CN111304752A - 抗原结合能力根据化合物的浓度而变化的抗原结合分子及其文库 - Google Patents

抗原结合能力根据化合物的浓度而变化的抗原结合分子及其文库 Download PDF

Info

Publication number
CN111304752A
CN111304752A CN202010168341.5A CN202010168341A CN111304752A CN 111304752 A CN111304752 A CN 111304752A CN 202010168341 A CN202010168341 A CN 202010168341A CN 111304752 A CN111304752 A CN 111304752A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antigen
antigen binding
library
binding
binding domain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010168341.5A
Other languages
English (en)
Inventor
井川智之
丹波茂郎
清水骏
辰巳加奈子
门野正次郎
河内宏树
大原一宏
松下正行
江村岳
上村将树
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53273524&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN111304752(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Publication of CN111304752A publication Critical patent/CN111304752A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/14—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support
    • C40B50/16—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support involving encoding steps
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Structural Engineering (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明的课题是提供：靶组织特异性抗原结合分子、抗原结合活性根据非天然化合物浓度而变化的抗原结合分子、包含各自不同的多个该抗原结合分子的文库、包含该抗原结合分子的药物组合物、筛选该抗原结合分子的方法、和制造其的方法等。本发明人创建了抗原结合活性依赖于低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子，进而创建了包含各自不同的多个该抗原结合结构域或抗原结合结构域，并发现通过使用该文库，可以解决上述课题。通过使用本申请发明的抗原结合分子，可以靶组织特异性地治疗起因于靶组织的各种疾病。

