、同種幹細胞、強度低減同種、骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁、静脈、動脈、血管、胃及び精巣などの移植片に由来する）移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎疾患、真性糖尿病、微小変化群（リポイドネフローゼ）、腎性全身性線維症（ＮＳＦ）、腎性線維化性皮膚症、線維性胆汁うっ滞性肝炎、好酸球性筋膜炎（シュルマン症候群）、硬化性粘液水腫（丘疹性ムチン沈着症）、強皮症、硬化性萎縮性苔癬、高月病（または、ＰＥＰ症候群）、ネフローゼ症候群、ＰＯＥＭｓ症候群、クロウ・深瀬症候群、ネフローゼ症候群、抗好中球細胞質抗体、血管炎、巨細胞性動脈炎及び多発性骨髄腫誘発溶解性骨疾患骨疾患、連鎖球菌細胞壁（ＳＣＷ）誘導性関節炎、歯肉炎／歯周炎、ヘルペス性間質性角膜炎、グルテン感受性腸疾患再狭窄、川崎病及び免疫性腎疾患を治療するのに使用することができる。本明細書に記載の二重特異性抗体及び単一特異性抗体は、血管新生を含めたがんを治療するのに使用することもできる。
一実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明の単一特異性または二重特異性抗原結合タンパク質を投与することによる前述の疾患及び障害の１つまたは複数の治療を、そうした治療を必要としている哺乳動物において行う方法に関する。好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の好ましい実施形態では、疾患または障害はＩＢＤ、ＣＤまたはＵＣである。
本発明は、さらに、上昇したレベルのＴＬ１Ａまたは／（二重特異性抗体の場合には）ＴＮＦ−αの存在によって特徴づけられる炎症性疾患の治療並びに上昇したレベルのＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αの存在によって特徴づけられるがんの治療における、本発明の二重特異性及び単一特異性抗体の使用に関する。
したがって、一実施形態では、本発明は、炎症誘発性サイトカイン、例えば、ＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αの１つまたは複数の阻害を、そうした治療を必要としている哺乳動物において行う方法であって、治療有効量の本発明の二重特異性または単一特異性抗体の投与を、そうした治療を必要としている哺乳動物において行うことを含む、方法を提供する。好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。この方法は、ＴＬ１ＡまたはＴＮＦ−αの上昇した発現または活性を特徴とする障害を治療するのに使用することができる。単一特異性または二重特異性抗原結合タンパク質を、別の医薬品とともに、同じ製剤でまたは別々に投与することができる。
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の単一特異性または二重特異性抗原結合タンパク質及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。医薬的に有用な組成物を調製するために、本発明の抗体、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質を含む医薬組成物を、既知の方法に従って製剤化することができ、ここでは、治療用抗体は、医薬的に許容可能な担体と混合物中で組み合わされる。組成物は、その投与がレシピエント患者によって許容され得る場合、「医薬的に許容可能な担体」を含むと言われる。無菌リン酸緩衝食塩水は、医薬的に許容可能な担体の一例である。他の適切な担体が当業者に周知である。例えば、Ｇｅｔｍａｎ），ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９５）を参照されたい。
医薬的使用のために、本発明の抗体、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質は、従来の方法に従って、非経口、特に、静脈内または皮下送達用に製剤化される。静脈内投与は、ボーラス注射、例えばミニポンプもしくは他の適切な技術を使用する制御放出によってもよく、または１〜数時間の典型的な期間にわたる注入によってもよい。一般に、医薬製剤は、本発明の抗体、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質を、医薬的に許容可能な担体、例えば、生理食塩水、緩衝食塩水、５％デキストロース水溶液などと組み合わせて含む。製剤は、１種または複数の賦形剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上でのタンパク質喪失を防止するためのアルブミンなどをさらに含むことができる。そのような組み合わせ療法を利用する場合、抗体（二重特異性抗体を含む）を単一製剤中に組み合わせることができ、または別々の製剤で投与することができる。製剤の方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．（１９９０）に開示されており、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。治療用量は、一般に、１日あたり０．１〜１００ｍｇ／患者体重ｋｇ、好ましくは１日あたり０．５〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、正確な用量は、認められている基準に従って、治療される状態の性質及び重症度、患者の特性などを考慮して、臨床医によって決定される。用量の決定は、当技術分野の通常の技能のレベル内である。より一般的には、抗体は、１週またはそれ以下にわたって、しばしば１〜３日の期間にわたって投与される。一般に、投与される抗体の投薬量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態及び以前の病歴などの因子によって変動する。一般的には、約１ｐｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（薬剤量／患者の体重）の範囲の抗体の投薬量をレシピエントに与えることが望ましいが、状況に応じて、より低いまたはより高い投薬量も投与することができる。
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質の対象への投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、局所カテーテルを介する灌流によるもの、または直接病巣内注射によるものであり得る。注射によって治療用抗体を投与する場合、投与は、持続注入によるものでもよく、または単一もしくは複数のボーラスによるものでもよい。
さらなる投与経路としては、経口、粘膜、肺及び経皮が挙げられる。経口送達は、ポリエステルミクロスフェア、ゼインミクロスフェア、プロテイノイドミクロスフェア、ポリシアノアクリレートミクロスフェア及び脂質ベースの系に適している（例えば、ＤｉＢａｓｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｒａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｐｐ．２５５−２８８，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）を参照されたい）。鼻腔内送達の実行可能性は、インスリン投与のそのような様式で例示される（例えば、Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，３５：１９９（１９９９）を参照されたい）。本発明の抗体を含む乾燥または液体粒子は、乾燥粉末分散機、液体エアロゾル発生機またはネブライザーを用いて、調製及び吸入することができる（例えば、Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，１６：３４３（１９９８）、Ｐａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，３５：２３５（１９９９））。このアプローチは、エアロゾル化インスリンを肺に送達する携帯式電子吸入器であるＡＥＲＸ（登録商標）糖尿病管理システムによって例示される。研究によって、低周波超音波を用いて、４８，０００ｋＤａ程の大きさのタンパク質が治療濃度で皮膚を通過して送達されることが示され、これは、経皮的投与の実行可能性を例示するものである（Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：８５０（１９９５））。エレクトロポレーションを使用する経皮送達は、ＩＬ−１７及びＴＮＦ−α／ｐ１９結合活性を有する分子を投与するための別の手段を提供する（Ｐｏｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：２１３（１９９７））。
療法目的で、本発明の抗体、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物は、治療有効量で患者に投与される。本発明の抗体、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質と医薬的に許容可能な担体の組み合わせは、投与される量が生理学的に有意である場合、「治療有効量」で投与されると言われる。薬剤は、その存在がレシピエント患者の生理機能の検出可能な変化をもたらす場合、生理学的に有意である。例えば、炎症を治療するのに使用される薬剤は、その存在が炎症反応を軽減する場合、生理学的に有意である。様々な方法で有効な治療を評価することができる。一実施形態では、有効な治療は、炎症が低減することによって判定される。他の実施形態では、有効な治療は、炎症の阻害を特徴とする。さらに他の実施形態では、有効な療法は、体重増加、体力回復、疼痛低下、成長及びより良い健康状態の患者からの自覚徴候を含めた、患者の良好な状態の増大によって判断される。
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質を含む医薬組成物は、液体形態、エアロゾルまたは固体形態で提供され得る。液体形態は、注射溶液剤及び経口懸濁剤によって例示される。例示的固体形態としては、カプセル剤、錠剤及び制御放出形態が挙げられる。後者の形態は、ミニ浸透圧ポンプ及び埋植体によって例示される（Ｂｒｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：２３９（１９９７）、Ｒａｎａｄｅ，“Ｉｍｐｌａｎｔｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ Ｒａｎａｄｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｐｐ．９５−１２３，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）、Ｂｒｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｐｕｍｐｓ”，ｉｎ Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｐｐ．２３９−２５４，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）、Ｙｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ａ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｉｍｐｌａｎｔ”，ｉｎ Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｐｐ．９３−１１７，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）。
リポソームは、静脈内に、腹腔内に、髄腔内に、筋肉内に、皮下に、または経口投与、吸入もしくは鼻腔内投与を介して、治療的ポリペプチドを対象に送達する１手段を提供する。リポソームは、水性コンパートメントを囲んでいる１つまたは複数の脂質二重層から成る、極微の小胞である（一般に、Ｂａｋｋｅｒ−Ｗｏｕｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１２（Ｓｕｐｐｌ．１）：５６１（１９９３）、Ｋｉｍ，Ｄｒｕｇｓ，４６：６１８（１９９３）、及びＲａｎａｄｅ，“Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｕｓｉｎｇ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ Ｃａｒｒｉｅｒｓ”，ｉｎ Ｒａｎａｄｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｐｐ．３−２４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）を参照されたい）。リポソームは細胞膜と組成物が類似しており、その結果、リポソームは安全に投与することができ、且つ生分解性である。調製方法に応じて、リポソームは単層でもよく、または多層でもよく、リポソームはサイズが変動してもよく、直径が０．０２μｍ〜１０μｍ越に及ぶ。様々な薬剤をリポソームにカプセル化することができ、疎水性薬剤は二重層に分配され、親水性薬剤は内部の水性空間（複数可）に分配される（例えば、Ｍａｃｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｌｉｂｂｅｙ（１９８７）、及びＯｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．，４６：１５７６（１９８９）を参照されたい）。さらに、リポソームのサイズ、二重層の数、脂質組成並びにリポソームの電荷及び表面の特徴を変えることによって、カプセル化した薬剤の治療的有効性を制御することができる。
リポソームは事実上いかなるタイプの細胞にも吸収され得、次いで、カプセル化した薬剤を緩徐に放出することができる。あるいは、吸収されたリポソームは、食細胞である細胞によってエンドサイトーシスを受け得る。エンドサイトーシスに続いて、リポソーム脂質のリソソーム内分解及びカプセル化した薬剤の放出が起こる（Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，４４６：３６８（１９８５））。静脈内投与後に、小さなリポソーム（０．１〜１．０．ｍｕ．ｍ）は、一般的には、肝臓及び脾臓に主に位置する細網内皮系の細胞によって取り込まれるが、３．０．ｍｕ．ｍより大きいリポソームは肺に蓄積する。細網内皮系の細胞による小さなリポソームのこの優先的な取り込みは、マクロファージ及び肝臓の腫瘍へ化学療法剤を送達するのに使用された。
大用量のリポソーム粒子による飽和または薬理学的手段による選択的マクロファージ不活性化を含めたいくつかの方法によって、細網内皮系を回避することができる（Ｃｌａａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，８０２：４２８（１９８４））。さらに、リポソーム膜への糖脂質またはポリエチレングリコールによって誘導体化されたリン脂質の組み込みは、細網内皮系による取り込みの有意な低減をもたらすことが示された（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ，１０６８：１３３（１９９１）、Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１５０：９（１９９３））。
リポソームはまた、リン脂質の組成を変えることによって、または受容体またはリガンドをリポソームに挿入することによって、特定の細胞または臓器を標的にするように調製することできる。例えば、高含量の非イオン性界面活性剤を用いて調製されたリポソームは、肝臓を標的にするように使用された（Ｈａｙａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，日本特許第０４−２４４，０１８号、Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１６：９６０（１９９３））。これらの製剤は、メタノール中でダイズホスファチジルコリン、アルファ−トコフェロール及びエトキシル化硬化ヒマシ油（ＨＣＯ−６０）を混合し、この混合物を真空下で濃縮し、次いで、この混合物を水で再構成することによって、調製された。ダイズ由来のステアリルグルコシド混合物（ＳＧ）及びコレステロール（Ｃｈ）を用いるジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）のリポソーム製剤も肝臓を標的にすることが示された（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２０：８８１（１９９７））。
あるいは、抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミン及び輸送タンパク質などの様々なターゲティングリガンドをリポソームの表面に結合させることができる。例えば、肝細胞の表面でもっぱら発現するアシアロ糖タンパク質（ガラクトース）受容体を標的にするように、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を用いてリポソームを改変することができる（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．，１４：２８７（１９９７）；Ｍｕｒａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２０：２５９（１９９７））。同様に、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２７：７７２（１９９８）は、アシアロフェツインによるリポソームの標識が、リポソームの血漿半減期を短縮し、且つ肝細胞によるアシアロフェツイン標識リポソームの取り込みを大いに増強したことを示した。これに対して、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝臓蓄積は、アシアロフェツインを前注射することで阻害することができる（Ｍｕｒａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２０：２５９（１９９７））。ポリアコニチル化ヒト血清アルブミンリポソームは、肝細胞にリポソームをターゲティングするための別のアプローチを提供する（Ｋａｍｐｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１１６８１（１９９７））。さらに、Ｇｅｈｏ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６０３，０４４号は、肝臓の特殊化した代謝細胞に関連する肝胆道受容体に特異性を有する、肝細胞を対象とするリポソーム小胞送達システムを述べている。
組織ターゲティングに対するより一般的なアプローチでは、標的細胞が発現するリガンドに対して特異的なビオチン化抗体で標的細胞を予め標識する（Ｈａｒａｓｙｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，３２：９９（１９９８））。遊離抗体の血漿除去後、ストレプトアビジンコンジュゲート化リポソームを投与する。別のアプローチでは、ターゲティング抗体をリポソームに直接結合させる（Ｈａｒａｓｙｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，３２：９９（１９９８））。
タンパク質のマイクロカプセル化の標準的な技法を使用して、抗体をリポソーム内にカプセル化することができる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，３１：１０９９（１９８１）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０：１８５３（１９９０）、及びＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０６３：９５（１９９１），Ａｌｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ”，ｉｎ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，ｅｄ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．ＩＩＩ，ｐ．３１７，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、Ｗａｓｓｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１２４（１９８７）を参照されたい）。上記のように、治療的に有用なリポソームは様々な成分を含むことができる。例えば、リポソームは、ポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含むことができる（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１５０：９（１９９３））。
治療用タンパク質の高い全身レベルを維持するように、分解性ポリマーミクロスフェアが設計された。ミクロスフェアは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリアンヒドリド、ポリ（オルトエステル）、非生分解性エチル酢酸ビニルポリマーなどの分解性ポリマーから調製され、ここでは、タンパクがポリマー中に封入されている（Ｇｏｍｂｏｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，６：３３２（１９９５）、Ｒａｎａｄｅ，“Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ Ｒａｎａｄｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｐｐ．５１−９３，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）、Ｒｏｓｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｐｐ．４５−９２，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）、Ｂａｒｔｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：１１６１（１９９８）、Ｐｕｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：１５３（１９９８）、Ｐｕｔｎｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５４８（１９９８））。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングしたナノスフェアは、治療用タンパク質の静脈内投与のための担体も提供することができる（例えば、Ｇｒｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：１６７（１９９６）を参照されたい）。
製剤は、治療を受ける特定の適応症に必要な場合、１種を超える活性化合物、好ましく、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含むこともできる。あるいは、またはさらに、組成物は、その機能を増強する薬剤、例えば、細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法剤または成長阻害剤などを含むことができる。そのような分子は、意図された目的に有効な量の組み合わせで適切に存在する。
一実施形態では、本発明の抗体、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質は、組み合わせ療法で、すなわち、病態または障害、例えば、自己免疫障害及び炎症性疾患を治療するのに有用な他の薬剤、例えば、治療剤と組み合わされて投与される。この文脈において、用語「組み合わせて」は、薬剤が実質的に同時期に、すなわち、同時にまたは連続して与えられることを意味する。連続して与えられる場合、第２の化合物の投与の開始時に、２種の化合物のうちの第１のものは、好ましくは、治療部位において有効濃度で依然として検出可能である。
例えば、組み合わせ療法は、より詳細に以下に記載するように、１種または複数のさらなる治療剤、例えば、１種または複数のサイトカイン及び増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤及び／または細胞毒性剤もしくは細胞分裂阻害剤と共製剤化される、及び／または同時投与される、本発明の１種または複数の抗体、例えば、二重特異性抗体を含むことができる。さらに、本明細書に記載の１種または複数の抗体、例えば、二重特異性抗体は、本明細書に記載の治療剤の２つ以上と組み合わせて使用することができる。そのような組み合わせ療法は、有利なことに、投与治療剤のより低い投薬量を利用することができるので、様々な単独療法に付随する、あり得る毒性または合併症を回避する。
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質と組み合わせて使用される好ましい治療剤は、炎症反応の異なる段階で妨害する薬剤である。一実施形態では、本明細書に記載の１種または複数の抗体、例えば、二重特異性抗体は、他のサイトカインもしくは増殖因子アンタゴニスト（例えば、可溶性受容体、ペプチド阻害剤、小分子、リガンド融合体）などの１種もしくは複数のさらなる薬剤、または他の標的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、他のサイトカインもしくは増殖因子、それらの受容体、もしくは他の細胞表面分子に結合する抗体）、及び抗炎症性サイトカインまたはそのアゴニストと共製剤化及び／または同時投与することができる。本明細書に記載の抗体と組み合わせて使用することができる薬剤の非限定例としては、限定されないが、１種または複数のインターロイキン（ＩＬ）またはそれらの受容体のアンタゴニスト、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ１７Ａ−Ｆ、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２５及びＩＬ−３１のアンタゴニスト、サイトカインまたは増殖因子またはそれらの受容体、例えば、ＬＴ、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ及びＰＤＧＦのアンタゴニストが挙げられる。本発明の抗体は、例えば、細胞表面分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０（例えば、ＣＤ２０阻害剤リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ９０、またはこれらのリガンド、例えば、ＣＤ１５４（ｇｐ３９もしくはＣＤ４０Ｌ）もしくはＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１及びＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１（Ｙｕｓｕｆ−Ｍａｋａｇｉａｎｓａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，２２：１４６−１６７（２００２））に対する抗体の阻害剤と組み合わせることもできる。本明細書に記載の１種または複数の抗体、例えば、二重特異性抗体と組み合わせて使用することができる好ましいアンタゴニストとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２及びＩＬ−３１のアンタゴニストが挙げられる。
そうした薬剤の例としては、ＩＬ−１２アンタゴニスト、例えば、ＩＬ−１２（好ましくはヒトＩＬ−１２）に結合するキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体もしくはインビトロ生成抗体（または、これらの抗原結合断片）、例えばＷＯ００／５６７７２に開示されている抗体；ＩＬ−１２受容体阻害剤、例えばヒトＩＬ−１２受容体に対する抗体；及びＩＬ−１２受容体、例えばヒトＩＬ−１２受容体の可溶性断片が挙げられる。ＩＬ−１５アンタゴニストの例としては、ＩＬ−１５またはその受容体に対する抗体（または、その抗原結合断片）、例えば、ヒトＩＬ−１５またはその受容体に対するキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはインビトロ生成抗体、ＩＬ−１５受容体の可溶性断片及びＩＬ−１５結合タンパク質が挙げられる。ＩＬ−１７アンタゴニストの例としては、ブロダルマブ、セクキヌマブ及びイキセキズマブが挙げられる。ＩＬ−１８アンタゴニストの例としては、ヒトＩＬ−１８に対する抗体、例えば、キメラ、ヒト化、ヒトまたはインビトロ生成抗体（または、これらの抗原結合断片）、ＩＬ−１８受容体の可溶性断片及びＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）が挙げられる。ＩＬ−１アンタゴニストの例としては、インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ）阻害剤、例えば）Ｖｘ７４０、ＩＬ−１アンタゴニスト、例えば、ＩＬ−１ＲＡ（アナキンラ、Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標））、ｓＩＬ１ＲＩＩ及び抗ＩＬ−１受容体抗体（または、その抗原結合断片）が挙げられる。
他の実施形態では、本明細書に記載の１種または複数の抗体、例えば、二重特異性抗体は、以下の１つまたは複数と組み合わせて投与することができる：ＩＬ−１３アンタゴニスト、例えば、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３）及び／またはＩＬ−１３に対する抗体；ＩＬ−２アンタゴニスト、例えば、ＤＡＢ４８６−ＩＬ−２及び／またはＤＡＢ３８９−ＩＬ−２（ＩＬ−２融合タンパク質、Ｓｅｒａｇｅｎ）、及び／またはＩＬ−２Ｒに対する抗体、例えば、抗Ｔａｃ（ヒト化抗ＩＬ−２Ｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）。さらに、別の組み合わせは、非枯渇性抗ＣＤ４阻害剤（ＤＥＣ−ＣＥ９．１／ＳＢ２１０３９６；非枯渇性霊長類化抗ＣＤ４抗体；ＩＤＥＣ／ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）と組み合わせて、本発明の１種または複数の抗体、例えば、二重特異性抗体、アンタゴニスト性小分子及び／または阻害性抗体を含む。さらに、他の好ましい組み合わせは、抗体、可溶性受容体またはアンタゴニスト性リガンドを含めた、共刺激経路ＣＤ８０（Ｂ７．１）またはＣＤ８６（Ｂ７．２）のアンタゴニスト；並びにｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）、抗炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−４（ＤＮＡＸ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）；ＩＬ−１０（ＳＣＨ５２０００；組換えＩＬ−１０ ＤＮＡＸ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）；ＩＬ−１３及びＴＧＦ−ベータ並びにこれらのアゴニスト（例えば、アゴニスト抗体）を含む。
他の実施形態では、本発明の１種または複数の抗体、例えば、二重特異性抗体は、１種または複数の抗炎症薬、免疫抑制剤または代謝阻害剤もしくは酵素阻害剤と共製剤化及び／または同時投与することができる。本明細書に記載の抗体と組み合わせて使用することができる薬物または阻害剤の非限定例としては、限定されないが、以下の１つまたは複数が挙げられる：非ステロイド性抗炎症薬（複数可）（ＮＳＡＩＤｓ）、例えば、イブプロフェン、テニダップ、ナプロキセン、メロキシカム、ピロキシカム、ジクロフェナク及びインドメタシン；スルファサラジン；プレドニゾロンなどのコルチコステロイド；サイトカイン抑制抗炎症薬（複数可）（ＣＳＡＩＤｓ）；ヌクレオチド生合成の阻害剤、例えばプリン生合成の阻害剤、葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキサート（Ｎ−［４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−グルタミン酸）；並びにピリミジン生合成の阻害剤、例えば、ジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＤＨＯＤＨ）阻害剤。本発明の１種または複数の抗体、例えば、二重特異性抗体と組み合わせて使用するのに好ましい治療剤としては、ＮＳＡＩＤｓ、ＣＳＡＩＤｓ、（ＤＨＯＤＨ）阻害剤（例えば、レフルノミド）及び葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキサート）が挙げられる。
さらなる阻害剤の例としては、以下の１つまたは複数が挙げられる：コルチコステロイド（経口、吸入及び局部的注射）；免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）；並びにｍＴＯＲ阻害剤、例えば、シロリムス（ラパマイシン−−ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）またはラパマイシン誘導体、例えば、可溶性ラパマイシン誘導体（例えば、エステルラパマイシン誘導体、例えば、ＣＣＩ−７７９）；ＩＬ−１などの炎症誘発性サイトカインによるシグナリングを妨げる薬剤（例えば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）；ＣＯＸ２阻害剤、例えば、セレコキシブ、ロフェコキシブ及びそれらの変異体；ホスホジエステラーゼ阻害剤、例えば、Ｒ９７３４０１（ホスホジエステラーゼタイプＩＶ阻害剤）；ホスホリパーゼ阻害剤、例えば、サイトゾルホスホリパーゼ２（ｃＰＬＡ２）の阻害剤（例えば、トリフルオロメチルケトン類似体）；血管内皮細胞増殖因子または増殖因子受容体の阻害剤、例えば、ＶＥＧＦ阻害剤及び／またはＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤；並びに血管新生の阻害剤。本発明の抗体と組み合わせて使用するのに好ましい治療剤は、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）；ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、シロリムス（ラパマイシン）またはラパマイシン誘導体、例えば、可溶性ラパマイシン誘導体（例えば、エステルラパマイシン誘導体、例えば、ＣＣＩ−７７９）；ＣＯＸ２阻害剤、例えば、セレコキシブ及びそれらの変異体；並びにホスホリパーゼ阻害剤、例えば、サイトゾルホスホリパーゼ２（ｃＰＬＡ２）の阻害剤、例えば、トリフルオロメチルケトン類似体である。
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質と組み合わせることができるさらなる治療剤の例としては、以下の１つまたは複数が挙げられる：６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）；アザチオプリンスルファサラジン；メサラジン；オルサラジン；クロロキン／ヒドロキシクロロキン（ＰＬＡＱＵＥＮＩＬ（登録商標））；ペンシラミン；金チオリンゴ酸（筋肉内及び経口）；アザチオプリン；コルヒチン；ベータ−２アドレノセプターアゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテロール）；キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）；クロモグリケート；ネドクロミル；ケトチフェン；イプラトロピウム及びオキシトロピウム；ミコフェノール酸モフェチル；アデノシンアゴニスト；抗血栓剤；補体阻害剤；並びにアドレナリン作用剤。
本発明の抗ＴＬ１Ａ抗体は、抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α二重特異性抗原結合タンパク質について本明細書に記載されるものと同じ状態の治療ために、ＴＮＦ−αアンタゴニストと組み合わせることができる。そのようなＴＮＦ−αアンタゴニストとしては、例えば、エタネルセプト、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ及びセルトリズマブペゴルが挙げられる。
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質を組み合わせることができる、関節炎障害（例えば、関節リウマチ、炎症性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節症及び乾癬性関節炎）を治療または予防するための薬剤の非限定例としては、以下の１つまたは複数が挙げられる：本明細書に記載のＩＬ−１２アンタゴニスト；ＮＳＡＩＤｓ；ＣＳＡＩＤｓ；本明細書に記載の非枯渇性抗ＣＤ４抗体；本明細書に記載のＩＬ−２アンタゴニスト；抗炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及びＴＧＦ−αまたはこれらのアゴニスト；本明細書に記載のＩＬ−１またはＩＬ−１受容体アンタゴニスト；本明細書に記載のホスホジエステラーゼ阻害剤；本明細書に記載のＣｏｘ−２阻害剤；イロプロスト：メトトレキサート；サリドマイド及びサリドマイド関連薬物（例えば、セルジェン）；レフルノミド；プラスミノーゲン活性化阻害剤、例えば、トラネキサム酸；サイトカイン阻害剤、例えば、Ｔ−６１４；プロスタグランジンＥ１；アザチオプリン；インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ）の阻害剤；ｚａｐ−７０及び／または１ｃｋ阻害剤（チロシンキナーゼｚａｐ−７０または１ｃｋの阻害剤）；本明細書に記載の血管内皮細胞増殖因子または血管内皮細胞増殖因子受容体の阻害剤；本明細書に記載の血管新生の阻害剤；コルチコステロイド抗炎症薬（例えば、ＳＢ２０３５８０）；ＴＮＦ−α−変換酵素阻害剤；ＩＬ−１；ＩＬ−１３；ＩＬ−１７阻害剤；金；ペニシラミン；クロロキン；ヒドロキシクロロキン；クロラムブシル；シクロホスファミド；シクロスポリン；全身リンパ節照射；抗胸腺細胞グロブリン；ＣＤ５−毒素；経口投与されるペプチド及びコラーゲン；ロベンザリット二ナトリウム；サイトカイン調節剤（ＣＲＡ）ＨＰ２２８及びＨＰ４６６（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；ＩＣＡＭ−１アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＳＩＳ２３０２；Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；可溶性補体受容体１（ＴＰ１０；Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）；プレドニゾン；オルゴテイン；グリコサミノグリカンポリ硫酸；ミノサイクリン（ＭＩＮＯＣＩＮ（登録商標））；抗ＩＬ２Ｒ抗体；海産及び植物性脂質（魚及び植物種子の脂肪酸）；オーラノフィン；フェニルブタゾン；メクロフェナム酸；フルフェナム酸；静注用免疫グロブリン；ジロートン；ミコフェノール酸（ＲＳ−６１４４３）；タクロリムス（ＦＫ−５０６）；シロリムス（ラパマイシン）；アミプリロース（テラフェクチン）；クラドリビン（２−クロロデオキシアデノシン）；並びにアザリビン。好ましい組み合わせは、メトトレキサートまたはレフルノミド、及び中程度または重度の関節リウマチの場合ではシクロスポリンと組み合わせた、本発明の１種または複数の抗体、例えば、二重特異性抗体を含む。
関節炎障害を治療するために本発明の１種または複数の抗原結合タンパク質、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質と組み合わせて使用するための阻害剤の好ましい例としては、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２のアンタゴニスト；Ｔ細胞及びＢ細胞枯渇剤（例えば、抗ＣＤ４または抗ＣＤ２２抗体）；小分子阻害剤、例えば、メトトレキサート及びレフルノミド；シロリムス（ラパマイシン）及びこれらの類似体、例えば、ＣＣＩ−７７９；ｃｏｘ−２及びｃＰＬＡ２阻害剤；ＮＳＡＩＤｓ；ｐ３８阻害剤、ＴＰＬ−２、Ｍｋ−２及びＮＦκＢ阻害剤；ＲＡＧＥまたは可溶性ＲＡＧＥ；Ｐ−セレクチンまたはＰＳＧＬ−１阻害剤（例えば、小分子阻害剤、ＰＳＧＬ−１に対する抗体、Ｐ−セレクチンに対する抗体）；エストロゲン受容体ベータ（ＥＲＢ）アゴニストまたはＥＲＢ−ＮＦκＢアンタゴニストが挙げられる。本発明の１種または複数の抗体、例えば、二重特異性抗体と同時投与及び／または共製剤化することができる、最も好ましいさらなる治療剤は、以下の１つまたは複数を含む：メトトレキサート、レフルノミド、もしくはシロリムス（ラパマイシン）またはこれらの類似体、例えば、ＣＣＩ−７７９。
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質を組み合わせることができる、炎症性疾患または障害（例えば、ＩＢＤ、ＣＤ、ＵＣ、ＩＢＳ）を治療または予防するための薬剤の非限定例としては、以下が挙げられる：ブデノシド；上皮増殖因子；コルチコステロイド；シクロスポリン；スルファサラジン；アミノサリチル酸；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポキシゲナーゼ阻害剤；メサラミン；オルサラジン；バルサラジド；抗酸化剤；トロンボキサン阻害剤；ＩＬ−１受容体アンタゴニスト；抗ＩＬ−１モノクローナル抗体；抗ＩＬ−６モノクローナル抗体（例えば、抗ＩＬ−６受容体抗体及び抗ＩＬ−６抗体）；増殖因子；エラスターゼ阻害剤；ピリジニル−イミダゾール化合物；ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及び／またはＴＧＦベータサイトカインまたはこれらのアゴニスト（例えば、アゴニスト抗体）；ＩＬ−１１；プレドニゾロン、デキサメタゾンまたはブデソニドのグルクロニドまたはデキストランコンジュゲート化プロドラッグ；ＩＣＡＭ−１アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＳＩＳ ２３０２；Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；可溶性補体受容体１（ＴＰ１０；Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）；徐放性メサラジン；メトトレキサート；血小板活性化因子（ＰＡＦ）のアンタゴニスト；シプロフロキサシン；並びにリグノカイン。
本発明の１種または複数の抗体、例えば、二重特異性抗体を組み合わせることができる、多発性硬化症を治療または予防するための薬剤の非限定例としては、以下が挙げられる：インターフェロン、例えば、インターフェロンーα（例えば、ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）、Ｂｉｏｇｅｎ）及びインターフェロン−１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）、Ｃｈｉｒｏｎ／Ｂｅｒｌｅｘ）；コポリマー１（Ｃｏｐ−１；ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）、Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；フマル酸ジメチル（例えば、ＢＧ−１２；Ｂｉｏｇｅｎ）；高圧酸素；静注用免疫グロブリン；クラドリビン；コルチコステロイド；プレドニゾロン；メチルプレドニゾロン；アザチオプリン；シクロホスファミド；シクロスポリン；シクロスポリンＡ、メトトレキサート；４−アミノピリジン；並びにチザニジン。本発明の抗体と組み合わせて使用することができるさらなるアンタゴニストとしては、他のヒトサイトカインまたは増殖因子、例えば、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＥＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−１１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ及びＰＤＧＦに対する抗体またはこれらのアンタゴニストが挙げられる。本明細書に記載の抗体は、細胞表面分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０またはこれらのリガンドに対する抗体と組み合わせることができる。本発明の１種または複数の抗体、例えば、二重特異性抗体は、メトトレキサート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤｓ、例えば、イブプロフェン、コルチコステロイド、例えば、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作用剤、本明細書に記載の炎症誘発性サイトカインによるシグナリングを妨げる薬剤、ＩＬ−１ｂ変換酵素阻害剤（例えば、Ｖｘ７４０）、抗Ｐ７ｓ、ＰＳＧＬ、ＴＡＣＥ阻害剤、Ｔ細胞シグナリング阻害剤、例えば、キナーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、本明細書に記載の可溶性サイトカイン受容体及びその誘導体、並びに抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及びＴＧＦ）などの薬剤と組み合わせることもできる。
本発明の抗体を組み合わせることができる、多発性硬化症に対する治療剤の好ましい例としては、フマル酸ジメチル（例えば、ＢＧ−１２；Ｂｉｏｇｅｎ）、インターフェロン−ベータ、例えば、ＩＦＮ−β−１ａ及びＩＦＮ−β−１ｂ；ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）、コルチコステロイド、ＩＬ−１阻害剤、ＣＤ４０リガンド及びＣＤ８０に対する抗体、ＩＬ−１２アンタゴニストが挙げられる。
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質を組み合わせることができる、乾癬を治療または予防するための薬剤の非限定例としては、以下が挙げられる：コルチコステロイド；ビタミンＤ３及びその類似体；レチノイド（例えば、ソリアタン）；メトトレキサート；シクロスポリン、６−チオグアニン；アキュテイン；ハイドレア；ヒドロキシ尿素；スルファサラジン；ミコフェノール酸モフェチル；アザチオプリン；タクロリムス；フマル酸エステル；生物製剤、例えば、ＡＭＥＶＩＶＥ（登録商標）、ラプティバウステキヌマブ及びＸＰ−８２８Ｌ；光線療法；並びに光化学療法（例えば、ソラレンと紫外線光線療法の組み合わせ）。
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質を組み合わせることができる、炎症性気道／呼吸器疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患、喘息）を治療または予防するための薬剤の非限定例としては、以下が挙げられる：ベータ２−アドレナリン受容体アゴニスト（例えば、サルブタモール（アルブテロール）、レブアルブテロール、テルブタリン、ビトルテロール）；長時間作用型ベータ２−アドレナリン受容体アゴニスト（例えば、サルメテロール、ホルモテロール、バンブテロール）；アドレナリンアゴニスト（例えば、吸入エピネフリン及びエフェドリン錠剤）；抗コリン剤（例えば、臭化イプラトロピウム）；吸入ステロイドと長時間作用型気管支拡張剤の組み合わせ（例えば、フルチカゾン／サルメテロール（米国ではＡＤＶＡＩＲ（登録商標）、英国ではセレタイド））またはブデソニド／ホルモテロール（ＳＹＭＢＩＣＯＲＴ（登録商標）））；吸入グルココルチコイド（例えば、シクレソニド、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、モメタゾン、トリアムシノロン）；ロイコトリエン修飾薬（例えば、モンテルカスト、ザフィルルカスト、プランルカスト及びジロートン）；肥満細胞安定化薬（例えば、クロモグリク酸（クロモリン）及びネドクロミル）；抗ムスカリン薬／抗コリン薬（例えば、イプラトロピウム、オキシトロピウム、チオトロピウム）；メチルキサンチン（例えば、テオフィリン、アミノフィリン）；抗ヒスタミン薬；ＩｇＥブロッカー（例えば、オマリズマブ）；Ｍ３ムスカリンアンタゴニスト（抗コリン薬）（例えば、イプラトロピウム、チオトロピウム）；クロモン（例えば、クロモグリク酸、ネドクロミル）；キサンチン（例えば、テオフィリン）；ＩＬ−１７阻害剤（例えば、ブロダルマブ、セクキヌマブ、イキセキズマブ）、ＩＬ−４阻害剤；並びにＩＬ−１３阻害剤。
一実施形態では、本発明の抗体、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質は、免疫応答、例えば、移植拒絶の調節に関与する他の標的に対する１種または複数の抗体と組み合わせて使用することができる。
本発明の抗体、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質を組み合わせることができる、免疫応答を治療または予防するための薬剤の非限定例としては、以下が挙げられる：限定されないが、ＣＤ２５（インターロイキン−２受容体−α、ＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４（ＣＤ８０（Ｂ７．１）、例えば、ＣＴＬＡ４ Ｉｇ（アバタセプト、ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標））、ＩＣＯＳＬ、ＩＣＯＳ及び／またはＣＤ８６（Ｂ７．２）を含めた他の細胞表面分子に対する抗体。さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、１種または複数の一般的な免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６と組み合わせて使用される。
他の実施形態では、抗体は、自己免疫障害、炎症性疾患などに対するワクチンアジュバントとして使用される。これらのタイプの障害の治療に対するアジュバントの組み合わせは、自己免疫に関与する、標的にされる自己抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎｓ）、すなわち、自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ）由来の多種多様の抗原、例えば、ミエリン塩基性タンパク質；炎症性自己抗原（例えば、アミロイドペプチドタンパク質）または移植片抗原（例えば、同種抗原）との組み合わせでの使用に適する。抗原は、タンパク質に由来するペプチドまたはポリペプチド、及び以下のうちのいずれかの断片を含むことができる：サッカリド、タンパク質、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、自己抗原、アミロイドペプチドタンパク質、移植片抗原、アレルゲンまたは他の高分子成分。ある場合には、１種を超える抗原が抗原性組成物に含まれる。
例えば、本発明のアジュバントの組み合わせを含む、脊椎動物宿主においてアレルゲンへの応答を緩和するのに望ましいワクチンとしては、アレルゲンまたはその断片を含むものが挙げられる。そのようなアレルゲンの例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８３０，８７７号及びＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５１２５９号に記載され、花粉、昆虫毒、動物の鱗屑、菌胞子及び薬物（例えば、ペニシリン）が挙げられる。ワクチンは、アレルギー反応の既知の原因であるＩｇＥ抗体の生成を妨げる。別の例では、本発明のアジュバントの組み合わせを含む、脊椎動物宿主においてアミロイド沈着を特徴とする疾患を予防または治療するのに望ましいワクチンとしては、アミロイドペプチドタンパク質（ＡＰＰ）の一部を含むものが挙げられる。この疾患は、アルツハイマー病、アミロイド症またはアミロイド形成性疾患として色々な名前で呼ばれる。したがって、本発明のワクチンは、本発明のアジュバントの組み合わせ＋Ａベータペプチド、並びにＡβペプチドの断片及びＡβペプチドまたはその断片に対する抗体を含む。
別の実施形態では、医薬組成物は、本発明の抗体、二重特異性抗原結合タンパク質または抗原結合性断片を含む容器を含むキットとして供給される。本発明の抗体、例えば、二重特異性抗体は、単回または複数回用量用の注射溶液剤の形態で、または注射の前に再構成される無菌粉末剤として提供することができる。あるいは、そのようなキットは、抗原結合タンパク質（例えば、抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α二重特異性抗原結合タンパク質）の投与のために、乾燥粉末分散機、液体エアロゾル発生機またはネブライザーを含むことができる。そのようなキットは、医薬組成物の適応症及び使用法に関する書面情報をさらに含むことができる。さらに、そのような情報は、抗体組成物がＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αに対して既知の過敏症を有する患者には禁忌であるという記載を含むことができる。
さらなる実施形態では、本発明は、以下を含む製造品を提供する：（ａ）本明細書に記載の抗体、二重特異性抗原結合タンパク質または抗原結合性断片を含む物質の組成物、（ｂ）前記組成物を含む容器、及び（ｃ）免疫関連疾患の治療における前記抗体の使用に言及する、前記容器に貼られたラベルまたは前記容器に含まれる添付文書。
別の態様では、組成物は、さらなる活性成分を含み、これは、例えば、さらなる抗体または抗炎症剤、細胞毒性剤もしくは化学療法剤でもよい。好ましくは、組成物は無菌である。
本明細書に記載の抗体、例えば、二重特異性抗体はまた、例えば、ＩＢＳ、ＩＢＤ、ＣＤ、ＵＣを含めた免疫関連疾患及び炎症性疾患の治療のための薬及び医薬を調製するのに有用である。特定の態様では、そのような薬及び医薬は、治療有効量の本発明の二重特異性抗原結合タンパク質、抗体または抗原結合性断片を医薬的に許容可能な担体とともに含む。一実施形態では、混合物は無菌である。
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、生物試料におけるＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αの検出、並びにＴＬ１Ａ受容体ＤＲ３及び／またはＴＮＦ−α受容体を発現する細胞または組織の特定に有用である。例えば、二重特異性抗原結合タンパク質は、診断アッセイ、例えば、組織または細胞においてＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αの結合及び／または発現を検出及び／または定量化するための結合アッセイで使用することができる。さらに、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＴＬ１Ａがその受容体ＤＲ３と複合体を形成するのを阻害し、それによって、細胞または組織においてＴＬ１ＡまたはＤＲ３の生物活性をモジュレートするのに使用することができる。同様に、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＴＮＦ−αがその受容体と複合体を形成するのを阻害し、それによって、細胞または組織においてＴＮＦ−αまたはその受容体の生物活性をモジュレートするのに使用することができる。モジュレートされ得る例示的活性としては、限定されないが、炎症を阻害する及び／または低減させることが挙げられる。
本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αと関連する疾患及び／または状態を検出、診断またはモニターするために、診断目的に使用することができる。当業者に既知の伝統的な免疫組織学的方法を使用して試料中のＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αの存在を検出する方法も提供される。例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｖｏｌ １５（Ｅｄｓ Ｒ．Ｈ．Ｂｕｒｄｏｎ ａｎｄ Ｐ．Ｈ． ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、Ｚｏｌａ（１９８７），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｊａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５、Ｊａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６を参照されたい。ＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αのいずれの検出もインビボでまたはインビトロで実施することができる。
本明細書で提供される診断適用としては、ＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αの発現並びにこれらのリガンドのその受容体への結合を検出するための抗原結合タンパク質の使用が挙げられる。リガンドの存在の検出に有用な方法の例としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイが挙げられる。
診断適用については、抗原結合タンパク質は、一般的には、検出可能な標識基で標識される。適切な標識基としては、限定されないが、以下が挙げられる：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、または第２のレポーターに認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、第２の抗体への結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態では、標識基は、潜在的な立体障害を低減するように、様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質に結合している。タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で既知であり、使用可能である。
別の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αを発現する細胞（複数可）を特定するのに使用することができる。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質が標識基で標識され、ＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αへの標識された抗原結合タンパク質の結合が検出される。さらなる特定の実施形態では、ＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αへの抗原結合タンパク質の結合が、インビボで検出される。さらなる特定の実施形態では、当技術分野で既知の技法を使用して、二重特異性抗原結合タンパク質が単離され、測定される。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（ｅｄ．１９９１ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）、Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｄ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓを参照されたい。
本発明の別の態様は、ＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αへの結合について本明細書に記載の抗原結合タンパク質と競合する試験分子の存在の検出を提供する。１つのそうしたアッセイの例は、試験分子の存在または非存在下である量のＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αを含む溶液中の遊離抗原結合タンパク質の量を検出することを含むと思われる。遊離抗原結合タンパク質（すなわち、ＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αに結合していない抗原結合タンパク質）の量の増大は、試験分子が、ＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αの結合について二重特異性抗原結合タンパク質と競合することができることを示すと思われる。一実施形態では、抗原結合タンパク質は標識基で標識される。あるいは、試験分子が標識され、抗原結合タンパク質の存在及び非存在下で、遊離試験分子の量がモニターされる。
本発明は以下の実施例によってさらに明らかにされるが、これは、本発明の範囲を例示するが制限しない。
実施例１
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）抗ＴＬ１Ａモノクローナル抗体の調製
マウス系統
ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）トランスジェニックマウスを免疫化することによって、ヒトＴＬ１Ａに対する完全ヒト抗体を生成した。米国特許第６，１１４，５９８号、第６，１６２，９６３号、第６，８３３，２６８号、第７，０４９，４２６号、第７，０６４，２４４号（これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１、Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｉｓ（１９９８），Ｊ．Ｅｘ．Ｍｅｄ，１８８：４８３−４９５、Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ（２００２），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３，５９３−５９７（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）。ＸＭＧ１−ＫＬ、ＸＭＧ２−Ｋ、ＸＭＧ２−Ｋ／Ｂａｌｂｃ、ＸＭＧ２−ＫＬ、ＸＭＧ４−Ｋ及びＸＭＧ４−ＫＬ ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）系統由来の動物をすべての免疫化に使用した。
ＴＬ１Ａ免疫原の生成
最初の２２アミノ酸がＶＫ１シグナルペプチドであるＮ末端のＨｉｓタグ（Ｈ６）を含むＴＬ１Ａポリペプチドを、対応するｃＤＮＡを２９３ＨＥＫ細胞に一過的にトランスフェクトすることによって生成した。検出及びその後の精製を容易にするために、一般に使用されるポリＨｉｓタグを用いた。
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の３ｍｌ ＰＥＩ／ｍｇ ＤＮＡを用いて、０．５ｍｇ／ＬのＤＮＡ（Ｈｉｓ−ＴＬ１Ａを入れたｐＴＴ５ベクター０．１ｍｇ／Ｌと空ｐＴＴ５ベクター０．４ｍｇ／Ｌ）（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＮＲＣＣ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３０，ｅ９）を９．４８×１０５細胞／ｍｌの２９３−６Ｅ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションしてから１時間後に、培養物にトリプトンＮ１を加えた。０．１％プルロニックＦ６８及び５０μｇ／ｍｌジェネテシンを補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地中で懸濁状態で７日間細胞を増殖させ、精製用に収集した。
実施例２
ＴＬ１Ａの生成
最初の２２アミノ酸がＶＫ１シグナルペプチドであるＮ末端のＨｉｓタグ（Ｈ６）を含むＴＬ１Ａポリペプチドを、対応するｃＤＮＡを２９３ＨＥＫ細胞に一過的にトランスフェクトすることによって生成した。検出及びその後の精製を容易にするために、一般に使用されるポリＨｉｓタグを用いた。
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の３ｍｌ ＰＥＩ／ｍｇ ＤＮＡを用いて、０．５ｍｇ／Ｌ ＤＮＡ（Ｈｉｓ−ＴＬ１Ａを入れたｐＴＴ５ベクター０．１ｍｇ／Ｌと空ｐＴＴ５ベクター０．４ｍｇ／Ｌ）（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．ＮＲＣＣ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（２００２）３０，ｅ９）を９．４８×１０５細胞／ｍｌの２９３−６Ｅ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションしてから１時間後に、培養物にトリプトンＮ１を加えた。０．１％プルロニックＦ６８及び５０μｇ／ｍｌジェネテシンを補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地中で懸濁状態で７日間細胞を増殖させ、精製用に収集した。
免疫化
細胞で発現させた組換えヒトＴＬ１Ａ及び組換えヒトＴＬ１Ａ可溶性タンパク質またはこれらの組み合わせを含めた、１種または複数の適切な形態のＴＬ１Ａ抗原を使用して、免疫化を行う。
適切な量の免疫原（すなわち、腹部への注射によって送達される１０μｇのタンパク質）を、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）における最初の免疫化に使用する。最初の免疫化に続いて、免疫原（すなわち、２×１０ｅ６細胞または５μｇのタンパク質）の引き続く追加免疫化をスケジュール通りに、且つマウスにおいて抗ＴＬ１Ａ抗体の適切な力価を誘導するのに必要な期間にわたって施す。任意の適切な方法、例えば、酵素イムノアッセイまたは蛍光標識細胞分取法（ＦＡＣＳ）によって、力価を決定する。
抗ヒトＴＬ１Ａ免疫応答をもたらすために、免疫化の複数の免疫原及び経路を使用した。遺伝子的免疫化については、製造業者の指示に従って、Ｈｅｌｉｏｓ Ｇｅｎｅ Ｇｕｎシステム（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、６〜８週にわたって１２〜１６回マウスを免疫化した。手短に言えば、野生型のヒトまたはカニクイザルＴＬ１Ａをコードする発現ベクターを金ビーズ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にコーティングし、毛を剃ったマウス腹部の表皮に送達した。細胞ベースの免疫化については、ヒトＴＬ１Ａをコードする発現ベクターを安定的にトランスフェクトした、懸濁液に適合させたＣＨＯ−Ｋ１細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）でマウスを免疫化した。皮下注射と腹腔内注射を交互に繰り返すプロトコールを使用して、硫酸アルミニウムカリウムから調製したミョウバン（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）及びＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ ＬＬＣ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）と混合した細胞で、６〜８週にわたって１０〜１２回動物を免疫化した。最初の追加免疫は４×１０６細胞から構成されていたが、引き続く追加免疫は２×１０６細胞を含んでいた。可溶性組換えタンパク質による免疫化については、６×Ｈｉｓタグを付けた三量体形態のヒト及びカニクイザルのＴＬ１Ａ細胞外ドメイン（ＴＬ１Ａ配列のアミノ酸７２〜２５１）で、マウスを免疫化した。皮下注射を使用して、ミョウバン及びＣｐＧ−ＯＤＮと混合した組換えタンパク質で、４〜８週にわたって８〜１２回動物を免疫化した。最初の追加免疫は１０μｇから構成されていたが、引き続く追加免疫は５μｇを含んでいた。ＡｃｃｕｒｉまたはＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターにおける生細胞ＦＡＣＳ解析によって、ヒトＴＬ１Ａ特異的血清力価をモニターした。ヒト及びカニクイザルのＴＬ１Ａに対して抗原特異的血清力価が最も高い動物を屠殺し、ハイブリドーマ生成（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５）に使用した。
実施例３
モノクローナル抗体の調製
ハイブリドーマ生成
適切な力価を示す動物を特定し、リンパ球を流入領域リンパ節から得、必要ならば、各コホートについてプールした。適切な培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で粉砕することによって、プールしたリンパ球（各免疫化コホート由来）をリンパ組織から分離した。Ｂ細胞を、適切な方法を使用して選択及び／または増やすことができ、当技術分野で既知の技法を使用して、適切な融合パートナー、例えば、非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関ＣＲＬ １５８０；Ｋｅａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３，１９７９，１５４８−１５５０）と融合させることができる。Ｂ細胞を標準的な方法を使用して選択及び／または増やし、当技術分野で既知の技法を使用して適切な融合パートナーと融合させた。
１つの適切な融合方法では、リンパ球を融合パートナー細胞と１：４の比で混合する。この細胞混合物を、４００×ｇで４分間の遠心分離によって軽くペレット化し、上清をデカントし、細胞混合物を（例えば、１ｍｌピペットを使用して）軽く混合する。ＰＥＧ／ＤＭＳＯ（ポリエチレングリコール／ジメチルスルホキシド；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯから入手可能；１００万個のリンパ球あたり１ｍｌ）で融合を誘導する。ＰＥＧ／ＤＭＳＯを１分間にわたって軽く撹拌しながら緩徐に加え、続いて、１分間混合する。次いで、ＩＤＭＥＭ（グルタミンを含まないＤＭＥＭ；１００万個のＢ細胞あたり２ｍｌ）を軽く撹拌しながら２分間にわたって加え、続いて、さらなるＩＤＭＥＭ（１００万個のＢ細胞あたり８ｍｌ）を３分間にわたり加える。