Description

抗原结合能力根据化合物的浓度而变化的抗原结合分子及其 文库
本申请是国际申请号PCT/JP2014/082060，国际申请日2014年12月4日，中国申请号201480074824.1，发明名称为“抗原结合能力根据化合物的浓度而变化的抗原结合分子及其文库”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库。本发明还涉及抗原结合活性根据非天然化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子、该抗原结合分子的制造方法和筛选方法、以及包含该抗原结合分子的药物组合物。
背景技术
抗体由于在血浆中的稳定性高、副作用也少，因而作为医药品受到关注。其中IgG型的抗体药物已经大量上市，当前还有大量的抗体药物正在开发(非专利文献1、和非专利文献2)。
作为使用抗体药物的癌症治疗药，迄今为止的针对CD20抗原的利妥昔单抗、针对EGFR抗原的西妥昔单抗、针对HER2抗原的赫赛汀等已被认可(非专利文献3)。这些抗体分子与癌细胞中表达的抗原结合，通过ADCC等发挥针对癌细胞的毒性。已知这种基于ADCC等的细胞毒性依赖于表达于治疗用抗体的靶细胞的抗原的数目(非专利文献4)，因此从治疗用抗体的效果的观点出发，优选作为靶的抗原的表达量高。但是，即便抗原的表达量高，由于抗原表达于正常组织时，则针对正常细胞也会发生ADCC等的毒性，因而产生副作用大的问题。因此，作为癌治疗药的治疗用抗体的靶抗原优选特异性地表达于癌细胞。例如，针对已知作为癌抗原的EpCAM抗原的抗体分子被认为有望作为癌治疗药，但已知EpCAM抗原在胰腺也有表达，实际上据报道，在临床试验中，通过给予抗EpCAM抗体，由于对胰腺的细胞毒性，观察到了胰腺炎的副作用(非专利文献5)。
获得发挥基于ADCC活性的细胞毒性的抗体药物的成功后，报道了通过下述等而发挥强效的细胞毒性的第二代的改良抗体分子：通过除去天然型人IgG1的Fc区的N型糖链的岩藻糖而实现的ADCC活性的增强(非专利文献6)、通过天然型人IgG1的Fc区的氨基酸替换而增强对FcγRIIIa的结合所实现的ADCC活性的增强(非专利文献7)等。作为通过上述的NK细胞介导的ADCC活性以外的机制而对癌细胞发挥伤害活性的抗体药物，还报道了通过下述等而发挥强效的细胞毒性的改良分子抗体：将具有强效的细胞毒性的药物与抗体形成缀合物的Antibody Drug Conjugate(ADC)(非专利文献8)、和通过将T细胞补充至癌细胞而发挥对癌细胞的伤害活性的低分子抗体(非专利文献9)等。
如此发挥强效细胞毒性的抗体分子即使对抗原的表达不多的癌细胞也可发挥细胞毒性，另一方面，对抗原的表达少的正常组织却也同样地发挥细胞毒性。实际上，与针对EGFR抗原的天然型人IgG1即西妥昔单抗相比，针对CD3和EGFR的双特异性抗体即EGFR-BiTE通过将T细胞补充至癌细胞而对癌细胞发挥强效的细胞毒性，从而可发挥抗肿瘤效果。另一方面，还确认到由于EGFR在正常组织中也有表达，因而在将EGFR-BiTE给予食蟹猴时出现出严重的副作用(非专利文献10)。另外，使针对癌细胞中大量表达的CD44v6的抗体与mertansine结合而成的ADC即bivatuzumab mertansine，由于CD44v6在正常组织中也有表达，因而在临床上观察到严重的皮肤毒性和肝毒性(非专利文献11)。
如此，在使用对抗原的表达少的癌细胞也可以发挥强效的细胞毒性的抗体时，需要靶抗原高度癌特异性地表达，但如赫赛汀的靶抗原即HER2或西妥昔单抗的靶抗原即EGFR在正常组织中也有表达那样，认为高度癌特异性地表达的癌抗原的数目是有限的。因此，虽然能够强化对癌的细胞毒性，但对正常组织的细胞伤害作用导致的副作用也成为问题。
另外，最近，通过抑制有助于癌中的免疫抑制的CTLA4而增强肿瘤免疫的易普利姆玛(ipilimumab)对转移性黑素瘤显示出总存活期的延长(非专利文献12)。然而由于易普利姆玛全身性地抑制CTLA4，因而虽然肿瘤免疫得到增强，但显示全身性地免疫受到活化所致的自身免疫疾病样的严重副作用却成为问题(非专利文献13)。
另一方面，作为针对癌以外的疾病的抗体药物，已知在炎性·自身免疫疾病中通过抑制炎性细胞因子来发挥治疗效果的抗体药物(非专利文献14)。还已知，例如以TNF作为靶的Remicade或Humira、以及以IL-6R为靶的Actemra虽然对风湿性关节炎发挥高的治疗效果，但另一方面，由于全身性地中和这些细胞因子而观察到感染疾病的副作用(非专利文献15)。
作为可适用于第二代抗体药物的技术，开发有各种技术，报道了使效应功能、抗原结合能力、药物动力学、稳定性提高，或者使免疫原性风险降低的技术等(非专利文献16)，但基本没有报道用于解决如上所述的副作用的、能够靶组织特异性地使抗体药物作用的技术。例如，对于癌组织或炎性组织之类的病变部位，报道有利用了这些靶组织中的pH为酸性条件的pH依赖性抗体(专利文献1、和2)。然而，癌组织或炎性组织中的相比于正常组织的pH的降低(即氢离子浓度的上升)很小，检测分子量极小的氢离子的浓度的微小上升而作用的抗体的制作困难，同时破骨细胞骨吸收区等正常组织或对象病变以外的组织中也有pH为酸性条件的情形，将pH的条件作为对病变部位特异性的环境因子来利用被认为还具有许多问题。另一方面，报道有通过被在癌组织或炎性组织之类的病变部位表达的蛋白酶切断从而开始发挥抗原结合活性的抗体的制作方法(专利文献3)。但是，利用蛋白酶的抗体的切断是不可逆的，因此在该病变部位被切断的抗体随着血流返回到正常组织，在正常组织中也可以与抗原结合，这被认为是问题。另外，认为这样的蛋白酶的癌特异性方面也存在问题。因此，还不知道为了在避免副作用的同时发挥药效而在正常组织或血液中不全身性地作用，在作为病变部位的癌或炎症部位中可逆性地作用那样的技术。另外，还不知晓通过外源性的化合物的非侵袭性给予来控制抗体的活性、药理作用的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第WO2003/105757号
专利文献2:国际公开第WO2012/033953号
专利文献3:国际公开第WO2010/081173号
非专利文献
非专利文献1:Monoclonal antibody successes in the clinic.Janice MReichert,Clark J Rosensweig,Laura B Faden&Matthew C Dewitz,Nat.Biotechnol.(2005)23,1073-1078
非专利文献2:The therapeutic antibodies market to 2008.Pavlou AK,Belsey MJ.,Eur.J.Pharm.Biopharm.(2005)59(3),389-396
非专利文献3:Monoclonal antibodies:versatile platforms for cancerimmunotherapy.Weiner LM,Surana R,Wang S.,Nat.Rev.Immunol.(2010)10(5),317-327
非专利文献4:Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185HER2 monoclonal antibodies.Lewis GD,Figari I,Fendly B,Wong WL,Carter P,Gorman C,Shepard HM,Cancer Immunol.Immunotherapy(1993)37,255-263
非专利文献5:ING-1,a monoclonal antibody targeting Ep-CAM in patientswith advanced adenocarcinomas.de Bono JS,Tolcher AW,Forero A,Vanhove GF,Takimoto C,Bauer RJ,Hammond LA,Patnaik A,White ML,Shen S,Khazaeli MB,RowinskyEK,LoBuglio AF,Clin.Cancer Res.(2004)10(22),7555-7565
非专利文献6:Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generationtherapeutic antibodies.Satoh M,Iida S,Shitara K.,Expert Opin.Biol.Ther.(2006)6(11),1161-1173
非专利文献7:Optimizing engagement of the immune system by anti-tumorantibodies:an engineer's perspective.Desjarlais JR,Lazar GA,Zhukovsky EA,ChuSY.,Drug Discov.Today(2007)12(21-22),898-910
非专利文献8:Antibody-drug conjugates:targeted drug delivery forcancer.Alley SC,Okeley NM,Senter PD.,Curr.Opin.Chem.Biol.(2010)14(4),529-537
非专利文献9:BiTE:Teaching antibodies to engage T-cells for cancertherapy.Baeuerle PA,Kufer P,Bargou R.,Curr.Opin.Mol.Ther.(2009)11(1),22-30
非专利文献10:T cell-engaging BiTE antibodies specific for EGFRpotently eliminate KRAS-and BRAF-mutated colorectal cancer cells.LutterbueseR,Raum T,Kischel R,Hoffmann P,Mangold S,Rattel B,Friedrich M,Thomas O,Lorenczewski G,Rau D,Schaller E,Herrmann I,Wolf A,Urbig T,Baeuerle PA,KuferP.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2010)107(28),12605-12610
非专利文献11:Phase I trial with the CD44v6-targeting immunoconjugatebivatuzumab mertansine in head and neck squamous cell carcinoma.RiechelmannH,Sauter A,Golze W,Hanft G,Schroen C,Hoermann K,Erhardt T,Gronau S.,OralOncol.(2008)44(9),823-829
非专利文献12:Ipilimumab in the treatment of melanoma.Trinh VA,HwuWJ.,Expert Opin.Biol.Ther.,(2012)Apr 14(doi:10.1517/14712598.2012.675325)
非专利文献13:IPILIMUMAB-A NOVEL IMMUNOMODULATING THERAPY CAUSINGAUTOIMMUNE HYPOPHYSITIS:A CASE REPORT AND REVIEW.Juszczak A,Gupta A,Karavitaki N,Middleton MR,Grossman A.,Eur.J.Endocrinol.(2012)Apr 10(doi:10.1530/EJE-12-0167)
非专利文献14:The Japanese experience with biologic therapies forrheumatoid arthritis.Takeuchi T,Kameda H.,Nat.Rev.Rheumatol.(2010)6(11),644-652
非专利文献15:Current evidence for the management of rheumatoidarthritis with biological disease-modifying antirheumatic drugs:a systematicliterature review informing the EULAR recommendations for the management ofRA.Nam JL,Winthrop KL,van Vollenhoven RF,Pavelka K,Valesini G,Hensor EM,Worthy G,Landewe R,Smolen JS,Emery P,Buch MH.,Ann.Rheum.Dis.(2010)69(6),976-986
非专利文献16:Antibody engineering for the development of therapeuticantibodies.Kim SJ,Park Y,Hong HJ.,Mol.Cells.(2005)20(1),17-29。
发明内容
发明要解决的技术问题
鉴于上述的背景，若能获得与靶抗原的结合受到靶组织中特异性存在或产生的低分子的浓度的控制的抗体(以下，在本申请说明书中，有时称为“低分子开关抗体”(Smallmolecule switch antibody))，则这样的抗体由于能够可逆地作用于肿瘤部位、炎症部位等病变部位并避免副作用，因而极其有用。另外，若能获得与抗原的结合受到非天然化合物的浓度的控制的抗体，则这样的抗体由于能通过在病变部位活化抗体的活性、药理作用的外源性化合物、或者能够非侵袭给予的外源性化合物的给予来控制，因而极其有用。
但是，还没有任何通过作为现有方法的用抗原免疫非人动物的方法、或利用来源于人和非人动物的抗体文库的方法获得了这样的抗体的报道。
所以，强烈期望提供与任意靶抗原的结合受到靶组织中特异性地存在或产生的低分子、或非天然化合物的浓度的控制的抗体(低分子开关抗体)，进而提供在短期内有效地获得这样的抗体的方法。
用于解决技术问题的方法
本发明人为了实现上述目的而进行了深入研究，结果创建了包含抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子。另外，本发明人发现该抗原结合分子或包含该抗原结合分子的药物组合物对于起因于靶组织的疾病的治疗有用，同时还发现对于起因于包括给予该抗原结合分子的靶组织的疾病的治疗有用，和该抗原结合分子在用于起因于靶组织的疾病的治疗的医药的制造中有用。
进而，本发明人还成功地创建了包含序列彼此不同的多个抗原结合分子的文库，该抗原结合分子的抗原结合结构域中包含参与结合低分子的氨基酸残基，该低分子能够根据机体内的环境要素的不同、或根据非天然化合物的给予而使抗原结合分子的抗原结合活性变化，同时还创建了使用该文库筛选和制造该抗原结合分子的方法，从而完成了本发明。
本发明是基于上述见解的发明，具体包括以下例示性地记载的方案。
〔方案1〕
一种文库，主要包含：
(i)序列彼此不同的多个抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子，或
(ii)编码该序列彼此不同的多个抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸；
该文库的特征在于，所述抗原结合结构域或抗原结合分子是抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子。
〔方案2〕
方案〔1〕所述的文库，其是由包括下述步骤(a)和(b)的方法制造的：
步骤(a)鉴定抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域中满足以下(i)至(iii)中任一者以上的氨基酸位点；
(i)未参与结合该低分子化合物的1个或多个氨基酸位点，
(ii)在亲本抗原结合结构域所属的动物种的抗体谱(antibody repertoire)中具有氨基酸出现频率的多样性的1个或多个氨基酸位点，
(iii)对于经典结构的形成不重要的1个或多个氨基酸位点；和
步骤(b)设计文库，该文库包含：在所述抗原结合结构域中，编码未改变体的核酸以及分别编码在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有改变的、序列彼此不同的所述抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体的核酸。
〔方案3〕
方案〔2〕所述的文库，其是由包括下述步骤(a)至(d)的方法制造的：
步骤(a)鉴定抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域中满足以下(i)至(iii)中任一者以上的氨基酸位点；
(i)未参与结合该低分子化合物的1个或多个氨基酸位点、
(ii)在亲本抗原结合结构域所属的动物种的抗体谱中具有氨基酸出现频率的多样性的1个或多个氨基酸位点、
(iii)对于经典结构的形成不重要的1个或多个氨基酸位点；
步骤(b)制作在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有改变的、序列彼此不同的所述抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体；
步骤(c)鉴定实质上不对所述各改变体的该低分子化合物结合活性造成变化的1个或多个氨基酸的改变；和
步骤(d)制造文库，该文库包含：编码未改变体的核酸以及编码在步骤(c)中鉴定的1个或多个氨基酸具有改变的、序列彼此不同的所述抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体的核酸。
〔方案4〕
方案〔1〕所述的文库，其是由包括下述步骤1)和2)的方法制造的：
步骤1)使包含多个抗原结合分子的文库与低分子化合物接触，所述抗原结合分子具有低分子化合物结合活性；和
步骤2)由该文库浓缩核酸，所述核酸编码具有低分子化合物结合活性的抗原结合分子的多个改变体。
〔方案5〕
方案〔4〕所述的文库，其中，所述抗原结合分子是包含抗体的重链可变区和轻链可变区的抗原结合分子，且是通过包括下述步骤1)至3)的任1步骤的方法制造的：
步骤1)从方案〔4〕所述的文库浓缩编码具有低分子化合物结合活性的抗原结合分子的多个改变体的核酸来设计文库，其中方案〔4〕所述的文库是包含编码位于重链可变区的氨基酸经改变的1个或多个改变体的核酸的文库；
步骤2)从方案〔4〕所述的文库浓缩编码具有低分子化合物结合活性的抗原结合分子的多个改变体的核酸来设计文库，其中方案〔4〕所述的文库是包含编码位于轻链可变区的氨基酸经改变的1个或多个改变体的核酸的文库；
步骤3)组合由步骤1)和步骤2)的各可变区文库浓缩得到的编码抗原结合分子的核酸，由此设计文库。
〔方案6〕
方案〔1〕至〔5〕中任一项所述的文库，其特征在于，所述抗原结合分子是抗原结合结构域与病毒外壳蛋白的至少一部分的融合多肽。
〔方案7〕
方案〔1〕至〔5〕中任一项所述的文库，其中，所述抗原结合分子是包含抗体的重链和轻链的抗原结合分子，且该文库进一步包括设计所述重链和/或轻链的合成文库的步骤。
〔方案8〕
方案〔7〕所述的文库，其特征在于，所述抗体的重链和/或轻链包含来源于种系的框架序列。
〔方案9〕
方案〔1〕至〔8〕中任一项所述的文库，其中，所述低分子化合物是靶组织特异性化合物或非天然化合物。
〔方案10〕
方案〔1〕至〔9〕中任一项所述的文库，其中，所述靶组织是癌组织或炎性组织。
〔方案11〕
方案〔10〕所述的文库，其中，所述癌组织特异性化合物是选自由具有嘌呤环结构的核苷、氨基酸及其代谢产物、脂质及其代谢产物、糖代谢的一次代谢产物、以及烟酰胺及其代谢产物组成的组中的至少一种化合物。
〔方案12〕
方案〔1〕至〔11〕中任一项所述的文库，其中，所述低分子化合物是犬尿氨酸、腺苷、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、或三磷酸腺苷。
〔方案13〕
方案〔1〕至〔12〕中任一项所述的文库，其中，未参与结合所述低分子化合物的氨基酸位点是选自以下任一者以上的氨基酸之外的位点：
H链：97、100c、101、94、95、100d、100e、33、50、52、56、57、58、99、100、100a、54、55(Kabat编号)；
L链：49、55、95c、96、95a、95b(Kabat编号)。
〔方案14〕
包含抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的制造方法，其包括下述步骤(a)至(g)：
步骤(a)在低分子化合物的非存在下使方案〔1〕至〔13〕中任一项所述的文库与抗原接触；
步骤(b)选择所述步骤(a)中不与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(c)使所述步骤(b)中选择的抗原结合结构域在低分子化合物的存在下与抗原接触；
步骤(d)选择所述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(e)使编码所述步骤(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(f)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有步骤(e)中得到的多核苷酸；和
步骤(g)从所述步骤(f)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
〔方案15〕
包含抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的制造方法，其包括下述步骤(a)至(e)：
步骤(a)使方案〔1〕至〔13〕中任一项所述的文库在低分子化合物的存在下与抗原接触；
步骤(b)用比所述步骤(a)低浓度的低分子化合物将抗原结合结构域解离并回收；
步骤(c)使编码所述步骤(b)中回收的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(d)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有步骤(c)中得到的多核苷酸；和
步骤(e)从所述步骤(d)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
〔方案16〕
方案〔14〕或〔15〕所述的包含抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的制造方法，其进一步包括下述步骤(a)至(b)：
步骤(a)使方案〔1〕至〔13〕中任一项所述的文库与低分子化合物接触；和
步骤(b)选择所述步骤(a)中回收的抗原结合结构域。
〔方案17〕
方案〔14〕至〔16〕中任一项所述的抗原结合分子的制造方法，其中，所述低分子化合物是犬尿氨酸、腺苷、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、或三磷酸腺苷。
〔方案18〕
抗原结合分子，其含有抗原结合活性根据非天然化合物的浓度而变化的抗原结合结构域。
〔方案19〕
药物组合物，其含有方案〔18〕所述的抗原结合分子。
本领域技术人员当然理解，只要基于本领域技术人员的技术常识在技术上不矛盾，则组合上述记载的1个或多个方案而成的方案也包含在本发明中。
发明效果
本发明的抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子、以及包含它们的药物组合物在正常组织、血液中不会全身性地作用，而是在作为靶组织的病变部位的癌症或炎症部位中可逆地作用，由此可以避免副作用的同时发挥药效，治疗起因于该靶组织的疾病。
进而，只要使用本发明的包含序列彼此不同的多个、抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库，则能够在短期内获得如上所述的对于组织特异性疾病的治疗有用的各种抗原结合分子。
在该本发明的文库的一个方案中，特征在于鉴定未参与结合低分子化合物的抗原结合分子结构域的氨基酸位点，以该位点的氨基酸为1～数种氨基酸的方式，设计包含编码序列彼此不同的抗原结合结构域的核酸的文库，藉此，提供能够比利用基于非人哺乳动物的免疫的方法、或来源于人或非人动物的抗体文库更有效率地获得抗原结合能力在化合物存在下发生变化的抗原结合分子的文库。
附图说明
[图1]是示出在低分子不存在的正常环境中低分子开关抗体(Small moleculeswitch antibody)不与抗原结合，而在低分子以高浓度存在的靶组织中与抗原结合的图。
[图2]是示出通过夹在低分子抗体与抗原的复合体中，低分子发挥开关功能的图。低分子若不存在则抗体与抗原的相互作用变得不充分，抗体无法与抗原结合，但若低分子存在则通过夹在抗体与抗原之间，抗体变得可以与抗原结合。
[图3]是示出对兔的免疫中使用的腺苷类似物2'-腺苷-PEG-肽的结构的图。
[图4]是示出对兔的免疫中使用的腺苷类似物5'-腺苷-PEG-肽的结构的图。
[图5]是示出将对兔的免疫中使用的腺苷类似物的肽部分替换为生物素得到的2'-腺苷-PEG-生物素的结构的图。
[图6]是示出将对兔的免疫中使用的腺苷类似物的肽部分替换为生物素得到的5'-腺苷-PEG-生物素的结构的图。
[图7]是示出由兔B细胞克隆得到的各抗体对2'-腺苷-PEG-生物素的结合活性的比较结果的图。是将使各抗体与2'-腺苷-PEG-生物素相互作用时的结合量除以各抗体的捕获量(RU)得到的值(N_结合_100)表示为纵轴，将在2'-腺苷-PEG-生物素的相互作用后2'-腺苷-PEG-生物素从各抗体解离60秒后的值除以各抗体的捕获量(RU)得到的值(N_稳定性_100)表示为横轴。
[图8A]是示出克隆SMB0002与腺苷结合(相互作用)的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从上方起依次表示100(Duplicate)50、25、12.5、6.25、3.13nM的腺苷与SMB0002的相互作用。
[图8B]是示出克隆SMB0002与ATP结合(相互作用)的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从上方起依次表示5000,1250,313,78.1nM的ATP与SMB0002的相互作用。
[图9]是示出竞争ELISA的结果的图，该竞争ELISA示出克隆SMB0002与腺苷和ATP结合。
[图10A]是示出克隆SMB0002与AMP结合(相互作用)的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从上方起依次表示500、250(Duplicate)、125、62.5、31.3、15.6、7.81μM的AMP与SMB0002的相互作用。
[图10B]是示出克隆SMB0002与ADP结合(相互作用)的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从上方起依次表示图2000、1000(Duplicate)、500、250、125、62.5、31.3μM的ADP与SMB0002的相互作用。
[图11A]是示出SMB0002抗体与腺苷的腺嘌呤环部分的结合模式的图。图中，该抗体的H链以粗线表示，L链以细线表示，腺苷以球棒模型表示。距腺嘌呤环
Figure BDA0002407382280000101
以内的氨基酸残基以棒模型表示。虚线表示在该抗体与腺嘌呤环部分之间为
Figure BDA0002407382280000111
以内的距离的氢键。
[图11B]是示出SMB0002抗体与腺苷的核糖部分的结合模式的图。图中，该抗体的H链以粗线表示，L链以细线表示，腺苷以球棒模型表示。距核糖部分
Figure BDA0002407382280000112
以内的氨基酸残基以棒模型表示。虚线表示在该抗体与核糖部分之间为
Figure BDA0002407382280000113
以内的距离的氢键。点线区域内表示在AMP结合时预想的磷酸基的存在区域。
[图12]是示出人源化SMB0002与腺苷结合(相互作用)的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从上方起依次表示200、100、50(duplicate)、25、12.5、6.25、3.125nM的腺苷与人源化SMB0002的相互作用。
[图13]是示出人源化SMB0002与AMP结合(相互作用)的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从上方起依次表示500、250、125(duplicate)、62.5、31.3、15.6、7.8μM的AMP与人源化SMB0002的相互作用。
[图14]是示出人源化SMB0002与ADP结合(相互作用)的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从上方起依次表示1000(duplicate)、500、250、125、62.5μM的ADP与人源化SMB0002的相互作用。
[图15]是示出人源化SMB0002与ATP结合(相互作用)的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从上方起依次表示1000(duplicate)、500、250、125、62.5μM的ATP与人源化SMB0002的相互作用。
[图16]是示出克隆6RNMSC1-2_F02对人IL-6R的结合ELISA的结果的图。纵轴是通过各低分子的有无来评价抗体对人IL-6R的结合活性的吸光度的值。
[图17]是示出克隆6RNMSC1-3_G02对人IL-6R的结合ELISA的结果的图。纵轴是通过各低分子的有无来评价抗体对人IL-6R的结合活性的吸光度的值。
[图18]是示出抗体对人IL-6R的结合ELISA的结果的图。纵轴是通过各氨基酸或氨基酸代谢物的有无来评价抗体对人IL-6R的结合活性的吸光度的值。
[图19]是100μmol/L犬尿氨酸存在下、10mmol/L ATP存在下、犬尿氨酸、ATP非存在下的6RNMSC1-2_F02与1μmol/L IL-6R的相互作用的传感图。实线表示犬尿氨酸存在下的相互作用、点线表示ATP存在下的相互作用、和虚线表示它们非存在下的相互作用。
[图20]在100μmol/L犬尿氨酸存在下，使6RNMSC1-2_F02与固定化于传感器芯片CM5的IL-6R相互作用，然后在含有100μmol/L 犬尿氨酸的缓冲液或不含犬尿氨酸的缓冲液条件下观察6RNMSC1-2_F02从IL-6R解离的图。图的纵轴表示将100μmol/L犬尿氨酸存在下的6RNMSC1-2_F02的结合量设为100而进行标准化得到的值，横轴表示相互作用开始后的经过时间(秒)。实线表示犬尿氨酸存在下的6RNMSC1-2_F02从IL-6R解离，点线表示犬尿氨酸非存在下的6RNMSC1-2_F02从IL-6R解离。
[图21]是将5μg/L的6RNMSC1-2_F02作为分析物而进行180秒钟相互作用，评价对固定化于传感器芯片CM5上的IL-6R的应答的图。纵轴表示使6RNMSC1-2_F02相互作用前后的应答的变化(RU)、横轴表示溶液中所含的犬尿氨酸浓度(μmol/L)。
[图22]是示出克隆6RNMSC1-2_F02与犬尿氨酸结合(相互作用)的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从上方起依次表示1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039mM的犬尿氨酸与6RNMSC1-2_F02的相互作用。另外，动力学参数为：ka＝709(1/s),kd＝0.17(1/s),KD＝0.239(mmol/L)。
[图23]是示出克隆6RNMSC1-2_F02与3-羟基-DL-犬尿氨酸结合(相互作用)的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从上方起依次表示0.625、0.313、0.156、0.078、0.039mM的3-羟基-DL-犬尿氨酸与6RNMSC1-2_F02的相互作用。
[图24]是示出克隆6RNMSC1-2_F02与化合物RO0635389-000-001结合(相互作用)的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从上方起依次表示0.625、0.313、0.156mM的化合物RO0635389-000-001与6RNMSC1-2_F02的相互作用。
[图25]是示出克隆6RNMSC1-2_F02与化合物RO0635390-000-001结合(相互作用)的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从上方起依次表示0.625、0.313、0.156mM的化合物RO0635390-000-001与6RNMSC1-2_F02的相互作用。
[图26]是示出克隆6RNMSC1-2_F02通过犬尿氨酸的存在下(实线)非存在下(虚线)而使对IL6R的结合(相互作用)发生变化的Octet的传感图。纵轴表示对IL6R的应答。
[图27]是示出克隆6RNMSC1-2_F02通过3-羟基-DL-犬尿氨酸的存在下(实线)非存在下(虚线)而使对IL6R的结合(相互作用)发生变化的Octet的传感图。纵轴表示对IL6R的应答。
[图28]是示出克隆6RNMSC1-2_F02通过化合物RO0635389-000-001的存在下(实线)非存在下(虚线)而使对IL6R的结合(相互作用)发生变化的Octet的传感图。纵轴表示对IL6R的应答。
[图29]是示出克隆6RNMSC1-2_F02通过化合物RO0635390-000-001的存在下(实线)非存在下(虚线)而使对IL6R的结合(相互作用)发生变化的Octet的传感图。纵轴表示对IL6R的应答。
[图30]是示出6RNMSC1-2_F02 Fab片段与犬尿氨酸的结合模式的图。图中，该抗体的H链以粗线表示，L链以细线表示，犬尿氨酸以球棒模型表示。距犬尿氨酸
Figure BDA0002407382280000131
以内的氨基酸残基以棒模型表示。虚线表示在该抗体与犬尿氨酸之间为
Figure BDA0002407382280000132
以内的距离的氢键或静电相互作用。
[图31]是示出克隆6RNMSC1-2_F02的H49Y改变体与犬尿氨酸结合(相互作用)的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从上方起依次表示1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039mM的犬尿氨酸与6RNMSC1-2_F02H49Y的相互作用。另外，动力学参数为：ka＝2543(1/s),kd＝0.24(1/s),KD＝0.095(mmol/L)。
[图32]是示出对6RNMSC1-2_F02的框架序列导入了用于恢复至种系序列的突变的克隆F02h011/F02l003与犬尿氨酸结合(相互作用)的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从上方起依次表示1000、500、250、125、62.5μM的犬尿氨酸与F02h011/F02l003的相互作用。
[图33]是示出对F02h011/F02l003导入了使对犬尿氨酸的结合增强的改变的克隆F02h011/F02l098与犬尿氨酸结合(相互作用)的表面等离子体共振分析的传感图。传感图从上方起依次表示500、250、125、62.5、31.3 15.6μM的犬尿氨酸与F02h011/F02l098的相互作用。
[图34]是示出6RNMSC1-2_F02 Fab片段与犬尿氨酸的结合模式的图。图中，该抗体的重链以黒色粗线表示，轻链以灰色细线表示，犬尿氨酸以球棒模型表示。距犬尿氨酸
Figure BDA0002407382280000133
Figure BDA0002407382280000134
以内的氨基酸残基以棒模型表示。
[图35]是示出6RNMSC1-2_F02 Fab片段与犬尿氨酸的结合模式的图。图中，该抗体的重链以黒色粗线表示，轻链以灰色细线表示，犬尿氨酸以球棒模型表示。轻链Ser56(kabat编号)以棒模型表示。虚线与虚线上的数字表示轻链Ser56与犬尿氨酸之间的非氢原子间的最短距离。
[图36]是示出6RNMSC1-2_F02 Fab片段与犬尿氨酸的结合模式的图。图中，该抗体的重链以黒色粗线表示，轻链以灰色细线表示，犬尿氨酸以球棒模型表示。重链Gly50和轻链Asp28(kabat编号)以棒模型表示。
[图37]是示出在各低分子1mM存在下·非存在下使各克隆1μM与固定化于传感器芯片CM5上的IL-6R相互作用120秒钟时的结合量(Binding response(RU))的图。
[图38]是示出在各低分子1mM存在下·非存在下使各克隆10μg/mL与固定化于Octet传感器上的IL-6R相互作用120秒钟时的结合量(Binding response(RU))的图。
[图39]是示出由犬尿氨酸文库Ver.A获得的克隆6RFHm12-4_040、6RFHm12-4_078、6RFHm14-4_087、6RFHm14-4_093、6RFHm17-4_006、6RFHm17-4_010对hIL-6R的各条件下的ELISA结果的图。使用6RNMSC1-2_F02作为阳性对照。纵轴是评价抗体的hIL-6R结合活性的吸光度的值。各条件的具体内容示于表38。
[图40]是示出由犬尿氨酸文库Ver.A获得的克隆hIAFHm12-4_018、hIAFHm12-4_061、hIAFHm14-4_001、hIAFHm14-4_041、hIAFHm17-4_026、hIAFHm17-4_072对hIgA-Fc的各条件下的ELISA结果的图。纵轴是评价抗体的hIgA-Fc结合活性的吸光度的值。各条件的具体内容示于表41。
[图41]是示出由犬尿氨酸文库Ver.A获得的克隆I6FHm12-4_068、I6FHm12-4_094、I6FHm14-4_007、I6FHm14-4_030、I6FHm17-4_016、I6FHm17-4_036对hIL-6的各条件下的ELISA结果的图。纵轴是评价抗体的hIL-6结合活性的吸光度的值。各条件的具体内容示于表44。
[图42]是评价ATP抑制ATNLSA1-4_D12结合生物素标记抗原(5'-腺苷-PEG-生物素,ATP-PEG-生物素的混合)的能力的图。
[图43]是示出通过作为开关的低分子夹在抗体与抗原之间，将与抗原接触的抗体可变区部分文库化，从而对于任意抗原均能够获得低分子开关抗体的合理设计抗体文库的概念的图。
[图44]是示出由将与ATP/腺苷结合的抗体作为模板的合理设计抗体文库得到的克隆I6RLSA1-6_011对人IL-6的在ATP和腺苷10mM的存在/非存在下的ELISA的结果的图。纵轴是评价抗体的人IL-6结合活性的吸光度的值。阳性对照使用了由合理设计抗体文库得到的、无论低分子的存在/非存在均显示人IL-6结合活性的克隆。阴性对照使用了M13KO7辅助噬菌体。
[图45]是示出由将与ATP/腺苷结合的抗体作为模板的合理设计抗体文库得到的克隆6RRLSA1-6_037、6RRLSA1-6_045对人IL-6受体的在ATP和腺苷10mM的存在/非存在下的ELISA的结果的图。纵轴是评价抗体的人IL-6受体结合活性的吸光度的值。阴性对照(图中记载为nega)使用了M13KO7辅助噬菌体。
[图46]是示出由将与ATP/腺苷结合的抗体作为模板的合理设计抗体文库得到的克隆HSADSA1-6_020对HSA的在ATP和腺苷10mM的存在/非存在下的ELISA的结果的图。纵轴是评价抗体的HSA结合活性的吸光度的值。阳性对照使用了由合理设计抗体文库得到的、无论低分子的存在/非存在均显示人HSA结合活性的克隆。阴性对照使用了M13KO7辅助噬菌体。
具体实施方式
提供以下的定义和详细说明来使本说明书中说明的本发明容易理解。
氨基酸
本说明书中，例如，以表示为Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V的方式，氨基酸用单字母密码或三字母密码、或其两者来标记。
氨基酸的改变
为了改变抗原结合分子的氨基酸序列中的氨基酸，可以适宜采用位点特异性突变诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR等公知方法。此外，作为置换为天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸突变方法，还可采用多种公知的方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。还可优选使用例如：包含作为终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补琥珀抑制物tRNA上结合有非天然氨基酸而成的tRNA的无细胞翻译系统(Clover Direct(Protein Express))等。
本说明书中，表示氨基酸的改变位点时所用的“和/或”一词的含义包括“和”与“或”适宜组合的所有组合。具体地，例如“33位、55位和/或96位的氨基酸被替换”包含以下的氨基酸改变的变体；
(a)33位、(b)55位、(c)96位、(d)33位和55位、(e)33位和96位、(f)55位和96位、(g)33位和55位和96位。
此外，本说明书中，作为表示氨基酸的改变的表述，也可以适宜使用在表示特定位置的数字的前后同时记有改变前与改变后的氨基酸的单字母密码或三字母密码的表述。例如，在加入抗体可变区所含的氨基酸的替换时所使用的N100bL或Asn100bLeu这一改变表示将以Kabat编号表示的100b位的Asn替换成Leu。即，数字表示以Kabat编号表示的氨基酸的位置，记载于其之前的的氨基酸的单字母密码或三字母密码表示替换前的氨基酸、记载于其之后的氨基酸的单字母密码或三字母密码表示替换后的氨基酸。同样地，在对抗体恒定区所含的Fc区加入氨基酸的替换时使用的P238D或Pro238Asp这一改变表示将以EU编号表示的238位的Pro替换为Asp。即，数字表示以EU编号表示的氨基酸的位置，记载于其之前的氨基酸的单字母密码或三字母密码表示替换前的氨基酸，记载于其之后的氨基酸的单字母密码或三字母密码表示替换后的氨基酸。
抗原
本说明书中，“抗原”只要含有抗原结合结构域所结合的表位，则其结构并不限于特定的结构。就另外的意义而言，抗原可以是无机物也可以是有机物。作为抗原，可例示如下述的分子：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素RIB ALK-4、激活素RIIA、激活素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房钠尿因子、av/b3整合素、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3成骨素(Osteogenin)、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP-6Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、蛙皮素、骨衍生神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒杆菌毒素、产气荚膜梭菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、PD1、PDL1、LAG3、TIM3、半乳凝素-9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、补体抑制因子(衰变促进因子)、脱(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮素受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、Eotaxin 1、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择素、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、促卵胞激素、断裂因子、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌肉生长抑制素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF)、Hep B gp120、乙酰肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIBgp 120V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-21、IL-23、IL-27、干扰素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素样生长因子1、整合素α2、整合素α3、整合素α4、整合素α4/β1、整合素α4/β7、整合素α5(αV)、整合素α5/β1、整合素α5/β3、整合素α6、整合素β1、整合素β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、层连蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜伏型TGF-1、潜伏型TGF-1bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、促黄体激素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Muc1)、MUC18、缪勒管抑制物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C粘附因子、NCA 90、NCAM、NCAM、脑啡肽酶、神经营养素-3、神经营养素-4、或神经营养素-6、Neurturin、神经生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙黏蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T细胞受体(例如，T细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特异性(泛特异性的TGF-β)、TGF-βRI(ALK-5)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲状腺激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFFR)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RICD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbRTNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(FasApo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAILR1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHTHVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a黏附素(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、TRF、Trk、TROP-2、TLR(Toll-like receptor)1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA125、肿瘤相关抗原表达Lewis-Y相关碳水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙黏蛋白、VE-钙黏蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、冯维勒布兰德因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81,CD97,CD98,DDR1,DKK1,EREG、Hsp90,IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL,PCSK9,激肽释放酶原,RON,TMEM16F、SOD1,嗜铬粒蛋白A,嗜铬粒蛋白B、tau,VAP1、高分子激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1,C1q,C1r,C1s,C2,C2a,C2b,C3,C3a,C3b,C4,C4a,C4b,C5,C5a,C5b,C6,C7,C8,C9,因子B,因子D,因子H,备解素、硬骨素(sclerostin)、纤维蛋白原,纤维蛋白,凝血酶原,凝血酶,组织因子,因子V,因子Va,因子VII,因子VIIa,因子VIII,因子VIIIa,因子IX,因子IXa,因子X,因子Xa,因子XI,因子XIa,因子XII,因子XIIa,因子XIII,因子XIIIa,TFPI,抗凝血酶III,EPCR,血栓调节蛋白、TAPI,tPA,纤溶酶原,纤溶酶,PAI-1,PAI-2、GPC3、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖-2、多配体蛋白聚糖-3、多配体蛋白聚糖-4、LPA、S1P以及用于激素和生长因子的受体。作为抗原，优选为癌组织或炎性组织中的癌细胞·免疫细胞·基质细胞等中表达的抗原。
在上述抗原的例示中还记载有受体，但在这些受体以可溶型存在于生物体液中的情形中，也可以作为本发明的包含抗原结合活性根据低分子化合物(例如，靶组织特异性化合物)的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子所结合的抗原而使用。作为这样的可溶型受体的非限定的一个方案，例如可例示，由Mullberg等(J.Immunol.(1994)152(10),4958-4968)记载的作为可溶型IL-6R的、由SEQ ID NO:1所示的IL-6R多肽序列中第1至第357位氨基酸构成的蛋白。
上述抗原的例示中还包含表达于细胞膜的膜型分子、和由细胞分泌到细胞外的可溶型分子。本发明的包含抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子结合于由细胞分泌的可溶型分子时，作为该抗原结合分子，优选如后所述具有中和活性。
对于可溶型分子所存在的溶液没有限定，该可溶型分子可以存在于生物体液、即充满生物体内的脉管或组织·细胞空间的所有的液体。在非限定的一个方案中，本发明的抗原结合分子所结合的可溶型分子可以存在于细胞外液。就脊椎动物而言，细胞外液是指血浆、组织间液、淋巴液、致密的结缔组织、脑脊髓液、髓液、穿刺液、或关节液等骨和软骨中的成分、肺泡液(支气管肺泡清洗液)、腹水、胸水、心包液、囊内液、或眼房水(房水)等细胞透过液(细胞的主动输送·分泌活动的结果产生的各种腺腔内的液体、和消化道管腔等其他体腔内液)的总称。
本发明的包含抗原结合活性根据低分子化合物(例如，靶组织特异性化合物)的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子与表达于细胞膜的膜型分子结合时，作为该抗原结合分子的优选实例，可举出如后所述具有细胞毒性的抗原结合分子、或者结合细胞伤害性物质的抗原结合分子或具有结合细胞伤害性物质的能力的抗原结合分子。此外，替代具有细胞毒性、或者结合细胞伤害性物质或具有结合细胞伤害性物质的能力的性质，或除了该性质之外，还具有中和活性的抗原结合分子也可优选举出作为非限定的一个方案。
表位
表示存在于抗原中的抗原决定基的表位，意指本说明书中公开的抗原结合分子中的抗原结合结构域所结合的抗原上的部位。所以，例如表位可通过其结构来定义。另外，也可以通过相对于识别该表位的抗原结合分子中的抗原的结合活性来定义该表位。抗原为肽或者多肽时，还可以通过构成表位的氨基酸残基来规定表位。另外，表位为糖链时，也可以通过特定的糖链结构来规定表位。
线性表位是下述表位，其包含氨基酸一级序列得到识别的表位。线性表位在固有序列中典型地含有至少3个氨基酸，和最普通地含有至少5个、例如约8至约10个、6至20个氨基酸。
与线性表位相对地，立体结构表位是这样的表位，其中，含有表位的氨基酸的一级序列并非是被识别表位的单一规定成分(例如，氨基酸的一级序列不需要被规定表位的抗体所识别的表位)。立体结构表位相对于线性表位可以含有增大数目的氨基酸。关于立体结构表位的识别，抗体识别肽或蛋白质的三维结构。例如，蛋白质分子折叠形成三维结构时，形成立体结构表位的某氨基酸和/或多肽主链变得并排，使得抗体可以识别表位。确定表位的立体结构的方法包括例如：X射线结晶学、二维核磁共振分光学以及位点特异性旋转标记和电子顺磁共振分光学，但并非限定于此。例如，参照Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology(1996)、第66卷、Morris(编)。
与表位结合的抗原结合结构域的结构被称为互补位。表位和互补位通过在表位和互补位之间发生作用的氢键、静电力、范德华力、疏水键等稳定地结合。该表位与互补位之间的结合力被称为亲和力(affinity)。多个抗原与多个抗原结合分子结合时的结合力的总和被称为亲合力(avidity)。包含多个抗原结合结构域的(即多价的)抗体等与多个表位结合时，结合力(affinity)协同地发挥作用，因此亲合力比亲和力高。
结合活性以下例示了通过含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法，但通过含有针对IL-6R以外的抗原的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法也可基于下述例示而适宜实施。
例如，含有针对IL-6R抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否识别存在于IL-6R分子中的线性表位，可通过如下所示操作来确认。为了上述目的，合成了包含构成IL-6R的细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽。该肽可化学性地合成。或者，可以利用IL-6R的cDNA中编码相当于细胞外结构域的氨基酸序列的区域，通过基因工程技术得到。接着，对包含构成细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽、和含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合活性进行评价。例如，通过以固定化线性肽作为抗原的ELISA，可以评价该抗原结合分子对该肽的结合活性。或者，基于该抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合中的、线性肽造成的抑制水平，也可以明确对线性肽的结合活性。通过这些试验，可以明确该抗原结合分子对线性肽的结合活性。
另外，还可以如下所述来确认含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否识别立体结构表位。为了上述目的，制备了表达IL-6R的细胞。可举出：含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子在与IL-6R表达细胞接触时强烈地与该细胞结合，但该抗原结合分子与经固定化的包含构成IL-6R细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽实质上不结合的情形等。这里，实质上不结合是指，对人IL-6R表达细胞的结合活性的80％以下、通常50％以下、优选30％以下、特别优选15％以下的结合活性。
作为测定对含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的IL-6R表达细胞的结合活性的方法，可举出例如：Antibodies A Laboratory Manual记载的方法(EdHarlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。即，可通过以IL-6R表达细胞为抗原的ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting)的原理来进行评价。
在ELISA形式中，对含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的IL-6R表达细胞的结合活性，通过比较由酶反应生成的信号水平而定量地进行评价。即，将被测多肽复合体添加至固定有IL-6R表达细胞的ELISA板，利用识别被测抗原结合分子的酶标记抗体，检出与细胞结合的被测抗原结合分子。或者在FACS中，制作被测抗原结合分子的稀释系列，确定相对于IL-6R表达细胞的抗体结合效价(titer)，由此可以比较被测抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合活性。
被测抗原结合分子与悬浮于缓冲液等中的细胞表面上表达的抗原的结合可以通过流式细胞仪检测出。作为流式细胞仪，已知例如如下的装置。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM(均为BD Biosciences公司的商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均为Beckman Coulter公司的商品名)
例如，含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对抗原的结合活性的优选测定方法的一例，可举出以下方法。首先，将表达IL-6R的细胞与被测抗原结合分子反应，将其用识别被测抗原结合分子的经FITC标记的二次抗体染色。将被测抗原结合分子用适宜的优选缓冲液稀释，由此将该抗原结合分子制备为所期望的浓度来使用。例如，能够以10μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。接着，通过FACSCalibur(BD公司)测定荧光强度和细胞数。抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELL QUEST Software(BD公司)进行分析而得的荧光强度、即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，能够测定由被测抗原结合分子的结合量表示的被测抗原结合分子的结合活性。
含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否与某抗原结合分子共有表位，可通过两者对相同表位的竞争来确认。抗原结合分子间的竞争通过交叉阻断试验等来检测。例如竞争ELISA试验是优选的交叉阻断试验。
具体地，在交叉阻断试验中，涂布于微量滴定板的孔上的IL-6R蛋白在候选竞争抗原结合分子的存在下、或非存在下经孵育后，添加被测抗原结合分子。与孔中的IL-6R蛋白结合的被测抗原结合分子的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗原结合分子的结合能力间接地相关。即，竞争抗原结合分子对相同表位的亲和性越大，则被测抗原结合分子对涂布有IL-6R蛋白的孔的结合活性越降低。
经由IL-6R蛋白而与孔结合的被测抗原结合分子的量可以通过预先标记抗原结合分子来容易地测定。例如，经生物素标记的抗原结合分子通过使用亲和素过氧化酶缀合物和合适的底物来测定。利用过氧化酶等酶标记的交叉阻断试验特别被称为竞争ELISA试验。抗原结合分子能够用可检测或可测定的其它标记物质进行标记。具体地，公知的是放射标记或荧光标记等。
与在候选竞争抗原结合分子复合体的非存在下实施的对照试验中得到的结合活性进行比较，竞争抗原结合分子只要可以阻断至少20％、优选至少20-50％、进一步优选至少50％的含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合，则该被测抗原结合分子是与竞争抗原结合分子实质上结合于相同表位、或者竞争结合于相同的表位的抗原结合分子。
在鉴定含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子所结合的表位的结构时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子是否共有表位，能够通过比较两抗原结合分子对在构成该表位的肽中导入氨基酸突变而得的肽的结合活性来进行评价。
作为这种测定结合活性的方法，例如，在前述ELISA形式中，可通过比较被测抗原结合分子和对照抗原结合分子对导入了突变的线性肽的结合活性来测定。作为ELISA以外的方法，通过使被测抗原结合分子与对照抗原结合分子流过该柱后，对洗脱液中洗脱的抗原结合分子进行定量，也可以测定对结合于柱的该突变肽的结合活性。使突变肽作为例如与GST的融合肽的形式而吸附于柱的方法是公知的。
另外，鉴定的表位为立体表位时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子是否共有表位可通过以下方法来评价。首先，制备表达IL-6R的细胞和表达在表位中导入了突变的IL-6R的细胞。将这些细胞悬浮于PBS等适当的缓冲液中，向所得细胞悬浮液添加被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，用合适的缓冲液清洗，向所得细胞悬浮液添加能够识别被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的经FITC标记的抗体。被标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数通过FACSCalibur(BD公司)来测定。被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的浓度通过合适的缓冲液适当稀释，由此可以制备为所期望的浓度来使用。例如，能够以10μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。标记抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELLQUEST Software(BD公司)进行分析而得的荧光强度、即几何平均值。即、通过得到该几何平均值，可以测定由标记抗体的结合量表示的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的结合活性。
本方法中，例如“实质上不与突变IL-6R表达细胞结合”可通过以下方法判断。首先，用标记抗体染色与表达突变IL-6R的细胞结合的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，检测细胞的荧光强度。荧光检测中使用作为流式细胞仪的FACSCalibur时，所得的荧光强度可以使用CELL QUEST Software进行分析。由多肽复合体存在下和非存在下的几何平均值，通过下述式1计算该比较值(ΔGeo-Mean)，由此可以求出抗原结合分子的结合造成的荧光强度的增加比例。
(式1)
ΔGeo-Mean＝Geo-Mean(多肽复合体存在下)/Geo-Mean(多肽复合体非存在下)
将通过分析得到的、反映被测抗原结合分子对突变IL-6R表达细胞的结合量的几何平均比较值(突变IL-6R分子ΔGeo-Mean值)、与反映被测抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合量的ΔGeo-Mean比较值进行比较。此时，计算相对于突变IL-6R表达细胞和IL-6R表达细胞的ΔGeo-Mean比较值时使用的被测抗原结合分子的浓度特别优选制备为相互相同或者实质上相同的浓度。预先确定了识别IL-6R中的表位的抗原结合分子被用作对照抗原结合分子。
被测抗原结合分子相对于突变IL-6R表达细胞的ΔGeo-Mean比较值只要小于被测抗原结合分子相对于IL-6R表达细胞的ΔGeo-Mean比较值的至少80％、优选50％、进一步优选30％、特别优选15％，则认为“实质上不与突变IL-6R表达细胞结合”。计算Geo-Mean值(几何平均)的计算式记载于CELL QUEST Software User’s Guide(BD biosciences公司)。通过对比较值进行比较，只要是能够将其实质上视为相同的程度，则能够评价被测抗原结合分子与对照抗原结合分子的表位相同。
靶组织
本说明书中所用的术语“靶组织”是指包含存在有本发明的抗原结合分子根据低分子化合物浓度而结合的抗原的细胞的组织，是指该抗原结合分子与表达于该细胞的膜型分子的结合、或与存在于该组织的可溶型分子的结合对包含该组织的机体带来正的药理作用的组织。此时，“正的药理作用”是指包含靶组织的病理部位对包含该组织的机体造成的症状的减轻、缓和、改善、或治愈的作用。作为带来这种药理作用的非限定性机制的一个方案，例如，在癌等恶性肿瘤所造成的症状的情形中，可例示针对癌细胞的细胞毒性和增殖抑制以及癌组织中免疫活化等。作为这种非限定性机制的一个方案，例如，在炎性疾病的情形中，可例示炎性组织中的炎性细胞因子的作用的阻断活性和免疫抑制等。
癌组织特异性化合物
本说明书中所用的术语“癌组织特异性化合物(癌组织特异性化合物)”是指与非癌组织相比在癌组织中差异地存在的化合物。本说明书中，术语“癌”通常用于表示恶性新生物，其可以是转移性或非转移性。例如，作为由消化道、皮肤等上皮组织产生的癌症的非限定性实例，可例示：脑肿瘤、皮肤癌、头颈部癌、食道癌、肺癌、胃癌、十二指肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肝癌、大肠癌、结肠癌、膀胱癌、和卵巢癌等。此外，作为由肌肉等非上皮性组织(间质)产生的肉瘤的非限定性实例，可例示：骨肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、和血管肉瘤等。进而，作为来源于造血器官的血液肿瘤的非限定性实例，可例示：包括霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)和非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin's lymphoma)的恶性淋巴瘤、包括急性髓细胞性白血病(acutemyelocytic leukemia)或慢性髓细胞性白血病(chronic myelocytic leukemia)、和急性淋巴性白血病(acute lymphatic leukemia)或慢性淋巴性白血病(chronic lymphaticleukemia)的白血病、以及多发性骨髓瘤(multiple myeloma)。本说明书中广泛使用的术语“新生物”还意指新产生任何病理组织肿瘤。本发明中，新生物引起肿瘤的形成，其部分地以血管形成为特征。新生物可以是良性，例如血管瘤、神经胶质瘤、畸胎瘤等，或者是恶性，例如癌肿瘤、肉瘤、胶质细胞瘤、星状胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤等。
术语“癌组织”意指含有至少一种癌细胞的组织。因此，例如癌组织含有癌细胞和血管那样，其是指有助于含有癌细胞和内皮细胞的肿瘤(tumor mass)的形成的所有的细胞型。本说明书中，肿瘤是指肿瘤组织病灶(a foci of tumor tissue)。术语“肿瘤”通常用于意指良性新生物或恶性新生物。
例如，在数个实施方案中，癌组织特异性化合物可以是由存在于癌组织但不存在于非癌组织中、或者不存在于癌组织但存在于非癌组织中等定性的癌组织特异性所规定的化合物。在其它实施方案中，癌组织特异性化合物可以是由以与非癌组织相比为不同浓度(例如，高浓度或低浓度)存在于癌组织中等定量的癌组织特异性所规定的化合物。例如，癌组织特异性化合物以任意的浓度差异地存在。但通常，癌组织特异性化合物可以以增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍、或其以上、直至无限大(即不存在于非癌组织中的情形)的浓度存在；或者通常可以以减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或直至至少100％(即，表示不存在)的浓度存在。优选癌组织特异性化合物以统计学上显著的浓度(即，以使用Welch's t检验或Wilcoxon秩和检验中的任一者来确定的方式，p值为小于0.05和/或q值为小于0.10)差异地存在。作为癌组织特异性化合物的非限定的一个方案，可例示下述化合物，其是如下所述的癌组织所含的癌细胞、免疫细胞、基质细胞中通过特有的代谢活性所产生的癌组织特异性的代谢产物(癌组织特异性代谢产物；癌细胞特异性代谢产物、浸润于癌组织的免疫细胞特异性的代谢产物、癌基质细胞特异性代谢产物)。
本说明书中使用的术语“非天然化合物”是指非天然来源的化学物质和其代谢物。作为发明的一个方案，是具有在从机体外给予至机体内后在靶组织集结的性质的非天然来源的化学物质和其代谢物。作为非天然化合物，例示有(1)卡培他滨(Capecitabine(Xeloda))和作为其代谢物的5-FU(fluorouracil，氟尿嘧啶)、以及(2)TH-302和溴化异磷酰胺氮芥(Br-IPM)等。5-FU是卡培他滨(Capecitabine(Xeloda))的代谢物，已知由作为癌组织特异性代谢酶的胞苷脱氨酶与胸苷磷酸化酶所代谢(Desmoulin F.et al.Drug MetabDispos.2002)。另外，还已知TH-302通过如在癌组织周边那样的低氧条件下进行还原而被转换为Br-IPM(Duan JX,et al.J Med Chem.2008)。例如，在给予卡培他滨(capecitabine(xeloda))时，由于被癌特异性代谢酶等代谢为5-FU，因而癌局部的5-FU的浓度变高(Desmoulin F.et al.Drug Metab Dispos.2002)，所以认为通过以5-FU为开关的抗体，可以仅在癌局部选择性地与靶抗原结合。另外，除了代谢酶以外，认为还可以使用通过在癌特异性的低氧环境、酸性环境下而生成的分子作为开关。例如，TH-302(Duan JX,et al.J MedChem.2008)在低氧条件下被代谢为Br-IPM，因而认为利用以Br-IPM为开关的抗体，可以仅在癌局部选择性地与靶抗原结合。例如，作为将非天然化合物给予至机体的方法，可举出口服给予，滴眼给予、透皮给予、经鼻给予、经静脉给予、经肺给药等公知的给予方法，但并不限定于此。
作为本说明书中使用的术语“非天然化合物”的另一方案，除了具有集结于靶组织的性质的化学物质和其代谢物以外，还包含将作为开关的非天然化合物通过例如经口给予，从而能够通过服用口服制剂来控制抗体作用的化学物质等。即，将某种能够口服等非侵袭给予的非天然化合物作为开关，将对某种抗原显示出结合的开关抗体预先进行静脉内或皮下给予等侵袭给予，然后将作为开关的外源性化合物进行经口等非侵袭给予，由此可以控制该抗体的作用的化学物质等。作为这样的化合物质，可举出例如ATPγS、犬尿氨酸代谢物等，但并不限定于此。
抗体药物由于半衰期长，因而产生副作用时则其作用的持续成为缺点，但是若如上所述能够通过将非天然化合物进行口服等非侵袭给予来控制抗体的作用，则在产生副作用时也可以通过停止开关分子的给予来终止药物的作用。另外，通过预先给予开关抗体，能够仅在因疾病而产生症状时给予开关分子，仅在必要时通过口服等非侵袭给予来发挥药理作用。
本发明中的“包含抗原结合活性根据非天然化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子”在被给予至机体时能够带来正的药理作用。
癌组织特异性代谢产物
术语“代谢”是指在生物的组织内产生的化学变化，包括“同化”和“异化”。同化是指分子的生物合成或蓄积，异化是指分子的分解。“代谢产物”是起因于物质代谢的中间体或产物。“一次代谢产物”是指与细胞或生物的成长或者繁殖的过程直接相关的代谢产物；“二次代谢产物”是指与它们的成长或者繁殖的过程不直接相关，而是生物合成与细胞或生物中共同的生命现象不直接相关的物质的代谢结果所产生的抗生素或色素等产物。代谢产物可以是“生物高分子”的代谢产物，也可以是“低分子”的代谢产物。“生物高分子”是包含一种以上的重复单元的高分子。生物高分子通常见于生物系统，可举出：形成生物的细胞和粘附于其的细胞间基质、组织间基质等形成结构物的分子量为大约5000以上的分子，特别是多糖类(碳水化物等)和肽(该术语以包括多肽和蛋白的方式使用)和多核苷酸、同样地它们的类似物、例如由氨基酸类似物或者非氨基酸基团构成的化合物或者含有氨基酸类似物或者非氨基酸基团的化合物。
本说明书中使用的术语“低分子”是指存在于机体的“生物高分子”以外的天然来源的化学物质或非天然来源的化学物质。优选为靶组织特异性化合物或非天然化合物，但并不限定于此。作为本说明书中记载的非限定的一个方案的癌组织特异性代谢产物，可适宜地举出癌细胞特异性的低分子代谢产物(Eva Gottfried,Katrin Peter and MarinaP.Kreutz,From Molecular to Modular Tumor Therapy(2010)3(2),111-132)。进而，也包括浸润于癌组织的免疫细胞所大量产生的代谢产物或支持癌细胞的生存和/或成长的基质细胞(癌基质细胞或癌间质成纤维细胞(CAF))所大量产生的代谢产物。作为浸润的免疫细胞，可例示树突细胞、抑制性树突细胞、抑制性T细胞、耗竭性T细胞(exhausted T cell)、骨髄系来源的抑制细胞(myeloma derived suppressor cell、MDSC)等。另外，本发明的代谢产物中还包括存在于癌组织的细胞(癌细胞、免疫细胞、基质细胞)由于凋亡、坏死等而发生细胞死亡时从细胞内释放至细胞外的化合物。
为了鉴定癌细胞特异性代谢产物，除了转录组水平上的分析(例如，例示有Dhanasekaran等(Nature(2001)412,822-826)、Lapointe等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2004)101,811-816)或Perou等(Nature(2000)406,747-752等)或者蛋白质组水平上的分析(例如，Ahram等(Mol.Carcinog.(2002)33,9-15、Hood等(Mol.Cell.Proteomics(2005)4,1741-1753)之外，还适宜使用以代谢学分析为中心的代谢学(Metabolomics)分析。即，为了鉴定被测试样中的代谢产物，可以使用将高压液相色谱(HPLC)、核磁共振(NMR)(Brindle等(J.Mol.Recognit.(1997)10,182-187)、质谱法(Gates和Sweeley(Clin.Chem.(1978)24,1663-1673)(GC/MS和LC/MS))和ELISA等单独和/或组合使用的代谢学分析。
通过这些研究阐明了，因改变使癌细胞能够在低的氧压条件下生长的代谢产物(例如葡萄糖或氧)和生长因子的浓度梯度而构成的肿瘤内的异质性(Dang和Semenza(Trends Biochem.Sci.(1999)24,68-72))。这些研究中，为了理解肿瘤的恶性度的不同程度所致的能量利用通路的变化，而使用了细胞株模型(Vizan等(Cancer Res.(2005)65,5512-5515)。作为代谢学平台技术的构成要素的非限定的一个方案，例示有Lawton等(Pharmacogenomics(2008)9,383)中记载的试样提取、分离、检出、分光分析、数据标准化、类特异性代谢产物的描述、通路测绘、确认、和候补代谢产物的功能性表征。通过这些方法可以鉴定所期望的癌组织中的癌细胞特异性代谢产物。
作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物、或癌组织特异性代谢产物的非限定的一个方案，优选可举出选自以下化合物中的至少一种化合物。至少一种化合物意指后述相同的抗原结合结构域的抗原结合活性除了依赖于一种癌组织特异性化合物、或癌组织特异性代谢产物的情形，还包括依赖于多种癌组织特异性化合物、或癌组织特异性代谢产物的情形。
(1)乳酸、琥珀酸、柠檬酸等糖酵解系统、或克雷伯氏循环的一次代谢产物作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物、特别是癌细胞特异性代谢产物的非限定的一个方案，优选可举出在乳酸、琥珀酸、柠檬酸等与存在于周围的非癌部组织相比在癌组织中以高浓度存在的葡萄糖代谢的结果生成的一次代谢产物。一直以来，已知表征为丙酮酸激酶、己糖激酶、和乳酸脱氢酶(LDH)等糖酵解系统(Embden-Myerhof通路)酶的向上调节(上调)的糖酵解系统表现型作为瓦伯格效应是实体瘤的特征。
即，在肿瘤细胞中，认为并非M1同种型而是在厌氧条件下的糖酵解(erobicglycolysis)所需的M2同种型的丙酮酸激酶的高表达对于机体内的肿瘤细胞的生长起有利作用(Christofk等(Nature(2008)452,230-233)。由丙酮酸激酶生成的丙酮酸受到乳酸的反馈抑制，该乳酸是厌氧条件下的乳酸脱氢酶(LDH)的平衡反应的结果生成的。据称通过该反馈抑制引起线粒体中的呼吸(克雷伯氏循环)的促进、和细胞增殖抑制，因此LDH、己糖激酶、和葡萄糖转运体(GLUT)的向上调节对于肿瘤细胞的增殖起到重要的作用(Fantin等(Cancer Cell(2006)9,425-434))。葡萄糖通过糖酵解系统而代谢，其最终代谢产物乳酸与质子一起被共同输送至肿瘤的周围，结果据说肿瘤周边组织的pH变化为酸性条件。已知糖酵解系统的最终产物乳酸、因线粒体中的呼吸的促进而生成的琥珀酸和柠檬酸在癌组织中蓄积(Teresa等(Mol.Cancer(2009)8,41-59))。作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物、特别是癌细胞特异性代谢产物的非限定的一个方案，优选可举出通过这样的糖酵解系统的代谢而生成的一次代谢产物即乳酸、琥珀酸、柠檬酸等。此外，还已知由于细胞死亡，在细胞内以高浓度存在的琥珀酸漏出至细胞外(Nature Immunology,(2008)9,1261-1269)。因此认为在细胞死亡频繁发生的癌组织中，琥珀酸的浓度会上升。
(2)丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸已知除了上述的葡萄糖代谢以外，在需要连续供给厌氧条件下的生物高分子的生物合成所需的必需氨基酸和非必需氨基酸的肿瘤细胞中，氨基酸代谢也变化。谷氨酰胺是在其侧链含有二个氮的作为氮转运体作用的在机体中最广泛地分布的氨基酸。谷氨酰胺向细胞内摄入的速度上升的肿瘤细胞据称作为谷氨酰胺陷阱(glutamine trap)发挥作用。这种谷氨酰胺的摄入和向谷氨酸和乳酸转换的活性的上升被称作“谷氨酰胺分解(glutaminolysis)”，被认为是经转化的(肿瘤)细胞的特征(Mazurek和Eigenbrodt(Anticancer Res.(2003)23,1149-1154、以及Mazurek等(J.Cell.Physiol.(1999)181,136-146))。其结果，癌患者表现出血浆中谷氨酰胺的水平的减少，同时表现出谷氨酸浓度的增大(Droge等(Immunobiology(1987)174,473-479)。继而，通过肺癌组织的经13C放射标记的葡萄糖的代谢研究，在13C标记琥珀酸、13C标记丙氨酸、13C标记谷氨酸、和13C标记柠檬酸的浓度间观察到相关。作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物的非限定的一个方案，优选可举出通过这种谷氨酰胺分解等而在癌组织中以高浓度蓄积的丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等。
(3)犬尿氨酸(kynurenine)等氨基酸的代谢产物
吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)是在黑素瘤、结肠癌、和肾癌等许多的癌中高表达的色氨酸代谢酶(Uyttenhove等(Nat.Med.(2003)9,1269-127)，已知存在二个同种型(Lob等(CancerImmunol.Immunother.(2009)58,153-157))。IDO催化色氨酸向犬尿氨酸(化1所示)转换，是烟酰胺核苷酸(NAD)的从头合成通路的最初的酶。此外，在不表达IDO的神经胶质瘤中，通过肝脏的色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)而由色氨酸生成犬尿氨酸(Opitz等(Nature(2011)478,7368,197-203))。另外IDO在浸润于癌组织的树突细胞中也有表达，树突细胞也会产生犬尿氨酸(J.Immunol.(2008)181,5396-5404)。另外，IDO在癌组织的骨髄系来源的抑制细胞(MDSC)中也有表达，MDSC也会产生犬尿氨酸(Yu等(J.Immunol.(2013)190,3783-3797))。
[化1]
Figure BDA0002407382280000301
已知犬尿氨酸抑制同种T细胞应答(Frumento等(J.Exp.Med.(2002)196,459-468)，并且提倡下述机制，其中，肿瘤细胞通过上述抑制避开抗肿瘤免疫应答，同时通过犬尿氨酸作为表达于神经胶质瘤的芳烃受体的内源性配体发挥作用的自分泌增殖机制，神经胶质瘤细胞的增殖得到促进(Opitz等(上述))。犬尿氨酸通过犬尿氨酸酶转变为邻氨基苯甲酸([化2]所示)，并通过犬尿氨酸3-羟化酶转变为3-羟基犬尿氨酸([化3]所示)。邻氨基苯甲酸、和3-羟基犬尿氨酸均转变为形成NAD的前体的3-羟基邻氨基苯甲酸。
[化2]
Figure BDA0002407382280000311
[化3]
Figure BDA0002407382280000312
犬尿氨酸通过犬尿氨酸氨基转移酶转变为犬尿酸([化4]所示)。作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物、特别是癌细胞特异性代谢产物的非限定的一个方案，优选可举出这种犬尿氨酸、及其代谢产物，即邻氨基苯甲酸、3-羟基犬尿氨酸、和犬尿酸等氨基酸的代谢产物。
[化4]
Figure BDA0002407382280000313
(4)前列腺素E2(Prostaglandin E2)等花生四烯酸的代谢产物前列腺素E2(PGE2)([化5])是被称作包含由环氧合酶(COX)-1/2合成的前列腺素和血栓烷的前列腺素类的花生四烯酸的代谢物(Warner和Mitchell(FASEB J.(2004)18,790-804))。促进PGE2结肠癌细胞的增殖，并抑制其凋亡(Sheng等(Cancer Res.(1998)58,362-366))。已知在许多癌细胞中，环氧合酶的表达是变化的。即，主要发现COX-1几乎在所有的组织中构成性地表达，与之相对，COX-2在肿瘤中通过某种炎性细胞因子和癌基因诱导(Warner和Mitchell(前述))。还报道了COX-2的过表达与乳腺癌的预后不良(Denkert等(Clin.Breast Cancer(2004)4,428-433)、和卵巢癌的急速疾病进行(Denker等(Mod.Pathol.(2006)19,1261-1269)有关联性。另外，浸润于癌组织的抑制性T细胞也产生前列腺素E2(Curr.Med.Chem.(2011)18,5217-5223)。已知花生四烯酸的代谢物的前列腺素、白细胞三烯等低分子作为控制癌的自分泌和/或旁分泌性增殖的刺激因子起作用(Nat.Rev.Cancer(2012)12(11)782-792)。作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物、特别是癌细胞特异性代谢产物或浸润于癌组织的免疫细胞特异性代谢物的非限定的一个方案，优选可举出这种前列腺素E2等花生四烯酸的代谢产物。除了前列腺素E2以外，血栓烷A2(TXA2)在大肠癌等癌组织中的产生亢进(J.Lab.Clin.Med.(1993)122,518-523)，可作为本发明的花生四烯酸的代谢产物的非限定的一个方案而优选举出。
[化5]
Figure BDA0002407382280000321
(5)腺苷、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)等具有嘌呤环结 构的核苷已知若癌细胞发生细胞死亡则细胞内的大量ATP会漏出至细胞外。因此，癌组织中的ATP浓度与正常组织相比显著地高(PLoS One.(2008)3,e2599)。多种类型的细胞会释放ATP、ADP和AMP类型的腺嘌呤核苷酸。经由细胞外-5'-核苷酸酶(eco-5'-nucleotidase)(CD73)之类的细胞表面的细胞外酶代谢(Resta和Thompson(Immunol.Rev.(1998)161,95-109)以及Sadej等(Melanoma Res.(2006)16,213-222)。腺苷是以低浓度在细胞外环境构成性地存在的嘌呤核苷，在发现于实体癌的低氧组织中，报道了细胞外腺苷浓度的显著增加(Blay和Hoskin(Cancer Res.(1997)57,2602-2605)。CD73表达于肿瘤和免疫细胞的表面(Kobie等(J.Immunol.(2006)177,6780-6786)，在乳腺癌(Canbolat等(Breast CancerRes.Treat.(1996)37,189-193)、胃癌(Durak等(Cancer Lett.(1994)84,199-202)、胰腺癌(Flocke和Mannherz(Biochim.Biophys.Acta(1991)1076,273-281)和成胶质细胞瘤(Bardot等(Br.J.Cancer(1994)70,212-218))中观察到活性的上升。癌组织中的腺苷的蓄积被提出可能起因于细胞质的5'-核苷酸酶所致的AMP的脱磷酸引起的细胞内腺苷生成的增加(Headrick和Willis(Biochem.J.(1989)261,541-550)。进而，浸润于癌组织的抑制性T细胞等也表达ATP分解酶，从而产生腺苷(Proc.Natl.Acad.Sci.(2006)103(35),13132-13137、Curr.Med.Chem.(2011)18,5217-5223)。认为产生的腺苷通过A2A受体等腺苷受体而使癌组织成为免疫抑制性环境(Curr.Med.Chem.(2011),18,5217-23)。作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物的非限定的一个方案，优选可举出通过这种ATP等嘌呤核苷酸的代谢在癌组织中以高浓度蓄积的ATP、ADP、AMP、或腺苷等。进而，腺苷通过腺苷脱氨酶分解为肌苷，因而肌苷以高浓度蓄积。
(6)尿酸
尿酸是机体内的嘌呤核苷的代谢通路的产物，且被释放至血液或间质腔等细胞外。此外，近年来明确了其由存在于癌组织等病变部位的死细胞所释放(Nat.Med.(2007)13,851-856)。作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物的非限定的一个方案，还优选可举出通过这种ATP等嘌呤核苷酸的代谢而在癌组织中以高浓度蓄积的尿酸。
(7)1-甲基烟酰胺已知在多个人癌组织中，酶烟酰胺N-甲基转移酶有高表达。本酶由烟酰胺产生稳定代谢物1-甲基烟酰胺时，会消耗作为甲基供体的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基，因此提出通过伴随癌细胞中SAM浓度的减少的损害DNA的甲基化能力的机制，烟酰胺N-甲基转移酶的高表达有助于肿瘤化(tumorigenesis)(Ulanovskaya等(Nat.Chem.Biol.(2013)9(5)300-306))。已知本酶的稳定代谢产物1-甲基烟酰胺分泌至癌细胞的细胞外(Yamada等(J.Nutr.Sci.Vitaminol.(2010)56,83-86))，作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物的非限定的一个方案，还优选可举出通过这种烟酰胺的代谢而在癌组织以高浓度蓄积的1-甲基烟酰胺等。
炎症组织特异性化合物
本说明书中使用的术语“炎症组织特异性的化合物(炎症组织特异性化合物)”是指与非炎症组织相比在炎症组织中差异地存在的化合物。本说明书中，“炎症组织”是指例如如下例示性举出的。
·风湿性关节炎、变形性关节炎中的关节
·支气管哮喘、COPD中的肺(肺胞)
·炎性肠疾病、克隆病、溃疡性结肠炎中的消化器官
·肝脏、肾脏、肺的纤维化病中的纤维化组织
·发生了脏器移植中的排斥反应的组织
·动脉硬化、心力衰竭中的血管、心脏(心肌)
·代谢综合征中的内脏脂肪
·特应性皮炎等皮炎中的皮肤组织
·椎间盘脱出、慢性腰痛中的脊髓神经。
炎症组织特异性代谢产物
炎症组织特异性代谢产物是指浸润于炎性组织的免疫细胞大量产生的代谢产物、和在炎症组织中受伤害的正常细胞特异性地大量产生的代谢产物。作为浸润的免疫细胞，例示有效应T细胞、成熟树突细胞、嗜中性粒细胞、颗粒细胞(肥大细胞)、嗜碱性粒细胞等。另外，本发明中的代谢产物还包括：炎症组织中存在的细胞(免疫细胞、正常细胞)由于凋亡、坏死等而发生细胞死亡时从细胞内释放至细胞外的化合物。
作为本发明中所使用的炎症组织特异性化合物、或炎症组织特异性代谢产物的非限定的一个方案，优选可举出选自以下化合物中的至少一种化合物。至少一种化合物意指后述相同的抗原结合结构域的抗原结合活性除了依赖于一种炎症组织特异性化合物、或炎症组织特异性代谢产物的情形，还包括依赖于多种炎症组织特异性化合物、或炎症组织特异性代谢产物的情形。
(1)前列腺素E2(Prostaglandin E2)等花生四烯酸的代谢产物已知在风湿性关节炎、变形性关节炎中，PGE2的浓度高(Eur.J.Clin.Pharmacol.(1994)46,3-7.、Clin.Exp.Rheumatol.(1999)17,151-160、Am.J.Vet.Res.(2004)65,1269-1275.)。作为本发明中所使用的炎症组织特异性化合物、特别是炎症细胞特异性代谢产物、浸润于炎症组织的免疫细胞特异性代谢物的非限定的一个方案，优选可举出这种前列腺素E2等花生四烯酸的代谢产物。
(2)腺苷、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)等具有嘌呤环结 构的核苷已知在发生了起因于支气管哮喘的炎症的肺胞中，ATP的浓度高(Nat.Med.(2007)13,913-919)。另外，还已知在发生了起因于COPD的炎症的肺胞中，ATP的浓度高(Am.J.Respir.Crit.Care Med.(2010)181,928-934)。另外，还观察到在风湿性关节炎患者的关节液中腺苷的浓度高(Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis(2004)36877-882)。进而还已知在因GVHD而发生了排斥反应的的组织中ATP的浓度高(Nat.Med.(2010)16,1434-1438)。另外，还已知在肺、肝脏、肾脏的纤维化组织中，腺苷的浓度亢进(FASEB J.(2008)22,2263-2272、J.Immunol.(2006)176,4449-4458、J.Am.Soc.Nephrol.(2011)22(5),890-901、PLoS ONE J.(2010)5(2),e9242)。另外还观察到在肺纤维症患者的纤维化组织中ATP的浓度上升(Am.J.Respir.Crit.Care Med.(2010)182,774-783)。作为本发明中使用的炎性组织特异性化合物的非限定的一个方案，优选可举出通过这种ATP等嘌呤核苷酸的代谢在炎症组织中以高浓度蓄积的ATP、ADP、AMP、或腺苷等。进而，腺苷通过腺苷脱氨酶分解为肌苷，因而肌苷以高浓度蓄积。
(3)尿酸
尿酸是机体内的嘌呤核苷的代谢通路的产物，且被释放至血液或间质腔等细胞外。另外，近年来已明确从坏死(necrosis)进行的细胞游离出的尿酸会促进炎性应答(J.Clin.Invest.(2010)120(6),1939-1949)。作为本发明中所使用的炎症组织特异性化合物的非限定的一个方案，还优选可举出通过这种ATP等嘌呤核苷酸的代谢而在炎性组织中以高浓度蓄积的尿酸。
抗原结合结构域
本说明书中，“抗原结合结构域”只要与目标抗原结合，则还可以使用任意结构的结构域。作为这类结构域的例子，可优选举出例如：抗体的重链和轻链的可变区、机体内存在的细胞膜蛋白Avimer中所含的35个氨基酸左右的被称为A结构域的组件(国际公开WO2004/044011、WO2005/040229)、含有与在细胞膜表达的糖蛋白fibronectin中的蛋白结合的结构域10Fn3结构域的Adnectin(国际公开WO2002/032925)、以构成ProteinA的包含58氨基酸的3个螺旋束(bundle)的IgG结合结构域为scaffold的Affibody(国际公开WO1995/001937)、具有含33个氨基酸残基的转角与2个反向平行螺旋和环的亚基重复重叠而成的结构的锚蛋白重复序列(ankyrin repeat：AR)的分子表面露出的区域即DARPins(DesignedAnkyrin Repeat proteins)(国际公开WO2002/020565)、支持嗜中性粒细胞明胶酶结合脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等脂质运载蛋白分子中高度保守的8个反向平行链在中央方向上扭曲的桶结构的单侧的4个环区域即Anticalin等(国际公开WO2003/029462)、作为七鳃鳗、八目鳗等无颚类的获得免疫系统且不具有免疫球蛋白结构的可变性淋巴细胞受体(variable lymphocyte receptor(VLR))的亮氨酸残基富集重复(leucine-rich-repeat(LRR))组件反复重叠而成的马蹄铁形的结构内部的平行型片结构的凹陷区域(国际公开WO2008/016854)。
作为本发明的抗原结合结构域的优选实例，可举出含有抗体的重链和轻链的可变区的抗原结合结构域。作为这种抗原结合结构域的实例，优选可举出“scFv(单链Fv)”、“单链抗体”、“Fv”、“scFv2(单链Fv 2)”、“Fab”或“F(ab')2”等。
本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相同的表位结合。这里，相同的表位可以存在于例如包含序列编号：1所述的氨基酸序列的蛋白质中。或者，本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与彼此不同的表位结合。这里，不同的表位可以存在于例如包含序列编号：1所述的氨基酸序列的蛋白质中。
特异性
特异性是指特异性地结合的分子一方的分子对于其一个或多个结合对象分子以外的分子实质上不结合的状态。另外，也可以用于抗原结合结构域对某抗原中所含的多个表位中特定的表位为特异性的情形。另外，抗原结合结构域所结合的表位含有在多个不同的抗原中时，具有该抗原结合结构域的抗原结合分子可以与含有该表位的各种抗原结合。这里，实质上不结合是指按照上述结合活性一项所记载的方法确定，特异性结合分子相对于前述对象分子以外的分子的结合活性显示为相对于前述对象分子的结合活性的80％以下、通常50％以下、优选30％以下、特别优选15％以下的结合活性。
细胞毒性
本发明的非限定的一个方案中，提供含有抗原结合活性根据低分子化合物(例如，癌组织特异性化合物、炎症组织特异性化合物、或它们的代谢物)的浓度而变化的抗原结合结构域，并对在其细胞膜上表达膜型分子的细胞具有细胞毒性的抗原结合分子、和含有该抗原结合分子作为有效成分的药物组合物。本发明中，细胞毒性可举出例如：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)、补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity：CDC)和T细胞所致的细胞毒性等。本发明中，CDC活性意指补体系统所致的细胞毒性。另一方面，ADCC活性意指免疫细胞等通过表达于该免疫细胞的Fcγ受体而结合至含有与表达于靶细胞的细胞膜的膜型分子结合的抗原结合结构域的抗原结合分子的Fc区，从而该免疫细胞对靶细胞造成伤害的活性。目标抗原结合分子具有ADCC活性与否、或具有CDC活性与否可通过公知的方法测定(例如，Currentprotocols in Immunology,Chapter7.Immunologic studies in humans，Coligan等编(1993)等)。
具体地，首先，实施效应细胞、补体溶液、靶细胞的制备。
(1)效应细胞的制备由摘取自CBA/N小鼠等的脾脏，在RPMI1640培养基(Invitrogen)中分离脾脏细胞。将经含10％胎牛血清(FBS、HyClone)的相同培养基清洗的该脾脏细胞的浓度调整至5×106/mL，由此可制备效应细胞。
(2)补体溶液的制备
用含10％FBS的培养基(Invitrogen)将Baby Rabbit Complement(CEDARLANE)稀释10倍，可以制备补体溶液。
(3)靶细胞的制备
将表达抗原的细胞与0.2mCi的51Cr-铬酸钠(GE Healthcare Bio-Sciences)一起在含10％FBS的DMEM培养基中于37℃培养1小时，由此可将该靶细胞放射性标记。放射性标记后，用含10％FBS的RPMI1640培养基清洗3次，将细胞的浓度调整为2×105/mL，由此可制备该靶细胞。
ADCC活性或CDC活性可通过以下所述的方法测定。ADCC活性的测定时，使加入至96孔U底培养板(Becton Dickinson)的各50μl的靶细胞与抗原结合分子在室温反应15分钟。然后，将加入有效应细胞100μl的该培养板在二氧化碳培养箱内静置4小时。抗原结合分子的终浓度可以设定为例如0或10μg/ml等的浓度。静置后，使用伽马计数器(COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company)测定由各孔回收的100μl上清的放射活性。使用测定值，基于(A-C)/(B-C)x 100的计算式可计算细胞毒性(％)。A表示各试样的放射活性(cpm)、B表示加入了1％NP-40(nacalai tesque)的试样的放射活性(cpm)、C表示仅含靶细胞的试样的放射活性(cpm)。
另一方面，CDC活性的测定时，使加入至96孔平底培养板(Becton Dickinson)的各50μl的靶细胞与抗原结合分子在冰上反应15分钟。然后，将加入有补体溶液100μl的该培养板在二氧化碳培养箱内静置4小时。抗原结合分子的终浓度可设定为例如0或3μg/mL等的浓度。静置后，使用伽马计数器测定由各孔回收的100μl上清的放射活性。细胞毒性可与ADCC活性测定相同地计算。
此外，结合有后述的化学治疗药、毒性肽或放射性化学物质等细胞伤害性物质的修饰抗原结合分子修饰物也可适宜地用作本发明的具有细胞毒性的抗原结合分子。这种修饰抗原结合分子(以下，称为抗原结合分子药物缀合物)可通过对所得抗原结合分子进行化学修饰而获得。另外，作为抗原结合分子的修饰方法，可适宜使用在抗体药物缀合物等领域中已经确立的方法。此外，结合有毒性肽的修饰抗原结合分子可通过将编码该毒性肽的基因与编码本发明的抗原结合分子的基因框内连接得到的融合基因在适当的宿主细胞中表达后，从该细胞的培养液中分离而获得。
中和活性
在本发明的非限定的一个方案中，提供诱导免疫应答的药物组合物，该组合物含有抗原结合分子作为有效成分，该抗原结合分子含有抗原结合活性根据癌组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域，且对该膜型分子具有中和活性。本发明的非限定的另一方案中，提供诱导免疫应答的药物组合物，该组合物含有抗原结合分子作为有效成分，该抗原结合分子含有抗原结合活性根据低分子化合物(例如，癌组织特异性化合物、炎症组织特异性化合物、它们的代谢物等)的浓度而变化的抗原结合结构域，并且除了对在其细胞膜上表达膜型分子的细胞具有细胞毒性之外，还对该膜型分子具有中和活性。通常，中和活性是指抑制病毒或毒素等对细胞具有生物学活性的配体的该生物学活性的活性。即，具有中和活性的物质是指与该配体或该配体所结合的受体结合，而抑制该配体与受体的结合的物质。与配体的结合被中和活性阻断的受体变得不能通过该受体发挥生物学活性。抗原结合分子为抗体时，具有这种中和活性的抗体通常被称作中和抗体。某被测物质的中和活性可通过在该被测物质的存在或非存在下的条件之间比较配体存在下的生物学活性来测定。
例如，作为IL-6受体的主要配体，优选可举出SEQ ID NO:27所示的IL-6。其氨基末端形成细胞外结构域的I型膜蛋白即IL-6受体会与由IL-6诱导了二聚体化的gp130受体一起形成异源四聚体(Heinrich等(Biochem.J.(1998)334,297-314))。由于该异源四聚体的形成，与gp130受体缀合的Jak被活化。Jak进行自身磷酸化与受体的磷酸化。受体和Jak的磷酸化位点对Stat3之类的属于具有SH2的Stat家族的分子、MAP激酶、PI3/Akt、其它的具有SH2的蛋白或接头发挥结合位点的功能。接着，结合于gp130受体的Stat被Jak磷酸化。经磷酸化的Stat形成二聚体而移动至核内，调节靶基因的转录。Jak或Stat还可经由其它种类的受体而参与信号级联。解除控制的IL-6的信号级联在自身免疫疾病的病态或炎症、多发性骨髓瘤或前列腺癌等癌中被观察到。可作为癌基因起作用的Stat3在许多癌中恒定地活化。在前列腺癌与多发性骨髓瘤中，来自IL-6受体的信号级联与来自上皮生长因子受体(EGFR)家族成员的信号级联之间存在串扰(Ishikawa等(J.Clin.Exp.Hematopathol.(2006)46(2),55-66))。
这种细胞内的信号级联根据细胞种类而不同，因此可以根据目标靶细胞适宜设定靶分子，并不限定于上述因子。通过测定生物体内信号的活化，可以评价中和活性。此外，还可以将对存在于生物体内信号级联的下游的靶基因的转录诱导作用作为指标来检测生物体内信号的活化。靶基因的转录活性的变化可通过报告测定(reporter assay)的原理来检测。具体地，在靶基因的转录因子或启动子区域的下游配置GFP(Green FluorescenceProtein，绿色荧光蛋白)或荧光素酶等报告基因，并测定其报告活性，由此可以以报告活性的方式测定转录活性的变化。生物体内信号的活化的测定试剂盒可适宜使用市售品(例如，Mercury Pathway Profiling Luciferase System(Clontech)等)。
进而，作为测定作用于通常在促进细胞增殖的方向上工作的信号级联的EGF受体家族等受体配体的中和活性的方法，可通过测定目标细胞的增殖活性来评价抗原结合分子的中和活性。例如，作为评价或测定相对于例如HB-EGF等其增殖被EGF家族的生长因子所促进的细胞的增殖的、基于抗HB-EGF抗体的中和活性的抑制效果的方法，可适宜使用以下的方法。作为在试管内评价或测定该细胞增殖抑制活性的方法，可以采用以活细胞对添加于培养基中的[3H]标记胸苷的摄入作为DNA复制能力的指标来进行测定的方法。作为更简便的方法，还可采用在显微镜下测量将台盼蓝等色素排除至细胞外的能力的色素排除法或MTT法。后者利用了活细胞具有将作为四唑盐的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)转变为蓝色的甲
Figure BDA0002407382280000391
产物的能力。更具体地，将被测抗体与配体一起添加至被测细胞的培养液中，经过一定时间后，将MTT溶液加入培养液中，静置一定时间，由此使MTT进入细胞。结果，黄色化合物MTT被细胞内线粒体内的琥珀酸脱氢酶转变为蓝色的化合物。使该蓝色产物溶解并显色后测定其吸光度，从而作为活细胞数的指标。除了MTT以外，MTS、XTT、WST-1、WST-8等试剂也有市售(nacalai tesque等)而可适宜使用。在活性测定时，可以与抗HB-EGF抗体相同地使用与抗HB-EGF抗体具有相同的同种型但不具有该细胞增殖抑制活性的结合抗体作为对照抗体，通过抗HB-EGF抗体较对照抗体显示出更强的细胞增殖抑制活性来判定活性。
作为用于评价活性的细胞，还可适宜使用例如：其增殖被HB-EGF促进的细胞即卵巢癌细胞RMG-1细胞株、利用以表达的方式结合了编码将人EGFR的细胞外结构域与小鼠G-CSF受体的细胞内结构域框内融合得到的融合蛋白hEGFR/mG-CSFR的基因的载体转化的小鼠Ba/F3细胞等。这样，本领域技术人员通过适宜选择用于评价活性的细胞，可以用于测定前述的细胞增殖活性。
抗体
本说明书中，抗体是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成制造的免疫球蛋白。抗体可从天然存在其的血浆、血清等天然资源或产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中分离得到，或者通过使用基因重组等方法而部分或完全合成。作为抗体的实例，优选可举出：免疫球蛋白的同种型和这些同种型的亚类。作为人的免疫球蛋白，已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类型(同种型)。本发明的抗体中可包含这些同种型中的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。作为人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4恒定区，由基因多态性形成的多个同种异型序列记载在Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242中，但在本发明中可以是其中的任一种。特别是，作为人IgG1的序列，以EU编号表示的356-358位氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。此外，作为人Igκ(Kappa)恒定区和人Igλ(Lambda)恒定区，由基因多态性形成的多个同种异型序列记载在Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242中，但在本发明可以是其中的任一种。
制造具有所期望结合活性的抗体的方法对本领域技术人员来说是公知的。以下例示与IL-6R结合的抗体(抗IL-6R抗体)的制作方法。与IL-6R以外的抗原结合的抗体也可以根据下述例示而适宜制作。
抗IL-6R抗体可以使用公知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式获得。作为抗IL-6R抗体，可优选制作来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体包含：由杂交瘤产生的单克隆抗体、和利用基因工程技术通过用含有抗体基因的表达载体进行了转化的宿主细胞产生的单克隆抗体等。应予说明，本申请发明的单克隆抗体包含“人源化抗体”和“嵌合抗体”。
产生单克隆抗体的杂交瘤可以通过使用公知技术，例如如下所示来制作。即，使用IL-6R蛋白作为敏化抗原，按照通常的免疫方法来免疫哺乳动物。通过通常的细胞融合法，将所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合。接着，通过通常的筛选方法筛选单克隆的抗体产生细胞，由此可以选择出产生抗IL-6R抗体的杂交瘤。
具体地，单克隆抗体的制作例如如下所示地进行。首先，表达其核苷酸序列公开在序列编号：2中的IL-6R基因，由此可得到由序列编号：1表示的IL-6R蛋白，其用作敏化抗原用于抗体制备。即，将编码IL-6R的基因序列插入公知的表达载体，由此转化适当的宿主细胞。以公知的方法从该宿主细胞中或培养上清中纯化所期望的人IL-6R蛋白。为了从培养上清中获得可溶型的IL-6R，代替由序列编号：1表示的IL-6R蛋白，表达了例如，如Mullberg等(J.Immunol.(1994)152(10),4958-4968)所记载的可溶型IL-6R、即，由序列编号：1表示的IL-6R多肽序列中的第1至357个氨基酸构成的蛋白质。另外，纯化的天然IL-6R蛋白也可以同样地用作敏化抗原。
作为用于免疫哺乳动物的敏化抗原，可使用该纯化IL-6R蛋白。另外，IL-6R的部分肽也可以用作敏化抗原。此时，该部分肽也可以根据人IL-6R的氨基酸序列通过化学合成获得。另外，也可以通过将IL-6R基因的一部分整合至表达载体并进行表达来获得。进而，还可以使用蛋白质分解酶分解IL-6R蛋白来获得，用作部分肽的IL-6R肽的区域和大小并不特别限于特定的方案。对于优选的区域，可以从序列编号：1的氨基酸序列中相当于第20-357个氨基酸的氨基酸序列中选择任意的序列。构成作为敏化抗原的肽的氨基酸的数目优选为至少5个以上、例如6个以上、或7个以上。更具体地，可以将8～50、优选10～30个残基的肽用作敏化抗原。
另外，也可以将IL-6R蛋白的所期望的部分多肽或肽与不同的多肽进行融合而得的融合蛋白用作敏化抗原。为了制造用作敏化抗原的融合蛋白，例如，可以优选利用抗体的Fc片段或肽标签等。表达融合蛋白的载体可如下制作：将编码所期望的两种或两种以上的多肽片段的基因框内融合，将该融合基因如前所述地插入表达载体。融合蛋白的制作方法记载于Molecular Cloning 2nd ed.(Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nd ed.,9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab.press)。作为用作敏化抗原的IL-6R的获得方法和使用它的免疫方法也具体记载于国际公开WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等中。
作为用该敏化抗原免疫的哺乳动物，并不限定于特定的动物，优选考虑与细胞融合中使用的亲本细胞的适应性来选择。通常优选使用啮齿类的动物，例如，小鼠、大鼠、仓鼠、或兔、猴等。
按照公知的方法将上述动物用敏化抗原免疫。例如，作为通常的方法，通过将敏化抗原注射至哺乳动物的腹腔内或皮下来实施免疫。具体地，将用PBS(Phosphate-BufferedSaline)或生理盐水等以适当稀释倍率稀释的敏化抗原根据需要与通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂混合，在乳化后将该敏化抗原对哺乳动物每4至21日给予数次。另外，敏化抗原免疫时可以使用适当的载体。特别是将分子量小的部分肽用作敏化抗原时，有时期望将与白蛋白、匙孔血蓝蛋白等载体蛋白质结合的该敏化抗原肽进行免疫。
另外，产生所期望抗体的杂交瘤可通过使用DNA免疫，如下所示来制作。DNA免疫是指下述免疫方法：被给予了以能在免疫动物中表达编码抗原蛋白的基因的方式构建的载体DNA的该免疫动物中，敏化抗原在该免疫动物的机体内表达，由此赋予免疫刺激。与将蛋白质抗原给予免疫动物的通常的免疫方法相比，DNA免疫期待如下优越性。
-能够维持IL-6R之类的膜蛋白的结构而赋予免疫刺激
-无需纯化免疫抗原
为了通过DNA免疫获得本发明的单克隆抗体，首先，对免疫动物给予表达IL-6R蛋白的DNA。编码IL-6R的DNA可通过PCR等公知方法合成。将所得DNA插入适当的表达载体，给予免疫动物。作为表达载体，可优选利用例如pcDNA3.1等市售的表达载体。作为将载体给予机体的方法，可采用通常所使用的方法。例如，将吸附有表达载体的金粒子用基因枪导入免疫动物个体的细胞内，由此进行DNA免疫。进而，识别IL-6R的抗体的制作也可以采用国际公开WO2003/104453中记载的方法来制作。
如此将哺乳动物免疫，确认到血清中与IL-6R结合的抗体效价的上升后，从哺乳动物采集免疫细胞，供细胞融合。作为优选的免疫细胞，特别可使用脾细胞。
作为与前述免疫细胞融合的细胞，可使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具备用于筛选的适当的选择标记物。选择标记物指的是赋予细胞能够在特定培养条件下存活(或死亡)的性质。选择标记物中，公知的是次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺陷(以下简称为HGPRT缺陷)、或胸苷激酶缺陷(以下简称为TK缺陷)等。具有HGPRT、TK缺陷的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下简称为HAT敏感性)。HAT敏感性的细胞不能在HAT选择培养基中进行DNA合成而会死亡，但若与正常细胞发生融合，则可利用正常细胞的补救途径继续DNA的合成，因此在HAT选择培养基中也会增殖。
HGPRT缺陷、TK缺陷的细胞各自可通过含有6硫代鸟嘌呤、8氮杂鸟嘌呤(以下简称为8AG)、或5'溴脱氧尿苷的培养基来选择。DNA中整合有这些嘧啶类似物的正常细胞会死亡。而无法整合这些嘧啶类似物的缺乏上述酶的细胞则可以在选择培养基中存活。此外，被称为G418抗性的选择标记物可通过新霉素抗性基因赋予针对2-脱氧链霉胺系抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。细胞融合中优选的各种骨髓瘤细胞是公知的。
作为这类骨髓瘤细胞，可优选使用，例如，P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4),1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7),511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3),405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685),269-270)、FO(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2),1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1),313-323)、R210(Nature(1979)277(5692),131-133)等。
基本上，根据公知方法，例如Kohler和Milstein等的方法(Methods Enzymol.(1981)73,3-46)等，进行前述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。
更具体地，例如，可以在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中实施前述细胞融合。作为融合促进剂，使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，进而为了提高融合效率，根据期望添加二甲基亚砜等助剂使用。
免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞，优选使免疫细胞为1至10倍。作为用于前述细胞融合的培养液，使用例如适于前述骨髓瘤细胞株的增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、以及用于此种细胞培养的通常的培养液，进而可优选添加胎牛血清(FCS)等血清补液。
对于细胞融合，将前述免疫细胞和骨髓瘤细胞在前述培养液中以规定量充分混合，将预先加热至37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)通常以30至60％(w/v)的浓度添加。通过缓缓混合混合液，形成所期望的融合细胞(杂交瘤)。接着，依次添加上述列举的适当的培养液，通过重复进行离心除去上清的操作，可以除去对杂交瘤的生长不利的细胞融合剂等。
这样得到的杂交瘤可通过用通常的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来进行选择。使用上述HAT培养液的培养可持续足够所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间(通常，所述足够的时间为数天至数周)。接着，通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
如此得到的杂交瘤可通过使用对应于用于细胞融合的骨髓瘤所具有的选择标记物的选择培养液来进行选择。例如，具有HGPRT、TK缺陷的细胞可以通过用HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来进行选择。即，在细胞融合中使用HAT敏感性的骨髓瘤细胞时，在HAT培养液中，与正常细胞的细胞融合成功了的细胞可选择性地增殖。使用上述HAT培养液的培养可以持续足够所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间。具体地，通常通过数天至数周的培养，可以选择所期望的杂交瘤。接着，可通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
所期望抗体的筛选和单克隆优选可通过公知的基于抗原抗体反应的筛选方法来实施。例如，与IL-6R结合的单克隆抗体可以与细胞表面表达的IL-6R结合。这类单克隆抗体可通过例如FACS(fluorescence activated cell sorting，荧光活化细胞分选系统)来筛选。FACS是可以用激光分析与荧光抗体接触的细胞、测定各细胞发出的荧光从而可以测定抗体对细胞表面的结合的系统。
为了利用FACS来对产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤进行筛选，首先制备表达IL-6R的细胞。优选用于筛选的细胞是强制表达IL-6R的哺乳动物细胞。作为对照，通过使用用作宿主细胞的未转化的哺乳动物细胞，可以选择性地检测出抗体对细胞表面的IL-6R的结合活性。即，通过选择产生不与宿主细胞结合、而与IL-6R强制表达细胞结合的抗体的杂交瘤，可以获得产生IL-6R单克隆抗体的杂交瘤。
或者，可以基于ELISA的原理来评价抗体对固定化的IL-6R表达细胞的结合活性。例如，将IL-6R表达细胞固定于ELISA板的孔中。使杂交瘤的培养上清与孔内的固定化细胞接触，检出与固定化细胞结合的抗体。单克隆抗体来源于小鼠时，与细胞结合的抗体可通过抗小鼠免疫球蛋白抗体检出。通过这些筛选选择出的、产生对抗原具有结合能力的所期望的抗体的杂交瘤可以通过有限稀释方法等进行克隆。
这样制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中传代培养。另外，该杂交瘤可以在液氮中长期保存。
按照通常的方法培养该杂交瘤，可从其培养上清中获得所期望的单克隆抗体。或者，可以将杂交瘤给予和其具有适应性的哺乳动物并使其增殖，从其腹水中获得单克隆抗体。前者的方法适于获得高纯度的抗体。
也可以适宜地使用由从该杂交瘤等抗体产生细胞克隆的抗体基因编码的抗体。将克隆的抗体基因整合至适当的载体中，导入宿主，由此表达由该基因所编码的抗体。用于抗体基因的分离、向载体中的导入、以及宿主细胞的转化的方法已经由例如Vandamme等确立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3),767-775)。另外，如下所述的重组抗体的制造方法也是公知的。
例如，由产生抗IL-6R抗体的杂交瘤细胞获得编码抗IL-6R抗体的可变区(V区域)的cDNA。为此，通常首选从杂交瘤提取总RNA。作为用于从细胞提取mRNA的方法，例如，可使用如下所述的方法。
-胍超离心法(Biochemistry(1979)18(24),5294-5299)
-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1),156-159)
提取的mRNA可使用mRNA Purification Kit(GE Healthcare Bioscience制)等进行纯化。或者还市售有QuickPrep mRNA Purification Kit(GE Healthcare Bioscience制)等这样的用于从细胞直接提取总mRNA的试剂盒。使用这种试剂盒，可从杂交瘤获得mRNA。可以由所得mRNA，使用反转录酶来合成编码抗体V区域的cDNA。cDNA可通过AMVReverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化学工业社制)等合成。另外，为了cDNA的合成和扩增，可以适宜采用使用了SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech制)和PCR的5’-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85(23),8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989)17(8),2919-2932)。进而，可以在这种cDNA的合成过程中向cDNA的两末端导入后述适合的限制酶位点。
从所得PCR产物纯化出目标cDNA片段，接着与载体DNA连接。如此制作重组载体，并导入大肠杆菌等中，选择菌落后，可以由形成该菌落的大肠杆菌制备所期望的重组载体。而且，对于该重组载体是否具有目标cDNA的碱基序列，可以通过公知的方法，例如，双脱氧核苷酸链终止法等来确认。
为了获得编码可变区的基因，简便的是利用5’-RACE法，其中使用了可变区基因扩增用的引物。首先，将从杂交瘤细胞提取的RNA作为模板来合成cDNA，获得5’-RACE cDNA文库。5’-RACE cDNA文库的合成中可适宜地使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒等市售的试剂盒。