融合させた細胞を軽くペレット化し（４００×ｇ、６分）、１００万個のＢ細胞あたり２０ｍｌの選択培地（例えば、アザセリン及びヒポキサンチン［ＨＡ］並びに必要に応じて他の補充材料を含むＤＭＥＭ）に再懸濁する。細胞を３７Ｃで２０〜３０分間インキュベートし、次いで、２００ｍｌの選択培地に再懸濁し、Ｔ１７５フラスコ中で３〜４日間培養してから、９６ウェルにプレーティングする。
得られるコロニーのクローン性を最大にするために、標準的な技法を使用して細胞を９６ウェルプレートに分配する。培養してから数日後、上清を収集し、ヒトＴＬ１Ａへの結合の確認、他の種のＴＬ１Ａ（例えば、カニクイザルのＴＬ１Ａ）との交差反応性及びＴＬ１Ａの活性を阻害する能力の評価を含めて、以下の実施例で詳しく述べるスクリーニングアッセイにかける。陽性細胞をさらに選択し、標準的なクローニング及びサブクローニング技法にかける。クローン株をインビトロで増やすことができ、分泌されたヒト抗体を解析のために得る。
この方法で、およそ２か月にわたって、合計で１５の免疫化について、マウスを組換えヒトＴＬ１Ａ可溶性タンパク質で免疫化し、ＴＬ１Ａ特異的抗体を分泌するいくつかのハイブリドーマ細胞株を得、抗体をさらに特徴づけした。それらの配列を配列表及び表Ａ、Ｃ及びＤに提供し、これらの抗体を使用する様々な試験の結果を本明細書に示す。
本明細書の表Ａ〜Ｅは、本実施例に従って調製した抗ＴＬ１Ａ抗体の配列を示す。
実施例４
ハイブリドーマプールの抗原濃縮
選ばれた免疫性組織収集物由来の融合したハイブリドーマプールを、ＦＡＣＳベースの濃縮のための材料の供給源として使用した。ネイティブ（全長、細胞上（ｏｎ−ｃｅｌｌ））ヒトＴＬ１Ａに特異的な抗体を発現するハイブリドーマについて濃縮するために、ＴＬ１Ａ ｃＤＮＡコンストラクトを一過的に発現している２９３Ｔ細胞から膜を調製した。２９３Ｆｅｃｔｉｎ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用してトランスフェクションしてから２４時間後に、製造者の推奨に従って（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）、Ｅ−Ｚ結合ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンで細胞をビオチン化した。ビオチン化してから、針及び注射器で細胞をホモジナイズして、膜断片を形成し、「膜プレップ」と称した。次いで、ビオチン化した膜プレップを使用して、標準的なビオチン−ストレプトアビジン化学作用を介して、目的の標的に特異的な表面抗体を発現するハイブリドーマを検出した。
目的の抗原についてハイブリドーマプールを濃縮するために、これらを最初に膜プレッププローブとともにインキュベートした。次いで、未結合のプローブを洗い流し、表面ＩｇＧ（Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート化Ｇｔ抗ヒトＦｃ第２抗体；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈを用いる）とビオチン化膜プレップＴＬ１Ａプローブ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲート化ストレプトアビジン；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の同時検出によって、抗原特異的ハイブリドーマを特定した。表面ＩｇＧ及び結合抗原を発現するハイブリドーマをＡｃｃｕｒｉフローサイトメーターにおけるＦＡＣＳ解析で検出した。ＦＡＣＳ Ａｒｉａセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、二重陽性イベントを単一細胞として３８４ウェルプレート中に選別した。数日の培養後、モノクローナル抗体を含むハイブリドーマ上清を収集し、以下の実施例に記載されているスクリーニングアッセイで使用した。
実施例５
ＴＬ１Ａ特異的結合抗体の最初の選択
製造者によって設計されたプロトコールに従って、ｈｕＴＬ１Ａ ｃＤＮＡを発現する発現ベクター、Ｇｉｂｃｏ（商標）Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１９８５０８８）及び２９３Ｆｅｃｔｉｎ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２３４７０１９）を使用するトランスフェクションによって、宿主のヒト胎児由来腎臓２９３細胞でヒトＴＬ１Ａを発現させた。ＦＭＡＴ８２００スクリーニングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）及びＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔイメージングプラットフォーム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ｈｕＴＬ１Ａ特異的モノクローナル抗体の存在について、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。ｈｕＴＬ１Ａ陽性ウェル（すなわち、不適切なハイブリドーマ上清を超えるシグナルを有するもの）の数を表５．１に示す。ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔスクリーニングについては、１５μｌ／ウェルのハイブリドーマ上清（並びに陽性及び陰性コントロール）を黒色の３８４ウェルの底部が透明なプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３７１２）に加え、続いて、３０μｌ／ウェルの、ＴＬ１Ａ／２９３Ｔ細胞、核Ｈｏｅｓｃｈｔ染色剤（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号６２２４９）及びＡｌｅｘａ４８８−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９−５４５−０８８）の混合物を加えた。室温で３時間インキュベートしてから、プレートを（３８４ウェル細胞洗浄ヘッドが装着された）ＡｑｕａＭａｘ４０００プレート洗浄機で２回洗浄し、製造者の推奨に従って、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ機器で読み取った。ＦＭＡＴベースのスクリーニングについては、２０μｌ／ウェルのハイブリドーマ上清（並びに陽性及び陰性コントロール）を黒色の３８４ウェルの底部が透明プレートに加え、続いて、４０μｌ／ウェルの、ＴＬ１Ａ／２９３Ｔ細胞、２９３Ｔ親細胞及びＣｙ５−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９−０７５）の混合物を加えた。室温で３時間インキュベートしてから、製造者の推奨に従って、ＦＭＡＴ８２００システムでプレートを読み取った。
Figure 2019502692
実施例６
ＴＬ１Ａ受容体−リガンドブロック抗体の特定
１００μｇ／ｍｌのＮＨＳ ＬＣ ＬＣビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１３３８）及び１００μｇのｈｕＴＬ１Ａ（実施例２に記載されているように調製した）を１ｍｌのＰＢＳ ｐＨ８．５中で室温で１時間反応させることによって、ビオチン化ｈｕＴＬ１Ａを調製した。５ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ８ ００５）を使用して、限外濾過によって、未反応のビオチンを除去した。ＥＬＩＳＡベースの受容体−リガンドアッセイによって、ｈｕＴＬ１Ａ結合抗体を含むハイブリドーマ上清を、ヒト細胞死受容体３（ｈｕＤＲ３）へのｈｕＴＬ１Ａの結合をブロックするその能力についてアッセイした。ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３７０２）をコーティング緩衝液（１×ＰＢＳ／０．０５％アジド）中で４０μｌ／ウェルのヒトＤＲ３−Ｆｃキメラ（１μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９４３−Ｄ３）でコーティングし、次いで、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを水で３回洗浄し、９０μｌの希釈剤（１×ＰＢＳ／１％ミルク）で室温で３０分間ブロッキングした。１５μｌの抗ＴＬ１Ａハイブリドーマ上清を、９６ウェル貯蔵プレート（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ６８６６）において、アッセイ希釈剤中で、４５μｌのビオチン化ＴＬ１Ａ（最終的に３０ｎｇ／ｍｌ）とともに２時間室温で予めインキュベートしてから、予めブロッキングしたＤＲ３ ＥＬＩＳＡプレートに加えた。次いで、アッセイプレートを室温で１時間インキュベートした。試料プレートを続いて３回洗浄し、続いて、４０μｌ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１１２６）を加え、さらに室温で１時間インキュベートした。プレートをさらに３回洗浄し、４０μｌのＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ、カタログ番号３０８１７７）を加えた。このＴＭＢ反応物を室温で３０分間インキュベートし、次いで、４０μｌ／ウェルの１Ｎ塩酸でクエンチした。最後に、４５０ｎｍの波長のＥＬＩＳＡプレートリーダーでプレートを読み取った。陰性コントロール、すなわち不適切なＥＳＮ（枯渇させた上清）のシグナルの＜３８％にカットオフ設定した。（このカットオフによって定義される場合の）ｈｕＴＬ１Ａ−ＤＲ３相互作用をブロックすることができる試料の数を表６．１に示す。
Figure 2019502692
実施例７
ＴＬ１Ａ機能性ブロッキングアッセイ
ＴＬ１Ａの機能活性をブロックことするができるハイブリドーマについてスクリーニングするために、一次Ｔ細胞からのＩＦＮγの放出またはＴＦ１細胞におけるＮＦ−κＢレポーターアッセイを用いた。ＩＦＮγ放出アッセイについては、ＴＬ１Ａに特異的なハイブリドーマ上清の存在または非存在下で、精製された一次ヒトＴ細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ Ｃｏｒｐ．、カタログ番号２１５−０１−１０）を可溶性ヒトＴＬ１Ａで刺激した。９６ウェルの丸底プレートにおいて、抗ＴＬ１Ａ抗体を含むハイブリドーマ上清の存在下で、２×１０５個の一次ヒトＴ細胞を８〜１６ｎｇ／ｍＬのヒトＴＬ１Ａ（Ａｍｇｅｎ）、１〜２ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び０．５〜１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で、３７℃で７２時間刺激した。次いで、製造業者の指示（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、ＥＬＩＳＡによって、ＩＦＮγレベルについて培養上清を試験した。ＴＬ１Ａ応答性レポーターアッセイについては、ＴＦ−１ ＮＦ−κＢレポーター細胞株（Ａｍｇｅｎ）を可溶性もしくは膜結合ヒトＴＬ１Ａまたは可溶性カニクイザルＴＬ１Ａで刺激した。９６または３８４ウェルプレートにおいて、段階希釈したハイブリドーマ上清（または、コントロール）の存在下で、（それぞれ）０．２〜３ｎＭまたは２〜２０ｎＭの可溶性のヒトまたはカニクイザルＴＬ１Ａを１０４〜１０５のＴＦ−１ ＮＦ−κＢレポーター細胞とともに３７℃で一晩インキュベートした。膜結合ＴＬ１Ａに対する試料の試験については、ＴＦ−１ ＮＦ−κＢレポーター細胞株をヒトＴＬ１Ａを発現するＡＭ１Ｄ細胞と共培養することによって、活性アッセイを行った。３８４ウェルプレートにおいて、５ｕｇ／ｍＬの抗ＴＬ１Ａ抗体（または、コントロール）の存在下で、１０５個のＴＦ−１ ＮＦ−κＢレポーター細胞及び１０３個のＡＭ１Ｄ細胞を３７℃で一晩共培養した。製造者の推奨（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、各ウェルのレポーターシグナルを測定した。
実施例８
ＴＬ１Ａ受容体−リガンドブロック抗体の分子レスキュー及びシークエンシング
ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙミニまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｍＲＮＡ ｃａｔｃｈｅｒ ｐｌｕｓキットを使用して、ＴＬ１Ａ−中和抗体生成ハイブリドーマ細胞を含むウェルからＲＮＡ（全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）を精製した。精製したＲＮＡを使用して、逆転写を介するｃＤＮＡ合成、それに続くポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、抗体重鎖及び軽鎖可変領域（Ｖ）遺伝子を増幅した。Ｑｉａｇｅｎ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、完全ヒト抗体ガンマ重鎖を得た。この方法を使用して、ＲＮＡ鋳型から第１鎖ｃＤＮＡを生成し、次いで、マルチプレックスＰＣＲを使用してガンマ重鎖の可変領域を増幅した（それぞれ、完全なプライマーリストについて、表８．１、配列番号１１９１〜１２５２を参照されたい）。５’ガンマ鎖特異的プライマーは抗体重鎖のシグナル配列にアニールしたが、３’プライマーはガンマ定常ドメインの領域にアニールした。Ｑｉａｇｅｎ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、完全ヒトカッパ軽鎖を得た。この方法を使用して、ＲＮＡ鋳型から第１鎖ｃＤＮＡを生成し、次いで、マルチプレックスＰＣＲを使用してカッパ軽鎖の可変領域を増幅した。５’カッパ軽鎖特異的プライマーは抗体軽鎖のシグナル配列にアニールしたが、３’プライマーはカッパ定常ドメインの領域にアニールした。Ｑｉａｇｅｎ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、完全ヒトラムダ軽鎖を得た。この方法を使用して、ＲＮＡ鋳型から第１鎖ｃＤＮＡを生成し、次いで、マルチプレックスＰＣＲを使用してラムダ軽鎖の可変領域を増幅した。５’ラムダ軽鎖特異的プライマーは軽鎖のシグナル配列にアニールしたが、３’プライマーはラムダ定常ドメインの領域にアニールした。
エキソヌクレアーゼＩ及びアルカリホスファターゼを使用して、増幅したｃＤＮＡを酵素的に精製し、精製したＰＣＲ産物を直接的にシークエンスした。対応する核酸配列からアミノ酸配列をバイオインフォマティクス的に推定した。観察されるいかなる変異もＰＣＲの結果でないことを確認するために、２つのさらなる独立したＲＴ−ＰＣＲ増幅及びシークエンシングサイクルを各ハイブリドーマ試料について完了した。次いで、得られたアミノ酸配列を解析して、抗体の生殖系列配列起源を決定し、生殖系列配列からの逸脱を特定した。シークエンスした抗体のＣＤＲに対応するアミノ酸配列を整列させ、これらのアライメントを使用して、類似性によってクローンをグループ化した。
Figure 2019502692
Figure 2019502692
実施例９
ヘテロＩｇコンストラクトの調製
２つの異なる抗体の共発現を介する二重特異性抗体の生成は、誤って対になった重鎖及び軽鎖から主に成る混入物をもたらす。正確に対になった軽鎖と結合している２つの異なる重鎖を有する、好ましい二重特異性ヘテロ四量体分子は、アセンブルすることができる組み合わせの総量のうちのほんの少数である。混入物は、主に２つの異なる理由が原因で生じる。第１の理由は、抗体のＦｃ領域で一緒になる重鎖がホモ二量体化して、従来の単一特異性抗体をもたらし得るか、またはヘテロ二量体して、潜在的な二重特異性抗体をもたらし得ることである。第２の理由は、軽鎖が乱雑であり、重鎖のいずれかと対になることができ、これによって、所望の標的への結合を保持することができない、誤って対になった軽鎖−重鎖Ｆａｂアセンブリーをもたらすことである。これらの理由で、二重特異性の設計は二段階プロセスである。最初の目標は、重鎖のホモ二量体化を防止すること、及びヘテロ二量体化を助長することである。これは、例えば、ノブイントゥホールまたは電荷対変異ストラテジーを使用して抗体のＦｃ領域を設計することを介して、達成することができる。第２の目標は、軽鎖がその同種の重鎖のみと特異的に結合するように、軽鎖−重鎖境界面を設計することである。
「ヘテロ−Ｉｇ」プラットフォーム技術（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００９０８９００４及びＷＯ２０１４０８１９５５を参照されたい）は、上述の対形成問題を克服するために、静電的ステアリングメカニズムを利用する。特に、重鎖ヘテロ二量体化を推進し、軽鎖−重鎖結合を訂正するために、荷電残基が導入または活用される。Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン中の電荷対変異（ＣＰＭ）は、静電引力を引き起こす逆の電荷を介して、２つの異なる重鎖のヘテロ二量体化を推進する（例えば、ＷＯ２００９０８９００４及び米国特許第８，５９２，５６２号を参照されたい）。２つの同一の重鎖の組み合わせは、同一の並置電荷を有するので、反発する。
正確な重鎖−軽鎖対形成は、ＨＣ／ＬＣ結合面またはＨＣ１／ＨＣ２結合面のＣＰＭによって促進される（図１を参照されたい）。正確な重鎖−軽鎖の組み合わせは逆の電荷を有するので、互いに引きつけられるが、不正確な重鎖−軽鎖の組み合わせは並置された同じ電荷を有し、反発が生じる。図１では、正確にアセンブルされたヘテロ−Ｉｇ分子は、２つの異なる重鎖及び２つの異なる軽鎖を含む好ましいヘテロ四量体のアセンブリーを推進する、２つまたは３つのＨＣ１／ＨＣ２ ＣＰＭ及び２つから４つのＨＣ／ＬＣ ＣＰＭを有し、その結果、ヘテロ四量体は、発現システムによって生成される大多数の成分になる。抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−αヘテロＩｇ−ｓをコードするＤＮＡは、抗ＴＬ１Ａ（または抗ＴＮＦ−α）重鎖及び抗ＴＮＦ−α（または抗ＴＬ１Ａ）Ｆａｂをコードする断片を含む。このＤＮＡをｐＴＴ５．１ベクターにクローニングした。次いで、これらの発現ベクターを使用して、ヒト２９３ ６Ｅ細胞において、抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α二重特異性体をトランスフェクトし、発現させた。
抗ＴＮＦ−α抗体の３．２、２３４及びセルトリズマブを抗ＴＬ１Ａ抗体の３Ｂ３、２Ｇ１１、２３Ｂ３ ＶＨ３、２３Ｂ３ＶＨ４及び３Ｃ６とともに使用して、ハイスループットなクローニング、発現及び精製を使用して、表Ｊに記載されているヘテロＩｇ分子を設計した。二重特異性ヘテロＩｇ分子のそれぞれは、ＩｇＧ１エフェクター機能のないスキャフォールドまたはＩｇＧ２スキャフォールドを使用して、図１に示される４型式のうちの１つを有していた。好ましいＩｇＧ分子は図１（ｖ２）に示される電荷変異を組み入れ、これは表Ｍに示される。ＩｇＧ１エフェクター機能のないスキャフォールドは置換Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃを含み、置換Ｎ２９７Ｇを含むこともできる（ＳＥＦＬ２スキャフォールドとしても知られる）。
実施例１０
抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦαヘテロ−Ｉｇ分子の発現及び精製の方法
ヘテロ−Ｉｇの発現を２９３−６Ｅ細胞の一過的トランスフェクションを介して行った。トランスフェクションの１日前に、Ｎ−１培養を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｆ−１７培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に８．５Ｅ５ｖｃ／ｍＬで全量９Ｌの培養液を用いて、３６℃〜３７℃、５％ＣＯ２、０．２ＬＰＭオーバーレイで、２０ＬのＷａｖｅバッグ中にセットした。次いで、１：１：１：１のプラスミドＤＮＡ鎖比で、予め温めたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ−１７培地を０．５ｍｇ／ＬのトランスフェクションＤＮＡと混合することによって、トランスフェクション複合物を調製した。トランスフェクション複合物（培地＋ＤＮＡ＋ＰＥＩ試薬）量は、最終培養量の１０％であった。トランスフェクションしてから４時間後に、イーストレート及びグルコースの供給物を加えた。培養物を、２．１１ Ｅ６細胞／ｍＬ及び７８．２％の生存率で６日目に収集した。８４．０ｍｇ／ＬでＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｑシステムを使用して、発現力価を測定した。条件培地を遠心分離によって収集し、ペリスタルティックポンプを使用して、０．２μｍのセルロースアセテートフィルターによって濾過した。
精製については、洗浄緩衝液として二価陽イオンを含まないダルベッコのＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、及び溶出緩衝液として１００ｍＭ酢酸、ｐＨ３．６を使用して、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅクロマトグラフィー（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって、ヘテロ−Ｉｇ分子を親和性捕獲した（図３）。すべての分離は周囲温度で行った。溶出ピークをクロマトグラムに基づいてプールし、２Ｍトリス塩基を使用してｐＨ７．０に中和し、５容量の水で希釈し、０．２２μｍのセルロースアセテートフィルターを通して濾過した。半抗体種を除去するために、次いで、試料をＳＰ−ＨＰセファロースカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にロードし、８カラム容量のＳＰ−緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で洗浄し、続いて、６０％ＳＰ−緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）までの２０カラム容量のグラジエントを使用して溶出した（図４）。クロマトグラム及び画分のＣａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）解析に基づいて、プールを作製した。プールを等容量の２×ＨＩＣ緩衝液（２００ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０）で調節し、０．２２μｍのセルロースアセテートフィルターを通して濾過した。誤って対になった種を除去するために、試料をブチル−ＨＰセファロースカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にロードし、８カラム容量のブチル−緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．７５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０）で洗浄し、続いて、１００％ブチル−緩衝液Ｂ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）までの２０カラム容量のグラジエントを使用して溶出した（図５）。クロマトグラム並びに非還元及び還元条件下での画分のＣａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）解析に基づいて、プールを作製した。１０ｋＤａのカットオフ膜を有するＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して、およそ３０容量の１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％ショ糖、ｐＨ５．２に対してプールを透析濾過し、１０ｋＤａのカットオフ膜を有するＶｉｖａｓｐｉｎ−２０遠心濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、さらに濃縮した。次いで、濃縮した材料を０．８／０．２μｍのセルロースアセテートフィルターを通して濾過し、およそ２１２，０００の吸光係数を使用して、２８０ｎｍの吸光度によって濃度を決定した。還元（２％の２−メルカプトエタノールを用いる）及び非還元（２５ｍＭのヨードアセトアミドを用いる）条件下で、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ分析によって、試料の純度を決定した（図６）。１８分にわたる、５０ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．９における定組成溶出を用いて、Ｚｅｎｉｘ−Ｃ ＳＥＣ−３００カラム（Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）を使用して、分析用ＳＥＣを行った（図７）。
両方のヘテロ−Ｉｇ完全性を評価し、重鎖−軽鎖対形成を確認するために、非還元ヘテロ−Ｉｇ及びヘテロ−Ｉｇのヘテロ−Ｉｇ Ｆａｂ（抗原結合断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ））領域を生成するための制限リジルエンドプロテイナーゼＣ（Ｗａｋｏ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）消化後のヘテロ−Ｉｇに対して、ＬＣ−ＭＳを行った。非還元ヘテロ−Ｉｇの解析は、０．１％ＴＦＡ中に１：１の、３０μｇのネイティブヘテロ−Ｉｇ試料の単純希釈及び２０μｇの注入により行った。Ｆａｂの解析は、ｐＨ８に調整した１００ｍＭ Ｔｒｉｓの存在下で１：４００の酵素／基質比を使用するリジルエンドプロテイナーゼＣの存在下で、ヘテロ−Ｉｇを３７℃で３０分間インキュベートすることによって達成した。次いで、等量の０．１％ＴＦＡで希釈することによって、反応を停止した。リジルエンドプロテイナーゼＣによる抗体の最初の切断は、配列モチーフＳＣＤＫ／ＴＨＴＣＰＰＣのリジンの後のヒンジジスルフィドのすぐ上であり、これは、Ｆａｂ及びＦｃ断片をもたらす。
Ａｇｉｌｅｎｔ ６２３０ ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計及び１２６０クオータナリーＨＰＬＣシステム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ８、２．１×５０ｍｍ ３．５μｍカラムを備える）（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、質量分析を行った。移動相Ａは０．１％ＴＦＡから成っており、移動相Ｂは９０％ｎ−プロパノール、０．１％ＴＦＡの水溶液から成っていた。非還元ヘテロ−Ｉｇの解析のためのクロマトグラフィーのグラジエント条件は以下の通りであった：１分間の２０％移動相Ｂ；１〜９分、２０〜７０％のＢ；９〜１０分、７０〜１００％のＢ；１０〜１１分、１００％のＢ。カラム温度を７５℃に維持し、２０％移動相Ｂでのポストカラム平衡化を７分間行ってから、次の試料を注入した。ＥＳＩ−ＴＯＦの設定は以下の通りであった：キャピラリー電圧、５９００Ｖ；ガス温度、３４０℃；乾性ガス、１３Ｌ／分；ネブライザー圧力、２５ｐｓｉｇ；フラグメンター電圧、４６０Ｖ及びスキマー電圧、９５Ｖ（図８）。
ｌｙｓｌエンドプロテイナーゼＣで消化したヘテロ−Ｉｇの解析は、逆相ＨＰＬＣカラムに２０μｇを注入し、以下のＬＣグラジエントを使用して溶出することによって行った：２分間保たれる２％移動相；２〜１２分、２〜４５％のＢ；１２〜１６分、４５〜９０％のＢ；１６〜１７分、９０％のＢ。カラム温度を７５℃に維持し、２０％移動相Ｂでのポストカラム平衡化を７分間行ってから、次の試料を注入した（図９）。
実施例１１
ＩｇＧ−ＳｃＦｖコンストラクトの調製
各抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−αＩｇＧ−ｓｃＦｖ抗原結合タンパク質は２つの抗原結合ドメインから成り、１つはＴＬ１Ａに対するものであり、もう１つはＴＮＦ−αに対するものである。抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−αＩｇＧ−ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、生物物理学的特性を向上させる目的で、システインクランプの有無にかかわらず、抗ＴＮＦ−α（または、抗ＴＬ１Ａ）抗体の単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）にＣ末端が融合している抗ＴＬ１Ａ（または、抗ＴＮＦ−α）重鎖（ＨＣ）（図２を参照されたい）をコードする断片を含む。システインクランプを導入するために、ＶＨの位置４４（Ｋａｂａｔナンバリング）及びＶＬの１００（Ｋａｂａｔナンバリング）をシステインに変異させた。これらのＤＮＡをｐＴＴ５．１ベクターにクローニングした。次いで、これらの発現ベクターを使用して、ヒト２９３−６Ｅ細胞において、抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α二重特異性体をトランスフェクトし、発現させた。生成される抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−αＩｇＧ−ｓｃＦｖ抗原結合タンパク質の完全な配列を表Ｌ及びＭに示す。
実施例１２
抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦαＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子の精製方法
一過的な２９３の生成を介して、ＩｇＧ−ＳｃＦｖの発現を行った。トランスフェクションの１日前、培養を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｆ−１７培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に各８．５Ｅ５ｖｃ／ｍＬで全量２．２５０Ｌの培養液を用いて、８つの５ＬのＴｈｏｍｐｓｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｙｉｅｌｄフラスコにセットした。培養を３６℃〜３７℃、５％ＣＯ２及び１２０ＲＰＭの振盪で維持した。２０％のコーディングプラスミド及び８０％の空ｐＴＴ５ベクター並びに１０％最終培養量のＰＥＩを使用して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ−１７培地を０．５ｍｇ／ＬのＤＮＡと混合することによって、トランスフェクション複合物を調製した。４時間後、酵母可溶化液及びグルコースの供給物を各フラスコに加えた。トランスフェクションしてから６日目後に、遠心分離によって細胞を収集し、プールし、濾過した。２５ｍｇ／ＬでのＦｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔによって、平均力価を測定した。
洗浄緩衝液として二価陽イオンを含まないダルベッコのＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、及び溶出緩衝液として１００ｍＭ酢酸、ｐＨ３．６を使用して、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅクロマトグラフィー（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子を親和性捕獲した（図１０）。親和性分離は周囲温度で行った。溶出ピークをクロマトグラムに基づいてプールし、２Ｍトリス塩基を使用してｐＨ７．０に中和し、１容量の１０ｍＭクエン酸、７５ｍＭリジン、４％トレハロース、ｐＨ７．０で希釈し、３０ｋＤａカットオフ膜を有するＶｉｖａｃｅｌｌ−１００遠心濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、およそ２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。高分子凝集物を除去するために、試料を０．８／０．２μｍセルロースアセテートフィルターを通して濾過し、次いで、１０ｍＭクエン酸、７５ｍＭリジン、４％トレハロース、ｐＨ７．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｐｒｅｐ Ｇｒａｄｅカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にロードし、同じ緩衝液を用いる定組成グラジエントで溶出した（図１１）。ゲル濾過分離をおよそ７℃で行った。クロマトグラム及びＺｅｎｉｘ−Ｃ ＳＥＣ−３００カラム（Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）を使用する画分の分析用ＳＥＣに基づいて、プールを作製した。このプールを３０ｋＤａのカットオフ膜を有するＶｉｖａｓｐｉｎ−２０遠心濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してさらに濃縮し、０．８／０．２μｍのセルロースアセテートフィルターを通して濾過した。およそ３４１，０００の吸光係数を使用して、２８０ｎｍの吸光度によって濃度を決定した。還元（２％の２−メルカプトエタノールを用いる）及び非還元（２５ｍＭのヨードアセトアミドを用いる）条件下で、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ分析によって、試料の純度を決定した（図１２）。１８分にわたる、５０ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．９における定組成溶出を用いて、Ｚｅｎｉｘ−Ｃ ＳＥＣ−３００カラム（Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）を使用して、分析用ＳＥＣを行った（図１３）。
Ｉｇ−ｓｃＦｖｓのサイズが大きい（２００ｋＤａ以上）ため、ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析によって正確な質量を得ることができなかった。質量を確認し、品質を評価するために、Ｉｇ−ｓｃＦｖをＩｄｅＳプロテアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）による消化（これは、配列モチーフＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ／ＧＰのグリシンの間で、ＩｇＧヒンジジスルフィドのすぐ下を切断し、（Ｆａｂ）２及びＣ末端に融合したｓｃＦｖを有するＦｃをもたらす）後に解析した。１：１０の酵素基質比を使用して、ＩｄｅＳプロテアーゼの存在下で、Ｉｇ−ｓｃＦｖを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、試料を０．１％ＴＦＡ中に１：１に希釈し、２０μｇをＬＣ−ＭＳに注入した。