以所得的5’-RACE cDNA文库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。基于公知的抗体基因序列，可设计小鼠抗体基因扩增用的引物。这些引物根据免疫球蛋白的亚类而具有不同的碱基序列。因此，理想的是使用Iso Strip小鼠单克隆抗体亚类检测试剂盒(ロシュ·ダイアグノスティックス)等市售试剂盒来预先确定亚类。
具体地，例如为了获得编码小鼠IgG的基因时，可以使用下述引物，其能够扩增编码作为重链的γ1、γ2a、γ2b、γ3、作为轻链的κ链和λ链的基因。为了扩增IgG的可变区基因，通常，3'侧的引物采用会退火到相当于接近可变区的恒定区的部分上的引物。而5'侧的引物则采用5’RACE cDNA文库制作试剂盒所附带的引物。
采用这样扩增得到的PCR产物，可以重构由重链和轻链的组合构成的免疫球蛋白。将经重构的免疫球蛋白的针对IL-6R的结合活性作为指标，可筛选所期望的抗体。例如，为了获得针对IL-6R的抗体时，进一步优选抗体对IL-6R的结合是特异性的。与IL-6R结合的抗体例如可如下所述进行筛选：
步骤(1)，使包含由杂交瘤获得的cDNA所编码的V区的抗体与表达IL-6R的细胞接触；
步骤(2)，检测表达IL-6R的细胞与抗体的结合；和
步骤(3)，选择与表达IL-6R的细胞结合的抗体。
检测抗体和IL-6R表达细胞的结合的方法是公知的。具体地，通过如前所述的FACS等方法，可检测出抗体与IL-6R表达细胞的结合。为了评价抗体的结合活性，可适宜利用IL-6R表达细胞的固定标本。
作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，还可适宜采用淘选法，其利用了噬菌体载体。从多克隆抗体表达细胞群以重链和轻链的亚类的文库的形式获得抗体基因时，有利的是利用噬菌体载体的筛选方法。编码重链和轻链的可变区的基因通过用适当的接头序列连接，可形成单链Fv(scFv)。通过将编码scFv的基因插入噬菌体载体，可以获得在表面表达scFv的噬菌体。该噬菌体与所期望的抗原接触后，回收与抗原的噬菌体，从而可以回收编码具有目标结合活性的scFv的DNA。通过根据需要重复该操作，可以浓缩具有所期望结合活性的scFv。
得到目标的编码抗IL-6R抗体的V区域的cDNA后，通过识别插入该cDNA的两末端的限制酶位点的限制酶，将该cDNA消化。优选的限制酶会识别并消化在构成抗体基因的碱基序列中出现频率低的碱基序列。进而，为了将1拷贝的消化片段以正确方向插入载体，优选插入能提供粘性末端的限制酶。将如上所述消化的编码抗IL-6R抗体的V区域的cDNA插入适当的表达载体，由此可获得抗体表达载体。此时，只要将编码抗体恒定区(C区域)的基因、和编码前述V区域的基因框内融合，则可获得嵌合抗体。这里，嵌合抗体是指恒定区和可变区的来源不同。因此，除了小鼠-人等异种嵌合抗体之外，人-人同种嵌合抗体也包含在本发明的嵌合抗体中。通过在预先具有恒定区的表达载体中插入前述V区域基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体地，例如，可在保持有编码所期望抗体恒定区的DNA的表达载体的5’侧适宜地配置消化前述V区域基因的限制酶的限制酶识别序列。对经相同组合的限制酶消化的两者进行框内融合，由此构建嵌合抗体表达载体。
为了制造抗IL-6R单克隆抗体，以在表达调控区的调控下进行表达的方式，将抗体基因整合至表达载体中。用于表达抗体的表达调控区包含例如增强子和启动子。另外，可以在氨基酸末端添加合适的信号序列，以使表达的抗体分泌到细胞外。在后述实施例中，作为信号序列使用了具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(序列编号：3)的肽，除此之外也可以添加合适的信号序列。表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切断，被切断的多肽能够以成熟多肽的形式分泌到细胞外。接着，用该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可以获得表达编码抗IL-6R抗体的DNA的重组细胞。
为了表达抗体基因，编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA被分别整合于不同的表达载体中。通过用整合有H链和L链的载体同时转化(co-transfect)相同的宿主细胞，可以表达具备H链和L链的抗体分子。或者，也可以将编码H链和L链的DNA整合于单一的表达载体中，由此转化宿主细胞(参照国际公开WO 1994/011523)。
用于将分离的抗体基因导入适当的宿主来制作抗体的宿主细胞和表达载体的多个组合是公知的。这些表达系统均可用于分离本发明的抗原结合结构域。将真核细胞用作宿主细胞时，可适宜使用动物细胞、植物细胞、或真菌细胞。具体地，动物细胞可例示下述细胞。
(1)哺乳类细胞：CHO(中国仓鼠卵巢细胞株)、COS(猴肾细胞株)、骨髓瘤(Sp2/0、NS0等)、BHK(幼仓鼠肾细胞株)、Hela、Vero、HEK293(携带已剪切腺病毒(Ad)5DNA的人胚肾细胞株)、PER.C6细胞(用5型腺病毒(Ad5)E1A和E1B基因转化的人胚视网膜细胞株)等(Current Protocols in Protein Science(May,2001,Unit 5.9,Table 5.9.1))
(2)两栖动物细胞：非洲爪蟾卵母细胞等
(3)昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等
或者，作为植物细胞，公知有基于来源于烟草(Nicotiana tabacum)等烟草(Nicotiana)属的细胞的抗体基因表达系统。植物细胞的转化中，可以适宜使用进行了愈伤组织培养的细胞。
进而，作为真菌细胞，可以使用如下细胞。
-酵母：酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等酵母(Saccharomyces)属、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等毕赤酵母属；
-丝状真菌：黑曲霉菌(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)属。
另外，利用原核细胞的抗体基因表达系统也是公知的。例如，使用细菌细胞时，可适宜利用大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌等细菌细胞。通过转化向这些细胞中导入含有目标抗体基因的表达载体。通过在体外培养经转化的细胞，可以从该转化细胞的培养物中获得所期望的抗体。
除了上述宿主细胞之外，重组抗体的产生也可以利用转基因动物。即，可以从导入有编码所期望抗体的基因的动物获得该抗体。例如，抗体基因可以通过框内插入编码乳汁中固有产生的蛋白质的基因的内部，而构建为融合基因。作为分泌至乳汁中的蛋白质，可利用例如山羊β酪蛋白等。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎，再将该进行了注入的胚胎导入母山羊。由接受胚胎的山羊生出的转基因山羊(或其后代)产生的乳汁中，能够以与乳汁蛋白的融合蛋白的形式获得所期望的抗体。另外，为了使由转基因山羊产生的含有所期望抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊给予激素(Bio/Technology(1994),12(7),699-702)。
对人给予本说明书中记载的抗原结合分子时，作为该抗原结合分子中的抗原结合结构域，可以适宜采用来源于基因重组型抗体的抗原结合结构域，该基因重组型抗体为了降低针对人的异源抗原性等目的已进行了人工修饰。基因重组型抗体包含例如人源化(Humanized)抗体等。这些修饰抗体可使用公知方法适宜制造。
为了制作本说明书中记载的抗原结合分子的抗原结合结构域而使用的抗体的可变区通常由被4个框架区域(FR)夹持的3个互补决定区(complementarity-determiningregion；CDR)构成。CDR是实质上决定抗体结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列富有多样性。另一方面，构成FR的氨基酸序列即便是在具有不同结合特异性的抗体之间也多显示高度的同一性。因此，通常认为可以通过CDR的移植来将某抗体的结合特异性移植到其它抗体。
人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体。具体地，将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体中的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的通常的基因重组方法也是已知的。具体地，作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，公知的是例如Overlap Extension PCR。Overlap Extension PCR中，用于合成人抗体FR的引物中添加有编码待移植小鼠抗体CDR的碱基序列。针对4个FR分别准备引物。通常，对于将小鼠CDR移植到人FR中，选择与小鼠FR同一性高的人FR，在维持CDR功能方面被认为有利。即，通常优选使用下述人FR，其包含与待移植小鼠CDR的相邻FR氨基酸序列的同一性高的氨基酸序列。
另外，连接的碱基序列被设计为相互框内连接。通过各引物单独地合成人FR。结果得到各FR上添加有编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物的编码小鼠CDR的碱基序列被设计为相互重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠CDR部分相互退火，进行互补链合成反应。通过该反应，人FR通过小鼠CDR序列而连接。
最终3个CDR和4个FR连接得到的V区域基因，通过会与其5'末端和3'末端发生退火并添加有适当的限制酶识别序列的引物而扩增出其全长。将如上所述得到的DNA和编码人抗体C区域的DNA以进行框内融合的方式插入表达载体中，由此可以制作人型抗体表达用载体。将该整合载体导入宿主中建立重组细胞后，培养该重组细胞，通过表达编码该人源化抗体的DNA，从而在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(参照欧州专利公开EP239400、国际公开WO1996/002576)。
通过定性或者定量地测定并评价如上所述制作的人源化抗体对抗原的结合活性，可以适宜地选择人抗体FR，以便通过CDR连接时该CDR形成良好的抗原结合位点。根据需要，也可以按照重构人抗体CDR形成合适抗原结合位点的方式来置换FR的氨基酸残基。例如，可以应用将小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，向FR导入氨基酸序列的突变。具体地，可以向会与FR发生退火的引物中导入部分碱基序列的突变。通过这类引物合成的FR中导入了碱基序列的突变。通过用上述方法测定并评价进行了氨基酸置换的突变型抗体对抗原的结合活性，可以选择具有所期望性质的突变FR序列(Cancer Res.,(1993)53,851-856)。
另外，将具有人抗体基因的全部组成成分(repertoire)的转基因动物(参照国际公开WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)作为免疫动物，可以通过DNA免疫获得所期望的人抗体。
进而，使用人抗体文库通过淘选法获得人抗体的技术也是已知的。例如，人抗体的V区域以单链抗体(scFv)的形式通过噬菌体展示法表达在噬菌体的表面。可以选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过对选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体V区域的DNA序列。确定与抗原结合的scFv的DNA序列后，将该V区域序列与所期望的人抗体C区域序列框内融合后，插入适当的表达载体，由此可以制作表达载体。将该表达载体导入上述列举的适宜表达细胞中，通过使编码该人抗体的基因表达，可以获得该人抗体。这些方法已经公知(参照国际公开WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。
除了噬菌体展示法以外，作为使用人抗体文库通过淘选获得人抗体的技术，还已知使用无细胞翻译系统的技术、在细胞或病毒表面呈递抗原结合分子的技术、使用乳液的技术等。例如，作为使用无细胞翻译系统的技术，可以使用：通过终止密码子的除去等而经由核糖体形成mRNA与所翻译的蛋白质的复合体的核糖体展示法、利用嘌呤霉素等化合物而使基因序列与所翻译的蛋白质共价结合的cDNA展示法、mRNA展示法、或使用针对核酸的结合蛋白形成基因与所翻译的蛋白质的复合体的CIS展示法等。另外，作为在细胞或病毒表面呈递抗原结合分子的技术，除了噬菌体展示法以外，还可以使用E.coli展示法、革兰氏阳性菌展示法、酵母展示法、哺乳类细胞展示法、病毒展示法等。作为使用乳液的技术，可以使用基于在乳液中包含基因和翻译相关分子的体外病毒展示法等。这些方法已经公知(NatBiotechnol.2000Dec；18(12):1287-92、Nucleic Acids Res.2006；34(19):e127、ProcNatl Acad Sci U S A.2004Mar 2；101(9):2806-10、Proc Natl Acad Sci U S A.2004Jun22；101(25):9193-8、Protein Eng Des Sel.2008Apr；21(4):247-55、Proc Natl Acad SciU S A.2000Sep26；97(20):10701-5、MAbs.2010Sep-Oct；2(5):508-18、Methods MolBiol.2012；911:183-98)。
另外，作为获得抗体基因的方法，除了上述之外，还可以适宜地使用如Bernasconi等(Science(2002)298,2199-2202)或国际公开WO2008/081008中记载的B细胞克隆(各抗体的编码序列的鉴定和克隆、其分离、以及用于制备各抗体(特别是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的表达载体构建用的用途等)的方法。
另外，作为本发明中的抗体的非限定的一个方案，可举出：将识别抗原而不是识别T细胞受体的抗体或其片段与T细胞的信号结构域的融合体整合至T细胞而得的嵌合型抗原受体(Chimeric antigen receptor)以及整合有该嵌合型抗原受体的T细胞，但并不限定于此。
EU编号和Kabat编号
根据本发明中使用的方法，分配给抗体的CDR和FR的氨基酸位置依照Kabat规定(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute ofHealth,Bethesda,Md.,1987年和1991年)。本说明书中，抗原结合分子为抗体或抗原结合片段时，可变区的氨基酸按照Kabat编号来表示，恒定区的氨基酸按照基于Kabat氨基酸位置的EU编号来表示。
结合活性根据低分子化合物浓度而变化的抗原结合结构域
作为低分子化合物，可举出例如，靶组织特异性化合物或非天然化合物。以下例示靶组织特异性化合物依赖性的抗原结合结构域的选择方法等，但是靶组织特异性化合物以外的低分子化合物依赖性的抗原结合结构域的选择方法等也可以根据下述实例适宜实施。为了获得抗原结合活性根据靶组织特异性化合物的浓度而变化的抗原结合结构域(或含有该结构域的抗原结合分子)，可以适宜采用上述结合活性一项所示出的方法等。作为非限定的一个方案，以下例示数个其具体例。例如，为了确认与靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)对抗原的结合活性相比，该化合物的存在下的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)对抗原的结合活性变高，将靶组织特异性化合物的非存在下和存在下的、或低浓度存在下和高浓度存在下的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)对抗原的结合活性进行比较。在不同的非限定的一个方案中，例如，为了确认与靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)对抗原的结合活性相比，该化合物的高浓度存在下的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)对抗原的结合活性变高，将靶组织特异性化合物的低浓度存在下和高浓度存在下的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)对抗原的结合活性进行比较。
进而，在本发明中，“靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合活性较该化合物的非存在下的抗原结合活性高”的表述也可以表述为“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低”。另外，本发明中，有时也将“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低”记载为“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性弱”。
进而，在本发明中，“靶组织特异性化合物的高浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的低浓度存在下的抗原结合活性高”的表述也可以表述为“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低”。另外，本发明中，有时也将“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低”记载为“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性弱”。
测定抗原结合活性时的靶组织特异性化合物的浓度以外的条件，本领域技术人员可以适宜选择，并无特别限定。例如，可以在HEPES缓冲液、37℃的条件下进行测定。例如，可以使用Biacore(GE Healthcare)等进行测定。对于抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)与抗原的结合活性的测定，在抗原为可溶型分子时，通过对固定有抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的芯片加载抗原作为分析物，由此可以评价对可溶型分子的结合活性；在抗原为膜型分子时，通过对固定有抗原的芯片加载抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)作为分析物，由此可以评价对膜型分子的结合活性。
只要本发明的抗原结合分子中所含的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的、靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合活性弱，则该化合物的非存在下的抗原结合活性与该化合物存在下的抗原结合活性之比没有特别限定，优选相对于抗原的靶组织特异性化合物的非存在下的KD(Dissociation constant：解离常数)与存在下的KD之比即KD(化合物非存在下)/KD(化合物存在下)的值为2以上，进一步优选KD(化合物非存在下)/KD(化合物存在下)的值为10以上，进一步优选KD(化合物非存在下)/KD(化合物存在下)的值为40以上。KD(化合物非存在下)/KD(化合物存在下)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以为400、1000、10000等任意的值。在靶组织特异性化合物的非存在下未观察到抗原结合活性时，该上限为无限大的数值。
只要本发明的抗原结合分子中所含的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的、靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较靶组织特异性化合物的高浓度存在下的抗原结合活性弱，则该化合物的低浓度存在下的抗原结合活性与该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性之比没有特别限定，优选相对于抗原的靶组织特异性化合物的低浓度存在下的KD(Dissociation constant：解离常数)与高浓度存在下的KD之比即KD(化合物低浓度存在下)/KD(化合物高浓度存在下)的值为2以上，进一步优选KD(化合物低浓度存在下)/KD(化合物高浓度存在下)的值为10以上，进一步优选KD(化合物低浓度存在下)/KD(化合物高浓度存在下)的值为40以上。KD(化合物低浓度存在下)/KD(化合物高浓度存在下)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以为400、1000、10000等任意的值。在靶组织特异性化合物的低浓度存在下未观察到抗原结合活性时，该上限为无限大的数值。
作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型分子时可以使用KD(解离常数)，而在抗原为膜型分子时则可以使用表观KD(Apparent dissociation constant：表观解离常数)。KD(解离常数)、和表观KD(表观解离常数)可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图(Scatchard plot)、流式细胞仪等。
此外，作为表示本发明的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性与存在下的抗原结合活性之比的其它指标，例如也可以适宜使用解离速度常数kd(Dissociation rate constant：解离速度常数)。使用kd(解离速度常数)替代KD(解离常数)来作为表示结合活性之比的指标时，靶组织特异性化合物的非存在下的相对于抗原的kd(解离速度常数)与该化合物存在下的kd(解离速度常数)之比即kd(化合物非存在下)/kd(化合物存在下)的值优选为2以上，进一步优选为5以上，进一步优选为10以上，更优选为30以上。Kd(化合物非存在下)/kd(化合物存在下)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以为50、100、200等任意的值。在靶组织特异性化合物的非存在下未观察到抗原结合活性时，由于解离也不发生，故该上限为无限大的数值。
另外，作为表示本发明的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性与高浓度存在下的抗原结合活性之比的其它指标，例如也可以适宜使用解离速度常数kd(Dissociation rate constant：解离速度常数)。使用kd(解离速度常数)替代KD(解离常数)来作为表示结合活性之比的指标时，靶组织特异性化合物的低浓度存在下的相对于抗原的kd(解离速度常数)与该化合物高浓度存在下的kd(解离速度常数)之比即kd(化合物低浓度存在下)/kd(化合物高浓度存在下)的值优选为2以上，进一步优选为5以上，进一步优选为10以上，更优选为30以上。Kd(化合物低浓度存在下)/kd(化合物高浓度存在下)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以为50、100、200等任意的值。在靶组织特异性化合物的低浓度存在下未观察到抗原结合活性时，由于解离也不发生，故该上限为无限大的数值。
作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型分子时可以使用kd(解离速度常数)，在抗原为膜型分子时可以使用表观kd(Apparent dissociation rate constant：表观解离速度常数)。kd(解离速度常数)、和表观kd(表观解离速度常数)可通过本领域技术人员公知的方法测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式细胞仪等。另外，本发明中，在测定靶组织特异性化合物的某浓度下的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的抗原结合活性时，该化合物的浓度以外的条件优选设为相同。
例如，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)可以通过包括下述步骤(a)～(c)的抗原结合结构域(或抗原结合分子)的筛选来获得。
步骤(a)：获得靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合结构域(或抗原结合分子)的抗原结合活性；
步骤(b)：获得靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合结构域(或抗原结合分子)的抗原结合活性；
步骤(c)：选择靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性比该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或抗原结合分子)。
例如，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)可以通过包括下述步骤(a)～(c)的抗原结合结构域(或抗原结合分子)的筛选来获得。
步骤(a)：获得靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合结构域(或抗原结合分子)的抗原结合活性；
步骤(b)：获得靶组织特异性化合物的高浓度存在下的抗原结合结构域(或抗原结合分子)的抗原结合活性；
步骤(c)：选择靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性比该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或抗原结合分子)。
进而，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)可以通过包括下述步骤(a)～(c)的抗原结合结构域(或抗原结合分子)或者它们的文库的筛选来获得。
步骤(a)：使靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合结构域(或抗原结合分子)或者它们的文库与抗原接触；
步骤(b)：将在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域(或抗原结合分子)置于该化合物的非存在下；
步骤(c)：分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域(或抗原结合分子)。
进而，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)可以通过包括下述步骤(a)～(c)的抗原结合结构域(或抗原结合分子)或者它们的文库的筛选来获得。
步骤(a)：使靶组织特异性化合物的高浓度存在下的抗原结合结构域(或抗原结合分子)或者它们的文库与抗原接触；
步骤(b)：将在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域(或抗原结合分子)置于该化合物的低浓度存在下；
步骤(c)：分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域(或抗原结合分子)。
此外，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)可以通过包括下述步骤(a)～(d)的抗原结合结构域(或抗原结合分子)或它们的文库的筛选来获得。
步骤(a)：在靶组织特异性化合物的非存在下使抗原结合结构域(或抗原结合分子)的文库与抗原接触；
步骤(b)：选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合结构域(或抗原结合分子)；
步骤(c)：使在前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域(或抗原结合分子)在该化合物的存在下与抗原结合；
步骤(d)：分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域(或抗原结合分子)。
此外，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)可以通过包括下述步骤(a)～(d)的抗原结合结构域(或抗原结合分子)或它们的文库的筛选来获得。
步骤(a)：在靶组织特异性化合物的低浓度存在下使抗原结合结构域(或抗原结合分子)的文库与抗原接触；
步骤(b)：选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合结构域(或抗原结合分子)；
步骤(c)：使在前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域(或抗原结合分子)在该化合物的高浓度存在下与抗原结合；
步骤(d)：分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域(或抗原结合分子)。
进而，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)可以通过包括下述步骤(a)～(c)的筛选方法来获得。
步骤(a)：使抗原结合结构域(或抗原结合分子)的文库在靶组织特异性化合物的存在下与固定有抗原的柱接触；
步骤(b)：在该化合物的非存在下从柱洗脱在前述步骤(a)中与柱结合了的抗原结合结构域(或抗原结合分子)；
步骤(c)：分离在前述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域(或抗原结合分子)。
进而，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)可以通过包括下述步骤(a)～(c)的筛选方法来获得。
步骤(a)：使抗原结合结构域(或抗原结合分子)的文库在靶组织特异性化合物的高浓度存在下与固定有抗原的柱接触；
步骤(b)：在该化合物的低浓度存在下从柱洗脱在前述步骤(a)中与柱结合了的抗原结合结构域(或抗原结合分子)；
步骤(c)：分离在前述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域(或抗原结合分子)。
进而，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)可以通过包括下述步骤(a)～(d)的筛选方法来获得。
步骤(a)：在靶组织特异性化合物的非存在下使抗原结合结构域(或抗原结合分子)的文库通过固定有抗原的柱；
步骤(b)：回收在前述步骤(a)中未与柱结合而洗脱的抗原结合结构域(或抗原结合分子)；
步骤(c)：使在前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域(或抗原结合分子)在该化合物的存在下与抗原结合；
步骤(d)：分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域(或抗原结合分子)。
进而，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)可以通过包括下述步骤(a)～(d)的筛选方法来获得。
步骤(a)：在靶组织特异性化合物的低浓度存在下使抗原结合结构域(或抗原结合分子)的文库通过固定有抗原的柱；
步骤(b)：回收在前述步骤(a)中未与柱结合而洗脱的抗原结合结构域(或抗原结合分子)；
步骤(c)：使在前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域(或抗原结合分子)在该化合物的高浓度存在下与抗原结合；
步骤(d)：分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域(或抗原结合分子)。
进而，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)可以通过包括下述步骤(a)～(d)的筛选方法来获得。
步骤(a)：在靶组织特异性化合物的存在下使抗原结合结构域(或抗原结合分子)的文库与抗原接触；
步骤(b)：获得在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域(或抗原结合分子)；
步骤(c)：将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域(或抗原结合分子)置于化合物的非存在下；
步骤(d)：分离在前述步骤(c)中抗原结合活性弱于在前述步骤(b)中选择的基准的抗原结合结构域(或抗原结合分子)。
进而，作为本发明所提供的一个方案的、靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)可以通过包括下述步骤(a)～(d)的筛选方法来获得。
步骤(a)：在靶组织特异性化合物的高浓度存在下使抗原结合结构域(或抗原结合分子)的文库与抗原接触；
步骤(b)：获得在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域(或抗原结合分子)；
步骤(c)：将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域(或抗原结合分子)置于化合物的低浓度存在下；
步骤(d)：分离在前述步骤(c)中抗原结合活性弱于在前述步骤(b)中选择的基准的抗原结合结构域(或抗原结合分子)。
应予说明，前述步骤可以重复2次以上。因此根据本发明，提供通过在上述筛选方法中进一步包括将步骤(a)～(c)或(a)～(d)重复2次以上的步骤的筛选方法而获得的、靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)或靶组织特异性化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)。(a)～(c)或(a)～(d)的步骤的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。
本发明的筛选方法中，靶组织特异性化合物可以是由以与非靶组织相比为不同的浓度(例如，高浓度或低浓度)存在于靶组织中等定量的靶组织特异性所规定的化合物。例如，靶组织特异性化合物以任意的浓度差异地存在。但是，通常靶组织特异性化合物可以以增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍、或其以上、直至无限大(即不存在于非靶组织中时)的浓度存在。
区别低浓度和高浓度的阈值可以对应于化合物而适宜设定。例如，ATP或腺苷的阈值的非限定的一个方案中，作为阈值，低浓度条件可以由10nM、1nM、100pM、10pM、1pM或0M的值中适宜设定。对应于所设定的阈值，高浓度条件可以由各阈值的至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍的值中适宜设定。此外，在PGE2的非限定的一个方案中，作为阈值，低浓度条件可以由10pM、1pM、100fM、10fM、1fM或0M的值中适宜设定。对应于所设定的阈值，高浓度条件可以由各阈值的至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍的值中适宜设定。进而，在犬尿氨酸的非限定的一个方案中，作为阈值，低浓度条件可以由10μM、1μM、100nM、10nM、1nM或0M的值中适宜设定。对应于所设定的阈值，高浓度条件可以由各阈值的至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍的值中适宜设定。
抗原结合结构域(或抗原结合分子)的抗原结合活性可通过本领域技术人员公知的方法测定，对于靶组织特异性化合物的浓度以外的条件，本领域技术人员可以适宜决定。抗原结合结构域(或抗原结合分子)的抗原结合活性可以作为KD(Dissociation constant：解离常数)、表观KD(Apparent dissociation constant：表观解离常数)、解离速度kd(Dissociation rate：解离速度常数)、或表观kd(Apparent dissociation：表观解离速度常数)等来进行评价。它们可通过本领域技术人员公知的方法测定，例如可以采用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图、FACS等。
本发明中，选择靶组织特异性化合物的存在下的抗原结合活性较该化合物的非存在下的抗原结合活性高的抗原结合结构域或抗体的步骤，与选择靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体的步骤含义相同。
另外，本发明中，选择靶组织特异性化合物的高浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的低浓度存在下的抗原结合活性高的抗原结合结构域或抗体的步骤，与选择靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体的步骤含义相同。
只要靶组织特异性化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低，则对该化合物的存在下的抗原结合活性与非存在下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选该化合物的存在下的抗原结合活性是非存在下的抗原结合活性的2倍以上，进一步优选为10倍以上，更优选为40倍以上。该抗原结合活性之差的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以是400倍、1000倍、10000倍等任意的值。在靶组织特异性化合物的非存在下未观察到抗原结合活性时，该上限为无限大的数值。
通过前述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)可以是任意的抗原结合结构域(或抗原结合分子)，例如，可以筛选上述的抗原结合结构域(或抗原结合分子)。例如，可以筛选具有天然序列的抗原结合结构域(或抗原结合分子)，也可以筛选氨基酸序列被替换的抗原结合结构域(或抗原结合分子)。
文库
根据某一个方案，本发明的抗原结合结构域(或含有该结构域的抗原结合分子)可以由文库获得，该文库主要包含多个抗原结合分子，所述多个抗原结合分子的序列彼此不同，并且其抗原结合结构域中含有至少一个使抗原结合分子对抗原的结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的氨基酸残基。作为低分子化合物的非限定的一个方案，可举出靶组织特异性化合物或非天然化合物。作为靶组织特异性化合物的实例，例示：(1)乳酸、琥珀酸、柠檬酸等糖酵解系统、或克雷伯氏循环的一次代谢产物；(2)丙氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸等氨基酸；(3)犬尿氨酸、及其代谢产物，即邻氨基苯甲酸、3-羟基犬尿氨酸、和犬尿酸等氨基酸的代谢产物；(4)前列腺素E2等花生四烯酸的代谢产物；以及(5)腺苷、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)等具有嘌呤环结构的核苷等。以下例示一种文库，其主要包含多个抗原结合分子，该多个抗原结合分子的序列彼此不同，并且其抗原结合结构域包含至少一个使抗原结合分子对抗原的结合活性对应于作为这种靶组织特异性化合物的腺苷、和/或ATP而变化的氨基酸残基，但是使抗原结合活性根据腺苷、和/或ATP以外的低分子化合物的浓度而变化的抗原结合分子的文库也可以根据下述实例而适宜适用。
本说明书中，“文库”是指各自具有不同的序列的多个抗原结合分子或含有抗原结合分子的多个融合多肽、或编码这些分子或多肽的核酸或多核苷酸的组件。文库中所含的多个抗原结合分子或含有抗原结合分子的多个融合多肽的序列并非单一的序列，而使序列彼此不同的抗原结合分子或含有抗原结合分子的融合多肽。
作为本说明书中的“文库”的方案，不仅可提供能够有效地获得在低分子存在下与靶抗原结合，在低分子非存在下不与靶抗原结合的抗原结合分子的文库(低分子依赖性)，还可以提供能有效地获得在低分子非存在下与靶抗原结合，在低分子存在下不与靶抗原结合的抗体的文库(低分子反依赖性)。
本发明的一个实施方案中，可以制作本发明的抗原结合分子与异源多肽的融合多肽。在某实施方案中，融合多肽可以通过与病毒外壳蛋白，例如选自pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVI和其突变体中的病毒外壳蛋白的至少一部分融合得到。
在某实施方案中，本发明的抗原结合分子可以是ScFv、Fab片段、F(ab)2或F(ab')2，在另一个实施方案中，提供主要包含序列彼此不同的多个融合多肽的文库，该融合多肽是这些抗原结合分子与异源多肽的融合多肽。具体地，提供主要包含序列彼此不同的多个融合多肽的文库，该融合多肽是这些抗原结合分子与病毒外壳蛋白，例如选自pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVI和其突变体的病毒外壳蛋白的至少一部分融合得到的融合多肽。本发明的抗原结合分子还可以包含二聚体化结构域。在某实施方案中，前述二聚体化结构域可以存在于抗体的重链或轻链可变区与病毒外壳蛋白的至少一部分之间。该二聚体化结构域中可以包含至少1个二聚体化序列、和/或1个或多个包含半胱氨酸残基的序列。该二聚体化结构域可优选与重链可变区或恒定区的C末端连接。二聚体化结构域，取决于前述抗体可变区是否是以与病毒的外壳蛋白成分的融合多肽成分的形式制作的(二聚体化结构域的后面不具有琥珀终止密码子)，或取决于前述抗体可变区是否是主要以不含病毒外壳蛋白成分的方式制作的(例如，二聚体化结构域的后面具有琥珀终止密码子)，可以呈现各种结构。前述抗体可变区主要是以与病毒的外壳蛋白成分的融合多肽的形式制作时，通过1个或多个二硫键和/或单一的二聚体化序列而实现二价呈递。
本说明书中，序列彼此不同的多种抗原结合分子的记载中的“序列彼此不同”这一术语意指文库中的各抗原结合分子的序列彼此不同。即，文库中的彼此不同的序列的数量反映文库中的序列不同的独立克隆的数量，有时也被视为“文库大小”。通常的噬菌体展示文库为106至1012，通过使用核糖体展示法等公知的技术，可将文库大小放大至1014。然而，噬菌体文库的淘选选择时使用的噬菌体粒子的实际数目通常比文库大小大10至10000倍。该超过倍数也称为“文库当量数”，表示具有相同氨基酸序列的各克隆能够存在10至10000个。所以，本发明中的“序列相互不同”这一术语意指文库当量数除外的文库中的各抗原结合分子的序列相互不同，更具体意指序列相互不同的抗原结合分子存在106至1014个分子、优选107至1012个分子、进一步优选108至1011、特别优选108至1010。
另外，本发明中的主要包含多个抗原结合分子的文库这一记载中的术语“多个”，对于例如本发明的抗原结合分子、融合多肽、多核苷酸分子、载体或病毒而言，通常是指这些物质的两种以上的集合。例如，只要某2个以上的物质在特定形态方面相互不同，则表示该物质存在2种以上。作为例子，可举出氨基酸序列中的特定氨基酸位置观察到的突变体氨基酸。例如，当除了柔性残基以外、或除了露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸以外，序列实质上相同、优选相同的本发明的2个以上的抗原结合分子存在时，则本发明的抗原结合分子存在多个。在其他实例中，当除了编码柔性残基的碱基以外、或除了编码露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸的碱基以外实质上相同、优选相同的序列的本发明的2个以上的多核苷酸分子存在时，则本发明的多核苷酸分子存在多个。
进而，本发明的主要包含多个抗原结合分子的文库这一记载中的“主要包含”的表述反映出文库中的序列不同的独立克隆的数量中，抗原结合分子对抗原的结合活性根据低分子化合物(例如，靶组织特异性化合物)的浓度条件而不同的抗原结合分子的数量。具体地，优选表现出这种结合活性的抗原结合分子在文库中至少存在104个分子。此外，更优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在105个分子的文库中获得。进一步优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在106个分子的文库中获得。特别优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在107个分子的文库中获得。还优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在108个分子的文库中获得。在其他表现中，也可适宜地表现为文库中的序列不同的独立克隆的数量中，抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而不同的抗原结合分子的比例。具体地，本发明的抗原结合结构域可以由显示出这种结合活性的抗原结合分子占文库中的序列不同的独立克隆的数量的10-6％％至80％、优选10-5％至60％、更优选10-4％至40％的文库获得。融合多肽、多核苷酸分子或载体的情形也与上述相同，可以用分子的数量或全部分子中的比例来表现。此外，病毒的情形也与上述相同，可以用病毒个体的数量或全部个体中的比例来表现。作为本发明的非限定的一个方案，结合多个抗原结合分子的抗原为1种时，显示这种结合活性的抗原结合分子在文库中优选存在至少10个分子,100个分子,1000个分子,104个分子，105个分子，106个分子，107个分子或108个分子。另外，更优选本发明的抗原结合结构域可由显示这种结合活性的抗原结合分子至少存在10个分子的文库获得。进一步优选本发明的抗原结合结构域可由显示这种结合活性的抗原结合分子至少存在100个分子的文库获得。特别优选本发明的抗原结合结构域可由显示这种结合活性的抗原结合分子至少存在1000个分子的文库获得。
作为本发明的一个方案，提供通过包括下述步骤(a)和(b)的方法制造的文库：
步骤(a)鉴定抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域中满足以下(i)至(iii)中任一者以上的氨基酸位点；
(i)未参与结合该低分子化合物的1个或多个氨基酸位点；
(ii)在亲本抗原结合结构域所属的动物种的抗体谱中具有氨基酸出现频率的多样性的1个或多个氨基酸位点；
(iii)对于经典结构的形成不重要的1个或多个氨基酸位点；和
步骤(b)设计文库，该文库包含：在所述抗原结合结构域中，编码未改变体的核酸以及分别编码在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有改变的、序列彼此不同的所述抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体的核酸。
本发明中“未参与结合低分子化合物的1个或多个氨基酸位点”可以通过低分子化合物与抗体的复合体的晶体结构分析、使用NMR的立体结构分析、或氨基酸的突变导入等方法来鉴定。作为本发明的非限定的一个方案，可以根据低分子与抗体的复合体的晶体结构分析来鉴定未参与结合低分子的抗体的残基。这里，“参与结合低分子”是指：形成抗体的H链或L链的氨基酸中的侧链或主链的原子与低分子化合物的原子以能够对结合活性造成效果的距离形成了分子间相互作用的状态，或者某氨基酸残基有助于低分子化合物的结合(包括使CDR环等的立体结构稳定化至低分子化合物结合时的构型等的间接性影响)的状态、以及满足这两者的状态。
本说明书中的“形成了分子间相互作用的状态”，例如，可以根据低分子与抗体的复合体的晶体结构分析，基于构成形成抗体的H链或L链的氨基酸的侧链或主链的非氢原子与构成低分子化合物的非氢原子的原子间距离来判定。例如，上述原子间距离优选为
Figure BDA0002407382280000611
Figure BDA0002407382280000612
或
Figure BDA0002407382280000613
以内，但并不限定于此。进一步优选的上述原子间距离为
Figure BDA0002407382280000615
或
Figure BDA0002407382280000614
以内。
更具体地，基于立体结构上的原子间距离与所形成的分子间相互作用的种类以及原子的种类的信息，可以直接判定发生了相互作用的可能性。突变为Ala或Gly等氨基酸残基的突变导入可以根据对低分子化合物的活性造成的影响而更准确地判断，但并不限定于此。
本说明书中的“间接性影响的状态”，例如，可以通过根据低分子与抗体的复合体的立体结构详细分析各氨基酸残基的构型、与周围残基的分子间相互作用的状況，从而推定是否间接性影响了低分子的结合，突变为Ala或Gly等氨基酸残基的突变导入可以根据对低分子化合物的活性造成的影响而更准确地判断。
作为本发明的一个方案，可以选择即使将鉴定为未参与结合低分子的残基替换为其它氨基酸也能够以适当程度维持与化合物的结合的氨基酸。藉此，可以设计所选择的氨基酸出现在所选择的残基中的文库。此时，可以以形成鉴定为未参与结合低分子化合物的残基被替换为彼此不同的氨基酸的抗原结合分子的集合的方式设计主要包含多个抗原结合分子的文库。
在另一个方案中，对于未参与结合低分子化合物的氨基酸位点的判定，可以认为是选自参与结合低分子化合物的氨基酸位点中的任意一个以上的氨基酸位点以外的氨基酸位点。
作为本发明的非限定的一个方案，“未参与结合低分子化合物的1个或多个氨基酸位点”可以通过氨基酸的突变导入的方法来鉴定。例如，全面(comprehensively)改变可变区的氨基酸，各改变体对低分子的结合通过采用Biacore等的公知方法来测定，各改变体对低分子的结合活性(亲和力)以KD值的形式算出。该KD值与作为亲本序列的未改变体的KD值进行比较，将显示出高于一定基准的结合的改变位置判定为未参与结合低分子化合物的氨基酸位点。例如，使用Biacore等公知方法的测定的结果，各改变体对低分子的结合活性(亲和力)以KD值的形式算出，作为重链的位点，低分子结合能力没有因改变而低于未改变体的1/100、1/50、1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5、1/4、1/3或1/2的结合能力的那些、以及作为轻链的位点，低分子结合能力没有因改变而低于未改变体的1/100、1/50、1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5、1/4、1/3或1/2的结合能力的那些判定为未参与结合低分子化合物的氨基酸位点，但并不限于上述基准。或者，替代与作为亲本序列的未改变体的KD值进行比较，将各改变体对低分子的结合活性(亲和力)以KD值的形式算出，作为重链的位点的不低于10mM、1mM、100uM、10uM、1uM、100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、或1pM的结合能力的那些，以及作为轻链的位点的不低于10mM、1mM、100uM、10uM、1uM、100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、或1pM的结合能力的那些判定为未参与结合低分子化合物的氨基酸位点，但并不限于上述基准。
未改变和改变体的低分子结合活性的测定可以从本领域技术人员公知的方法(Biacore、ELISA、ECL等)中适宜选择来实施。
在另一个方案中，对于未参与结合低分子化合物的氨基酸位点的判定，可以认为是选自参与结合低分子化合物的氨基酸位点中的任意一个以上的氨基酸位点以外的氨基酸位点。
本发明中的“设计包含分别编码序列彼此不同的所述抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体的核酸的文库”包括：利用例如NNK、TRIMLibrary等(Gonzalez-Munoz A et al.MAbs 2012,Lee CV et al.J Mol Biol.2004,Knappik A.et al.J Mol Biol.2000,Tiller T et al.MAbs 2013)的公知的文库技术，设计包含将特定位点的氨基酸改变为所期望的氨基酸的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体的文库，但并不特别限于该方案。
本发明中的“1个或多个氨基酸”并不特别限定氨基酸的数量，可以是2种以上的氨基酸、5种以上的氨基酸、10种以上的氨基酸、15种以上的氨基酸或20种氨基酸。
本发明中的“具有氨基酸出现频率的多样性的氨基酸位点”是指在亲本抗体(亲本抗原结合结构域)所属的动物种的抗体谱中，作为被发现以1％以上的出现频率存在的氨基酸的种类，确认到2种以上的氨基酸位点。
本发明中的“亲本抗原结合结构域”是指作为制作文库的模板的、抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域。
本发明中的“亲本抗原结合结构域所属的动物种的抗体谱”是指在该亲本抗原结合结构域来自的动物种中基因上确认到的抗体基因序列的组成成分。作为一例，并非限定于此，该亲本抗原结合结构域来自人时，亲本抗原结合结构域所属的动物种的抗体谱是指在人的基因上确认到的抗体基因序列的组成成分，该亲本抗原结合结构域来自兔时，亲本抗原结合结构域所属的动物种的抗体谱是指在兔的基因上所确认到的抗体基因序列的组成成分。其中，即使在基因上存在，也不包括由于终止/起始密码子的存在或移码而实际上没有作为抗体表达的序列。
该亲本抗原结合结构域来自非人动物时，可以依照常法将其人源化，该方法是本领域技术人员广泛公知的(欧州专利公开EP239400、国际公开WO1996/002576、WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735、WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388、Cancer Res.,(1993)53,851-856、BBRC.,(2013)436(3):543-50等)。将该亲本抗原结合结构域依照常法人源化后实施文库化时，本发明中的“亲本抗原结合结构域所属的动物种的抗体谱”中，实施人源化之前的抗原结合结构域与实施人源化后的抗原结合结构域两者均可作为亲本抗原结合结构域处理，相应地，可以将实施人源化之前的抗原结合结构域所来自的动物种与人这两者的组成成分作为同一动物种适用。作为一例，并非限定于此，实施人源化之前的抗原结合结构域来自兔时，亲本抗原结合结构域所属的动物种的抗体谱是指在人和/或兔的基因上确认到的抗体基因序列的组成成分。其中，即使在基因上存在，也不包括由于终止/起始密码子的存在或移码而实际上没有作为抗体表达的序列。
作为一例，并非限定于此，亲本抗原结合结构域所属的动物种的抗体谱可以通过参照已知的数据库来研究。具有氨基酸出现频率的多样性的位点通常存在于CDR区。一个方案中，在确定公知和/或天然抗体的超变位置时，Kabat,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.)(1987年和1991年)所提供的数据是有效的。此外，因特网上的多个数据库(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)中提供有收集的大量人轻链和重链的序列以及其配置，这些序列及其配置的信息对于确定本发明中的超变位置有用。
另外，作为另一方案，亲本抗原结合结构域所属的动物种的抗体谱也可以通过克隆由该生物种获得的抗体基因并分析序列来研究。作为一例，并非限定于此，人的抗体谱可以通过对由来自正常人淋巴细胞的抗体基因构建、且其组成成分由不含偏差的抗体序列即天然序列构成的天然文库的序列进行分析来研究(Gejima等(Human Antibodies(2002)11,121-129)和Cardoso等(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。研究组成成分时，理想的是对至少100种、优选200种、进一步优选400种以上的序列进行分析。
并非限定于此，本发明中的亲本抗原结合结构域所属的动物种的抗体谱更优选是对亲本抗原结合结构域所属的种系的亚类实施研究。作为框架的例子，可将例如V-Base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等网站中所包括的、现在已知的完全人型框架区域的序列适宜用作本发明的抗原结合分子所含的种系的序列。种系的序列可基于其相似性来分类为亚类(Tomlinson等(J.Mol.Biol.(1992)227,776-798)Williams和Winter(Eur.J.Immunol.(1993)23,1456-1461)和Cox等(Nat.Genetics(1994)7,162-168)。作为一例，人的抗体中重链可变区报道了7种亚类、Vκ报道了7种亚类、Vλ报道了10种亚类，各氨基酸位点可以通过分析亲本抗原结合结构域所属的亚类内的氨基酸的组成成分来研究，但并不特别限于该方案。
本发明的“对于经典结构的形成不重要的氨基酸位点”中，抗体的经典结构表示抗体重链和轻链的主要为CDR1、2的立体结构的成簇，结构可根据抗体的亚类、CDR的长度和序列来分类。各经典结构中，对于维持结构重要的残基已经公知，通过参照Chothia等(J.Mol.Biol.(1992)227,799-817)、Al-Lazikani等(J.Mol.Biol.(1997)273,927-948)、Tomlinson等(J.Mol.Biol.(1992)227,776-798)等的报道，可以特定该亲本抗原结合分子所分类的经典结构、和对其结构重要的残基。
另外，在抗体之外的抗原结合结构域中，对维持结构重要的残基的存在是公知的，并非限定于此，通过制作的突变体的结构分析等，可以鉴定各抗原结合结构域中对于形成经典结构不重要的氨基酸位点。
作为本发明的文库的另一方案，可举出以下的文库。
通过包含下述步骤(a)至(d)的方法制造的文库：
步骤(a)鉴定抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域中满足以下(i)至(iii)中任一者以上的氨基酸位点；
(i)未参与结合该低分子化合物的1个或多个氨基酸位点；
(ii)在亲本抗原结合结构域所属的动物种的抗体谱中具有氨基酸出现频率的多样性的1个或多个氨基酸位点；
(iii)对于经典结构的形成不重要的1个或多个氨基酸位点；
步骤(b)制作在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有改变的、序列彼此不同的所述抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体；
步骤(c)鉴定实质上不对所述各改变体的该低分子化合物结合活性造成变化的1个或多个氨基酸的改变；和
步骤(d)制造文库，该文库包含：编码未改变体的核酸以及编码在步骤(c)中鉴定的1个或多个氨基酸具有改变的、序列彼此不同的所述抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体的核酸。
本发明中的“制作序列彼此不同的所述抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体的步骤”中，在步骤(a)所鉴定的氨基酸位点之中，CDR1和CDR2的位点可以替换为种系中的出现频率为10％以上、9％以上、8％以上、7％以上、6％以上、5％以上、4％以上、3％以上、2％以上或1％以上的氨基酸，CDR3的位点也可以替换为种系中的出现频率为10％以上、9％以上、8％以上、7％以上、6％以上、5％以上、4％以上、3％以上、2％以上或1％以上的氨基酸，来制作各改变体，但并不限定于此。
本发明中的“多个改变体”是指相对于作为亲本序列的抗原结合结构域的未改变体，至少1个或1个以上的氨基酸被替换了的抗原结合结构域的各个不同的改变体。
本发明中的“鉴定实质上不对各改变体的该低分子化合物结合活性造成变化的1个或多个氨基酸的改变的步骤”具有如下所示的含义。例如，各改变体对低分子的结合通过采用Biacore等的公知方法来测定，各改变体对低分子的结合活性(亲和力)以KD值的形式算出。将该KD值与作为亲本序列的未改变体的KD值进行比较，将显示高于一定基准的结合的改变位置判定为能够改变的位点，在该位点被替换的氨基酸可判定为能够文库化的氨基酸(在文库中出现的柔性残基)，但并不限定于此。或者并不与作为亲本序列的未改变体的KD值进行比较，而是将显示各改变体的KD值高于一定基准的结合的改变位置判定为能够改变的位点，在该位点被替换的氨基酸可判定为能够文库化的氨基酸(在文库中出现的柔性残基)，但并不限定于此。
本发明中，判定能够文库化的氨基酸时的“显示高于一定基准的结合的改变位置”具有如下所述含义。例如，使用Biacore等公知方法测定的结果，各改变体对低分子的结合活性(亲和力)以KD值的形式算出，作为重链的位点，低分子结合能力没有因改变而低于未改变体的1/100、1/50、1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5、1/4、1/3或1/2的结合能力的那些、以及作为轻链的位点，低分子结合能力没有因改变而低于未改变体的1/100、1/50、1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5、1/4、1/3或1/2的结合能力那些判定为能够改变的位点，在该位点被替换的氨基酸可判定为能够文库化的氨基酸位置，但并不限于上述基准。或者，替代与作为亲本序列的未改变体的KD值进行比较，将各改变体对低分子的结合活性(亲和力)以KD值的形式算出，作为重链的位点的不低于10mM、1mM、100uM、10uM、1uM、100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、或1pM的结合能力的那些、和作为轻链的位点的不低于10mM、1mM、100uM、10uM、1uM、100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、或1pM的结合能力的那些判定为能够改变的位点，在该位点被替换的氨基酸可判定为能够文库化的氨基酸位置，但并不限于上述基准。
未改变和改变体的低分子结合活性的测定可以从本领域技术人员公知的方法(Biacore、ELISA、ECL等)中适宜选择来实施。
在另一个方案中，对于未参与结合低分子化合物的氨基酸位点的判定，可以认为是选自参与结合低分子化合物的氨基酸位点中的任意一个以上的氨基酸位点以外的氨基酸位点。
本发明中的“制造包含编码未改变体的核酸、以及在步骤(d)中鉴定的1个或多个氨基酸具有改变的、序列彼此不同的所述抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体的文库的步骤”包括以步骤(d)中鉴定的各氨基酸的特定部位处的氨基酸出现频率相同的方式(例如在氨基酸组成成分为10种时以各氨基酸为10％出现的方式)构建文库的方案，但并不限定于此。
作为本发明的文库的另一方案，可举出以下的文库。
通过包含下述步骤1)和2)的方法制造的文库：
步骤1)使包含多个抗原结合分子的文库与低分子化合物接触，所述抗原结合分子具有低分子化合物结合活性；和
步骤2)由该文库浓缩核酸，所述核酸编码具有低分子化合物结合活性的抗原结合分子的多个改变体。
作为其它的方案，该文库是下述文库，其中抗原结合分子是包含抗体的重链可变区和轻链可变区的抗原结合分子，且是通过包括下述步骤1)至3)的任1步骤的方法制造的。
步骤1)从该文库浓缩编码具有低分子化合物结合活性的抗原结合分子的多个改变体的核酸来设计文库，其中该文库是包含编码位于重链可变区的氨基酸经改变的1个或多个改变体的核酸的文库；
步骤2)从该文库浓缩编码具有低分子化合物结合活性的抗原结合分子的多个改变体的核酸来设计文库，其中该文库是包含编码位于轻链可变区的氨基酸经改变的1个或多个改变体的核酸的文库；
步骤3)组合由步骤1)和步骤2)的各可变区文库浓缩得到的编码抗原结合分子的核酸，由此设计文库。
本发明中的“浓缩”是指与实施浓缩操作前的文库相比，使编码具有目标活性的改变体的核酸的存在比率上升。作为一例，并非限定于此，浓缩编码具有低分子化合物结合活性的抗原结合分子的改变体的核酸可以如下实现：通过淘选使编码具有低分子化合物结合活性的抗原结合分子的改变体的核酸的存在比率上升。更具体地，作为一例，使将含有多个抗原结合分子的文库通过噬菌体展示法呈递于表面的噬菌体与该低分子化合物接触并通过清洗操作将呈递不具有结合活性的分子的噬菌体和未呈递分子的噬菌体除去后仅回收呈递维持结合的抗原结合分子的噬菌体，由此可通过淘选使编码具有低分子化合物结合活性的抗原结合分子的改变体的核酸的存在比率上升，但并不限定于此。更具体地，编码具有目标活性的改变体的核酸的存在比率与实施浓缩操作前的文库相比，优选上升1.1倍以上。更优选使编码具有目标活性的改变体的核酸的存在比率上升1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、4倍以上、10倍以上、25倍以上、100倍以上，由此可以制造本发明所述的文库。
文库的制造方法
本申请发明还涉及制造上述本申请发明所包含的各种方案的“文库”的方法。
本申请发明的“文库的制造方法”并不限定于以下例示的任一特定的方法，只要是能够制造上述本申请发明的“文库”的方法，则包括任意方法。
作为本申请发明的“文库的制造方法”，可举出例如，以下例示的方法。
另外，以下例示的“文库的制造方法”中的各特定事项上述具有针对本申请发明的“文库”所详述的技术含义。
(例1)
包含下述步骤(a)和(b)的文库的制造方法，该文库主要包含：
(i)序列彼此不同的多个抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子；或
(ii)编码该序列彼此不同的多个抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸；
该文库的特征在于，所述抗原结合结构域或抗原结合分子是抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子；
步骤(a)鉴定抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域中满足以下(i)至(iii)中任一者以上的氨基酸位点；
(i)未参与结合该低分子化合物的1个或多个氨基酸位点；
(ii)在亲本抗原结合结构域所属的动物种的抗体谱中具有氨基酸出现频率的多样性的1个或多个氨基酸位点；
(iii)对于经典结构的形成不重要的1个或多个氨基酸位点；和
步骤(b)设计文库，该文库包含：在所述抗原结合结构域中，编码未改变体的核酸以及分别编码在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有改变的、序列彼此不同的所述抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体的核酸。
(例2)
包含下述步骤(a)至(d)的文库的制造方法，该文库主要包含：
(i)序列彼此不同的多个抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子；或
(ii)编码该序列彼此不同的多个抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸；
该文库的特征在于，所述抗原结合结构域或抗原结合分子是抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子；
步骤(a)鉴定抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域中满足以下(i)至(iii)中任一者以上的氨基酸位点；
(i)未参与结合该低分子化合物的1个或多个氨基酸位点；
(ii)在亲本抗原结合结构域所属的动物种的抗体谱中具有氨基酸出现频率的多样性的1个或多个氨基酸位点；
(iii)对于经典结构的形成不重要的1个或多个氨基酸位点；
步骤(b)制作在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有改变的、序列彼此不同的所述抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体；
步骤(c)鉴定实质上不对所述各改变体的该低分子化合物结合活性造成变化的1个或多个氨基酸的改变；和
步骤(d)制造文库，该文库包含：编码未改变体的核酸以及编码在步骤(c)中鉴定的1个或多个氨基酸具有改变的、序列彼此不同的所述抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体的核酸。
(例3)
包含下述步骤1)和2)的文库的制造方法，该文库主要包含：
(i)序列彼此不同的多个抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子；或
(ii)编码该序列彼此不同的多个抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸；
该文库的特征在于，所述抗原结合结构域或抗原结合分子是抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子；
步骤1)使包含多个抗原结合分子的文库与低分子化合物接触，所述抗原结合分子具有低分子化合物结合活性；和
步骤2)由该文库浓缩核酸，所述核酸编码具有低分子化合物结合活性的抗原结合分子的多个改变体。
(例4)
包含下述步骤1)至3)中任1步骤的文库的制造方法，该文库主要包含：
(i)序列彼此不同的多个抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子；或
(ii)编码该序列彼此不同的多个抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸；
该文库的特征在于，所述抗原结合结构域或抗原结合分子是抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子；
步骤1)从前述(例3)所述的文库浓缩编码具有低分子化合物结合活性的抗原结合分子的多个改变体的核酸来设计文库，其中(例3)所述的文库是包含编码位于重链可变区的氨基酸经改变的1个或多个改变体的核酸的文库；
步骤2)从前述(例3)所述的文库浓缩编码具有低分子化合物结合活性的抗原结合分子的多个改变体的核酸来设计文库，其中(例3)所述的文库是包含编码位于轻链可变区的氨基酸经改变的1个或多个改变体的核酸的文库；
步骤3)组合由步骤1)和步骤2)的各可变区文库浓缩得到的编码抗原结合分子的核酸，由此设计文库。
(例5)
前述(例1)至(例4)中任一者所述的文库的制造方法，其特征在于，抗原结合分子是抗原结合结构域与病毒外壳蛋白的至少一部分的融合多肽。
(例6)
前述(例1)至(例4)中任一者所述的文库的制造方法，其中，前述抗原结合分子是包含抗体的重链和轻链的抗原结合分子，该方法进一步包括设计前述重链和/或轻链的合成文库的步骤。
(例7)
前述(例6)的文库的制造方法，其特征在于，前述抗体的重链和/或轻链包含来源于种系的框架序列。
(例8)
前述(例1)至(例7)中任一者所述的文库的制造方法，其中，前述低分子化合物是靶组织特异性化合物或非天然化合物。
(例9)
前述(例1)至(例8)中任一者所述的文库的制造方法，其中，前述靶组织是癌组织或炎性组织。
(例10)
前述(例9)所述的文库的制造方法，其中，所述癌组织特异性化合物是选自由具有嘌呤环结构的核苷、氨基酸及其代谢产物、脂质及其代谢产物、糖代谢的一次代谢产物、以及烟酰胺及其代谢产物组成的组中的至少一种化合物。
(例11)
前述(例1)至(例10)中任一者所述的文库的制造方法，其中，前述低分子化合物是犬尿氨酸、腺苷、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、或三磷酸腺苷。
(例12)
前述(例1)至(例11)中任一者所述的文库的制造方法，其中，未参与结合前述低分子化合物的氨基酸位点是选自下述的任一者以上的氨基酸之外的位点：
H链：97、100c、101、94、95、100d、100e、33、50、52、56、57、58、99、100、100a、54、55(Kabat编号)；
L链：49、55、95c、96、95a、95b(Kabat编号)。
文库(其它方案)
作为本发明中的能够获得抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的文库的一个方案，可举出以下的文库。
一种文库，主要包含：
(i)序列彼此不同的多个抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子；或
(ii)编码该序列彼此不同的多个抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸；
该文库的特征在于，所述抗原结合结构域或抗原结合分子是具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子。
作为本方案的文库，优选具有1.2×108以上的多样性。
本方案的主要包含多个抗原结合分子的文库的表述中的“主要包含”的术语反映文库中的序列不同的独立克隆的数量中具有低分子化合物(例如，靶组织特异性化合物)结合活性的抗原结合分子的数量。具体地，优选表现出这种结合活性的抗原结合分子在文库中至少存在104个分子。在其他表现中，也可以适宜地表现为文库中的序列不同的独立克隆的数量中，抗原结合结构域对抗原的结合活性根据低分子的存在或非存在而不同的抗原结合分子的比例。具体地，本发明的抗原结合结构域可以由显示出这种结合活性的抗原结合分子占文库中的序列不同的独立克隆的数量的10-6％％至80％、或10-5％至60％、优选10-4％至40％、更优选10-3％至40％、进一步优选10-2％至40％的文库获得。融合多肽、多核苷酸分子或载体的情形也与上述相同，可以用分子的数量或全部分子中的比例来表现。此外，病毒的情形也与上述相同，可以用病毒个体的数量或全部个体中的比例来表现。
作为本发明中的能够获得抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的文库的一个方案，可举出以下的文库。
一种文库，主要包含：
(i)序列彼此不同的多个抗体分子；或
(ii)编码该序列彼此不同的多个抗体分子的核酸，
该文库的特征在于，前述抗体分子是具有低分子化合物结合活性的抗体分子，且具有满足以下(i)至(vi)中任一者以上的多样性；
(i)重链CDR1的多样性为13以上
(ii)重链CDR2的多样性为129以上
(iii)重链CDR3的多样性为5以上
(iv)轻链CDR1的多样性为193以上
(v)轻链CDR2的多样性为7以上
(vi)轻链CDR3的多样性为17以上。
本方案的主要包含多个抗原结合分子的文库的表述中的“主要包含”的术语反映文库中的序列不同的独立克隆的数量中具有低分子化合物(例如，靶组织特异性化合物)结合活性的抗原结合分子的数量。具体地，优选表现出这种结合活性的抗原结合分子在文库中至少存在104个分子。在其他表现中，也可以适宜地表现为文库中的序列不同的独立克隆的数量中，抗原结合结构域对抗原的结合活性根据低分子的存在或非存在而不同的抗原结合分子的比例。具体地，本发明的抗原结合结构域可以由显示出这种结合活性的抗原结合分子占文库中的序列不同的独立克隆的数量的10-6％％至80％、或10-5％至60％、优选10-4％至40％、更优选10-3％至40％、进一步优选10-2％至40％的文库获得。融合多肽、多核苷酸分子或载体的情形也与上述相同，可以用分子的数量或全部分子中的比例来表现。此外，病毒的情形也与上述相同，可以用病毒个体的数量或全部个体中的比例来表现。
作为本发明中的能够获得抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的文库的一个方案，可举出以下的文库。
一种文库，主要包含：
(i)序列彼此不同的多个抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子；或
(ii)编码该序列彼此不同的多个抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸；
其中，前述抗原结合结构域或抗原结合分子是具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域或含有抗原结合结构域的抗原结合分子，且该文库是用于获得抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或含有抗原结合结构域的抗原结合分子的文库。
本方案的主要包含多个抗原结合分子的文库的表述中的“主要包含”的术语反映文库中的序列不同的独立克隆的数量中具有低分子化合物(例如，靶组织特异性化合物)结合活性的抗原结合分子的数量。具体地，优选表现出这种结合活性的抗原结合分子在文库中至少存在104个分子。在其他表现中，也可以适宜地表现为文库中的序列不同的独立克隆的数量中，抗原结合结构域对抗原的结合活性根据低分子的存在或非存在而不同的抗原结合分子的比例。具体地，本发明的抗原结合结构域可以由显示出这种结合活性的抗原结合分子占文库中的序列不同的独立克隆的数量的10-6％％至80％、或10-5％至60％、优选10-4％至40％、更优选10-3％至40％、进一步优选10-2％至40％的文库获得。融合多肽、多核苷酸分子或载体的情形也与上述相同，可以用分子的数量或全部分子中的比例来表现。此外，病毒的情形也与上述相同，可以用病毒个体的数量或全部个体中的比例来表现。
使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据低分子的存在或非存在而变化的氨基 酸关于本发明中制作文库时使用的模板(抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域)的获得方法(筛选方法)，这些抗原结合结构域等可以任意制备，可以使用预先存在的抗原结合结构域或抗体、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤、或来自免疫动物的B细胞制作的抗体或文库、由通过例如但不限于适当连接了作为低分子化合物的一个方案的腺苷或ATP的免疫原性高的T细胞表位肽等与佐剂的缀合物(conjugate)免疫的动物的B细胞等免疫细胞制作的抗体或文库等。作为该T细胞表位肽的非限定的一例，可优选举出来源于破伤风毒素的p30辅助肽(由SEQ ID NO:4所示，也称为Fragment C(FrC))等。
作为通过前述筛选方法获得的本发明的抗原结合结构域或抗体的制备法的非限定的1个方案，可以使用文库，其包含：机体内存在的细胞膜蛋白Avimer中所含的35个氨基酸程度的被称为A结构域的组件、包含与表达于细胞膜的糖蛋白即fibronectin中的蛋白质结合的结构域即10Fn3结构域的Adnectin、以构成ProteinA的包含58个氨基酸的3个螺旋束(bundle)的IgG结合结构域为scaffold的Affibody、具有含33个氨基酸残基的转角与2个反向平行螺旋和环的亚基重复重叠而成的结构的锚蛋白重复序列(ankyrin repeat：AR)的分子表面露出的区域即DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)、支持嗜中性粒细胞明胶酶结合脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等脂质运载蛋白分子中高度保守的8个反向平行链在中央方向上扭曲的桶结构的单侧的4个环区域即Anticalin等、作为七鳃鳗、八目鳗等无颚类的获得免疫系统且不具有免疫球蛋白结构的可变性淋巴细胞受体(variable lymphocyte受体(VLR))的亮氨酸残基富集重复序列(leucine-rich-repeat(LRR))组件反复重叠而成的马蹄铁形的结构内部的平行型片结构的凹陷区域等。
作为本发明的抗原结合结构域的优选实例，可举出含有抗体的重链和轻链的可变区的抗原结合结构域。作为这种抗原结合结构域的实例，优选可举出“scFv(单链Fv)”、“单链抗体”、“Fv”、“scFv2(单链Fv 2)”、“Fab”或“F(ab')2”或IgG等，也可以使用包含它们的文库。
进而，作为通过前述筛选方法获得的本发明的抗原结合结构域或抗体的制备法的非限定的1个方案，可以采用下述方法：使用前述文库，通过淘选制备具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域或抗体。作为文库，并不限定于此，可使用噬菌体展示文库、核糖体展示文库、mRNA展示文库、cDNA展示文库、CIS展示文库、E.coli展示文库、革兰氏阳性菌展示文库、酵母展示文库、哺乳类细胞展示文库、病毒展示文库、体外病毒展示文库等。
作为通过前述淘选制备具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域或抗体的方法的1个方案，可以使用固定化于珠子等载体的低分子化合物。经固定化的低分子化合物可以通过使以通过接头与生物素化学连接的状态合成的低分子化合物与固定有链霉亲和素、中性亲和素的珠子或板接触的方法；将与牛血清白蛋白(BSA)等佐剂通过共价键而连接的低分子化合物通过疏水相互作用而与珠子或板接合的方法等来制作，但并不限定于此。这些方法已经公知(J Immunol Methods.2003Sep；280(1-2):139-55、BMCBiotechnol.2009Jan 29；9:6.doi:10.1186/1472-6750-9-6)。通过回收这些经固定化的具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域或抗体，可以制备具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域或抗体。
或者作为前述通过淘选制备具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域或抗体的方法的另外的1个方案，可以使用经荧光标记的低分子化合物、经生物素标记的低分子化合物以及经荧光标记的链霉亲和素(或中性亲和素或亲和素)。使呈递于细胞等的表面的文库与该经荧光标记的低分子化合物、或经生物素标记的低分子化合物以及经荧光标记的链霉亲和素(或中性亲和素或亲和素)接触后，通过使用荧光活化细胞分选(FACS)法，可以制备该具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域或抗体。这些方法已经公知(ProcNatl Acad Sci U S A.2000Sep 26；97(20):10701-5.)。
另外，作为通过前述筛选方法获得的本发明的抗原结合结构域或抗体的制备法的非限定的1个方案，可以使用预先存在的具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域。例如，并不限定于此，以腺苷和/ATP为例时，可将属于具有ATP结合活性的激酶家族的分子用作抗原结合结构域，另外还可以将属于具有腺苷结合活性的腺苷脫氨酶家族的分子用作抗原结合结构域。通过将未参与结合这些ATP或腺苷的部分文库化，可以获得ATP或腺苷浓度依赖性地与抗原结合的抗原结合分子。
作为使用了非抗体样蛋白的抗原结合结构域的获得方法，虽不限定于此，可以采用使用该非抗体蛋白的环形成位点、α螺旋的表面残基等得到的文库。这种文库的构建方法已经公知(Nat Biotechnol.2004May；22(5):575-82、J Mol Biol.1998Dec 11；284(4):1141-51.、Nat Biotechnol.1997Aug；15(8):772-7)。进而，使用如上所述构建的文库，通过淘选获得具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域的技术也是公知的。作为一例，构建的文库通过噬菌体展示法表达于噬菌体表面。表达与连接有牛血清白蛋白、生物素等的低分子化合物结合的结合结构域的噬菌体可以使用珠子、抗原管(immunotube)、板等来选择。这种具有低分子化合物结合活性的非抗体样抗原结合结构域的获得方法已经公知(Proc Natl Acad Sci U S A.1999Mar 2；96(5):1898-903)。进而，针对这些具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域，虽不限定于此，但通过分析晶体结构、制作突变体来评价结合活性，可以鉴定未参与结合低分子化合物的氨基酸位点、对经典结构的形成并不重要的氨基酸位点(J Mol Biol.2003Jul 4；330(2):385-96、Proteins.2003Oct 1；53(1):121-9)。通过在如此鉴定的氨基酸位点导入多样性，可以构建本发明中记载的文库。进而，作为本发明中的另一方案，还可以使用限定了氨基酸位点的文库。作为一例，虽不限定于此，在被报道作为非抗体样抗原结合结构域的、支持嗜中性粒细胞明胶酶结合脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等脂质运载蛋白分子中高度保守的8个反向平行链在中央方向上扭曲的桶结构的单侧的4个环区域即Anticalin中，用于结合低分子化合物的氨基酸位点与用于结合蛋白的氨基酸位点已知是不同的，公知可以使用对能够参与各自的结合的氨基酸位点进行了改变的彼此不同的文库(FEBSLett.2014Jan 21；588(2):213-8)。因此，由能够获得针对低分子化合物的结合结构域的文库获得该具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域后，相对于获得的该具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域，在用于获得具有蛋白结合活性的抗原结合结构域的氨基酸位点导入多样性，由此可以构建本发明的文库。更具体地，公知在人脂质运载蛋白2(Human lipocalin2,Lcn2)中，可以将V33、L36、I41、Y52、T54、S68、L70、W79、R81、K134、T136、Y138各氨基酸位点用作低分子化合物结合结构域获得用文库的多样性导入位点(JAm Chem Soc.2009Mar 18；131(10):3565-76)，另外相同地，可以将A40、L42、E44、K46、D47、Q49、K50、L70、R72、K73、D77、W79、P101、G102、L103、K125、S127、Q128、R130、Y132各氨基酸位点用作蛋白质结合结构域获得用文库的多样性导入位点(Proc Natl Acad Sci U SA.2009May 19；106(20):8198-203)。因此，首先使用包含使V33、L36、I41、Y52、T54、S68、L70、W79、R81、K134、T136、Y138各氨基酸位点具有多样性的抗原结合结构域的文库，获得该具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域后，相对于获得的该具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域，在A40、L42、E44、K46、D47、Q49、K50、R72、K73、D77、P101、G102、L103、K125、S127、Q128、R130、Y132各氨基酸位点导入多样性，由此可以构建本发明中记载的文库，但并不限定于此。关于脂质运载蛋白分子之外的非抗体样抗原结合结构域和抗体，通过适宜参照上述文库的构建方法，本领域技术人员可以制造本发明中的文库。另外，作为另一方案，可以利用具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域。作为一例，可以利用公知对ATP、ADP、AMP和腺苷具有结合活性的、属于脂质运载蛋白家族的Rhodnius prolixusaggregation inhibitor1(RPAI-1)(J Biol Chem.2000Apr 28；275(17):12639-50、Biochemistry.2002Mar19；41(11):3810-8)。虽不限定于此，通过分析该抗原结合结构域的晶体结构、制作突变体来评价结合活性，可以鉴定未参与结合低分子化合物的氨基酸位点、对经典结构的形成并不重要的氨基酸位点。通过在如此鉴定的氨基酸位点导入多样性，可以构建本发明中记载的文库。属于对ATP、ADP、AMP和腺苷、以及组胺、血清素、肾上腺素和去甲肾上腺素等各种低分子化合物具有结合活性的脂质运载蛋白家族的抗原结合结构域的存在是公知的(J Biol Chem.2003Feb 14；278(7):4611-7、Expert Rev ClinImmunol.2007Jul；3(4):491-501)，通过利用它们，可以构建使用了各种具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域的、本发明中记载的文库，但并不限定于此。
关于其它非抗体样抗原结合结构域和抗体，通过适宜参照上述文库的构建方法，本领域技术人员可以制造本发明中的文库。
作为本发明的非限定的1个方案，以腺苷和/或ATP为例，以下进行详细说明，但关于腺苷和/或ATP以外的低分子，也可以下述实例为准适宜适用。作为如上所述使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸，可例示形成腺苷和/或ATP结合模体的氨基酸。包含前述氨基酸的抗原结合结构域中的氨基酸的位置并不限于特定位置，只要是使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化，则可以是形成抗原结合结构域的重链可变区或轻链可变区中的任意位置。即，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要包含重链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子。在非限定的一个方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要包含重链的CDR1、CDR2、和/或CDR3中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子。在非限定的另一个方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要包含重链的FR1、FR2、FR3和/或FR4中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子。
另外，在本发明的一个方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要包含重链和/或轻链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸，且序列彼此不同的抗原结合分子。在非限定的一个方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要包含重链和/或轻链的CDR1、CDR2、和/或CDR3中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子。在非限定的一个方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要包含重链和/或轻链的FR1、FR2、FR3和/或FR4中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子。
作为这种氨基酸的非限定的一个方案，可以例示含有在重链可变区中的52位、52a位、53位、96位、100a位、或100c位的氨基酸中的任一者以上的氨基酸等。另外，作为这种氨基酸的非限定的一个方案，可以例示含有在重链可变区中的52位的Ser、52a位的Ser、53位的Arg、96位的Gly、100a位的Leu、100c位的Trp等氨基酸中的任一者以上的氨基酸。
对于抗原结合分子的轻链和/或重链可变区的框架序列，只要重链和/或轻链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸，则可以使用任意框架序列。框架序列的起源没有限定，可以由非人动物的任意生物或人获得。优选地，作为任意生物，优选可举出选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、和非人灵长类中的生物。在特别优选的实施方案中，理想的是抗原结合分子的轻链和/或重链可变区的框架序列具有人的种系框架序列。因此，在本发明的一个方案中，若框架序列完全为人的序列，则认为在给予人(例如疾病的治疗)时，本发明的抗原结合分子基本或完全不会引起免疫原性反应。根据上述含义，本发明的“含有种系序列”意指本发明的框架序列的一部分与任意的人的种系框架序列的一部分相同。具体地，本发明的框架序列优选与种系序列具有至少50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或100％以上的同源性。例如，在本发明的抗原结合分子的重链FR2序列为多个不同的人的种系框架序列的重链FR2序列组合得到的序列时，该抗原结合分子也是本发明的“含有种系序列”的抗原结合分子。此外，本发明的抗原结合分子的框架序列是经替换的序列时，该抗原结合分子也是本发明的“含有种系序列”的抗原结合分子。作为这种经替换的序列的实例，特别可举出：人的种系框架序列的一部分氨基酸被替换成使抗原结合分子对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸的序列。
作为框架的例子，例如优选列举现在已知的完全人型框架区的序列，其包含在V-Base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等网站中。这些框架区域的序列能够适宜用作本发明的抗原结合分子中所含的种系序列。种系序列可基于其相似性来分类(Tomlinson等(J.Mol.Biol.(1992)227,776-798)Williams和Winter(Eur.J.Immunol.(1993)23,1456-1461)和Cox等(Nat.Genetics(1994)7,162-168))。可以从分类为7个亚类的Vκ、分类为10个亚类的Vλ、分类为7个亚类的VH中适宜选择合适的种系序列。
完全人型VH序列并不仅限于下述，优选可举出例如：VH1亚类(例如，VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69)、VH2亚类(例如，VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3亚类(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4亚类(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5亚类(VH5-51)、VH6亚类(VH6-1)、VH7亚类(VH7-4、VH7-81)的VH序列等。它们也记载于公知文献(Matsuda等(J.Exp.Med.(1998)188,1973-1975))等中，本领域技术人员可以基于它们的序列信息适宜设计本发明的抗原结合分子。也可优选使用它们以外的完全人型框架或框架的亚区域(sub-region)。
完全人型Vκ序列并不仅限于下述序列，优选可举出例如：分类为Vk1亚类的A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、L11、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、O2、O4、O8、O12、O14、O18；分类为Vk2亚类的A1、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、O1、O11；分类为Vk3亚类的A11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25；分类为Vk4亚类的B3；分类为Vk5亚类的B2(本说明书中也称为Vk5-2))；分类为Vk6亚类的A10、A14、A26等(Kawasaki等(Eur.J.Immunol.(2001)31,1017-1028)、Schable和Zachau(Biol.Chem.Hoppe Seyler(1993)374,1001-1022)和Brensing-Kuppers等(Gene(1997)191,173-181))。
完全人型的Vλ序列并不仅限于下述序列，优选可举出例如：分类为VL1亚类的V1-2、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-20、V1-22；分类为VL1亚类的V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19；分类为VL3亚类的V3-2、V3-3、V3-4；分类为VL4亚类的V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6；分类为VL5亚类的V5-1、V5-2、V5-4、V5-6等(Kawasaki等(Genome Res.(1997)7,250-261))。
通常，这些框架序列根据一个或更多的氨基酸残基的区别而彼此不同。这些框架序列可以与本发明中的“使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的至少一个氨基酸残基”一起使用。作为与本发明的“使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的至少一个氨基酸残基”一起使用的完全人型框架的实例，并不仅限于此，另外还可举出KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY、POM等(例如，前述的Kabat等(1991)和Wu等(J.Exp.Med.(1970)132,211-250))。
本发明并不受特定理论的束缚，认为种系序列的使用有望排除大多数个体中的有害免疫反应的一个理由如下。通常的免疫反应中产生的亲和性成熟步骤的结果造成免疫球蛋白的可变区频繁地产生体细胞的突变。这些突变主要产生在其序列为超变的CDR的附近，对框架区的残基也造成影响。这些框架的突变在种系基因中不存在，而成为患者的免疫原性的可能性也小。另一方面，通常的人群暴露于种系基因所表达的框架序列的大多数，作为免疫耐受性的结果，预测这些种系框架在患者中的免疫原性低或为非免疫原性。为了使免疫耐受性的可能性达到最大，编码可变区的基因可以从通常存在的功能性种系基因的集合中选择。
为了制作本发明的、前述可变区序列的序列、重链可变区或轻链可变区的序列、或者CDR序列或框架序列中含有使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的氨基酸的抗原结合分子，可以适宜采用位点特异性诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR等公知方法。
例如，通过将被选择作为预先含有使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化的至少一个氨基酸残基的CDR序列和/或框架序列的轻链可变区、与被制作为随机可变区序列文库的重链可变区组合，可以制作含有本发明的多个序列彼此不同的抗原结合分子的文库。
另外，也可以设计成前述被选择作为预先含有使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据腺苷或ATP的存在或非存在而变化的至少一个氨基酸残基的CDR序列和/或框架序列的重链和/或轻链可变区的序列中含有作为该氨基酸残基以外的残基的各种氨基酸。本发明中，这样的残基也被称为柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要根据组织特异性化合物的浓度的条件而发生变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多个的柔性残基。可以通过腺苷和/或ATP与抗体的复合体的晶体结构分析或导入突变来鉴定柔性残基以及能否将该残基替换为其它何种氨基酸来制作文库。例如，根据腺苷和/或ATP与抗体的复合体的晶体结构分析，可以鉴定未参与腺苷和/或ATP的结合的抗体的残基。可以选择即使将被鉴定为不参与腺苷和/或ATP的结合的残基替换为其它氨基酸，也能将与化合物的结合维持于适当程度的氨基酸。藉此，可以设计所选择的氨基酸出现于所选择的残基的文库。该情形中，能够以形成将被鉴定为不参与腺苷和/或ATP的结合的残基替换为彼此不同的氨基酸而得的抗原结合分子的集合的方式，设计主要包含多个抗原结合分子的文库。即，通过组合被替换为彼此不同的氨基酸的各柔性残基，可以带来含有该柔性残基的抗原结合分子的序列多样性。
另外，还能够以被鉴定为参与腺苷和/或ATP的结合的残基的至少一个是选自该残基和不同于该残基的残基中的任意残基的方式，设计包含这些残基的抗原结合分子。作为被鉴定为参与腺苷和/或ATP的结合的氨基酸的非限定的一个方案，可例示重链可变区中所含的52位、52a位、53位、96位、100a位、或100c位的氨基酸中的任一者以上的氨基酸等。另外，作为这种氨基酸的非限定的一个方案，可以例示含有在重链可变区中的52位的Ser、52a位的Ser、53位的Arg、96位的Gly、100a位的Leu、100c位的Trp等氨基酸中的任一者以上的氨基酸。例如，在前述100a位的Leu被鉴定为参与腺苷和/或ATP的结合时，文库中所含的抗原结合分子的100a位的氨基酸残基除了Leu之外，还可以是选自His、Met、Leu、Arg、Trp、或Tyr的任一柔性残基中的氨基酸残基。
作为前述柔性残基的非限定的一个方案，可例示重链可变区中所含的31位、32位、33位、35位、50位、55位、56位、57位、58位、59位、95位、96位、97位、98位、99位、100位、100a位、和100b位的氨基酸。作为这种氨基酸的其它的非限定的一个方案，可例示轻链可变区中所含的26位、27位、27a位、27b位、27c位、28位、29位、31位、32位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、89位、90位、91位、92位、93位、94位、95a位、96位、和97位的氨基酸。
作为前述柔性残基的非限定的一个方案，可例示作为重链可变区中所含的氨基酸的下述氨基酸：
31位的氨基酸为Asp、Gly、Asn、Ser、Arg、或Thr中的任一者，
32位的氨基酸为Ala、Phe、His、Asn、Ser、或Tyr中的任一者，
33位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Asn、Gln、Pro、Ser、Arg、Trp、Val、Tyr、或Thr中的任一者，
35位的氨基酸为His、Ser、Thr、Tyr、或Asn中的任一者，
50位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Asn、Gln、Pro、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Ser中的任一者，
55位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Gly、Leu、Thr、Ser、Arg、或Asn中的任一者，
56位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Gln、Pro、Ser、Thr、Trp、Val、或Tyr中的任一者，
57位的氨基酸为Ala、Lys、Arg、Thr、或Ile中的任一者，
58位的氨基酸为Asp、Gly、Phe、His、Ser、Thr、Tyr、或Asn中的任一者，
59位的氨基酸为Leu、或Tyr中的任一者，
95位的氨基酸为Ala、Ile、Lys、Met、Leu、Arg、Trp、Val、Tyr、或Phe中的任一者，
96位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、或Ser中的任一者，
97位的氨基酸为Ala、Asp、Gly、Ile、His、Lys、Met、Leu、Asn、Ser、Val、Tyr、或Arg中的任一者，
98位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Met、Leu、Asn、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Lys中的任一者，
99位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Phe、His、Lys、Asn、Gln、Ser、Arg、Trp、Val、Tyr、或Gly中的任一者，
100位的氨基酸为Ala、Glu、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Asn、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Asp中的任一者，
100a位的氨基酸为Ala、Phe、Ile、His、Lys、Met、Arg、Trp、Val、或Tyr中的任一者，或
100b位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Asn中的任一者。
作为前述柔性残基的非限定的一个方案，可例示作为轻链可变区中所含的氨基酸的下述氨基酸：
26位的氨基酸为Ala、Ser、或Thr中的任一者，
27位的氨基酸为Thr、或Ser中的任一者，
27a位的氨基酸为Gly、Asn、Thr、或Ser中的任一者，
27b位的氨基酸为Asn、或Asp中的任一者，
27c位的氨基酸为Ile、或Val中的任一者，
28位的氨基酸为Asp、或Gly中的任一者，
29位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Ser、Arg、Thr、Tyr、或Gly中的任一者，
31位的氨基酸为Glu、Asp、Lys、或Asn中的任一者，
32位的氨基酸为Ala、Asp、Ser、Thr、或Tyr中的任一者，
50位的氨基酸为Asp、Gly、Lys、Asn、Gln、Ser、Arg、Tyr、或Glu中的任一者，
51位的氨基酸为Asp、Gly、Lys、Asn、Thr、或Val中的任一者，
52位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、或Ser中的任一者，
53位的氨基酸为Glu、Asp、His、Asn、Gln、Ser、Tyr、或Lys中的任一者，
54位的氨基酸为Lys、或Arg中的任一者，
55位的氨基酸为Leu、或Pro中的任一者，
89位的氨基酸为Ala、Gly、Phe、Leu、Asn、Gln、Thr、Val、Tyr、或Ser中的任一者，
90位的氨基酸为Ala、Leu、Thr、Val、或Ser中的任一者，
91位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、His、Lys、Asn、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、或Tyr中的任一者，
92位的氨基酸为Glu、Asp、Ser、Arg、Thr、Val、Tyr、或Ala中的任一者，
93位的氨基酸为Ala、Asp、Ile、Asn、Ser、Arg、Thr、Val、Tyr、或Gly中的任一者，
94位的氨基酸为Ala、Asp、Gly、Ile、Asn、Arg、Thr、或Ser中的任一者，
95位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Asn中的任一者，
95a位的氨基酸为Ala、Glu、Asp、Gly、Ile、His、Lys、Leu、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Tyr、或Asn中的任一者，
96位的氨基酸为Ala、Asp、Gly、Phe、His、Lys、Leu、Asn、Gln、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val中的任一者，或
97位的氨基酸为Ala、Gly、Ile、Met、Leu、Ser、或Val中的任一者。
作为本发明的一个方案，在低分子化合物为犬尿氨酸的情形中，可以通过犬尿氨酸与抗体的复合体的晶体结构分析或导入突变来鉴定柔性残基以及能否将该残基替换为其它何种氨基酸来制作文库。例如，根据犬尿氨酸与抗体的复合体的晶体结构分析，可以鉴定未参与犬尿氨酸的结合的抗体的残基。可以选择即使将被鉴定为不参与犬尿氨酸的结合的残基替换为其它氨基酸，也能将与化合物的结合维持于适当程度的氨基酸。藉此，可以设计所选择的氨基酸出现于所选择的残基的文库。此时，可以以形成鉴定为未参与结合犬尿氨酸的残基被替换为彼此不同的氨基酸的抗原结合分子的集合的方式设计主要包含多个抗原结合分子的文库。即，通过组合被替换为彼此不同的氨基酸的各柔性残基，可以带来含有该柔性残基的抗原结合分子的序列多样性。
另外，还能够以被鉴定为参与犬尿氨酸的结合的残基的至少一个是选自该残基和不同于该残基的残基中的任意残基的方式，设计包含这些残基的抗原结合分子。作为被鉴定为参与犬尿氨酸的结合的氨基酸的非限定的一个方案，作为其侧链参与和犬尿氨酸结合的氨基酸残基，可例示H链：P97、R100c、D101(Kabat编号)，L链：H49、F55(Kabat编号)的氨基酸中的任一者以上的氨基酸。另外，作为在主链部分充分参与结合犬尿氨酸的氨基酸残基，可例示H链：R94、D95、R100c、G100d、A100e的氨基酸中的任一者以上的氨基酸。进而，根据X射线晶体结构，作为在将H链CDR3的结构维持于犬尿氨酸的结合构型方面重要的残基，可例示H链：P97、P100b、G100d的氨基酸中的任一者以上的氨基酸。
作为本发明中的低分子为犬尿氨酸时的柔性残基的非限定的一个方案，可例示重链可变区中所含的24位、26位、27位、28位、29位、30位、31位、32位、33位、50位、51位、52位、52a位、53位、54位、55位、56位、58位、73位、95位、96位、97位、98位、99位、100位、100a位、100b位、100c位、100d位、100e位、100f位、和102位的氨基酸。作为这种氨基酸的其它的非限定的一个方案，可例示轻链可变区中所含的27d位、27e位、28位、29位、32位、46位、49位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、92位、93位、和94位的氨基酸。
作为前述柔性残基的非限定的一个方案，可例示作为重链可变区中所含的氨基酸的下述氨基酸：
24位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
26位的氨基酸为Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
27位的氨基酸为Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
28位的氨基酸为Thr、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
29位的氨基酸为Phe、Ile、Leu、Trp、或Tyr中的任一者，
30位的氨基酸为Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
31位的氨基酸为Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
32位的氨基酸为Tyr、Phe、或His中的任一者，
33位的氨基酸为Ala、Gly、Ile、Lys、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Trp中的任一者，
50位的氨基酸为Gly、Ala、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
51位的氨基酸为Ile、Ala、Gly、Lys、Leu、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
52位的氨基酸为Ile、Ala、Glu、Phe、His、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
52a位的氨基酸为Pro、Ala、Gly、Ser、Thr、或Trp中的任一者，
53位的氨基酸为Ile、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
54位的氨基酸为Phe、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
55位的氨基酸为Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
56位的氨基酸为Thr、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
58位的氨基酸为Asn、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
73位的氨基酸为Glu、Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者，
95位的氨基酸为Asp、或Gly中的任一者，
96位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
97位的氨基酸为Pro、Ala、Asn、或Ser中的任一者，
98位的氨基酸为Val、Leu、或Thr、中的任一者，
99位的氨基酸为Val、Ala、Asp、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、或Tyr中的任一者，
100位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
100a位的氨基酸为Arg、Ala、Asp、Glu、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr或Val中的任一者，
100b位的氨基酸为Pro、Ala、Lys、Asn、Gln、Arg或Ser中的任一者，
100c位的氨基酸为Arg、His、Lys、或Gln中的任一者，
100d位的氨基酸为Gly、或Asn中的任一者，
100e位的氨基酸为Ala、Gly或Ser中的任一者，
100f位的氨基酸为Phe、或Leu中的任一者，或
102位的氨基酸为Ile、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者。
作为前述柔性残基的非限定的一个方案，可例示作为轻链可变区中所含的氨基酸的下述氨基酸：
27d位的氨基酸为His、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
27e位的氨基酸为Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
28位的氨基酸为Asp、Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
29位的氨基酸为Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
32位的氨基酸为Tyr、Ala、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Val、或Trp中的任一者，
46位的氨基酸为Leu、Ile、Met、Asn、或Val中的任一者，
49位的氨基酸为Tyr、Phe、His、或Trp中的任一者，
50位的氨基酸为Glu、Ala、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者，
51位的氨基酸为Ile、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
52位的氨基酸为Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
53位的氨基酸为Asn、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
54位的氨基酸为、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
55位的氨基酸为Phe、Leu、Met、Arg、或Tyr中的任一者，
92位的氨基酸为Thr、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
93位的氨基酸为Gln、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Asn、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者，或
94位的氨基酸为Phe、His、Ile、Lys、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者。
作为本发明中的低分子为犬尿氨酸时的柔性残基的非限定的另外一个方案，可例示重链可变区中所含的28位、31位、33位、50位、51位、52位、54位、55位、56位、58位、96位、97位、99位、100位、100a位、100b位、和100c位的氨基酸。作为这种氨基酸的另一非限定的一个方案，可例示轻链可变区中所含的27d位、27e位、28位、29位、32位、52位、53位、54位、56位、92位、和93位的氨基酸。
作为本发明的一个方案，在低分子化合物为腺苷的情形中，可以通过腺苷与抗体的复合体的晶体结构分析或导入突变来鉴定柔性残基以及能否将该残基替换为其它何种氨基酸来制作文库。例如，根据腺苷与抗体的复合体的晶体结构分析，可以鉴定未参与腺苷的结合的抗体的残基。可以选择即使将被鉴定为未参与腺苷的结合的残基替换为其它氨基酸，也能将与化合物的结合维持于适当程度的氨基酸。藉此，可以设计所选择的氨基酸出现于所选择的残基的文库。此时，可以以形成鉴定为未参与结合腺苷的残基被替换为彼此不同的氨基酸的抗原结合分子的集合的方式设计主要包含多个抗原结合分子的文库。即，通过组合被替换为彼此不同的氨基酸的各柔性残基，可以带来含有该柔性残基的抗原结合分子的序列多样性。
另外，还能够以被鉴定为参与腺苷的结合的残基的至少一个是选自该残基和不同于该残基的残基中的任意残基的方式，设计包含这些残基的抗原结合分子。作为被鉴定为参与腺苷结合的氨基酸的非限定的一个方案，可例示H链：A33、I50、G52、S56、T57、W58、G99、Y100、T100a(Kabat编号)，L链：Y95c、N96(Kabat编号)的氨基酸中的任一者以上的氨基酸。
作为本发明中的低分子为腺苷时的柔性残基的非限定的一个方案，可例示重链可变区中所含的31位、32位、53位、54位、55位、56位、57位、59位、61位、62位、65位、96位、97位、98位、100位、100a位、101位、和102位的氨基酸。作为这种氨基酸的另一非限定的一个方案，可例示轻链可变区中所含的28位、29位、32位、93位、94位、95位、95a位、95b位、和95c位的氨基酸。
作为前述柔性残基的非限定的一个方案，可例示作为重链可变区中所含的氨基酸的下述氨基酸：
31位的氨基酸为Asn、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
32位的氨基酸为Tyr、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、或Trp中的任一者，
53位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者，
54位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Gln、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者，
55位的氨基酸为Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Gln、Arg、Thr、Val、或Tyr中的任一者，
56位的氨基酸为Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Thr、或Val中的任一者，
57位的氨基酸为Thr、Ala、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser或Val中的任一者，
59位的氨基酸为Tyr、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Trp中的任一者，
61位的氨基酸为Ser、Ala、Phe、His、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