Ａｇｉｌｅｎｔ ６２３０ ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計及び１２６０クオータナリーＨＰＬＣシステム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ８、２．１×５０ｍｍ ３．５μｍカラムを備える）（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、質量分析を行った。移動相Ａは０．１％ＴＦＡから成っており、移動相Ｂは９０％ｎ−プロパノール、０．１％ＴＦＡの水溶液から成っていた。ＩｄｅＳプロテアーゼで消化したＩｇ−ｓｃＦｖの解析は、２０μｇを注入し、以下のＬＣグラジエントを使用して溶出することによって行った：２分間保たれる２％移動相；２〜１２分、２〜４５％のＢ；１２〜１６分、４５〜９０％のＢ；１６〜１７分、９０％のＢ。カラム温度を７５℃に維持し、２０％移動相Ｂでのポストカラム平衡化を７分間行ってから、次の試料を注入した（図１４）。
実施例１３
ＴＬ１Ａ結合アッセイ
ヤギ抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ、カタログ番号１０９−００５−０９８）を、アミン結合を使用してＳＣＭ５センサーチップに最初に固定化した。抗ＴＬ１Ａモノクローナル抗体、Ｆａｂ断片（抗ｈｕＦａｂ抗体、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８−９５８３−２５を使用する）または抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α二重特異性分子を１０μｌ／分で１分間チップに注入した。試料緩衝液（ＰＢＳ、０．００５％のＰ２０、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）中に０．７８〜２５ｎＭの様々な濃度のヒトまたはカニクイザルＴＬ１Ａタンパク質を、３分の結合、１０分の解離に対して、５０μｌ／分の流速で注入した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで１：１結合モデルを使用して、オン速度、オフ速度及び平衡解離定数を計算した。
表１３．１〜１３．３は、抗ＴＬ１Ａ抗体、ヘテロＩｇ二重特異性抗体及びＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体に対する抗ＴＬ１Ａ結合データを示す。
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実施例１４
ＴＬ１Ａ活性アッセイ
ＴＦ−１ ＮＦ−κＢレポーター細胞株を使用して、ＴＬ１Ａ活性アッセイを行った。手短に述べると、９６ウェルプレート中で、段階希釈した抗ＴＬ１Ａ抗体または抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α二重特異性分子の存在下で、３０ｎｇ／ｍｌ（ＥＣ９０）のヒトまたはカニクイザルＴＬ１Ａを１０４個のＴＦ−１ ＮＦ−κＢレポーター細胞とともに３７℃で一晩インキュベートした。５０μｌのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試験溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに補充した。プレートをカバーし、１０分間振盪しながらインキュベートした。マイクロベータリーダーによって、ルシフェラーゼ活性を解析した。
表１４．１−１４．３は、ヒト及びカニクイザルのＴＬ１Ａの両方を用いた、抗ＴＬ１Ａ抗体、ヘテロＩｇ二重特異性抗体、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体及びＦａｂに対する抗ＴＬ１Ａの品質管理（ＱＣ）及び活性のデータを示す。
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実施例１５
ＴＮＦ−α結合アッセイ
ヤギ抗ヒトＦｃを、アミン結合を使用してＳＣＭ５センサーチップ最初に固定化した。抗ＴＮＦモノクローナル抗体、Ｆａｂ断片またはＴＬ１Ａ／ＴＮＦ二重特異性体を１０μｌ／分で１分間チップに注入した。試料緩衝液（ＰＢＳ、０．００５％のＰ２０、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）中に０．７８〜２５ｎＭの様々な濃度のヒトまたはカニクイザルＴＮＦタンパク質を、３分の結合、１０分の解離に対して、５０μｌ／分の流速で注入した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで１：１結合モデルを使用して、オン速度、オフ速度及び平衡解離定数を計算した。
表１５．１〜１５．３は、抗ＴＮＦ−α抗体、ヘテロＩｇ二重特異性抗体、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体及びＩｇＧ−Ｆａｂ二重特異性抗体に関するＴＮＦ−α結合活性データを示す。
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実施例１６
ＴＮＦ−α活性アッセイ
ＴＦ−１ ＮＦ−ｋＢレポーター細胞株を使用して、ＴＮＦ−α活性アッセイを行った。手短に述べると、９６ウェルプレート中で、段階希釈した抗ＴＮＦ−α抗体またはＴＬ１Ａ／ＴＮＦ−α二重特異性分子の存在下で、１ｎｇ／ｍｌ（ＥＣ９０）のヒトまたはカニクイザルＴＮＦ−αを１０４個のＴＦ−１ ＮＦ−κＢレポーター細胞とともに３７℃で一晩インキュベートした。５０μｌのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試験溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加えた。プレートをカバーし、１０分間振盪しながらインキュベートした。マイクロベータリーダーによって、ルシフェラーゼ活性を解析した。
表１６．１は、抗ＴＮＦ抗体に対する抗ＴＮＦ−αのＱＣ及び活性のデータを示す。表１４．２及び１４．３は、それぞれ、ヘテロＩｇ二重特異性抗原結合タンパク質及びＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗原結合タンパク質に対する、抗ＴＮＦ−α結合活性を示す。
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実施例１７
二重特異性分子の活性
二重特異性抗原結合タンパク質のヒト及びカニクイザルのＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αの結合活性を実施例１３及び１５に記載されているように決定した。表１７．１にデータを示す。
Figure 2019502692
二重特異性抗原結合タンパク質のヒト及びカニクイザルのＴＬ１Ａ及びＴＮＦ−αのブロッキング活性を実施例１４及び１６に記載されているように決定した。表１７．２にデータを示す。
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実施例１８
ＳＮＰ遺伝子型判定
発現との潜在的なＴＬ１Ａ遺伝子型の関連を評価するために、ＱｉａｇｅｎのＧｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｔｉｓｓｕｅキットを使用して、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を健常なＰＢＭＣドナーから単離した。ＬｉｆｅＴｅｃｈのｒｓ７８４８６４７、ｒｓ６４７８１０９、ｒｓ６４７８１０８及びｒｓ３８１０９３６アッセイに関するＴａｑＭａｎ ＳＮＰ遺伝子型判定アッセイ並びにＢｉｏ−ＲａｄドロップレットデジタルＰＣＲプラットフォームに対する標準的なプロトコールを使用して、ゲノムＤＮＡを遺伝子型判定した。手短に言えば、各ドナー由来の１０ｎｇのｇＤＮＡを、ｄｄＰＣＲ（商標）Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及び目的の各ＳＮＰに対するＴａｑＭａｎ ＳＮＰ遺伝子型判定アッセイ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）と混合した。ＱＸ１００（商標）ドロップレットジェネレーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ドロップレットを各反応について生成し、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で温度サイクルにかけた。増幅に続いて、ドロップレットの蛍光をＱＸ１００（商標）ドロップレットリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で読み取り、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してデータを解析した。リスクアレルのみが４つすべての遺伝子型判定されたＳＮＰｓ（ｒｓ７８４８６４７、ｒｓ６４７８１０９、ｒｓ６４７８１０８及びｒｓ３８１０９３６）に存在する場合、ドナーをホモ接合型リスクハプロタイプと考えた。非リスクアレルのみが４つの遺伝子型判定されたＳＮＰｓに存在する場合、ドナーをホモ接合型非リスクハプロタイプと考えた。４つすべての遺伝子型判定されたＳＮＰｓにリスク及び非リスクアレルの両方が存在する場合、ドナーをヘテロ接合型ハプロタイプと考えた。「組換え」と考えたドナーは、ｒｓ７８４８６４７、ｒｓ６４７８１０９及びｒｓ６４７８１０８にホモ接合型リスクアレルのみを有していたが、ｒｓ３８１０９３６ではヘテロ接合型（リスク及び非リスクアレルが存在）であった。
ＴＬ１Ａ遺伝子のエクソン４における同義ＳＮＰ（ｒｓ３８１０９３６）の存在によって、アレル発現不均衡（ＡＥＩ）研究において、アレル特異的蛍光プローブを使用するドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって、リスクアレル対非リスクアレルの発現を追跡することが可能になった。基底レベルにおけるまたは免疫複合体刺激後のヘテロ接合型ＰＢＭＣにおける、リスクアレルの使用対非リスクアレルの使用の頻度を様々な時点で評価した。手短に述べると、ＴＬ１Ａ遺伝子型についてヘテロ接合型のＰＢＭＣを様々な時間にわたって免疫複合体で処理した。次いで、ＱｉａｇｅｎのオンカラムＤＮａｓｅＩ消化を用いて、Ｒｎｅａｓｙミニキットを使用して、ＰＢＭＣからＲＮＡを単離した。製造者の指示書（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）に従って、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキットを使用して、各試料からのＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ｒｓ３８１０９３６に対して特異的なＴａｑＭａｎ ＳＮＰ遺伝子型判定アッセイ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）及びＢｉｏ−ＲａｄドロップレットデジタルＰＣＲプラットフォームに対する標準的なプロトコールを使用して、ｒｓ３８１０９３６におけるアレル特異的発現を判定した。手短に述べると、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアによって各試料について数えられる陽性ドロップレットの数を最大にすることによって精度を高めるために、投入ｃＤＮＡの量を各時点でのＴＮＦＳＦ１５発現について最初に最適化した。試料あたりの最適な量のｃＤＮＡをｄｄＰＣＲ（商標）Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及びｒｓ３８１０９３６に対するＴａｑＭａｎ ＳＮＰ遺伝子型判定アッセイ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）と混合した。ＱＸ１００（商標）ドロップレットジェネレーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ドロップレットを各反応について生成し、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で温度サイクルにかけた。増幅に続いて、ドロップレットの蛍光をＱＸ１００（商標）ドロップレットリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で読み取った。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してデータを解析し、ｒｓ３８１０９３６における各アレルのコピー／ｍｌを決定した。アレル発現比は、リスクアレルのコピー／ｍｌを非リスクアレルのコピー／ｍｌで割ることによって計算した。各アレルの全コピー数をｃＤＮＡの投入量（コピー／ｎｇ）で正規化し、各時点における各アレルの倍数誘導を目的の時点におけるコピー／ｎｇをベースライン（０時間）におけるコピー／ｎｇで割ることによって計算した。アレル発現不均衡研究において、ヘテロ接合型ＰＢＭＣの非リスクアレルと比較して、ＴＬ１Ａリスクアレルの高い誘導が免疫複合体処理後のＰＢＭＣにおいて観察された。
本発明者（ら）は、ｒｓ７８４８６４７、ｒｓ６４７８１０９及びｒｓ６４７８１０８におけるリスクアレルに対してホモ接合型であるが、ｒｓ６４７８１０９と同義ＳＮＰ ｒｓ３８１０９３６の間の組換えがおそらく原因で、ｒｓ３８１０９３６においてヘテロ接合型である、少数のドナーを特定した。これらのドナーは同義ＳＮＰ ｒｓ３８１０９３においてヘテロ接合型であるので、本発明者（ら）は、リスクアレル及び非リスクアレルの使用を追跡することができ、これらのドナーにおいてアレル発現不均衡が依然として保持されているかどうかを評価することができた。興味深いことに、ヘテロ接合型ドナーと比較して、アレル発現不均衡は、免疫複合体刺激の前または後のこれらの組換え個体において検出されなかった。これは、同義ＳＮＰ ｒｓ３８１０９３それ自体はアレル不均衡な制御に関与しないことを示す。調節性ＳＮＰｓは、ｒｓ７８４８６４７、ｒｓ６４７８１０９、ｒｓ６４７８１０８及び／または同義ＳＮＰ ｒｓ３８１０９３６に対して５’側の他のＳＮＰｓにおそらく由来する。
ＴＬ１Ａのアレル発現不均衡データが発現定量的形質遺伝子座（ｅＱＴＬ）と関連があるかどうかを評価するために、ホモ接合型ＴＬ１Ａリスクアレル、ホモ接合型非リスクアレルまたはヘテロ接合型アレルを有するＰＢＭＣドナーを免疫複合体で処理した。先に記載されているように、各試料からのＲＮＡを単離し、次いでｃＤＮＡに変換した。各ドナーにおけるＴＬ１Ａ（ＴＮＦＳＦ１５）の全発現をデジタルＰＣＲによって決定した。手短に述べると、各試料からのｃＤＮＡをｄｄＰＣＲ（商標）Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及びＰｒｉｍｅＴｉｍｅ（登録商標）ｑＰＣＲアッセイＩＤ Ｈｓ．ＰＴ．５６ａ．４１００３９７０と混合した。ＱＸ１００（商標）ドロップレットジェネレーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ドロップレットを各反応について生成し、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で温度サイクルにかけた。増幅に続いて、ドロップレットの蛍光をＱＸ１００（商標）ドロップレットリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で読み取った。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してデータを解析し、ＴＬ１Ａのコピー／μｌを決定し、投入ｃＤＮＡの量（コピー／ｎｇ）に対して正規化した。スチューデントのｔ検定を使用して、異なるＴＮＦＳＦ１５ハプロタイプ間のＴＬ１Ａ発現レベルの差に対するＰ値を決定した。ＴＬ１ＡはＰＢＭＣにおいて非常に低い基底レベルで発現しているが、免疫複合体刺激後に強く誘導される。基底レベルでは、ＴＬ１ＡリスクＳＮＰｓに対してホモ接合型のドナー由来のＰＢＭＣは、非常に低いコピー数においてではあるが、非リスクホモ接合型ドナーと比較して低いＴＬ１Ａ ｍＲＮＡを有し、これは、刺激がなければリスクアレル対非リスクアレルの低い比を示したアレル発現不均衡研究と矛盾がない。しかし、免疫複合体刺激後は、ＴＬ１ＡリスクＳＮＰｓに対してホモ接合型のドナー由来のＰＢＭＣは、非リスクホモ接合型ドナーと比較して高いＴＬ１Ａ発現を有する。これらのデータは、合わせて、ＴＬ１ＡリスクＳＮＰｓがより高いＴＬ１Ａ誘導を調節することを示した。本発明者（ら）は、ＩＢＤなどの炎症状態では、ＴＬ１ＡリスクＳＮＰｓを保有するドナーは、サイトカイン、オプソニン化または非オプソニン化微生物などの刺激に遭遇した際に、より高いＴＬ１Ａ誘導におそらく遭遇すると推測する。したがって、ＴＬ１ＡリスクＳＮＰｓは、ＴＬ１Ａ阻害剤または抗ＴＬ１Ａ／抗ＴＮＦ−α二重特異性阻害剤に対する患者の層別化に使用することができる。
ＴＬ１Ａ遺伝子型媒介性発現制御が組織特異的であるかどうかを評価するために、様々なドナー由来のＨＵＶＥＣ細胞を、先に記載されているように遺伝子型判定した。様々なドナー由来の遺伝子型判定したＨＵＶＥＣ細胞を様々な時点でＩＬ−１で処理した。各アレルの全コピー数を、先に記載されているように測定した。アレル発現比は、リスクアレルのコピー／ｍｌを非リスクアレルのコピー／ｍｌで割ることによって計算した。ＩＬ−１処理の有無にかかわらず、ＨＵＶＥＣ細胞においてアレル発現不均衡は観察されなかった。
実施例１９
マウスＩＢＤモデル
ＩＢＤにおけるＴＬ１Ａの役割を評価するために、マウスＩＢＤモデルで一連の前臨床実験を行った。マウスｍｄｒ１ａ−／−の自発的大腸炎モデルでＴＬ１Ａ阻害の効果を評価した。Ｍｄｒ１ａ遺伝子は、Ｐ−糖タンパク質１７０に対する複数の薬物抵抗性遺伝子をコードする。ｍｄｒ１ａ遺伝子がノックアウトされたマウスは、腸管バリアが弱まるために、１２週齢から自発的な大腸炎を発生する傾向がある。疾患の経過は腸内微生物の影響を受ける。本発明者らの実験では、雌のＭｄｒ１ａ−／−または野生型のＦＶＢコントロールを４〜６週齢でＴａｃｏｎｉｃから得た。動物の体重及び臨床的疾患活性を定期的にモニターした。臨床疾患活性スコアは、肛門炎症（０＝なし、１＝軽度、２＝中程度、３＝重度、４＝直腸脱）及び便の硬さ（０＝正常、１＝湿性／粘着性、２＝軟性、３＝下痢、４＝血性）を評価して得られたスコアの合計を使用して得た。ベースラインの臨床疾患活性測定値に基づいてマウス（ｎ＝１０、６〜７週齢）をランダム化して異なる群にし、８週にわたって、５００μｇの抗マウスＴＬ１Ａ抗体、抗ＩＬ２３ｐ１９抗体、抗マウスＩＬ１７ＲＡ抗体またはマウスアイソタイプコントロールで週１回腹腔内的に処理したか、週１回、処理をしなかった。次いで、マウスを屠殺し、腸の切片を得て、Ｈ＆Ｅ染色について処理してから、病理学者が疾患についてスコア化した。組織病理検査基づいて以下のスコアを割り当てた：０＝正常；１＝最小の単核浸潤及び／または上皮肥大／過形成；２＝軽度の単核浸潤及び／または上皮肥大／過形成；３＝まれな腺窩膿瘍をともなう、中程度の単核浸潤及び／または上皮肥大／過形成；４＝顕著な３と同じもの＋大量の腺窩膿瘍及び腺窩脱落及び／または限局的潰瘍；５＝重度の４と同じものであるが、大きな領域の腺窩脱落及び／または広範な領域の潰瘍。統計解析は、ｍＩｇＧ１群と比較して、Ｄｕｎｅｔｔ法を用いる一元配置ＡＮＯＶＡを使用して行った。結論として、抗ＴＬ１ＡｍＡｂによる予防的処理は、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて自発的な大腸炎の発生を阻害した。
本発明者（ら）は、腸管バリアが弱まるために、１２週齢から自発的な大腸炎を発生する傾向があるｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて、ＴＬ１Ａタンパク質によるチャレンジが大腸炎の発生を悪化させるかどうかも評価した。６〜８週齢のＭｄｒ１ａ−／−マウスまたは野生型コントロールマウスを、４週間にわたって、１５０μｇの組換えｍＦｃ−ＴＬ１Ａ融合タンパク質で週１回またはアイソタイプコントロールで週３回、腹腔内的に処理した。臨床的疾患活性を、先に記載されているように肛門炎症及び便の硬さを評価することによってモニターした。４週間の処理後、マウスを屠殺し、腸の切片を得て、Ｈ＆Ｅ染色について処理してから、先に記載されているように疾患についてスコア化した。統計解析は、ｍＩｇＧ１群と比較して、Ｄｕｎｅｔｔ法を用いる一元配置ＡＮＯＶＡを使用して行った。ＴＬ１Ａタンパク質のチャレンジは、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて大腸炎の発生を激しく悪化させたが、野生型マウスではそうではなかった。
本発明者（ら）は、ｍｄｒ１ａ−／−マウス対野生型マウスにおいて、粘膜固有層リンパ球におけるＴＬ１Ａチャレンジの影響をさらに調べた。手短に述べると、以前に述べられているように（Ｄ’Ｓｏｕｚａ ＷＮ ｅｔ ａｌ．，ＪＩ，Ｖ１６８：５５６６−５５７２，２００２）、粘膜固有層リンパ球を単離した。手短に述べると、腸を単離し、縦方向に切開し、緩衝液ですすぎ、０．５ｃｍの小片に切った。次いで、これをＥＤＴＡ中で２回洗浄し、上清を捨てた。この小片をＲＰＭＩで洗浄し、コラゲナーゼ／ＤＮａｓｅ中で３０分間インキュベートした。単離した細胞をパーコールグラジエントに通し、界面相で収集した細胞を表面抗原について染色し、ＦＡＣＳによって解析した。Ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおけるＴＬ１Ａチャレンジは、粘膜固有層における炎症細胞の増大をもたらした。
実施例２０
薬力学的研究
ＴＬ１ＡチャレンジとＴＮＦチャレンジが同様のまたは異なる薬力学的効果をもたらすかどうかを評価するために、５００μｇ／マウスの抗マウスＴＬ１Ａ、抗マウスＴＮＦ−αまたはＰＢＳで、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（８週、雌）を最初に腹腔内注射した。４時間後、次いで、１００μｇ／マウスのＴＬ１Ａまたは１０μｇ／マウスのＴＮＦ−αでマウスをチャレンジしたか、チャレンジしなかった。２４時間後に血清を収集した。サイトカインをＭＳＤによって測定した（ＩＬ−２２はＥＬＩＳＡによって測定した）。マウスにおけるＴＬ１ＡまたはＴＮＦタンパク質によるチャレンジは、異なるサイトカイン誘導をもたらした。ＴＬ１ＡチャレンジはＩＦＮ−γ及びＩＬ−５を主に誘導したが、ＴＮＦチャレンジはＩＬ−６、ＩＬ−８及びＩＬ−１０を誘導した。
本発明者（ら）は、ヒトＰＢＭＣにおいて、ＴＬ１ＡまたはＴＮＦ処理によるサイトカイン誘導を評価した。手短に述べると、ヒトの血液から新しく単離したＰＢＭＣを、１００ｎｇ／ｍｌのヒトＴＬ１ＡまたはＴＮＦ−αの存在下で、培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５×１０−５Ｍの２−ＭＥ及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ１６４０）中で培養した。７２時間後に上清を収集した。上清中のサイトカインをＭＳＤによって測定した（ＩＬ−２２はＥＬＩＳＡによって測定した）。マウスのチャレンジ実験と同様に、ヒトＰＢＭＣを用いるＴＬ１Ａの処理はＩＦＮ−γ、ＩＬ−５及びＩＬ−２２を誘導したが、ＴＮＦ処理はＩＬ−８、ＩＬ−１０及びＭＣＰ−１を増大させた。したがって、ＴＬ１Ａ及びＴＮＦは、ヒトＰＢＭＣにおいて、別々のサイトカインプロファイルを誘導する。
実施例２１
ＩｇＧ−Ｆａｂ分子
抗ＴＮＦα及び抗ＴＬ１Ａ抗体のサブセットを用いて、二重特異性抗原結合タンパク質を調製した。このＩｇＧ−Ｆａｂ型式のいくつかの実施形態では、改変重鎖を形成するために、第２の抗体由来のＶＨ−ＣＨ１ドメインを含むポリペプチドは、ペプチドリンカーを介して、第１の抗体の重鎖のカルボキシル末端に融合している。第１の抗体由来のＦａｂ断片の残りのドメイン（すなわち、ＶＬ−ＣＬドメイン）を含むポリペプチドを、第１の抗体の軽鎖及び改変重鎖とともに共発現させて、完全な分子を生成する。完全な分子のアセンブリーは、二量体化した免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ末端側に位置する、第１の抗原に対する２つの抗原結合ドメイン、及び二量体化したＦｃ領域のカルボキシル末端側に位置する、第２の抗原に対する２つの抗原結合ドメインを有する、四価結合タンパク質を作出する。
ＴＮＦα／ＴＬ１Ａ ＩｇＧ−Ｆａｂは２つの抗原結合ドメインから成り、１つはＴＮＦαに対するものであり、もう１つはＴＬ１Ａに対するものである。ＴＮＦα／ＴＬ１Ａ ＩｇＧ−Ｆａｂ分子をコードするＤＮＡ分子は、抗ＴＮＦα（または、抗ＴＬ１Ａ）抗体軽鎖、抗ＴＮＦα（または、抗ＴＬ１Ａ）抗体重鎖（ここでは、Ｃ末端は、（ｉ）抗ＴＬ１Ａ（もしくは、抗ＴＮＦα）抗体軽鎖、または（ｉｉ）抗ＴＬ１Ａ（もしくは、抗ＴＮＦα）Ｆｄ（ＶＨ−ＣＨ１）に融合している）、及び、カルボキシ末端結合ドメインを完全なものにするためのＦａｂ断片のもう半分、例えば、（ｉ）抗ＴＬ１Ａ（もしくは、抗ＴＮＦα）Ｆｄまたは（ｉｉ）抗ＴＬ１Ａ（もしくは、抗ＴＮＦα）抗体軽鎖を含む第３のポリペプチドをコードする断片を含む。ＩｇＧ−Ｆａｂ二重特異性分子は、各Ｆａｂ領域（図３に例示するＦａｂ１及びＦａｂ２）のＣＨ１及びＣＬドメインに導入された電荷対変異を含む。電荷対は、抗ＴＮＦΑＲ軽鎖／ＶＨＣＨ１（Ｆｄ）対及び抗ＴＬ１Ａ軽鎖／ＶＨＣＨ１（Ｆｄ）対の優先的なアセンブリーを可能にするように設計される。軽鎖／ＶＨＣＨ１（Ｆｄ）対の正確な対形成を促進するためのさらなるアプローチとして、生成されたＩｇＧ−Ｆａｂ分子のサブセットについて、第２の抗体の重鎖のカルボキシル末端領域に融合したポリペプチドが第１の抗体由来のＶＬ及びＣＨ１領域を含み、第２のポリペプチドが第１の抗体由来のＶＨ及びＣＬ領域を含むように、カルボキシル末端のＦａｂ（すなわち、Ｆａｂ２）のＣＬ及びＣＨ１領域をスワップした。表２１．１及び２１．３に列挙される分子を参照されたい。ＶＬ及びＶＨのＣＤＲは表２１．２Ａ及び２１．２Ｂに列挙され、純度は表２１．４に列挙される。合成されたｇＢｌｏｃｋによってＤＮＡ分子を生成し、ｐＴＴ５．１ベクターにクローニングした。これらの発現ベクターをヒト２９３−６Ｅ細胞におけるＴＮＦα／ＴＬ１二重特異性分子のトランスフェクト及び発現に使用した。１４４種の異なるＩｇＧ−Ｆａｂ二重特異性分子を生成した。各分子の完全な配列を表２１．１及び配列表に記載する。
ラージフォーマットオートサンプラー（ＬＦＡＳ、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）を使用するＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅクロマトグラフィー（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）による親和性捕獲を使用して、ＩｇＧ−Ｆａｂ分子を精製した。説明すると、二価陽イオンを含まないダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で平衡化した１ｍＬのＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に条件培地をロードした。ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムを８カラム容量のＤ−ＰＢＳで洗浄し、１００ｍＭ酢酸、ｐＨ３．６で溶出した。プロテインＡ溶出液が２８０ｎｍで５ｍＡＵより上の吸光度を有する場合、溶出液をＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に直接的ロードし、１．２カラム容量の１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０で展開した。脱塩溶出液が２８０ｎｍで３ｍＡＵより上の吸光度を有する場合、試料採取を開始し、９６ウェルディープウェルブロックに画分をそれぞれ最大２ｍＬまで収集した。還元（２％の２−メルカプトエタノールを用いる）及び非還元（２５ｍＭのヨードアセトアミドを用いる）条件下で、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ分析によって、試料の純度を決定した。８分にわたる、５０ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．９における定組成溶出を用いて、Ｚｅｎｉｘ−Ｃ ＳＥＣ−３００カラム（Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）を使用して、分析用ＳＥＣを行った。
ＩｇＧ−Ｆａｂ分子をその発現能力（力価及び回収）及び活性について試験した。図２７〜３３及び表２１．３に結果を示す。表２１．３及び全体を通して、「ａｄａ」はアダリムマブを指す。
ＴＦ−１ ＮＦ−κＢレポーター細胞株を使用して、ＴＬ１Ａ活性アッセイを行った。手短に述べると、９６ウェルプレート中で、段階希釈した抗ＴＬ１Ａ抗体またはＴＬ１Ａ／ＴＮＦ−α二重特異性分子の存在下で、３０ｎｇ／ｍｌ（ＥＣ９０）のヒトまたはカニクイザルＴＬ１Ａを１０４個のＴＦ−１ ＮＦ−κＢレポーター細胞とともに３７℃で一晩インキュベートした。５０μｌのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試験溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに補充した。プレートをカバーし、１０分間振盪しながらインキュベートした。マイクロベータリーダーによって、ルシフェラーゼ活性を解析した。
ＴＦ−１ ＮＦ−ｋＢレポーター細胞株を使用して、ＴＮＦαの活性アッセイを行った。手短に述べると、９６ウェルプレート中で、段階希釈した抗ＴＮＦ−α抗体またはＴＬ１Ａ／ＴＮＦα二重特異性分子の存在下で、１ｎｇ／ｍｌ（ＥＣ９０）のヒトまたはカニクイザルＴＮＦ−αを１０４個のＴＦ−１ ＮＦ−κＢレポーター細胞とともに３７℃で一晩インキュベートした。５０μｌのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試験溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加えた。プレートをカバーし、１０分間振盪しながらインキュベートした。マイクロベータリーダーによって、ルシフェラーゼ活性を解析した。
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前述のアミノ酸配列は、配列表のその直前の核酸配列にコードされる。
前述のＶＬ及びＶＨドメインのＣＤＲ配列は、以下の表２１．２Ａ及び２１．２Ｂに示す通りである。
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本明細書で議論及び引用されたすべての刊行物、特許及び特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。開示された発明は、記載される特定の方法論、プロトコール及び材料に限定されないが、これは、これらが変動し得るからであることが理解される。本明細書で使用される術語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されよう。
当業者は、単なる日常的な実験を使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
省略形
本明細書全体を通して使用される省略された用語は、以下のように定義される。
ａａ，ＡＡ アミノ酸
ＡＥＩ アレル発現不均衡
ＡＮＯＶＡ 分散分析
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＣＨＯ チャイニーズハムスター卵巣細胞
ＣＰＭ 電荷対変異
ＤＭＥＭ ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着測定法
ｅＱＴＬ 発現定量的形質遺伝子座
ＥＳＩ−ＴＯＦ エレクトロスプレーイオン化飛行時間型
ＥＳＮ 枯渇させた上清
ＦＡＣＳ 蛍光活性化セルソーティング
ＦＢＳ ウシ胎仔血清
ＦＰＬＣ 高速タンパク質液体クロマトグラフィー
ＦＶＢ Ｆｒｉｅｎｄ白血病ウイルス１ｂ（Ｆｖ１ｂ）アレルについて近交系であるマウスの系統
Ｈ＆Ｅ ヘマトキシリン−エオジン
ＨＡ ヒポキサンチン
ＨＩＣ 疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＨＲＰ 西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＨＵＶＥＣ ヒト臍静脈上皮細胞
ＩＢＤ 炎症性腸疾患
ＩＤＭＥＭ グルタミンを含まないＤＭＥＭ
ＩＦＮ インターフェロン
ＩＬ インターロイキン
ＭＣＰ 単球走化性タンパク質
ＭＳＤ 高分子構造データベース
ＮＡ 核酸
ＰＢＭＣ 末梢血単核球
ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＥＩ ポリエチレンイミン
ＱＴＬ 量的形質遺伝子座
ＲＰＭＩ Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで開発された培地
ＲＴ−ＰＣＲ 室温でのポリメラーゼ連鎖反応
ＳＮＰ 一塩基多型
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＬ１Ａ ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＮＦＳＦ１５）
ＴＭＢ テトラメチルベンゼン
ＴＮＦ 腫瘍壊死因子−α

Claims (161)

  1. ＴＬ１Ａ結合物及びＴＬ１Ａ結合物ではない第２の結合物を含む抗原結合タンパク質であって、
    ａ．前記ＴＬ１Ａ結合物が１つまたは２つの軽鎖可変ドメイン及び１つまたは２つの重鎖可変ドメインを有し、
    ｂ．前記ＴＬ１Ａ結合物の軽鎖可変ドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
    ｃ．前記ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
    ｄ．前記ＨＣＤＲ３の配列が、表Ａ（配列番号１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、４８９、７８１、７８７、７９６、８０２、８０７、８１３、８２３、８２９、８３４、８４０、８４５、８５１、８５５及び８６１）から選択されるか、または表Ａの各ＨＣＤＲ３配列について、
    ｉ．１つまたは複数の酸性残基が、場合により、任意の他の酸性残基に置き換えられており、
    ｉｉ．１つまたは複数のアミド残基が、場合により、任意の他のアミド残基に置き換えられており、
    ｉｉｉ．１つまたは複数の芳香族残基が、場合により、任意の他の芳香族残基に置き換えられており、
    ｉｖ．１つまたは複数の塩基性残基が、場合により、任意の他の塩基性残基に置き換えられており、
    ｖ．１つまたは複数の親水性残基が、場合により、任意の他の親水性残基に置き換えられており、
    Ｖｉ．１つまたは複数の非官能性残基が、場合により、任意の他の非官能性残基に置き換えられている、
    配列であり、
    ｅ．「酸性残基」がＤまたはＥを意味し、
    ｆ．「アミド残基」がＮまたはＱを意味し、
    ｇ．「芳香族残基」がＦ、ＹまたはＷを意味し、
    ｈ．「塩基性残基」がＨ、ＫまたはＲを意味し、