62位的氨基酸为Trp、Ala、Asp、Glu、Phe、或Gly中的任一者，
65位的氨基酸为Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、或Trp中的任一者，
96位的氨基酸为Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Asn、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
97位的氨基酸为Phe、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
98位的氨基酸为Val、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、或Thr中的任一者，
100位的氨基酸为Tyr或Phe中的任一者，
100a位的氨基酸为Thr、Ser或Val中的任一者，
101位的氨基酸为Asp、Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，或
102位的氨基酸为Pro、Asp、或Asn中的任一者。
作为前述柔性残基的非限定的一个方案，可例示作为轻链可变区中所含的氨基酸的下述氨基酸：
28位的氨基酸为Trp、Ala、Phe、His、Lys、Asn、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者
29位的氨基酸为Asn、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
32位的氨基酸为Tyr、Ala、Asp、Phe、Gly、或His中的任一者，
93位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Leu、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者，
94位的氨基酸为Asn、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
95位的氨基酸为Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
95a位的氨基酸为Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
95b位的氨基酸为Trp、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者，或
95c位的氨基酸为Tyr、Phe、His、Lys、Leu、Asn或Val中的任一者。
作为本发明的一个方案，在低分子化合物为一磷酸腺苷的情形中，可以通过一磷酸腺苷与抗体的复合体的晶体结构分析以及基于作为类似化合物的腺苷与抗体的复合体的晶体结构的建模、导入突变来鉴定柔性残基以及能否将该残基替换为其它何种氨基酸来制作文库。例如，根据使用腺苷与抗体的复合体的晶体结构分析的建模，可以鉴定未参与一磷酸腺苷的结合的抗体的残基。可以选择即使将被鉴定为未参与一磷酸腺苷的结合的残基替换为其它氨基酸，也能将与化合物的结合维持于适当程度的氨基酸。藉此，可以设计所选择的氨基酸出现于所选择的残基的文库。此时，可以以形成鉴定为未参与结合一磷酸腺苷的残基被替换为彼此不同的氨基酸的抗原结合分子的集合的方式设计主要包含多个抗原结合分子的文库。即，通过组合被替换为彼此不同的氨基酸的各柔性残基，可以带来含有该柔性残基的抗原结合分子的序列多样性。
另外，还能够以被鉴定为参与一磷酸腺苷的结合的残基的至少一个是选自该残基和不同于该残基的残基中的任意残基的方式，设计包含这些残基的抗原结合分子。被鉴定为参与一磷酸腺苷的腺嘌呤环部分以及核糖部分的结合的氨基酸与腺苷相同，作为非限定的一个方案，可例示H链：A33、I50、G52、S56、T57、W58、G99、Y100、T100a(Kabat编号)，L链：Y95c、N96(Kabat编号)的氨基酸中的任一者以上的氨基酸。另外，作为被鉴定为参与一磷酸腺苷的磷酸基部分的结合的氨基酸的非限定的一个方案，可例示H链CDR2的D54、S55、S56、T57、W58，以及L链CDR3的G95a、W95b、Y95c(Kabat编号)的氨基酸中的任一者以上的氨基酸。
作为前述柔性残基的非限定的一个方案，可例示作为重链可变区中所含的氨基酸的下述氨基酸：
31位的氨基酸为Asn、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
32位的氨基酸为Tyr、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、或Trp中的任一者，
53位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者，
54位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Gln、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者，
55位的氨基酸为Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Gln、Arg、Thr、Val、或Tyr中的任一者，
56位的氨基酸为Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Thr、或Val中的任一者，
57位的氨基酸为Thr、Ala、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser或Val中的任一者，
59位的氨基酸为Tyr、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Trp中的任一者，
61位的氨基酸为Ser、Ala、Phe、His、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
62位的氨基酸为Trp、Ala、Asp、Glu、Phe、或Gly中的任一者，
65位的氨基酸为Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、或Trp中的任一者，
96位的氨基酸为Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Asn、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
97位的氨基酸为Phe、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
98位的氨基酸为Val、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、或Thr中的任一者，
100位的氨基酸为Tyr或Phe中的任一者，
100a位的氨基酸为Thr、Ser或Val中的任一者，
101位的氨基酸为Asp、Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，或
102位的氨基酸为Pro、Asp、或Asn中的任一者。
作为前述柔性残基的非限定的一个方案，可例示作为轻链可变区中所含的氨基酸的下述氨基酸：
28位的氨基酸为Trp、Ala、Phe、His、Lys、Asn、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者
29位的氨基酸为Asn、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
32位的氨基酸为Tyr、Ala、Asp、Phe、Gly、或His中的任一者，
93位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Leu、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者，
94位的氨基酸为Asn、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
95位的氨基酸为Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
95a位的氨基酸为Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Val、Trp、或Tyr中的任一者，
95b位的氨基酸为Trp、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中的任一者，或
95c位的氨基酸为Tyr、Phe、His、Lys、Leu、Asn或Val中的任一者。
作为本发明的一个方案，在低分子化合物为二磷酸腺苷、或三磷酸腺苷的情形中，可以通过二磷酸腺苷或三磷酸腺苷与抗体的复合体的晶体结构分析以及基于作为类似化合物的腺苷与抗体的复合体的晶体结构的建模、导入突变来鉴定柔性残基和能否将该残基替换为其它何种氨基酸来制作文库。例如，根据使用二磷酸腺苷或三磷酸腺苷与抗体的复合体的晶体结构分析的建模，可以鉴定未参与二磷酸腺苷或三磷酸腺苷的结合的抗体的残基。可以选择即使将被鉴定为未参与二磷酸腺苷或三磷酸腺苷的结合的残基替换为其它氨基酸，也能将与化合物的结合维持于适当程度的氨基酸。藉此，可以设计所选择的氨基酸出现于所选择的残基的文库。此时，可以以形成鉴定为未参与结合二磷酸腺苷或三磷酸腺苷的残基被替换为彼此不同的氨基酸的抗原结合分子的集合的方式设计主要包含多个抗原结合分子的文库。即，通过组合被替换为彼此不同的氨基酸的各柔性残基，可以带来含有该柔性残基的抗原结合分子的序列多样性。
另外，还能够以被鉴定为参与二磷酸腺苷或三磷酸腺苷的结合的残基的至少一个是选自该残基和不同于该残基的残基中的任意残基的方式，设计包含这些残基的抗原结合分子。被鉴定为参与二磷酸腺苷或三磷酸腺苷的腺嘌呤环部分以及核糖部分的结合的氨基酸与腺苷相同，作为非限定的一个方案，可例示H链：A33、I50、G52、S56、T57、W58、G99、Y100、T100a(Kabat编号)，L链：Y95c、N96(Kabat编号)的氨基酸中的任一者以上的氨基酸。被鉴定为参与二磷酸腺苷或三磷酸腺苷的磷酸基部分的结合的氨基酸，通过基于晶体结构进行与上述相同的考察，还可以预测能够增强与二磷酸腺苷或三磷酸腺苷的结合的改变。
本说明书中，柔性残基是指在与公知和/或天然抗体或抗原结合结构域的氨基酸序列进行比较时，具有在该位置上出现的数个不同氨基酸的轻链和重链可变区上的氨基酸为超变的位置上存在的氨基酸残基的改变。超变的位置一般存在于CDR区域。一个方案中，在确定公知和/或天然抗体的超变位置时，Kabat,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.)(1987年和1991年)所提供的数据是有效的。此外，因特网上的多个数据库(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)中提供有收集的大量人轻链和重链的序列以及其配置，这些序列及其配置的信息对于确定本发明中的超变位置有用。根据本发明，当氨基酸在某位置具有优选约2至约20、优选约3至约19、优选约4至约18、优选5至17、优选6至16、优选7至15、优选8至14、优选9至13、优选10至12个可能的不同的氨基酸残基的多样性时，可以说该位置是超变的。在数个实施方案中，某氨基酸位置可以具有优选至少约2、优选至少约4、优选至少约6、优选至少约8、优选约10、优选约12个可能的不同氨基酸残基的多样性。
另外，通过将前述导入有使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据低分子的存在或非存在而变化的至少一个氨基酸残基的轻链可变区和被制作为随机可变区序列文库的重链可变区组合，也可以制作本发明中的含有多个序列彼此不同的抗原结合分子的文库。同样地，通过将导入有前述使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据低分子的存在或非存在而变化的至少一个氨基酸残基、并且使其以外的氨基酸残基设计为柔性残基的重链可变区组合，也可以制作本发明的含有多个序列彼此不同的抗原结合分子的文库。
在将前述导入有“使抗原结合分子对抗原的结合活性根据低分子化合物的浓度的条件而变化的至少一个氨基酸残基”的轻链可变区和制作为随机可变区序列文库的重链可变区组合时，也可以与前述相同地，以柔性残基包含在该轻链可变区序列中的形式来设计。只要本发明的抗原结合分子的抗原结合活性根据腺苷和/或ATP的存在或非存在而变化，则该柔性残基的数量和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多个的柔性残基。
作为要组合的重链可变区的实例，优选可举出随机可变区文库。随机可变区文库的制作方法适宜组合公知的方法。本发明的非限定的一个方案中，根据用特定抗原免疫的动物、感染疾病患者或接种疫苗而使血中抗体效价上升的人、癌患者、自身免疫疾病的淋巴细胞来源的抗体基因而构建的免疫文库可以优选用作随机可变区文库。
此外，在本发明的非限定的一个方案中，将基因组DNA中的V基因或重构功能性V基因的CDR序列用包含适当程度的编码密码子组的序列的合成寡核苷酸组替换而得的合成文库也可以优选用作随机可变区文库。此时，由于观察到重链的CDR3的基因序列的多样性，因而也可仅替换CDR3的序列。抗原结合分子的可变区中产生氨基酸的多样性的基准是，抗原结合分子的露出于表面的位置的氨基酸残基具有多样性。露出于表面的位置是指，根据抗原结合分子的结构、结构总体和/或模型化结构，判断为可以露出于表面和/或可与抗原接触的位置，通常为其CDR。露出于表面的位置优选使用InsightII程序(Accelrys)之类的计算机程序，使用来自抗原结合分子的三维模型的坐标来确定。露出于表面的位置可使用本技术领域公知的算法(例如，Lee和Richards(J.Mol.Biol.(1971)55,379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16,548-558))来确定。露出于表面的位置的确定可使用由适于蛋白建模的软件和抗体得到的三维结构信息来进行。作为可用于上述目的的软件，优选列举SYBYL生物体高分子模量软件(Tripos Associates)。通常或优选地，在算法需要使用者输入大小参数时，计算中使用的探针的“大小”设定为半径约1.4埃以下。进而，使用个人电脑用软件的露出于表面的区域和面积的确定方法记载于Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4),377-386和J.Mol.Model.(1995)1,46-53)中。
另外，在本发明的非限定的一个方案中，为了提高抗体的稳定性，也可以适宜改变含有CDR区和/或框架区的可变区的氨基酸。作为这种氨基酸的非限定的一个方案，可以例示1位、5位、10位、30位、48位、58位的氨基酸。更具体地，可例示1位的Gln、5位的Gln、10位的Asp、30位的Asn、48位的Leu、58位的Asn。为了提高抗体的稳定性，可以将这些氨基酸替换为种系序列中所含的对应的氨基酸。作为这样的种系的非限定的一个方案的序列，可例示VH3-21的序列。该情形中，可以将1位的Gln替换为Glu、5位的Gln替换为Val、10位的Asp替换为Gly、30位的Asn替换为Ser、48位的Leu替换为Val、58位的Asn替换为Tyr。
进而，在本发明的非限定的一个方案中，由来源于正常人淋巴细胞的抗体基因构建、且由其组成成分不含偏差的抗体序列即天然(naive)序列构成的天然文库也可特别优选用作随机可变区文库(Gejima等(Human Antibodies(2002)11,121-129)和Cardoso等(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。本发明中记载的包含天然序列的氨基酸序列是指由上述天然文库获得的氨基酸序列。
Fc区
Fc区包含来源于抗体重链恒定区的氨基酸序列。Fc区是从以EU编号表示的大约216位氨基酸的木瓜蛋白酶切割位点的铰链区N末端开始，包含该铰链、CH2和CH3结构域的抗体重链恒定区的一部分。Fc区可由人IgG1获得，但并不限于IgG的特定的亚类。作为该Fc区的优选实例，可举出如下所述在pH酸性范围内具有对FcRn的结合活性的Fc区。另外，该Fc区的优选实例还可举出如下所述具有Fcγ受体结合活性的Fc区。作为这种Fc区的非限定的一个方案，例示人IgG1(SEQ ID NO:5)、IgG2(SEQ ID NO:6)、IgG3(SEQ ID NO:7)、或IgG4(SEQ ID NO:8)所示的Fc区。
Fcγ受体(FcγR)
Fcγ受体(也记为FcγR)是指可与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体Fc区结合的受体，实质上指Fcγ受体基因所编码的蛋白家族的任意成员。就人而言，该家族包含：包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)；包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131。即，FcγRIIa(H)和FcγRIIa(R))、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)；以及包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158。即，FcγRIIIa(V)和FcγRIIIa(F))和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)、以及任何未发现的人FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但并不限定于此。FcγR可来源于任意的生物，包括人、小鼠、大鼠、兔和猴，但并不限定于此。小鼠FcγR类中包括：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(FcγRIV、CD16-2)、以及任意的未发现的小鼠FcγR类或FcγR同种型或异型，但并不限定于此。作为这种Fcγ受体的优选例子，可举出：人FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)和/或FcγRIIIb(CD16)。人FcγRI的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：9(NM_000566.3)和10(NP_000557.1)中；人FcγRIIa(同种异型H131)的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：11(BC020823.1)和12(AAH20823.1)(同种异型R131是SEQ ID NO：12的166位的氨基酸被替换为Arg的序列)中；FcγRIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：13(BC146678.1)和14(AAI46679.1)中；FcγRIIIa的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：15(BC033678.1)和16(AAH33678.1)中；和FcγRIIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：17(BC128562.1)和18(AAI28563.1)中(括号内示出RefSeq等数据库登录编号)。Fcγ受体对IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区是否具有结合活性，除了上述记载的FACS或ELISA形式之外，还可通过ALPHA筛选(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面等离子共振(SPR)现象的BIACORE法等来确认(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103(11),4005-4010)。
包括FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)以及包括同种型FcγRIIIa(含有异型V158和F158)和FcγRIIIb(含有异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)中，与IgG的Fc区结合的α链和具有在细胞内传导活化信号的ITAM的共有γ链缀合。另一方面，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)自身的细胞质结构域中含有ITAM。这些受体表达于巨噬细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞等众多免疫细胞。通过这些受体与IgG的Fc区结合而传递的活化信号使得巨噬细胞吞噬能力、炎性细胞因子的产生、肥大细胞的脱粒、抗原呈递细胞的功能亢进受到促进。如上所述，具有传导活化信号能力的Fcγ受体在本说明书中也称为活性型Fcγ受体。
另一方面，FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)自身的细胞质内结构域中含有传递抑制型信号的ITIM。B细胞中，FcγRIIb和B细胞受体(BCR)的交联使得来自BCR的活化信号受到抑制，结果BCR的抗体产生受到抑制。巨噬细胞中，FcγRIII与FcγRIIb的交联使得吞噬能力和炎性细胞因子的产生能力受到抑制。如上所述，具有传导抑制信号能力的Fcγ受体在本说明书中也称为抑制型Fcγ受体。
Fc区对FcγR的结合活性
如上所述，作为本发明的抗原结合分子所含的Fc区，可举出具有Fcγ受体结合活性的Fc区。作为这种Fc区的非限定的一个方案，例示人IgG1(SEQ ID NO:5)、IgG2(SEQ IDNO:6)、IgG3(SEQ ID NO:7)、或IgG4(SEQ ID NO:8)所示的Fc区。Fcγ受体对IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区是否具有结合活性，除了上述记载的FACS或ELISA形式之外，还可通过ALPHA筛选(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面等离子共振(SPR)现象的BIACORE法等来确认(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103(11),4005-4010)。
ALPHA筛选是通过使用供体和受体这2种珠的ALPHA技术基于下述原理来实施。结合于供体珠的分子和结合于受体珠的分子发生生物学相互作用，仅在2种珠接近的状态时检测出发光信号。由激光激发的供体珠内的光敏剂将周围的氧转换为激发状态的单线态氧。单线态氧扩散至供体珠周围，到达接近的受体珠时，引起珠内的化学发光反应，最终发出光。结合于供体珠的分子和结合于受体珠的分子不发生相互作用时，供体珠产生的单线态氧不会到达受体珠，因而不会引起化学发光反应。
例如，将含有经生物素标记的Fc区的抗原结合分子与供体珠结合，将经谷胱甘肽S转移酶(GST)标签化的Fcγ受体与受体珠结合。在包含竞争Fc区改变体的抗原结合分子的非存在下，具有天然型Fc区的抗原结合分子与Fcγ受体发生相互作用，产生520-620nm的信号。含有没有标签的Fc区改变体的抗原结合分子与具有天然型Fc区的抗原结合分子竞争与Fcγ受体间的相互作用。通过对反映竞争结果的荧光的减少进行定量，可以确定相对结合亲和性。使用Sulfo-NHS-生物素等来将抗体等抗原结合分子生物素化是公知的。作为用GST将Fcγ受体标签化的方法，可适宜地采用下述方法：将编码Fcγ受体的多核苷酸和编码GST的多核苷酸进行框内融合而成的融合基因可操作地与载体连接，在保持有该载体的细胞等中进行表达，使用谷胱甘肽柱来进行纯化。所得的信号可以通过使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad社、San Diego)等软件，与利用非线性回归分析的单位点竞争(one-sitecompetition)模型拟合而适宜地分析。
将观察相互作用的物质的一方(配体)固定在传感器芯片的金薄膜上，若从传感器芯片的背侧接受光以使在金薄膜和玻璃的界面发生全反射，则反射光的一部分会形成反射强度降低的部分(SPR信号)。将观察相互作用的物质的另一方(分析物)加载于传感器芯片的表面，配体和分析物若结合，则固定的配体分子的质量会增加，传感器芯片表面的溶剂的折射率会发生变化。由于该折射率的变化，SPR信号的位置发生偏移(相反，若结合发生解离则信号的位置会返回)。Biacore系统将上述偏移的量、即传感器芯片表面的质量变化作为纵轴，将质量的时间变化作为测定数据表示(传感图)。由传感图的曲线可求出动力学参数：结合速度常数(ka)和解离速度常数(kd)，由此该常数之比可求出亲和性(KD)。BIACORE法中还优选使用抑制测定法。抑制测定法的实例记载在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103(11),4005-4010中。
Fcγ受体(FcγR)结合改变Fc区
作为本发明所含的Fc区，除了人IgG1(SEQ ID NO:5)、IgG2(SEQ ID NO:6)、IgG3(SEQ ID NO:7)、或IgG4(SEQ ID NO:8)所示的Fc区之外，还可适宜使用Fcγ受体结合活性较天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性高的FcγR结合改变Fc区。本说明书中，“天然型人IgG的Fc区”意指与SEQ ID NO:5、6、7或8所示的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区的EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的Fc区。这种FcγR结合改变Fc区可通过改变天然型人IgG的Fc区的氨基酸来制作。FcγR结合改变Fc区的FcγR结合活性是否比天然型人IgG的Fc区的FcγR结合活性高，这可以采用上述结合活性一项中记载的方法来适当实施。
本发明中，Fc区的“氨基酸的改变”或“氨基酸改变”包括改变成与起始Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。只要起始Fc区的修饰改变体可以在pH中性范围与人Fcγ受体结合，则可使用任何Fc区作为起始Fc区。此外，将已进行了改变的Fc区作为起始Fc区并进一步进行了改变而得到的Fc区也可优选用作本发明的Fc区。起始Fc区可指多肽自身、含有起始Fc区的组合物或编码起始Fc区的氨基酸序列。起始Fc区可包括抗体一项中概述的通过重组产生的公知的Fc区。起始Fc区的起源没有限定，可以由非人动物的任意生物或人获得。优选地，作为任意生物，优选可举出选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、和非人灵长类中的生物。在其他方案中，起始Fc区还可由食蟹猴、狨猴、恒河猴、黑猩猩、或人中获得。优选起始Fc区可由人IgG1获得，但不限于IgG的特定类别。这意味着可以适宜使用人IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的Fc区来作为起始Fc区。同样地，本说明书中也意指可以将来源于前述任意生物的IgG的任意种类或亚类的Fc区优选用作起始Fc区。天然存在的IgG的变体或修饰型的实例记载于公知文献(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),685-91、Curr.Opin.Immunol.(2008)20(4),460-470、Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4),195-202、国际公开WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635、和WO2006/105338)中，但并不受其限定。
作为改变的实例，包括一个以上的变异，例如替换成与起始Fc区的氨基酸不同的氨基酸残基的变异、或者向起始Fc区的氨基酸中插入一个以上的氨基酸残基或从起始Fc区的氨基酸中缺失一个以上的氨基酸等。优选改变后的Fc区氨基酸序列包含含有非天然产生的Fc区的至少一部分的氨基酸序列。这种变体与起始Fc区必然具有不足100％的序列同一性或相似性。在优选的实施方案中，变体具有与起始Fc区的氨基酸序列为约75％～小于100％的氨基酸序列同一性或类似性、更优选为约80％～小于100％、更优选为约85％～小于100％、更优选为约90％～小于100％、最优选为约95％～小于100％的同一性或类似性的氨基酸序列。在本发明的非限定的一个方案中，起始Fc区和本发明的FcγR结合改变Fc区之间具有至少1个氨基酸的差异。起始Fc区与本发明的FcγR结合改变Fc区的氨基酸的不同可优选通过特别是上述的以EU编号特定的氨基酸残基位置的特定氨基酸的不同来规定。这种变体的制作方法例示于“氨基酸对改变”一项。
本发明的抗原结合分子所含的、Fcγ受体结合活性高于天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性的FcγR结合改变Fc区(FcγR结合改变Fc区)可通过任意方法获得，具体地，可通过被用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸的改变来获得该FcγR结合改变Fc区。作为用于改变的优选的IgG型免疫球蛋白的Fc区，可举出例如，SEQ ID NO:5、6、7或8所示的人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、和它们的改变体)的Fc区。
对于向其它氨基酸的改变，只要Fcγ受体结合活性较天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性高，则任何位置的氨基酸均可改变。在抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为人Fc区的情况下，优选包含带来Fcγ受体结合活性较与EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性高的效果的改变。作为这种氨基酸的改变，例如在国际公开WO2007/024249、WO2007/021841、WO2006/031370、WO2000/042072、WO2004/029207、WO2004/099249、WO2006/105338、WO2007/041635、WO2008/092117、WO2005/070963、WO2006/020114、WO2006/116260和WO2006/023403等中有报道。
测定本发明的抗原结合分子所含的Fcγ受体结合结构域与Fcγ受体的结合活性的pH条件可以适宜使用pH酸性范围至pH中性范围的条件。作为测定本发明的抗原结合分子所含的Fcγ受体结合结构域与Fcγ受体的结合活性的条件的pH酸性范围至pH中性范围，通常意指pH5.8～pH8.0。优选为由pH6.0～pH7.4的任意pH值表示的范围，优选从pH6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3和7.4中选择，特别优选为与癌组织的pH接近的pH6.15～7.4(Vaupel等(Cancer Res.(1989)49,6449-6665))。作为在测定条件中使用的温度，Fcγ受体结合结构域与人Fcγ受体的结合亲和性可在10℃～50℃的任意温度下进行评价。为了确定人Fcγ受体结合结构域与Fcγ受体的结合亲和性，优选使用15℃～40℃的温度。更优选诸如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、和35℃中的任一者的20℃至35℃的任意温度也同样用于确定Fcγ受体结合结构域与Fcγ受体的结合亲和性。25℃的温度是本发明的方案的非限定性的一例。
本说明书中，FcγR结合改变Fc区的Fcγ受体结合活性较天然型Fc区的Fcγ受体结合活性高是指，FcγR结合改变Fc区的FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一者的人Fcγ受体结合活性比天然型Fc区对这些人Fcγ受体的结合活性高。例如，基于上述分析方法，与作为对照的包含人IgG的天然型Fc区的抗原结合分子的结合活性进行比较，包含FcγR结合改变Fc区的抗原结合分子的结合活性显示出105％以上、优选110％以上、115％以上、120％以上、125％以上、特别优选130％以上、135％以上、140％以上、145％以上、150％以上、155％以上、160％以上、165％以上、170％以上、175％以上、180％以上、185％以上、190％以上、195％以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、5倍以上、7.5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上的结合活性。作为天然型Fc区，既可以使用起始Fc区，也可以使用相同亚类的抗体的天然型Fc区。
本发明中，作为对照的人IgG的天然型Fc区，优选使用与以EU编号表示的297位的氨基酸结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区。与以EU编号表示的297位的氨基酸结合的糖链是否为含岩藻糖的糖链，可以采用已知的方法(Non-fucosylatedtherapeutic antibodies as next-generation therapeutic antibodies.Satoh M,IidaS,Shitara K.,Expert Opin.Biol.Ther.(2006)6(11),1161-1173)。例如，通过下述的方法，可以判定与天然型人IgG的Fc区结合的糖链是否为含岩藻糖的糖链。通过使N-糖苷酶F(Roche diagnostics)与被测天然型人IgG反应，糖链从被测天然型人IgG中游离出来(Weitzhandler等(J.Pharma.Sciences(1994)83,12,1670-1675)。接着，将与乙醇反应而除去了蛋白的反应液(Schenk等(J.Clin.Investigation(2001)108(11)1687-1695)的浓缩干固物用2-氨基吡啶进行荧光标记(Bigge等(Anal.Biochem.(1995)230(2)229-238)。将经过使用纤维素过滤筒的固相提取进行了脱试剂的、经荧光标记的2-AB化糖链通过正相层析进行分析。通过观察所检测的色谱图的峰，可以判定与人IgG的天然型Fc区结合的糖链是否是含岩藻糖的糖链。
作为对照的包含相同亚类的抗体的天然型Fc区的抗原结合分子，可以适宜使用具有IgG单克隆抗体的Fc区的抗原结合分子。该Fc区的结构记载于SEQ ID NO:5(数据库注册号AAC82527.1的N末端添加有A)、6(数据库注册号AAB59393.1的N末端添加有A)、7(数据库注册号CAA27268.1)、和8(数据库注册号AAB59394.1的N末端添加有A)。另外，使用包含某特定同种型的抗体Fc区的抗原结合分子作为被测物质时，通过使用具有该特定同种型的IgG单克隆抗体Fc区的抗原结合分子作为对照，来验证包含被测Fc区的抗原结合分子的Fcγ受体结合活性的效果。如上所述，适当选择包含已被证实Fcγ受体结合活性高的Fc区的抗原结合分子。
具有选择性Fcγ受体结合活性的Fc区
此外，作为本发明中优选使用的Fcγ受体结合结构域的实例，还优选举出：具有对特定Fcγ受体的结合活性较其他Fcγ受体结合活性高的性质的Fcγ受体结合结构域(具有选择性Fcγ受体结合活性的Fcγ受体结合结构域)。使用抗体作为抗原结合分子(使用Fc区作为Fcγ受体结合结构域)时，由于一分子的抗体只能与一分子的Fcγ受体结合，因此一分子的抗原结合分子在与抑制型Fcγ受体结合的状态下无法与其它活性型FcγR结合，在与活性型Fcγ受体结合的状态下也无法与其它活性型Fcγ受体或抑制型Fcγ受体结合。
活性型Fcγ受体结合活性较抑制型Fcγ受体结合活性高的Fc区如上所述，作为活性型Fcγ受体，优选可举出：包含FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)、包含FcγRIIa以及FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)。此外，作为抑制型Fcγ受体的优选实例，可举出FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)。
本说明书中，作为对特定的Fcγ受体的结合活性较其以外的Fcγ受体结合活性高的实例，可举出例如，活性型Fcγ受体结合活性高于抑制型Fcγ受体结合活性的情形。此时是指Fc区对FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一人Fcγ受体的结合活性高于对FcγRIIb的结合活性。例如，是指基于上述分析方法，含有Fc区的抗原结合分子对FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一人Fcγ受体的结合活性表现出对FcγRIIb的结合活性的105％以上、优选110％以上、120％以上、130％以上、140％以上、特别优选150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上、200％％以上、250％以上、300％以上、350％以上、400％以上、450％以上、500％以上、750％以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍以上的结合活性。活性型Fcγ受体结合活性较抑制型Fcγ受体结合活性高的Fc区可优选包含在抗原结合结构域与膜型分子结合的本发明的抗原结合分子中。已知含有这种Fc区的IgG1抗体会增强后述的ADCC活性，因此含有该Fc区的抗原结合分子可用作本发明的药物组合物中所含的抗原结合分子。
在本发明的非限定的一个方案中，作为活性型Fcγ受体结合活性较抑制型Fcγ受体结合活性高(对抑制型Fcγ受体具有选择性结合活性)的Fc区的实例，优选可举出：选自前述以EU编号表示的221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位中的至少一个以上的氨基酸被改变为与天然型Fc区不同的氨基酸的Fc区。
抑制型Fcγ受体结合活性较活性型Fcγ受体结合活性高的Fc区本说明书中，作为对特定Fcγ受体的结合活性较对其以外的Fcγ受体的结合活性高的实例，可举出例如，抑制型Fcγ受体结合活性较活性型Fcγ受体结合活性高的情形。此时是指Fc区对FcγRIIb的结合活性较对FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一人Fcγ受体的结合活性高。例如，是指基于上述分析方法，含有Fc区的抗原结合分子对FcγRIIb的结合活性表现出对FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一人Fcγ受体的结合活性的105％以上、优选110％以上、120％以上、130％以上、140％以上、特别优选150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上、200％％以上、250％以上、300％以上、350％以上、400％以上、450％以上、500％以上、750％以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍以上的结合活性。抑制型Fcγ受体结合活性较活性型Fcγ受体结合活性高的Fc区可优选包含在抗原结合结构域与可溶型分子结合的本发明的抗原结合分子中。
在本发明的非限定的一个方案中，作为抑制型Fcγ受体结合活性较活性型Fcγ受体结合活性高(对抑制型Fcγ受体具有选择性结合活性)的Fc区的实例，优选可举出前述Fc区的氨基酸中以EU编号表示的238或328的氨基酸被改变为与天然型Fc区不同的氨基酸的Fc区。
另外，在本发明的非限定的一个方案中，作为抑制型Fcγ受体结合活性较活性型Fcγ受体结合活性高(对抑制型Fcγ受体具有选择性结合活性)的Fc区的实例，优选可举出前述Fc区的以EU编号表示的氨基酸被改变为下述中的任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238的氨基酸为Asp、或328的氨基酸为Glu。此外，作为对抑制型Fcγ受体具有选择性结合活性的Fc区，还可以适宜选择US2009/0136485中记载的Fc区或改变。
另外，在本发明的非限定的一个方案中，优选可举出前述Fc区的以EU编号表示的氨基酸被改变为下述中的任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238的氨基酸为Asp、或328的氨基酸为Glu。
进而，在本发明的非限定的一个方案中，可优选举出PCT/JP2012/054624中所例示的改变为下述任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238位的Pro替换为Asp、以及以EU编号表示的237位的氨基酸为Trp、以EU编号表示的237位的氨基酸为Phe、以EU编号表示的267位的氨基酸为Val、以EU编号表示的267位的氨基酸为Gln、以EU编号表示的268位的氨基酸为Asn、以EU编号表示的271位的氨基酸为Gly、以EU编号表示的326位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Gln、以EU编号表示的326位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Met、以EU编号表示的239位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的267位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的234位的氨基酸为Trp、以EU编号表示的234位的氨基酸为Tyr、以EU编号表示的237位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的237位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的237位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的237位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的237位的氨基酸为Met、以EU编号表示的237位的氨基酸为Tyr、以EU编号表示的330位的氨基酸为Lys、以EU编号表示的330位的氨基酸为Arg、以EU编号表示的233位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位的氨基酸为Ser、以EU编号表示的326位的氨基酸为Thr、以EU编号表示的323位的氨基酸为Ile、以EU编号表示的323位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的323位的氨基酸为Met、以EU编号表示的296位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的326位的氨基酸为Asn、以EU编号表示的330位的氨基酸为Met。
糖链经修饰的Fc区
作为本发明所提供的抗原结合分子所含的Fc区，还可包含下述Fc区：其是以与Fc区结合的糖链的组成中结合有岩藻糖缺陷糖链的Fc区的比例变高的方式、或添加有平分型N-乙酰葡糖胺的Fc区的比例变高的方式进行了修饰的Fc区。已知若从与抗体Fc区结合的N-糖苷结合复合型糖链还原末端的N-乙酰葡萄糖胺除去岩藻糖残基，则对FcγRIIIa的亲和性增强(非专利文献6)。已知含有这种Fc区的IgG1抗体会增强后述的ADCC活性，因此含有该Fc区的抗原结合分子可用作本发明的药物组合物中所含的抗原结合分子。作为从与抗体Fc区结合的N-糖苷结合复合型糖链还原末端的N-乙酰葡萄糖胺除去了岩藻糖残基的抗体，例如是如下所述的抗体：
经糖基化修饰的抗体(国际公开WO1999/054342等)，
添加于糖链的岩藻糖缺陷的抗体(国际公开WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。
更具体地，作为从与抗体Fc区结合的N-糖苷结合复合型糖链还原末端的N-乙酰葡萄糖胺除去了岩藻糖残基的抗体的不同的非限定的一个方案，为了制作添加于糖链的岩藻糖缺陷的抗体(国际公开WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)，改变要受糖链修饰的多肽的形成糖链结构的活性，结果制作对糖链添加岩藻糖的能力低的宿主细胞。通过在该宿主细胞中表达所期望的抗体基因，可以从该宿主细胞的培养液中回收该糖链中的岩藻糖缺陷的该抗体。作为形成多肽的糖链结构的活性，可举出选自下述中的酶或转运体的活性作为非限定的优选实例：岩藻糖基转移酶(EC 2.4.1.152)、岩藻糖转运体(SLC35C1)、GMD(GDP-甘露糖-4,6-脱水酶)(EC 4.2.1.47)、Fx(GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3，5-表异构酶，4-还原酶)(EC 1.1.1.271)、和GFPP(GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶)(EC2.7.7.30)。这些酶或转运体只要可以发挥其活性，则不必规定其结构。本说明书中，将可以发挥这些活性的蛋白称为功能性蛋白。作为改变这些活性的方法的非限定的一个方案，可举出这些活性的缺失。为了制作这些活性缺失的宿主细胞，可以适宜采用破坏这些功能性蛋白的基因使之不能发挥功能的方法等公知的方法(国际公开WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。这种活性缺失的宿主细胞可通过破坏对CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞、HEK293细胞、或杂交瘤细胞等为内源性的这些功能性蛋白的基因使之不能发挥功能的方法等来制作。
包含具有平分型GlcNAc的糖链的抗体(国际公开WO2002/079255等)是公知的。在非限定的一个方案中，为了制作包含具有平分型GlcNAc的糖链的抗体，制备表达下述基因的宿主细胞，该基因编码具有GnTIII(β-1,4-甘露糖基-糖蛋白，4-β-N-乙酰葡糖胺基转移酶)(EC 2.4.1.144)活性或GalT(β-1,4-半乳糖基转移酶)(EC 2.4.1.38)活性的功能性蛋白。在其它非限定的优选的一个方案中，制作除了前述功能性蛋白之外，还共表达编码具有人ManII(甘露糖苷酶II)(3.2.1.114)活性的功能性蛋白的基因、编码具有GnTI(β-1,2-乙酰葡糖胺基转移酶I)(EC 2.4.1.94)活性的功能性蛋白的基因、编码具有GnTII(β-1,2-乙酰葡糖胺基转移酶II)(EC 2.4.1.143)活性的功能性蛋白的基因、编码具有ManI(甘露糖苷酶)(EC 3.2.1.113)活性的功能性蛋白的基因、和α-1,6-岩藻糖基转移酶(EC2.4.1.68)的宿主细胞(国际公开WO2004/065540)。
通过对如上所述的对糖链添加岩藻糖的能力低的宿主细胞、和具有形成含有平分型GlcNAc结构的糖链的活性的宿主细胞转染含有抗体基因的表达载体，分别可制作从与抗体Fc区结合的N-糖苷结合复合型糖链还原末端的N-乙酰葡萄糖胺除去了岩藻糖残基的抗体、和包含具有平分型GlcNAc的糖链的抗体。这些抗体的制造方法也可以适用于含有改变Fc区的抗原结合分子的制造方法，所述改变Fc区是以与本发明的Fc区结合的糖链的组成中结合有岩藻糖缺陷糖链的Fc区的比例变高的方式、或添加有平分型N-乙酰葡糖胺的Fc区的比例变高的方式经修饰的改变Fc区。通过这种制造方法制作的与本发明的抗原结合分子所含的Fc区结合的糖链的组成可通过前述“Fcγ受体(FcγR)结合改变Fc区”中记载的方法来确认。
多特异性抗原结合分子或多互补位的抗原结合分子
从其反应特异性的观点考虑，将具有如下特征且包含至少两个抗原结合结构域的抗原结合分子称作多特异性抗原结合分子：其至少一个抗原结合结构域与抗原分子中的第一表位结合，其至少一个其他的抗原结合结构域与抗原分子中的第二表位结合。抗原结合分子通过一分子的该抗原结合分子所含的两种抗原结合结构域与两个不同的表位结合时，该抗原结合分子被称作双特异性抗原结合分子。此外，抗原结合分子通过一分子的该抗原结合分子所含的三种抗原结合结构域与三个不同表位结合时，该抗原结合分子被称作三特异性抗原结合分子。
与抗原分子中的第一表位结合的抗原结合结构域中的互补位和与结构不同于第一表位的第二表位结合的抗原结合结构域中的互补位的结构彼此不同。所以，从其结构特异性的观点考虑，具有如下特征且包含至少两个抗原结合结构域的抗原结合分子被称作多互补位的抗原结合分子：其至少一个抗原结合结构域与抗原分子中的第一表位结合，其至少一个其他的抗原结合结构域与抗原分子中的第二表位结合。抗原结合分子通过一分子的该抗原结合分子所含的两种抗原结合结构域与两个不同表位结合时，该抗原结合分子被称作双互补位的抗原结合分子。此外，抗原结合分子通过一分子的该抗原结合分子所含的三种抗原结合结构域与三个不同表位结合时，该抗原结合分子被称作三互补位的抗原结合分子。
包含一个或多个抗原结合结构域的多价多特异性或多互补位的抗原结合分子及其制备方法还记载在Conrath等(J.Biol.Chem.(2001)276(10)7346-7350)、Muyldermans(Rev.Mol.Biotech.(2001)74,277-302)和Kontermann R.E.(2011)BispecificAntibodies(Springer-Verlag)等非专利文献、以及国际公开WO1996/034103或WO1999/023221等专利文献等中。通过利用其中记载的多特异性或多互补位的抗原结合分子及其制备方法，可以制作本发明的抗原结合分子。
双特异性抗体及其制作方法
作为如上所述的多特异性或多互补位的抗原结合分子及其制备方法的一个方案，以下例示双特异性抗体及其制作方法。双特异性抗体是指包含与不同表位进行特异性结合的两种可变区的抗体。IgG型双特异性抗体可由通过融合两种产生IgG抗体的杂交瘤而产生的杂交的杂交瘤(quadroma)来分泌(Milstein等(Nature(1983)305,537-540)。
利用上述抗体一项中记载的重组方法制造双特异性抗体时，可以采用将编码包含两种目标可变区的重链的基因导入细胞中使其共表达的方法。但是，仅考虑这种共表达方法中的重链的组合，也会形成下述的(i)、(ii)、(iii)的组合以2：1：1的分子数的比例存在的混合物：(i)包含与第一表位结合的可变区的重链和包含与第二表位结合的可变区的重链形成一对的重链组合、(ii)只是包含与第一表位结合的可变区的重链形成一对的重链组合、(iii)只是包含与第二表位结合的可变区的重链形成一对的重链组合。难以从这三种重链组合的混合物中纯化包含目标重链组合的抗原结合分子。
利用这种重组方法制造双特异性抗体时，通过对构成重链的CH3结构域进行适当的氨基酸替换的改变，可以优先分泌包含异源组合的重链的双特异性抗体。具体地，有下述方法：将存在于一条重链的CH3结构域的氨基酸侧链替换成更大的侧链(knob(意为“突起”))、将存在于另一条重链的CH3结构域的氨基酸侧链替换成更小的侧链(hole(意为“空隙”))，从而使突起能够配置在间隙内，以促进异种的重链形成和抑制同种的重链形成(国际公开WO1996027011、Ridgway等(Protein Engineering(1996)9,617-621)、Merchant等(Nat.Biotech.(1998)16,677-681))。
此外，还已知通过将控制多肽的缔合或由多肽构成的异源多聚体的缔合的方法用于重链的缔合来制作双特异性抗体的技术。即，在双特异性抗体的制作中可以采用下述方法：通过改变形成重链内的界面的氨基酸残基，而控制成抑制具有相同序列的重链的缔合且形成序列不同的两个重链(国际公开WO2006/106905)。在制造双特异性抗体时也可以采用这样的方法。
作为本发明的非限定的一个方案中的抗原结合分子所含的Fc区，可适当使用形成以上述的双特异性抗体为来源的Fc区的两个多肽。更具体地，优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的349位氨基酸为Cys、366位氨基酸为Trp，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的356位氨基酸为Cys、366位氨基酸为Ser、368氨基酸为Ala、407位氨基酸为Val。
作为另外的本发明的非限定的一个方案中的Fc区，优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的409位氨基酸为Asp，在另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的399位氨基酸为Lys。在上述方案中，409位氨基酸可以是Glu以代替Asp，399位氨基酸可以是Arg以代替Lys。此外，除399位氨基酸Lys以外，还可以适当追加作为360位氨基酸的Asp或作为392位氨基酸的Asp。
作为本发明的另外的非限定的一个方案中的Fc区，优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的370位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的357位氨基酸为Lys。
作为本发明的另外的非限定的一个方案中的Fc区，优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的439位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的356位氨基酸为Lys。
作为本发明的其它的非限定的一个方案中的Fc区，优选使用上述组合得到的以下方案中的任一者：
(i)形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的409位氨基酸为Asp、370位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的399位氨基酸为Lys、357位氨基酸为Lys(本方案中，以EU编号表示的370位氨基酸可以是Asp以代替Glu，可以是以EU编号表示的392位氨基酸的Asp以代替370位氨基酸的Glu)；
(ii)形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的409位氨基酸为Asp、439位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的399位氨基酸为Lys、356位氨基酸为Lys(在本方案中，可以是以EU编号表示的360位氨基酸的Asp以代替439位氨基酸的Glu、可以是以EU编号表示的392位氨基酸的Asp或439位氨基酸的Asp)；
(iii)形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的370位氨基酸为Glu、439位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的357位氨基酸为Lys、356位氨基酸为Lys；或者
形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的409位氨基酸为Asp、370位氨基酸为Glu、439位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的399位氨基酸为Lys、357位氨基酸为Lys、356位氨基酸为Lys(本方案中，以EU编号表示的370位氨基酸可以替换成Glu，而且370位氨基酸不替换成Glu，并且439位氨基酸Glu可以替换成Asp、或者392位氨基酸Asp可以替换成439位氨基酸Glu)。
进而，在本发明的其它的非限定的一个方案中，还优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的356位氨基酸为Lys，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的435位氨基酸为Arg、439位氨基酸为Glu。
进而，在本发明的其它的非限定的一个方案中，还优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的356位氨基酸为Lys、357位氨基酸为Lys，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的370位氨基酸为Glu、435位氨基酸为Arg、439位氨基酸为Glu。
此外，除上述的异种重链的缔合技术外，为了制作本发明提供的多特异性或多互补位的抗原结合分子，还可以使用以下的作为异种轻链的缔合技术而已知的CrossMab技术：使形成与第一表位结合的可变区的轻链和形成与第二表位结合的可变区的轻链分别与形成与第一表位结合的可变区的重链和形成与第二表位结合的可变区的重链缔合(Scaefer等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2011)108,11187-11192))。此外，为了制作本发明所提供的多特异性或多互补位抗原结合分子，还可使用以下的作为异种重链的缔合技术而已知的Fab-Arm Exchange：利用不同的IgG4重链彼此发生交换，使形成与第一表位结合的可变区的重链和形成与第二表位结合的可变区的重链缔合(Labrijn等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2013)110,5145-5150)、WO2008119353)。
效应细胞
本发明中，“效应细胞”可以以包括T细胞(CD4+(辅助淋巴细胞)T细胞和/或CD8+(细胞毒性)T细胞)、多核白细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞)、单核细胞、巨噬细胞、组织细胞或自然杀伤细胞(NK细胞)、NK样T细胞、库普弗细胞、朗格汉斯细胞、或淋巴因子活化杀伤细胞(LAK细胞)等白细胞、B淋巴细胞、或者树突细胞或巨噬细胞等抗原提呈细胞的最广义的含义来使用，作为优选的效应细胞的实例，可举出CD8+(细胞毒性)T细胞、NK细胞、或巨噬细胞。只要是表达于效应细胞的细胞膜的膜型分子，则可以用作本发明的抗原结合分子所含的至少1个抗原结合结构域所结合的抗原，作为优选的膜型分子，可例示作为非限定性实例的构成TCR的多肽、CD3、CD2、CD28、CD44、CD16、CD32、CD64、或NKG2D或者NK细胞活化配体。
细胞毒性物质
为了本发明的抗原结合分子与癌细胞结合而发挥细胞毒性，细胞毒性物质可以结合于抗原结合分子。作为细胞毒性物质，可以是以下例示的化学治疗药，也可以是CurrOpin Chem Biol(2010)14,529-37或国际公开2009/140242中公开的化合物，这些化合物通过适当的接头等与抗原结合分子结合。将本发明的抗原结合分子用作药物组合物时，可以在将该抗原结合分子给予对象(被测者、患者等)前，使这些细胞毒性物质与该抗原结合分子结合，也可以在给予前后或同时给予这些细胞毒性物质。
此外，结合有后述的化学治疗药、毒性肽或放射性化学物质等细胞毒性物质的修饰抗原结合分子修饰物也可适宜地用作本发明的具有细胞毒性的抗原结合分子。这种修饰抗原结合分子(以下，称为抗原结合分子药物缀合物)可通过对所得抗原结合分子进行化学修饰而获得。另外，作为抗原结合分子的修饰方法，可适宜使用在抗体药物缀合物等领域中已经确立的方法。此外，结合有毒性肽的修饰抗原结合分子可通过将编码该毒性肽的基因与编码本发明的抗原结合分子的基因框内连接得到的融合基因在适当的宿主细胞中表达后，从该细胞的培养液中分离而获得。
与本发明的抗原结合分子结合的化学治疗药可以例示：阿扎立平(azaribine)、阿那曲唑(anastrozole)、阿扎胞苷(azacytidine)、博莱霉素(bleomycin)、波替单抗(bortezomib)、苔藓抑素-1(bryostatin-1)、白消安(busulfan)、喜树碱(camptothecin)、10-羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin)、卡莫司汀(carmustine)、塞来昔布(celebrex)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、伊立替康(irinotecan)、卡铂(carboplatin)、克拉曲滨(cladribine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、多西他赛(docetaxel)、放射菌素(dactinomycin)、柔红霉素葡萄糖醛酸化物(daunomycin glucuronide)、柔红霉素(daunorubicin)、地塞米松(dexamethasone)、二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)、阿霉素(doxorubicin)、阿霉素葡萄糖醛酸化物(doxorubicin glucuronide)、表阿霉素(epirubicin)、乙炔基雌二醇(ethinyl estradiol)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷(etoposide)、依托泊苷葡萄糖醛酸化物(etoposide glucuronide)、氟苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟羟甲睾酮(fluoxymesterone)、吉西他滨(gemcitabine)、己酸羟孕酮(hydroxyprogesteronecaproate)、羟基脲(hydroxyurea)、去甲氧基柔红霉素(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、洛莫司汀(lomustine)、美登醇(maytansinoid)、氮芥(mechlorethamine)、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、丁酸苯酯(phenylbutyrate)、强的松(prednisone)、甲苄肼(procarbazine)、紫杉醇(paclitaxel)、喷司他丁(pentostatin)、司莫司丁(semustine)、链脲菌素(streptozocin)、它莫西芬(tamoxifen)、紫杉醇类(taxanes)、紫杉醇(taxol)、丙酸睾酮(testosterone propionate)、沙利度胺(thalidomide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、三胺硫磷(thiotepa)、替尼泊苷(teniposide)、拓扑替康(topotecan)、脲嘧啶氮芥(uracil mustard)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春新碱(vincristine)。
本发明中，优选的化学治疗药为低分子的化学治疗药。低低分子的化学治疗药在与本发明的抗原结合分子结合后，干涉抗原结合分子的功能的可能性也低。本发明中，低分子的化学治疗药通常具有100～2000、优选200～1000的分子量。这里例示的化学治疗药均为低分子的化学治疗药。这些本发明中的化学治疗药包括在生物体内转化为活性化学治疗药的前药。前药的活化可以是酶转化，也可以是非酶转化。
此外，作为与本发明的抗原结合分子结合的细胞毒性物质，还可例示假单胞菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)、肥皂草素-s6(Saporin-s6)、白喉毒素(Diphtheriatoxin)、海葵毒素(Cnidarian toxin)等毒性肽(毒素)或放射碘(Radioiodine)、光敏剂(Photosensitizer)。作为毒性肽的实例，例如，优选可举出下述毒性肽。
白喉毒素A链(Diphtheria toxin A Chain)(Langone等(Methods in Enzymology(1983)93,307-308))；
假单胞菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin)(Nature Medicine(1996)2,350-353)；
蓖麻毒素链(Ricin A Chain)(Fulton等(J.Biol.Chem.(1986)261,5314-5319)、Sivam等(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、Cumber等、(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24、Wawrzynczak等(Cancer Res.(1990)50,7519-7562)、和Gheeite等(J.Immunol.Methods(1991)142,223-230))；
无糖链蓖麻毒素A链(Deglicosylated Ricin AChain)(Thorpe等(Cancer Res.(1987)47,5924-5931))；
相思豆毒素A链(Abrin A Chain)(Wawrzynczak等(Br.J.Cancer(1992)66,361-366)、Wawrzynczak等(Cancer Res.(1990)50,7519-7562)、Sivam等(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、和Thorpe等(Cancer Res.(1987)47,5924-5931))；
白树毒素(Gelonin)(Sivam等(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、Cumber等(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24)、Wawrzynczak等(Cancer Res.,(1990)50,7519-7562)、和Bolognesi等(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；
美洲商陆抗病毒蛋白(PAP-s；来源于种子的美洲商陆抗病毒蛋白)(Bolognesi等(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；
ブリオジン(Briodin)(Bolognesi等(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；
皂草素(Saporin)(Bolognesi等(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；
木鳖子苷(Momordin)(Cumber等(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24)；Wawrzynczak等(Cancer Res.(1990)50,7519-7562)、和Bolognesi等(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；
木鳖糖蛋白(Momorcochin)(Bolognesi等(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；
石竹素32(Dianthin 32)(Bolognesi等(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；
石竹素30(Dianthin 30)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；
莫迪素(Modeccin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；
槲寄生凝集素(Viscumin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；
蒴莲素(Volkesin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；
商陆毒蛋白(Dodecandrin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；
小麦毒蛋白(Tritin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；
丝瓜素(Luffin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；和
栝楼子毒蛋白(Trichokirin)(Casellas等(Eur.J.Biochem.(1988)176,581-588)、和Bolognesi等(Clin.exp.Immunol.,(1992)89,341-346))。
抗原结合分子
本发明中，包含低分子化合物(例如靶组织特异性化合物)的存在下的抗原结合活性较该化合物的非存在下的抗原结合活性高的抗原结合结构域的抗原结合分子以最广义的含义的形式使用，具体地，只要它们显示出抗原结合活性，则包括各种分子类型。例如，作为抗原结合结构域与Fc区结合的分子的实例，可举出抗体。抗体可包括单一的单克隆抗体(包括激动抗体和拮抗抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。另外，作为以抗体片段的形式使用的情形，可优选举出：抗原结合结构域和抗原结合片段(例如，Fab、F(ab’)2、scFv和Fv)。现有的稳定的α/β桶蛋白结构等立体结构作为构架(scaffold，基础)使用、仅其一部分结构为了构建抗原结合结构域而文库化的构架分子也包括在本发明的抗原结合分子中。
本发明的抗原结合分子可包含介导Fcγ受体结合和/或FcRn结合的Fc区的至少一部分。例如，在非限定的一个方案中，抗原结合分子可以是抗体或Fc融合蛋白。融合蛋白是指包含含有第一氨基酸序列的多肽的嵌合多肽，该含有第一氨基酸序列的多肽与在天然情况下不会自然连接的具有第二氨基酸序列的多肽连接。例如，融合蛋白可以包括多肽，该多肽包含编码Fc区的至少一部分(例如，赋予Fcγ受体结合的Fc区部分和/或赋予FcRn结合的Fc区部分)的氨基酸序列。氨基酸序列可存在于一起转移到融合蛋白中的各蛋白中、或者它们通常可存在于同一蛋白中，但会进入融合多肽中的新的重组中。融合蛋白例如可通过化学合成来制作，或通过制作以所期望的关系编码肽区的多核苷酸、并将其表达的基因重组方法来制作。
本发明的各结构域可以通过多肽键直接连接，也可经由接头连接。作为接头，可以使用能通过基因工程导入的任意肽接头、或合成化合物接头(例如，Holliger等(ProteinEngineering(1996)9(3),299-305))中公开的接头等，本发明中优选肽接头。肽接头的长度没有特别限定，本领域技术人员可根据目的适当选择，优选长度为5个氨基酸以上(上限没有特别限定，通常为30个氨基酸以下，优选20个氨基酸以下)，特别优选为15个氨基酸。
例如，在肽接头的情形中，优选可举出：
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:19)
Ser·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:20)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:21)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:22)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:23)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:24)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:25)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:26)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:21))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:22))n
[n为1以上的整数]等。其中，本领域技术人员根据目的可以适当选择肽接头的长度或序列。
合成化学物接头(化学交联剂)是通常用于肽的交联的交联剂，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯(BS3)、二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、乙二醇双(琥珀酸磺基琥珀酰亚胺酯)(磺基-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)等，这些交联剂有市售。
使用多个连接各结构域的接头时，可全部使用同种的接头，也可使用不同种的接头。此外，除了上述记载中例示的接头之外，也可适当使用例如具有His标签、HA标签、myc标签、FLAG标签等肽标签的接头。此外，也可优选利用通过氢键、二硫键、共价键、离子性相互作用或这些键的组合来相互结合的性质。例如，利用抗体的CH1与CL间的亲和性，或者在异源Fc区缔合时利用以上述双特异性抗体为来源的Fc区。此外，还可优选利用在结构域间形成的二硫键。
为了通过肽键连接各结构域，将编码该结构域的多核苷酸进行框内连接。作为将多核苷酸进行框内连接的方法，限制性片段的连接或融合PCR、重叠PCR等方法是公知的，在本发明的抗原结合分子的制作中也可适宜单独或组合使用这些方法。本发明中，术语“被连接”、“被融合”、“连接”或“融合”可互换使用。这些术语是指通过包括上述化学结合方法或重组方法在内的所有方法来连接两个以上的多肽等组分或成分以形成一个结构。框内连接，在两个以上的组分(element)或成分为多肽时，是指以维持该多肽的正确阅读框的方式连接的、用于形成更长的阅读框的两个以上的阅读框单位的连接。将二分子的Fab用作抗原结合结构域时，该抗原结合结构域与包含Fc区的恒定区不经由接头而通过肽键进行框内连接得到的作为本发明的抗原结合分子的抗体可以作为本发明的优选抗原结合分子来使用。
低分子化抗体
本发明中所使用的抗体并不限于抗体的全长分子，也可以是低分子化抗体或其修饰物。低分子化抗体包括全长抗体(例如，完整IgG等完整抗体)的一部分缺失的抗体片段，只要具有抗原结合活性则没有特别限定。本发明的低分子化抗体只要是全长抗体的一部分则没有特别限定，但优选含有重链可变区(VH)或/和轻链可变区(VL)。VH或VL的氨基酸序列可以有替换、缺失、添加和/或插入。进而，只要具有抗原结合活性，则可以使VH或/和VL的一部分缺失。另外，可变区可以被嵌合化或人源化。作为抗体片段的具体例，可举出例如：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv等。此外，作为低分子化抗体的具体例，可举出例如：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv(单链Fv)、双抗体、sc(Fv)2(单链(Fv)2)等。这些抗体的多聚体(例如，二聚体、三聚体、四聚体、多聚体)也包含在本发明的低分子化抗体中。
抗体片段可以通过将抗体用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶进行处理而产生，或者可以构建编码这些抗体片段的基因，并将其导入表达载体，然后通过适当的宿主细胞来表达(参照例如，Co等(J.Immunol.(1994)152,2968-2976)、Better和Horwitz(Methods inEnzymology(1989)178,476-496)、Plueckthun和Skerra等(Methods in Enzymology(1989)178,476-496)、Lamoyi(Methods in Enzymology(1989)121,652-663)、Rousseaux等(Methods in Enzymology(1989)121,663-669)和Bird等(TIBTECH(1991)9,132-137))。
双抗体是指通过基因融合构建的二价(bivalent)的低分子化抗体(Holliger等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90,6444-6448(1993)、欧州公开公报EP404097、和PCT公开公报WO1993/011161等)。双抗体是由2条多肽链构成的二聚体，通常，对于各多肽链，VL和VH在同一链中通过短至彼此不能结合程度的例如5个残基左右的接头结合。对于编码于同一多肽链上的VL与VH，由于它们之间的接头短，因而无法形成单链可变区片段，从而形成二聚体，所以双抗体具有2个抗原结合位点。
scFv可通过连接抗体的H链V区与L链V区来获得。该scFv中，H链V区与L链V区通过接头、优选肽接头而连接(Huston等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85,5879-5883)。scFv中的H链V区和L链V区可以来自本说明书中作为抗体记载的任一抗体。作为连接V区的肽接头，没有特别限制，但可使用例如由3至25个残基左右组成的任意的单链肽，此外，还可使用后述的肽接头等。作为V区的连接方法，可利用如上所述的PCR法。可以通过PCR法扩增编码scFv的DNA，该PCR法中，以编码前述抗体的H链或H链V区的DNA序列、以及编码L链或L链V区的DNA序列中的编码全部或所期望的氨基酸序列的DNA部分为模板，并使用具有与其两端的序列对应的序列的一对引物。接着，组合编码肽接头部分的DNA、以及具有以使其两端分别与H链、L链连接的方式设计的序列的一对引物，进行PCR反应，由此可获得具有所期望序列的DNA。此外，一旦制作编码scFv的DNA，则可根据常法获得含有其的表达载体、和由该表达载体转化的重组细胞，此外，可通过培养结果得到的重组细胞并使编码该scFv的DNA表达来获得该scFv。
sc(Fv)2是通过接头等将2个VH和2个VL结合成为单链的低分子化抗体(Hudson等(J.Immunol.Methods(1999)231,177-189)。sc(Fv)2例如可通过将scFv用接头连接来制作。
另外，优选下述抗体，其特征在于，2个VH和2个VL以单链多肽的N末端侧为起点，并按照VH、VL、VH、VL([VH]接头[VL]接头[VH]接头[VL])的顺序排列。2个VH和2个VL的顺序并不特别限于上述配置，可以按照任意顺序排列。例如还可举出如下所述的配置。
-[VL]接头[VH]接头[VH]接头[VL]
-[VH]接头[VL]接头[VL]接头[VH]
-[VH]接头[VH]接头[VL]接头[VL]
-[VL]接头[VL]接头[VH]接头[VH]
-[VL]接头[VH]接头[VL]接头[VH]。
作为将抗体可变区结合的接头，可以使用与前述抗原结合分子一项中记载的接头相同的接头。例如，作为本发明中特别优选的sc(Fv)2的方案，可举出例如，以下的sc(Fv)2。
-[VH]肽接头(15氨基酸)[VL]肽接头(15氨基酸)[VH]肽接头(15氨基酸)[VL]
在将4个抗体可变区结合时，通常需要3个接头，全部可以使用相同的接头，也可以使用不同的接头。本发明中，作为非限定性低分子化抗体的一个方案，可例示下述双抗体或sc(Fv)2，其中，互补位彼此不同，一个互补位与结合至癌细胞或浸润于炎症组织的细胞等的细胞膜的膜型分子上存在的表位结合，另一互补位与表达于效应细胞细胞膜的膜型分子中存在的表位结合。上述双抗体或sc(Fv)2中，一互补位对结合至癌细胞或浸润于炎症组织的细胞等的细胞膜的膜型分子上存在的表位的结合活性可以依赖于低分子化合物(例如，癌组织特异性化合物、炎症组织特异性化合物、非天然化合物)，一互补位对结合至效应细胞细胞膜的膜型分子上存在的表位的结合活性可以依赖于低分子化合物(例如，癌组织特异性化合物、炎症组织特异性化合物、非天然化合物)，另外，两互补位的结合活性可以依赖于低分子化合物(例如，癌组织特异性化合物、炎症组织特异性化合物、非天然化合物)。
本发明中，作为非限定性低分子化抗体的一个方案，可例示下述双抗体或sc(Fv)2，其中，互补位彼此不同，一互补位与结合至癌细胞或浸润于炎症组织的细胞等的细胞膜的膜型分子上存在的表位结合，另一互补位与细胞毒性物质上存在的表位结合。上述双抗体或sc(Fv)2中，一互补位对结合至癌细胞或浸润于炎症组织的细胞的细胞膜的膜型分子上存在的表位的结合活性可以依赖于低分子化合物(例如，癌组织特异性化合物、炎症组织特异性化合物、非天然化合物)，一互补位对细胞毒性物质上存在的表位的结合活性可以依赖于低分子化合物(例如，癌组织特异性化合物、炎症组织特异性化合物、非天然化合物)，另外，两互补位的结合活性可以依赖于癌组织特异性化合物。
为了获得这种低分子化抗体，可以将抗体用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等进行处理而产生抗体片段；或者构建编码这些抗体片段或低分子化抗体的DNA，并将其导入表达载体，然后通过适当的宿主细胞来表达(参照例如，Co,M.S.et al.,J.Immunol.(1994)152,2968-2976；Better,M.and Horwitz,A.H.,Methods Enzymol.(1989)178,476-496；Pluckthun,A.and Skerra,A.,Methods Enzymol.(1989)178,497-515；Lamoyi,E.,MethodsEnzymol.(1986)121,652-663；Rousseaux,J.et al.,Methods Enzymol.(1986)121,663-669；Bird,R.E.and Walker,B.W.,Trends Biotechnol.(1991)9,132-137)。
FcRn
与属于免疫球蛋白超家族的Fcγ受体不同，人FcRn在结构上与主要组织不相容性复合体(MHC)I类的多肽结构类似，与I类的MHC分子具有22至29％的序列同一性(Ghetie等，Immunol.Today(1997)18(12),592-598)。FcRn表达为异源二聚体，其由与可溶性β或轻链(β2微球蛋白)复合而成的跨膜α或重链构成。如MHC那样，FcRn的α链包含3个细胞外结构域(α1、α2、α3)，短的细胞质结构域将蛋白锚定于细胞表面。α1和α2结构域与抗体的Fc区中的FcRn结合结构域相互作用(Raghavan等(Immunity(1994)1,303-315)。
FcRn在哺乳动物的母体胎盘或卵黄囊中表达，其参与IgG从母体向胎儿的转移。此外，表达有FcRn的啮齿类新生儿的小肠中，FcRn参与母体IgG从所摄取的初乳或乳中穿过刷状边缘上皮的移动。FcRn在大量种类的大量的其它组织以及各种内皮细胞系中表达。其也在人成年血管内皮、肌肉血管系和肝窦毛细血管中有表达。FcRn被认为与IgG结合，将其再循环至血清中，由此起到维持血浆中的IgG浓度的作用。通常，FcRn对IgG分子的结合严格地为pH依赖性，最佳结合在小于7.0的pH酸性范围内可观察到。
以含有SEQ ID NO:28所示信号序列的多肽为前体的人FcRn在生物体内(SEQ IDNO:29中记载了含有信号序列的该多肽)与人β2-微球蛋白形成复合体。与β2-微球蛋白形成复合体的可溶型人FcRn可利用通常的重组表达方法来制造。可以评价本发明的Fc区对这种与β2-微球蛋白形成复合体的可溶型人FcRn的结合活性。本发明中，若无特别记载，则人FcRn是指能够与本发明的Fc区结合的形态，作为实例，可举出人FcRn与人β2-微球蛋白的复合体。
作为本发明与恒定区改变技术的组合的方案，可举出与酸性pH下的FcRn结合增强改变Fc技术(WO2002060919、WO2004035752、WO2000042072)、中性pH下的FcRn结合增强改变Fc技术(WO2011122011、WO2012133782)、抑制型Fcγ受体选择性结合增强技术(WO2012115241、WO2013125667)、活性型Fcγ受体选择性结合增强技术(ADCC活性增强技术)(WO2013002362)、降低类风湿因子的结合活性的技术(WO2013046704)等抗体改变技术的组合。
作为本发明与可变区改变技术的非限定的组合方案，可举出与pH依赖性抗体(WO2009125825)、钙依赖性抗体(WO2012073992)等改变技术的组合。
包含二分子的FcRn和一分子的活性型Fcγ受体这四者的异源复合体通过FcRn和IgG抗体的结晶学研究，认为FcRn-IgG复合体是由一分子的IgG对两分子的FcRn而构成，在位于IgG的Fc区两侧的CH2和CH3结构域的接触面附近，发生二分子的结合(Burmeister等(Nature(1994)372,336-343)。另一方面，如PCT/JP2012/058603的实施例3中所确认，明确了抗体的Fc区可以形成包含二分子的FcRn和一分子的活性型Fcγ受体这四者的复合体(PCT/JP2012/058603)。该异源复合体的形成是对包含在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区的抗原结合分子的性质进行分析并由所得结果明确的现象。
本发明并不受特定理论的束缚，但认为通过包含抗原结合分子所含的Fc区与两分子的FcRn以及一分子的活性型Fcγ受体这四者的异源复合体的形成，会对将抗原结合分子给予至生物体内时的抗原结合分子在该生物体内的药代动力学(血浆中滞留性)、以及针对被给予抗原结合分子的免疫应答(免疫原性)带来如下所述的影响。免疫细胞上除了各种活性型Fcγ受体之外还表达有FcRn，这暗示抗原结合分子在免疫细胞上形成这种四者复合体会提高对免疫细胞的亲和性，进而使细胞内结构域缔合而增强内化信号，促进摄入至免疫细胞中。对于抗原呈递细胞也同样，暗示通过在抗原呈递细胞的细胞膜上形成四者复合体，可将抗原结合分子容易地摄入抗原呈递细胞中。通常，被摄入抗原呈递细胞中的抗原结合分子在抗原呈递细胞内的溶酶体中被分解并被呈递至T细胞。结果，通过在抗原呈递细胞的细胞膜上形成上述四者复合体，抗原呈递细胞对抗原结合分子的摄入得到促进，因此有可能使抗原结合分子的血浆中滞留性变差。此外同样还可能诱发免疫应答(变差)。
因此，认为在将形成这种四者复合体的能力降低的抗原结合分子给予生物体时，该抗原结合分子的血浆中滞留性将提高，该机体的免疫应答的诱发会被抑制。作为这种抑制包含抗原呈递细胞的免疫细胞上的该复合体的形成的抗原结合分子的优选方案，可举出以下三种。
抑制异源复合体的形成的抗原结合分子
(方案1)包含下述Fc区的抗原结合分子，该Fc区具有pH中性范围条件下的FcRn结 合活性、且对活性型FcγR的结合活性较天然型Fc区对活性型FcγR的结合活性低方案1的抗原结合分子通过与二分子FcRn结合而形成三者复合体，但不形成包含活性型FcγR的复合体。对活性型FcγR的结合活性较天然型Fc区对活性型FcγR的结合活性低的Fc区可通过如上所述改变天然型Fc区的氨基酸来制作。改变Fc区对活性型FcγR的结合活性是否较天然型Fc区对活性型FcγR的结合活性低，可使用前述结合活性一项中记载的方法适宜实施。
作为活性型Fcγ受体，优选可举出：包含FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)、包含FcγRIIa(包括同种异型R131和H131)以及同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)。
本说明书中，Fc区改变体对活性型Fcγ受体的结合活性较天然型Fc区对活性型Fcγ受体的结合活性低是指，Fc区改变体对FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一人Fcγ受体的结合活性较天然型Fc区对这些人Fcγ受体的结合活性低。例如是指，基于上述分析方法，与作为对照的包含天然型Fc区的抗原结合分子的结合活性进行比较，包含Fc区改变体的抗原结合分子的结合活性显示出95％以下、优选90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、特别优选70％以下、65％以下、60％以下、55％以下、50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下的结合活性。作为天然型Fc区，既可以使用起始Fc区，也可以使用野生型抗体的不同同种型的Fc区。
此外，天然型对活性型FcγR的结合活性优选是指人IgG1对Fcγ受体的结合活性，为了降低对Fcγ受体的结合活性，除了上述改变以外，还可通过对人IgG2、人IgG3、人IgG4改变同种型来实现。此外，除了上述改变以外，通过用大肠杆菌等不添加糖链的宿主来表达包含具有Fcγ受体结合活性的Fc区的抗原结合分子，也可以降低对Fcγ受体的结合活性。
作为包含作为对照的Fc区的抗原结合分子，可适宜使用具有IgG单克隆抗体的Fc区的抗原结合分子。该Fc区的结构记载于：SEQ ID NO:5(RefSeq注册号AAC82527.1的N末端添加有A)、6(RefSeq注册号AAB59393.1的N末端添加有A)、7(RefSeq注册号CAA27268.1)、8(RefSeq注册号AAB59394.1的N末端添加有A)。另外，使用包含某特定同种型的抗体Fc区的抗原结合分子作为被测物质时，通过使用具有该特定同种型的IgG单克隆抗体Fc区的抗原结合分子作为对照，来验证包含该Fc区的抗原结合分子的Fcγ受体结合活性的效果。如上所述，适当选择包含已被证实Fcγ受体结合活性高的Fc区的抗原结合分子。
在本发明的非限定的一个方案中，作为对活性型FcγR的结合活性较天然型Fc区对活性型FcγR的结合活性低的Fc区的实例，优选可举出前述Fc区的氨基酸中以EU编号表示的234、235、236、237、238、239、270、297、298、325、328、和329中的任意一个以上的氨基酸被改变为与天然型Fc区不同的氨基酸的Fc区，但Fc区的改变并不限于上述改变，也可以是例如Cur.Opin.in Biotech.(2009)20(6),685-691中记载的脱糖链(N297A,N297Q)、IgG1-L234A/L235A、IgG1-A325A/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG1-S267E/L328F、IgG2-V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A、IgG4-L236E等改变、和国际公开WO2008/092117中记载的G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R、N325L/L328R等改变、以及EU编号233位、234位、235位、237位的氨基酸的插入、国际公开WO2000/042072中记载的位置的改变。
此外，在本发明的非限定的一个方案中，优选可举出下述Fc区，其包括前述Fc区的以EU编号表示的氨基酸的下述任一者以上的改变：
将234位的氨基酸改变为Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr或Trp中的任一者，
将235位的氨基酸改变为Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Arg中的任一者，
将236位的氨基酸改变为Arg、Asn、Gln、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro或Tyr中的任一者，
将237位的氨基酸改变为Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Val、Tyr或Arg中的任一者，
将238位的氨基酸改变为Ala、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Thr、Trp或Arg中的任一者，
将239位的氨基酸改变为Gln、His、Lys、Phe、Pro、Trp、Tyr或Arg中的任一者，
将265位的氨基酸改变为Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中的任一者，
将266位的氨基酸改变为Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一者，
将267位的氨基酸改变为Arg、His、Lys、Phe、Pro、Trp或Tyr中的任一者，
将269位的氨基酸改变为Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中的任一者，
将270位的氨基酸改变为Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中的任一者，
将271位的氨基酸改变为Arg、His、Phe、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一者，
将295位的氨基酸改变为Arg、Asn、Asp、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中的任一者，
将296位的氨基酸改变为Arg、Gly、Lys或Pro中的任一者，
将297位的氨基酸改变为Ala，
将298位的氨基酸改变为Arg、Gly、Lys、Pro、Trp或Tyr中的任一者，
将300位的氨基酸改变为Arg、Lys或Pro中的任一者，
将324位的氨基酸改变为Lys或Pro中的任一者，
将325位的氨基酸改变为Ala、Arg、Gly、His、Ile、Lys、Phe、Pro、Thr、TrpTyr、或Val中的任一者，
将327位的氨基酸改变为Arg、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中的任一者，
将328位的氨基酸改变为Arg、Asn、Gly、His、Lys或Pro中的任一者，
将329位的氨基酸改变为Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val或Arg中的任一者，
将330位的氨基酸改变为Pro或Ser中的任一者，
将331位的氨基酸改变为Arg、Gly或Lys中的任一者，或
将332位的氨基酸改变为Arg、Lys或Pro中的任一者。
(方案2)包含下述Fc区的抗原结合分子，该Fc区具有pH中性范围条件下的FcRn结 合活性、且对抑制型FcγR的结合活性较对活性型Fcγ受体的结合活性高方案2的抗原结合分子可通过与二分子的FcRn和一分子的抑制型FcγR结合而形成含有它们四者的复合体。然而，由于一分子的抗原结合分子只能与一分子的FcγR结合，因而一分子的抗原结合分子在与抑制型FcγR结合的状态下无法与其它活性型FcγR结合。进而，据报道，在与抑制型FcγR结合的状态下被摄入细胞内的抗原结合分子会被再循环至细胞膜上、从而避免细胞内的分解(Immunity(2005)23,503-514)。即，认为对抑制型FcγR具有选择结合活性的抗原结合分子无法形成引起免疫应答的包含活性型FcγR和两分子的FcRn的异源复合体。
作为活性型Fcγ受体，优选可举出：包含FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)、包含FcγRIIa(包括同种异型R131和H131)以及同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)。此外，作为抑制型Fcγ受体的优选实例，可举出FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)。
本说明书中，对抑制型FcγR的结合活性较对活性型Fcγ受体的结合活性高是指，Fc区改变体对FcγRIIb的结合活性较对FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一人Fcγ受体的结合活性高。例如，是指基于上述分析方法，含有Fc区改变体的抗原结合分子对FcγRIIb的结合活性表现出对FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一人Fcγ受体的结合活性的105％以上、优选110％以上、120％以上、130％以上、140％以上、特别优选150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上、200％％以上、250％以上、300％以上、350％以上、400％以上、450％以上、500％以上、750％以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上的结合活性。
最优选的是对FcγRIIb的结合活性较对FcγRIa、FcγRIIa(包括同种异型R131和H131)和FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)的均高。FcγRIa对天然型IgG1的亲和性极高，因而认为在生物体内大量的内源性IgG1使得结合达到饱和，所以认为即使对FcγRIIb的结合活性比对FcγRIIa和FcγRIIIa的高、比对FcγRIa的低，也可能抑制该复合体的形成。
作为包含作为对照的Fc区的抗原结合分子，可适宜使用具有IgG单克隆抗体的Fc区的抗原结合分子。该Fc区的结构记载于：SEQ ID NO:5(RefSeq注册号AAC82527.1的N末端添加有A)、6(RefSeq注册号AAB59393.1的N末端添加有A)、7(RefSeq注册号CAA27268.1)、8(RefSeq注册号AAB59394.1的N末端添加有A)。另外，使用包含某特定同种型的抗体Fc区的抗原结合分子作为被测物质时，通过使用具有该特定同种型的IgG单克隆抗体Fc区的抗原结合分子作为对照，来验证包含该Fc区的抗原结合分子的Fcγ受体结合活性的效果。如上所述，适当选择包含已被证实Fcγ受体结合活性高的Fc区的抗原结合分子。
在本发明的非限定的一个方案中，作为对抑制型FcγR具有选择性结合活性的Fc区的实例，优选可举出前述Fc区的氨基酸中以EU编号表示的238或328的氨基酸被改变为与天然型Fc区不同的氨基酸的Fc区。此外，作为对抑制型Fcγ受体具有选择性结合活性的Fc区，还可以适宜选择US2009/0136485中记载的Fc区或改变。
另外，在本发明的非限定的一个方案中，优选可举出前述Fc区的以EU编号表示的氨基酸被改变为下述中的任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238的氨基酸为Asp、或328的氨基酸为Glu。
进而，在本发明的非限定的一个方案中，可优选举出改变为下述任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238位的Pro替换为Asp、以及以EU编号表示的237位的氨基酸为Trp、以EU编号表示的237位的氨基酸为Phe、以EU编号表示的267位的氨基酸为Val、以EU编号表示的267位的氨基酸为Gln、以EU编号表示的268位的氨基酸为Asn、以EU编号表示的271位的氨基酸为Gly、以EU编号表示的326位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Gln、以EU编号表示的326位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Met、以EU编号表示的239位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的267位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的234位的氨基酸为Trp、以EU编号表示的234位的氨基酸为Tyr、以EU编号表示的237位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的237位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的237位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的237位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的237位的氨基酸为Met、以EU编号表示的237位的氨基酸为Tyr、以EU编号表示的330位的氨基酸为Lys、以EU编号表示的330位的氨基酸为Arg、以EU编号表示的233位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位的氨基酸为Ser、以EU编号表示的326位的氨基酸为Thr、以EU编号表示的323位的氨基酸为Ile、以EU编号表示的323位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的323位的氨基酸为Met、以EU编号表示的296位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的326位的氨基酸为Asn、以EU编号表示的330位的氨基酸为Met。
(方案3)包含下述Fc区的抗原结合分子，其中，构成Fc区的二个多肽的一方具有pH 中性范围条件下的FcRn结合活性、另一方不具有pH中性范围条件下的FcRn结合能力活性
方案3的抗原结合分子可通过与一分子的FcRn和一分子的FcγR结合而形成三者复合体，但不形成包含二分子的FcRn和一分子的FcγR的四者的异源复合体。作为本方案3的抗原结合分子所含的、构成Fc区的二个多肽的一方具有pH中性范围条件下的FcRn结合活性、另一多肽不具有pH中性范围条件下的FcRn结合能力活性的Fc区，还可适宜使用来源于双特异性抗体(bispecific抗体)的Fc区。双特异性抗体是指对不同抗原具有特异性的二种抗体。IgG型双特异性抗体可由通过融合两种产生IgG抗体的杂交瘤而产生的杂交的杂交瘤(quadroma)来分泌(Milstein等(Nature(1983)305,537-540)。
通过使用前述抗体一项中记载的重组方法来制造上述方案3的抗原结合分子时，可采用将编码构成目标的二种Fc区的多肽的基因导入细胞并使它们共表达的方法。然而，制造的Fc区会形成下述Fc区以2：1：1的分子数的比例存在的混合物：构成Fc区的二个多肽的一方具有pH中性范围条件下的FcRn结合活性、另一多肽不具有pH中性范围条件下的FcRn结合能力活性的Fc区；构成Fc区的二个多肽的双方均具有pH中性范围条件下的FcRn结合活性的Fc区；构成Fc区的二个多肽的双方均不具有pH中性范围条件下的FcRn结合活性的Fc区。难以由3种IgG纯化包含目标组合的Fc区的抗原结合分子。
使用这种重组手法制造方案3的抗原结合分子时，通过对构成Fc区的CH3结构域施加适当的氨基酸替换的改变，可以优先分泌出包含异源组合Fc区的抗原结合分子。具体地，有下述方法：将存在于一条重链的CH3结构域的氨基酸侧链替换成更大的侧链(knob(意为“突起”))、将存在于另一条重链的CH3结构域的氨基酸侧链替换成更小的侧链(hole(意为“空隙”))，从而使突起能够配置在间隙内，以促进异种的H链形成和抑制同种的H链形成(国际公开WO1996027011、Ridgway等(Protein Engineering(1996)9,617-621)、Merchant等(Nat.Biotech.(1998)16,677-681))。
此外，还已知通过将控制多肽的缔合、或由多肽构成的异种多聚体的缔合的方法用于构成Fc区的二个多肽的缔合来制作双特异性抗体的技术。即，通过改变构成Fc区的二个多肽内的形成界面的氨基酸残基，而控制成抑制构成具有相同序列的Fc区的多肽的缔合、且形成构成序列不同的二个Fc区的多肽复合体的方法可用于双特异性抗体的制作(国际公开WO2006/106905)。具体地，在制造本发明的方案3的抗原结合分子时，作为非限定的一个方案，可采用前述双特异性抗体及其制作方法一项中记载的方法。
期待上述方案1～3的抗原结合分子与能够形成四者复合体的抗原结合分子相比均可使免疫原性降低、并使血浆中滞留性提高。
抗原结合结构域的制造方法
本发明提供低分子化合物的存在下的抗原结合活性较该化合物的非存在下的抗原结合活性高的抗原结合结构域的制造方法。
即，本发明提供包含下述步骤(a)～(e)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)获得低分子化合物的非存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
步骤(b)获得低分子化合物的存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
步骤(c)选择低分子化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域；
步骤(d)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(e)由(d)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
此外，本发明还提供包含下述步骤(a)～(e)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)获得低分子化合物的低浓度存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
步骤(b)获得低分子化合物的高浓度存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
步骤(c)选择低分子化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域；
步骤(d)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(e)由(d)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(e)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)使低分子化合物的存在下的抗原结合结构域或它们的文库与抗原接触；
步骤(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域置于该化合物的非存在下；
步骤(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域；
步骤(d)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(e)由(d)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(e)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)使低分子化合物的高浓度存在下的抗原结合结构域或它们的文库与抗原接触；
步骤(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域置于该化合物的低浓度存在下；
步骤(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域；
步骤(d)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(e)由(d)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
另外，本发明还提供包含下述步骤(a)～(f)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的非存在下使抗原结合结构域的文库与抗原接触；
步骤(b)选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(c)使前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域在该化合物的存在下与抗原结合；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
另外，本发明还提供包含下述步骤(a)～(f)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的低浓度存在下使抗原结合结构域的文库与抗原接触；
步骤(b)选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(c)使前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域在该化合物的高浓度存在下与抗原结合；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(e)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的存在下使抗原结合结构域的文库与固定有抗原的柱接触；
步骤(b)在该化合物的非存在下从柱洗脱在前述步骤(a)中与柱结合了的抗原结合结构域；
步骤(c)分离在前述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域；
步骤(d)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(e)由(d)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(e)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的高浓度存在下使抗原结合结构域的文库与固定有抗原的柱接触；
步骤(b)在该化合物的低浓度存在下从柱洗脱在前述步骤(a)中与柱结合了的抗原结合结构域；
步骤(c)分离在前述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域；
步骤(d)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(e)由(d)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(f)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的非存在下使抗原结合结构域的文库通过固定有抗原的柱；
步骤(b)回收在前述步骤(a)中未与柱结合而洗脱的抗原结合结构域；
步骤(c)使前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域在该化合物的存在下与抗原结合；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(f)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的低浓度存在下使抗原结合结构域的文库通过固定有抗原的柱；
步骤(b)回收在前述步骤(a)中未与柱结合而洗脱的抗原结合结构域；
步骤(c)使前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域在该化合物的高浓度存在下与抗原结合；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(f)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的存在下使抗原结合结构域的文库与抗原接触；
步骤(b)获得在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域置于化合物的非存在下；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中抗原结合活性较前述步骤(b)中选择的基准弱的抗原结合结构域；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(f)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的高浓度存在下使抗原结合结构域的文库与抗原接触；
步骤(b)获得在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域置于化合物的低浓度存在下；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中抗原结合活性较前述步骤(b)中选择的基准弱的抗原结合结构域；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，该载体可操作地连接有编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸；和
步骤(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合结构域。
“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”在本说明书中同义地使用，这样的命名包括细胞或细胞系的所有后代。这样，例如，“转化体”和“转化细胞”之类的术语则包括来源于它们的初级对象细胞(primary target cell)和培养物，而与传代数无关。此外，还应理解由于故意突变(intentional mutations)或偶然突变的缘故，在所有后代中，DNA的内容未必精确地相同。还可包括如在最初的转化细胞中筛选的那些实质上具有相同功能或生物学活性的突变体的后代。在记载意欲表示不同命名的情形中，根据该记载的上下文关系可明确这样的意图。作为所使用的细胞，从前述“抗体”一项中记载的细胞中适宜选择合适的细胞。
提及编码序列的表达时的控制序列是指在特定宿主生物中可操作地连接的编码序列的表达所需的DNA碱基序列。例如适宜于原核生物的控制序列包括：启动子、根据情况的操纵基因序列、核糖体结合位点、和可能还不甚理解的其它序列。真核细胞中，为了表达编码序列，公知的是利用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。
关于核酸，“可操作地连接”意指该核酸与其它核酸序列具有功能性关系。例如，前序列(presequence)或分泌前导肽的DNA在作为与某多肽的分泌相关的前体蛋白表达时，则与该多肽的DNA可操作地连接。启动子或增强子在其影响某编码序列的转录的情况下，则与该序列可操作地连接。或者，核糖体结合位点在其位于使翻译变得容易的位置时，则与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”是指连接的DNA序列连续，在分泌前导肽的情况下是指连续位于阅读框内。但是，增强子没有连续的必要。连接是在合适的限制性位点通过连接作用来实现。不存在这样的位点时，根据以往的惯例使用合成寡核苷酸衔接头或接头。还可通过上述重叠延伸PCR方法制作连接的核酸。
“连接作用”是在2个核酸片段之间形成磷酸二酯键的方法。为了2个片段的连接，片段的末端必须彼此适应。根据情况，该末端在核酸内切酶消化后立即具有适应性。但是，为了适合连接，首先需要将核酸内切酶消化后通常所形成的交错末端转变为平端。为了形成平端，将DNA在合适的缓冲液中，在4种脱氧核糖核苷三磷酸的存在下，在15℃用约10单位的DNA聚合酶I或T4DNA聚合酶的Klenow片段处理至少15分钟。接着，通过酚-氯仿提取和乙醇沉淀、或二氧化硅纯化(silica purification)来纯化DNA。将要连接的DNA片段以等摩尔量加入溶液。在该溶液中除了ATP、连接酶缓冲液外，还含有相对于DNA0.5μg为约10单位的T4DNA连接酶之类的连接酶。将DNA与载体连接时，首先通过利用适当限制性核酸内切酶的消化作用将将载体线性化。然后，通过用细菌碱性磷酸酶或小牛肠碱性磷酸酶来处理经线性化的片段，可以防止连接步骤期间的该片段的自身连接。
本发明的制造方法中，分离通过上述“低分子化合物依赖性的抗原结合结构域”一项中说明的方法选择的、低分子化合物的存在下的抗原结合活性较该化合物的非存在下的抗原结合活性高的抗原结合结构域。例如，如此分离的抗原结合结构域是由文库中选择得到时，如后述实施例中所述，编码该抗原结合结构域的多核苷酸通过通常的基因扩增由噬菌体等病毒分离。另外，如此分离的抗原结合结构域或抗体是由杂交瘤等细胞的培养液中选择得到时，如前述抗体一项中所示，抗体基因等通过通常的基因扩增由该细胞分离。
抗原结合分子的制造方法
本发明提供低分子化合物的存在下的抗原结合活性较该化合物的非存在下的抗原结合活性高的抗原结合分子的制造方法。
即，本发明提供包含下述步骤(a)～(f)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)获得低分子化合物的非存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
步骤(b)获得低分子化合物的存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
步骤(c)选择低分子化合物的非存在下的抗原结合活性较该化合物的存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域；
步骤(d)将编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有(d)中所得的多核苷酸；和
步骤(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
另外，本发明还提供包含下述步骤(a)～(f)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)获得低分子化合物的低浓度存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
步骤(b)获得低分子化合物的高浓度存在下的抗原结合结构域的抗原结合活性；
步骤(c)选择低分子化合物的低浓度存在下的抗原结合活性较该化合物的高浓度存在下的抗原结合活性低的抗原结合结构域；
步骤(d)将编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有(d)中所得的多核苷酸；和
步骤(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(f)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)使低分子化合物的存在下的抗原结合结构域或它们的文库与抗原接触；
步骤(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域置于该化合物的非存在下；
步骤(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域；
步骤(d)将编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有(d)中所得的多核苷酸；和
步骤(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(f)的抗原结合结构域的制造方法：
步骤(a)使低分子化合物的高浓度存在下的抗原结合结构域或它们的文库与抗原接触；
步骤(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域置于该化合物的低浓度存在下；
步骤(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域；
步骤(d)将编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有(d)中所得的多核苷酸；和
步骤(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
另外，本发明还提供包含下述步骤(a)～(g)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的非存在下使抗原结合结构域的文库与抗原接触；
步骤(b)选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(c)使前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域在该化合物的存在下与抗原结合；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(e)将编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(f)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有(e)中所得的多核苷酸；和
步骤(g)由(f)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
另外，本发明还提供包含下述步骤(a)～(g)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的低浓度存在下使抗原结合结构域的文库与抗原接触；
步骤(b)选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(c)使前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域在该化合物的高浓度存在下与抗原结合；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(e)将编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(f)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有(e)中所得的多核苷酸；和
步骤(g)由(f)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(f)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的存在下使抗原结合结构域的文库与固定有抗原的柱接触；
步骤(b)在该化合物的非存在下从柱洗脱在前述步骤(a)中与柱结合了的抗原结合结构域；
步骤(c)分离在前述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域；
步骤(d)将编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有(d)中所得的多核苷酸；和
步骤(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(f)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的高浓度存在下使抗原结合结构域的文库与固定有抗原的柱接触；
步骤(b)在该化合物的低浓度存在下从柱洗脱在前述步骤(a)中与柱结合了的抗原结合结构域；
步骤(c)分离在前述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域；
步骤(d)将编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(e)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有(d)中所得的多核苷酸；和
步骤(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(g)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的非存在下使抗原结合结构域的文库通过固定有抗原的柱；
步骤(b)回收在前述步骤(a)中未与柱结合而洗脱的抗原结合结构域；
步骤(c)使前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域在该化合物的存在下与抗原结合；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(e)将编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(f)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有(e)中所得的多核苷酸；和
步骤(g)由(f)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(g)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的低浓度存在下使抗原结合结构域的文库通过固定有抗原的柱；
步骤(b)回收在前述步骤(a)中未与柱结合而洗脱的抗原结合结构域；
步骤(c)使前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域在该化合物的高浓度存在下与抗原结合；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(e)将编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(f)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有(e)中所得的多核苷酸；和
步骤(g)由(f)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(g)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的存在下使抗原结合结构域的文库与抗原接触；
步骤(b)获得在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域置于化合物的非存在下；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中抗原结合活性较前述步骤(b)中选择的基准弱的抗原结合结构域；
步骤(e)将编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(f)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有(e)中所得的多核苷酸；和
步骤(g)由(f)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(g)的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的高浓度存在下使抗原结合结构域的文库与抗原接触；
步骤(b)获得在前述步骤(a)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域置于化合物的低浓度存在下；
步骤(d)分离在前述步骤(c)中抗原结合活性较前述步骤(b)中选择的基准弱的抗原结合结构域；
步骤(e)将编码(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(f)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有(e)中所得的多核苷酸；和
步骤(g)由(f)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(g)的包含抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)在低分子化合物的非存在下使本发明的文库与抗原接触；
步骤(b)选择在前述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(c)使在前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域在低分子化合物的存在下与抗原接触；
步骤(d)选择在前述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(e)使编码前述步骤(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(f)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有前述步骤(e)中得到的多核苷酸；和
步骤(g)由前述步骤(f)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，提供除了上述方案之外还进一步包含下述步骤(a)～(b)的包含抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)使本发明的文库与低分子化合物接触；和
步骤(b)选择在前述步骤(a)中回收的抗原结合结构域。
进而，本发明还提供包含下述步骤(a)～(e)的包含抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)使本发明的文库在低分子化合物的存在下与抗原接触；
步骤(b)用较前述步骤(a)低浓度的低分子化合物将抗原结合结构域解离并回收；
步骤(c)使编码前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(d)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有前述步骤(c)中得到的多核苷酸；和
步骤(e)由前述步骤(d)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
进而，提供除了上述方案之外还进一步包含下述步骤(a)～(b)的包含抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的制造方法：
步骤(a)使本发明的文库与低分子化合物接触；和
步骤(b)选择在前述步骤(a)中回收的抗原结合结构域。
作为其多核苷酸序列与编码抗原结合结构域的多核苷酸连接的Fc区的非限定的一个方案，例示有人IgG1(SEQ ID NO:5)、IgG2(SEQ ID NO:6)、IgG3(SEQ ID NO:7)、或IgG4(SEQ ID NO:8)所示的抗体的恒定区中所含的Fc区。Fc区是从以EU编号表示的大约216位氨基酸的木瓜蛋白酶切割位点的铰链区N末端开始，包含该铰链、CH2和CH3结构域的抗体重链恒定区的一部分。Fc区可由人IgG1获得，但并不限于IgG的特定的亚类。
作为其多核苷酸序列与编码抗原结合结构域的多核苷酸连接的Fc区的非限定的一个方案，可例示对活性型FcγR的结合活性较天然型Fc区对活性型FcγR的结合活性低的Fc区。作为该Fc区的非限定的其它的一个方案，优选可举出：以EU编号表示的的234位、235位、236位、237位、238位、239位、270位、297位、298位、325位、328位、和329位中的任一个以上的氨基酸被改变为与例如SEQ ID NO:5、6、7、或8所示的天然型Fc区不同的氨基酸的Fc区，但Fc区的改变并不限于上述改变，也可以是例如Cur.Opin.in Biotech.(2009)20(6),685-691中记载的脱糖链(N297A,N297Q)、IgG1-L234A/L235A、IgG1-A325A/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG1-S267E/L328F、IgG2-V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A、IgG4-L236E等改变、和国际公开WO2008/092117中记载的G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R、N325L/L328R等改变、以及EU编号233位、234位、235位、237位的氨基酸的插入、国际公开WO2000/042072中记载的位置的改变。
在本发明的抗原结合分子所含的Fc区是以使与该Fc区结合的糖链的组成是结合有岩藻糖缺陷糖链的Fc区的比例变高的方式、或添加有平分型N-乙酰葡糖胺的Fc区的比例变高的方式进行了修饰的Fc区的情形中，作为前述经转化的细胞，适宜使用要受到糖链修饰的多肽的形成糖链结构的活性被改变而使对糖链添加岩藻糖的能力低的宿主细胞(国际公开WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。作为该宿主细胞的非限定的一个方案，适宜使用选自岩藻糖基转移酶(EC 2.4.1.152)、岩藻糖转运体(SLC35C1)、GMD(GDP-甘露糖4,6-脱水酶)(EC 4.2.1.47)、Fx(GDP-酮-6-脱氧甘露糖3，5-表异构酶，4-还原酶)(EC 1.1.1.271)、和GFPP(GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶)(EC 2.7.7.30)中的酶或转运体的活性缺失的宿主细胞(国际公开WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。这种活性缺失的宿主细胞可通过破坏对CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞、HEK293细胞、或杂交瘤细胞等为内源性的这些功能性蛋白的基因使之不能发挥功能的方法等来制作。
本发明的抗原结合分子所含的Fc区为包含具有平分型GlcNAc的糖链的Fc区时，作为前述经转化的细胞，为了制作包含具有平分型GlcNAc的糖链的抗体，适宜使用表达编码功能性蛋白的基因的宿主细胞，该功能性蛋白具有GnTIII(β-1,4-甘露糖基-糖蛋白，4-β-N-乙酰葡糖胺基转移酶)(EC 2.4.1.144)活性或GalT(β-1,4-半乳糖基转移酶)(EC2.4.1.38)活性(国际公开WO2002/079255等)。在其它非限定的优选的一个方案中，适宜适用除了前述功能性蛋白之外，还共表达编码具有人ManII(甘露糖苷酶II)(3.2.1.114)活性的功能性蛋白的基因、编码具有GnTI(β-1,2-乙酰葡糖胺基转移酶I)(EC 2.4.1.94)活性的功能性蛋白的基因、编码具有GnTII(β-1,2-乙酰葡糖胺基转移酶II)(EC 2.4.1.143)活性的功能性蛋白的基因、编码具有ManI(甘露糖苷酶)(EC 3.2.1.113)活性的功能性蛋白的基因、和α-1,6-岩藻糖基转移酶(EC 2.4.1.68)的宿主细胞(国际公开WO2004/065540)。
使用从上述细胞的培养液分离等依照上述抗体一项中记载的抗体制造方法的方法，制造本发明的抗原结合分子。作为前述包含Fc区的多肽的非限定的一个方案，例如，可例示SEQ ID NO:5、6、7、或8所示的抗体的恒定区。此外，作为本发明的抗原结合分子的非限定的一个方案，可举出全长抗体分子。
药物组合物
根据本发明，提供包含抗原结合分子的药物组合物，该抗原结合分子为了在避免副作用的同时发挥药效而在正常组织或血液中不全身性地作用，但在作为病变部位的癌或炎症部位作用。本发明的药物组合物中所含的抗原结合分子对靶抗原的结合对应于靶组织中特异性存在或产生的靶组织特异性化合物和/或集结于该组织等的非天然化合物的浓度而受到控制，因此例如在该抗原结合分子以癌组织或炎症组织中的抗原为靶时，则与癌组织的癌细胞·免疫细胞·基质细胞等中表达的抗原、癌组织中分泌的抗原、或表达于炎性组织中的免疫细胞等的抗原、炎性组织中分泌的抗原结合，但不能与正常组织中表达的抗原结合，因此在避免对正常组织的细胞毒性作用、中和作用等所致的副作用的同时，发挥对癌的强效细胞毒性作用、增殖抑制作用、免疫亢进作用等、或对炎性组织的炎性细胞的免疫抑制效果等。例如，包含癌组织特异性化合物依赖性地与T细胞上表达的CD3结合的抗原结合结构域、以及与癌细胞上表达的EGFR结合的抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子或双互补位抗原结合分子不与正常组织中表达的EGFR结合，但与癌细胞中表达的EGFR结合，因而在避免副作用的同时发挥强效的抗肿瘤效果。即，与存在于癌细胞附近的T细胞上表达的CD3癌组织特异性化合物依赖性地结合，但不与存在于癌细胞附近以外的T细胞上表达的CD3结合，因而将存在于癌细胞附近的T细胞活化而在避免副作用的同时发挥强效的抗肿瘤效果。
如此，在靶组织中与抗原结合、但在靶组织以外的正常组织或血液中不与抗原结合的抗原结合分子可在避免副作用的同时发挥药效。本发明提供的将生物体内的靶组织中高浓度存在的低分子作为开关而与抗原结合的抗原结合分子，即，低分子开关抗原结合分子(Small molecule switch antigen binding molecule)可以在该低分子不存在的正常环境中不与抗原结合，而在该低分子以高浓度存在的靶组织中与抗原结合。
作为这种低分子开关抗原结合分子的非限定的一个方案，首先例示将在癌组织或炎性组织中高浓度存在、并且能够作为开关起作用的癌组织或炎性组织特异性化合物，即，腺苷(adenosine)、三磷酸腺苷(adenosine 5'-triphosphate；ATP)、肌苷(inosine)、犬尿氨酸(犬尿氨酸)、前列腺素E2(prostaglandin E2；PGE2)、琥珀酸(succinic acid)、乳酸(lactic acid)夹在本发明的抗原结合分子(所含的互补位)与抗原(所含的表位)中，或通过与本发明的抗原结合分子结合而使抗原结合分子的针对抗原的互补位的结构发生变化，从而发挥开关功能的癌组织或炎性组织特异性化合物依赖性的抗原结合分子。若该化合物不存在，则本发明的抗原结合分子所含的互补位与抗原所含的表位的相互作用变得不充分，本发明的抗原结合分子无法与抗原结合，但若该化合物存在，则通过夹在本发明的抗原结合分子所含的互补位与抗原所含的表位之间，或通过使互补位的结构发生变化，在该化合物以高浓度存在的癌组织或炎性组织等靶组织中已与抗原结合的该抗原结合分子可以对表达该抗原的细胞发挥药效。另外，由于该作为开关的化合物的结合是可逆的，因而认为借助这些化合物的开关的本发明的抗原结合分子对抗原的结合的控制是可逆的。因此，可以在癌组织或炎性组织等病变部位中与癌组织或炎性组织的癌细胞或免疫细胞等病原细胞结合、或与癌组织或炎性组织中所分泌的抗原结合从而发挥药效的本发明的抗原结合分子作为药物组合物有用。本发明的药物组合物中可含有药学上可接受的载体。
本发明中，药物组合物通常是指用于疾病的治疗或预防、或检查·诊断的药剂。另外，本发明中，“包含抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合分子的药物组合物”(这里，低分子化合物是指靶组织特异性化合物、非天然化合物等)的术语既可以说成“包括对治疗对象给予抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合分子的疾病的治疗方法”，也可以说成“抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合分子在制造用于治疗疾病的药物中的用途”。此外，还可将“包含抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合分子的药物组合物”的用语说成“抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合分子的用于治疗疾病的用途”。
本发明的药物组合物可使用本领域技术人员公知的方法来进行制剂化。例如，可以以水或其以外的药学上可接受的液体的无菌性溶液、或悬浮液剂的注射剂形式非口服地使用。例如，可以适宜组合药理学上可接受的载体或介质、具体地、适宜组合灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、载体、防腐剂、粘合剂等，以通常所认可的制药实践所要求的单位用量形态进行混和，由此进行制剂。设定这些制剂中的有效成分量，以便可得到指示范围的适当容量。
用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸馏水之类的载体按照通常的制剂实践来进行配制。作为注射用水溶液，可举出例如生理盐水、包含葡萄糖或其它辅助药(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠)的等渗液。可以并用适当的溶解助剂，例如，醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(聚山梨醇酯80(TM)、HCO-50等)。
油性液可举出芝麻油、大豆油，还可以并用苯甲酸苄酯和/或苯甲醇作为溶解助剂。此外，还可以与缓冲剂(例如、磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液)、止痛剂(例如、盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如、苯甲醇和苯酚)、抗氧化剂配合。所制备的注射液通常填充于适当的安瓿中。
本发明的药物组合物优选通过非口服给药来给予。给予例如注射剂型、经鼻给予剂型、经肺给予剂型、经皮给予型的组合物。通过例如静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等可全身或局部给予。
给予方法可根据患者的年龄、症状而适宜选择。含有抗原结合分子的药物组合物的给予量可设定为例如对于一次给药体重每1kg为0.0001mg至1000mg的范围。或者，可设定例如每个患者为0.001～100000mg的给予量，本发明并受上述数值的限制。给予量和给予方法根据患者的体重、年龄、症状等而改变，本领域技术人员可以考虑这些条件设定适当的给予量和给予方法。
应予说明，本发明中记载的氨基酸序列中所含的氨基酸有时也会在翻译后受到修饰(例如，N末端的谷氨酰胺通过焦谷氨酰基化而修饰成为焦谷氨酸是本领域技术人员熟知的修饰)，这种氨基酸经翻译后修饰的情形自然也包含在本发明中记载的氨基酸序列中。
本领域技术人员当然理解，只要基于本领域技术人员的技术常识在技术上不矛盾，则组合本说明书记载的1个或多个方案而成的方案也包含在本发明中。
应予说明，本说明书中引用的全部现有技术文献作为参考并入本说明书中。
以下通过实施例具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例所限制。
实施例
〔实施例1〕将在靶组织中以高浓度存在的低分子作为开关而与抗原结合的开关抗体的概念以及获得策略
(1-1)对抗原的结合能力在靶组织特异性化合物存在下发生变化的开关抗体的概念为了在避免副作用的同时发挥药效，需要一种在正常组织或血液中不全身性地作用、但在作为病变部位的癌或炎性部位中作用的药物的研发技术。在给药后可以与癌细胞上表达的抗原结合，但不与正常组织中表达的抗原结合的抗体分子可以在避免对正常组织的细胞毒性作用所致的副作用的同时发挥对癌的强效细胞毒性作用。例如，改变前述EGFR-BiTE(非专利文献9)得到的抗原结合分子，其是不与正常组织中表达的EGFR结合，但可与癌细胞上表达的EGFR结合的分子，可以在避免副作用的同时发挥强效的抗肿瘤效果。此外，BiTE经由CD3募集并活化T细胞从而发挥抗肿瘤效果(非专利文献8)，因而只要对EGFR-BiTE赋予与存在于癌细胞附近的T细胞上表达的CD3结合，但不与存在于癌细胞附近以外的T细胞上表达的CD3结合的性质，则被赋予了这种性质的改变EGFR-BiTE可在癌中活化T细胞，可在避免副作用的同时发挥强效的抗肿瘤效果。
并不限于针对癌的抗体药物，若抗体分子在类风湿性关节炎中已发生炎症的关节的滑液中与细胞因子结合并抑制其作用，但不全身性地抑制，则认为可在避免全身性的细胞因子的中和所致的感染疾病风险增大的同时，对类风湿性关节炎等炎性疾病·自身免疫疾病发挥良好的治疗效果。
如此，在癌组织中与抗原结合、但在癌组织以外的正常组织或血液中不与抗原结合的抗体可以在避免副作用的同时发挥药效。然而，迄今为止尚未报道具有这种特性的理想抗体。因此，将机体内的癌组织中高浓度存在的低分子、或具有会在给予生物体后集结于癌组织的性质的化合物作为开关而与抗原结合的抗体分子，即低分子开关抗体(Smallmolecule switch antibody)，如图1所示，可以在低分子不存在的环境中不与抗原结合、而在低分子以高浓度存在的靶组织中与抗原结合。
在研发这种低分子开关抗体时，首先对在癌组织中以高浓度存在、并且被认为能够用作开关的低分子进行了探究。其结果，腺苷(adenosine)、三磷酸腺苷(adenosine 5'-triphosphate；ATP)、肌苷(inosine)、犬尿氨酸(犬尿氨酸)、前列腺素E2(prostaglandinE2；PGE2)、琥珀酸(succinic acid)、乳酸(lactic acid)有望作为开关。这些低分子均是由癌细胞自身产生、或由已发生细胞死亡的癌细胞所释放、或由浸润于癌组织的免疫细胞等产生，从而在癌组织中以高浓度存在，而在正常组织或血液中以相较于癌组织的低浓度存在。
接着，对具有会在给予生物体后集结于癌组织的性质的分子进行了研究。Xeloda、TH302等前药在给予至机体内后，被表达于癌组织的代谢酶所代谢，产生能够作为开关的低分子。即，认为5-FU(fluorouracil，氟尿嘧啶)、Br-IPM等有望作为开关。5-FU是卡培他滨(Xeloda)的代谢物，已知由作为癌组织特异性代谢酶的胞苷脱氨酶与胸苷磷酸化酶所代谢(Desmoulin F.et al.Drug Metab Dispos.2002)。另外，还已知TH-302通过如在癌组织周边那样的低氧条件下进行还原而被转换为Br-IPM(Duan JX,et al.J Med Chem.2008)。因此，认为前药在给予至机体内后，通过经癌组织中表达的代谢酶代谢而以高浓度存在，而在正常组织、血液中则与癌组织相比为以低浓度存在。
这些低分子只要能够如图2所示夹在抗体与抗原的复合体间，则该低分子可以发挥开关功能。或者只要通过这些低分子与抗体的结合能使抗体的抗原结合位点的立体结构发生变化，藉此使对抗原的结合能力发生变化，则该低分子可以发挥开关功能。即，若低分子不存在则抗体与抗原的相互作用变得不充分，抗体无法与抗原结合，但若低分子存在则抗体可以与抗原结合。换而言之，在低浓度的低分子存在下，抗体与抗原的相互作用变得不充分，抗体无法与抗原结合，但在高浓度的低分子存在下时，抗体可以与抗原结合。此外，由于该作为开关的低分子的结合是可逆的，因而借助这些低分子开关的抗原结合的控制也是可逆的。
另外，通过口服给予作为开关的外源性化合物，也可以将抗体的作用通过口服制剂的服用来控制。即，将某种能够口服等的非侵袭给予的外源性化合物作为开关，将对某种抗原显示出结合的开关抗体预先进行静脉内或皮下给予等侵袭给予，然后将作为开关的外源性化合物进行口服等非侵袭给予，由此可以控制该抗体的作用。抗体药物由于半衰期长，因而产生副作用时则其作用的持续成为缺点，但是若如上所述能够通过外源性化合物的口服等非侵袭给予来控制抗体的作用，则在产生副作用时也可以通过停止开关分子的给予来终止药物的作用。另外，通过预先给予开关抗体，通过仅在因疾病而产生症状时给予开关分子，能够仅在必要时通过口服等非侵袭给予来发挥药理作用。
(1-2)对抗原的结合能力在靶组织特异性化合物存在下发生变化的开关抗体的获得策略
作为用于更加效率良好地创制在有无靶组织特异性化合物的存在下而可逆地与抗原结合的开关抗体的方法，存在利用了文库技术的方法。以维持了与靶组织特异性化合物的结合的抗体为模板，将未参与结合化合物的可变区制为文库，由此与通常的抗体文库相比，能够与化合物结合的抗体以高频率出现，因此能够效率良好地获得具有所期望性质的抗原结合分子。所以，首先为了获得作为文库的模板序列的抗体，尝试获得已知在癌细胞中高浓度存在的腺苷或ATP的结合抗体。
〔实施例2〕利用兔B细胞克隆获得抗腺苷抗体
(2-1)用于腺苷结合文库制作的免疫原的设计
作为对兔进行免疫的免疫原，使用图3所示的2'-腺苷-PEG-破伤风毒素p30辅助肽(2'-腺苷-PEG-肽)、和图4所示的5'-腺苷-PEG-破伤风毒素p30辅助肽(5'-腺苷-PEG-肽)。破伤风毒素p30辅助肽由FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列组成，其是被鉴定为辅助T细胞上表达的T细胞受体的表位的肽(Eur.J.Immunol.(1989)19,2237-2242)。已知活化抗体产生(J.Immunol.(1992)149,717-721)，通过与腺苷连接而作为佐剂发挥作用，因此期待增强针对腺苷的抗体的产生。为了使所产生抗体的表位难以在含有腺苷的同时还含有破伤风毒素p30辅助肽，设计使得腺苷与破伤风毒素p30辅助肽通过PEG而连接。腺苷是ATP的代谢物，由于ATP的磷酸基添加于腺苷的5'位羟基，因此认为不以腺苷的5'位羟基作为表位的抗体除了腺苷之外还可与ATP结合。即，设想通过使用5'-腺苷-PEG-破伤风毒素p30辅助肽作为免疫原，容易得到能够与腺苷和ATP两者结合的抗体，通过使用2'-腺苷-PEG-破伤风毒素p30辅助肽作为免疫原，容易得到与腺苷结合但不与ATP结合的抗体，因此，如(2-2)所述制作了包含与腺苷的2'位或5'位连接的破伤风毒素p30辅助肽的二种免疫原。
另外，如下所述制作了替代破伤风毒素p30辅助肽而缀合了生物素的2'-腺苷-PEG-生物素(图5)和5'-腺苷-PEG-生物素(图6)。通过验证与这二种腺苷-PEG-生物素的结合，可以判断并不是含有破伤风毒素p30辅助肽作为表位的抗体。
(2-2)用于腺苷结合文库制作的免疫原的合成
2'-腺苷-PEG-肽(腺苷2'-PEG-肽缀合物或2'-(PEG-肽)腺苷)和2'-腺苷-PEG-生物素(腺苷2'-PEG-生物素缀合物或2'-(PEG-生物素)腺苷)如下所述进行合成。另外，合成的2'-腺苷-PEG-肽或2'-腺苷-PEG-生物素在以下条件下进行分析或制备。
LCMS的分析条件如下所述。
[表1]
Figure BDA0002407382280001381
HPLC的制备条件如下所述。
[表2]
Figure BDA0002407382280001382
(2-2-1)化合物006(Boc-Phe-Asn-Asn-Phe-Thr(tBu)-Val-Ser(tBu)-Phe-Trp(Boc)-Lue-Arg(Pbf)-Val-Pro-Lys(Boc)-Val-Ser(tBu)-Ala-Ser(tBu)-His(Trt)-Leu-Glu(tBu)-OH)的合成
[化6]
Figure BDA0002407382280001383
使用肽合成仪(Multipep RS；Intavis)，通过Fmoc法进行肽合成。所有的Fmoc氨基酸购自渡边化学工业。另外，操作的详细步骤依照合成仪所附的操作说明。
在合成仪中，设置结合有C末端的Fmoc-Glu(tBu)-OH的2-氯三苯甲基树脂(每1柱250mg、30柱、11.7mmol)、各种Fmoc氨基酸(0.6mol/L)与1-羟基-7-氮杂苯并三唑(0.375mol/L)的N,N-二甲基甲酰胺溶液、以及二异丙基碳二亚胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液(10％v/v)，使用含5％(wt/v)脲的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20％v/v)作为Fmoc脱保护溶液，进行合成反应。树脂用N,N-二甲基甲酰胺清洗后，进行Fmoc脱保护，然后进行Fmoc氨基酸的缩合反应，将上述操作作为1个循环，通过重复进行该循环，使肽在树脂表面上延伸。延伸结束后，将树脂用三氟乙醇清洗，加入三氟乙醇/二氯甲烷(＝1/1)，从树脂切出肽，以粗产物形式得到化合物006(7.2g)。
LCMS(ESI)m/z＝1185(M+3H)3+
保留时间：1.24分(分析条件SQDAA05)。
(2-2-2)化合物007的合成
[化7]
Figure BDA0002407382280001391
在冷却至0℃的腺苷(2.00g、7.48mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(40ml)悬浮液中，加入60％氢化钠(0.42g、10.48mol)，将反应液在0℃搅拌1小时。加入溴乙酸甲酯(0.76ml、8.01mmol)，将该反应液在室温搅拌5小时。加入乙酸(1ml)和甲醇(3ml)，将所得反应混合物减压浓缩。将所得残渣通过正相硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇)纯化，得到化合物007(0.93g、37％)。
LCMS(ESI)m/z＝340(M+H)+
保留时间：0.27分(分析条件SQDFA05)。
(2-2-3)化合物008的合成
[化8]
Figure BDA0002407382280001401
将加入有叔丁基二甲基氯硅烷(999mg、6.63mol)和咪唑(722mg、10.61mol)的化合物007(900mg、2.65mmol)的吡啶(8ml)溶液在室温搅拌4小时。将用乙酸乙酯/水由反应混合物提取的有机层用饱和盐水清洗。将经无水硫酸钠干燥的有机层过滤后进行减压浓缩。将所得残渣通过正相硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇)纯化，得到化合物008(1.17g、78％)。
LCMS(ESI)m/z＝568(M+H)+
保留时间：1.10分(分析条件SQDFA05)。
(2-2-4)化合物009的合成
[化9]
Figure BDA0002407382280001402
将加入有溶解于水(0.17ml)的氢氧化锂(61mg、2.55mol)的化合物008(290mg、0.511mmol)的甲醇(0.34ml)/四氢呋喃(0.34ml)溶液在室温搅拌30分钟。将用1M盐酸中和的反应混合物进行减压浓缩。将用乙酸乙酯/水由浓缩残渣提取得到的有机层用饱和盐水清洗。将经无水硫酸钠干燥的有机层过滤后，进行减压浓缩，得到化合物009(319mg、90％)。
LCMS(ESI)m/z＝552(M-H)-
保留时间：0.97分(分析条件SQDFA05)。
(2-2-5)化合物010和化合物011的合成
[化10]
Figure BDA0002407382280001411
[化11]
Figure BDA0002407382280001412
将加入有1-羟基苯并三唑(75mg、0.553mol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(106mg、0.553mol)的化合物009(255mg、0.460mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(1.5ml)溶液在室温搅拌3分钟。将加入有O-(2-氨基乙基)-O'-2-叠氮乙基)九聚乙二醇(291mg、0.553mmol)的反应液在室温搅拌3小时。将经减压浓缩得到的反应混合物的残渣通过反相硅胶柱色谱(10mM乙酸铵水溶液/甲醇)进行纯化，得到化合物010(177mg、42％)和011(72mg、19％)。
化合物010
LCMS(ESI)m/z＝1063(M+H)+
保留时间：0.98分(分析条件SQDFA05)
化合物011
LCMS(ESI)m/z＝949(M+H)+
保留时间：0.67分(分析条件SQDFA05)。
(2-2-6)化合物012的合成
[化12]
Figure BDA0002407382280001413
将加入有10％钯-碳(34mg)的化合物010(170mg、0.160mmol)的乙醇(1ml)溶液在氢气氛下搅拌2小时。进而加入10％钯-碳(34mg)，在氢气氛下搅拌2小时，结束反应。将反应液的滤液减压浓缩，得到化合物012(34mg、95％)。
LCMS(ESI)m/z＝1037(M+H)+
保留时间：0.70分(分析条件SQDFA05)。
(2-2-7)化合物013和化合物014的合成
[化13]
Figure BDA0002407382280001421
[化14]
Figure BDA0002407382280001422
将加入有化合物006(354mg、0.110mmol)、1-羟基苯并三唑(13mg、0.100mol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(19mg、0.100mol)的化合物012(86mg、0.083mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(1.5ml)溶液在室温搅拌2小时。将反应混合物的滤液以表2中记载的制备条件A进行纯化，得到化合物013和014的混合物(72mg)。
化合物013
LCMS(ESI)m/z＝1525(M+3H)3+、1144(M+4H)4+
保留时间：1.13分(分析条件SQDAA50)
化合物014
LCMS(ESI)m/z＝1444(M+3H)3+、1083(M+4H)4+
保留时间：1.02分(分析条件SQDAA50)。
(2-2-8)2'-腺苷-PEG-肽(腺苷2'-PEG-肽缀合物或2'-(PEG-肽)腺苷)(化合物015)的合成
[化15]
Figure BDA0002407382280001431
将加入有三氟乙酸(16ml)、二氯甲烷(8ml)、水(1.3ml)和四异丙基硅烷(1.3ml)的化合物013和014的混合物(42mg)在室温搅拌6小时。将经减压浓缩的反应混合物的残渣以表2中记载的制备条件B进行纯化，得到化合物015(10mg)。
LCMS(ESI)m/z＝1090(M+3H)3+、818(M+4H)4+
保留时间：0.52分(分析条件SQDAA50)。
(2-2-9)化合物016的合成
[化16]
Figure BDA0002407382280001432
将加入有10％钯-碳(34mg)的化合物011(70mg、0.074mmol)的乙醇(1ml)溶液在氢气氛下搅拌5小时。将反应液的滤液减压浓缩，得到化合物016(58mg、85％)。
LCMS(ESI)m/z＝923(M+H)+
保留时间：0.50分(分析条件SQDFA05)。
(2-2-10)化合物017的合成
[化17]
Figure BDA0002407382280001441
将加入有D-生物素N-琥珀酰亚胺酯(24mg、0.069mmol)、和三乙胺(13μl、0.094mol)的化合物016(58mg、0.063mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(1ml)溶液在室温搅拌2小时。进而，加入D-生物素N-琥珀酰亚胺酯(5mg、0.015mmol)后，在室温搅拌1.5小时，结束反应。将反应混合物通过反相硅胶柱色谱(10mM乙酸铵水溶液/甲醇)进行纯化，得到化合物017(50mg、69％)。
LCMS(ESI)m/z＝1149(M+H)+
保留时间：1.04分(分析条件SQDFA05)。
(2-2-11)2'-腺苷-PEG-生物素(腺苷2'-PEG-生物素缀合物或2'-(PEG-生物素)腺苷)(化合物018)的合成
[化18]
Figure BDA0002407382280001442
将加入有1M氟化四正丁基铵四氢呋喃溶液(65μl、0.065mmol)的化合物017(62mg、0.054mmol)的四氢呋喃(2ml)溶液在室温搅拌1小时。进而，加入1M氟化四正丁基铵四氢呋喃溶液(20μl、0.020mmol)，在室温搅拌1小时，结束反应。将经减压浓缩得到的反应液的残渣通过反相硅胶柱色谱(0.1％甲酸水溶液/0.1％甲酸乙腈)进行纯化，得到化合物018(12mg、21％)。
LCMS(ESI)m/z＝1035(M+H)+
保留时间：0.71分(分析条件SQDAA05)。
另外，5'-腺苷-PEG-肽和5'-腺苷-PEG-生物素也使用相同的反应来合成。
(2-3)利用动物的腺苷结合抗体制作和抗体的筛选
通过通常的方法用2'-腺苷-PEG-肽和/或5'-腺苷-PEG-肽对兔进行免疫。使用autoMACS Pro Separator和FACSAria(BD)，以腺苷-PEG-生物素结合性和兔IgG的表达作为指标，从采集自免疫兔的血液的细胞悬浮液选取具有腺苷结合活性的细胞的候选。接着，筛选分泌在选取细胞的培养上清中的抗体。作为筛选，通过ELISA法来评价是否具有对腺苷-PEG-生物素的结合活性。此外，还通过ELISA法评价了将腺苷与腺苷-PEG-生物素一起以1000倍以上的量加入时，是否会抑制对腺苷-PEG-生物素的结合。以具有腺苷-PEG-生物素结合活性，并且在与腺苷-PEG-生物素一起加入腺苷时腺苷-PEG-生物素结合受到抑制作为指标进行选取，使用PCR法由所选细胞获得H链可变区和L链可变区。将所获得的可变区与人IgG1重链恒定区、和人轻链恒定区进行组合并表达。
〔实施例3〕评价由兔B细胞克隆得到的克隆
(3-1)评价由兔B细胞克隆得到的克隆与2'-腺苷-PEG-生物素的结合活性
使用SPR法评价由兔B细胞克隆法得到的克隆与腺苷的结合活性。使用Biacore4000(GE Healthcare)，对上述克隆与2'-腺苷-PEG-生物素的抗原抗体反应进行动力学分析。在用胺偶联法固定有适当量的protein A/G(Invitrogen)的传感器芯片CM5(GEHealthcare)上捕获目标抗体。接着，使作为分析物的100nmol/L的2'-腺苷-PEG-生物素相互作用60秒钟后，跟踪60秒钟测定分析物的解离。流动缓冲液使用HBS-P+(GEHealthcare)。测定均在25℃实施，分析物的稀释使用流动缓冲液。
将使2'-腺苷-PEG-生物素相互作用时的结合量除以各抗体的捕获量(RU)得到的值(N_结合_100)、与使2'-腺苷-PEG-生物素的相互作用后2'-腺苷-PEG-生物素从各抗体解离60秒后的值除以各抗体的捕获量(RU)得到的值(N_稳定性_100)作为指标，对各抗体与2'-腺苷-PEG-生物素的结合活性进行比较。其中，捕获量为1500RU以下的抗体无法充分观察到结合，因而从研究对象中排除。该结果示于图7。图7的结果表明，通过B细胞克隆法得到了以各种亲和力与腺苷结合的克隆。
(3-2)2'-腺苷-PEG-生物素结合克隆与腺苷和ATP的结合活性的评价及其序列分 析
观察到与2'-腺苷-PEG-生物素的结合的克隆与腺苷或ATP的结合通过SPR法和竞争ELISA法进行评价。
(3-2-1)通过2'-腺苷-PEG-生物素结合克隆的SPR法来评价对腺苷的结合
使用Biacore T200(GE Healthcare)，分析由B细胞克隆法得到的抗体SMB0002与腺苷的抗原抗体反应的相互作用。在传感器芯片CM5(GE Healthcare)上以胺偶联法固定适当量的protein A(Invitrogen)，在该芯片上捕获目标抗体，并使作为抗原的腺苷相互作用。流动缓冲液使用50mmol/L TrisHCl、150mmol/L NaCl、0.02％(w/v)Tween20、pH7.6。测定均在25℃下实施，抗原的稀释使用流动缓冲液。
对于SMB0002，将抗原稀释液和作为空白的流动缓冲液以流速30μL/min添加75秒钟，使各抗原与传感器芯片上捕获的抗体相互作用。然后，以流速30μL/min通入4分钟流动缓冲液，观察抗原从抗体的解离。然后，将10mmol/L Glycine-HCl,pH1.5以流速30μL/min添加30秒钟，将传感器芯片再生。根据测定所得的传感图，计算作为动力学参数的结合速度常数ka(1/Ms)、和解离速度常数kd(1/s)。基于这些常数算出解离常数KD(M)。各参数的计算中使用了Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。
结果观察到SMB0002对腺苷结合。评价克隆在腺苷100(Duplicate)、50、25、12.5、6.25、3.13nM的浓度下的结合时所观察到的传感图总结于图8A。SMB0002对腺苷的KD为1.5×10-8(mol/L)。
(3-2-2)通过SPR法评价2'-腺苷-PEG-生物素结合克隆对ATP的结合
使用Biacore T200(GE Healthcare)分析与ATP的抗原抗体反应的相互作用。在传感器芯片CM5(GE Healthcare)上以胺偶联法固定适当量的protein A/G(Invitrogen)，在该芯片上捕获目标抗体，并使作为抗原的ATP相互作用。流动缓冲液使用10mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.4。测定均在25℃下实施，抗原的稀释用流动缓冲液。
关于SMB0002，以流速20μL/min注入2分钟抗原稀释液和作为空白的流动缓冲液，使各抗原与传感器芯片上捕获的抗体相互作用。然后，以流速20μL/min通入3分钟流动缓冲液，观察抗原从抗体的解离。然后，将10mmol/L Glycine-HCl,pH1.5以流速30μL/min注入30秒钟，将传感器芯片再生。根据测定所得的传感图，计算作为动力学参数的结合速度常数ka(1/Ms)、和解离速度常数kd(1/s)。基于这些常数算出解离常数KD(M)。各参数的计算中使用了Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。
结果观察到SMB0002对ATP也结合。评价各克隆在ATP 5000、1250、313、78.1nM的浓度下的结合时所观察到的传感图总结于图8B。如图8A和8B所示，观察到SMB0002对腺苷和ATP两者的结合。SMB0002对腺苷的KD为1.5E-8(mol/L)，SMB0002对ATP的KD为1.0E-5(mol/L)。
(3-2-3)通过竞争ELISA法评价2'-腺苷-PEG-生物素结合克隆对腺苷和ATP的结合
将观察到对2'-腺苷-PEG-生物素的结合的抗体以达到1μg/mL的方式用PBS稀释，加入384孔的MAXISorp(Nunc)的各孔中，在室温放置1小时以上，使之与板结合。将板的各孔中的用PBS稀释了的抗体除去后，加入含1％BSA的TBS，将该板放置1小时以上。然后，除去含1％BSA的TBS pH7.4，加入用PBS稀释的50nM的2'-腺苷-PEG-生物素、用PBS稀释的50nM的2′-腺苷-PEG-生物素与500μM的腺苷的混合物、用PBS稀释的50nM的2′-腺苷-PEG-生物素与500μM的ATP的混合物、或仅PBS中的任一者，将该培养板在室温放置1小时。然后，该培养板的各孔用含有0.05％Tween-20的PBS 80μL清洗3次。然后，向各孔加入用PBS稀释20000倍的链霉亲和素-HRP(Thermo fisher scientific)，将培养板在室温放置1小时以上。用含0.05％Tween-20的PBS 80μL清洗3次，在该培养板的各孔中显色底物(ABTS过氧化物酶底物)。将该培养板孵育1小时后，将各孔中溶液的显色通过Molecular Device社制SpectraMax测定405nm的吸光度。
结果如图9所示，对于SMB0002，通过过量添加腺苷和ATP，对2′-腺苷-PEG-生物素的结合受到抑制，因此确认这些克隆是不仅与2′-腺苷-PEG-生物素结合，而且也与腺苷和ATP两者结合的抗体。
(3-2-4)腺苷和ATP结合克隆的序列分析
确认到与腺苷和ATP两者结合的克隆SMB0002的氨基酸序列如表3所示。
[表3]
克隆名称 重链序列编号 轻链序列编号
SMB0002 SEQ ID NO：30 SEQ ID NO：31
〔实施例4〕利用抗ATP/腺苷抗体的基于全面改变的AMP/ADP/ATP/腺苷开关抗体获得用文库的设计
已知在癌组织和炎性组织中，腺苷和ATP的浓度高。通过后述参考实施例2中构建的以与ATP结合的抗体为模板的合理设计文库，大量获得了仅在ATP存在下显示抗原结合能力的抗体，由此认为通过同样地构建以对腺苷或AMP、ADP、ATP显示结合能力的抗体为模板的文库，能够获得仅在腺苷或AMP、ADP、ATP存在下显示抗原结合能力的抗体。
(4-1)通过SPR法评价腺苷结合抗体SMB0002对AMP和ADP的结合
以后述参考实施例1中所示的方法表达和纯化的SMB0002对AMP的结合通过与实施例3-2所示的利用Biacore的测定方法相同的方法进行测定。对SMB0002以AMP 500、250(Duplicate)、125、62.5、31.25、15.625、7.8125μM的浓度评价结合时所观察到的传感图示于图10A。如图10A所示，确认到SMB0002对AMP的结合。SMB0002对AMP的KD为5.9×10-5(mol/L)。
另外，对ADP的结合通过与实施例3-2所示的采用Biacore的测定方法相同的方法，但将NaCl浓度改变为600mM进行测定。对于SMB0002，以ADP 2000、1000(Duplicate)、500、250、250、125、62.5、31.3μM的浓度评价结合时所观察到的传感图示于图10B。如图10B所示，确认到SMB0002对ADP的结合。SMB0002对ADP的KD为2.4×10-4(mol/L)。
(4-2)腺苷结合抗体SMB0002的X射线晶体结构分析
从实施例3中免疫的兔获得的腺苷结合抗体SMB0002与腺苷的复合体的立体结构通过X射线晶体结构分析来阐明。
(4-2-1)结晶化用SMB0002全长抗体的制备
结晶化用SMB0002全长抗体的制备和纯化通过本领域技术人员公知的方法进行。
(4-2-2)来自全长抗体的SMB0002Fab片段的制备
将所得的SMB0002全长抗体通过分子量分级大小10000MWCO的超滤膜浓缩后，用4mM L-半胱氨酸、5mM EDTA、25mM MES pH 6.5稀释至1.5mg/ml，制得样品，向其中加入相对于全长抗体以质量比计为百分之一的量的木瓜蛋白酶(Roche Applied Science)，在35℃静置2小时。然后，加入溶解蛋白酶抑制剂Cocktail(不含EDTA,mini片剂)(Roche AppliedScience)1片得到的20ml的25mM乙酸钠缓冲液pH5.0，由此终止反应。接着，将该样品添加至经25mM乙酸钠缓冲液pH5.0平衡化了的1ml大小的阳离子交换柱HiTrap SP HP(GEHealthcare)的下游串联有1ml大小的ProteinA载体柱HiTrap MabSelect Sure(GEHealthcare)的柱上，在相同缓冲液中线性提升NaCl浓度进行洗脱，由此得到SMB0002抗体的Fab片段的纯化级分。接着，将所得纯化级分通过5000MWCO的超滤膜浓缩，将其添加至经25mM HEPES缓冲液pH 7.0、100mM NaCl平衡化的凝胶过滤柱Superdex 200 16/60prepgrade(GE Healthcare)，通过相同缓冲液由柱洗脱，得到结晶化用SMB0002的Fab片段。另外，全部柱操作均在低温下实施。
(4-2-3)SMB0002Fab片段与腺苷复合体的结晶化
将用上述方法纯化的结晶化用SMB0002_Fab样品通过5000MWCO的超滤膜浓缩至A280＝22.3。然后以终浓度为0.9mM的方式添加腺苷，通过坐滴蒸气扩散法进行结晶化。结晶化使用Hydra II Plus One(MATRIX)，对于20％PEG3350,0.2M柠檬酸二铵的储液，按照储液：结晶化样品＝0.2μl：0.2μl进行混合制作结晶化液滴，在20℃静置，成功得到板状的结晶。
(4-2-4)来自SMB0002 Fab片段与腺苷的复合体结晶的X射线衍射数据的测定
将所得的SMB0002 Fab片段与腺苷的复合体的一个单晶浸于0.2M柠檬酸二铵，0.025M HEPES pH7，25％PEG3350，0.1M NaCl，1mM腺苷，16％甘油的溶液中后，用带有微小尼龙环的针与溶液一并掬起，在液氮中冷冻，用高能加速器研究机构的放射光设施PhotonFactory的BL-17A进行X射线衍射数据的测定。另外，测定中一直置于-178℃的氮气流中以维持冷冻状态，通过设置有光束线的CCD探测器Quantum 315r(ADSC)，一边使结晶每次旋转0.6°一边采集总计300幅X射线衍射图像。基于所得衍射图像的晶格常数的确定、衍射斑的指数化、以及衍射数据的处理中使用程序Xia2(J.Appl.Cryst.(2010)43,186-190)、XDS Package(Acta Cryst.(2010)D66,125-132)和Scala(Acta Cryst.(2006)D62,72-82)，最终成功得到分辨率达
Figure BDA0002407382280001491
的衍射强度数据。本结晶属于空间群P1，晶格常数
Figure BDA0002407382280001492
Figure BDA0002407382280001493
α＝62.58°、β＝77.29°、γ＝77.49°。
(4-2-5)SMB0002 Fab片段与腺苷的复合体的X射线晶体结构分析
为了确定SMB0002 Fab片段与腺苷的复合体结晶的结构，使用程序Phaser(J.Appl.Cryst.(2007)40,658-674)实施分子替换法。根据所得晶格的大小与SMB0002 Fab片段的分子量，预计非对称单元中的复合体的数目为4个。使用Discovery Studio3.5(Accelrys)，制作该抗体的同源模型，将该模型分为可变区和恒定区部分，将各自的结构坐标用作搜索用模型，根据旋转函数和并进函数确定该结晶的晶格内的取向和位置。进而对于所得的初期结构模型，进行使可变区和恒定区部分独立运动的的刚体精密化，结果相对于
Figure BDA0002407382280001494
的衍射强度数据的结晶学可靠性因子R值为46.36％、Free R值为46.10％。进而，基于使用程序REFMAC5(Acta Cryst.(2011)D67,355-367)的结构精密化、以及实验确定的结构因子Fo和根据模型计算的结构因子Fc和根据模型计算的相位而算出2Fo-Fc、Fo-Fc，参照以它们为系数的电子密度图的同时，使用程序Coot(Acta Cryst.(2010)D66,486-501)实施该结构模型的修正，重复上述操作，由此进行结构模型的精密化。最终，使用分辨率
Figure BDA0002407382280001495
的168160个衍射强度数据，含14681个非氢原子的结构模型的结晶学可靠性因子R值为19.82％、Free R值为23.15％。
(4-2-6)鉴定SMB0002与腺苷的相互作用位点
最终，SMB0002_Fab片段与腺苷的复合体的晶体结构以分辨率
Figure BDA0002407382280001496
来确定。本结晶的非对称单元中存在4个SMB0002_Fab片段，它们均结合有腺苷，其结合模式也都大致相同。根据本晶体结构可知，腺苷结合至该抗体的Fab片段的H链和L链之间形成的袋子，其中，腺嘌呤环为朝向袋子深处的形式。
如图11A所示，腺苷的腺嘌呤环部分被该抗体的H链A33、I50、W58、Y100、L链Y95c、N96的各侧链以及H链G99、T100a的各主链所识别。可知特别是通过L链N96侧链与腺苷1位的N以及6位的NH2形成2个氢键，进而H链T100a主链的羰基氧以及酰胺NH基与腺嘌呤环的6位的NH2以及7位的N之间分别形成氢键，从而被强力地识别。进而，腺嘌呤环被该抗体的H链A33、I50、W58、Y100和L链Y95c的各侧链所包围，从而与这些残基形成范德华相互作用或CH-π相互作用。H链G99、T100a均在主链部分与腺嘌呤环形成相互作用，但由于G99在拉氏图上具有Gly特有的φ-Ψ角，因而认为对于与腺苷结合时的H链CDR3的环结构的维持是重要的。另外，还认为T100a侧链也通过与H链CDR3的其它残基形成相互作用而在与腺苷结合时的H链CDR3环的结构的维持中发挥重要作用。如图11B所示，腺苷的核糖部分通过H链S56、W58、L链Y95c的各侧链以及T57的主链、H链G52而被识别。与这些残基的相互作用主要基于范德华相互作用，但对于H链S56，在侧链与核糖的3'位OH之间虽然弱也观察到了氢键的形成。H链G52，包括其Cα原子，与核糖部分形成大量的范德华相互作用，被认为在腺苷的识别中发挥重要功能。另一方面，H链T57仅在主链与核糖部分发生相互作用，侧链并不直接参与结合。
如实施例4-1所示，该抗体不仅与腺苷结合，而且还与结合活性降低的AMP结合。本晶体结构中腺苷的核糖5'位OH与腺嘌呤环部分3位的N形成分子内相互作用，但在AMP中却无法形成本结合，5'位的O的位置稍有变化，则作为结果，AMP的磷酸基被推测存在于图11B所示的虚线内的区域。本区域位于能够与H链CDR2以及L链CDR3的残基进行相互作用的位置，通过对H链CDR2以及L链CDR3导入适当的突变，可以期待对AMP的结合增强。
根据以上结果，不仅明确了基于该抗体的腺苷的识别模式，而且鉴定了深度参与腺苷结合的抗体可变区的氨基酸残基。作为深度参与腺苷结合的氨基酸残基，可举出H链：A33、I50、G52、S56、T57、W58、G99、Y100、T100a(Kabat编号)，L链：Y95c、N96(Kabat编号)。另外，作为有可能位于AMP的5'位磷酸基的附近的残基，预测了H链CDR2的D54、S55、S56、T57、W58以及L链CDR3的G95a、W95b、Y95c，对这些残基的改变有可能与AMP结合增强相关。
进而对于ADP、ATP，通过基于晶体结构进行相同的考察，也可以预测能够增强对ADP、ATP的结合的改变。
(4-3)来源于兔的抗体SMB0002的人源化
SMB0002是来源于兔的抗体，因而在制作人抗体文库时，通过本领域技术人员公知的方法实施序列的人源化(欧州专利公开EP239400、国际公开WO1996/002576、WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735、WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388、Cancer Res.,(1993)53,851-856、BBRC.,(2013)436(3):543-50等)。
人源化SMB0002(重链可变区序列：SEQ ID NO:85、轻链可变区序列：SEQ ID NO:86)以参考实施例1-1所示的方法进行表达和纯化。人源化SMB0002与腺苷和AMP的结合通过使用Biacore T200(GE Healthcare)的方法进行测定、分析。在传感器芯片CM5(GEHealthcare)上以胺偶联法固定适当量的protein A(Invitrogen)，在其上捕获目标抗体，观察与作为抗原的腺苷或AMP、ADP、ATP的相互作用。流动缓冲液在腺苷或AMP的情形中使用50mM TrisHCl、150mM NaCl、0.02％(w/v)Tween20、pH7.6，在ADP或ATP的情形中使用50mMTrisHCl、150mM NaCl、0.02％(w/v)Tween20、2mM MgCl2、pH7.6。测定均在25℃下实施，抗原的稀释用流动缓冲液。
对于在传感器芯片上捕获的抗体，将抗原稀释液和作为空白的流动缓冲液以流速30μL/min添加75秒钟，观察抗原与抗体的结合。然后，以流速30μL/min通入5分钟流动缓冲液，观察抗原从抗体的解离。然后，将10mM Glycine-HCl,pH1.5以流速30μL/min添加30秒钟，将传感器芯片再生。根据测定所得的传感图，计算作为动力学参数的结合速度常数ka(1/Ms)、和解离速度常数kd(1/s)。基于这些常数算出解离常数KD(M)。各参数的计算中使用了Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。
结果观察到人源化SMB0002对腺苷、AMP、ADP、ATP结合。将腺苷浓度200、100、50(duplicate)、25、12.5、6.25、3.125nM的试样与克隆相互作用时所观察到的传感图总结于图12。人源化SMB0002对腺苷的KD为7.5×10-9M。接着，将AMP浓度500、250、125(duplicate)、62.5、31.3、15.6、7.8μM的试样与克隆相互作用时所观察到的传感图总结于图13。人源化SMB0002对AMP的KD为3.5×10-5M。接着，将ADP浓度1000(duplicate)、500、250、125、62.5μM的试样与克隆相互作用时所观察到的传感图总结于图14。人源化SMB0002对ADP的KD为7.9×10-5M。最后，将ATP浓度1000(duplicate)、500、250、125、62.5μM的试样与克隆相互作用时所观察到的传感图总结于图15。人源化SMB0002对ATP的KD为1.4×10-4M。人源化SMB0002对腺苷和AMP,ADP,ATP具有结合活性，因此将该序列用作人抗体文库构建的模板序列。
(4-4)用于基于X射线晶体结构分析结果的文库设计的全面改变体评价
在实施例(4-2)中，分析腺苷结合抗体SMB0002与腺苷的复合体的晶体结构。根据晶体结构分析的结果，推定出该抗体识别腺苷(和AMP)的识别模式以及预想不深度参与腺苷(和AMP)结合的抗体可变区的氨基酸残基。认为通过全面评价存在于腺苷识别位点附近的残基被各氨基酸所替换得到的改变体，可以判断能够文库化的位点和能够文库化的氨基酸。即，认为通过判定未深度参与对腺苷或AMP、ADP、ATP的结合的位点、或即使参与结合但不会使对腺苷或AMP、ADP、ATP的结合大幅降低(不使结合为零)的天然序列以外的氨基酸所存在的位点和氨基酸，可以判定能够文库化的位点和能够文库化的氨基酸。对于实施例(4-3)中所制作的人源化SMB0002，制作了大量对这些残基导入改变得到的改变体。
重链的位点中被改变的位点(表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点)以及该位点的改变前的氨基酸(表中记载为“天然序列”的氨基酸)和改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”的氨基酸)示于表4。
[表4]
Figure BDA0002407382280001531
轻链的位点中被改变的位点(表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点)以及该位点的改变前的氨基酸(表中，记载为“天然序列”的氨基酸)和改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”的氨基酸)示于表5。
[表5]
Figure BDA0002407382280001541
通过后述参考实施例1所示的方法表达和纯化的各改变体对腺苷和AMP的结合，通过实施例4-3所示的使用Biacore的方法仅将MgCl2浓度改变为2mM来进行测定。测定的结果，各改变体与腺苷和AMP的亲和力以KD值的形式算出。重链的各改变体与作为亲本序列的人源化SMB0002的对腺苷的KD值的比较结果示于表6，对AMP的KD值的比较结果示于表7。轻链的各改变体与人源化SMB0002的对腺苷的KD值的比较结果示于表8，对AMP的KD值的比较结果示于表9。
[表6]
Figure BDA0002407382280001551
[表7]
Figure BDA0002407382280001561
[表8]
Figure BDA0002407382280001571
[表9]
Figure BDA0002407382280001572
(4-5)基于全面性改变体评价结果的文库设计
设计文库时，根据实施例4-4所得的信息，选定满足以下条件中的至少一者的位点作为能够文库化的位点。
条件1)不深度参与对腺苷或AMP、ADP、ATP的结合的位点、或即使参与结合也不会使对腺苷或AMP、ADP、ATP的结合大幅降低(不使结合为零)的天然序列以外的氨基酸所存在的位点；
条件2)作为抗体谱具有某种程度氨基酸出现频率的多样性的位点；
条件3)对于经典结构的形成不重要的位点。
根据实施例(4-4)的评价结果，将显示对腺苷和AMP的KD值均高于亲本序列(人源化SMB0002)对腺苷和AMP的KD值的20％的结合的改变体存在至少一个以上的位置判定为满足上述条件的能改变的位点。在该位点处被替换的氨基酸中，显示对腺苷和AMP的KD值均高于亲本序列(人源化SMB0002)对腺苷和AMP的KD值的20％的结合的氨基酸被判定为能够文库化的氨基酸(能够在文库中出现的柔性残基)。通过设计在人源化SMB0002的CDR位点中，在被判定的能够改变的位点出现包含根据前述改变体的分析选出的能够文库化的氨基酸(能够在文库中出现的柔性残基)和未改变体的氨基酸(即人源化SMB0002的天然序列中所含的氨基酸)的氨基酸组成成分中所含的氨基酸之中的至少任一者以上的氨基酸的文库，构建用于获得ATP/AMP/ADP/腺苷开关抗体的文库。包含重链中的氨基酸组成成分的位点、以及该位点处的氨基酸组成成分示于表10。包含轻链中的氨基酸组成成分的位点、以及该位点处的氨基酸组成成分示于表11。表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点表示能够改变的位点，记载为“天然序列”的氨基酸表示该位点处的未改变体的氨基酸，记载为“能够文库化的氨基酸”的氨基酸表示该位点处的能够文库化的氨基酸。设计所选出的氨基酸组成成分所含的氨基酸之中的至少任一者出现于各个能够改变的酸位点处的文库。
[表10]
Figure BDA0002407382280001591
[表11]
Figure BDA0002407382280001592
合成包含这样设计的文库中所含的各序列的基因，将这些各种基因的集合体(文库)用作模板，通过可分别扩增VH和VL的引物来扩增基因文库。将扩增得到的合理设计人抗体重链可变区的基因文库和人抗体轻链可变区的基因文库导入具有来源于人IgG的CH1序列和来源于人IgG的轻链恒定区序列这两者的合适的噬粒载体。将该噬粒载体通过电穿孔法导入大肠杆菌，从而构建合理设计文库，其展示包含人抗体可变区-恒定区的Fab结构域、且可获得能够以腺苷或AMP、ADP、ATP为开关而与抗原结合的抗体。如此由多样的具有腺苷或AMP、ADP、ATP结合活性的H链和L链构成的合理设计文库被认为可用作包含人抗体的文库，其中，如图43所示，腺苷或AMP、ADP、ATP夹在抗体与抗原之间，且可以效率良好地获得针对任意抗原的AMP/ADP/ATP/腺苷开关抗体。另外，如上所述SMB0002不仅与腺苷和AMP结合，还与ADP、ATP结合，因而预测对于和AMP、ADP、ATP及腺苷的结构类似的cAMP和ATP-gamma-S也具有结合活性。因此，认为本文库可用于获得对任意靶抗原的结合活性根据ATP、ADP、AMP、cAMP、腺苷、或ATP-gamma-S之中的任一者以上的低分子的有无而变化的开关抗体。
〔实施例5〕利用基于开关分子的淘选的AMP/ADP/ATP/腺苷开关抗体获得用的文库设计
实施例4中记载了通过全面改变进行文库化位点的设计，构建以显示腺苷或AMP、ADP、ATP结合能力的抗体为模板的文库的方法。作为文库制作方法，作为不同方法的利用淘选开关分子的方法也是有用的。
(5-1)腺苷结合抗体SMB0002的X射线晶体结构分析
在实施例4-2中，分析腺苷结合抗体SMB0002与腺苷的复合体的晶体结构。根据晶体结构分析的结果，推定出该抗体识别腺苷(和AMP)的识别模式以及预想不深度参与腺苷(和AMP)结合的抗体可变区的氨基酸残基。
SMB0002是来源于兔的抗体，因此在制作人抗体文库时，通过本领域技术人员公知的方法实施序列的人源化(与前述相同)。
设计文库时，满足以下条件中的至少一个的位点被选定作为能够文库化的位点。
条件1)不深度参与对腺苷或AMP、ADP、ATP的结合的位点、或即使参与结合也不会使对腺苷或AMP、ADP、ATP的结合大幅降低(不使结合为零)的天然序列以外的氨基酸所存在的位点；
条件2)作为抗体谱具有某种程度氨基酸出现频率的多样性的位点；
条件3)对于经典结构的形成不重要的位点。
首先，设计下述文库，其中，重链中满足上述条件且人源化SMB0002的序列所含的位点之中，关于CDR1,CDR2,CDR3的位点，对于未深度参与对腺苷或AMP、ADP、ATP的结合的位点的氨基酸，将出现仅限于某种恒定碱基。例如可举出NNK、TRIM Library等(Gonzalez-Munoz A et al.MAbs 2012,Lee CV et al.J Mol Biol.2004,Knappik A.et al.J MolBiol.2000,Tiller T et al.MAbs 2013)。将所设计的基因序列的集合体进行基因合成(重链可变区文库)，与人源化SMB0002的轻链可变区序列(亲本序列、SEQ ID NO:86)组合，导入具有来源于人IgG的CH1序列和来源于人IgG的轻链恒定区序列的适合的噬粒载体。将该噬粒载体通过电穿孔法导入大肠杆菌，从而构建能够以腺苷、AMP、ADP、ATP中的任一者为开关而与抗原结合的人抗体重链可变区噬菌体展示文库。
接着，设计下述文库，其中，轻链中满足上述条件且人源化SMB0002的序列所含的位点之中，关于CDR1,CDR2,CDR3的位点，对于未深度参与对腺苷或AMP、ADP、ATP的结合的位点的氨基酸，将出现仅限于某种恒定碱基。例如可举出NNK、TRIM Library等。将所设计的基因序列的集合体进行基因合成(轻链可变区文库)，与人源化SMB0002的重链可变区序列(亲本序列、SEQ ID NO:85)组合，导入具有来源于人IgG的CH1序列和来源于人IgG的轻链恒定区序列的适合的噬粒载体。将该噬粒载体通过电穿孔法导入大肠杆菌，从而构建能够以腺苷、AMP、ADP、ATP中的任一者为开关而与抗原结合的人抗体轻链可变区噬菌体展示文库。
为了由所构建的重链、轻链可变区各自的噬菌体展示文库获得与ATP、ADP、AMP或腺苷特异性结合的抗体群体，实施相对于生物素化ATP、生物素化ADP、生物素化AMP或生物素化腺苷的淘选。
生物素化腺苷通过实施例2-2-11中记载的方法制备。ATP-PEG-生物素可以购入JenaBioscience社、目录编号NU-926-BI0使用。AMP、ADP与ATP相同地是在腺苷的5'位羟基添加有磷酸基的结构，因而理想的是与生物素化ATP相同地，从磷酸基结合适合的接头(PEG接头等)，并在其末端添加生物素。
由保持所构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生噬菌体。在进行噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，在该噬菌体文库液中以终浓度为4％的方式添加BSA。使用固定于磁珠的抗原实施淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeadsNeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads M-280Streptavidin)。
在淘选中对能够结合腺苷、AMP、ADP或ATP的噬菌体进行回收。具体地，通过在所制备的噬菌体文库液中加入生物素标记抗原，使噬菌体文库在室温与腺苷、AMP、ADP或ATP接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用1mL的TBST和TBS清洗。然后将添加了含有终浓度1mg/mL的胰蛋白酶的TBS的珠在室温悬浮15分钟后，由立即使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。通过胰蛋白酶的添加，将不展示Fab的噬菌体的pIII蛋白质(来源于辅助噬菌体的pIII蛋白质)切断，使得不展示Fab的噬菌体对大肠杆菌的感染能力丧失。将用胰蛋白酶溶液洗脱的噬菌体添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL的大肠杆菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的培养板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此回收噬菌体文库液。实施多次相同的淘选，获得与腺苷、AMP、ADP或ATP结合的噬菌体群体。
相对于由各重链、轻链可变区噬菌体展示文库获得的抗原(腺苷、AMP、ADP或ATP)的结合噬菌体是具有抗原结合能力的群体，因而通过这两者的组合制作的Fab展示噬菌体文库中预计大量含有维持了开关低分子结合的克隆，因此认为能够制作更有效率地获得开关抗体的文库。
将感染于重链、轻链各自的噬菌体文库的大肠杆菌通过本领域技术人员公知的方法提取基因。将这样获得的各种基因的集合体(文库)用作模板，通过可分别扩增VH和VL的引物扩增基因文库。将扩增得到的人抗体重链可变区的基因文库和人抗体轻链可变区的基因文库导入具有来源于人IgG的CH1序列和来源于人IgG的轻链恒定区序列这两者的合适的噬粒载体。将该噬粒载体通过电穿孔法导入大肠杆菌，从而构建设计文库，其展示包含人抗体可变区-恒定区的Fab结构域、且可获得能够以腺苷或AMP、ADP、ATP为开关而与抗原结合的抗体。如此由多样的具有腺苷或AMP、ADP、ATP结合活性的H链和L链构成的设计文库被认为可用作包含人抗体的文库，其中，如图43所示，腺苷或AMP、ADP、ATP夹在抗体与抗原之间，且可以效率良好地获得针对任意抗原的AMP/ADP/ATP/腺苷开关抗体。另外，如上所述SMB0002不仅与腺苷和AMP结合，还与ADP、ATP结合，因而预测对于和ATP、AMP、ADP及腺苷的结构类似的cAMP和ATP-gamma-S也具有结合活性。因此，认为本文库可用于获得对任意靶抗原的结合活性根据ATP、ADP、AMP、cAMP、腺苷或ATP-gamma-S之中的任一者以上的低分子的有无而变化的开关抗体。
〔实施例6〕从使用噬菌体展示技术的人抗体文库获得在低分子存在下与人IL-6受体(hIL-6R)结合的抗体
(6-1)通过珠淘选从天然人抗体文库获得在低分子存在下与hIL-6R结合的抗体由后述参考实施例1中构建的天然人抗体噬菌体展示文库，筛选在低分子存在下显示人IL-6受体(hIL-6R)结合活性的抗体。即，收集展示抗体的噬菌体，该抗体在低分子存在下对被珠捕获的hIL-6R显示结合活性。从在低分子非存在的条件下从珠洗脱出的噬菌体洗脱液回收噬菌体。本获得方法中，使用经生物素标记的hIL-6R作为抗原。
由保持有构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生的噬菌体通过通常的方法纯化。然后得到经TBS透析处理的噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中以终浓度达到4％的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads M-280Streptavidin)。
为了有效率地获得低分子(该低分子能够在癌组织中发挥开关功能)依赖性的低分子开关抗体，实施了对下述各种低分子(腺苷(adenosine)、三磷酸腺苷(adenosine 5'-triphosphate；ATP)、肌苷(inosine)、犬尿氨酸(犬尿氨酸)、前列腺素E2(prostaglandinE2；PGE2)、琥珀酸(succinic acid)、乳酸(lactic acid))的混合液(以下，表述为SC(smallmolecule cocktail，小分子混合液))的存在下与抗原结合、但在SC非存在下与抗原不结合的抗体进行浓缩的淘选。
具体地，对于制备的噬菌体文库液，使250pmol的生物素标记抗原、以及包含各终浓度为1mM的三磷酸腺苷钠盐(ATP-Na)、腺苷(Adenosine)、肌苷(Inosine)、琥珀酸(Succinic acid)和乳酸(Lactic acid)、终浓度为1μM的前列腺素E2(PGE2)、以及终浓度为100μM的犬尿氨酸(犬尿氨酸)且通过NaOH将其pH调整为7.4的SC与该噬菌体文库液在室温接触60分钟。接着，在噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用SC/TBS(含有SC的TBS)清洗1次。然后，加入有1mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL的珠在室温下悬浮15分钟后，由立即使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
在第1次淘选中，进行能够在低分子存在下结合的噬菌体的回收，在第2次以后的淘选中，进行仅在SC存在下能够与抗原结合的噬菌体的浓缩。具体地，在制备的噬菌体文库液中加入40pmol的生物素标记抗原和SC、NaOH，由此使噬菌体文库在室温与抗原和低分子接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用1mL的SC/TBST和SC/TBS清洗。然后将加入有0.5mL的TBS的珠在室温悬浮后，立即由使用磁力架分离的珠回收噬菌体溶液。再次重复该操作后，将分2次洗脱出的噬菌体液混合。在回收的噬菌体溶液中加入100mg/mL的胰蛋白酶5μL，由此将不展示Fab的噬菌体的pIII蛋白(来源于辅助噬菌体的pIII蛋白)切断，使得不展示Fab的噬菌体对大肠杆菌的感染能力丧失。将从经胰蛋白酶处理的噬菌体溶液中回收的噬菌体添加至达到对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此回收噬菌体文库液。将获得在SC存在下具有抗原结合活性的抗体的淘选重复进行3次。
(6-2)通过噬菌体ELISA评价低分子存在下的结合活性由(6-1)中所得的大肠杆菌的单菌落，按照常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)回收含有噬菌体的培养上清。通过参考实施例(1-3)中记载的方法纯化的纯化噬菌体按照下述步骤供ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记hIL-6R的100μLTBS包被一晩。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去未与培养板结合的生物素标记hIL-6R，然后将该孔用250μL的2％脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2％脱脂奶粉-TBS，然后，将各孔中加入了所制备纯化噬菌体的该培养板在室温静置1小时，由此使噬菌体展示抗体与各孔中存在的生物素标记hIL-6R在SC非存在/存在下结合。在经TBST或SC/TBST清洗的各孔中，加入用TBS或SC/TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)，将培养板孵育1小时。用TBST或SC/TBST清洗后，向各孔添加TMB single溶液(ZYMED)，各孔中溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450nm的吸光度对该显色进行测定。
使用分离的960个克隆进行噬菌体ELISA，由此得到在低分子混合物存在下对作为抗原的hIL-6R具有结合活性的克隆6RNMSC1-2_F02和6RNMSC1-3_G02。
(6-3)与hIL-6R结合的抗体的表达和纯化由(6-2)中记载的噬菌体ELISA所示的、判定为在SC存在下具有生物素标记hIL-6R结合活性的克隆6RNMSC1-2_F02和6RNMSC1-3_G02，使用特异性引物(SEQ ID NO:78和80)进行扩增，对所得基因的碱基序列进行分析(6RNMSC1-2_F02：重链的序列由SEQ ID NO:32所示，轻链的序列由SEQ ID NO:33所示；6RNMSC1-3_G02：重链的序列由SEQ ID NO:34所示，轻链的序列由SEQ ID NO:35所示)。将编码6RNMSC1-2_F02、6RNMSC1-3_G02和作为阴性对照的抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体GC413(重链为SEQ ID NO:36、轻链为SEQ ID NO:37)的可变区的基因插入人IgG1/Kappa的动物表达用质粒。表达的抗体通过后述参考实施例1中记载的方法进行纯化。
(6-4)获得的抗体与hIL-6R结合所需的低分子的鉴定
获得的6RNMSC1-2_F02和6RNMSC1-3_G02以及GC413的3种抗体在表12所示的9个条件下供ELISA。另外，使用表13所示的缓冲液以表12所示的浓度适宜制备各低分子。使用经生物素标记的hIL-6R作为抗原。
[表12]
Figure BDA0002407382280001651
[表13]
清洗缓冲液 10mM ACES，150mM NaCl，0.05％Tween20，pH7.4
封闭缓冲液 10mM ACES，150mM NaCl，2％脱脂奶粉，pH7.4
样品缓冲液 10mM ACES，150mM NaCl，低分子(Small molecule)，pH7.4
首先，将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记hIL-6R的100μL的PBS在室温包被1小时以上。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去未与培养板结合的生物素标记hIL-6R，然后将该孔用封闭缓冲液(2％脱脂奶粉/TBS)250μL封闭1小时以上。在除去了封闭缓冲液的各孔中，加入在以表12的终浓度含有低分子的样品缓冲液中制备为2.5μg/mL的纯化IgG各100μL，将该培养板在室温静置1小时，由此使各IgG与各孔中存在的生物素标记hIL-6R结合。使用以表12的终浓度含有低分子的清洗缓冲液进行清洗后，将经加入有相同低分子的样品缓冲液稀释的HRP结合抗人IgG抗体(BIOSOURCE)添加至各孔中，将培养板孵育1小时。用含有各低分子的清洗缓冲液清洗后，向各孔添加TMB single溶液(ZYMED)，各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450nm的吸光度对该显色进行测定。另外，作为缓冲液，使用包含表13中记载的组成的缓冲液。
测定结果示于图16和图17。使用6RNMSC1-2_F02和6RNMSC1-3_G02的情形中，得到下述结果：与条件8(全部低分子cocktail溶液)中的吸光度相比，条件9(无低分子)中的吸光度显著地低。由该结果确认到，6RNMSC1-2_F02和6RNMSC1-3_G02具有与抗原的结合根据低分子的有无而变化的性质。另外，使用6RNMSC1-2_F02的情形中，在条件7(犬尿氨酸100uM)中表现出与条件8相同的吸光度，在其他条件下则吸光度显著地低，由该结果表明，6RNMSC1-2_F02是在犬尿氨酸存在下与作为抗原的hIL-6R结合的抗体(图16)。另外，使用6RNMSC1-3_G02的情形中，在条件1(ATP-Na 1mM)中表现出与条件8相同的吸光度，在其它条件下则吸光度显著地低，由该结果表明，6RNMSC1-3_G02是在ATP存在下与作为抗原的hIL-6R结合的抗体(图17)。表明通过使用这种方法，可以一次获得多个在不同的低分子的存在下与抗原的结合能力发生变化的抗体。
〔实施例7〕6RNMSC1-2_F02抗体的表征
(7-1)通过ELISA评价犬尿氨酸以外的氨基酸和氨基酸代谢物存在下的hIL-6R结 合活性
实施例6中获得的在低分子存在下与hIL-6R结合的抗体6RNMSC1-2_F02是在犬尿氨酸存在下与hIL-6R结合的抗体。对一系列的色氨酸代谢物等氨基酸代谢物是否适合作为本发明中所使用的癌组织特异性化合物、特别是癌细胞特异性代谢产物的非限定的一个方案进行了验证。
将实施例6中所示的在犬尿氨酸存在下具有抗原结合活性的抗体6RNMSC1-2_F02和作为阴性对照的GC413在表14所示的7个条件下供ELISA。另外利用表13所示的缓冲液以表14所示的浓度适宜制备各氨基酸及其代谢物。使用经生物素标记的hIL-6R作为抗原。
[表14]
条件 低分子(Small Molecule) 浓度
1 犬尿氨酸(Kynurenine) 1mM
2 色氨酸(Tryptophan) 1mM
3 苯丙氨酸(Phenylalanine) 1mM
4 邻氨基苯甲酸(Anthranilic acid) 1mM
5 3-羟基犬尿氨酸(3-Hydroxykynurenine) 1mM
6 犬尿酸(Kynurenic acid) 1mM
7 - -
首先，将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记抗原的100μL的PBS在室温包被1小时以上。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去未与培养板结合的抗原，然后将该孔用封闭缓冲液(2％脱脂奶粉/TBS)250μL封闭1小时以上。在除去了封闭缓冲液的各孔中，加入在以表14的终浓度含有低分子的样品缓冲液中制备为2.5μg/mL的纯化IgG各100μL，将该培养板在室温静置1小时，由此使各IgG与各孔中存在的抗原结合。在用以表14的终浓度含有氨基酸和氨基酸代谢物的清洗缓冲液进行清洗后，向各孔中添加经含有氨基酸和氨基酸代谢物的样品缓冲液稀释的HRP结合抗人IgG抗体(BIOSOURCE)，将培养板孵育1小时。用含有各氨基酸和氨基酸代谢物的清洗缓冲液清洗后，添加了TMB single溶液(ZYMED)的各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸来终止，然后通过450nm的吸光度对该显色进行测定。另外，作为缓冲液，使用了包含表13中记载的组成的缓冲液。
测定结果示于图18。使用6RNMSC1-2_F02的情形中，与条件1(犬尿氨酸溶液)中的吸光度相比，条件7(无低分子)中的吸光度显著地低。另外，相同地，条件5(3-羟基犬尿氨酸溶液)中的吸光度也表现出与条件1相同的高吸光度，由此表明，6RNMSC1-2_F02是不仅在犬尿氨酸存在下、而且在犬尿氨酸的代谢物存在下也与作为抗原的hIL-6R结合的抗体。此外，在其它条件则吸光度显著地低，由此表明，6RNMSC1-2_F02是即使在犬尿氨酸前体色氨酸的存在下，也不与作为抗原的hIL-6R结合的抗体。在癌症微环境中，代谢色氨酸而产生犬尿氨酸的酶即IDO的表达上升，因而认为在色氨酸存在下不与抗原结合、但在犬尿氨酸及其代谢物存在下与抗原结合的抗体作为仅在癌症微环境下与抗原结合的抗体是重要的。由此，认为通过使用同样的方法可以获得不仅在一种氨基酸代谢物的存在下、而且在结构不同的多种氨基酸代谢物存在下也与目标抗原结合的抗体。
如此，认为将被癌特异性的酶(本实施例中为IDO和其下游的代谢酶)所代谢而在癌局部产生的分子作为开关的抗体能够仅在癌局部选择性地与靶抗原结合。本实施例中，使用作为内源性分子的色氨酸的基于癌特异性代谢酶的代谢产物作为开关，但也可以使用通过由外部口服或静脉内给予等而给予的人工分子(非天然分子)或内源性分子的基于癌特异性代谢酶的代谢产物作为开关。例如，如实施例1中所述，在给予卡培他滨(xeloda)时，由于被癌特异性代谢酶等代谢为5-FU，因而癌局部的5-FU的浓度变高(Desmoulin F.etal.Drug Metab Dispos.2002)，所以认为通过以5-FU为开关的抗体，可以仅在癌局部选择性地与靶抗原结合。另外，除了代谢酶以外，认为还可以使用通过在癌特异性的低氧环境、酸性环境下而生成的分子作为开关。例如，TH-302(Duan JX,et al.J Med Chem.2008)在低氧条件下被代谢为Br-IPM，因而认为利用以Br-IPM为开关的抗体，可以仅在癌局部选择性地与靶抗原结合。
(7-2)通过表面等离子共振评价犬尿氨酸对人IL6受体结合的影响
使用Biacore T200(GE Healthcare)，分析6RNMSC1-2_F02与人IL-6受体(hIL-6R)的抗原抗体反应的相互作用。在用胺偶联法固定了适当量的protein A(Invitrogen)的传感器芯片CM5(GE Healthcare)上捕获目标抗体，使之与作为抗原的hIL-6R相互作用。流动缓冲液使用20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.4。与作为抗原的hIL-6R的相互作用在25℃下进行测定，hIL-6R的稀释使用了流动缓冲液，在流动缓冲液中加入了100μmol/L犬尿氨酸的缓冲液、以及用于比较对照而在流动缓冲液中加入了10mmol/L ATP的缓冲液。
以流速10μL/min注入hIL-6R稀释液和作为空白的流动缓冲液1分钟，使捕获于传感器芯片上的6RNMSC1-2_F02与hIL-6R相互作用。然后，以流速10μL/min流过1分钟的流动缓冲液，观察到hIL-6R从抗体解离后，以流速30μL/min注入30秒钟的10mmol/L Glycine-HCl、pH1.5，将传感器芯片再生。由测定得到的传感图算出作为动力学参数的结合速度常数ka(1/Ms)、和解离速度常数kd(1/s)，基于它们计算6RNMSC1-2_F02相对于hIL-6R的解离常数KD(M)。各参数的计算中使用了Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。
该测定中获得的在100μmol/L犬尿氨酸存在下、10mmol/L ATP存在下、或非存在下的6RNMSC1-2_F02与1μmol/L的hIL-6R的相互作用的传感图示于图19。如图19所示，6RNMSC1-2_F02在100μmol/L的犬尿氨酸存在下与hIL-6R结合，但在犬尿氨酸非存在下则未观察到与hIL-6R的结合。由此确认到，6RNMSC1-2_F02具有以犬尿氨酸作为开关而与hIL-6R结合的性质。此外，100μmol/L犬尿氨酸存在下的6RNMSC1-2_F02的解离常数KD为1.5μmol/L。
(7-3)对于抗体从hIL-6R解离的犬尿氨酸开关的效果
使用Biacore T200(GE Healthcare)，评价在犬尿氨酸存在下与hIL-6R结合了的6RNMSC1-2_F02在犬尿氨酸存在下是否犬尿氨酸浓度依赖性地解离。作为流动缓冲液，使用20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.4和20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.4、100μmol/L犬尿氨酸，在25℃下进行测定。将用含有100μmol/L的犬尿氨酸的20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.4进行了稀释的5μg/mL的6RNMSC1-2_F02作为分析物，使之与通过胺偶联固定了hIL-6R的传感器芯片CM5相互作用180秒钟，然后观察各流动缓冲液条件下的hIL-6R的解离的状况。为了比较各流动缓冲液条件下的解离的程度，将100μmol/L犬尿氨酸存在下的6RNMSC1-2_F02对hIL-6R的结合量设为100进行标准化(normalize)，对所得的值进行比较。示出进行了该标准化后的6RNMSC1-2_F02与hIL-6R的相互作用的状况的传感图示于图20。由图20的结果表明，6RNMSC1-2_F02具有在犬尿氨酸存在下与hIL-6R结合，然后在犬尿氨酸变得不存在时将hIL-6R快速解离的性质。即，确认到由犬尿氨酸实现的对抗体和hIL-6R的结合的控制是可逆的。
(7-4)评价犬尿氨酸浓度对hIL-6R结合造成的影响
接着，使用Biacore T200(GE Healthcare)，评价6RNMSC1-2_F02与hIL-6R的抗原抗体反应中的犬尿氨酸浓度的影响。作为流动缓冲液，使用20mmol/L ACES、150mmol/LNaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.4，6RNMSC1-2_F02与人IL-6R的抗原抗体反应在25℃下进行测定。在传感器芯片CM5上通过胺偶联固定hIL-6R，将用含有以各种浓度制备的犬尿氨酸的20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.4进行了稀释的1μg/mL的6RNMSC1-2_F02作为分析物，使之相互作用180秒钟，观察其结合量的变化。其结果示于图21。由该结果可知，作为开关的犬尿氨酸浓度越高，则6RNMSC1-2_F02越多结合hIL-6R。
另外，该评价体系中hIL-6R被固定于传感器芯片上，因而认为6RNMSC1-2_F02以二价结合。在这种6RNMSC1-2_F02以二价识别hIL-6R的评价体系中，也观察到犬尿氨酸浓度越高则6RNMSC1-2_F02的hIL-6R结合量越增加。由该结果可知，在二价的结合中6RNMSC1-2_F02也具有以犬尿氨酸为开关而与IL-6R结合的性质。
这些结果表明，6RNMSC1-2_F02是以犬尿氨酸为开关，在犬尿氨酸存在下与hIL-6R结合，在犬尿氨酸非存在下则从hIL-6R解离的抗体。另外，6RNMSC1-2_F02确认到可以进行在犬尿氨酸非存在下对hIL-6R不显示结合活性的完全的ON/OFF控制，确认到发挥开关功能。
(7-5)6RNMSC1-2 F02对犬尿氨酸的衍生物的结合能力评价
使用Biacore T200(GE Healthcare)，评价由文库获得的犬尿氨酸依赖性抗体6RNMSC1-2_F02与犬尿氨酸及其衍生物的结合。作为衍生物，评价了以下7种分子。犬尿氨酸的异构体D-犬尿氨酸、作为衍生物的3-羟基-DL-犬尿氨酸、4-(4-甲基苯基)-4-氧代丁酸、RO0447436-000-001、RO0635389-000-001、RO0438566-001-001、RO0635390-000-001。各化合物的化学结构如下所示。
[化19]
Figure BDA0002407382280001701
[化20]
Figure BDA0002407382280001702
[化21]
Figure BDA0002407382280001703
[化22]
Figure BDA0002407382280001704
[化23]
Figure BDA0002407382280001705
[化24]
Figure BDA0002407382280001711
[化25]
Figure BDA0002407382280001712
在传感器芯片CM4(GE Healthcare)上以胺偶联法固定适当量的protein A(Invitrogen)，在该芯片上捕获目标抗体，并使作为抗原的犬尿氨酸及衍生物相互作用。流动缓冲液使用50mmol/L TrisHCl、150mmol/L NaCl、0.02％(w/v)Tween20、5％DMSO、pH7.6。测定均在15℃下实施，抗原的稀释用流动缓冲液。
对于6RNMSC1-2_F02，将抗原稀释液和作为空白的流动缓冲液以流速30μL/min添加60秒钟，使各抗原与传感器芯片上捕获的抗体相互作用。然后，以流速30μL/min通入60秒钟流动缓冲液，观察抗原从抗体的解离。根据测定所得的传感图，计算作为动力学参数的结合速度常数ka(1/Ms)、和解离速度常数kd(1/s)。基于这些常数算出解离常数KD(M)。各参数的计算中使用了Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。
评价的结果，犬尿氨酸与6RNMSC1-2_F02相互作用的动力学参数确定为：ka＝709(1/s),kd＝0.17(1/s),KD＝0.239(mmol/L)。另外，评价的结果所得的传感图示于图22。另外，表示与衍生物的结合结果的传感图示于图23：3-羟基-DL-犬尿氨酸、图24：RO0635389-000-001、图25：RO0635390-000-001。传感图的表示使用了Scrubber2(Biologic software)和Microsoft Office Excel 2007。由该结果明确了6RNMSC1-2_F02不仅能够结合犬尿氨酸，而且还能够与3-羟基-DL-犬尿氨酸、和RO0635389-000-001、RO0635390-000-001等一部分犬尿氨酸衍生物结合。
(7-6)6RNMSC1-2 F02对非天然低分子的应答性评价
使用Octet(PRIMETECH)，评价由文库获得的犬尿氨酸开关抗体6RNMSC1-2_F02与hIL-6R的抗原抗体反应中的各种低分子的影响。作为低分子，评价了作为犬尿氨酸和衍生物的实施例(7-5)中所示的全部8种分子。作为测定缓冲液，使用TBS、pH7.4，在30℃进行测定。在链霉亲和素传感器芯片上固定生物素化hIL-6R，使抗体相互作用，观察其结合量的变化。抗体的稀释使用测定缓冲液和在测定缓冲液中分别添加了各低分子的任一者的缓冲液，调整各低分子的终浓度为100uM，抗体的终浓度为10μg/mL。
该测定中获得的100uM的各低分子存在下、或非存在下的6RNMSC1-2_F02对hIL-6R的结合性示于图26：犬尿氨酸、图27：3-羟基-DL-犬尿氨酸、图28：RO0635389-000-001、图29：RO0635390-000-001。如图26所示，6RNMSC1-2_F02在100uM犬尿氨酸存在下与hIL-6R结合，但在犬尿氨酸非存在下则未观察到对hIL-6R的结合。由此，通过Octet也确认到具有以犬尿氨酸为开关而与hIL-6R结合的性质。另外，如图27-29所示，对于作为犬尿氨酸以外的低分子的3-羟基-DL-犬尿氨酸和RO0635389-000-001、RO0635390-000-001等能够与6RNMSC1-2_F02结合的犬尿氨酸衍生物，也观察到低分子存在下的结合，但在这些低分子非存在下则未观察到hIL-6R结合。以上表明以犬尿氨酸和其衍生物(非天然化合物)作为开关发挥功能的hIL-6R抗体可以从文库获得。
在实施例7-3中，显示了将内源性分子用作开关，但根据本实施例，表明也可以将人工分子(非天然分子)用作开关。即，表明可以制作抗体，该抗体将通过由外部口服或静脉内给予等所给予的人工分子(非天然分子)由癌特异性代谢酶产生的非天然代谢产物用作开关。
〔实施例8〕利用犬尿氨酸开关抗hIL-6R抗体的基于全面改变的犬尿氨酸开关抗体获得用文库的设计已知在癌组织中，犬尿氨酸的浓度高。通过参考实施例2中构建的以与ATP结合的抗体为模板的合理设计文库，大量获得仅在ATP存在下显示抗原结合能力的抗体，由此认为通过同样地构建以对犬尿氨酸显示结合能力的抗体为模板的文库，能够获得仅在犬尿氨酸存在下显示抗原结合能力的抗体。
(8-1)以犬尿氨酸为开关的hIL-6R结合抗体6RNMSC1-2 F02的X射线晶体结构分析
以实施例7中由文库获得的犬尿氨酸为开关的hIL-6R结合抗体6RNMSC1-2_F02与犬尿氨酸的复合体的立体结构通过X射线晶体结构分析来阐明。
(8-1-1)结晶化用6RNMSC1-2 F02全长抗体的制备
结晶化用6RNMSC1-2_F02全长抗体的制备和纯化通过本领域技术人员公知的方法进行。
(8-1-2)来自全长抗体的6RNMSC1-2 F02 Fab片段的制备
将所得的6RNMSC1-2_F02抗体通过分子量分级大小10000MWCO的超滤膜浓缩后，用100mM Tris缓冲液pH 8.0稀释至2mg/ml，制得样品，向其中加入相对于全长抗体以质量比计为四百分之一的量的蛋白内切酶Lys-C Sequencing Grade(Roche Applied Science)，在35℃静置45分钟。然后，加入溶解蛋白酶抑制剂Cocktail(不含EDTA,mini片剂)(RocheApplied Science)1片得到的20ml的25mM乙酸钠缓冲液pH5.0，由此终止反应。接着，将该样品添加至经25mM乙酸钠缓冲液pH5.0平衡化了的1ml大小的阳离子交换柱HiTrap SP HP(GEHealthcare)的下游串联有1ml大小的ProteinA载体柱HiTrap MabSelect Sure(GEHealthcare)的柱上，在相同缓冲液中线性提升NaCl浓度进行洗脱，由此得到6RNMSC1-2_F02抗体的Fab片段的纯化级分。将其添加至经25mM HEPES缓冲液pH 7.5、100mM NaCl平衡化的凝胶过滤柱Superdex 20016/60prep grade(GE Healthcare)，通过相同缓冲液由柱洗脱，得到结晶化用6RNMSC1-2_F02的Fab片段。另外，全部柱操作均在低温下实施。
(8-1-3)6RNMSC1-2 F02 Fab片段与犬尿氨酸复合体的结晶的制作
将用上述方法纯化的结晶化用6RNMSC1-2_F02的Fab片段的样品通过5000MWCO的超滤膜浓缩至A280＝24.1。然后，将溶解于100％DMSO的50mM犬尿氨酸以终浓度2mM的方式添加，通过坐滴蒸气扩散法进行结晶化。结晶化使用Hydra II Plus One(MATRIX)，对于0.2M硫酸锂一水合物、30.0％w/v PEG 3350、0.1M Tris pH 8.5的储液，按照储液：结晶化样品＝0.2μl：0.2μl进行混合制作结晶化液滴，在20℃静置，结果成功得到细柱状的结晶。进而将所得的结晶之一在0.18M硫酸锂一水合物、27.3％PEG3350、0.09M HEPES pH7.5、18.2％乙二醇、4.5mM犬尿氨酸、9％DMSO的溶液中在室温浸渍30分钟，得到6RNMSC1-2_F02Fab片段与犬尿氨酸复合体的结晶。
(8-1-4)来自6RNMSC1-2 F02 Fab片段与犬尿氨酸复合体的结晶的X射线衍射数据 的测定
将上述方法所得的6RNMSC1-2_F02 Fab片段与犬尿氨酸复合体的结晶的一个单晶用带有微小尼龙环的针与溶液一并掬起，在液氮中冷冻，用高能加速器研究机构的放射光设施Photon Factory的BL-5A进行X射线衍射数据的测定。另外，测定中一直置于-178℃的氮气流中以维持冷冻状态，通过设置有光束线的CCD探测器Quantum 315r(ADSC)，一边使结晶每次旋转0.5°一边采集总计360幅X射线衍射图像。基于所得衍射图像的晶格常数的确定、衍射斑的指数化、以及衍射数据的处理中使用程序Xia2(J.Appl.Cryst.(2010)43,186-190)、XDS Package(Acta Cryst.(2010)D66,125-132)和Scala(Acta Cryst.(2006)D62,72-82)，最终成功得到分辨率达
Figure BDA0002407382280001741
的衍射强度数据。本结晶属于空间群P1，晶格常数
Figure BDA0002407382280001742
Figure BDA0002407382280001743
α＝87.81°、β＝82.88°、γ＝65.54°。
(8-1-5)6RNMSC1-2 F02 Fab片段与犬尿氨酸复合体的X射线晶体结构分析
为了确定6RNMSC1-2_F02 Fab片段与犬尿氨酸复合体的结构，使用程序Phaser(J.Appl.Cryst.(2007)40,658-674)实施分子替换法。根据所得晶格的大小与6RNMSC1-2_F02 Fab片段的分子量，预计非对称单元中的复合体的数目为2个。使用DiscoveryStudio3.5(Accelrys)，制作该抗体的同源模型，将该Fab的模型分为可变区和恒定区部分，将各自的结构坐标用作搜索用模型，根据旋转函数和并进函数确定该结晶的晶格内的取向和位置。进而对于所得的初期结构模型，进行使可变区和恒定区独立运动的的刚体精密化，结果相对于
Figure BDA0002407382280001744
的衍射强度数据的结晶学可靠性因子R值为40.57％、Free R值为38.91％。进而，基于使用程序REFMAC5(Acta Cryst.(2011)D67,355-367)的结构精密化、以及实验确定的结构因子Fo和根据模型计算的结构因子Fc和根据模型计算的相位而算出2Fo-Fc、Fo-Fc，参照以它们为系数的电子密度图的同时，使用程序Coot(Acta Cryst.(2010)D66,486-501)实施该结构模型的修正，重复上述操作，由此进行结构模型的精密化。最终，使用分辨率
Figure BDA0002407382280001745
的34135个衍射强度数据，含7019个非氢原子的结构模型的结晶学可靠性因子R值为20.4％、Free R值为26.56％。
(8-1-6)6RNMSC1-2 F02与犬尿氨酸的相互作用位点的鉴定
最终，以实施例7中由文库获得的犬尿氨酸为开关的hIL-6R结合抗体6RNMSC1-2-F02的Fab片段与犬尿氨酸的复合体的晶体结构以分辨率
Figure BDA0002407382280001746
来确定。
在本结晶的非对称单元中，该抗体的Fab片段存在2个分子，确认到犬尿氨酸仅与其中之一结合。可知犬尿氨酸主要被该抗体的H链CDR3所识别，但此时在稍微偏离通常用于与抗原结合的部分的位置与该抗体结合。
如图30所示，犬尿氨酸分子通过该抗体的H链P97、R100c、D101、L链H49、F55的各侧链、以及H链R94、D95、R100c、G100d、A100e的各主链而被识别。另外，犬尿氨酸的氨基酸骨架中的氨基在中性下具有正电荷，在H链D95、R94、A100e的各主链的羰基氧以及D101侧链的羧基之间观察到多个氢键以及静电相互作用。进而，具有负电荷的犬尿氨酸的羧基与H链G100d、R100c的各主链的酰胺NH基形成多个氢键。这些牢固的氢键以及静电相互作用的网络被认为在基于该抗体的犬尿氨酸的识别中发挥重要的功能。进而，H链R100c的侧链与犬尿氨酸的苯环部分形成阳离子-π相互作用，此外犬尿氨酸的苯环部分被L链H49、F55以及H链D101所包围，并与这些残基形成范德华相互作用，由此有助于与犬尿氨酸结合识别。另外，L链H49的侧链与犬尿氨酸的芳香环上的NH2基之间虽然弱但也确认到形成了氢键。
根据以上结果，不仅明确了基于该抗体的犬尿氨酸的识别模式，而且鉴定了深度参与犬尿氨酸结合的抗体可变区的氨基酸残基。作为其侧链深度参与犬尿氨酸结合的氨基酸残基，可举出H链：P97、R100c、D101(Kabat编号)，L链：H49、F55(Kabat编号)。另外，作为在主链部分深度参与犬尿氨酸结合的残基，可举出H链R94、D95、R100c、G100d、A100e。进而，P97、P100b、G100d等残基，由于其结构性特征，被认为可通过将H链CDR3的结构维持于与犬尿氨酸结合所需的构型，从而间接地深度有助于犬尿氨酸结合。
(8-2)6RNMSC1-2 F02的改变体对犬尿氨酸的结合能力评价
(8-2-1)6RNMSC1-2 F02的重链改变体对犬尿氨酸的结合能力评价
如上所述，通过晶体结构分析，作为有可能在与犬尿氨酸结合中发挥重要作用的残基，发现了重链的P97、P100b、R100c、G100d、D101等。因此，对于它们之中的数个残基，实际制作改变体，评价与犬尿氨酸的结合能力。制作的改变体如下所述。P97A、P97G、P100bG、R100cA、G100dA、G100dV、D101A(表15)。
[表15]
克隆名称 重链序列编号 轻链序列编号
6RNMSC1-2_F02 P97A SEQ ID NO：38 SEQ ID NO：33
6RNMSC1-2_F02 P97G SEQ ID NO：39 SEQ ID NO：33
6RNMSC1-2_F02 P100bG SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：33
6RNMSC1-2_F02 R100cA SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：33
6RNMSC1-2_F02 G100dA SEQ ID NO：42 SEQ ID NO：33
6RNMSC1-2_F02 G100dV SEQ ID NO：43 SEQ ID NO：33
6RNMSC1-2_F02 D101A SEQ ID NO：44 SEQ ID NO：33
通过后述参考实施例1所示的方法表达、纯化的6RNMSC1-2_F02的各种改变体以与实施例(7-5)所示的Biacore相同的方法评价对犬尿氨酸的结合。其结果是，6RNMSC1-2_F02再度确认到与犬尿氨酸结合，但其它所有的改变体对犬尿氨酸的结合能力均减弱或大幅减弱。即明确了根据晶体结构推导的对于犬尿氨酸结合重要的残基确实参与了结合，该结果证实了晶体结构分析结果。
(8-2-2)6RNMSC1-2 F02的H49Y改变体对犬尿氨酸的结合能力评价根据晶体结构分析，认为与犬尿氨酸进行重要相互作用的轻链氨基酸残基仅为H49(Kabat编号)。另外根据序列分析的结果，推测6RNMSC1-2_F02的框架来源于VLkappa-2种系。Kabat编号49位氨基酸在VLkappa-2种系中基本上均为Tyr，保守性非常高。因此，制作将His49替换为Tyr的改变体，验证His对于与犬尿氨酸的相互作用的贡献度。
通过后述参考实施例1所示的方法表达、纯化的6RNMSC1-2_F02的His49Tyr改变体(重链SEQ ID NO:32、轻链SEQ ID NO:45)以与实施例(7-5)所示的Biacore相同的方法评价对犬尿氨酸的结合。其结果明确了H49Y维持了与犬尿氨酸的结合。另外，动力学参数确定为：ka＝2543(1/s),kd＝0.24(1/s),KD＝0.095(mmol/L)。显示评价结果的传感图示于图31。
(8-2-3)6RNMSC1-2 F02的种系框架序列中的改变
根据序列分析结果，推测6RNMSC1-2_F02的VH框架来源于VH1-69种系。另外，推测6RNMSC1-2_F02的VL框架来源于Vκ2-28种系。因此，以提高抗体的稳定性为目的，为了使6RNMSC1-2_F02的框架序列恢复至种系框架序列，将VH_Met108Leu,VL_Thr07Ser、VL_Ser11Leu、VL_Leu15Pro、VL_Gln17Glu、VL_Leu36Tyr、VL_Gln37Leu、VL_Arg39Lys、VL_Pro43Ser、VL_Arg45Gln、VL_His49Tyr、VL_Ala67Ser、VL_Asn70Asp(数字表示Kabat编号)的改变导入6RNMSC1-2_F02的框架序列，命名为F02h011/F02l003(重链可变区序列：SEQ IDNO:95、轻链可变区序列：SEQ ID NO:96)。通过参考实施例1-1所示的方法表达和纯化的F02h011/F02l003的Tm通过DSC进行测定。利用DSC的测定通过本领域技术人员公知方法实施。添加了这些改变的6RNMSC1-2_F02的改变体的Tm从82.9℃提高到85.2℃，确认到其结构的稳定化。另外，F02h011/F02l003与犬尿氨酸的结合是在实施例(7-5)所示的使用Biacore的方法中将抗原稀释液和作为空白的流动缓冲液的添加时间改变为30秒钟的条件下测定，确认到维持了犬尿氨酸结合。犬尿氨酸结合的动力学参数确定为：ka＝3664(1/s),kd＝0.40(1/s),KD＝0.11(mmol/L)，示出评价结果的传感图示于图32。作为抗体文库，由于有时也优选使用稳定性高的框架，因而F02h011/F02l003可用作后述实施例(8-2-3)和实施例(9-2)的框架序列。框架序列示于表16。
[表16]
框架 序列编号 序列
重链框架1 87 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS
重链框架2 88 WVRQAPGQGLEWMG
重链框架3 89 RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
重链框架4 90 WGQGTLVTVSS
轻链框架1 91 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC
轻链框架2 92 WYLQKPGQSPQLLIY
轻链框架3 93 GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC
轻链框架4 94 WYLQKPGQSPQLLIY
(8-2-4)探索增强F02h011/F021003对犬尿氨酸的结合的改变
根据实施例(8-1)、(8-2-1)的结果，预测被推定参与6RNMSC1-2_F02与犬尿氨酸的结合的残基。进而，除了这些残基之外，还进行了下述残基的探索，该残基有可能通过改变而预见对犬尿氨酸的结合增强。
具体地，根据该抗体的Fab片段与犬尿氨酸的复合体的晶体结构，如图34所示，挑选存在于距离犬尿氨酸4.2A以内的氨基酸残基。结果新发现了重链Tyr32、Arg100a(kabat编号)，轻链Leu46(kabat编号)。另外，重链CDR3是最高度有助于犬尿氨酸结合的CDR环，认为通过改变该环上的残基，有可能间接地对犬尿氨酸结合造成影响，因此在尽可能多的残基位置进行氨基酸残基的改变。然而，将与轻链Arg96形成牢固的氢键并规定环结构的重链Asp95、与轻链Glu50形成氢键并规定环结构的重链Arg100a、侧链朝向犬尿氨酸的相反方向且即使导入改变也不能预见与犬尿氨酸形成相互作用的重链Pro100b从改变残基位点的候补中排除。另外，轻链Ser56如图35所示距犬尿氨酸的距离远，但由于侧链以朝向犬尿氨酸的方向存在，且通过改变为较Ser更大长度的氨基酸残基则有可能形成与犬尿氨酸的相互作用，因而被挑选作为改变残基位点。另外，后述实施例(9-2)的结果表明通过将重链Gly50和轻链Asp28替换为Ala，从而犬尿氨酸结合活性增强。这些残基位点并非是能够直接与犬尿氨酸相互作用的位置(图36)，因而推测是将与犬尿氨酸结合时的Fab整体的构型稳定化，从而起间接性作用。进而，对于这些残基位点，认为通过对Ala以外的改变，有可能进一步增强犬尿氨酸结合，因而该残基位置也被挑选作为全面改变位点。通过综合评价将这些残基替换为各氨基酸得到的改变体，验证能否鉴定期待增强犬尿氨酸结合能力的效果的改变。
对于实施例(8-2-3)中制作的F02h011/F021003，如此被改变的位点(表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点)以及该位点的改变前的氨基酸(表中，记载为“天然序列”的氨基酸)和改变后的氨基酸(表中，记载为“改变氨基酸”的氨基酸)示于表17。
[表17]
Figure BDA0002407382280001781
通过后述参考实施例1所示的方法表达和纯化的各改变体对犬尿氨酸的结合是在实施例(7-5)中所示的使用Biacore的方法中将抗原稀释液和作为空白的流动缓冲液的添加时间改变为30秒钟的条件下进行测定。另外，对于一部分改变体，在将固定Protein A的传感器芯片的种类改变为传感器芯片Series S CM3(GE Healthcare)的条件下进行测定。在犬尿氨酸的解离快速而无法确定解离速度常数时，通过基于与各抗原相互作用期间(结合相)的结合应答的大小的平衡值分析来算出解离常数KD(M)。此时，参数的计算中也使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。测定的结果，各改变体与犬尿氨酸的亲和力以KD值的形式算出。各改变体与F02h011/F02l003对犬尿氨酸的KD值的比较结果示于表18。
[表18]
Figure BDA0002407382280001782
在期待增强犬尿氨酸结合的改变中，添加了Lch_Ser56Tyr的改变的序列被命名为F02h011/F02l098(重链可变区序列：SEQ ID NO:95，轻链可变区序列：SEQ ID NO:97)，用作文库的模板序列。F02h011/F02l098与犬尿氨酸的结合是在实施例(7-5)所示的使用Biacore的方法中将抗原稀释液和作为空白的流动缓冲液的添加时间改变为30秒钟，将固定Protein A的传感器芯片的种类改变为传感器芯片Series S CM3(GE Healthcare)的条件下进行测定。相对于F02h011/F02l098的犬尿氨酸结合的动力学参数确定为：ka＝3686(1/s),kd＝0.26(1/s),KD＝0.072(mmol/L)。示出评价结果的传感图示于图33。
(8-3)用于基于X射线晶体结构分析结果的文库设计的全面改变体评价实施例(8-1)中分析了6RNMSC1-2_F02与犬尿氨酸的复合体的晶体结构。根据晶体结构分析的结果，鉴定出该抗体识别犬尿氨酸的识别模式、以及预想不高度参与结合犬尿氨酸的抗体可变区的氨基酸残基。认为通过全面评价将以下所示的残基替换为各氨基酸得到的改变体，可以判定能够文库化的位点和能够文库化的氨基酸。即，认为通过判定未高度参与对犬尿氨酸的结合的位点、或即使参与结合也不会使对犬尿氨酸的结合大幅降低(不会使结合为零)的天然序列以外的氨基酸所存在的位点和氨基酸，可以判定能够文库化的位点和能够文库化的氨基酸。对于实施例(8-2-4)中制作的添加了增强犬尿氨酸结合的改变的F02h011/F02l098，制作多个对这些残基导入改变而得的改变体。
重链的位点中被改变的位点(表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点)以及该位点的改变前的氨基酸(表中记载为“天然序列”的氨基酸)和改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”的氨基酸)示于表19。
[表19]
Figure BDA0002407382280001801
轻链的位点中被改变的位点(表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点)以及该位点的改变前的氨基酸(表中，记载为“天然序列”的氨基酸)和改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”的氨基酸)示于表20。
[表20]
Figure BDA0002407382280001811
通过后述参考实施例1所示的方法表达和纯化的各改变体对犬尿氨酸的结合是在实施例(7-5)中所示的使用Biacore的方法中将抗原稀释液和作为空白的流动缓冲液的添加时间改变为30秒钟的条件下进行测定。另外，对于一部分改变体，在将固定Protein A的传感器芯片的种类改变为传感器芯片Series S CM3(GE Healthcare)的条件下进行测定。在犬尿氨酸的解离快速而无法确定解离速度常数时，通过基于与各抗原相互作用期间(结合相)的结合应答的大小的平衡值分析来算出解离常数KD(M)。此时，参数的计算中也使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。测定的结果，各改变体与犬尿氨酸的亲和力以KD值的形式算出。重链的各改变体与作为亲本序列的F02h011/F02l098对犬尿氨酸的KD值的比较结果示于表21。轻链的各改变体与作为亲本序列的F02h011/F02l098对犬尿氨酸的KD值的比较结果示于表22。
[表21]
Figure BDA0002407382280001821
[表22]
Figure BDA0002407382280001831
(8-4)基于全面改变体评价结果的文库设计
设计文库时，根据实施例(8-2-4)、(8-3)和后述实施例(9-2)中所得的信息，选定满足以下条件中的至少一者的位点作为能够文库化的位点。
条件1)不高度参与对犬尿氨酸的结合的位点、或即使参与结合也不会使对犬尿氨酸的结合大幅降低的天然序列以外的氨基酸所存在的位点；
条件2)作为抗体谱具有某种程度氨基酸出现频率的多样性的位点；
条件3)对于经典结构的形成不重要的位点。
根据实施例(8-2-4)、(8-3)和后述实施例(9-2)中实施的评价结果，将各评价中显示高于亲本序列对犬尿氨酸的KD值的20％的结合的改变体存在至少1个以上的位置判定为满足上述条件的能够改变的位点。在该位点处被替换的氨基酸中，各评价中显示高于亲本序列对犬尿氨酸的KD值的20％的结合的氨基酸被判定为能够文库化的氨基酸(能够在文库中出现的柔性残基)。通过设计在实施例(8-2-4)中制作的添加了增强犬尿氨酸结合的改变的F02h011/F02l098中，在被判定的各个能够改变的位点出现包含通过改变体分析选出的能够文库化的氨基酸(能够在文库中出现的柔性残基)和未改变体的氨基酸(即F02h011/F02l098的天然序列中所含的氨基酸)的氨基酸组成成分中所含的氨基酸中的至少任一者以上的氨基酸的文库，构建用于获得犬尿氨酸开关抗体的文库。包含重链中的氨基酸组成成分的位点、以及该位点处的氨基酸组成成分示于表23。包含轻链中的氨基酸组成成分的位点、以及该位点处的氨基酸组成成分示于表24。表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点表示能够改变的位点，记载为“天然序列”的氨基酸表示该位点处的未改变体的氨基酸，记载为“能够文库化的氨基酸”的氨基酸表示该位点处的能够文库化的氨基酸。设计所选出的氨基酸组成成分所含的氨基酸之中的至少任一者出现于各个能够改变的酸位点处的文库。
[表23]
Figure BDA0002407382280001851
[表24]
Figure BDA0002407382280001861
合成包含这样设计的文库中所含的各序列的基因，将这些各种基因的集合体(文库)用作模板，通过可分别扩增VH和VL的引物来扩增基因文库。将扩增得到的合理设计人抗体重链可变区的基因文库和人抗体轻链可变区的基因文库导入具有来源于人IgG的CH1序列和来源于人IgG的轻链恒定区序列这两者的合适的噬粒载体。将该噬粒载体通过电穿孔法导入大肠杆菌，从而构建合理设计文库，其展示包含人抗体可变区-恒定区的Fab结构域、且可获得能够以犬尿氨酸为开关而与抗原结合的抗体。如此由多样的具有犬尿氨酸结合活性的H链和L链构成的合理设计文库被认为可用作包含人抗体的文库，其可效率良好地获得针对任意抗原的犬尿氨酸开关抗体。另外，如实施例(7-6)所示，6RNMSC1-2_F02不仅与犬尿氨酸结合，而且还与以犬尿氨酸代谢物即3―羟基犬尿氨酸、RO0635389-000-001为代表的犬尿氨酸衍生物结合，因而预计对于其结构类似于犬尿氨酸的其它衍生物也具有结合活性。因此，认为本文库可用于获得对任意靶抗原的结合活性根据犬尿氨酸、犬尿氨酸代谢物、以及作为生物体外分子的犬尿氨酸衍生物中的任一者以上的低分子的有无而变化的开关抗体。
〔实施例9〕利用基于开关分子的淘选的犬尿氨酸开关抗体获得用的文库设计实施例8中记载了通过全面改变进行文库化位点的设计，构建以显示犬尿氨酸结合能力的抗体为模板的文库的方法。作为文库制作方法，作为不同方法的利用淘选开关分子的方法也是有用的。
(9-1)以犬尿氨酸为开关的hIL-6R结合抗体6RNMSC1-2 F02的X射线晶体结构分析
实施例(8-1)中分析了6RNMSC1-2_F02与犬尿氨酸的复合体的晶体结构。根据晶体结构分析的结果，鉴定出该抗体识别犬尿氨酸的识别模式、以及预想不高度参与结合犬尿氨酸的抗体可变区的氨基酸残基。
(9-2)能够文库化的位点选定评价和文库设计
对于实施例(8-2-2)中制作的F02h011/F02l003(重链可变区序列：SEQ ID NO:95；轻链可变区序列：SEQ ID NO:96)，认为通过对将基于晶体结构分析结果挑选的各位点替换为Ala或Val得到的改变体进行评价，可选择能够文库化的位点。
(9-2-1)重链可变区的能够文库化的位点选定评价和文库设计
首先，对于重链，在F02h011/F02l003的重链序列所含的位点之中，制作将基于晶体结构分析结果挑选的各位点替换为Ala或Val而得的各改变体。被改变的位点(表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点)以及该位点的改变前的氨基酸(表中，记载为“天然序列”的氨基酸)和改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”的氨基酸)示于表25。
[表25]
Figure BDA0002407382280001871