    ｉ．「親水性残基」がＳ、Ｔ、ＮまたはＱを意味し、
    ｊ．「非官能性残基」がＭ、Ｇ、Ａ、Ｖ、ＩまたはＬを意味する、
    前記抗原結合タンパク質。
  2. 前記ＨＣＤＲ３が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、４８９、７８１、７８７、７９６、８０２、８０７、８１３、８２３、８２９、８３４、８４０、８４５、８５１、８５５、８６１、６４１、６４５、６５０、６５７、６７６、６８０、６８１、６６７、６７１、９７６、９８５、１０００、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１８、１０１９、１０２０、１０２４、１０４３、１０４９、１０５０、１０５１、１０５２、１０６３、１０７１、１０７５、１０７６、１０７７、１０９１、１１０５、２５５、２５８、２６１、２６４、２６７、２７０、２７３、６７２、６７５、９５２、９５４、９５８、９６１、９６４、９６６、９６７、９６８、９６９及び９７０）から選択される配列を含む、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  3. 前記ＨＣＤＲ３が、表Ａ（配列番号１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、４８９、７８１、７８７、７９６、８０２、８０７、８１３、８２３、８２９、８３４、８４０、８４５、８５１、８５５及び８６１）から選択される配列を含む、請求項２に記載の抗原結合タンパク質。
  4. 前記ＨＣＤＲ３が抗体及び９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１８０及び１９２）から選択される配列を有する、請求項３に記載の抗原結合タンパク質。
  5. 前記ＨＣＤＲ１が、表Ａ（配列番号１６４、１７０、１８２、１８８、７７７、７８３、７９２、７９８、８０４、８０９、８１５、８１９、２６５、８３６、８４７及び８５７）から選択される配列を有し、前記ＨＣＤＲ２が、表Ａ（配列番号１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、４８３、４８５、７７９、７８５、７９４、８００、８１１、８１７、８２１、８２７、８３２、８３８、８４３、８４９、８５３、８５９及び８６４）から選択される配列を有し、またはＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２が表Ａの各ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２配列について、
    ａ．１つまたは複数の酸性残基が、場合により、任意の他の酸性残基に置き換えられており、
    ｂ．１つまたは複数のアミド残基が、場合により、任意の他のアミド残基に置き換えられており、
    ｃ．１つまたは複数の芳香族残基が、場合により、任意の他の芳香族残基に置き換えられており、
    ｄ．１つまたは複数の塩基性残基が、場合により、任意の他の塩基性残基に置き換えられており、
    ｅ．１つまたは複数の親水性残基が、場合により、任意の他の親水性残基に置き換えられており、
    ｆ．１つまたは複数の非官能性残基が、場合により、任意の他の非官能性残基に置き換えられている
    配列を有する、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  6. ａ．前記ＨＣＤＲ１が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１６４、１７０、１８２、１８８、７７７、７８３、７９２、７９８、８０４、８０９、８１５、８１９、２６５、８３６、８４７、８５７、６３９、６５４、６５５、６３２、６６４、９５５、９７９、９９４、１０１０、１０１７、１０２２、１０２７、１０２８、１０２９、１０３７、１０４５、１０８７、２５３、２５６、２５９、２６２、２６８、２７１、２６５及び９５０）から選択される配列を有し、
    ｂ．前記ＨＣＤＲ２が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、４８３、４８５、７７９、７８５、７９４、８００、８１１、８１７、８２１、８２７、８３２、８３８、８４３、８４９、８５３、８５９、８６４、６４０、２０４、６７８、６７９、６４４、６４８、６４９、６３３、６５６、６５９、６６０、６６５、６６６、６７７、１１４、２２７、２３０、６９１、７１５、６６９、７１１、９７１、９７２、９７３、９７４、９７５、９８０、９８１、９８２、９８３、９８４、９９５、９９６、９９７、９９８、０９９９、１０１１、１０２３、１０３０、１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４６、１０４７、１０４８、１０５８、１０５９、１０６０、１０６１、１０６２、１０６６、１０６７、１０６８、１０６９、１０７０、１０７４、１０８８、１０８９、１０９０、１０９５、１０９６、１０９７、１１０２、１１０３、１１０４、１１０８、１１０９、１１１０、１１１１、１１１２、２５４、２６０、１８４、２６９、２７２、２６６、９５１、９５３、９５６及び９６３）から選択される配列を有する、
    請求項２に記載の抗原結合タンパク質。
  7. ａ．前記ＨＣＤＲ１が、表Ａ（配列番号１６４、１７０、１８２、１８８、７７７、７８３、７９２、７９８、８０４、８０９、８１５、８１９、２６５、８３６、８４７及び８５７）から選択される配列を有し、
    ｂ．前記ＨＣＤＲ２が、表Ａ（配列番号１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、４８３、４８５、７７９、７８５、７９４、８００、８１１、８１７、８２１、８２７、８３２、８３８、８４３、８４９、８５３、８５９及び８６４）から選択される配列を有する、
    請求項３に記載の抗原結合タンパク質。
  8. 前記ＨＣＤＲ１が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１７０及び１８８）から選択される配列を有し、前記ＨＣＤＲ２が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１７８及び１９０）から選択される配列を有する、請求項４に記載の抗原結合タンパク質。
  9. 前記ＬＣＤＲ３が、表Ａ（配列番号１０２、１０８、２６３、１２０、１２６、６８７、６９３、７０１、７０７、７１７、７２７、７３３、７３９、７４５、７５１、７５７、７６３、７６７、７７１及び７７５）から選択される配列を有するか、表Ａの各ＬＣＤＲ３配列について、
    ａ．１つまたは複数の酸性残基が、場合により、任意の他の酸性残基に置き換えられており、
    ｂ．１つまたは複数のアミド残基が、場合により、任意の他のアミド残基に置き換えられており、
    ｃ．１つまたは複数の芳香族残基が、場合により、任意の他の芳香族残基に置き換えられており、
    ｄ．１つまたは複数の塩基性残基が、場合により、任意の他の塩基性残基に置き換えられており、
    ｅ．１つまたは複数の親水性残基が、場合により、任意の他の親水性残基に置き換えられており、
    ｆ．１つまたは複数の非官能性残基が、場合により、任意の他の非官能性残基に置き換えられている配列である、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  10. 前記ＬＣＤＲ３が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１０２、１０８、２６３、１２０、１２６、６８７、６９３、７０１、７０７、７１７、７２７、７３３、７３９、７４５、７５１、７５７、７６３、７６７、７７１、７７５、６３７、６３８、６３１、６５３、６６３、６３７、２３３、９４０、９７８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、１００５、１００６、１００７、１００８、１００９、１０３４、１０３５、１０３６、１０５５、１０５６、１０５７、１０６５、１０８６、１０９３、１０９４、１０９９、１１００、１１０１、１１０７、２２８、２３１、２３４、２３７、２４３、２４０、６７４、９３６、９３８、７０１、７０７、９４９、９４２及び９４４）から選択される配列を有する、請求項２に記載の抗原結合タンパク質。
  11. 前記ＬＣＤＲ３が、表Ａ（配列番号１０２、１０８、２６３、１２０、１２６、６８７、６９３、７０１、７０７、７１７、７２７、７３３、７３９、７４５、７５１、７５７、７６３、７６７、７７１及び７７５））から選択される配列を有する、請求項３に記載の抗原結合タンパク質。
  12. 前記ＬＣＤＲ３が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号２６３及び１２６）から選択される配列を有する、請求項４に記載の抗原結合タンパク質。
  13. 前記ＬＣＤＲ１が、表Ａ（配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、４６７、４６９、６８３、６８９、２３５、６９７、１４６、７０９、７１３、７１９、７２３、２２９、２２６、７４１、７４７、７５３及び７７３）から選択される配列を有し、前記ＬＣＤＲ２が、表Ａ（配列番号１００、１０６、１１２、１１８、１２４、６８５、６９９、７０５、７２１、７２５、７３１、７３７、７４９、７５５、７６１及び７６９）から選択される配列、または表Ａの各ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２配列について、
    ａ．１つもしくは複数の酸性残基が、場合により、任意の他の酸性残基に置き換えられており、
    ｂ．１つもしくは複数のアミド残基が、場合により、任意の他のアミド残基に置き換えられており、
    ｃ．１つもしくは複数の芳香族残基が、場合により、任意の他の芳香族残基に置き換えられており、
    ｄ．１つもしくは複数の塩基性残基が、場合により、任意の他の塩基性残基に置き換えられており、
    ｅ．１つもしくは複数の親水性残基が、場合により、任意の他の親水性残基に置き換えられており、
    ｆ．１つもしくは複数の非官能性残基が、場合により、任意の他の非官能性残基に置き換えられている
    配列を有する、請求項９に記載の抗原結合タンパク質。
  14. ａ．前記ＬＣＤＲ１が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、４６７、４６９、６８３、６８９、２３５、６９７、１４６、７０９、７１３、７１９、７２３、２２９、２２６、７４１、７４７、７５３、７７３、６３５、６４２、６４６、６５１、６５８、６６１、６６８、７５９、７４３、７６５、９７７、９８６、９８７、１００１、１０１６、１０２１、１０２５、１０３１、１０３２、１０３３、１０４４、１０５３、１０６４、１０７２、１０７８、１０７９、１０８０、１１０６、２２６、２２９、２３２、２３５、２４１、２３８、１１１３、１４６及び９４７）から選択される配列を有し、
    ｂ．前記ＬＣＤＲ２が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１００、１０６、１１２、１１８、１２４、２３５、６９９、７０５、７２１、７２５、７３１、７３７、７４９、７５５、７６１、７６９、６３６、６４３、６４７、６５２、６６２、７８９、９８８、１００１、１００２、１００４、１０２６、１０５４、１０７３、１０８１、１０８２、１０８３、１０８４、１０８５、１０９２、１０９８、２４２、９３５、１４８、９４８及び９４３）から選択される配列を有する、
    請求項１０に記載の抗原結合タンパク質。
  15. ａ．前記ＬＣＤＲ１が、表Ａ（配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、４６７、４６９、６８３、６８９、２３５、６９７、１４６、７０９、７１３、７１９、７２３、２２９、２２６、７４１、７４７、７５３及び７７３）から選択される配列を有し、
    ｂ．前記ＬＣＤＲ２が、表Ａ（配列番号１００、１０６、１１２、１１８、１２４、６８５、６９９、７０５、７２１、７２５、７３１、７３７、７４９、７５５、７６１及び７６９）から選択される配列を有する，
    請求項１１に記載の抗原結合タンパク質。
  16. 前記ＬＣＤＲ１が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１１０及び１２２）から選択される配列を有し、前記ＬＣＤＲ２が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１１２及び１２４）から選択される配列を有する、請求項１２に記載の抗原結合タンパク質。
  17. ａ．前記ＬＣＤＲ１が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、４６７、４６９、６８３、６８９、２３５、６９７、１４６、７０９、７１３、７１９、７２３、２２９、２２６、７４１、７４７、７５３、７７３、６３５、６４２、６４６、６５１、６５８、６６１、６６８、７５９、７４３、７６５、９７７、９８６、９８７、１００１、１０１６、１０２１、１０２５、１０３１、１０３２、１０３３、１０４４、１０５３、１０６４、１０７２、１０７８、１０７９、１０８０、１１０６、２２６、２２９、２３２、２３５、２４１、２３８、１１１３、１４６及び９４７）から選択される配列を有し、
    ｂ．前記ＬＣＤＲ２が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１００、１０６、１１２、１１８、１２４、２３５、６９９、７０５、７２１、７２５、７３１、７３７、７４９、７５５、７６１、７６９、６３６、６４３、６４７、６５２、６６２、７８９、９８８、１００１、１００２、１００４、１０２６、１０５４、１０７３、１０８１、１０８２、１０８３、１０８４、１０８５、１０９２、１０９８、２４２、９３５、１４８、９４８及び９４３）から選択される配列を有し、
    ｃ．前記ＬＣＤＲ３が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１０２、１０８、２６３、１２０、１２６、６８７、６９３、７０１、７０７、７１７、７２７、７３３、７３９、７４５、７５１、７５７、７６３、７６７、７７１、７７５、６３７、６３８、６３１、６５３、６６３、６３７、２３３、９４０、９７８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、１００５、１００６、１００７、１００８、１００９、１０３４、１０３５、１０３６、１０５５、１０５６、１０５７、１０６５、１０８６、１０９３、１０９４、１０９９、１１００、１１０１、１１０７、２２８、２３１、２３４、２３７、２４３、２４０、６７４、９３６、９３８、７０１、７０７、９４９、９４２及び９４４）から選択される配列を有する、
    請求項６に記載の抗原結合タンパク質。
  18. ａ．前記ＬＣＤＲ１が、表Ａ（配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、４６７、４６９、６８３、６８９、２３５、６９７、１４６、７０９、７１３、７１９、７２３、２２９、２２６、７４１、７４７、７５３及び７７３）から選択される配列を有し、
    ｂ．前記ＬＣＤＲ２が、表Ａ（配列番号１００、１０６、１１２、１１８、１２４、６８５、６９９、７０５、７２１、７２５、７３１、７３７、７４９、７５５、７６１及び７６９）から選択される配列を有し、
    ｃ．前記ＬＣＤＲ３が、表Ａ（配列番号１０２、１０８、２６３、１２０、１２６、６８７、６９３、７０１、７０７、７１７、７２７、７３３、７３９、７４５、７５１、７５７、７６３、７６７、７７１及び７７５）から選択される配列を有する、
    請求項７に記載の抗原結合タンパク質。
  19. ａ．前記ＬＣＤＲ１が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１１０及び１２２）から選択される配列を有し、
    ｂ．前記ＬＣＤＲ２が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１１２及び１２４）から選択される配列を有し、
    ｃ．前記ＬＣＤＲ３が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１０８及び１２６）から選択される配列を有する、
    請求項８に記載の抗原結合タンパク質。
  20. 前記軽鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、４９１、４９３、８６６、８７０、８７４、８７８、８８２、８８６、８９０、８９４、８９８、９０２、９０６、９１０、９１４、９１８、９２２、９２４、９２８及び９３２）から選択される軽鎖可変ドメイン配列に少なくとも約９０％同一である配列を含む、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  21. 前記軽鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、４９１、４９３、８６６、８７０、８７４、８７８、８８２、８８６、８９０、８９４、８９８、９０２、９０６、９１０、９１４、９１８、９２２、９２４、９２８及び９３２）から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項２０に記載の抗原結合タンパク質。
  22. 前記重鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、４９５、４９７、８６８、８７２、８７６、８８０、８８４、８８８、８９２、８９６、９００、９０４、９０８、９１２、９１６、９２０、９２６、９３０及び９３４）から選択される重鎖可変ドメイン配列に少なくとも約９０％同一である配列を含む、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  23. 前記重鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、４９５、４９７、８６８、８７２、８７６、８８０、８８４、８８８、８９２、８９６、９００、９０４、９０８、９１２、９１６、９２０、９２６、９３０及び９３４）から選択される重鎖可変ドメイン配列に少なくとも約９０％同一である配列を含む、請求項２０に記載の抗原結合タンパク質。
  24. 前記重鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、４９５、４９７、８６８、８７２、８７６、８８０、８８４、８８８、８９２、８９６、９００、９０４、９０８、９１２、９１６、９２０、９２６、９３０及び９３４）から選択される重鎖可変ドメイン配列を含む、請求項２０に記載の抗原結合タンパク質。
  25. 前記重鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、４９５、４９７、８６８、８７２、８７６、８８０、８８４、８８８、８９２、８９６、９００、９０４、９０８、９１２、９１６、９２０、９２６、９３０及び９３４）から選択される重鎖可変ドメイン配列を含む、請求項２１に記載の抗原結合タンパク質。
  26. 前記重鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号８、１２、１６、２０、２４、２８及び３２）から選択される重鎖可変ドメイン配列を含む、請求項２０に記載の抗原結合タンパク質。
  27. 前記軽鎖可変ドメイン配列が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１４及び２２）から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含み、前記重鎖可変ドメインが、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１６及び２４）から選択される重鎖可変ドメイン配列を含む、請求項２５に記載の抗原結合タンパク質。
  28. 前記タンパク質が、表Ｅ（配列番号６６、５４、５８、６２、６６、７０、７４、４５５、４５９、１１１６、１１２０、１１２４、１１２８、１１３２、１１３６、１１４０、１１４４、１１４８、１１５２、１１５６、１１６０、１１６４、１１６８、１１７２、１１７６、１１８０、１１８４及び１１８８）から選択される軽鎖配列を有する軽鎖を含む、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  29. 前記タンパク質が、表Ｅ（配列番号５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、４５７、４６１、１１１８、１１２２、１１２６、１１３０、１１３４、１１３８、１１４２、１１４６、１１５０、１１５４、１１５８、１１６２、１１６６、１１７０、１１７４、１１７８、１１８２、１１８６及び１１９０）から選択される重鎖配列を有する重鎖を含む、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  30. 表Ｅ、配列番号
    ａ．５０及び５２、
    ｂ．５４及び５６、
    ｃ．５８及び６０、
    ｄ．６２及び６４、
    ｅ．６６及び６８、
    ｆ．７０及び７２、
    ｇ．７４及び７６、
    ｈ．４５５及び４５７、
    ｉ．４５９及び４６１
    ｊ．１１１６及び１１１８、
    ｋ．１１２０及び１１２２、
    ｌ．１１２４及び１１２６、
    ｍ．１１２８及び１１３０、
    ｎ．１１３２及び１１３４、
    ｏ．１１３６及び１１３８、
    ｐ．１１４０及び１１４２、
    ｑ．１１４４及び１１４６、
    ｒ．１１４８及び１１５０、
    ｓ．１１５２及び１１５４、
    ｔ．１１５６及び１１５８、
    ｕ．１１６０及び１１６２、
    ｖ．１１６４及び１１６６、
    ｗ．１１６８及び１１７０、
    ｘ．１１７２及び１１７４、
    ｙ．１１７６及び１１７８、
    ｚ．１１８０及び１１８２、
    ａａ．１１８４及び１１８６、並びに
    ｂｂ．１１８８及び１１９０
    から選択される抗体の前記軽鎖及び重鎖配列を含む、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  31. 前記第２の結合物がＴＮＦ−α結合物である、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  32. ａ．前記ＴＮＦ−α結合物が１つまたは２つの軽鎖可変ドメイン及び１つまたは２つの重鎖可変ドメインを有し、
    ｂ．前記ＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
    ｃ．前記ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、
    請求項３１に記載の抗原結合タンパク質。
  33. ａ．前記第２の結合物が、１つまたは２つの軽鎖可変ドメイン及び１つまたは２つの重鎖可変ドメインを有するＴＮＦ−α結合物であり、
    ｂ．前記ＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
    ｃ．前記ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
    ｄ．前記ＴＮＦ−α結合物のＨＣＤＲ３が、表Ｇ（配列番号１６２、２２２、２１０及び２１６）から選択される配列を含む、
    請求項２に記載の抗原結合タンパク質。
  34. ａ．前記第２の結合物が、１つまたは２つの軽鎖可変ドメイン及び１つまたは２つの重鎖可変ドメインを有するＴＮＦ−α結合物であり、
    ｂ．前記ＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
    ｃ．前記ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
    ｄ．前記ＴＮＦ−α結合物のＨＣＤＲ３が、表Ｇ（配列番号１６２、２２２、２１０及び２１６）から選択される配列を含む、
    請求項３に記載の抗原結合タンパク質。
  35. ａ．前記第２の結合物が、１つまたは２つの軽鎖可変ドメイン及び１つまたは２つの重鎖可変ドメインを有するＴＮＦ−α結合物であり、
    ｂ．前記ＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
    ｃ．前記ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
    ｄ．前記ＴＮＦ−α結合物のＨＣＤＲ３が、アダリムマブ、セルトリズマブまたは抗体Ｃ２３４（配列番号１６２、２１０及び２２２）から選択される配列を含む、
    請求項４に記載の抗原結合タンパク質。
  36. ａ．前記第２の結合物が、１つまたは２つの軽鎖可変ドメイン及び１つまたは２つの重鎖可変ドメインを有するＴＮＦ−α結合物であり、
    ｂ．前記ＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
    ｃ．前記ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
    ｄ．前記ＴＮＦ−α結合物のＨＣＤＲ１が、表Ｇ（配列番号１５８、２１８、２０６及び２１２）から選択される配列を含み、
    ｅ．前記ＴＮＦ−α結合物のＨＣＤＲ２が、表Ｇ（配列番号１６０、２２０、２０８及び２１４）から選択される配列を含み、
    ｆ．前記ＴＮＦ−α結合物のＨＣＤＲ３が、表Ｇ（配列番号１６２、２２２、２１０及び２１６）から選択される配列を含む、
    請求項６に記載の抗原結合タンパク質。
  37. ａ．前記第２の結合物が、１つまたは２つの軽鎖可変ドメイン及び１つまたは２つの重鎖可変ドメインを有するＴＮＦ−α結合物であり、
    ｂ．前記ＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
    ｃ．前記ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
    ｄ．前記ＴＮＦ−α結合物のＨＣＤＲ１が、表Ｇ（配列番号１５８、２１８、２０６及び２１２）から選択される配列を含み、
    ｅ．前記ＴＮＦ−α結合物のＨＣＤＲ２が、表Ｇ（配列番号１６０、２２０、２０８及び２１４）から選択される配列を含み、
    ｆ．前記ＴＮＦ−α結合物のＨＣＤＲ３が、表Ｇ（配列番号１６２、２２２、２１０及び２１６）から選択される配列を含む、
    請求項７に記載の抗原結合タンパク質。
  38. ａ．前記ＴＬ１Ａ結合物の軽鎖配列が、
    ｉ．表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、４６７、４６９、６３５、６４２、６４６、６５１、６５８、６６１、６６８、２２６、２２９、２３２、２３５、２４１、２３８）から選択されるＬＣＤＲ１配列、並びに
    ｉｉ．表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１００、１０６、１１２、１１８、１２４、６３６、６４３、６４７、６５２、６６２、２２７、２３０、２３３、２４２及び４７３）から選択されるＬＣＤＲ２配列、
    ｉｉｉ．表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１０２、１０８、２６３、１２０、１２６、６３７、６３８、６３１、６５３、６６３、２２８、２３１、２３４、２３７、２４３、２４０及び６７４）から選択されるＬＣＤＲ３配列
    を含み、
    ｂ．前記ＴＬ１Ａ結合物の重鎖配列が、
    ｉ．表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１６４、１７０、１８２、１８８、６３９、６５４、６５５、６３２、６６４、２５３、２５６、２５９、２６２、２６８、２７１及び２６５）から選択されるＨＣＤＲ１配列、
    ｉｉ．表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、４８３、４８５、６４０、２０４、６４４、６４８、６３３、６５６、６５９、６６０、６６５、６６６、１１４、６６９、２５４、１７２、２６０、１８４、２６９、２７２、２６６及び２５４）から選択されるＨＣＤＲ２配列、並びに
    ｉｉｉ．表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、４８９、６４１、６４５、６５０、６５７、６７６、６５７、６６７、６７１、２５５、２５８、２６１、２６４、２６７、２７０、２７３、６７２及び６７５）から選択されるＨＣＤＲ３配列
    を含み、
    ｃ．前記ＴＮＦ−α結合物の軽鎖配列が、
    ｉ．表Ｇ（配列番号９２、１５２、１４０及び１４６）から選択されるＬＣＤＲ１配列、
    ｉｉ．表Ｇ（配列番号９４、１５４、１１２及び１４８）から選択されるＬＣＤＲ２配列、並びに
    ｉｉｉ．表Ｇ（配列番号９６、１５６、１４４及び１５０）から選択されるＬＣＤＲ３配列
    を含み、
    ｄ．前記ＴＮＦ−α結合物の重鎖配列が、
    ｉ．表Ｇ（配列番号１５８、２１８、２０６及び２１２）から選択されるＨＣＤＲ１配列、
    ｉｉ．表Ｇ（配列番号１６０、２２０、２０８及び２１４）から選択されるＨＣＤＲ２配列、並びに
    ｉｉｉ．表Ｇ（配列番号１６２、２２２、２１０及び２１６）から選択されるＨＣＤＲ３配列
    を含む、
    請求項３２に記載の抗原結合タンパク質。
  39. ａ．前記ＴＬ１Ａ結合物の軽鎖配列が、
    ｉ．表Ａ（配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、４６７及び４６９）から選択されるＬＣＤＲ１配列、
    ｉｉ．表Ａ（配列番号１００、１０６、１１２、１１８及び１２４）から選択されるＬＣＤＲ２配列、
    ｉｉｉ．表Ａ（配列番号１０２、１０８、２６３、１２０及び１２６）から選択されるＬＣＤＲ３配列
    を含み、
    ｂ．前記ＴＬ１Ａ結合物の重鎖配列が、
    ｉ．表Ａ（配列番号１６４、１７０、１８２及び１８８）から選択されるＨＣＤＲ１配列、
    ｉｉ．表Ａ（配列番号１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、４８３及び４８５）から選択されるＨＣＤＲ２配列、並びに
    ｉｉｉ．表Ａ（配列番号１６８、１７４、１８０、１８６、１９２及び４８９）から選択されるＨＣＤＲ３配列
    を含む、
    請求項３８に記載の抗原結合タンパク質。
  40. ａ．前記第２の結合物が、１つまたは２つの軽鎖可変ドメイン及び１つまたは２つの重鎖可変ドメインを有するＴＮＦ−α結合物であり、
    ｂ．前記ＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメインが、表Ｈ（配列番号２、４２、３８及び３４）から選択される軽鎖可変ドメイン配列に少なくとも約９０％同一である配列を含む、
    請求項２０に記載の抗原結合タンパク質。
  41. ａ．前記第２の結合物が、１つまたは２つの軽鎖可変ドメイン及び１つまたは２つの重鎖可変ドメインを有するＴＮＦ−α結合物であり、
    ｂ．前記軽鎖可変ドメイン配列が表Ｈ（配列番号２、４２、３８及び３４）から選択される、
    請求項２１に記載の抗原結合タンパク質。
  42. ａ．前記第２の結合物が、１つまたは２つの軽鎖可変ドメイン及び１つまたは２つの重鎖可変ドメインを有するＴＮＦ−α結合物であり、
    ｂ．前記重鎖可変ドメインが、表Ｈ（配列番号４、４４、３１８、４０及び３６）から選択される重鎖可変ドメイン配列に少なくとも約９０％同一である配列を含む、
    請求項２２に記載の抗原結合タンパク質。
  43. ａ．前記第２の結合物が、１つまたは２つの軽鎖可変ドメイン及び１つまたは２つの重鎖可変ドメインを有するＴＮＦ−α結合物であり、
    ｂ．前記重鎖可変ドメイン配列が表Ｈ（配列番号４、４４、３１８、４０及び３６）から選択される、
    請求項２３に記載の抗原結合タンパク質。
  44. ａ．前記第２の結合物が、１つまたは２つの軽鎖可変ドメイン及び１つまたは２つの重鎖可変ドメインを有するＴＮＦ−α結合物であり、
    ｂ．前記ＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメインが、表Ｈ（配列番号２、４２、３８及び３４）から選択される軽鎖可変ドメイン配列に少なくとも約９０％同一である配列を含み、
    ｃ．前記ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメインが、表Ｈ（配列番号４、４４、３１８、４０及び３６）から選択される重鎖可変ドメイン配列に少なくとも約９０％同一である配列を含む、
    請求項２４に記載の抗原結合タンパク質。
  45. ａ．前記第２の結合物が、１つまたは２つの軽鎖可変ドメイン及び１つまたは２つの重鎖可変ドメインを有するＴＮＦ−α結合物であり、
    ｂ．前記ＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメイン配列が表Ｈ（配列番号２、４２、３８及び３４）から選択され、
    ｃ．前記ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメイン配列が表Ｈ（配列番号４、４４、３１８、４０及び３６）から選択される、
    請求項２５に記載の抗原結合タンパク質。
  46. 前記抗原結合タンパク質が、表Ｉ、配列番号
    ａ．４２、２８６、２８８及び２９０、
    ｂ．４２、４４、２９２及び２９４、
    ｃ．４２、４４、２９６及び２９８、
    ｄ．４２、４４、３００及び３０２、
    ｅ．４２、４４、３０４及び３０６、
    ｆ．４２、４４、３０８及び３１０、
    ｇ．３１２、３１４、２８８及び２９０、
    ｈ．３１２、３１４、２９２及び２９４、
    ｉ．３１２、３１４、３００及び３０２、
    ｊ．３１２、３１４、３０４及び３０６、
    ｋ．３１２、３１４、３０８及び３１０、
    ｌ．４２、３１８、２８８及び２９０、
    ｍ．４２、３１８、２９２及び２９４、
    ｎ．４２、３１８、２９６及び２９８、
    ｏ．４２、３１８、３０４及び３０６、
    ｐ．４２、３１８、３０８及び３１０、
    ｑ．３２０、３２２、２８８及び２９０、
    ｒ．３２０、３２２、２９２及び２９４、
    ｓ．３２０、３２２、３１及び２９８、
    ｔ．３２０、３２２、３００及び３０２、
    ｕ．３２０、３２２、３０４及び３０６、または
    ｖ．３２０、３２２、３０８及び３１０
    の抗原結合タンパク質から選択される可変領域配列を含む、請求項３２に記載の抗原結合タンパク質。
  47. ａ．前記重鎖及び軽鎖がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、
    ｂ．前記抗原結合タンパク質が、ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメインを１つ、ＴＬ１Ａ結合物の軽鎖可変ドメインを１つ、ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメインを１つ及びＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメインを１つ含み、
    ｃ．前記ＴＬ１Ａ結合物の軽鎖可変ドメインが、前記ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメイン、前記ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメイン及び前記ＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメインとは別の軽鎖に含まれ、
    ｄ．前記ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメインが、前記ＴＬ１Ａ結合物の軽鎖可変ドメイン、前記ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメイン及び前記ＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメインとは別の重鎖に含まれ、
    ｅ．前記ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメインが、前記ＴＮＦ−α結合物の軽鎖ドメイン、前記ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメイン及び前記ＴＬ１Ａ結合物の軽鎖可変ドメインとは別の重鎖に含まれ、
    ｆ．前記ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメインを含む前記重鎖が、前記ＴＬ１Ａ結合物の軽鎖可変ドメインを含む前記軽鎖に共有結合しており、
    ｇ．前記ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメインを含む前記重鎖が、前記ＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメインを含む前記軽鎖に共有結合しており、
    ｈ．前記ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメインを含む前記重鎖が、前記ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメインを含む前記重鎖に共有結合している、
    請求項３８に記載の抗原結合タンパク質。
  48. 前記抗原結合タンパク質が、表Ｊ、配列番号
    ａ．１３２、１３６、１３４及び１３０、
    ｂ．１３２、１３６、２３９及び１３８、
    ｃ．１３２、１３６、２５３及び３２３、
    ｄ．１３２、１３６、３２７及び３２５、
    ｅ．１３２、１３６、３３１及び３２９、
    ｆ．１３２、１３６、３３５及び３２９、
    ｇ．３３７、３３９、１３４及び１３０、
    ｈ．３３７、３３９、３２３及び２５３、
    ｉ．３３７、３３９、３２７及び３２５、
    ｊ．３３７、３３９、３３１及び３２９、
    ｋ．３３７、３３９、３３５及び３２９、
    ｌ．１３２、３１６、２３９及び１３８、
    ｍ．１３２、３１６、３２３及び２５３、
    ｎ．１３２、３１６、３３５及び３２９、
    ｏ．１３２、３１６、３３１及び３２９、
    ｐ．３３３、３１６、１３４及び１３０、
    ｑ．３３３、３１６、２３９及び１３８、
    ｒ．３３３、４６３、３２３及び２５３、
    ｓ．３３３、４６３、３３１及び３２９、
    ｔ．３３３、４６３、３３５及び３２９、
    ｕ．３４１、３４３、１３４及び１３０、
    ｖ．３４１、３４３、２３９及び１３８、
    ｗ．３４１、３４３、３２３及び２５３、
    ｘ．３４１、３４３、３２７及び３２５、
    ｙ．３４１、３４３、３３１及び３２９、
    ｚ．３４１、３４３、３３５及び３２９、
    ａａ．５１０、５１４、５１２及び５５５、
    ｂｂ．５１０、５１４、５４１及び５５８、
    ｃｃ．５１０、５１４、５３９及び５６２、
    ｄｄ．５１０、５１４、５４３及び５６５、
    ｅｅ．５１０、５１４、５４３及び５６８、
    ｆｆ．５１０、５１４、５４４及び５６８、
    ｇｇ．５４２、５７１、５１２及び５５５、
    ｈｈ．５４２、５７１、５４１及び５５８、
    ｉｉ．５４２、５７１、５３９及び５６２、
    ｊｊ．５４２、５７１、５４３及び５６５、
    ｋｋ．５４２、５７１、５４３及び５６８、
    ｌｌ．５４２、５７１、５４４及び５６８、
    ｍｍ．５１０、５７３、５１２及び５５５、
    ｎｎ．５１０、５７３、５４１及び５５８、
    ｏｏ．５１０、５７３、５３９及び５６２、
    ｐｐ．５１０、５７３、５４３及び５６８、
    ｑｑ．５１０、５７３、５４４及び５６８、
    ｒｒ．５４０、５７３、５１２及び５５５、
    ｓｓ．５４０、５７３、５４１及び５５８、
    ｔｔ．５４０、５７３、５３９及び５６２、
    ｕｕ．５４０、５７３、５４３及び５６８、
    ｖｖ．５４０、５７３、５４４及び５６８、
    ｗｗ．５４０、４８７、５１２及び５５５、
    ｘｘ．５４０、４８７、５４１及び５５８、
    ｙｙ．５４０、４８７、５３９及び５６２、
    ｚｚ．５４０、４８７、５４３及び５６８、
    ａａａ．５４０、４８７、５４４及び５６８、
    ｂｂｂ．５１８、５２２、５１２及び５５５、
    ｃｃｃ．５１８、５２２、５４１及び５５８、
    ｄｄｄ．５１８、５２２、５３９及び５６２、
    ｅｅｅ．５１８、５２２、５４３及び５６５、
    ｆｆｆ．５ｌ８、５２２、５４３及び５６８、
    ｇｇｇ．５１８、５２２、５４４及び５６８、
    ｈｈｈ．５４５、５７８、５４６及び５７９、
    ｉｉｉ．５４５、５７８、５４８及び５６２、
    ｊｊｊ．５４５、５７８、５４９及び５８５、
    ｋｋｋ．５４５、５７８、５５０及び５８８、
    ｌｌｌ．５４５、５７８、５５１及び５９１、
    ｍｍｍ．５４５、５７８、５５２及び５９１、
    ｎｎｎ．５４７、５９５、５４６及び５７９、
    ｏｏｏ．５４７、５９５、５４８及び５８２、
    ｐｐｐ．５４７、５９５、５４９及び５８５、
    ｑｑｑ．５４７、５９５、５５０及び５８８、
    ｒｒｒ．５４７、５９５、５５１及び５９１、
    ｓｓｓ．５４７、５９５、５５２及び５９１、
    ｔｔｔ．１３２、５９９、１３４及び５９８、
    ｕｕｕ．１３２、５９９、２３９及び６０１、
    ｖｖｖ．１３２、５９９、３２３及び６０３、
    ｗｗｗ．１３２、５９９、３２７及び６０５、
    ｘｘｘ．１３２、５９９、３３１及び６０７、
    ｙｙｙ．１３２、５９９、３３５及び６０７、
    ｚｚｚ．３３７、６０９、１３４及び５９８、
    ａａａａ．３３７、６０９、２３９及び６０１、
    ｂｂｂｂ．３３７、６０９、３２３及び６０３、
    ｃｃｃｃ．３３７、６０９、３２７及び６０５、
    ｄｄｄｄ．３３７、６０９、３３５及び６０７、
    ｅｅｅｅ．１３２、６１１、１３４及び５９８、
    ｆｆｆｆ．１３２、６１１、２３９及び６０１、
    ｇｇｇｇ．１３２、６１１、３２３及び６０３、
    ｈｈｈｈ．１３２、６１１、３３１及び６０７、
    ｉｉｉｉ．１３２、６１１、３３５及び６０７、
    ｊｊｊｊ．３３３、６１１、１３４及び５９８、
    ｋｋｋｋ．３３３、６１１、２３９及び６０１、
    ｌｌｌｌ．３３３、６１１、３２３及び６０３、
    ｍｍｍｍ．３３３、６１１、３３１及び６０７、
    ｎｎｎｎ．３３３、６１１、３３５及び６０７、
    ｏｏｏｏ．３３３、６１３、１３４及び５９８、
    ｐｐｐｐ．３３３、６１３、２３９及び６０１、
    ｑｑｑｑ．３３３、６１３、３２３及び６０３、
    ｒｒｒｒ．３３３、６１３、３３５及び６０７、
    ｓｓｓｓ．３４１、６１５、１３４及び５９８、
    ｔｔｔｔ．３４１、６１５、２３９及び６０１、
    ｕｕｕｕ．３４１、６１５、３２３及び６０３、
    ｖｖｖｖ．３４１、６１５、３２７及び６０５、
    ｗｗｗｗ．３４１、６１５、３３１及び６０７、
    ｘｘｘｘ．３４１、６１５、３３５及び６０７、
    ｙｙｙｙ．３３３、６１３、３３１及び６０７、
    ｚｚｚｚ．１３２、４６３、２３９及び１３８、
    ａａａａａ．１３２、４６３、３３１及び３２９、
    ｂｂｂｂｂ．１３２、４６３、３３５及び３２０、
    ｃｃｃｃｃ．５１０、４８７、５１２及び５５５、
    ｄｄｄｄｄ．５１０、４８７、５４１及び５５８、
    ｅｅｅｅｅ．５１０、４８７、５４３及び５６８、
    ｆｆｆｆｆ．５１０、４８７、５４４及び５６８、
    ｇｇｇｇｇ．１３２、６１３、１３４及び５９８、
    ｈｈｈｈｈ．１３２、６１３、３２３及び６０３、
    ｉｉｉｉｉ．１３２、６１３、３３１及び６０７、
    ｊｊｊｊｊ．１３２、６１３、３３５及び６０７、
    ｋｋｋｋｋ．１３２、４６３、１３４及び１３０、
    ｌｌｌｌｌ．５４０、６１６、５１２及び５０８、
    ｍｍｍｍｍ．５４０、６２０、５１２及び５０８、
    ｎｎｎｎｎ．５４０、６１６、５４１及び５５８、
    ｏｏｏｏｏ．５４０、６１６、５３９及び５６２、
    ｐｐｐｐｐ．５４０、６２０、５３９及び５６２、
    ｑｑｑｑｑ．５３８、６２３、５１２及び５０２、
    ｒｒｒｒｒ．５３７、６２６、５１２及び５０８、
    ｓｓｓｓｓ．５４６、５１４、１９４及び５３５、
    ｔｔｔｔｔ．５３６、６１６、１９４及び５３５、
    ｕｕｕｕｕ．５３６、６２０、１９４及び５３５、
    ｖｖｖｖｖ．５４６、４８７、１９４及び５３５、
    ｗｗｗｗｗ．４７１、１３６、４７３及び１９８、
    ｘｘｘｘｘ．１７６、１３６、５２０及び１９８、
    ｙｙｙｙｙ．４７５、４７７、５２０及び１９８、
    ｚｚｚｚｚ．４７１、４６３、４７３及び１９８、
    ａａａａａａ．１７６、４６３、４７３及び１９８、
    ｂｂｂｂｂｂ．４７１、４６５、４７３及び１９８、
    ｃｃｃｃｃｃ．１７６、４６３、５７０及び１９８、
    ｄｄｄｄｄｄ．４７１、４６５、４７３及び１９８、
    ｅｅｅｅｅｅ．１７６、４６５、５２０及び１９８、
    ｆｆｆｆｆｆ．５１０、５１４、５１２及び５０８、
    ｇｇｇｇｇｇ．５１８、５２２、５１２及び５０８、
    ｈｈｈｈｈｈ．５４０、６１６、５１２及び５０８、
    ｉｉｉｉｉｉ．５４０、６２０、５１２及び５０８、並びに
    ｊｊｊｊｊｊ．５３７、６２６、５１２及び５０８
    の抗原結合タンパク質から選択される配列を含む、請求項４７に記載の抗原結合タンパク質。
  49. 前記抗原結合タンパク質がｉＰＳ番号３７６５４３（配列番号５１０、５１６、５１２及び５０８）の配列を含む、請求項４７に記載の抗原結合タンパク質。
  50. ａ．ＥＵナンバリングを使用して、１つの重鎖が置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、もう１つの重鎖が置換Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋを含むか、または
    ｂ．ＥＵナンバリングを使用して、１つの重鎖が置換Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｄを含み、もう１つの重鎖が置換Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋを含む、
    請求項４７に記載の抗原結合タンパク質。
  51. ａ．ＥＵナンバリングを使用して、１つの重鎖が置換Ｓ１８３Ｋを含み、もう１つの重鎖が置換Ｓ１８３Ｅを含み、１つの軽鎖が置換Ｓ１７６Ｅを含み、もう１つの軽鎖が置換Ｓ１７６Ｋを含むか、または
    ｂ．ＥＵナンバリングを使用して、１つの重鎖が置換Ｑ３９Ｋ及びＳ１８３Ｋを含み、もう１つの重鎖が置換Ｑ３９Ｅ及びＳ１８３Ｅを含み、１つの軽鎖が置換Ｑ３８Ｅ及びＳ１７６Ｅを含み、もう１つの軽鎖が置換Ｑ３８Ｋ及びＳ１７６Ｋを含むか、または
    ｃ．ＥＵナンバリングを使用して、１つの重鎖が置換Ｇ４４Ｋ及びＳ１８３Ｋを含み、もう１つの重鎖が置換Ｇ４４Ｅ及びＳ１８３Ｅを含み、１つの軽鎖が置換Ｇ１００Ｅ及びＳ１７６Ｅを含み、もう１つの軽鎖が置換Ｇ１００Ｋ及びＳ１７６Ｋを含むか、または
    ｄ．ＥＵナンバリングを使用して、１つの重鎖が置換Ｓ１８３Ｋを含み、もう１つの重鎖が置換Ｓ１８３Ｅを含み、１つの軽鎖が置換Ｓ１７６Ｅを含み、もう１つの軽鎖が置換Ｓ１７６Ｋを含む、
    請求項４７に記載の抗原結合タンパク質。
  52. ａ．ＥＵナンバリングを使用して、１つの重鎖が置換Ｓ１８３Ｋを含み、もう１つの重鎖が置換Ｓ１８３Ｅを含み、１つの軽鎖が置換Ｓ１７６Ｅを含み、もう１つの軽鎖が置換Ｓ１７６Ｋを含むか、または
    ｂ．ＥＵナンバリングを使用して、１つの重鎖が置換Ｑ３９Ｋ及びＳ１８３Ｋを含み、もう１つの重鎖が置換Ｑ３９Ｅ及びＳ１８３Ｅを含み、１つの軽鎖が置換Ｑ３８Ｅ及びＳ１７６Ｅを含み、もう１つの軽鎖が置換Ｑ３８Ｋ及びＳ１７６Ｋを含むか、または
    ｃ．ＥＵナンバリングを使用して、１つの重鎖が置換Ｇ４４Ｋ及びＳ１８３Ｋを含み、もう１つの重鎖が置換Ｇ４４Ｅ及びＳ１８３Ｅを含み、１つの軽鎖が置換Ｇ１００Ｅ及びＳ１７６Ｅを含み、もう１つの軽鎖が置換Ｇ１００Ｋ及びＳ１７６Ｋを含むか、または
    ｄ．ＥＵナンバリングを使用して、１つの重鎖が置換Ｓ１８３Ｋを含み、もう１つの重鎖が置換Ｓ１８３Ｅを含み、１つの軽鎖が置換Ｓ１７６Ｅを含み、もう１つの軽鎖が置換Ｓ１７６Ｋを含む、
    請求項５０に記載の抗原結合タンパク質。
  53. 前記二重特異性抗原結合タンパク質が、ＥＵナンバリングを使用して、置換Ｒ２９２Ｃ、Ｖ３０２Ｃ及びＮ２９７Ｇを含む２つのＩｇＧ１重鎖を含む、請求項４７に記載の抗原結合タンパク質。
  54. 前記二重特異性抗原結合タンパク質が、ＥＵナンバリングを使用して、置換Ｒ２９２Ｃ、Ｖ３０２Ｃ及びＮ２９７Ｇを含む２つのＩｇＧ１重鎖を含む、請求項５０に記載の抗原結合タンパク質。
  55. 前記二重特異性抗原結合タンパク質が、ＥＵナンバリングを使用して、置換Ｒ２９２Ｃ、Ｖ３０２Ｃ及びＮ２９７Ｇを含む２つのＩｇＧ１重鎖を含む、請求項５１に記載の抗原結合タンパク質。
  56. 前記二重特異性抗原結合タンパク質が、ＥＵナンバリングを使用して、置換Ｒ２９２Ｃ、Ｖ３０２Ｃ及びＮ２９７Ｇを含む２つのＩｇＧ１重鎖を含む、請求項５２に記載の抗原結合タンパク質。
  57. ａ．前記抗原結合タンパク質が２つの軽鎖及び２つの重鎖を含み、
    ｂ．前記重鎖及び軽鎖がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４定常ドメインを含み、
    ｃ．前記抗原結合タンパク質が、ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメインを２つ、ＴＬ１Ａ結合物の軽鎖可変ドメインを２つ、ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメインを２つ及びＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメインを２つ含み、
    ｄ．各軽鎖がＴＬ１Ａ結合物の軽鎖可変ドメイン配列を含み、
    ｅ．各重鎖が、ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメイン配列、ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメイン配列及びＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメイン配列を含む、
    請求項３９に記載の抗原結合タンパク質。
  58. ａ．前記ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号８、１２、１６、２０、２４、２８及び３２）から選択される重鎖可変ドメイン配列を含み、
    ｂ．前記ＴＬ１Ａ結合物の軽鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号６、１０、１４、１８、２２、２６及び３０）から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含み、
    ｃ．前記ＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメイン配列が表Ｈ（配列番号２、４２、３８及び３４）から選択され、
    ｅ．前記ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメイン配列が表Ｈ（配列番号４、４４、３１８、４０及び３６）から選択される、
    請求項５７に記載の抗原結合タンパク質。
  59. Ｋａｂａｔの通りにナンバリングして、前記抗ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメインが位置４４にシステイン残基を含み、前記抗ＴＮＦ−α軽鎖結合ドメインが位置１００にシステイン残基を含む、請求項５７に記載の抗原結合タンパク質。
  60. 前記タンパク質が、表Ｌ、配列番号
    ａ．３５５及び４４７、
    ｂ．３５７及び４４７、
    ｃ．３５９及び４４７、
    ｄ．３６１及び４４７、
    ｅ．３６３及び４４７、
    ｆ．３６５及び５８、
    ｇ．３６７及び７０、
    ｈ．３６９及び７０、
    ｉ．３７１及び７０、
    ｊ．３７３及び７０、
    ｋ．３７５及び７０、
    ｌ．３７７及び７０、
    ｍ．３９１及び４６７、
    ｎ．３９１及び６６、
    ｏ．３９５及び６６、
    ｐ．３９７及び６６、
    ｑ．３９９及び６６、
    ｒ．４０１及び６６、
    ｓ．４０３及び６６、
    ｔ．４０５及び６６
    ｕ．４０７及び４４７、
    ｖ．４０９及び４４７、
    ｗ．４１１及び６６、
    ｘ．４１３及び６６、
    ｙ．４１５及び６６、
    ｚ．４１７及び６６、
    ａａ．４１９及び７０、
    ｂｂ．４２１及び７０、
    ｃｃ．４２３及び７０、並びに
    ｄｄ．４２５及び７０
    から選択される抗原結合タンパク質の重鎖配列及び軽鎖配列を含む、請求項５７に記載の抗原結合タンパク質。
  61. ａ．前記軽鎖配列が配列番号４５３を含み、前記重鎖配列が配列番号４４１を含み、
    ｂ．前記軽鎖配列が配列番号４５１を含み、前記重鎖配列が配列番号４３３を含み、または
    ｃ．前記軽鎖配列が配列番号４５３を含み、前記重鎖配列が配列番号４４５を含む、
    請求項５７に記載の抗原結合タンパク質。
  62. ａ．前記抗原結合タンパク質が２つの軽鎖及び２つの重鎖を含み、
    ｂ．前記重鎖及び軽鎖がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４定常ドメインを含み、
    ｃ．前記抗原結合タンパク質が、ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメインを２つ、ＴＬ１Ａ結合物の軽鎖可変ドメインを２つ、ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメインを２つ及びＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメインを２つ含み、
    ｄ．各軽鎖がＴＮＦ−α結合物の軽鎖配列を含み、
    ｅ．各重鎖が、ＴＮＦ−α結合物の重鎖配列、ＴＬ１Ａ結合物の重鎖結合ドメイン配列及びＴＬ１Ａ結合物の軽鎖結合ドメイン配列を含む、
    請求項３９に記載の抗原結合タンパク質。
  63. ａ．前記ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号８、１２、１６、２０、２４、２８及び３２）から選択される重鎖可変ドメイン配列を含み、
    ｂ．前記ＴＬ１Ａ結合物の軽鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号６、１０、１４、１８、２２、２６及び３０）から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含み、
    ｃ．前記ＴＮＦ−α結合物の軽鎖可変ドメイン配列が表Ｈ（配列番号２、４２、３８及び３４）から選択され、
    ｄ．前記ＴＮＦ−α結合物の重鎖可変ドメイン配列が表Ｈ（配列番号４、４４、３１８、４０及び３６）から選択される、
    請求項６２に記載の抗原結合タンパク質。
  64. Ｋａｂａｔの通りにナンバリングして、前記ＴＬ１Ａ結合物の重鎖可変ドメインが、位置４４にシステイン残基を含み、前記ＴＬ１Ａ結合物の軽鎖結合ドメインが、位置１００にシステイン残基を含む、請求項６２に記載の抗原結合タンパク質。
  65. 前記タンパク質が、表Ｍ、配列番号
    ａ．８２及び４６、
    ｂ．２８４及び４６、
    ｃ．２８６及び４６、
    ｄ．４４１及び４５３
    ｅ．３１２及び４６、
    ｆ．４４５及び４５３、
    ｇ．３１４及び８４、
    ｈ．３２０及び８４、
    ｉ．３２２及び８４、
    ｊ．３４５及び８４、
    ｋ．３４７及び７８、
    ｌ．３４９及び７８、
    ｍ．３５１及び７８、
    ｎ．３５３及び７８、
    ｏ．３７９及び４６、
    ｐ．３８１及び４６、
    ｑ．３８３及び８４、
    ｒ．３８５及び８４、
    ｓ．３８７及び７８、
    ｔ．３８９及び７８、
    ｕ．４３３及び４５１、
    ｖ．４２７及び４４９、
    ｗ．４２９及び４４９、
    ｘ．４３１及び４５１、
    ｙ．４３３及び４５１、
    ｚ．４３５及び４５１、
    ａａ．４３７及び４５１、
    ｂｂ．４３９及び４５３、
    ｃｃ．４４１及び４５３、
    ｄｄ．４４３及び４５３、並びに
    ｅｅ．４４５及び４５３
    から選択される抗原結合タンパク質の重鎖配列及び軽鎖配列を含む、請求項６２に記載の抗原結合タンパク質。
  66. 配列番号
    ａ．４４１及び４５３、
    ｂ．４３３及び４５１、または
    ｃ．４４５及び４５３
    を含む、請求項６２に記載の抗原結合タンパク質。
  67. 請求項１〜６６及び１３１〜１５２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質をコードする、１種または複数の単離核酸。
  68. 請求項６７に記載の核酸（複数可）を含む、１種または複数の発現ベクター。
  69. 請求項６８に記載の１種または複数の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  70. ａ．前記抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項６９に記載の宿主細胞を培養すること、及び
    ｂ．前記培養から前記抗原結合タンパク質を回収すること
    を含む、抗原結合タンパク質の調製方法。
  71. 請求項１〜６６及び１３１〜１５２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質並びに医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体を含む、医薬組成物。
  72. ＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αと関係がある状態の治療を前記治療が必要な患者に行う方法であって、有効量の、請求項１〜６６及び１３１〜１５２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質を前記患者に投与することを含む、前記方法。
  73. 前記状態が炎症性腸疾患である、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記状態がクローン病である、請求項７２に記載の方法。
  75. 前記状態が潰瘍性大腸炎である、請求項７２に記載の方法。
  76. ＴＬ１Ａと関係がある状態の治療を前記治療が必要な患者に行うための医薬の調製における、請求項１〜６６及び１３１〜１５２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質の使用。
  77. 前記状態が炎症性腸疾患である、請求項７６に記載の使用。
  78. 前記状態がクローン病である、請求項７６に記載の使用。
  79. 前記状態が潰瘍性大腸炎である、請求項７６に記載の使用。
  80. ＴＬ１Ａ及び／またはＴＮＦ−αと関係がある状態の治療を前記治療が必要な患者に行う方法で使用するための、請求項１〜６６及び１３１〜１５２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  81. 前記状態が炎症性腸疾患である、請求項８０に記載の抗原結合タンパク質。
  82. 前記状態がクローン病である、請求項８０に記載の抗原結合タンパク質。
  83. 前記状態が潰瘍性大腸炎である、請求項８０に記載の抗原結合タンパク質。
  84. ＴＬ１Ａに対して特異的な抗原結合タンパク質であって、
    ａ．前記抗原結合タンパク質が１つまたは２つの軽鎖可変ドメイン及び１つまたは２つの重鎖可変ドメインを含み、
    ｂ．前記軽鎖可変ドメインがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
    ｃ．前記重鎖可変ドメインがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
    ｄ．前記ＨＣＤＲ３の配列が、表Ａ（配列番号１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、４８９、７８１、７８７、７９６、８０２、８０７、８１３、８２３、８２９、８３４、８４０、８４５、８５１、８５５及び８６１）から選択されるか、または表Ａの各ＨＣＤＲ３配列について、
    ｉ．１つまたは複数の酸性残基が、場合により、任意の他の酸性残基に置き換えられており、
    ｉｉ．１つまたは複数のアミド残基が、場合により、任意の他のアミド残基に置き換えられており、
    ｉｉｉ．１つまたは複数の芳香族残基が、場合により、任意の他の芳香族残基に置き換えられており、
    ｉｖ．１つまたは複数の塩基性残基が、場合により、任意の他の塩基性残基に置き換えられており、
    ｖ．１つまたは複数の親水性残基が、場合により、任意の他の親水性残基に置き換えられており、
    ｖｉ．１つまたは複数の非官能性残基が、場合により、任意の他の非官能性残基に置き換えられている、
    配列であり、
    ｅ．「酸性残基」がＤまたはＥを意味し、
    ｆ．「アミド残基」がＮまたはＱを意味し、
    ｇ．「芳香族残基」がＦ、ＹまたはＷを意味し、
    ｈ．「塩基性残基」がＨ、ＫまたはＲを意味し、
    ｉ．「親水性残基」がＳ、Ｔ、ＮまたはＱを意味し、
    ｊ．「非官能性残基」がＭ、Ｇ、Ａ、Ｖ、ＩまたはＬを意味する、
    前記抗原結合タンパク質。
  85. 前記ＨＣＤＲ３が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、４８９、７８１、７８７、７９６、８０２、８０７、８１３、８２３、８２９、８３４、８４０、８４５、８５１、８５５、８６１、６４１、６４５、６５０、６５７、６７６、６８０、６８１、６６７、６７１、９７６、９８５、１０００、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１８、１０１９、１０２０、１０２４、１０４３、１０４９、１０５０、１０５１、１０５２、１０６３、１０７１、１０７５、１０７６、１０７７、１０９１、１１０５、２５５、２５８、２６１、２６４、２６７、２７０、２７３、６７２、６７５、９５２、９５４、９５８、９６１、９６４、９６６、９６７、９６８、９６９及び９７０）から選択される配列を含む、請求項８４に記載の抗原結合タンパク質。
  86. 前記ＨＣＤＲ３が、表Ａ（配列番号１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、４８９、７８１、７８７、７９６、８０２、８０７、８１３、８２３、８２９、８３４、８４０、８４５、８５１、８５５及び８６１）から選択される配列を含む、請求項８５に記載の抗原結合タンパク質。
  87. 前記ＨＣＤＲ３が抗体及び９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１８０及び１９２）から選択される配列を有する、請求項８６に記載の抗原結合タンパク質。
  88. 前記ＨＣＤＲ１が、表Ａ（配列番号１６４、１７０、１８２、１８８、７７７、７８３、７９２、７９８、８０４、８０９、８１５、８１９、２６５、８３６、８４７及び８５７）から選択される配列を有し、前記ＨＣＤＲ２が、表Ａ（配列番号１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、４８３、４８５、７７９、７８５、７９４、８００、８１１、８１７、８２１、８２７、８３２、８３８、８４３、８４９、８５３、８５９及び８６４）から選択される配列を有し、またはＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２が、表Ａの各ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２配列について、
    ａ．１つまたは複数の酸性残基が、場合により、任意の他の酸性残基に置き換えられており、
    ｂ．１つまたは複数のアミド残基が、場合により、任意の他のアミド残基に置き換えられており、
    ｃ．１つまたは複数の芳香族残基が、場合により、任意の他の芳香族残基に置き換えられており、
    ｄ．１つまたは複数の塩基性残基が、場合により、任意の他の塩基性残基に置き換えられており、
    ｅ．１つまたは複数の親水性残基が、場合により、任意の他の親水性残基に置き換えられており、
    ｆ．１つまたは複数の非官能性残基が、場合により、任意の他の非官能性残基に置き換えられている、
    配列を有する、請求項８４に記載の抗原結合タンパク質。
  89. ａ．前記ＨＣＤＲ１が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１６４、１７０、１８２、１８８、７７７、７８３、７９２、７９８、８０４、８０９、８１５、８１９、２６５、８３６、８４７、８５７、６３９、６５４、６５５、６３２、６６４、９５５、９７９、９９４、１０１０、１０１７、１０２２、１０２７、１０２８、１０２９、１０３７、１０４５、１０８７、２５３、２５６、２５９、２６２、２６８、２７１、２６５、９５０）から選択される配列を有し、
    ｂ．前記ＨＣＤＲ２が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、４８３、４８５、７７９、７８５、７９４、８００、８１１、８１７、８２１、８２７、８３２、８３８、８４３、８４９、８５３、８５９、８６４、６４０、２０４、６７８、６７９、６４４、６４８、６４９、６３３、６５６、６５９、６６０、６６５、６６６、６７７、１１４、２２７、２３０、６９１、７１５、６６９、７１１、９７１、９７２、９７３、９７４、９７５、９８０、９８１、９８２、９８３、９８４、９９５、９９６、９９７、９９８、０９９９、１０１１、１０２３、１０３０、１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４６、１０４７、１０４８、１０５８、１０５９、１０６０、１０６１、１０６２、１０６６、１０６７、１０６８、１０６９、１０７０、１０７４、１０８８、１０８９、１０９０、１０９５、１０９６、１０９７、１１０２、１１０３、１１０４、１１０８、１１０９、１１１０、１１１１、１１１２、２５４、２６０、１８４、２６９、２７２、２６６、２５４、９５１、９５３、９５６、及び９６３）から選択される配列を有する、
    請求項８５に記載の抗原結合タンパク質。
  90. ａ．前記ＨＣＤＲ１が、表Ａ（配列番号１６４、１７０、１８２、１８８、７７７、７８３、７９２、７９８、８０４、８０９、８１５、８１９、２６５、８３６、８４７及び８５７）から選択される配列を有し、
    ｂ．前記ＨＣＤＲ２が、表Ａ（配列番号１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、４８３、４８５、７７９、７８５、７９４、８００、８１１、８１７、８２１、８２７、８３２、８３８、８４３、８４９、８５３、８５９及び８６４）から選択される配列を有する、
    請求項８６に記載の抗原結合タンパク質。
  91. 前記ＨＣＤＲ１が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１７０及び１８８）から選択される配列を有し、前記ＨＣＤＲ２が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１７８及び１９０）から選択される配列を有する、請求項８７に記載の抗原結合タンパク質。
  92. 前記ＬＣＤＲ３が、表Ａ（配列番号１０２、１０８、２６３、１２０、１２６、６８７、６９３、７０１、７０７、７１７、７２７、７３３、７３９、７４５、７５１、７５７、７６３、７６７、７７１及び７７５）から選択される配列を有するか、表Ａの各ＬＣＤＲ３配列について、
    ａ．１つまたは複数の酸性残基が、場合により、任意の他の酸性残基に置き換えられており、
    ｂ．１つまたは複数のアミド残基が、場合により、任意の他のアミド残基に置き換えられており、
    ｃ．１つまたは複数の芳香族残基が、場合により、任意の他の芳香族残基に置き換えられており、
    ｄ．１つまたは複数の塩基性残基が、場合により、任意の他の塩基性残基に置き換えられており、
    ｅ．１つまたは複数の親水性残基が、場合により、任意の他の親水性残基に置き換えられており、
    ｆ．１つまたは複数の非官能性残基が、場合により、任意の他の非官能性残基に置き換えられている、
    配列である、請求項８４に記載の抗原結合タンパク質。
  93. 前記ＬＣＤＲ３が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１０２、１０８、２６３、１２０、１２６、６８７、６９３、７０１、７０７、７１７、７２７、７３３、７３９、７４５、７５１、７５７、７６３、７６７、７７１、７７５、６３７、６３８、６３１、６５３、６６３、６３７、２３３、９４０、９７８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、１００５、１００６、１００７、１００８、１００９、１０３４、１０３５、１０３６、１０５５、１０５６、１０５７、１０６５、１０８６、１０９３、１０９４、１０９９、１１００、１１０１、１１０７、２２８、２３１、２３４、２３７、２４３、２４０、６７４、９３６、９３８、７０１、７０７、９４９、９４２及び９４４）から選択される配列を有する、請求項８５に記載の抗原結合タンパク質。
  94. 前記ＬＣＤＲ３が、表Ａ（配列番号１０２、１０８、２６３、１２０、１２６、６８７、６９３、７０１、７０７、７１７、７２７、７３３、７３９、７４５、７５１、７５７、７６３、７６７、７７１及び７７５））から選択される配列を有する、請求項８６に記載の抗原結合タンパク質。