通过后述参考实施例1所示的方法表达和纯化的各改变体对犬尿氨酸的结合是在实施例(7-5)中所示的使用Biacore的方法中将抗原添加时间改变为30秒钟的条件下进行测定。在犬尿氨酸的解离快速而无法确定解离速度常数时，通过基于与各抗原相互作用期间(结合相)的结合应答的大小的平衡值分析来算出解离常数KD(M)。此时，参数的计算中也使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。测定的结果，各改变体与犬尿氨酸的亲和力以KD值的形式算出。各改变体与作为亲本抗体的F02h011/F02l003对犬尿氨酸的KD值的比较结果示于表26。
[表26]
Figure BDA0002407382280001881
设计文库时，根据上述改变体评价和实施例(8-2-4)的评价中所得的信息，选定满足以下条件中的至少一者的位点作为能够文库化的位点。
条件1)不高度参与对犬尿氨酸的结合的位点、或即使参与结合也不会使对犬尿氨酸的结合大幅降低(不使结合为零)的天然序列以外的氨基酸所存在的位点；
条件2)作为抗体谱具有某种程度氨基酸出现频率的多样性的位点；
条件3)对于经典结构的形成不重要的位点。
设计下述文库，其中，在实施例(8-2-4)中制作的导入了犬尿氨酸结合增强改变的F02h011/F02l098的重链序列(SEQ ID NO:95)中，对于根据上述条件选出的位点的氨基酸，将出现仅限于某恒定的碱基。例如可举出NNK、TRIM Library等(Gonzalez-Munoz A etal.MAbs 2012,Lee CV et al.J Mol Biol.2004,Knappik A.et al.J Mol Biol.2000,Tiller T et al.MAbs 2013)。在实施了评价的各位点中，显示高于作为亲本序列的F02h011/F02l003对犬尿氨酸的KD值的20％的结合的改变位置被判定为满足上述条件的能够改变的位点。另外，即便是包含于其中的位点，也将被判断为结构上重要的残基的位点从文库化位点中排除，或限定出现的氨基酸来进行文库化。使用NNK密码子的文库化位点(表中以○表示)、固定于天然序列的位点(表中以×表示)、和限定出现的氨基酸时的氨基酸示于表27。
[表27]
Figure BDA0002407382280001882
所设计的基因序列是使用在文库化位点含有NNK密码子或限定的氨基酸出现的密码子的引物来进行基因合成(重链可变区文库)，与F02h011/F02l098的轻链可变区序列(亲本序列、SEQ ID NO:97)组合，并导入具有来源于人IgG的CH1序列和来源于人IgG的轻链恒定区序列的适合的噬粒载体。将该噬粒载体通过电穿孔法导入大肠杆菌，从而构建能够以犬尿氨酸为开关而与抗原结合的人抗体重链可变区噬菌体展示文库。
(9-2-2)轻链可变区的能够文库化的位点选定评价和文库设计接着，对于轻链，在F02h011/F02l003的轻链序列所含的位点之中，制作将基于晶体结构分析结果挑选的各位点替换为Ala或Val而得的各改变体。被改变的位点(表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点)以及该位点的改变前的氨基酸(表中，记载为“天然序列”的氨基酸)和改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”的氨基酸)示于表28。
[表28]
Figure BDA0002407382280001891
通过后述参考实施例1所示的方法表达和纯化的各改变体对犬尿氨酸的结合是在实施例(7-5)中所示的使用Biacore的方法中将抗原添加时间改变为30秒钟的条件下进行测定。在犬尿氨酸的解离快速而无法确定解离速度常数时，通过基于与各抗原相互作用期间(结合相)的结合应答的大小的平衡值分析来算出解离常数KD(M)。此时，参数的计算中也使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。测定的结果，各改变体与犬尿氨酸的亲和力以KD值的形式算出。各改变体与作为亲本序列的F02h011/F02l003对犬尿氨酸的KD值的比较结果示于表29。
[表29]
Figure BDA0002407382280001892
设计文库时，根据上述改变体评价和实施例(8-2-4)的评价中所得的信息，选定满足以下条件中的至少一者的位点作为能够文库化的位点。
条件1)不高度参与对犬尿氨酸的结合的位点、或即使参与结合也不会使对犬尿氨酸的结合大幅降低(不使结合为零)的天然序列以外的氨基酸所存在的位点；
条件2)作为抗体谱具有某种程度氨基酸出现频率的多样性的位点；
条件3)对于经典结构的形成不重要的位点。
设计下述文库，其中，在实施例(8-2-4)中制作的导入了犬尿氨酸结合增强改变的F02h011/F02l098的轻链序列(SEQ ID NO:97)中，对于根据上述条件选出的位点的氨基酸，将出现仅限于某恒定的碱基。例如可举出NNK、TRIM Library等。在实施了评价的各位点中，显示高于作为亲本序列的F02h011/F02l003对犬尿氨酸的KD值的20％的结合的改变位置被判定为满足上述条件的能够改变的位点。另外，即便是包含于其中的位点，也将被判断为结构上重要的残基的位点从文库化位点中排除，或限定出现的氨基酸来进行文库化。使用NNK密码子的文库化位点(表中以○表示)、固定于天然序列的位点(表中以×表示)、和限定出现的氨基酸时的氨基酸示于表30。
[表30]
Figure BDA0002407382280001901
所设计的基因序列是使用在文库化位点含有NNK密码子或限定的氨基酸出现的密码子的引物来进行基因合成(轻链可变区文库)，与F02h011/F02l098的重链可变区序列(亲本序列、SEQ ID NO:95)组合，并导入具有来源于人IgG的CH1序列和来源于人IgG的轻链恒定区序列的适合的噬粒载体。将该噬粒载体通过电穿孔法导入大肠杆菌，从而构建能够以犬尿氨酸为开关而与抗原结合的人抗体轻链可变区噬菌体展示文库。
(9-3)用于制作犬尿氨酸结合文库的生物素化犬尿氨酸的合成如实施例(7-6)所示，在6RNMSC1-2_F02中，犬尿氨酸的衍生物也作为开关发挥功能。由于这些衍生物均是犬尿氨酸的3位4位5位中的任一者被替换了的结构，另外还由于根据6RNMSC1-2_F02与犬尿氨酸的复合体的晶体结构分析结果预测生物素在犬尿氨酸的3位4位或5位的导入不会影响6RNMSC1-2_F02与抗原hIL-6R的结合，因而由3位4位5位的任一者结合适合的接头(PEG接头等)，并在其末端添加生物素是理想的。
以下，示出本发明的生物素化犬尿氨酸的实施例。本发明的生物素化犬尿氨酸可以通过各种方法合成，对其一部分通过以下方案进行说明。方案为例示，本发明并不仅限于明示的化学反应和条件。本发明的代表性化合物可以使用适合的中间体、公知的化合物和试剂进行合成。
(9-3-1)在犬尿氨酸的4位设置有接头的生物素化合物的合成通过以下记载的方法，可以制备生物素化犬尿氨酸化合物028和029。另外，生物素化犬尿氨酸化合物和合成中间体通过以下条件进行分析。
LCMS的分析条件如下所述。
[表31]
Figure BDA0002407382280001911
[化26]
Figure BDA0002407382280001921
[化27]
Figure BDA0002407382280001922
在5-溴-2-碘苯胺(化合物019、4.90g、16.5mmol、COMBI-BLOCKS)与二碳酸二叔丁酯(7.54g、41.1mmol)的四氢呋喃(100ml)溶液中，在氮气流下0℃下用15分钟加入双(三甲基甲硅烷基)氨基钠(38％四氢呋喃溶液、1.9mol/L、21.6ml、41.1mmol)，在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌18小时。反应液用乙酸乙酯(300ml)稀释，用1M盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、和饱和盐水清洗后，用硫酸钠干燥，进行减压浓缩。将所得的残渣通过正相硅胶柱色谱(乙酸乙酯/己烷)纯化，得到化合物020(6.14g、90％)。
LCMS(ESI)m/z＝342、344(M-Bu+H)+
保留时间：0.97分(分析条件H)。
[化28]
Figure BDA0002407382280001931
在N-叔丁氧基-(5-溴-2-碘苯基)氨基甲酸酯(化合物020、12.0g、30.2mmol)的四氢呋喃(120ml)溶液中，在氮气流下在-78℃加入甲基溴化镁(1M、33.2ml、33.2mmol)，在相同温度下搅拌1小时。接着加入正丁基锂(2.5M、13.3ml、33.3mmol)，然后在-78℃搅拌2小时。在该溶液中，在-78℃用30分钟加入(2S)-2-[[叔丁氧基羰基]氨基]-4-氧代丁酸酯(化合物021、4.20g、15.4mmol、Roberts等、Bioorg.Med.Chem.Letters,13(2),265-267(2003))的四氢呋喃(15ml)溶液，进而在相同温度搅拌2小时。在反应液中加入1M盐酸，用乙酸乙酯提取3次。将收集的有机层用1M盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水清洗后，进行减压浓缩。将所得的残渣通过正相硅胶柱色谱(乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到化合物022(7.50g、89％)。
LCMS(ESI)m/z＝569(M+Na)+
保留时间：1.93分(分析条件A)。
[化29]
Figure BDA0002407382280001932
在化合物022(7.50g、13.8mmol)的二氯甲烷(100ml)溶液中在25℃加入戴斯-马丁氧化剂(11.7g、27.6mmol)，搅拌2小时。反应混合物的乙酸乙酯稀释溶液用硫代硫酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液、饱和盐水清洗，进行减压浓缩。将所得的残渣通过正相硅胶柱色谱(乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到化合物023(5.80g、78％)。
LCMS(ESI)m/z＝565(M+Na)+
保留时间：1.78分(分析条件A)。
[化30]
Figure BDA0002407382280001941
将化合物023(2.50g、4.58mmol)、碘化铜(I)(438mg、2.30mmol)、(1R,2R)-(-)-N,N'-二甲基环己烷-1,2-二胺(654mg、4.60mmol)、碘化钠(1.40g、9.34mmol)的二噁烷(60ml)溶液在氮气氛下在120℃搅拌16小时。将经减压浓缩的反应混合液的残渣通过正相硅胶柱色谱(乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到化合物024(1.60g、59％)。
LCMS(ESI)m/z＝613(M+Na)+
保留时间：1.95分(分析条件B)。
[化31]
Figure BDA0002407382280001942
将化合物024(1.60g、2.71mmol)、四(三苯基膦)钯(627mg、0.54mmol)、碘化铜(103mg、0.54mmol)、双(2-丙烯基)醚(893mg、9.49mmol)、三乙胺(triathylamine)(960mg、9.49mmol)的四氢呋喃(20ml)溶液在氮气氛下在25℃搅拌16小时。将经减压浓缩的反应混合液的残渣通过正相硅胶柱色谱(乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到化合物025(700mg、46％)。
LCMS(ESI)m/z＝579(M+Na)+
保留时间：2.68分(分析条件B)。
[化32]
Figure BDA0002407382280001943
将化合物025(60.0mg、0.11mmol)、生物素-PEG4-N3(化合物026、60.0mg、0.13mmol)、硫酸铜·5水合物(10.0mg、0.040mmol)、1M抗坏血酸钠水溶液(5滴)的四氢呋喃(2.0ml)与叔丁醇(2.0ml)混合溶液在25℃搅拌16小时。将经减压浓缩的反应混合液的残渣通过正相硅胶柱色谱(甲醇/二氯甲烷)纯化，得到化合物027(100mg、91％)。
LCMS(ESI)m/z＝1001(M+H)+
保留时间：1.40分(分析条件C)。
[化33]
Figure BDA0002407382280001951
在化合物027(100mg、0.10mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中加入三氟乙酸(2.0ml)，在25℃搅拌2小时。将经减压浓缩的反应混合液的残渣通过高效液相色谱纯化，得到化合物028(27.8mg、37％)。
LCMS(ESI)m/z＝745(M+H)+
保留时间：2.14分(分析条件D)。
[化34]
Figure BDA0002407382280001952
在化合物027(100mg、0.10mmol)、钯/碳(20mg)的甲醇(10ml)溶液中用5小时吹入氢气。将反应混合物过滤后减压浓缩，在残渣的二氯甲烷(10ml)溶液中加入三氟乙酸(1.0ml)，在25℃搅拌1小时。将经减压浓缩的反应混合液的残渣通过高效液相色谱纯化，得到化合物029(13.5mg、18％)。
LCMS(ESI)m/z＝749(M+H)+
保留时间：1.20分(分析条件B)。
(9-3-2)在犬尿氨酸的5位设置有接头的生物素化合物的合成
通过以下记载的方法，可以制备生物素化犬尿氨酸化合物036。
[化35]
Figure BDA0002407382280001961
[化36]
Figure BDA0002407382280001962
在N-叔丁氧基-(4-溴-2-碘苯基)氨基甲酸酯(Wensbo等、Tetrahedron,51(37),10323-10342(1995))(化合物030、7.50g、18.8mmol)的四氢呋喃(80ml)溶液中，在氮气流下在-78℃加入甲基溴化镁(1M、20ml、20mmol)，在相同温度下搅拌20分钟。接着加入正丁基锂(2.5M、10ml、25mmol)，然后在-78℃搅拌30分钟。在该溶液中，在-78℃用30分钟加入(2S)-2-[[叔丁氧基羰基]氨基]-4-氧代丁酸酯(化合物021、2.57g、9.40mmol)的四氢呋喃(20ml)溶液，进而在相同温度搅拌1小时。在反应液中加入1M盐酸，用乙酸乙酯提取3次。将收集的有机层用1M盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水清洗，用硫酸钠干燥后，进行减压浓缩。将所得的残渣通过正相硅胶柱色谱(乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到化合物031(4.56g、89％)。
LCMS(ESI)m/z＝569(M+Na)+
保留时间：1.78分(分析条件A)。
[化37]
Figure BDA0002407382280001971
在化合物031(4.56g、8.36mmol)的二氯甲烷(100ml)溶液中在25℃加入戴斯-马丁氧化剂(8.89g、21.0mmol)，搅拌3小时。在反应混合物中加入硫代硫酸钠水溶液，然后用二氯甲烷提取3次。将合并的有机层用碳酸氢钠水溶液清洗后，用硫酸钠干燥，进行减压浓缩。将所得的残渣通过正相硅胶柱色谱(乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到化合物032(3.60g、79％)。
LCMS(ESI)m/z＝567(M+H)+
保留时间：1.90分(分析条件E)。
[化38]
Figure BDA0002407382280001972
将化合物032(3.60g、6.62mmol)、碘化铜(I)(650mg、3.41mmol)、(1R,2R)-(-)-N,N'-二甲基环己烷-1,2-二胺(940mg、6.61mmol)、碘化钠(1.98g、13.2mmol)的二噁烷(60ml)溶液在氮气氛下在120℃搅拌16小时。将经减压浓缩的反应混合液的残渣通过正相硅胶柱色谱(乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到化合物033(3.10g、79％)。
LCMS(ESI)m/z＝613(M+Na)+
保留时间：1.33分(分析条件E)。
[化39]
Figure BDA0002407382280001981
将化合物033(3.10g、5.25mmol)、四(三苯基膦)钯(1.21g、1.05mmol)、碘化铜(200mg、1.05mmol)、双(2-丙烯基)醚(1.73mg、18.4mmol)、三乙胺(triathylamine)(1.86g、18.4mmol)的四氢呋喃(20ml)溶液在氮气氛下在25℃搅拌16小时。将经减压浓缩的反应混合液的残渣通过正相硅胶柱色谱(乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到化合物034(1.00g、34％)。
LCMS(ESI)m/z＝579(M+Na)+
保留时间：1.28分(分析条件E)。
[化40]
Figure BDA0002407382280001982
将化合物034(90.0mg、0.20mmol)、生物素-PEG4-N3(化合物026、90.0mg、0.16mmol)、硫酸铜·5水合物(10mg、0.040mmol)、1M抗坏血酸钠水溶液(10滴)的四氢呋喃(2ml)与叔丁醇(2ml)混合溶液在25℃搅拌16小时。将经减压浓缩的反应混合液的残渣通过正相硅胶柱色谱(甲醇/二氯甲烷)纯化，得到化合物035(155mg、76％)。
LCMS(ESI)m/z＝1001(M+H)+
保留时间：1.13分(分析条件F)。
[化41]
Figure BDA0002407382280001991
在化合物035(85.0mg、0.080mmol)、钯/碳(10mg)的甲醇(10ml)溶液中用4小时吹入氢气。将反应混合物过滤后减压浓缩，在残渣的二氯甲烷(5.0ml)溶液中加入三氟乙酸(1.0ml)，在25℃搅拌1小时。将经减压浓缩的反应混合液的残渣通过高效液相色谱纯化，得到化合物036(18.9mg、31.6％)。
LCMS(ESI)m/z＝749(M+H)+
保留时间：0.70分(分析条件G)。
(9-4)使用重链和轻链可变区噬菌体展示文库获得与犬尿氨酸结合的抗体群体
为了从实施例(9-2-1)和(9-2-2)中设计、构建的重链、轻链可变区各自的噬菌体展示文库获得与犬尿氨酸特异性结合的抗体群体，实施相对于实施例(9-3)中合成的生物素化犬尿氨酸的淘选。因此，首先使抗体噬菌体展示文库在生物素化犬尿氨酸非存在下与磁珠接触，将展示在生物素化犬尿氨酸非存在下也对磁珠具有结合活性的抗体的噬菌体除去。接着，通过在生物素化犬尿氨酸存在的条件下相同地进行淘选，实施对生物素化犬尿氨酸具有特异性结合活性的抗体的筛选。
使保持所构建的噬菌体展示噬粒载体的大肠杆菌感染M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体(hyperphage))(PROGEN Biotechnik)，在30℃培养一晩，从上清回收噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此得到的沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而制备抗体多价展示噬菌体文库液。接着，在该噬菌体文库液中以终浓度为4％的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads MyOne StreptAvidin T1)。
淘选中，利用阴性选择法进行与犬尿氨酸特异性结合的噬菌体的回收。对于实施例(9-3)中合成的3种生物素化犬尿氨酸(化合物028、029、和036)，分别单独实施淘选。具体地，对经BSA封闭的磁珠(Dynabeads MyOne StreptAvidin T1)加入制备的噬菌体文库液0.8mL，在室温结合30分钟。然后，在4℃结合30分钟。使用磁力架将珠分离，由此回收不与珠结合的噬菌体。再次重复该操作。使另外准备的经BSA封闭的磁珠(Dynabeads MyOneStreptAvidin T1)和6nmol的生物素化犬尿氨酸在室温反应30分钟，由此使生物素化犬尿氨酸固定化于磁珠。对经TBST清洗3次的固定有生物素化犬尿氨酸的磁珠加入回收的噬菌体，由此使噬菌体文库在室温与生物素化犬尿氨酸接触30分钟。然后，使之在4℃接触30分钟。将珠用1mL的冰冷TBST清洗2次，用冰冷的TBS清洗1次。然后将添加了0.5mL含有终浓度1mg/mL的胰蛋白酶的TBS的珠在室温悬浮15分钟后，由立即使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将用胰蛋白酶溶液洗脱的噬菌体添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的60mL的大肠杆菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的3块板上。接着，使接种的大肠杆菌的培养液感染超级噬菌体，在30℃培养一晩，由此回收抗体多价展示噬菌体文库液。
在第2次淘选中，与第1次相同地，利用阴性选择法，分别对3种生物素化犬尿氨酸实施与犬尿氨酸特异性结合的噬菌体的回收。具体地，首先将磁珠(Sera-Mag SpeedBeadsNeutrAvidin-coated)用添加有5mg/mL的StreptAvidin recombinant(Roche)5μL的2％脱脂奶粉-TBS进行封闭。对经TBST清洗3次的磁珠加入经4％BSA封闭的噬菌体文库液0.8mL，在室温结合30分钟。使用磁力架将珠分离，由此回收不与珠结合的噬菌体。再次重复该操作。使另外准备的经添加有5mg/mL的StreptAvidin recombinant(Roche)5μL的2％脱脂奶粉-TBS封闭的磁珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)与10nmol生物素化犬尿氨酸在室温反应30分钟、在4℃反应30分钟，由此将生物素化犬尿氨酸固定化于磁珠。对经TBST清洗3次的固定有生物素化犬尿氨酸的磁珠加入回收的噬菌体，由此使噬菌体文库在室温与生物素化犬尿氨酸接触30分钟。然后，使之在4℃接触30分钟。将珠用1mL的冰冷TBST清洗3次，用冰冷的TBS清洗2次。然后将添加了0.5mL含有终浓度1mg/mL的胰蛋白酶的TBS的珠在室温悬浮15分钟后，由立即使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将用胰蛋白酶溶液洗脱的噬菌体0.5mL中的50μL添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的60mL的大肠杆菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的3块板上。
(9-4-2)通过噬菌体ELISA评价生物素化犬尿氨酸结合活性
由实施例(9-4-1)中所得的大肠杆菌的单菌落，按照常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)回收含有噬菌体的培养上清。通过使用超级噬菌体作为辅助噬菌体，回收抗体多价展示噬菌体，供ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有3种生物素化犬尿氨酸(将化合物028、029和036各自等量混合)的80μL的TBS包被1小时以上。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去未与StreptAvidin的生物素化犬尿氨酸，然后将该孔用250μL的2％脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2％脱脂奶粉-TBS，然后，将各孔中加入了所制备的纯化噬菌体的该培养板在室温静置1小时，由此使噬菌体展示抗体与各孔中存在的生物素化犬尿氨酸结合。在经TBST清洗的各孔中，加入用TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)，将培养板孵育1小时。用TBST清洗后，添加TMB single溶液(ZYMED)，各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸而终止后，通过450nm的吸光度来测定该显色。结果确认到多个与生物素化犬尿氨酸结合的抗体。噬菌体ELISA的结果示于表32。
[表32]
Figure BDA0002407382280002011
(9-4-3)生物素化犬尿氨酸结合抗体的序列分析
由基于实施例(9-4-2)中所示的噬菌体ELISA的结果判断为对犬尿氨酸具有特异性结合活性的克隆，使用特异性引物(SEQ ID NO:79和80)进行扩增，对所得的基因的碱基序列进行分析。分析的结果是，判断为对犬尿氨酸具有结合活性的克隆的序列是各自独立的。
(9-5)利用了针对犬尿氨酸的淘选的犬尿氨酸开关抗体获得用文库的构建
相对于由各重链、轻链可变区噬菌体展示文库获得的抗原(犬尿氨酸)的结合噬菌体是具有犬尿氨酸结合能力的群体，因此通过这两者的组合制作的Fab展示噬菌体文库中预计含有大量维持了作为开关的犬尿氨酸结合的克隆，因此认为能够制作可更有效率地获得犬尿氨酸开关抗体的文库。
从感染了实施例(9-4)中获得的重链、轻链各自的噬菌体文库的大肠杆菌通过本领域技术人员公知的方法提取基因。对于重链，将所获得的基因的集合体(重链可变区文库)用作模板，通过可分别扩增重链可变区的引物(SEQ ID NO:98和99)来扩增基因文库。对于轻链，从将所获得的基因的集合体(轻链可变区文库)通过限制酶处理切除F02h011/F02l098的重链可变区序列(文库模板序列：SEQ ID NO:95)，制备含有轻链可变区文库基因、来源于人IgG的轻链恒定区序列和来源于人IgG的CH1序列的噬粒载体。通过在制备的含有轻链可变区文库基因的噬粒载体中插入重链可变区文库基因，构建导入有人抗体重链/轻链可变区文库基因的噬粒载体。将该噬粒载体通过电穿孔法导入大肠杆菌，从而构建设计文库，其展示包含人抗体可变区-恒定区的Fab结构域、且可获得能够以犬尿氨酸为开关而与抗原结合的抗体。如此由多样的具有犬尿氨酸结合活性的H链和L链构成的设计文库被认为可用作包含人抗体的文库，其可效率良好地获得针对任意抗原的犬尿氨酸开关抗体。另外，如实施例(7-6)所示，6RNMSC1-2_F02不仅与犬尿氨酸结合，还与作为其代谢物的3-羟基犬尿氨酸、或3-羟基-DL-犬尿氨酸和RO0635389-000-001、RO0635390-000-001等犬尿氨酸衍生物结合，因而认为本文库对于获得任意的靶抗原结合活性根据犬尿氨酸、犬尿氨酸代谢物、犬尿氨酸衍生物中的任一者以上的低分子的有无而变化的开关抗体是有用的。
实施例(9-6)通过噬菌体ELISA评价文库所含的克隆的犬尿氨酸结合能力
实施例(9-5)中构建的文库是经由针对犬尿氨酸的淘选而制作的，因而预计该文库中含有大量对犬尿氨酸具有结合能力的克隆。由构建的文库得到的噬菌体克隆对生物素化犬尿氨酸的结合评价通过噬菌体ELISA来实施。
由具有所构建的文库基因的大肠杆菌的单菌落，按照常法(Methods Mol.Biol.(2002)178，133-145)进行噬菌体的培养。通过使用超级噬菌体作为辅助噬菌体，回收含有抗体多价展示噬菌体的培养上清。使用NucleoFast96(MACHERY-NAGEL)，对回收的噬菌体培养上清进行超滤。在NucleoFast96的各孔中添加培养上清各200μL，进行6000g、45分钟的离心分离，除去穿流物。加入H2O200μL，通过6000g、30分钟离心分离进行清洗。然后，加入TBS200μL，在室温静置5分钟，然后回收上清中所含的噬菌体液。
加入有TBS的纯化噬菌体通过与实施例(9-4-1)中使用的方法相同的方法供ELISA。结果确认到多个与生物素化犬尿氨酸结合的抗体。分析的来源于初级文库的噬菌体克隆中，约49％显示犬尿氨酸结合能力。噬菌体ELISA的结果示于表33。
[表33]
ELISA实施克隆数 192
阳性克隆数(吸光度＞0.2) 94
阳性克隆比例 48.96％
〔实施例10〕以非生物来源的低分子为开关的抗原结合蛋白的评价
对于从文库(其由结合ATP、腺苷的抗体ATNLSA1-4_D12所构建)获得的、在ATP或腺苷存在下对人IL-6受体(hIL-6R)显示结合能力的抗体(后述参考实施例3)，对于非生物来源的低分子存在下的人IL-6受体结合能力进行了评价。
(10-1)由文库获得的ATP/腺苷开关抗体的制备
将后述参考实施例3中获得的、被判断为在ATP或腺苷存在下具有生物素标记hIL-6R结合活性的克隆6RAD2C1-4_001、6RAD2C1-4_005、6RAD2C1-4_011、6RAD2C1-4_026、6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_042、6RAD2C1-4_076、6RDL3C1-4_085、6RDL3C5-4_011的重链和轻链的可变区序列各自插入具有重链抗体恒定区(SEQ ID NO:46)或轻链Lambda恒定区序列(SEQ ID NO:100)的人IgG1/Lambda的动物表达用质粒。使用以下方法表达抗体。对于在FreeStyle 293Expression Medium培养基(Invitrogen)中以1.33x 106细胞/mL的细胞密度进行悬浮，并在六孔板的各孔中分别接种了3mL的来源于人胚肾细胞的FreeStyle293-F株(Invitrogen)，通过脂质体转染法导入制备的质粒。从在CO2培养箱(37℃、8％CO2,90rpm)培养了4天的培养上清，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(AmershamBiosciences)以本领域技术人员公知的方法纯化抗体。使用分光光度计，测定纯化的抗体溶液在280nm下的吸光度。根据所得的测定值，使用以PACE法算出的吸光系数来算出纯化的抗体的浓度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(10-2)通过表面等离子共振评价各种低分子对人IL-6受体结合的影响使用Biacore T200(GE Healthcare)，评价各种低分子在由文库获得的ATP/腺苷依赖性抗体的9个克隆(6RAD2C1-4_001、6RAD2C1-4_005、6RAD2C1-4_011、6RAD2C1-4_026、6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_042、6RAD2C1-4_076、6RDL3C1-4_085、6RDL3C5-4_011)与hIL-6R的抗原抗体反应中的影响。作为流动缓冲液，使用20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.4，在25℃进行测定。在传感器芯片CM5上通过胺偶联固定hIL-6R，以抗体作为分析物，使之相互作用120秒钟，观察其结合量的变化。抗体的稀释使用流动缓冲液和在流动缓冲液中分别添加了ATP、ADP、AMP、cAMP、或腺苷(ADO)的任一者的缓冲液，进行调整使得各低分子的终浓度为1mM，抗体的终浓度为1μM。另外，在1mM ATP条件下，对数个梯度的抗体浓度系列进行测定，根据相对于抗体浓度的平衡值的曲线，算出各克隆对hIL-6R的解离常数KD(mol/L)。参数的计算中使用了Biacore T200 Evaluation Software(GEHealthcare)。1mM ATP存在下的各克隆的解离常数KD示于表34。
[表34]
Figure BDA0002407382280002041
该测定中获得的1mM的各低分子存在下、或非存在下的各克隆对hIL-6R的结合量示于图37。如图37所示，各克隆在1mM ATP存在下与hIL-6R结合，在ATP非存在下则未观察到对hIL-6R的结合。由此确认到具有以ATP为开关而与hIL-6R结合的性质。对于ATP以外的低分子，全部克隆在ADP存在下均观察到结合，一部分克隆也观察到了AMP和cAMP存在下的结合。ADO(腺苷)存在下未观察到与hIL-6R的结合。
(10-3)通过Octet评价各种低分子对人IL-6受体结合的影响使用Octet(PRIMETECH)，评价各种低分子在由文库获得的ATP/腺苷依赖性抗体的9个克隆(6RAD2C1-4_001、6RAD2C1-4_005、6RAD2C1-4_011、6RAD2C1-4_026、6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_042、6RAD2C1-4_076、6RDL3C1-4_085、6RDL3C5-4_011)与hIL-6R的抗原抗体反应中的影响。作为测定缓冲液，使用TBS、pH7.4，在30℃进行测定。在链霉亲和素传感器芯片上固定生物素化hIL-6R，使抗体相互作用，观察其结合量的变化。抗体的稀释使用测定缓冲液和在测定缓冲液中分别添加了ATP、ADP、AMP、cAMP、ADO或ATP-gamma-S的任一者的缓冲液，进行调整使得各低分子的终浓度为1mM、抗体的终浓度为10μg/mL。
评价该测定中获得的1mM的各低分子存在下、或非存在下的各克隆对hIL-6R的结合性，结果全部克隆在1mM ATP存在下均确认到与hIL-6R结合，在ATP非存在下则未观察到对hIL-6R的结合。由此通过Octet也确认到具有以ATP为开关而与hIL-6R结合的性质。另外全部克隆中均观察到ATP-gamma-S存在下的结合。评价中所得的ATP或ATP-gamma-S 1mM存在下或非存在下的IL6R结合量示于图38。以上表明以ATP和衍生物(生物体外分子)为开关发挥功能的hIL-6R结合抗体可以从文库获得。
〔实施例11〕从利用针对犬尿氨酸的淘选的犬尿氨酸开关抗体获得用文库(犬尿氨酸文库Ver.A)获得在犬尿氨酸存在下与人IL-6受体结合的抗体
(11-1)从抗体文库获得在犬尿氨酸存在下显示人IL-6受体结合活性，在犬尿氨酸 非存在下未显示结合的抗体
从实施例9中构建的、利用针对犬尿氨酸的淘选的犬尿氨酸开关抗体获得用噬菌体展示文库(称为犬尿氨酸文库Ver.A)筛选在犬尿氨酸存在下显示人IL-6受体(hIL-6R)结合活性的抗体。即，回收展示下述抗体的噬菌体，该抗体在犬尿氨酸存在下对捕获于珠上的hIL-6R显示结合活性，在犬尿氨酸非存在下的条件下则从珠上洗脱。本获得方法中，使用经生物素标记的hIL-6R作为抗原。
使保持所构建的噬菌体展示噬粒载体的大肠杆菌感染M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体(hyperphage))(PROGEN Biotechnik)，在30℃培养一晩，从上清回收噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此得到的沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而制备抗体多价展示噬菌体文库液。接着，在该噬菌体文库液中以终浓度为4％的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
在第1次淘选中，对仅在犬尿氨酸存在下能够与抗原结合的噬菌体进行浓缩。具体地，在制备的噬菌体文库液0.5mL中加入250pmol的生物素标记抗原的同时加入终浓度500μM的犬尿氨酸，由此使噬菌体文库在室温与抗原和犬尿氨酸接触15分钟。然后，使之在4℃接触45分钟。加入经BSA封闭的磁珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)，使抗原与噬菌体的复合体与磁珠在4℃结合15分钟。将珠用0.5mL的冰冷的犬尿氨酸/TBST清洗2次，用冰冷的犬尿氨酸/TBS清洗1次。然后将加入有0.25mL的TBS的珠在室温悬浮后，立即由使用磁力架分离的珠回收噬菌体溶液。再次重复该操作后，将分2次洗脱出的噬菌体液混合。在回收的噬菌体溶液中加入100mg/mL的胰蛋白酶5μL，由此将Fab切断，改善经胰蛋白酶处理的噬菌体对大肠杆菌的感染能力。将经胰蛋白酶处理的噬菌体添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL的大肠杆菌株ER2738。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。接着，使接种的大肠杆菌的培养液感染超级噬菌体，从在30℃培养一晩的上清回收噬菌体，由此制备抗体多价展示噬菌体文库液。
在第2次淘选中，在制备的噬菌体文库液0.4mL中加入250pmol的生物素标记抗原的同时加入终浓度500μM的犬尿氨酸，由此使噬菌体文库在室温与抗原和犬尿氨酸接触60分钟。加入经BSA封闭的磁珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)，使抗原与噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用0.5mL的犬尿氨酸/TBST清洗2次，用犬尿氨酸/TBS清洗1次。然后将加入有0.25mL的TBS的珠在室温悬浮后，立即由使用磁力架分离的珠回收噬菌体溶液。再次重复该操作后，将分2次洗脱出的噬菌体液混合。在回收的噬菌体溶液中加入100mg/mL的胰蛋白酶5μL，由此将Fab切断，改善经胰蛋白酶处理的噬菌体对大肠杆菌的感染能力。将经胰蛋白酶处理的噬菌体添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的20mL的大肠杆菌株ER2738。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。接着，使接种的大肠杆菌的培养液感染超级噬菌体，从在30℃培养一晩的上清回收噬菌体，由此制备抗体多价展示噬菌体文库液。
在第3次淘选中，在制备的噬菌体文库液0.2mL中加入100pmol的生物素标记抗原的同时加入终浓度500μM的犬尿氨酸，由此使噬菌体文库在室温与抗原和犬尿氨酸接触60分钟。加入经BSA封闭的磁珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在4℃结合30分钟。将珠用0.4mL的犬尿氨酸/TBST清洗3次，用犬尿氨酸/TBS清洗2次。然后将加入有0.25mL的TBS的珠在室温悬浮后，立即由使用磁力架分离的珠回收噬菌体溶液。再次重复该操作后，将分2次洗脱出的噬菌体液混合。在回收的噬菌体溶液中加入100mg/mL的胰蛋白酶5μL，由此将Fab切断，改善经胰蛋白酶处理的噬菌体对大肠杆菌的感染能力。将经胰蛋白酶处理的噬菌体添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的20mL的大肠杆菌株ER2738。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。接着，使接种的大肠杆菌的培养液感染超级噬菌体，从在30℃培养一晩的上清回收噬菌体，由此制备抗体多价展示噬菌体文库液。
在第4次淘选中，通过与第3次淘选相同的条件实施淘选。
(11-2)利用阴性选择法从抗体文库获得在犬尿氨酸存在下与hIL-6R结合的抗体从实施例9中构建的犬尿氨酸文库Ver.A进行下述抗体的筛选，该抗体在犬尿氨酸存在的条件下对抗原显示抗原结合活性。为了筛选，首先使抗体噬菌体展示文库在犬尿氨酸非存在下与生物素标记抗原-链霉亲和素接触，除去展示即使在犬尿氨酸非存在下也对抗原具有结合活性的抗体的噬菌体。接着，在犬尿氨酸存在的条件下同样地进行淘选，由此实施仅在犬尿氨酸存在的条件下对抗原具有结合活性的抗体的筛选。
使保持所构建的噬菌体展示噬粒载体的大肠杆菌感染M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体(hyperphage))(PROGEN Biotechnik)，在30℃培养一晩，从上清回收噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此得到的沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而制备抗体多价展示噬菌体文库液。接着，在该噬菌体文库液中以终浓度为4％的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
在第1次淘选中，利用阴性选择法对仅在犬尿氨酸存在下能够与抗原结合的噬菌体进行浓缩。具体地，对经BSA封闭的中和亲和素包被的Sera-Mag SpeedBeads加入500pmol的生物素化抗原，在室温结合15分钟。对经TBS清洗3次的珠加入以BSA进行了封闭的噬菌体文库液0.5mL，在室温结合1小时。使用磁力架将珠分离，由此回收未与抗原和珠结合的噬菌体。对回收的噬菌体添加250pmol的生物素标记抗原以及终浓度500μM的犬尿氨酸，由此使噬菌体文库在室温与抗原以及犬尿氨酸接触15分钟。然后，使之在4℃接触45分钟。接着，在该标记抗原以及犬尿氨酸与噬菌体文库的混合液中加入经BSA封闭的磁珠，在4℃使抗原和噬菌体的复合体与磁珠结合15分钟。将珠用0.5mL的冰冷的犬尿氨酸/TBST清洗2次，用冰冷的犬尿氨酸/TBS清洗1次。然后，将1mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL加入至该混合液中。将该混合液在室温搅拌15分钟后，由使用磁力架分离的珠回收噬菌体。将回收的噬菌体添加至达到对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x225mm的板上。接着，使接种的大肠杆菌的培养液感染超级噬菌体，从在30℃培养一晩的上清回收噬菌体，由此制备抗体多价展示噬菌体文库液。
在第2次以后的淘选中，对仅在犬尿氨酸存在下能够与抗原结合的噬菌体进行浓缩。具体地，通过与实施例(11-1)所示的第2次以后的淘选方法相同的方法，实施直至第4次淘选。
(11-3)利用针对开关分子的淘选从抗体文库获得在犬尿氨酸存在下与hIL-6R结 合的抗体
从实施例9中构建的犬尿氨酸文库Ver.A进行下述抗体的筛选，该抗体在犬尿氨酸存在的条件下对抗原显示抗原结合活性。为了筛选，首先针对生物素化犬尿氨酸(化合物028、029和036)进行淘选，回收展示具有犬尿氨酸结合活性的抗体的噬菌体。接着，在犬尿氨酸存在下进行针对生物素标记抗原的淘选，由此实施在犬尿氨酸存在的条件下对抗原具有结合活性的抗体的筛选。
使保持所构建的噬菌体展示噬粒载体的大肠杆菌感染M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体(hyperphage))(PROGEN Biotechnik)，在30℃培养一晩，从上清回收噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此得到的沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而制备抗体多价展示噬菌体文库液。接着，在该噬菌体文库液中以终浓度为4％的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
在第1次淘选中，对能够与生物素化犬尿氨酸(化合物028、029和036的混合物)结合的噬菌体进行浓缩。具体地，对经BSA封闭的珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)加入将化合物028、029和036各自等量混合得到的生物素化犬尿氨酸混合物4000pmol，在室温结合30分钟。对经TBS清洗3次的珠加入以BSA进行了封闭的噬菌体文库液0.8mL，使之在室温与生物素化犬尿氨酸接触30分钟。然后，使之在4℃接触30分钟。将珠用1mL的冰冷TBST清洗3次，用冰冷的TBS清洗2次。然后，将1mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL加入该混合液。将该混合液在室温悬浮15分钟后，立即由使用磁力架分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体添加至达到对数生长期(OD600为0.4-0.7)的100mL大肠杆菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的5块板上。接着，使接种的大肠杆菌的培养液感染超级噬菌体，从在30℃培养一晩的上清回收噬菌体，由此制备抗体多价展示噬菌体文库液。
在第2次以后的淘选中，对仅在犬尿氨酸存在下能够与抗原结合的噬菌体进行浓缩。具体地，通过与实施例(11-1)所示的第2次以后的淘选方法相同的方法，实施直至第4次淘选。
(11-4)通过噬菌体ELISA评价犬尿氨酸存在下的结合活性由(11-1)、(11-2)、(11-3)中所得的大肠杆菌的单菌落，按照常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)进行噬菌体的培养。通过使用超级噬菌体作为辅助噬菌体，回收含有抗体多价展示噬菌体的培养上清。使用NucleoFast96(MACHERY-NAGEL)，对回收的噬菌体培养上清进行超滤。在NucleoFast96的各孔中添加培养上清各200μL，进行6000g、45分钟的离心分离，除去穿流物。加入H2O 200μL，通过6000g、30分钟离心分离进行清洗。然后，加入TBS 200μL，在室温静置5分钟，然后回收上清中所含的噬菌体液。
加入有TBS或500μM犬尿氨酸/TBS的纯化噬菌体通过下述步骤供ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记hIL-6R的100μL的TBS包被1小时以上。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去未与培养板结合的生物素标记hIL-6R，然后将该孔用250μL的2％脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2％脱脂奶粉-TBS，然后，将各孔中加入了所制备纯化噬菌体的该培养板在室温静置1小时，由此使噬菌体展示抗体与各孔中存在的生物素标记hIL-6R在犬尿氨酸非存在/存在下结合。在经TBST或犬尿氨酸/TBST清洗的各孔中，加入用TBS或犬尿氨酸/TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham PharmaciaBiotech)，将培养板孵育1小时。用TBST或犬尿氨酸/TBST清洗后，向各孔添加TMB single溶液(ZYMED)，各孔中溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450nm的吸光度对该显色进行测定。结果确认到多个在犬尿氨酸存在下与人IL-6受体结合的抗体。噬菌体ELISA的结果示于表35。如前述实施例6所示，虽然从人天然抗体文库也获得了在犬尿氨酸存在下与人IL-6受体结合的抗体，但可以以较其非常高的效率获得针对人IL-6受体的开关抗体。实施例6-2中实施的噬菌体ELISA的结果示于表36。
[表35]
来源 实施例(11-1) 实施例(11-2) 实施例(11-3)
淘选次数 4 4 4
ELISA实施克隆数 96 96 96
阳性克隆数(吸光度＞0.2) 96 94 94
开关克隆数(犬尿氨酸+/-吸光度比＞2) 93 91 86
开关克隆序列数 87 88 77
[表36]
淘选次数 3
ELISA实施克隆数 960
阳性克隆数(吸光度＞0.1) 939
开关克隆数(犬尿氨酸+/-吸光度比＞1.5) 10
开关克隆序列数 2
(11-5)抗原结合活性根据犬尿氨酸的有无而变化的开关抗体的序列分析
由基于实施例(11-4)所示的噬菌体ELISA的结果判断为在犬尿氨酸存在的条件下具有抗原结合活性的克隆，使用特异性引物(SEQ ID NO：79和80)进行扩增，对所得基因的碱基序列进行分析。根据分析结果可知，在实施例(11-1)、(11-2)和(11-3)的全部条件下，获得了多个判断为在犬尿氨酸存在下具有生物素标记hIL-6R结合活性的克隆。在获得的克隆之中，对于挑选的6个克隆，下表37中示出获得的淘选条件(表中，标记为来源)和氨基酸序列。
[表37]
克隆名称 来源 重链序列编号 轻链序列编号
6RFHm12-4_040 实施例(11-3) SEQ ID NO：101 SEQ ID NO：102
6RFHm12-4_078 实施例(11-3) SEQ ID NO：103 SEQ ID NO：104
6RFHm14-4_087 实施例(11-2) SEQ ID NO：105 SEQ ID NO：106
6RFHm14-4_093 实施例(11-2) SEQ ID NO：107 SEQ ID NO：108
6RFHm17-4_006 实施例(11-1) SEQ ID NO：109 SEQ ID NO：110
6RFHm17-4_010 实施例(11-1) SEQ ID NO：111 SEQ ID NO：112
(11-6)与hIL-6R结合的抗体的表达和纯化
将实施例(11-5)中记载的6个克隆的重链和轻链的可变区序列分别插入具有重链抗体恒定区(SEQ ID NO：113)或轻链kappa恒定区序列(SEQ ID NO：47)的动物表达用质粒。通过后述参考实施例1中记载的方法实施抗体的表达和纯化。
(11-7)获得的抗体的hIL-6R结合活性的评价
将挑选的6种抗体与6RNMSC1-2_F02抗体在表38所示的条件下供ELISA。
[表38]
抗原 犬尿氨酸 色氨酸
条件1 hIL6R 500uM -
条件2 hIL6R - -
条件3 - 500uM -
条件4 hIL6R - 500uM
首先，将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记hIL-6R的100μL的TBS在室温包被1小时以上。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去未与培养板结合的生物素标记hIL-6R，然后将该孔用封闭缓冲液(2％脱脂奶粉/TBS)250μL封闭1小时以上。在除去了封闭缓冲液的各孔中，加入在表38的条件下用TBS制备为2.5μg/mL的纯化IgG各100μL，将该培养板在室温静置1小时，由此是各IgG与各孔中存在的生物素标记hIL-6R结合。在用制备为表38所示的终浓度的TBST进行了清洗的各孔中，添加通过含相同低分子的TBS稀释了的HRP结合抗人IgG抗体(BIOSOURCE)，将培养板孵育1小时。用制备为表38所示的终浓度的TBST进行清洗后，添加了TMB single溶液(ZYMED)的各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，然后通过450nm的吸光度对该显色进行测定。测定结果示于图39。
挑选的6种抗体与6RNMSC1-2_F02抗体相同地，与条件1的吸光度相比，条件2或条件3的吸光度显著地低。由此确认，所挑选的6种抗体即使是IgG型也在犬尿氨酸存在下对生物素标记hIL-6R具有特异性结合活性。另外，与条件4的吸光度相比，条件2的吸光度未观察到显著差异，因而还确认到所挑选的6种抗体不具有色氨酸存在下的生物素标记hIL-6R结合活性。以上表明，由利用针对犬尿氨酸的淘选的犬尿氨酸开关抗体获得用文库(犬尿氨酸文库Ver.A)，可以获得多个犬尿氨酸作为开关发挥功能的hIL-6R结合抗体。另外，如后述参考实施例4所示，由参考实施例2中构建的以与ATP结合的抗体为模板的合理设计文库，获得在ATP非存在下与靶抗原结合，在ATP存在下不与靶抗原结合的抗体，由此认为也可相同地由犬尿氨酸开关抗体获得用文库获得在犬尿氨酸非存在下与靶抗原结合，在犬尿氨酸存在下不与靶抗原结合的抗体。
〔实施例12〕从利用针对犬尿氨酸的淘选的犬尿氨酸开关抗体获得用文库(犬尿氨酸文库Ver.A)获得在犬尿氨酸存在下与人IgA-Fc(hIgA-Fc)结合的抗体
(12-1)从抗体文库获得在犬尿氨酸存在下显示hIgA-Fc结合活性，在犬尿氨酸非 存在下不显示结合的抗体
从实施例9中构建的犬尿氨酸文库Ver.A进行下述抗体的筛选，该抗体在犬尿氨酸存在下显示人IgA-Fc(hIgA-Fc)结合活性。即，回收展示下述抗体的噬菌体，该抗体在犬尿氨酸存在下对捕获于珠上的hIgA-Fc显示结合活性，在犬尿氨酸非存在下的条件下则从珠上洗脱。本获得方法中，使用通过参考实施例5中记载的方法制备的生物素标记hIgA-Fc(SEQ ID NO:146)作为抗原。
使保持所构建的噬菌体展示噬粒载体的大肠杆菌感染M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体(hyperphage))(PROGEN Biotechnik)，在30℃培养一晩，从上清回收噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此得到的沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而制备抗体多价展示噬菌体文库液。接着，在该噬菌体文库液中以终浓度为4％的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
在淘选中，对仅在犬尿氨酸存在下能够与抗原结合的噬菌体进行浓缩。具体地，通过与实施例(11-1)所示的方法相同的方法，将抗原量在第1次和第2次改变为500pmol、在第3次和第4次改变为200pmol，实施直至第4次的淘选。
(12-2)利用阴性选择法从抗体文库获得在犬尿氨酸存在下与hIgA-Fc结合的抗体从实施例9中构建的犬尿氨酸文库Ver.A进行下述抗体的筛选，该抗体在犬尿氨酸存在的条件下对抗原显示抗原结合活性。为了筛选，首先使抗体噬菌体展示文库在犬尿氨酸非存在下与生物素标记抗原-链霉亲和素接触，除去展示即使在犬尿氨酸非存在下也对抗原具有结合活性的抗体的噬菌体。接着，在犬尿氨酸存在的条件下同样地进行淘选，由此实施仅在犬尿氨酸存在的条件下对抗原具有结合活性的抗体的筛选。
使保持所构建的噬菌体展示噬粒载体的大肠杆菌感染M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体(hyperphage))(PROGEN Biotechnik)，在30℃培养一晩，从上清回收噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此得到的沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而制备抗体多价展示噬菌体文库液。接着，在该噬菌体文库液中以终浓度为4％的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
在第1次淘选中，利用阴性选择法对仅在犬尿氨酸存在下能够与抗原结合的噬菌体进行浓缩。具体地，对经BSA封闭的中和亲和素包被的Sera-Mag SpeedBeads加入1000pmol生物素化抗原，在室温结合15分钟。对经TBS清洗3次的珠加入以BSA进行了封闭的噬菌体文库液0.5mL，在室温结合1小时。使用磁力架将珠分离，由此回收未与抗原和珠结合的噬菌体。对回收的噬菌体添加500pmol的生物素标记抗原以及终浓度500μM的犬尿氨酸，由此使噬菌体文库在室温与抗原以及犬尿氨酸接触15分钟。然后，使之在4℃接触45分钟。接着，在该标记抗原以及犬尿氨酸与噬菌体文库的混合液中加入经BSA封闭的磁珠，在4℃使抗原和噬菌体的复合体与磁珠结合15分钟。将珠用0.5mL的冰冷的犬尿氨酸/TBST清洗2次，用冰冷的犬尿氨酸/TBS清洗1次。然后，将1mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL加入至该混合液中。将该混合液在室温搅拌15分钟后，由使用磁力架分离的珠回收噬菌体。将回收的噬菌体添加至达到对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。接着，使接种的大肠杆菌的培养液感染超级噬菌体，从在30℃培养一晩的上清回收噬菌体，由此制备抗体多价展示噬菌体文库液。
在第2次以后的淘选中，对仅在犬尿氨酸存在下能够与抗原结合的噬菌体进行浓缩。具体地，通过与实施例(11-1)所示的第2次以后的淘选方法相同的方法，将抗原量在第2次改变为500pmol、在第3次和第4次改变为200pmol，实施直至第4次的淘选。
(12-3)利用针对开关分子的淘选从抗体文库获得在犬尿氨酸存在下与hIgA-Fc结 合的抗体
从实施例9中构建的犬尿氨酸文库Ver.A进行下述抗体的筛选，该抗体在犬尿氨酸存在的条件下对抗原显示抗原结合活性。为了筛选，首先针对生物素化犬尿氨酸(化合物028、029和036)进行淘选，回收展示具有犬尿氨酸结合活性的抗体的噬菌体。接着，在犬尿氨酸存在下进行针对生物素标记抗原的淘选，由此实施在犬尿氨酸存在的条件下对抗原具有结合活性的抗体的筛选。
使保持所构建的噬菌体展示噬粒载体的大肠杆菌感染M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体(hyperphage))(PROGEN Biotechnik)，在30℃培养一晩，从上清回收噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此得到的沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而制备抗体多价展示噬菌体文库液。接着，在该噬菌体文库液中以终浓度为4％的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
在第1次淘选中，对能够与生物素化犬尿氨酸(化合物028、029和036的混合物)结合的噬菌体进行浓缩。具体地，对经BSA封闭的珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)加入将化合物028、029和036各自等量混合得到的生物素化犬尿氨酸混合物4000pmol，在室温结合30分钟。对经TBS清洗3次的珠加入以BSA进行了封闭的噬菌体文库液0.8mL，使之在室温与生物素化犬尿氨酸接触30分钟。然后，在4℃接触30分钟。将珠用1mL的冰冷TBST清洗3次，用冰冷的TBS清洗2次。然后，将1mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL加入该混合液。将该混合液在室温悬浮15分钟后，立即由使用磁力架分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体添加至达到对数生长期(OD600为0.4-0.7)的100mL大肠杆菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的5块板上。接着，使接种的大肠杆菌的培养液感染超级噬菌体，从在30℃培养一晩的上清回收噬菌体，由此制备抗体多价展示噬菌体文库液。
在第2次以后的淘选中，对仅在犬尿氨酸存在下能够与抗原结合的噬菌体进行浓缩。具体地，通过与实施例(11-1)所示的第2次以后的淘选方法相同的方法，将抗原量在第2次改变为500pmol、在第3次和第4次改变为200pmol，实施直至第4次的淘选。
(12-4)通过噬菌体ELISA评价犬尿氨酸存在下的结合活性由(12-1)、(12-2)、(12-3)中所得的大肠杆菌的单菌落，按照常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)进行噬菌体的培养。通过使用超级噬菌体作为辅助噬菌体，回收含有抗体多价展示噬菌体的培养上清。通过实施例(11-4)中记载的方法纯化的纯化噬菌体按照下述步骤供ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记hIgA-Fc的100μL的TBS包被1小时以上。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去未与培养板结合的生物素标记hIgA-Fc，然后将该孔用250μL的2％脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2％脱脂奶粉-TBS，然后，将各孔中加入了所制备纯化噬菌体的该培养板在室温静置1小时，由此使噬菌体展示抗体与各孔中存在的生物素标记hIgA-Fc在犬尿氨酸非存在/存在下结合。在经TBST或犬尿氨酸/TBST清洗的各孔中，加入用TBS或犬尿氨酸/TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham PharmaciaBiotech)，将培养板孵育1小时。用TBST或犬尿氨酸/TBST清洗后，向各孔添加TMB single溶液(ZYMED)，各孔中溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450nm的吸光度对该显色进行测定。结果确认到多个在犬尿氨酸存在下与人IgA-Fc结合的抗体。噬菌体ELISA的结果示于表39。
[表39]
来源 实施例(12-1) 实施例(12-2) 实施例(12-3)
淘选次数 4 4 4
ELISA实施克隆数 96 96 96
阳性克隆数(吸光度＞2) 89 90 91
开关克隆数(犬尿氨酸+/-吸光度比＞0.2) 87 90 86
开关克隆序列数 67 69 75
(12-5)抗原结合活性根据犬尿氨酸的有无而变化的开关抗体的序列分析由基于实施例(12-4)所示的噬菌体ELISA的结果判断为在犬尿氨酸存在的条件下具有抗原结合活性的克隆，使用特异性引物(SEQ ID NO：79和80)进行扩增，对所得基因的碱基序列进行分析。根据分析结果可知，在实施例(12-1)、(12-2)和(12-3)的全部条件下，获得了多个判断为在犬尿氨酸存在下具有生物素标记hIgA-Fc结合活性的克隆。在获得的克隆之中，对于挑选的6个克隆，下表40中示出获得的淘选条件(表中，标记为来源)和氨基酸序列。
[表40]
克隆名称 来源 重链序列编号 轻链序列编号
hlAFHm12-4_018 实施例(12-3) SEQ ID NO：114 SEQ ID NO：115
hlAFHm12-4_061 实施例(12-3) SEQ ID NO：116 SEQ ID NO：117
hlAFHm14-4_001 实施例(12-2) SEQ ID NO：118 SEQ ID NO：119
hlAFHm14-4_041 实施例(12-2) SEQ ID NO：120 SEQ ID NO：121
hlAFHm17-4_026 实施例(12-1) SEQ ID NO：122 SEQ ID NO：123
hlAFHm17-4_072 实施例(12-1) SEQ ID NO：124 SEQ ID NO：125
(12-6)与hIgA-Fc结合的抗体的表达和纯化
将实施例(12-5)中记载的6个克隆的重链和轻链的可变区序列分别插入具有重链抗体恒定区(SEQ ID NO：113)或轻链kappa恒定区序列(SEQ ID NO：47)的动物表达用质粒。通过后述参考实施例1中记载的方法实施抗体的表达和纯化。
(12-7)获得的抗体的hIgA-Fc结合活性的评价
将获得的6种抗体在表41所示的条件下供ELISA。
[表41]
抗原 犬尿氨酸 色氨酸
条件1 hIgA-Fc 500uM -
条件2 hlgA-Fc - -
条件3 - 500uM -
条件4 hIgA-Fc - 500uM
首先，将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记hIgA-Fc的100μL的TBS在室温包被1小时以上。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去未与培养板结合的生物素标记hIgA-Fc，然后将该孔用封闭缓冲液(2％脱脂奶粉/TBS)250μL封闭1小时以上。在除去了封闭缓冲液的各孔中，加入在表41条件下用TBS制备为2.5μg/mL的纯化IgG各100μL，将该培养板在室温静置1小时，由此是各IgG与各孔中存在的生物素标记hIgA-Fc结合。在用制备为表41所示的终浓度的TBST进行了清洗的各孔中，添加通过含相同低分子的TBS稀释了的HRP结合抗人IgG抗体(BIOSOURCE)，将培养板孵育1小时。用制备为表41所示的终浓度的TBST进行清洗后，添加了TMB single溶液(ZYMED)的各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，然后通过450nm的吸光度对该显色进行测定。测定结果示于图40。
对于挑选的6种抗体，与条件1的吸光度相比，条件2或条件3的吸光度显著地低。由此确认，所挑选的6种抗体即使是IgG型也在犬尿氨酸存在下对生物素标记hIgA-Fc具有特异性结合活性。另外，与条件4的吸光度相比，条件2的吸光度未观察到显著差异，因而还确认到所挑选的6种抗体不具有色氨酸存在下的生物素标记hIgA-Fc结合活性。以上表明，由利用针对犬尿氨酸的淘选的犬尿氨酸开关抗体获得用文库(犬尿氨酸文库Ver.A)，可以获得多个犬尿氨酸作为开关发挥功能的hIgA-Fc结合抗体。
〔实施例13〕从利用针对犬尿氨酸的淘选的犬尿氨酸开关抗体获得用文库(犬尿氨酸文库Ver.A)获得在犬尿氨酸存在下与人IL-6(hIL-6)结合的抗体
(13-1)从抗体文库获得在犬尿氨酸存在下显示hIL-6结合活性，在犬尿氨酸非存 在下不显示结合的抗体
从实施例9中构建的犬尿氨酸文库Ver.A进行下述抗体的筛选，该抗体在犬尿氨酸存在下显示人IL-6(hIL-6)结合活性。即，回收展示下述抗体的噬菌体，该抗体在犬尿氨酸存在下对捕获于珠上的hIL-6显示结合活性，在犬尿氨酸非存在下的条件下则从珠上洗脱。本获得方法中，使用经生物素标记的hIL-6作为抗原。
使保持所构建的噬菌体展示噬粒载体的大肠杆菌感染M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体(hyperphage))(PROGEN Biotechnik)，在30℃培养一晩，从上清回收噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此得到的沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而制备抗体多价展示噬菌体文库液。接着，在该噬菌体文库液中以终浓度为4％的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
在淘选中，对仅在犬尿氨酸存在下能够与抗原结合的噬菌体进行浓缩。通过与实施例(11-1)所示的方法相同的方法实施直至第4次的淘选。
(13-2)利用阴性选择法从抗体文库获得在犬尿氨酸存在下与hIL-6结合的抗体
从实施例9中构建的犬尿氨酸文库Ver.A进行下述抗体的筛选，该抗体在犬尿氨酸存在的条件下对抗原显示抗原结合活性。为了筛选，首先使抗体噬菌体展示文库在犬尿氨酸非存在下与生物素标记抗原-链霉亲和素接触，除去展示即使在犬尿氨酸非存在下也对抗原具有结合活性的抗体的噬菌体。接着，在犬尿氨酸存在的条件下同样地进行淘选，由此实施在犬尿氨酸存在的条件下对抗原具有结合活性的抗体的筛选。
使保持所构建的噬菌体展示噬粒载体的大肠杆菌感染M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体(hyperphage))(PROGEN Biotechnik)，在30℃培养一晩，从上清回收噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此得到的沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而制备抗体多价展示噬菌体文库液。接着，在该噬菌体文库液中以终浓度为4％的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
在第1次淘选中，利用阴性选择法对仅在犬尿氨酸存在下能够与抗原结合的噬菌体进行浓缩。具体地，对经BSA封闭的中和亲和素包被的Sera-Mag SpeedBeads加入500pmol的生物素化抗原，在室温结合15分钟。对经TBS清洗3次的珠加入以BSA进行了封闭的噬菌体文库液0.5mL，在室温结合1小时。使用磁力架将珠分离，由此回收未与抗原和珠结合的噬菌体。对回收的噬菌体添加250pmol的生物素标记抗原以及终浓度500μM的犬尿氨酸，由此使噬菌体文库在室温与抗原以及犬尿氨酸接触15分钟。然后，使之在4℃接触45分钟。接着，在该标记抗原以及犬尿氨酸与噬菌体文库的混合液中加入经BSA封闭的磁珠，在4℃使抗原和噬菌体的复合体与磁珠结合15分钟。将珠用0.5mL的冰冷的犬尿氨酸/TBST清洗2次，用冰冷的犬尿氨酸/TBS清洗1次。然后，将1mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL加入至该混合液中。将该混合液在室温搅拌15分钟后，由使用磁力架分离的珠回收噬菌体。将回收的噬菌体添加至达到对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x225mm的板上。接着，使接种的大肠杆菌的培养液感染超级噬菌体，从在30℃培养一晩的上清回收噬菌体，由此制备抗体多价展示噬菌体文库液。
在第2次以后的淘选中，对仅在犬尿氨酸存在下能够与抗原结合的噬菌体进行浓缩。具体地，通过与实施例(11-1)所示的第2次以后的淘选方法相同的方法，实施直至第4次淘选。
(13-3)利用针对开关分子的淘选从抗体文库获得在犬尿氨酸存在下与hIL-6结合 的抗体
从实施例9中构建的犬尿氨酸文库Ver.A进行下述抗体的筛选，该抗体在犬尿氨酸存在的条件下对抗原显示抗原结合活性。为了筛选，首先针对生物素化犬尿氨酸(化合物028、029和036)进行淘选，回收展示具有犬尿氨酸结合活性的抗体的噬菌体。接着，在犬尿氨酸存在下进行针对生物素标记抗原的淘选，由此实施在犬尿氨酸存在的条件下对抗原具有结合活性的抗体的筛选。
使保持所构建的噬菌体展示噬粒载体的大肠杆菌感染M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体(hyperphage))(PROGEN Biotechnik)，在30℃培养一晩，从上清回收噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此得到的沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而制备抗体多价展示噬菌体文库液。接着，在该噬菌体文库液中以终浓度为4％的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
在第1次淘选中，对能够与生物素化犬尿氨酸(化合物028、029和036的混合物)结合的噬菌体进行浓缩。具体地，对经BSA封闭的珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)加入将化合物028、029和036各自等量混合得到的生物素化犬尿氨酸混合物4000pmol，在室温结合30分钟。对经TBS清洗3次的珠加入以BSA进行了封闭的噬菌体文库液0.8mL，使之在室温与生物素化犬尿氨酸接触30分钟。然后，在4℃接触30分钟。将珠用1mL的冰冷TBST清洗3次，用冰冷的TBS清洗2次。然后，将1mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL加入该混合液。将该混合液在室温悬浮15分钟后，立即由使用磁力架分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体添加至达到对数生长期(OD600为0.4-0.7)的100mL大肠杆菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mmx225mm的5块板上。接着，使接种的大肠杆菌的培养液感染超级噬菌体，从在30℃培养一晚的上清回收噬菌体，由此制备抗体多价展示噬菌体文库液。
在第2次以后的淘选中，对仅在犬尿氨酸存在下能够与抗原结合的噬菌体进行浓缩。具体地，通过与实施例(11-1)所示的第2次以后的淘选方法相同的方法，实施直至第4次淘选。
(13-4)通过噬菌体ELISA评价犬尿氨酸存在下的结合活性由(13-1)、(13-2)、(13-3)中所得的大肠杆菌的单菌落，按照常法(Methods Mol.Biol.(2002)178，133-145)进行噬菌体的培养。通过使用超级噬菌体作为辅助噬菌体，回收含有抗体多价展示噬菌体的培养上清。通过参考实施例(11-4)中记载的方法纯化的纯化噬菌体按照下述步骤供ELISA。将链霉亲和素包被的384孔微板(Greiner Bio-One)用含有生物素标记hIL-6的10μL的TBS包被1小时以上。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去未与培养板结合的生物素标记hIL-6，然后将该孔用80μL的2％脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2％脱脂奶粉-TBS，然后，将各孔中加入了所制备纯化噬菌体的该培养板在室温静置1小时，由此使噬菌体展示抗体与各孔中存在的生物素标记hIL-6在犬尿氨酸非存在/存在下结合。在经TBST或犬尿氨酸/TBST清洗的各孔中，加入用TBS或犬尿氨酸/TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham PharmaciaBiotech)，将培养板孵育1小时。用TBST或犬尿氨酸/TBST清洗后，向各孔添加TMB single溶液(ZYMED)，各孔中溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，通过450nm的吸光度对该显色进行测定。结果确认到多个在犬尿氨酸存在下与hIL-6结合的抗体。噬菌体ELISA的结果示于表42。
[表42]
来源 实施例(13-1) 实施例(13-2) 实施例(13-3)
淘选次数 4 4 4
ELISA实施克隆数 96 96 96
阳性克隆数(吸光度＞0.2) 65 59 54
开关克隆数(犬尿氨酸+/-吸光度比＞2) 61 58 48
开关克隆序列数 42 37 44
(13-5)抗原结合活性根据犬尿氨酸的有无而变化的开关抗体的序列分析由基于实施例(13-4)所示的噬菌体ELISA的结果判断为在犬尿氨酸存在的条件下具有抗原结合活性的克隆，使用特异性引物(SEQ ID NO：79和80)进行扩增，对所得基因的碱基序列进行分析。根据分析结果可知，在实施例(13-1)、(13-2)或(13-3)的全部条件下，获得了多个判断为在犬尿氨酸存在下具有生物素标记hIL-6结合活性的克隆。在获得的克隆之中，对于挑选的6个克隆，下表43中示出获得的淘选条件(表中，标记为来源)和氨基酸序列。
[表43]
克隆名称 来源 重链序列编号 轻链序列编号
6FHm12-4_068 实施例(13-3) SEQ ID NO：126 SEQ ID NO：127
6FHm12-4_094 实施例(13-3) SEQ ID NO：128 SEQ ID NO：129
6FHm14-4_007 实施例(13-2) SEQ ID NO：130 SEQ ID NO：131
6FHm14-4_030 实施例(13-2) SEQ ID NO：132 SEQ ID NO：133
6FHm17-4_016 实施例(13-1) SEQ ID NO：134 SEQ ID NO：135
6FHm17-4_036 实施例(13-1) SEQ ID NO：136 SEQ ID NO：137
(13-6)与hIL-6结合的抗体的表达和纯化
将实施例(13-5)中记载的6个克隆的重链和轻链的可变区序列分别插入具有重链抗体恒定区(SEQ ID NO：113)或轻链kappa恒定区序列(SEQ ID NO：47)的动物表达用质粒。通过后述参考实施例1中记载的方法实施抗体的表达和纯化。
(13-7)获得的抗体的hIL-6结合活性的评价
将获得的6种抗体在表44所示的条件下供ELISA。
[表44]
抗原 犬尿氨酸 色氨酸
条件1 hIL-6 500uM -
条件2 hIL-6 - -
条件3 - 500uM -
条件4 hIL-6 - 500uM
首先，将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记hIL-6的100μL的TBS在室温包被1小时以上。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去未与培养板结合的生物素标记hIL-6，然后将该孔用封闭缓冲液(2％脱脂奶粉/TBS)250μL封闭1小时以上。在除去了封闭缓冲液的各孔中，加入在表44的条件下用TBS制备为2.5μg/mL的纯化IgG各100μL，将该培养板在室温静置1小时，由此是各IgG与各孔中存在的生物素标记hIL-6结合。在用制备为表44所示的终浓度的TBST进行了清洗的各孔中，添加通过含相同低分子的TBS稀释了的HRP结合抗人IgG抗体(BIOSOURCE)，将培养板孵育1小时。用制备为表44所示的终浓度的TBST进行清洗后，添加了TMB single溶液(ZYMED)的各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸终止后，然后通过450nm的吸光度对该显色进行测定。测定结果示于图41。
对于挑选的6种抗体，与条件1的吸光度相比，条件2或条件3的吸光度显著地低。由此确认，所挑选的6种抗体即使是IgG型也在犬尿氨酸存在下对生物素标记hIL-6具有特异性结合活性。另外，与条件4的吸光度相比，条件2的吸光度未观察到显著差异，因而还确认到所挑选的6种抗体不具有色氨酸存在下的生物素标记hIL-6结合活性。以上表明，由利用针对犬尿氨酸的淘选的犬尿氨酸开关抗体获得用文库(犬尿氨酸文库Ver.A)，可以获得多个犬尿氨酸作为开关发挥功能的hIL-6结合抗体。
[参考实施例1]从使用噬菌体展示技术的人抗体文库获得与腺苷和/或ATP结合的抗体
(1-1)天然人抗体噬菌体展示文库的制作
以由人PBMC制作的Poly A RNA、市售的人Poly A RNA等为模板，依照本领域技术人员公知的方法，构建了由展示彼此不同的人抗体序列的Fab结构域的多个噬菌体组成的人抗体噬菌体展示文库。
(1-2)通过珠淘选由文库获得与腺苷和/或ATP结合的抗体
由参考实施例(1-1)中构建的天然人抗体噬菌体展示文库，进行显示抗原结合活性的抗体的筛选。即，收集展示抗体的噬菌体，该抗体对捕获于珠上的抗原显示结合活性。作为抗原，使用ATP-PEG-生物素、2'-腺苷-PEG-生物素、和5'-腺苷-PEG-生物素。ATP-PEG-生物素购入并使用了Jena Bioscience社、目录编号NU-926-BIO。2'-腺苷-PEG-生物素、和5'-腺苷-PEG-生物素使用了实施例(2-2-11)中构建的那些。
由保持有构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生的噬菌体通过通常的方法纯化。然后得到经TBS透析处理的噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中以终浓度达到4％的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads M-280Streptavidin)。
然后，加入所制备的噬菌体文库液与250pmol的生物素化ATP、2'-腺苷-PEG-生物素、和5'-腺苷-PEG-生物素，由此使该噬菌体文库液与腺苷和ATP在室温接触60分钟。接着在噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使腺苷和/或ATP与噬菌体的复合体和磁珠在室温结合15分钟。将珠用TBS清洗1次。然后，加入有1mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL的珠在室温下悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
在第2次淘选中，进行能够与腺苷和/或ATP结合的噬菌体的浓缩。在所得噬菌体文库液中加入各50pmol的生物素化ATP、2'-腺苷-PEG-生物素、和5'-腺苷-PEG-生物素，由此使该噬菌体文库液与腺苷和ATP在室温接触60分钟。接着在噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使腺苷和/或ATP与噬菌体的复合体和磁珠在室温结合15分钟。将珠用TBST清洗3次、用TBS清洗2次。然后，加入有1mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL的珠在室温下悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
以相同的步骤重复3次获得能够与腺苷和/或ATP结合的抗体的淘选。第4次淘选中，TBST、TBS均实施5次清洗。
(1-3)通过噬菌体ELISA评价腺苷和ATP结合性
由利用上述实施例中所示的淘选法得到的大肠杆菌的单菌落，依照常法(MethodMol.Biol.(2002)178,133-145)回收含有噬菌体的培养上清。使用NucleoFast 96(MACHERY-NAGEL)对回收的培养上清进行超滤。将培养上清各100μL添加于NucleoFast 96的各孔中，进行4500g,45分钟离心分离，除去穿流物。加入H2O 100μL，再次通过4500g,30分钟离心分离进行清洗。然后，加入TBS 100μL，在室温静置5分钟，然后回收上清中所含的噬菌体液。
将加入有TBS的纯化噬菌体通过下述步骤供ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记抗原(将2'-腺苷-PEG-生物素、5'-腺苷-PEG-生物素、和ATP-PEG-生物素分别等量混合)的100μL的TBS在室温包被1小时。将该培养板的各孔用TBST(含0.1％Tween20的TBS)清洗，由此除去抗原后，将该孔用250μL的2％脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2％脱脂奶粉-TBS，然后在各孔中加入所制备的纯化噬菌体，将该培养板在室温静置1小时，由此使展示抗体的噬菌体与各孔中存在的抗原结合。在经TBST清洗的各孔中，加入用TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)，将培养板孵育1小时。用TBST清洗后，添加TMB single溶液(ZYMED)，各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸而终止后，通过450nm的吸光度来测定该显色。
从实施了噬菌体ELISA的192个克隆中，获得对2'-腺苷-PEG-生物素、5'-腺苷-PEG-生物素、ATP-PEG-生物素中的任一者、任意2者、或者3者全部具有结合能力的106个克隆。
接着，为了确认这些克隆对2'-腺苷-PEG-生物素,5'-腺苷-PEG-生物素,ATP-PEG-生物素中的何种抗原具有结合能力，将相同纯化噬菌体用TBS稀释后，通过下述步骤供ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记抗原(2'-腺苷-PEG-生物素,5'-腺苷-PEG-生物素,ATP-PEG-生物素中的任一者)的100μL的TBS在室温包被1小时。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去抗原后，将该孔用250μL的2％脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2％脱脂奶粉-TBS，然后在各孔中加入所制备的纯化噬菌体，将该培养板在室温静置1小时，由此使展示抗体的噬菌体与各孔中存在的抗原结合。在经TBST清洗的各孔中，加入用TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)，将培养板孵育1小时。用TBST清洗后，添加TMB single溶液(ZYMED)，各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸而终止后，通过450nm的吸光度来测定该显色。噬菌体ELISA的结果记载于下表45中。
[表45]
Figure BDA0002407382280002221
在实施了噬菌体ELISA的克隆中，确认到与二种以上抗原结合的是1个克隆，以本抗体片段作为模板，进行基因的碱基序列分析。本克隆是对5'-腺苷-PEG-生物素,ATP-PEG-生物素这二者具有结合能力的克隆，命名为ATNLSA1-4_D12。ATNLSA1-4_D12抗体的重链可变区的序列记载于SEQ ID NO:48，和轻链可变区的序列记载于SEQ ID NO:49。
(1-4)通过噬菌体竞争ELISA评价腺苷或者ATP结合性
噬菌体ELISA的结果判断为具有与5'-腺苷-PEG-生物素和ATP-生物素这两者结合的能力的克隆ATNLSA1-4_D12(重链可变区序列：SEQ ID NO:48，轻链序列：SEQ ID NO:49)，在5'-腺苷-PEG-生物素,ATP-PEG-生物素的结构上来说，残留有识别生物素标签或PEG区的可能性。因此，为了表明并非识别生物素标签或PEG的抗体，使用ATNLSA1-4_D12和作为阴性对照准备的hIL-6R结合克隆PF1(重链序列：SEQ ID NO:50，轻链序列：SEQ ID NO:51)，通过噬菌体ELISA确认与抗原的结合是否会被腺苷或者ATP所抑制。ATNLSA1-4_D12和PF1分别用TBS稀释，通过下述步骤供ELISA。
将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记抗原(5'-腺苷-PEG-生物素,ATP-PEG-生物素的混合)的100μL的TBS在室温包被1小时。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去抗原后，将该孔用250μL的2％脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2％脱脂奶粉-TBS，然后在各孔中加入所制备的纯化噬菌体，将该培养板在室温静置1小时，由此使噬菌体展示的抗体与各孔中存在的抗原结合。接着，在该孔中加入不含抗原、以及含有抗原与等量直至10,000倍量的ATP稀释系列的TBS。通过将该培养板在室温静置1小时，使固定的抗原与ATP竞争。然后，在经TBST清洗的各孔中，加入用TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)，将培养板孵育1小时。用TBST清洗后，添加TMB single溶液(ZYMED)，各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸而终止后，通过450nm的吸光度来测定该显色。
测定结果示于图42。确认到随着ATP浓度的变高，ATNLSA1-4_D12在过量ATP存在下显色值变小，确认到ATNLSA1-4_D12与抗原的结合ATP浓度依赖性地受到抑制。另外，对于作为阴性对照进行了比较实验的PF1，与ATP浓度无关，并未确认到与抗原的结合。由此确认，ATNLSA1-4_D12是具有ATP结合能力的抗体，并非识别生物素标签或PEG的抗体。
(1-5)与ATP和腺苷结合的抗体的表达和纯化
将编码ATNLSA1-4_D12的可变区的基因插入人IgG1/Lambda的动物表达用质粒。使用以下方法表达抗体。对于在FreeStyle 293Expression Medium培养基(Invitrogen)中以1.33x 106细胞/mL的细胞密度进行悬浮，并在六孔板的各孔中分别接种了3mL的来源于人胚肾细胞的FreeStyle 293-F株(Invitrogen)，通过脂质体转染法导入制备的质粒。从在CO2培养箱(37℃、8％CO2,90rpm)培养了4天的培养上清，使用rProtein A SepharoseTMFast Flow(Amersham Biosciences)以本领域技术人员公知的方法纯化抗体。使用分光光度计，测定纯化的抗体溶液在280nm下的吸光度。根据所得的测定值，使用以PACE法算出的吸光系数来算出纯化的抗体的浓度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(1-6)使用表面等离子共振评价ATP、腺苷结合抗体的ATP、腺苷结合
使用Biacore T200(GE Healthcare)，分析具有ATP和腺苷结合活性的克隆ATNLSA1-4_D12的可变区与IgG的恒定区连接了的D12的抗原抗体反应的相互作用。在用胺偶联法固定了适当量的protein A(Life technologies)的传感器芯片CM5或CM4(GEHealthcare)上捕获目标抗体，使之与作为抗原的ATP(Wako)、腺苷(Wako)、ADP(二磷酸腺苷)(Wako)相互作用。流动缓冲液使用50mM Tris-HCl(Takara,T903),500mM NaCl,0.01％(w/v)Tween20。使抗原以流速30μL/min相互作用30秒钟，解离30秒钟。与抗原的相互作用在15℃下进行测定，抗原的稀释使用与流动缓冲液相同的缓冲液。
由测定所得的传感图算出作为动力学参数的结合速度常数ka(1/Ms)、和解离速度常数kd(1/s)，基于它们算出解离常数KD(M)。或使用稳态分析法(Steady stateanalysis)，算出解离常数KD(M)。各参数的计算中使用了Biacore T200 EvaluationSoftware(GE Healthcare)。
为了算出相对于腺苷的KD，在20μmol/L ADP存在下和非存在下获得各浓度的腺苷存在下的结合应答，另外获得在20μmol/L ADP存在下的结合应答。将推测为非特异性结合成分的、从ADP存在下的对各浓度的腺苷的结合应答中减去ADP单独存在下的应答而得的值，从ADP非存在下的对腺苷的结合应答的值中减去，由此获得对腺苷的特异性结合的应答(R)。以腺苷浓度为X轴，以通过式2算出的R为Y轴进行描点得到曲线，使用OfficeExcel2007(Microsoft)的Solver函数对该曲线适用最小二乘法，由此确定相对于腺苷的KD值。
(式2)
R＝Rmax×conc/(KD+conc)
式2中，conc意指腺苷浓度(mol/L)，Rmax意指腺苷与抗体最大结合时所期待的应答值。实测应答值的提取使用Scrubber2(BioLogics.Inc)。
该测定中获得的D12相对于ATP的KD是8.5μmol/L、相对于ADP的KD是0.25μmol/L、相对于腺苷的KD是1100μmol/。由此认为D12对ATP、ADP、腺苷具有结合活性，而且对于AMP(单磷酸腺苷)和cAMP(环单磷酸腺苷)也具有结合活性。
〔参考实施例2〕利用抗ATP/腺苷抗体的ATP/腺苷开关抗体获得用文库的设计已知在癌组织和炎性组织中，不仅腺苷而且ATP的浓度也高。因此，不仅只将腺苷或ATP中的任一者用作开关的抗体，而且可以将腺苷和ATP两者(本实施例中记载为ATP/腺苷)用作开关的抗体(即只要腺苷或ATP任一以高浓度存在则能够与抗原结合的抗体)也是有用的。参考实施例1-4中所示的ATNLSA1-4_D12是与ATP/腺苷结合的抗体，对于该抗体，如图43所示，认为ATP/腺苷夹在抗体和靶抗原之间，因此包含与靶抗原接触的抗体可变区。因此认为，通过将能够如此与靶抗原接触并能够保持与ATP/腺苷的结合的抗体可变区部分文库化，可以制作合成抗体文库，该文库可以获得ATP/腺苷开关抗体，该抗体对任意抗原的任意抗原结合活性根据ATP/腺苷的有无而变化。
对在参考实施例1-4由人抗体文库获得的ATP/腺苷抗体ATNLSA1-4_D12与ATP的复合体的晶体结构进行分析。根据晶体结构分析的结果，鉴定了该抗体识别腺苷(和ATP)的识别模式、以及预计不高度参与腺苷(和ATP)结合的抗体可变区的氨基酸残基。主要参与腺苷(ATP)结合的氨基酸残基被鉴定为重链中的Ser52、Ser52a、Arg53、Gly96、Leu100a、Trp100c(Kabat编号)。
设计文库时，满足以下条件中的至少一个的位点被选定作为能够文库化的位点。
条件1)不高度参与对ATP的结合的位点、或即使参与结合也不使ATP结合降低的天然序列以外的氨基酸所存在的位点；
条件2)作为人抗体谱具有某种程度氨基酸出现频率的多样性的位点；
条件3)对于经典结构的形成不重要的位点。
重链、轻链均满足上述条件的ATNLSA1-4_D12的序列所含的位点中，关于CDR1和CDR2的位点将种系中的出现频率为2％以上的氨基酸、关于CDR3的位点将种系中的出现频率为1％以上的氨基酸全面地替换，制作组合了这些替换的多个ATNLSA1-4_D12的改变体。
重链的位点中被改变的位点(表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点)以及该位点的改变前的氨基酸(表中记载为“天然序列”的氨基酸)和改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”的氨基酸)示于表46。
[表46]
Figure BDA0002407382280002261
轻链的位点中被改变的位点(表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点)以及该位点的改变前的氨基酸(表中，记载为“天然序列”的氨基酸)和改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”的氨基酸)示于表47。
[表47]
Figure BDA0002407382280002262
通过参考实施例1-1所示的方法表达和纯化的各改变体与ATP和腺苷的结合通过与实施例1-6中所示的使用Biacore的测定方法相同的方法进行测定。测定的结果，各改变体与ATP的亲和力以KD值的形式算出。将作为重链的位点的通过改变不会使ATP结合能力低于ATNLSA1-4_D12的1/5的结合能力的那些(即KD值小于42.5μmol/L的那些)、和作为轻链的位点的高于ATNLSA1-4_D12的结合能力的那些(即KD值小于8.5μmol/L的那些)判定为可改变的位点，在该位点处被替换的氨基酸被判定为可以文库化的氨基酸(文库中出现的柔性残基)。
根据各改变体的ATP结合能力的评价结果，预期通过将各位点文库化而降低ATP结合能力。因此，对推测参与ATP结合的位点的附近位点进行替换，通过全面地评价组合了这些替换的各种改变体，验证是否可以鉴定预期增强ATP结合能力的效果的改变。如此被改变的位点(表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点)以及该位点的改变前的氨基酸(表中，记载为“天然序列”的氨基酸)和改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”的氨基酸)示于表48。
[表48]
Figure BDA0002407382280002271
通过参考实施例1-1所示的方法表达和纯化的各改变体与ATP和腺苷的结合通过与实施例1-6中所示的使用Biacore的测定方法相同的方法进行测定。测定的结果，预期与ATP和腺苷的结合增强的改变判定为Kabat编号所示的56位、100位等位点(例如Tyr56His、Asn100bLeu等氨基酸的改变)，在该位点处被替换的氨基酸也被判定为可文库化的氨基酸(文库中出现的柔性残基)。
对ATNLSA1-4_D12的CDR的位点中，包含根据前述改变体的分析选出的可文库化的氨基酸(文库中出现的氨基酸柔性残基)与该氨基酸的改变前的氨基酸(即，ATNLSA1-4_D12的天然序列所含的氨基酸)的氨基酸组成成分以及包含该组成成分的位点进行设计，构建ATP/腺苷开关抗体获得用的文库。以氨基酸组成成分所含的各氨基酸的出现频率相等的方式(例如，氨基酸组成成分为10种时，以各氨基酸分别10％出现的方式)构建文库。
包含重链中的氨基酸组成成分的位点(表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点)以及该位点处的氨基酸组成成分示于表49。包含轻链中的氨基酸组成成分的位点(表中，记载为“Kabat”的Kabat编号所示的位点)以及该位点处的氨基酸组成成分示于表50。
[表49]
Figure BDA0002407382280002281
[表50]
Figure BDA0002407382280002291
根据序列分析的结果，推测ATNLSA1-4_D12的框架来源于VH3-21种系。因此，出于提高抗体稳定性的目的，为了将ATNLSA1-4_D12的框架序列恢复至VH3-21种系序列，而将Gln01Glu、Gln05Val、Asp10Gly、Asn30Ser、Leu48Val、Asn58Tyr(数字表示Kabat编号)的改变导入ATNLSA1-4_D12的框架序列。通过参考实施例1-1所示的方法表达和纯化的ATNLSA1-4_D12的改变体的Tm利用DSC进行测定。利用DSC的测定通过本领域技术人员公知方法实施。添加了这些改变的ATNLSA1-4_D12的改变体的Tm由74.37℃大幅上升至81.44℃，确认到其结构的稳定化。作为抗体文库，由于有时优选使用稳定性高的框架，因而添加了前述改变的框架序列可用作文库的框架序列。文库所用的框架示于表51。
[表51]
框架 序列编号 序列
重链框架1 52 EVQLVESGGDLVKPGGGLRLSCAASGFTFS
重链框架2 53 WVRQAPGKGLEWVS
重链框架3 54 RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
重链框架4 55 WGQGTLVTVSS
轻链框架1 56 QSALTQPPSASGSPGQTVTISC
轻链框架2 57 WYQQHPGKAPKLMIY
轻链框架3 58 GVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYFC
轻链框架4 59 FGGGTKLTVL
合成包含这样设计的文库中所含的各序列的基因(DNA2.0)，将这些各种基因的集合体(文库)用作模板，通过可分别扩增VH和VL的引物来扩增基因文库。另外，VL扩增用引物的序列记载于SEQ ID NO:81和82，VH扩增用引物的序列记载于SEQ ID NO:83和84。将扩增得到的合理设计人抗体重链可变区的基因文库和人抗体轻链可变区的基因文库导入具有来源于人IgG的CH1序列和来源于人IgG的轻链恒定区序列这两者的合适的噬粒载体。将该噬粒载体通过电穿孔法导入大肠杆菌，从而构建合理设计文库，其展示包含人抗体可变区-恒定区的Fab结构域、且可获得能够以腺苷或ATP为开关而与抗原结合的抗体。如此由多样的具有腺苷或ATP结合活性的H链和L链构成的合理设计文库被认为可用作包含人抗体的文库，其中，如图43所示，腺苷或ATP夹在抗体与抗原之间，且可以效率良好地获得针对任意抗原的ATP/腺苷开关抗体。此外，如上所述ATNLSA1-4_D12不仅与腺苷和ATP结合，还与ADP结合，因而预测对于和ATP、ADP及腺苷的结构类似的AMP和cAM也具有结合活性。因此，认为本文库可用于获得对任意靶抗原的结合活性根据ATP、ADP、AMP、cAMP、或腺苷中的任一者以上的低分子的有无而变化的开关抗体。
〔参考实施例3〕使用噬菌体展示技术从抗体文库获得在腺苷、ATP存在下与抗原结合的抗体
(3-1)利用腺苷和ATP的混合物从文库获得在低分子存在下与抗原结合的抗体
从所构建的合理设计抗体噬菌体展示文库，获得在腺苷和/或ATP存在条件下显示抗原结合活性的抗体。为了获得，回收展示在腺苷和ATP存在下对捕获于珠上的抗原表现出结合能力的抗体的噬菌体，然后从在腺苷和ATP的非存在条件下从珠洗脱出的洗脱液中回收噬菌体。
由保持构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，在该噬菌体文库液中以终浓度为4％的方式添加BSA。实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-MagSpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads M-280Streptavidin)。作为抗原，使用经生物素化的人IL-6受体。
在制备的噬菌体文库液中加入500pmol的生物素标记抗原、以及各终浓度1mM的ATP-Na和腺苷，由此使该噬菌体文库液在室温与抗原和腺苷、以及ATP接触60分钟。接着，在该噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用溶解有ATP和腺苷的TBS清洗1次。然后，将加入有1mg/mL的胰蛋白酶0.5mL的珠在室温悬浮15分钟后，立即由使用磁力架分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
在第1次淘选中，进行能够在腺苷和ATP存在下与抗原结合的噬菌体的回收，在第2次以后的淘选中，进行能够在仅腺苷和ATP存在下与抗原结合的噬菌体的浓缩。具体地，在制备的噬菌体文库液中加入40pmol的生物素标记抗原以及各终浓度1mM的腺苷和ATP，由此使噬菌体文库在室温与抗原以及腺苷和ATP接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用1mL的溶解有腺苷和ATP的TBST(以下，称为(腺苷+ATP)/TBST)以及溶解有腺苷、腺苷和ATP的TBS(以下，称为(腺苷+ATP)/TBS)进行清洗。然后将加入有0.5mL的TBS的珠在室温悬浮后，立即由使用磁力架分离的珠回收噬菌体溶液。再次重复该操作后，将分2次洗脱出的噬菌体液混合。在回收的噬菌体溶液中加入100mg/mL的胰蛋白酶5μL，由此将不展示Fab的噬菌体的pIII蛋白(来源于辅助噬菌体的pIII蛋白)切断，使得不展示Fab的噬菌体对大肠杆菌的感染能力丧失。将从经胰蛋白酶处理的噬菌体溶液中回收的噬菌体添加至达到对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此回收噬菌体文库液。将获得在腺苷和ATP存在下具有抗原结合活性的抗体的淘选重复3次。
(3-2)利用阴性选择法从抗体文库获得在腺苷、ATP存在下与抗原结合的抗体从合理设计抗体噬菌体展示文库，进行在腺苷和/或ATP存在的条件下对抗原显示抗原结合活性的抗体的筛选。为了筛选，首先使抗体噬菌体展示文库在腺苷和ATP非存在下与生物素标记抗原-链酶亲和素接触，除去展示即使在腺苷和ATP非存在下也对抗原具有结合活性的抗体的噬菌体。接着，在腺苷和ATP存在的条件下同样地进行淘选，由此实施在腺苷和ATP存在的条件下对抗原具有结合活性的抗体的筛选。
由保持有构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中以终浓度达到4％的方式添加BSA。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads M-280Streptavidin)，实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。
在制备的噬菌体文库液中加入250pmol的生物素标记抗原、以及各终浓度为1mM的腺苷和ATP的混合液，由此使该噬菌体文库液与抗原以及腺苷和ATP在室温接触60分钟。接着，在噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用(腺苷+ATP)/TBS清洗1次。然后，加入有1mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL的珠在室温下悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。接着，使接种的大肠杆菌的培养液感染辅助噬菌体M13KO7(タカラバイオ)、或M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体)(PROGEN Biotechnik)，通过从30℃培养一晩的上清回收噬菌体，分别制备抗体一价展示噬菌体文库和抗体多价展示噬菌体文库液。
在第1次淘选中，进行能够在腺苷和ATP存在下结合的噬菌体的回收，在第2次以后的淘选中，进行能够在仅腺苷和ATP存在下与抗原结合的噬菌体的浓缩。具体地，对经BSA封闭的Sera-Mag中和亲和素珠加入250pmol生物素化抗原，在室温结合15分钟。对经TBS清洗3次的珠加入以BSA进行了封闭的噬菌体文库液，在室温结合1小时。使用磁力架将珠分离，由此回收未与抗原和珠结合的噬菌体。对回收的噬菌体添加40pmol的生物素标记抗原以及各终浓度1mM的腺苷和ATP，由此使噬菌体文库在室温与抗原以及腺苷和ATP接触60分钟。接着，在该标记抗原以及腺苷和ATP与噬菌体文库的混合液中加入用BSA封闭的磁珠，在室温使抗原与噬菌体的复合体和磁珠结合15分钟。将珠用1mL的(腺苷+ATP)/TBST与(腺苷+ATP)/TBS进行清洗。然后，将1mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL加入至该混合液中。将该混合液在室温搅拌20分钟后，由使用磁力架分离的珠回收噬菌体。将回收的噬菌体添加至达到对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。将获得在腺苷和ATP存在的条件下具有抗原结合活性的抗体的淘选重复3次。
(3-3)通过噬菌体ELISA评价腺苷和/或ATP的存在下和非存在下的结合活性由根据上述方法所得的大肠杆菌的单菌落，依照常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)回收含有噬菌体的培养上清。使用NucleoFast 96(MACHEREY-NAGEL)，对回收的培养上清进行超滤。对各孔中添加有培养上清各100μL的NucleoFast 96进行离心分离(4,500g、45分钟)，由此除去穿流物。将各孔中加入有100μl的H2O的该NucleoFast 96再次进行离心分离(4，500g、30分钟)，由此进行清洗。最后加入TBS 100μL，回收在室温静置5分钟的该NucleoFast 96的各孔的上清中所含的噬菌体液。
加入有TBS、或(腺苷+ATP)/TBS的纯化噬菌体通过下述步骤供ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记抗原的100μL TBS包被一晚。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去抗原，然后将该孔用250μL的2％SkimMilk-TBS封闭1小时以上。除去2％SkimMilk-TBS，然后，将各孔中加入了所制备纯化噬菌体的该培养板在37℃静置1小时，由此使展示抗体的噬菌体与各孔中存在的抗原在腺苷和/或ATP的非存在下和存在下结合。在经TBST或(腺苷+ATP)/TBST清洗的各孔中，加入用TBS或(腺苷+ATP)/TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)，将培养板孵育1小时。用TBST或(腺苷+ATP)/TBST清洗后，添加了TMB single溶液(ZYMED)的各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸终止，然后通过450nm的吸光度对该显色进行测定。结果确认到多个在ATP或腺苷存在下与人IL-6受体结合的抗体。噬菌体ELISA的结果示于表52。
[表52]
淘选次数 3 4
ELISA实施克隆数 96 96
阳性克隆数(S/N比＞10) 23 64
开关克隆数(SM+/-比＞2) 22 64
开关克隆序列数 17 35
(3-4)抗原结合活性根据腺苷和ATP的有无而变化的开关抗体的序列分析由基于参考实施例(3-3)所示的噬菌体ELISA的结果判断为在腺苷或ATP存在的条件下具有抗原结合活性的克隆，使用特异性引物(SEQ ID NO：79和80)进行扩增，对所得基因的碱基序列进行分析。分析的结果是，获得了被判断为在ATP或腺苷存在下具有生物素标记hIL-6R结合活性的克隆6RAD2C1-4_001、6RAD2C1-4_005、6RAD2C1-4_011、6RAD2C1-4_026、6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_042、6RAD2C1-4_076、6RDL3C1-4_085、6RDL3C5-4_011(表53)。
[表53]
克隆名称 重链序列编号 轻链序列编号
6RAD2C1-4_001 SEQ ID N0：60 SEQ ID NO：61
6RAD2C1-4O005 SEQ ID NO：62 SEQ ID NO：63
6RAD2C1-4_011 SEQ ID NO：64 SEQ ID NO：65
6RAD2C1-4_026 SEQ ID NO：66 SEQ ID NO：67
6RAD2C1-4_030 SEQ ID NO：68 SEQ ID NO：69
6RAD2C1-4_042 SEQ ID NO：70 SEQ ID NO：71
6RAD2C1-4_076 SEQ ID NO：72 SEQ ID NO：73
6RDL3C1-4_085 SEQ ID NO：74 SEQ ID NO：75
6RDL3C5-4_011 SEQ ID NO：76 SEQ ID NO：77
〔参考实施例4〕使用噬菌体展示技术从抗体文库获得在腺苷、ATP非存在下与抗原结合的抗体
(4-1)利用腺苷和ATP的混合物从文库获得在低分子存在下抗原结合受到抑制的 抗体
在上述参考实施例3中，获得在作为开关的低分子的存在下与靶抗原结合的抗体。在本参考实施例中，尝试获得在低分子非存在下与靶抗原结合的抗体。
从参考实施例2中所构建的合理设计抗体噬菌体展示文库，获得在腺苷和/或ATP非存在条件下对抗原显示抗原结合活性，并且结合能力在它们的存在下减弱的抗体。为了获得，首先使抗体噬菌体展示文库与生物素化腺苷和生物素化ATP接触，回收与腺苷和/或ATP结合的抗体噬菌体展示文库。接着，使该抗体噬菌体展示文库在腺苷和ATP非存在条件下与生物素化抗原-链霉亲和素接触，回收在腺苷和ATP非存在下与抗原结合的抗体。通过交替地进行这样的淘选，筛选对腺苷和/或ATP、以及抗原这两者均具有结合活性的抗体。期待具有这种性质的抗体在腺苷和ATP存在下，通过腺苷和/或ATP与抗体的结合，使得抗体与抗原的结合被抑制。
由保持参考实施例2中所构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中以终浓度达到4％的方式添加BSA。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads M-280Streptavidin)，实施使用固定于磁珠的抗原的淘选。
在所制备的噬菌体文库液中加入500pmol的生物素化ATP、2′-腺苷-PEG-生物素、和5′-腺苷-PEG-生物素，由此使该噬菌体文库液与腺苷和ATP在室温接触60分钟。接着在噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使腺苷和/或ATP与噬菌体的复合体和磁珠在室温结合15分钟。将珠用TBS清洗1次。然后，加入1mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL。将珠在室温悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
在第2次淘选中，进行可在腺苷和ATP非存在的条件下与生物素化抗原结合的噬菌体的浓缩。具体地，在制备的噬菌体文库液中加入250pmol的生物素化抗原，由此使该噬菌体文库液与抗原在室温接触60分钟。接着，在噬菌体文库液中加入经BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用TBST清洗2次，用TBS清洗1次。然后，加入有1mg/mL的胰蛋白酶溶液0.5mL的珠在室温下悬浮15分钟后，立即由使用磁力架进行了分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
之后，在第奇数次淘选中，通过与第1次淘选相同的条件重复实施淘选。其中，利用TBST和TBS的珠的清洗分别增加至3次、2次来实施。
之后，在第偶数次淘选中，通过与第2次淘选相同的条件重复实施淘选。其中，在第4次以后的淘选中，将生物素化抗原减少至40pmol，将利用TBST和TBS的珠的清洗分别增加至3次、2次来实施。
(4-2)通过噬菌体ELISA评价低分子存在下的结合活性
由根据上述方法所得的大肠杆菌的单菌落，依照常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)回收含有噬菌体的培养上清。回收的培养上清使用NucleoFast 96(MACHEREY-NAGEL)进行超滤。对各孔中添加有培养上清各100μL的NucleoFast 96进行离心分离(4,500g,45分钟)，由此除去穿流物(flow-through)。将各孔中加入有100μL的H2O的该NucleoFast 96再次进行离心分离(4,500g,30分钟离心)，由此进行清洗。最后加入TBS 100μL，回收在室温静置5分钟的该NucleoFast 96的各孔的上清中所含的噬菌体液。
加入有TBS、或ATP和腺苷/TBS的纯化噬菌体通过下述步骤供ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记抗原的100μLTBS包被一晩。将该培养板的各孔用TBST清洗，由此除去未与Streptavidin结合的抗原，然后将该孔用250μL的2％脱脂奶粉-TBS封闭1小时以上。除去2％脱脂奶粉-TBS，然后将各孔中加入了所制备的纯化噬菌体的该培养板在37℃静置1小时，由此使展示抗体的噬菌体与各孔中存在的抗原在腺苷和ATP10 mM存在下或非存在下结合。在经TBST或10mM ATP和腺苷/TBST清洗的各孔中，添加经TBS或10mM ATP和腺苷/TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham PharmaciaBiotech)，将培养板孵育1小时。用TBST或10mM ATP和腺苷/TBST清洗后，添加了TMB single溶液(ZYMED)的各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸而终止，然后通过450nm的吸光度对该显色进行测定。
使用分离的96个克隆进行噬菌体ELISA，由此通过合理设计抗体文库得到在ATP和腺苷非存在下对作为抗原的人IL-6表现出结合活性的克隆“I6RLSA1-6_011”、在ATP和腺苷非存在下对作为抗原的人血清白蛋白(HSA)表现出结合活性的克隆“HSADSA1-6_020”、和在ATP和腺苷非存在下对人IL-6受体表现出结合活性的克隆“6RRLSA1-6_037”、“6RRLSA1-6_045”(图44、45、46)。
(4-3)以腺苷和ATP为开关的抗体的序列分析
由基于(4-2)所示的噬菌体ELISA的结果判断为在腺苷或ATP的非存在条件下具有抗原结合活性的克隆，使用特异性引物(SEQ ID NO：79和80)进行扩增，对所得基因的碱基序列进行分析。对于分析结果，以下的表54中示出了氨基酸序列。
[表54]
克隆名称 重链序列编号 轻链序列编号
16RLSA1-6_011 138 139
HSADSA1-6_020 140 141
6RRLSA1-6_037 142 143
6RRLSA1-6_045 144 145
〔参考实施例5〕生物素化人IgA-Fc的制备
作为人IgA，使用了天然存在的人IgA序列之中的Fc部分(人IgA-Fc)。为了在人IgA-Fc的C末端添加生物素，通过接头连接编码通过生物素连接酶添加生物素的特异性序列(AviTag序列，SEQ ID NO：147)的基因片段。将编码人IgA-Fc与AviTag序列连接了的蛋白质(SEQ ID NO：146)的基因片段插入动物细胞表达用载体，将构建的质粒载体使用293Fectin(Invitrogen)导入FreeStyle293细胞(Invitrogen)。此时，将表达EBNA1(SEQ IDNO：148)的基因和表达生物素连接酶(BirA、SEQ ID NO：149)的基因同时导入，进而出于对人IgA-Fc进行生物素标记的目的而添加生物素。将依照前述步骤导入了基因的细胞在37℃、8％CO2下培养6天，使目标蛋白质分泌至培养上清中。
将含有目标的生物素化人IgA-Fc的细胞培养液用0.22μm瓶顶过滤器过滤，得到培养上清。在经20mM Tris-HCl，pH7.4平衡化的HiTrap Q HP(GE HEALTHCARE)中上样经相同溶液稀释了的培养上清，通过NaCl的浓度梯度洗脱目标生物素化人IgA-Fc。接着，在经50mMTris-HCl,pH8.0平衡化的SoftLink Avidin柱(Promega)中上样经相同溶液稀释了的前述HiTrap Q HP洗脱液，用5mM生物素,150mM NaCl,50mM Tris-HCl,pH8.0洗脱目标生物素化人IgA-Fc。然后，通过使用Superdex200(GE HEALTHCARE)的凝胶过滤色谱除去作为目标外的杂质的缔合体，得到缓冲液被替换为20mM Histidine-HCl,150mM NaCl,pH6.0的纯化生物素化人IgA-Fc。
产业实用性
本发明的抗原结合活性对应于低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子、以及包含它们的药物组合物在正常组织、血液中不会全身性地作用，而是在作为靶组织的病变部位的癌症或炎症部位中可逆地作用，由此可以避免副作用的同时发挥药效，治疗起因于该靶组织的疾病。另外，若能获得与抗原的结合受到非天然化合物的浓度的控制的抗体，则这样的抗体由于能通过在病变部位活化抗体的活性、药理作用的外源性化合物、或者能够非侵袭给予的外源性化合物的给予来控制，因而极其有用。
进而，只要使用本发明的包含序列彼此不同的多个、抗原结合活性对应于低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库，则能够在短期内获得对于组织特异性疾病的治疗有用的各种抗原结合分子。
Figure IDA0002407382330000011
Figure IDA0002407382330000021
Figure IDA0002407382330000031
Figure IDA0002407382330000041
Figure IDA0002407382330000051
Figure IDA0002407382330000061
Figure IDA0002407382330000071
Figure IDA0002407382330000081
Figure IDA0002407382330000091
Figure IDA0002407382330000101
Figure IDA0002407382330000111
Figure IDA0002407382330000121
Figure IDA0002407382330000131
Figure IDA0002407382330000141
Figure IDA0002407382330000151
Figure IDA0002407382330000161
Figure IDA0002407382330000171
Figure IDA0002407382330000181
Figure IDA0002407382330000191
Figure IDA0002407382330000201
Figure IDA0002407382330000211
Figure IDA0002407382330000221
Figure IDA0002407382330000231
Figure IDA0002407382330000241
Figure IDA0002407382330000251
Figure IDA0002407382330000261
Figure IDA0002407382330000271
Figure IDA0002407382330000281
Figure IDA0002407382330000291
Figure IDA0002407382330000301
Figure IDA0002407382330000311
Figure IDA0002407382330000321
Figure IDA0002407382330000331
Figure IDA0002407382330000341
Figure IDA0002407382330000351
Figure IDA0002407382330000361
Figure IDA0002407382330000371
Figure IDA0002407382330000381
Figure IDA0002407382330000391
Figure IDA0002407382330000401
Figure IDA0002407382330000411
Figure IDA0002407382330000421
Figure IDA0002407382330000431
Figure IDA0002407382330000441
Figure IDA0002407382330000451
Figure IDA0002407382330000461
Figure IDA0002407382330000471
Figure IDA0002407382330000481
Figure IDA0002407382330000491
Figure IDA0002407382330000501
Figure IDA0002407382330000511
Figure IDA0002407382330000521