  95. 前記ＬＣＤＲ３が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号２６３及び１２６）から選択される配列を有する、請求項８７に記載の抗原結合タンパク質。
  96. 前記ＬＣＤＲ１が、表Ａ（配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、４６７、４６９、６８３、６８９、２３５、６９７、１４６、７０９、７１３、７１９、７２３、２２９、２２６、７４１、７４７、７５３及び７７３）から選択される配列を有し、前記ＬＣＤＲ２が、表Ａ（配列番号１００、１０６、１１２、１１８、１２４、６８５、６９９、７０５、７２１、７２５、７３１、７３７、７４９、７５５、７６１及び７６９）から選択される配列、または表Ａの各ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２配列について、
    ａ．１つもしくは複数の酸性残基が、場合により、任意の他の酸性残基に置き換えられており、
    ｂ．１つもしくは複数のアミド残基が、場合により、任意の他のアミド残基に置き換えられており、
    ｃ．１つもしくは複数の芳香族残基が、場合により、任意の他の芳香族残基に置き換えられており、
    ｄ．１つもしくは複数の塩基性残基が、場合により、任意の他の塩基性残基に置き換えられており、
    ｅ．１つもしくは複数の親水性残基が、場合により、任意の他の親水性残基に置き換えられており、
    ｆ．１つもしくは複数の非官能性残基が、場合により、任意の他の非官能性残基に置き換えられている、
    配列を有する、請求項９２に記載の抗原結合タンパク質。
  97. ａ．前記ＬＣＤＲ１が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、４６７、４６９、６８３、６８９、２３５、６９７、１４６、７０９、７１３、７１９、７２３、２２９、２２６、７４１、７４７、７５３、７７３、６３５、６４２、６４６、６５１、６５８、６６１、６６８、７５９、７４３、７６５、９７７、９８６、９８７、１００１、１０１６、１０２１、１０２５、１０３１、１０３２、１０３３、１０４４、１０５３、１０６４、１０７２、１０７８、１０７９、１０８０、１１０６、２２６、２２９、２３２、２３５、２４１、２３８、１１１３、１４６及び９４７）から選択される配列を有し、
    ｂ．前記ＬＣＤＲ２が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１００、１０６、１１２、１１８、１２４、２３５、６９９、７０５、７２１、７２５、７３１、７３７、７４９、７５５、７６１、７６９、６３６、６４３、６４７、６５２、６６２、７８９、９８８、１００１、１００２、１００４、１０２６、１０５４、１０７３、１０８１、１０８２、１０８３、１０８４、１０８５、１０９２、１０９８、２４２、９３５、１４８、９４８及び９４３）から選択される配列を有する、
    請求項９３に記載の抗原結合タンパク質。
  98. ａ．前記ＬＣＤＲ１が、表Ａ（配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、４６７、４６９、６８３、６８９、２３５、６９７、１４６、７０９、７１３、７１９、７２３、２２９、２２６、７４１、７４７、７５３及び７７３）から選択される配列を有し、
    ｂ．前記ＬＣＤＲ２が、表Ａ（配列番号１００、１０６、１１２、１１８、１２４、６８５、６９９、７０５、７２１、７２５、７３１、７３７、７４９、７５５、７６１及び７６９）から選択される配列を有する、
    請求項９４に記載の抗原結合タンパク質。
  99. 前記ＬＣＤＲ１が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１１０及び１２２）から選択される配列を有し、前記ＬＣＤＲ２が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１１２及び１２４）から選択される配列を有する、請求項９５に記載の抗原結合タンパク質。
  100. ａ．前記ＬＣＤＲ１が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、４６７、４６９、６８３、６８９、２３５、６９７、１４６、７０９、７１３、７１９、７２３、２２９、２２６、７４１、７４７、７５３、７７３、６３５、６４２、６４６、６５１、６５８、６６１、６６８、７５９、７４３、７６５、９７７、９８６、９８７、１００１、１０１６、１０２１、１０２５、１０３１、１０３２、１０３３、１０４４、１０５３、１０６４、１０７２、１０７８、１０７９、１０８０、１１０６、２２６、２２９、２３２、２３５、２４１、２３８、１１１３、１４６及び９４７）から選択される配列を有し、
    ｂ．前記ＬＣＤＲ２が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１００、１０６、１１２、１１８、１２４、２３５、６９９、７０５、７２１、７２５、７３１、７３７、７４９、７５５、７６１、７６９、６３６、６４３、６４７、６５２、６６２、７８９、９８８、１００１、１００２、１００４、１０２６、１０５４、１０７３、１０８１、１０８２、１０８３、１０８４、１０８５、１０９２、１０９８、２４２、９３５、１４８、９４８及び９４３）から選択される配列を有し、
    ｃ．前記ＬＣＤＲ３が、表Ａ、Ｂ及びＣ（配列番号１０２、１０８、２６３、１２０、１２６、６８７、６９３、７０１、７０７、７１７、７２７、７３３、７３９、７４５、７５１、７５７、７６３、７６７、７７１、７７５、６３７、６３８、６３１、６５３、６６３、６３７、２３３、９４０、９７８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、１００５、１００６、１００７、１００８、１００９、１０３４、１０３５、１０３６、１０５５、１０５６、１０５７、１０６５、１０８６、１０９３、１０９４、１０９９、１１００、１１０１、１１０７、２２８、２３１、２３４、２３７、２４３、２４０、６７４、９３６、９３８、７０１、７０７、９４９、９４２及び９４４）から選択される配列を有する、
    請求項８９に記載の抗原結合タンパク質。
  101. ａ．前記ＬＣＤＲ１が、表Ａ（配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、４６７、４６９、６８３、６８９、２３５、６９７、１４６、７０９、７１３、７１９、７２３、２２９、２２６、７４１、７４７、７５３及び７７３）から選択される配列を有し、
    ｂ．前記ＬＣＤＲ２が、表Ａ（配列番号１００、１０６、１１２、１１８、１２４、６８５、６９９、７０５、７２１、７２５、７３１、７３７、７４９、７５５、７６１及び７６９）から選択される配列を有し、
    ｃ．前記ＬＣＤＲ３が、表Ａ（配列番号１０２、１０８、２６３、１２０、１２６、６８７、６９３、７０１、７０７、７１７、７２７、７３３、７３９、７４５、７５１、７５７、７６３、７６７、７７１及び７７５）から選択される配列を有する、
    請求項９０に記載の抗原結合タンパク質。
  102. ａ．前記ＬＣＤＲ１が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１１０及び１２２）から選択される配列を有し、
    ｂ．前記ＬＣＤＲ２が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１１２及び１２４）から選択される配列を有し、
    ｃ．前記ＬＣＤＲ３が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１０８及び１２６）から選択される配列を有する、
    請求項９１に記載の抗原結合タンパク質。
  103. 前記軽鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、４９１、４９３、８６６、８７０、８７４、８７８、８８２、８８６、８９０、８９４、８９８、９０２、９０６、９１０、９１４、９１８、９２２、９２４、９２８及び９３２）から選択される軽鎖可変ドメイン配列に少なくとも約９０％同一である配列を含む、請求項８４に記載の抗原結合タンパク質。
  104. 前記軽鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、４９１、４９３、８６６、８７０、８７４、８７８、８８２、８８６、８９０、８９４、８９８、９０２、９０６、９１０、９１４、９１８、９２２、９２４、９２８及び９３２）から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項２０に記載の抗原結合タンパク質。
  105. 前記重鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、４９５、４９７、８６８、８７２、８７６、８８０、８８４、８８８、８９２、８９６、９００、９０４、９０８、９１２、９１６、９２０、９２６、９３０及び９３４）から選択される重鎖可変ドメイン配列に少なくとも約９０％同一である配列を含む、請求項８４に記載の抗原結合タンパク質。
  106. 前記重鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、４９５、４９７、８６８、８７２、８７６、８８０、８８４、８８８、８９２、８９６、９００、９０４、９０８、９１２、９１６、９２０、９２６、９３０及び９３４）から選択される重鎖可変ドメイン配列に少なくとも約９０％同一である配列を含む、請求項１０３に記載の抗原結合タンパク質。
  107. 前記重鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、４９５、４９７、８６８、８７２、８７６、８８０、８８４、８８８、８９２、８９６、９００、９０４、９０８、９１２、９１６、９２０、９２６、９３０及び９３４）から選択される重鎖可変ドメイン配列を含む、請求項１０３に記載の抗原結合タンパク質。
  108. 前記重鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、４９５、４９７、８６８、８７２、８７６、８８０、８８４、８８８、８９２、８９６、９００、９０４、９０８、９１２、９１６、９２０、９２６、９３０及び９３４）から選択される重鎖可変ドメイン配列を含む、請求項１０４に記載の抗原結合タンパク質。
  109. 前記重鎖可変ドメインが、表Ｄ（配列番号８、１２、１６、２０、２４、２８及び３２）から選択される重鎖可変ドメイン配列を含む、請求項１０３に記載の抗原結合タンパク質。
  110. 前記軽鎖可変ドメイン配列が、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１４及び２２）から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含み、前記重鎖可変ドメインが、抗体９Ｃ８及び３Ｂ３（配列番号１６及び２４）から選択される重鎖可変ドメイン配列を含む、請求項１０８に記載の抗原結合タンパク質。
  111. 前記タンパク質が、表Ｅ（配列番号６６、５４、５８、６２、６６、７０、７４、４５５、４５９、１１１６、１１２０、１１２４、１１２８、１１３２、１１３６、１１４０、１１４４、１１４８、１１５２、１１５６、１１６０、１１６４、１１６８、１１７２、１１７６、１１８０、１１８４及び１１８８）から選択される軽鎖配列を有する軽鎖を含む、請求項８４に記載の抗原結合タンパク質。
  112. 前記タンパク質が、表Ｅ（配列番号５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、４５７、４６１、１１１８、１１２２、１１２６、１１３０、１１３４、１１３８、１１４２、１１４６、１１５０、１１５４、１１５８、１１６２、１１６６、１１７０、１１７４、１１７８、１１８２、１１８６及び１１９０）から選択される重鎖配列を有する重鎖を含む、請求項８４に記載の抗原結合タンパク質。
  113. 表Ｅ、配列番号
    ａ．５０及び５２、
    ｂ．５４及び５６、
    ｃ．５８及び６０、
    ｄ．６２及び６４、
    ｅ．６６及び６８、
    ｆ．７０及び７２、
    ｇ．７４及び７６、
    ｈ．４５５及び４５７、
    ｉ．４５９及び４６１、
    ｊ．１１１６及び１１１８、
    ｋ．１１２０及び１１２２、
    ｌ．１１２４及び１１２６、
    ｍ．１１２８及び１１３０、
    ｎ．１１３２及び１１３４、
    ｏ．１１３６及び１１３８、
    ｐ．１１４０及び１１４２、
    ｑ．１１４４及び１１４６、
    ｒ．１１４８及び１１５０、
    ｓ．１１５２及び１１５４、
    ｔ．１１５６及び１１５８、
    ｕ．１１６０及び１１６２、
    ｖ．１１６４及び１１６６、
    ｗ．１１６８及び１１７０、
    ｘ．１１７２及び１１７４、
    ｙ．１１７６及び１１７８、
    ｚ．１１８０及び１１８２、
    ａａ．１１８４及び１１８６、並びに
    ｂｂ．１１８８及び１１９０
    から選択される抗体の前記軽鎖及び重鎖配列を含む、請求項８４に記載の抗原結合タンパク質。
  114. 請求項８４〜１１３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質をコードする、１種または複数の単離核酸。
  115. 請求項１１４に記載の核酸（複数可）を含む、１種または複数の発現ベクター。
  116. 請求項１１５に記載の１種または複数の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  117. ａ．前記抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項１１６に記載の宿主細胞を培養すること、及び
    ｂ．前記培養から前記抗原結合タンパク質を回収すること
    を含む、抗原結合タンパク質の調製方法。
  118. 請求項８４〜１１３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質及び医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体を含む、医薬組成物。
  119. ＴＬ１Ａと関係がある状態の治療を前記治療が必要な患者に行う方法であって、有効量の、請求項８４〜１１３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質を前記患者に投与することを含む、前記方法。
  120. 前記状態が炎症性腸疾患である、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記状態がクローン病である、請求項１１９に記載の方法。
  122. 前記状態が潰瘍性大腸炎である、請求項１１９に記載の方法。
  123. ＴＬ１Ａと関係がある状態の治療を前記治療が必要な患者に行うための医薬の調製における、請求項８４〜１１３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質の使用。
  124. 前記状態が炎症性腸疾患である、請求項１２３に記載の使用。
  125. 前記状態がクローン病である、請求項１２３に記載の使用。
  126. 前記状態が潰瘍性大腸炎である、請求項１２３に記載の使用。
  127. ＴＬ１Ａと関係がある状態の治療を前記治療が必要な患者に行う方法で使用するための、請求項８４〜１１３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  128. 前記状態が炎症性腸疾患である、請求項１２７に記載の抗原結合タンパク質。
  129. 前記状態がクローン病である、請求項１２７に記載の抗原結合タンパク質。
  130. 前記状態が潰瘍性大腸炎である、請求項１２７に記載の抗原結合タンパク質。
  131. ａ．第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、前記第１の重鎖が、そのＣ末端を介して第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に融合しており、前記ＶＨ２が、そのＣ末端を介して第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に融合しており、前記第１の抗体が前記ＴＬ１Ａ結合物または前記ＴＮＦ−α結合物の１つを含み、前記第２の抗体がもう１つを含み、
    ｉ．前記ＶＨ１または第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３から成る群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
    ｉｉ．前記ＶＨ２または第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３に対応する残基から成る群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、
    前記第１のポリペプチド、並びに
    ｂ．ａ．の前記第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、前記第１の軽鎖が第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記第２のポリペプチド、並びに
    ｃ．ａ．の前記第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、前記第２の軽鎖が第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記第３のポリペプチド
    を含む、請求項３８に記載の抗原結合タンパク質。
  132. 前記第１の重鎖がペプチドリンカーを介して前記ＶＨ２に融合している、請求項１３１に記載の抗原結合タンパク質。
  133. 前記ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）６及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６から成る群から選択される配列を含む、請求項１３２に記載の抗原結合タンパク質。
  134. ａ．前記ＶＨ１または第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｑ３９Ｋ、Ｇ４４Ｋ及びＳ１８３Ｋから成る群から選択される変異を含み、
    ｂ．前記ＶＨ２または第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｑ３９Ｅ、Ｇ４４Ｅ及びＳ１８３Ｅから成る群から選択される変異を含み、
    ｃ．前記ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｑ３８Ｅ、Ｇ１００Ｅ及びＳ１７６Ｅから成る群から選択される変異を含み、
    ｄ．前記ＶＬ２または第２のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｑ３８Ｋ、Ｇ１００Ｋ及びＳ１７６Ｋから成る群から選択される変異を含む、
    請求項１３１に記載の抗原結合タンパク質。
  135. ａ．前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｓ１８３Ｋ変異を含み、
    ｂ．前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｓ１８３Ｅ変異を含み、
    ｃ．前記第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｓ１７６Ｅ変異を含み、
    ｄ．前記第２のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｓ１７６Ｋ変異を含む、
    請求項１３４に記載の抗原結合タンパク質。
  136. ａ．ＥＵナンバリングを使用して、前記ＶＨ１がＱ３９Ｋ変異を含み、前記第１のＣＨ１ドメインがＳ１８３Ｋ変異を含み、
    ｂ．ＥＵナンバリングを使用して、前記ＶＨ２がＱ３９Ｅ変異を含み、前記第２のＣＨ１ドメインがＳ１８３Ｅ変異を含み、
    ｃ．ＥＵナンバリングを使用して、前記ＶＬ１がＱ３８Ｅ変異を含み、前記第１のＣＬドメインがＳ１７６Ｅ変異を含み、
    ｄ．ＥＵナンバリングを使用して、前記ＶＬ２がＱ３８Ｋ変異を含み、前記第２のＣＬドメインがＳ１７６Ｋ変異を含む、
    請求項１３４に記載の抗原結合タンパク質。
  137. ａ．前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ４４Ｋ及びＳ１８３Ｋ変異を含み、
    ｂ．前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ４４Ｅ及びＳ１８３Ｅ変異を含み、
    ｃ．前記第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ１００Ｅ及びＳ１７６Ｅ変異を含み、
    ｄ．前記第２のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ１００Ｋ及びＳ１７６Ｋ変異を含む、
    請求項１３４に記載の抗原結合タンパク質。
  138. ａ．第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、前記第１の重鎖が、そのＣ末端を介して第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に融合しており、前記ＶＨ２が、そのＣ末端を介して第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に融合しており、前記第１の抗体が前記ＴＬ１Ａ結合物及び前記ＴＮＦ−α結合物の１つを含み、前記第２の抗体がもう１つを含み、
    ｉ．前記ＶＨ１または第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３から成る群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
    ｉｉ．前記ＶＨ２または第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３に対応する残基から成る群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、
    前記第１のポリペプチド
    ｂ．ａ．の前記第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、前記第１の軽鎖が第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に正に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記第２のポリペプチド、並びに
    ｃ．ａ．の前記第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、前記第２の軽鎖が第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に負に荷電したアミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記第３のポリペプチド
    を含む、請求項３８に記載の抗原結合タンパク質。
  139. 前記第１の重鎖がペプチドリンカーを介して前記ＶＨ２に融合している、請求項１３８に記載の抗原結合タンパク質。
  140. 前記ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）６及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６から成る群から選択される配列を含む、請求項１３９に記載の抗原結合タンパク質。
  141. ａ．前記ＶＨ１または第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｑ３９Ｅ、Ｇ４４Ｅ及びＳ１８３Ｅから成る群から選択される変異を含み、
    ｂ．前記ＶＨ２または第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｑ３９Ｋ、Ｇ４４Ｋ及びＳ１８３Ｋから成る群から選択される変異を含み、
    ｃ．前記ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｑ３８Ｋ、Ｇ１００Ｋ及びＳ１７６Ｋから成る群から選択される変異を含み、
    ｄ．前記ＶＬ２または第２のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｑ３８Ｅ、Ｇ１００Ｅ及びＳ１７６Ｅから成る群から選択される変異を含む、
    請求項１３８に記載の抗原結合タンパク質。
  142. ａ．前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｓ１８３Ｅ変異を含み、
    ｂ．前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｓ１８３Ｋ変異を含み、
    ｃ．前記第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｓ１７６Ｋ変異を含み、
    ｄ．前記第２のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｓ１７６Ｅ変異を含む、
    請求項１４１に記載の抗原結合タンパク質。
  143. ａ．ＥＵナンバリングを使用して、前記ＶＨ１がＱ３９Ｅ変異を含み、前記第１のＣＨ１ドメインがＳ１８３Ｅ変異を含み、
    ｂ．ＥＵナンバリングを使用して、前記ＶＨ２がＱ３９Ｋ変異を含み、前記第２のＣＨ１ドメインがＳ１８３Ｋ変異を含み、
    ｃ．ＥＵナンバリングを使用して、前記ＶＬ１がＱ３８Ｋ変異を含み、前記第１のＣＬドメインがＳ１７６Ｋ変異を含み、
    ｄ．ＥＵナンバリングを使用して、前記ＶＬ２がＱ３８Ｅ変異を含み、前記第２のＣＬドメインがＳ１７６Ｅ変異を含む、
    請求項１４１に記載の抗原結合タンパク質。
  144. ａ．前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ４４Ｅ及びＳ１８３Ｅ変異を含み、
    ｂ．前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ４４Ｋ及びＳ１８３Ｋ変異を含み、
    ｃ．前記第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ１００Ｋ及びＳ１７６Ｋ変異を含み、
    ｄ．前記第２のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ１００Ｅ及びＳ１７６Ｅ変異を含む、
    請求項１４１に記載の抗原結合タンパク質。
  145. ａ．第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第１のＣＨ１ドメインを含む第１の抗体の第１の重鎖を含む第１のポリペプチドであって、前記第１の重鎖が、そのＣ末端を介して第２の抗体の第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含むポリペプチドのＮ末端に融合しており、前記ＶＨ２が、そのＣ末端を介して第２のＣＨ１ドメインのＮ末端に融合しており、前記第１の抗体が前記ＴＬ１Ａ結合物及び前記ＴＮＦ−α結合物の１つを含み、第２の抗体がもう１つを含み、
    ｉ．前記ＶＨ１または第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３から成る群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
    ｉｉ．前記ＶＨ２または第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３９、４４及び１８３に対応する残基から成る群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここでは、前記電荷が、前記第１の重鎖の前記ＶＨ１または第１のＣＨ１の前記置換される残基の逆である、前記第１のポリペプチド、並びに
    ｂ．ａ．の前記第１の抗体の第１の軽鎖を含む第２のポリペプチドであって、前記第１の軽鎖が第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ１または第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
    ｉ．位置３８の電荷が、ＥＵナンバリングを使用して位置３９の、前記第１の重鎖の前記ＶＨ１または第１のＣＨ１の前記置換される残基の逆であり、ＥＵナンバリングを使用して位置１００の電荷が、ＥＵナンバリングを使用して位置４４の、前記第１の重鎖の前記ＶＨ１または第１のＣＨ１の前記置換される残基の逆であり、位置１７６の電荷が、ＥＵナンバリングを使用して位置１８３の、前記第１の重鎖の前記ＶＨ１または第１のＣＨ１の前記置換される残基の逆である、第２のポリペプチド
    ｃ．ａ．の前記第２の抗体の第２の軽鎖を含む第３のポリペプチドであって、前記第２の軽鎖が第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２のＣＬ領域を含み、前記ＶＬ２または第２のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、位置３８、１００及び１７６から成る群から選択される残基に荷電アミノ酸を導入するために、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
    ｉ．位置３８の電荷が、位置３９の、前記第２の重鎖の前記ＶＨ２または第２のＣＨ１の前記置換される残基の逆であり、位置１００の電荷が、位置４４の、前記第２の重鎖の前記ＶＨ２または第２のＣＨ１の前記置換される残基の逆であり、位置１７６の電荷が、位置１８３の、前記第２の重鎖の前記ＶＨ２または第２のＣＨ１の前記置換される残基の逆である、第３のポリペプチド
    を含む、請求項３８に記載の抗原結合タンパク質。
  146. 前記第１の重鎖がペプチドリンカーを介して前記ＶＨ２に融合している、請求項１４５に記載の抗原結合タンパク質。
  147. 前記ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）６及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６から成る群から選択される配列を含む、請求項１４６に記載の抗原結合タンパク質。
  148. ａ．ＥＵナンバリングを使用して、前記ＶＨ１がＱ３９Ｅ変異を含み、前記第１のＣＨ１ドメインがＳ１８３Ｋ変異を含み、
    ｂ．ＥＵナンバリングを使用して、前記ＶＨ２がＱ３９Ｋ変異を含み、前記第２のＣＨ１ドメインがＳ１８３Ｅ変異を含み、
    ｃ．ＥＵナンバリングを使用して、前記ＶＬ１がＱ３８Ｋ変異を含み、前記第１のＣＬドメインがＳ１７６Ｅ変異を含み、
    ｄ．ＥＵナンバリングを使用して、前記ＶＬ２がＱ３８Ｅ変異を含み、前記第２のＣＬドメインがＳ１７６Ｋ変異を含む、
    請求項１４５に記載の抗原結合タンパク質。
  149. ａ．前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ４４Ｅ及びＳ１８３Ｋ変異を含み、
    ｂ．前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ４４Ｋ及びＳ１８３Ｅ変異を含み、
    ｃ．前記第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ１００Ｋ及びＳ１７６Ｅ変異を含み、
    ｄ．前記第２のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ１００Ｅ及びＳ１７６Ｋ変異を含む、
    請求項１４６に記載の抗原結合タンパク質。
  150. ａ．ＥＵナンバリングを使用して、前記ＶＨ１がＱ３９Ｋ変異を含み、前記第１のＣＨ１ドメインがＳ１８３Ｅ変異を含み、
    ｂ．ＥＵナンバリングを使用して、前記ＶＨ２がＱ３９Ｅ変異を含み、前記第２のＣＨ１ドメインがＳ１８３Ｋ変異を含み、
    ｃ．ＥＵナンバリングを使用して、前記ＶＬ１がＱ３８Ｅ変異を含み、前記第１のＣＬドメインがＳ１７６Ｋ変異を含み、
    ｄ．ＥＵナンバリングを使用して、前記ＶＬ２がＱ３８Ｋ変異を含み、前記第２のＣＬドメインがＳ１７６Ｅ変異を含む、
    請求項１４６に記載の抗原結合タンパク質。
  151. ａ．前記第１のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ４４Ｋ及びＳ１８３Ｅ変異を含み、
    ｂ．前記第２のＣＨ１ドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ４４Ｅ及びＳ１８３Ｋ変異を含み、
    ｃ．前記第１のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ１００Ｅ及びＳ１７６Ｋ変異を含み、
    ｄ．前記第２のＣＬドメインが、ＥＵナンバリングを使用して、Ｇ１００Ｋ及びＳ１７６Ｅ変異を含む、
    請求項１４６に記載の抗原結合タンパク質。
  152. ａ．第１の抗体由来の第１の重鎖（ＶＨ２−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む第１のポリペプチドであって、前記第１の重鎖が、そのカルボキシル末端で（場合により、ペプチドリンカーを介して）第２の抗体のＶＨ２−ＣＨ１ドメインを含むポリペプチドに融合している、前記第１のポリペプチド、
    ｂ．前記第１の抗体由来の軽鎖（ＶＬ１−ＣＬ）を含む、第２のポリペプチド、及び
    ｃ．前記第２の抗体のＶＬ２−ＣＬドメインを含む第３のポリペプチド、
    を含み、
    前記第１の抗体がＴＬ１Ａ結合物及びＴＮＦ−α結合物の１つを含み、前記第２の抗体がもう１つを含む、請求項３８に記載の抗原結合タンパク質。
  153. ａ．前記第１の抗体由来のＣＬが位置２３０にＥを含み、前記第１の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＫを含み、前記第２の抗体由来のＣＬが位置２３０にＫを含み、前記第２の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＥを含み、
    ｂ．前記第１の抗体由来のＣＬが位置２３０にＥを含み、前記第１の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＫを含み、前記第１の抗体由来のＶＬが位置４６にＥを含み、前記第１の抗体由来のＶＨが位置４６にＫを含み、前記第２の抗体由来のＣＬが位置２３０にＫを含み、前記第２の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＥを含み、前記第２の抗体由来のＶＬが位置４６にＥを含み、前記第２の抗体由来のＶＨが位置４６にＫを含み、または