Claims (19)

1.一种文库，主要包含：
(i)序列彼此不同的多个抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子；或
(ii)编码该序列彼此不同的多个抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸；
该文库的特征在于，所述抗原结合结构域或抗原结合分子是抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子。
2.权利要求1所述的文库，其是由包括下述步骤(a)和(b)的方法制造的：
步骤(a)鉴定抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域中满足以下(i)至(iii)中任一者以上的氨基酸位点；
(i)未参与结合该低分子化合物的1个或多个氨基酸位点，
(ii)在亲本抗原结合结构域所属的动物种的抗体谱中具有氨基酸出现频率的多样性的1个或多个氨基酸位点，
(iii)对于经典结构的形成不重要的1个或多个氨基酸位点；和
步骤(b)设计文库，该文库包含：在所述抗原结合结构域中，编码未改变体的核酸以及分别编码在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有改变的、序列彼此不同的所述抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体的核酸。
3.权利要求2所述的文库，其是由包括下述步骤(a)至(d)的方法制造的：
步骤(a)鉴定抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域或具有低分子化合物结合活性的抗原结合结构域中满足以下(i)至(iii)中任一者以上的氨基酸位点；
(i)未参与结合该低分子化合物的1个或多个氨基酸位点，
(ii)在亲本抗原结合结构域所属的动物种的抗体谱中具有氨基酸出现频率的多样性的1个或多个氨基酸位点，
(iii)对于经典结构的形成不重要的1个或多个氨基酸位点；
步骤(b)制作在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有改变的、序列彼此不同的所述抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体；
步骤(c)鉴定实质上不对所述各改变体的该低分子化合物结合活性造成变化的1个或多个氨基酸的改变；和
步骤(d)制造文库，该文库包含：编码未改变体的核酸以及编码在步骤(c)中鉴定的1个或多个氨基酸具有改变的、序列彼此不同的所述抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体的核酸。
4.权利要求1所述的文库，其是由包括下述步骤1)和2)的方法制造的：
步骤1)使包含多个抗原结合分子的文库与低分子化合物接触，所述抗原结合分子具有低分子化合物结合活性；和
步骤2)由该文库浓缩核酸，所述核酸编码具有低分子化合物结合活性的抗原结合分子的多个改变体。
5.权利要求4所述的文库，其中，所述抗原结合分子是包含抗体的重链可变区和轻链可变区的抗原结合分子，且是通过包括下述步骤1)至3)的任1步骤的方法制造的：
步骤1)从权利要求4所述的文库浓缩编码具有低分子化合物结合活性的抗原结合分子的多个改变体的核酸来设计文库，其中权利要求4所述的文库是包含编码位于重链可变区的氨基酸经改变的1个或多个改变体的核酸的文库；
步骤2)从权利要求4所述的文库浓缩编码具有低分子化合物结合活性的抗原结合分子的多个改变体的核酸来设计文库，其中权利要求4所述的文库是包含编码位于轻链可变区的氨基酸经改变的1个或多个改变体的核酸的文库；
步骤3)组合由步骤1)和步骤2)的各可变区文库浓缩得到的编码抗原结合分子的核酸，由此设计文库。
6.权利要求1至5中任一项所述的文库，其特征在于，所述抗原结合分子是抗原结合结构域与病毒外壳蛋白的至少一部分的融合多肽。
7.权利要求1至5中任一项所述的文库，其中，所述抗原结合分子是包含抗体的重链和轻链的抗原结合分子，且该文库进一步包括设计所述重链和/或轻链的合成文库的步骤。
8.权利要求7所述的文库，其特征在于，所述抗体的重链和/或轻链包含来源于种系的框架序列。
9.权利要求1至8中任一项所述的文库，其中，所述低分子化合物是靶组织特异性化合物或非天然化合物。
10.权利要求1至9中任一项所述的文库，其中，所述靶组织是癌组织或炎性组织。
11.权利要求10所述的文库，其中，所述癌组织特异性化合物是选自由具有嘌呤环结构的核苷、氨基酸及其代谢产物、脂质及其代谢产物、糖代谢的一次代谢产物、以及烟酰胺及其代谢产物组成的组中的至少一种化合物。
12.权利要求1至11中任一项所述的文库，其中，所述低分子化合物是腺苷、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、或犬尿氨酸。
13.权利要求1至12中任一项所述的文库，其中，未参与结合所述低分子化合物的氨基酸位点是选自以下任一者以上的氨基酸之外的位点：
H链：33、50、52、56、57、58、99、100、100a、54、55、97、100c、101、94、95、100d、100e(Kabat编号)；
L链：95c、96、95a、95b、49、55(Kabat编号)。
14.包含抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的制造方法，其包括下述步骤(a)至(g)：
步骤(a)在低分子化合物的非存在下使权利要求1至13中任一项所述的文库与抗原接触；
步骤(b)选择所述步骤(a)中不与抗原结合的抗原结合结构域；
步骤(c)使所述步骤(b)中选择的抗原结合结构域在低分子化合物的存在下与抗原接触；
步骤(d)选择所述步骤(c)中与抗原结合了的抗原结合结构域；
步骤(e)使编码所述步骤(d)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(f)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有步骤(e)中得到的多核苷酸；和
步骤(g)从所述步骤(f)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
15.包含抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的制造方法，其包括下述步骤(a)至(e)：
步骤(a)使权利要求1至13中任一项所述的文库在低分子化合物的存在下与抗原接触；
步骤(b)用比所述步骤(a)低浓度的低分子化合物将抗原结合结构域解离并回收；
步骤(c)使编码所述步骤(b)中回收的抗原结合结构域的多核苷酸与编码包含Fc区的多肽的多核苷酸连接；
步骤(d)培养导入有载体的细胞，所述载体可操作地连接有步骤(c)中得到的多核苷酸；和
步骤(e)从所述步骤(d)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子。
16.权利要求14或15所述的包含抗原结合活性根据低分子化合物的浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的制造方法，其进一步包括下述步骤(a)至(b)：
步骤(a)使权利要求1至13中任一项所述的文库与低分子化合物接触；和
步骤(b)选择所述步骤(a)中回收的抗原结合结构域。
17.权利要求14至16中任一项所述的抗原结合分子的制造方法，其中，所述低分子化合物是腺苷、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、或犬尿氨酸。
18.抗原结合分子，其含有抗原结合活性根据非天然化合物的浓度而变化的抗原结合结构域。
19.药物组合物，其含有权利要求18所述的抗原结合分子。
CN202010168341.5A 2013-12-04 2014-12-04 抗原结合能力根据化合物的浓度而变化的抗原结合分子及其文库 Pending CN111304752A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013251537 2013-12-04
JP2013-251537 2013-12-04
CN201480074824.1A CN105980557B (zh) 2013-12-04 2014-12-04 抗原结合能力根据化合物的浓度而变化的抗原结合分子及其文库