    ｃ．前記第１の抗体由来のＣＬが位置２３０にＥを含み、前記第１の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＫを含み、前記第１の抗体由来のＶＬが位置１４１にＥを含み、前記第１の抗体由来のＶＨが位置５１にＫを含み、前記第２の抗体由来のＣＬが位置２３０にＫを含み、前記第２の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＥを含み、前記第２の抗体由来のＶＬが位置５１にＥを含み、前記第２の抗体由来のＶＨが位置１４１にＫを含み、
    ここでは、すべての位置がＥＵナンバリングに従う、請求項１５２に記載の抗原結合タンパク質。
  154. ａ．そのカルボキシル末端で（場合により、ペプチドリンカーを介して）第２の抗体のＶＨ２−ＣＨ１ドメインを含むポリペプチドに融合している、第１の抗体のＶＨ１−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド、
    ｂ．前記第１の抗体由来の軽鎖（ＶＬ１−ＣＨ１）を含む第２のポリペプチド、及び
    ｃ．前記第２の抗体のＶＬ２−ＣＬドメインを含む第３のポリペプチド
    を含み、
    前記第１の抗体がＴＬ１Ａ結合物またはＴＮＦ−α結合物の１つを含み、前記第２の抗体がもう１つを含む、請求項３８に記載の抗原結合タンパク質。
  155. ａ．前記第１の抗体由来のＣＬが位置２３０にＫを含み、前記第１の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＥを含み、前記第２の抗体由来のＣＬが位置２３０にＫを含み、前記第２の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＥを含み、
    ｂ．前記第１の抗体由来のＣＬが位置２３０にＫを含み、前記第１の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＥを含み、前記第１の抗体由来のＶＬが位置４６にＥを含み、前記第１の抗体由来のＶＨが位置４６にＫを含み、前記第２の抗体由来のＣＬが位置２３０にＫを含み、前記第２の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＥを含み、前記第２の抗体由来のＶＬが位置４６にＥを含み、前記第２の抗体由来のＶＨが位置４６にＫを含み、または
    ｃ．前記第１の抗体由来のＣＬが位置２３０にＫを含み、前記第１の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＥを含み、前記第１の抗体由来のＶＬが位置１４１にＥを含み、前記第１の抗体由来のＶＨが位置５１にＫを含み、前記第２の抗体由来のＣＬが位置２３０にＫを含み、前記第２の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＥを含み、前記第２の抗体由来のＶＬが位置５１にＥを含み、前記第２の抗体由来のＶＨが位置１４１にＫを含み、
    ここで、すべての位置がＥＵナンバリングに従う、請求項１５４に記載の抗原結合タンパク質。
  156. ａ．第１の抗体の第１の重鎖（ＶＨ１−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む第１のポリペプチドであって、前記第１の重鎖が、そのカルボキシル末端で（場合により、ペプチドリンカーを介して）第２の抗体のＶＨ２−ＣＬドメインを含むポリペプチドに融合している、前記第１のポリペプチド、
    ｂ．第１の抗体由来の軽鎖（ＶＬ１−ＣＬ）を含む第２のポリペプチド、及び
    ｃ．前記第２の抗体のＶＬ２−ＣＨ１ドメインを含む第３のポリペプチド
    を含み、
    前記第１の抗体がＴＬ１Ａ結合物またはＴＮＦ−α結合物の１つを含み、前記第２の抗体がもう１つを含む、請求項３８に記載の抗原結合タンパク質。
  157. ａ．前記第１の抗体由来のＣＬが位置２３０にＥを含み、前記第１の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＫを含み、前記第２の抗体由来のＣＬが位置２３０にＥを含み、前記第２の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＫを含み、
    ｂ．前記第１の抗体由来のＣＬが位置２３０にＥを含み、前記第１の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＫを含み、前記第１の抗体由来のＶＬが位置４６にＥを含み、前記第１の抗体由来のＶＨが位置４６にＫを含み、前記第２の抗体由来のＣＬが位置２３０にＥを含み、前記第２の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＫを含み、前記第２の抗体由来のＶＬが位置４６にＥを含み、前記第２の抗体由来のＶＨが位置４６にＫを含み、または
    ｃ．前記第１の抗体由来のＣＬが位置２３０にＥを含み、前記第１の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＫを含み、前記第１の抗体由来のＶＬが位置１４１にＥを含み、前記第１の抗体由来のＶＨが位置５１にＫを含み、前記第２の抗体由来のＣＬが位置２３０にＥを含み、前記第２の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＫを含み、前記第２の抗体由来のＶＬが位置５１にＥを含み、前記第２の抗体由来のＶＨが位置１４１にＫを含み、
    ここで、すべての位置がＥＵナンバリングに従う、請求項１５６に記載の抗原結合タンパク質。
  158. ａ．そのカルボキシル末端で（場合により、ペプチドリンカーを介して）第２の抗体のＶＨ２−ＣＬドメインを含むポリペプチドに融合している、第１の抗体のＶＨ１−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド、
    ｂ．前記第１の抗体由来のＶＬ１−ＣＨ１ドメインを含む第２のポリペプチド、及び
    ｃ．前記第２の抗体のＶＬ２−ＣＨ１ドメインを含む第３のポリペプチド
    を含み、
    前記第１の抗体がＴＬ１Ａ結合物またはＴＮＦ−α結合物の１つを含み、前記第２の抗体がもう１つを含む、請求項３８に記載の抗原結合タンパク質。
  159. ａ．前記第１の抗体由来のＣＬが位置２３０にＫを含み、前記第１の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＥを含み、前記第２の抗体由来のＣＬが位置２３０にＥを含み、前記第２の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＫを含み、
    ｂ．前記第１の抗体由来のＣＬが位置２３０にＫを含み、前記第１の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＥを含み、前記第１の抗体由来のＶＬが位置４６にＥを含み、前記第１の抗体由来のＶＨが位置４６にＫを含み、前記第２の抗体由来のＣＬが位置２３０にＥを含み、前記第２の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＫを含み、前記第２の抗体由来のＶＬが位置４６にＥを含み、前記第２の抗体由来のＶＨが位置４６にＫを含み、または
    ｃ．前記第１の抗体由来のＣＬが位置２３０にＫを含み、前記第１の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＥを含み、前記第１の抗体由来のＶＬが位置１４１にＥを含み、前記第１の抗体由来のＶＨが位置５１にＫを含み、前記第２の抗体由来のＣＬが位置２３０にＥを含み、前記第２の抗体由来のＣＨ１が位置２３０にＫを含み、前記第２の抗体由来のＶＬが位置５１にＥを含み、前記第２の抗体由来のＶＨが位置１４１にＫを含み、
    ここで、すべての位置がＥＵナンバリングに従う、請求項１５８に記載の抗原結合タンパク質。
  160. 前記抗原結合タンパク質が、
    ａ．表２１．２Ａ、配列番号
    ｉ．９２、１１０、１２２、１２８及び１４６、
    ｉｉ．１１２、１１８、１２４、１４８及び２４２、
    ｉｉｉ．９６、１０８、１２０、１２６及び１５０
    から選択される、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列、並びに
    ｂ．表２１．２Ｂ、配列番号
    ｉ．１５８、１７０、１８２、１８８及び２１２、
    ｉｉ．１６０、１９０、１９６、２１４及び６３３、
    ｉｉｉ．１６２、１８０、１８６、１９２及び２１６
    から選択される、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列
    を含む、請求項１３１、１３８、１４５、１５２、１５４、１５６及び１５８に記載の抗原結合タンパク質。
  161. 前記抗原結合タンパク質が、表２１．１、配列番号
    ａ．１２５４、１２５６及び１２５８、
    ｂ．１２６０、１２６２及び１２６４、
    ｃ．１２６６、１２６８及び１２７０、
    ｄ．１２７２、１２７４及び１２７６、
    ｅ．１２７８、１２８０及び１２８２、
    ｆ．１２８４、１２８６及び１２８８、
    ｇ．１２９０、１２９２及び１２９４、
    ｈ．１２９６、１２９８及び１３００、
    ｉ．１３０２、１３０４及び１３０６、
    ｊ．１３０８、１３１０及び１３１２、
    ｋ．１３１４、１３１６及び１３１８、
    ｌ．１３２０、１３２２及び１３２４、
    ｍ．１３２６、１３２８及び１３３０、
    ｎ．１３３２、１３３４及び１３３６、
    ｏ．１３３８、１３４０及び１３４２、
    ｐ．１３４４、１３４６及び１３４８、
    ｑ．１３５０、１３５２及び１３５４、
    ｒ．１３５６、１３５８及び１３６０、
    ｓ．１３６２、１３６４及び１３６６、
    ｔ．１３６８、１３７０及び１３７２、
    ｕ．１３７４、１３７６及び１３７８、
    ｖ．１３８０、１３８２及び１３８４、
    ｗ．１３８６、１３８８及び１３９０、
    ｘ．１３９２、１３９４及び１３９６、
    ｙ．１３９８、１４００及び１４０２、
    ｚ．１４０４、１４０６及び１４０８、
    ａａ．１４１０、１４１２及び１４１４、
    ｂｂ．１４１６、１４１８及び１４２０、
    ｃｃ．１４２２、１４２４及び１４２６、
    ｄｄ．１４２８、１４３０及び１４３２、
    ｅｅ．１４３４、１４３６及び１４３８、
    ｆｆ．１４４０、１４４２及び１４４４、
    ｇｇ．１４４６、１４４８及び１４５０、
    ｈｈ．１４５２、１４５４及び１４５６、
    ｉｉ．１４５８、１４６０及び１４６２、
    ｊｊ．１４６４、１４６６及び１４６８、
    ｋｋ．１４７０、１４７２及び１４７４、
    ｌｌ．１４７６、１４７８及び１４８０、
    ｍｍ．１４８２、１４８４及び１４８６、
    ｎｎ．１４８８、１４９０及び１４９２、
    ｏｏ．１４９４、１４９６及び１４９８、
    ｐｐ．１５００、１５０２及び１５０４、
    ｑｑ．１５０６、１５０８及び１５１０、
    ｒｒ．１５１２、１５１４及び１５１６、
    ｓｓ．１５１８、１５２０及び１５２２、
    ｔｔ．１５２４、１５２６及び１５２８、
    ｕｕ．１５３０、１５３２及び１５３４、
    ｖｖ．１５３６、１５３８及び１５４０、
    ｗｗ．１５４２、１５４４及び１５４６、
    ｘｘ．１５４８、１５５０及び１５５２、
    ｙｙ．１５５４、１５５６及び１５５８、
    ｚｚ．１５６０、１５６２及び１５６４、
    ａａａ．１５６６、１５６８及び１５７０、
    ｂｂｂ．１５７２、１５７４及び１５７６、
    ｃｃｃ．１５７８、１５８０及び１５８２、
    ｄｄｄ．１５８４、１５８６及び１５８８、
    ｅｅｅ．１５９０、１５９２及び１５９４、
    ｆｆｆ．１５９６、１５９８及び１６００、
    ｇｇｇ．１６０２、１６０４及び１６０６、
    ｈｈｈ．１６０８、１６１０及び１６１２、
    ｉｉｉ．１６１４、１６１６及び１６１８、
    ｊｊｊ．１６２０、１６２２及び１６２４、
    ｋｋｋ．１６２６、１６２８及び１６３０、
    ｌｌｌ．１６３２、１６３４及び１６３６、
    ｍｍｍ．１６３８、１６４０及び１６４２、
    ｎｎｎ．１６４４、１６４６及び１６４８、
    ｏｏｏ．１６５０、１６５２及び１６５４、
    ｐｐｐ．１６５６、１６５８及び１６６０、
    ｑｑｑ．１６６２、１６６４及び１６６６、
    ｒｒｒ．１６６８、１６７０及び１６７２、
    ｓｓｓ．１６７４、１６７６及び１６７８、
    ｔｔｔ．１６８０、１６８２及び１６８４、
    ｕｕｕ．１６８６、１６８８及び１６９０、
    ｖｖｖ．１６９２、１６９４及び１６９６、
    ｗｗｗ．１６９８、１７００、１７０２、
    ｘｘｘ．１７０４、１７０６及び１７０８、
    ｙｙｙ．１７１０、１７１２及び１７１４、
    ｚｚｚ．１７１６、１７１８及び１７２０、
    ａａａａ．１７２２、１７２４及び１７２６、
    ｂｂｂｂ．１７２８、１７３０及び１７３２、
    ｃｃｃｃ．１７３４、１７３６及び１７３８、
    ｄｄｄｄ．１７４０、１７４２及び１７４４、
    ｅｅｅｅ．１７４６、１７４８及び１７５０、
    ｆｆｆｆ．１７５２、１７５４及び１７５６、
    ｇｇｇｇ．１７５８、１７６０及び１７６２、
    ｈｈｈｈ．１７６４、１７６６及び１７６８、
    ｉｉｉｉ．１７７０、１７７２及び１７７４、
    ｊｊｊｊ．１７７６、１７７８及び１７８０、
    ｋｋｋｋ．１７８２、１７８４及び１７８６、
    ｌｌｌｌ．１７８８、１７９０及び１７９２、
    ｍｍｍｍ．１７９４、１７９６及び１７９８、
    ｎｎｎｎ．１８００、１８０２及び１８０４、
    ｏｏｏｏ．１８０６、１８０８及び１８１０、
    ｐｐｐｐ．１８１２、１８１４及び１８１６、
    ｑｑｑｑ．１８１８、１８２０及び１８２２、
    ｒｒｒｒ．１８２４、１８２６及び１８２８、
    ｓｓｓｓ．１８３０、１８３２及び１８３４、
    ｔｔｔｔ．１８３６、１８３８及び１８４０、
    ｕｕｕｕ．１８４２、１８４４及び１８４６、
    ｖｖｖｖ．１８４８、１９５０及び１８５２、
    ｗｗｗｗ．１８５４、１８５６及び１８５８、
    ｘｘｘｘ．１８６０、１８６２及び１８６４、
    ｙｙｙｙ．１８６６、１８６８及び１８７０、
    ｚｚｚｚ．１８７２、１８７４及び１８７６、
    ａａａａａ．１８７８、１８８０及び１８８２、
    ｂｂｂｂｂ．１８８４、１８８６及び１８８８、
    ｃｃｃｃｃ．１８９０、１８９２及び１８９４、
    ｄｄｄｄｄ．１８９６、１８９８及び１９００、
    ｅｅｅｅｅ．１９０２、１９０４及び１９０６、
    ｆｆｆｆｆ．１９０８、１９１０及び１９１２、
    ｇｇｇｇｇ．１９１４、１９１６及び１９１８、
    ｈｈｈｈｈ．１９２０、１９２２及び１９２４、
    ｉｉｉｉｉ．１９２６、１９２８及び１９３０、
    ｊｊｊｊｊ．１９３２、１９３４及び１９３６、
    ｋｋｋｋｋ．１９３８、１９４０及び１９４２、
    ｌｌｌｌｌ．１９４４、１９４６及び１９４８、
    ｍｍｍｍｍ．１９５０、１９５２及び１９５４、
    ｎｎｎｎｎ．１９５６、１９５８及び１９６０、
    ｏｏｏｏｏ．１９６２、１９６４及び１９６６、
    ｐｐｐｐｐ．１９６８、１９７０及び１９７２、
    ｑｑｑｑｑ．１９７４、１９７６及び１９７８、
    ｒｒｒｒｒ．１９８０、１９８２及び１９８４、
    ｓｓｓｓｓ．１９８６、１９８８及び１９９０、
    ｔｔｔｔｔ．１９９２、１９９４及び１９９６、
    ｕｕｕｕｕ．１９９８、２０００及び２００２、
    ｖｖｖｖｖ．２００４、２００６及び２００８、
    ｗｗｗｗｗ．２０１０、２０１２及び２０１４、
    ｘｘｘｘｘ．２０１６、２０１８及び２０２０、
    ｙｙｙｙｙ．２０２２、２０２４及び２０２６、
    ｚｚｚｚｚ．２０２８、２０３０及び２０３２、
    ａａａａａａ．２０３４、２０３６及び２０３８、
    ｂｂｂｂｂｂ．２０４０、２０４２及び２０４４、
    ｃｃｃｃｃｃ．２０４６、２０４８及び２０５０、
    ｄｄｄｄｄｄ．２０５２、２０５４及び２０５６、
    ｅｅｅｅｅｅ．２０５８、２０６０及び２０６２、
    ｆｆｆｆｆｆ．２０６４、２０６６及び２０６８、
    ｇｇｇｇｇｇ．２０７０、２０７２及び２０７４、
    ｈｈｈｈｈｈ．２０７６、２０７８及び２０８０、
    ｉｉｉｉｉｉ．２０８２、２０８４及び２０８６、
    ｊｊｊｊｊｊ．２０８８、２０９０及び２０９２、
    ｋｋｋｋｋｋ．２０９４、２０９６及び２０９８、
    ｌｌｌｌｌｌ．２１００、２１０２及び２１０４、
    ｍｍｍｍｍｍ．２１０６、２１０８及び２１１０、並びに
    ｎｎｎｎｎｎ．２１１２、２１１４及び２１１６
    から選択される抗原結合タンパク質の配列を含む、請求項１３１、１３８、１４５、１５２、１５４、１５６及び１５８に記載の抗原結合タンパク質。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022532582A (ja) * 2019-05-07 2022-07-15 アブマックス バイオファーマシューティカルズ 低免疫原性かつ低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能の抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０およびその使用

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010062960A2 (en) 2008-11-26 2010-06-03 Cedars-Sinai Medical Center METHODS OF DETERMINING RESPONSIVENESS TO ANTI-TNFα THERAPY IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE
CA2850549C (en) 2011-09-30 2023-03-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Antibodies against tl1a and uses thereof
UY35148A (es) * 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
CN112870368A (zh) 2013-03-27 2021-06-01 西达-赛奈医疗中心 通过抑制tl1a的功能和相关信号传导途径来减轻并逆转纤维化和炎症
EP3022295A4 (en) 2013-07-19 2017-03-01 Cedars-Sinai Medical Center Signature of tl1a (tnfsf15) signaling pathway
TWI703158B (zh) 2015-09-18 2020-09-01 美商希佛隆公司 特異性結合tl1a之抗體
GB201522394D0 (en) 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
WO2017161342A1 (en) 2016-03-17 2017-09-21 Cedars-Sinai Medical Center Methods of diagnosing inflammatory bowel disease through rnaset2
EP3532489A4 (en) 2016-10-26 2020-07-08 Cedars-Sinai Medical Center ANTI-TL1A NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES
TW201904588A (zh) * 2017-06-25 2019-02-01 美商西雅圖免疫公司 引導及導航控制蛋白質之製造及使用方法
EP3456738A1 (en) 2017-09-19 2019-03-20 Tillotts Pharma Ag Antibody variants
EP3735270A1 (en) * 2018-01-05 2020-11-11 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding anti-chikungunya virus antibodies
CN112585165A (zh) 2018-04-25 2021-03-30 普罗米修斯生物科学公司 优化的抗tl1a抗体
EP3969621A4 (en) * 2019-05-14 2023-01-25 Prometheus Biosciences, Inc. TL1A PATIENT SELECTION METHODS, SYSTEMS AND DEVICES
CN113968910A (zh) * 2019-07-11 2022-01-25 武汉友芝友生物制药有限公司 四价对称双特异性抗体
MX2022000726A (es) 2019-07-19 2022-02-10 Oncoresponse Inc Anticuerpos inmunomoduladores y metodos de uso de los mismos.
CN114901311A (zh) 2019-10-24 2022-08-12 普罗米修斯生物科学公司 Tnf样配体1a（tl1a）的人源化抗体及其用途
CN113121696A (zh) * 2019-12-31 2021-07-16 周易 Fab改造诱导形成的双特异性抗体及其制备方法和用途
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
JP2023530046A (ja) * 2020-04-02 2023-07-13 ラ ホヤ インスティテュート フォー イムノロジー Ｔｎｆファミリーのメンバーの二重標的化のための方法および組合せ
KR20230024904A (ko) * 2020-05-20 2023-02-21 더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 Sars-cov-2에 대한 강력한 중화 항체, 그의 생성 및 용도
MX2023000949A (es) 2020-07-23 2023-02-22 Othair Prothena Ltd Anticuerpos anti-beta-amiloide (abeta).
EP4200338A1 (en) * 2020-08-20 2023-06-28 Amgen Inc. Antigen binding proteins with non-canonical disulfide in fab region

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014500014A (ja) * 2010-11-08 2014-01-09 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒトｔｎｆ様リガンド１ａ（ｔｌ１ａ）に対するヒト抗体
WO2014144600A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Viktor Roschke Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
WO2014161845A1 (en) * 2013-04-03 2014-10-09 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies specific for fap and dr5, antibodies specific for dr5 and methods of use

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4603044A (en) 1983-01-06 1986-07-29 Technology Unlimited, Inc. Hepatocyte Directed Vesicle delivery system
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
JP3202999B2 (ja) 1991-01-31 2001-08-27 協和醗酵工業株式会社 肝移行性リポソーム製剤
US5830877A (en) 1993-08-26 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode antigens and immunostimulatory
US7820798B2 (en) 1994-11-07 2010-10-26 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
DE69731289D1 (de) 1996-03-18 2004-11-25 Univ Texas Immunglobulinähnliche domäne mit erhöhten halbwertszeiten
DK1500329T3 (da) 1996-12-03 2012-07-09 Amgen Fremont Inc Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa
ES2284247T3 (es) 1998-04-03 2007-11-01 University Of Iowa Research Foundation Metodos y productos para estimular el sistema inmunitario usando oligonucleotidos y citoquinas inmunoterapeuticos.
KR101222450B1 (ko) 1999-03-25 2013-01-16 애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게 사람 ｉｌ-12에 결합하는 사람 항체 및 이의 제조방법
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
EP1210435A1 (en) 1999-08-04 2002-06-05 Amgen Inc. Fhm, A NOVEL MEMBER OF THE TNF LIGAND SUPERGENE FAMILY
AU2003298816C1 (en) 2002-12-02 2010-12-16 Amgen Fremont, Inc. Antibodies directed to Tumor Necrosis Factor and uses thereof
DK1667730T3 (da) 2003-08-20 2013-09-23 Univ Miami Sammensætninger og fremgangsmåder til behandling af inflammatorisk lungesygdom
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US20110217310A1 (en) 2007-01-10 2011-09-08 Siegel Richard M Blockade of tl1a-dr3 interactions to ameliorate t cell mediated disease pathology
EP2220122A2 (en) 2007-11-13 2010-08-25 Teva Biopharmaceuticals USA, Inc. Humanized antibodies against tl1a
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
JP5522405B2 (ja) 2008-04-25 2014-06-18 協和発酵キリン株式会社 安定な多価抗体
MX2011010169A (es) 2009-04-07 2011-10-11 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-1/anti-c-met.
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
UY33827A (es) 2010-12-22 2012-07-31 Abbott Lab Proteínas de unión a media-inmunoglobulina y sus usos
UY33826A (es) 2010-12-22 2012-07-31 Abbott Lab Proteínas de unión con dominios trivariables y sus usos
KR20140104344A (ko) 2011-05-20 2014-08-28 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 시크리터리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비시스 Ｔ 세포 매개성 질병의 병증을 개선하기 위한 ｔｌ１ａ-ｄｒ３의 상호작용의 차단 및 그것의 항체
WO2013041687A1 (en) 2011-09-23 2013-03-28 Amgen Research (Munich) Gmbh Bispecific binding molecules for 5t4 and cd3
CA2850549C (en) 2011-09-30 2023-03-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Antibodies against tl1a and uses thereof
WO2013177101A2 (en) 2012-05-22 2013-11-28 Bristol-Myers Squibb Company Bispecific antibodies and methods of using the same
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
WO2014082179A1 (en) 2012-11-28 2014-06-05 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
PE20151289A1 (es) 2013-01-02 2015-10-05 Glenmark Pharmaceuticals Sa Anticuerpos que se unen al tl1a y sus usos
TW201444867A (zh) 2013-03-08 2014-12-01 Lilly Co Eli 抗ｔｎｆ－抗ｉｌ－１７雙特異性抗體
JOP20140087B1 (ar) 2013-03-13 2021-08-17 Amgen Inc بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها
US9580486B2 (en) 2013-03-14 2017-02-28 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of T-regulatory cells
US20160009824A1 (en) 2013-03-15 2016-01-14 Merck Patent Gmbh Tetravalent bispecific antibodies
SG10201810298VA (en) 2013-11-13 2018-12-28 Pfizer Tumor necrosis factor-like ligand 1a specific antibodies and compositions and uses thereof
US20160052006A1 (en) 2013-11-22 2016-02-25 Sheila S. Pirtle Spray Bottle

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014500014A (ja) * 2010-11-08 2014-01-09 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒトｔｎｆ様リガンド１ａ（ｔｌ１ａ）に対するヒト抗体
WO2014144600A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Viktor Roschke Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
WO2014161845A1 (en) * 2013-04-03 2014-10-09 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies specific for fap and dr5, antibodies specific for dr5 and methods of use

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARTHRITIS RHEUMATOL., vol. 67, no. 1, JPN6021000650, January 2015 (2015-01-01), pages 51 - 62, ISSN: 0004866905 *
MABS, vol. Vol. 7, Issue 3, JPN5018009051, 2015, pages 470 - 482, ISSN: 0004866906 *
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 32, no. 2, JPN5018009053, February 2014 (2014-02-01), pages 191 - 198, ISSN: 0004866907 *
SCIENCE-BUSINESS EXCHANGE: SCIBX / FROM THE MAKERS OF BIOCENTURY AND NATURE, vol. 4, no. 28, JPN5018009054, 2011, pages 1 - 3, ISSN: 0004866908 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022532582A (ja) * 2019-05-07 2022-07-15 アブマックス バイオファーマシューティカルズ 低免疫原性かつ低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能の抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０およびその使用
JP7300008B2 (ja) 2019-05-07 2023-06-28 アブマックス バイオファーマシューティカルズ 低免疫原性かつ低ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能の抗ＴＮＦ－αヒト化モノクローナル抗体ＴＣＸ０６０およびその使用

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