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480074824.1A Division CN105980557B (zh) 2013-12-04 2014-12-04 抗原结合能力根据化合物的浓度而变化的抗原结合分子及其文库

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111304752A true CN111304752A (zh) 2020-06-19

Family

ID=53273524

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010168341.5A Pending CN111304752A (zh) 2013-12-04 2014-12-04 抗原结合能力根据化合物的浓度而变化的抗原结合分子及其文库
CN201480074824.1A Active CN105980557B (zh) 2013-12-04 2014-12-04 抗原结合能力根据化合物的浓度而变化的抗原结合分子及其文库

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480074824.1A Active CN105980557B (zh) 2013-12-04 2014-12-04 抗原结合能力根据化合物的浓度而变化的抗原结合分子及其文库

Country Status (14)

Country Link
US (2) US10961530B2 (zh)
EP (2) EP3763813A1 (zh)
JP (3) JP7060317B2 (zh)
KR (3) KR102454360B1 (zh)
CN (2) CN111304752A (zh)
AU (2) AU2014358191B2 (zh)
BR (1) BR112016012094A2 (zh)
CA (1) CA2931296C (zh)
DK (1) DK3078744T3 (zh)
EA (1) EA201691154A1 (zh)
MX (1) MX2016007312A (zh)
SG (1) SG11201604495PA (zh)
TW (3) TWI664331B (zh)
WO (1) WO2015083764A1 (zh)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2013180200A1 (ja) 2012-05-30 2016-01-21 中外製薬株式会社 標的組織特異的抗原結合分子
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
BR112015029320A8 (pt) * 2013-05-24 2023-01-03 Nestec Sa Ensaios específicos de vias para predição de diagnóstico de síndrome do intestino irritável
TWI721929B (zh) 2013-08-05 2021-03-11 美商扭轉生物科技有限公司 重新合成之基因庫
JP7060317B2 (ja) 2013-12-04 2022-04-26 中外製薬株式会社 化合物の濃度に応じて抗原結合能の変化する抗原結合分子及びそのライブラリ
CA2975852A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
WO2016172377A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
US20160361360A1 (en) * 2015-06-12 2016-12-15 Immunomedics, Inc. Disease therapy with chimeric antigen receptor (car) constructs and t cells (car-t) or nk cells (car-nk) expressing car constructs
IL258164B (en) 2015-09-18 2022-09-01 Twist Bioscience Corp Methods to regulate the activity of proteins and cells and a method for the production of nucleic acids
WO2017053450A1 (en) 2015-09-22 2017-03-30 Twist Bioscience Corporation Flexible substrates for nucleic acid synthesis
EP3368561A1 (en) * 2015-10-30 2018-09-05 Medimmune Limited Prevention of n-terminal truncation in igg light chains
CN108603307A (zh) 2015-12-01 2018-09-28 特韦斯特生物科学公司 功能化表面及其制备
WO2018038772A1 (en) 2016-08-22 2018-03-01 Twist Bioscience Corporation De novo synthesized nucleic acid libraries
JP6871364B2 (ja) 2016-09-21 2021-05-12 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション 核酸に基づくデータ保存
EA201991262A1 (ru) 2016-12-16 2020-04-07 Твист Байосайенс Корпорейшн Библиотеки вариантов иммунологического синапса и их синтез
CN110809580A (zh) * 2017-01-24 2020-02-18 安贝科思生物制剂公司 用于靶向癌症中包含非典型hla-i和新抗原的复合体的方法和组合物
SG11201907713WA (en) 2017-02-22 2019-09-27 Twist Bioscience Corp Nucleic acid based data storage
EP3595674A4 (en) * 2017-03-15 2020-12-16 Twist Bioscience Corporation BANKS OF VARIANTS OF IMMUNOLOGICAL SYNAPSE AND THEIR SYNTHESIS
WO2018189611A1 (en) * 2017-04-12 2018-10-18 Pfizer Inc. Antibodies having conditional affinity and methods of use thereof
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
CN111566209A (zh) 2017-06-12 2020-08-21 特韦斯特生物科学公司 无缝核酸装配方法
US11407837B2 (en) 2017-09-11 2022-08-09 Twist Bioscience Corporation GPCR binding proteins and synthesis thereof
KR20240024357A (ko) 2017-10-20 2024-02-23 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 가열된 나노웰
CN109988748A (zh) * 2017-12-29 2019-07-09 深圳华大生命科学研究院 一种从til筛选肿瘤特异性t细胞的方法
US10936953B2 (en) 2018-01-04 2021-03-02 Twist Bioscience Corporation DNA-based digital information storage with sidewall electrodes
US20200399373A1 (en) * 2018-02-14 2020-12-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule and combination
KR20210013128A (ko) 2018-05-18 2021-02-03 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 하이브리드화를 위한 폴리뉴클레오타이드, 시약 및 방법
KR102259473B1 (ko) * 2018-08-10 2021-06-02 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항cd137 항원 결합 분자 및 그의 사용
CN109402127B (zh) * 2018-09-29 2021-12-10 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 一组与结缔组织生长因子特异性结合的高亲和力核酸适配体及其应用
CN109293778B (zh) * 2018-11-01 2021-09-17 浙江蓝盾药业有限公司 同时抗cd70和cd47的重链抗体及其制备方法和应用
KR20210108961A (ko) * 2018-12-28 2021-09-03 쿄와 기린 가부시키가이샤 TfR에 결합하는 이중 특이적 항체
SG11202109283UA (en) 2019-02-26 2021-09-29 Twist Bioscience Corp Variant nucleic acid libraries for antibody optimization
AU2020229349A1 (en) 2019-02-26 2021-10-14 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for GLP1 receptor
EP3943108A4 (en) * 2019-03-19 2023-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIGEN-BINDING MOLECULE CONTAINING AN ANTIGEN-BINDING DOMAIN WHOSE ANTIGEN-BINDING ACTIVITY IS ALTERED DEPENDING ON THE MTA, AND BANK FOR OBTAINING SUCH ANTIGEN-BINDING DOMAIN
EP3987019A4 (en) 2019-06-21 2023-04-19 Twist Bioscience Corporation BARCODE-BASED NUCLEIC ACID SEQUENCE ARRANGEMENT
WO2021131021A1 (ja) * 2019-12-27 2021-07-01 中外製薬株式会社 抗ｃｔｌａ－４抗体およびその使用
TW202144395A (zh) 2020-02-12 2021-12-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子
CR20240026A (es) 2021-06-25 2024-03-14 Chugai Seiyaku Kk Anticuerpo anti-ctla-4
KR20240024255A (ko) 2021-06-25 2024-02-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항ctla-4 항체의 사용
WO2023159140A2 (en) * 2022-02-17 2023-08-24 Adimab, Llc Anti-asgr1 polypeptides and methods of use for immune tolerance
CN115385990B (zh) * 2022-08-22 2023-06-02 首都医科大学附属北京妇产医院 分离的多肽及其在用于诊断或预测卵巢癌中的用途和检测设备

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040241759A1 (en) * 1997-06-16 2004-12-02 Eileen Tozer High throughput screening of libraries
US20100216159A1 (en) * 2009-02-20 2010-08-26 General Electric Company Switchable affinity binders
US20110245108A1 (en) * 2004-07-06 2011-10-06 Roberto Crea Universal Antibody Libraries
GB201211120D0 (en) * 2012-06-22 2012-08-01 Bessede Alban Antagonist to an enzyme and/or a metabolite of the kynurenine pathway
US20130203609A1 (en) * 2010-09-30 2013-08-08 Board Of Trustees Of Northern Illinois University Library-based methods and compositions for introducing molecular switch functionality into protein affinity reagents
CN104487457A (zh) * 2012-05-30 2015-04-01 中外制药株式会社 靶组织特异性抗原结合分子

Family Cites Families (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
ATE297465T1 (de) 1991-11-25 2005-06-15 Enzon Inc Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JP3507073B2 (ja) 1992-03-24 2004-03-15 ケンブリッジ アンティボディー テクノロジー リミティド 特異的結合対の成員の製造方法
CA2140638C (en) 1992-07-24 2010-05-04 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
FR2707189B1 (fr) 1993-07-09 1995-10-13 Gradient Ass Procédé de traitement de résidus de combustion et installation de mise en Óoeuvre dudit procédé.
EP0731842A1 (en) 1993-12-03 1996-09-18 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
EP0770628B9 (en) 1994-07-13 2007-02-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin-8
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
DE69620898T2 (de) * 1995-09-01 2002-11-07 Univ Washington Seattle Interaktive molekulare konjugate
CN1203178C (zh) 1997-10-27 2005-05-25 尤尼利弗公司 多价抗原结合蛋白
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
PT1914244E (pt) 1999-04-09 2013-07-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico
AU784151B2 (en) 1999-12-28 2006-02-09 Ribonomics, Inc. Methods for isolating and characterizing endogenous mRNA-protein (mRNP) complexes
ATE448301T1 (de) 2000-09-08 2009-11-15 Univ Zuerich Sammlung von proteinen mit sich wiederholenden sequenzen (repeat proteins), die repetitive sequenzmodule enthalten
CA2785941C (en) 2000-10-06 2017-01-10 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
JP2004526419A (ja) 2000-10-16 2004-09-02 フィロス インク． 抗体模倣物および他の結合タンパク質のためのタンパク質骨格
ES2649037T3 (es) 2000-12-12 2018-01-09 Medimmune, Llc Moléculas con semividas prolongadas, composiciones y usos de las mismas
WO2002079255A1 (en) 2001-04-02 2002-10-10 Idec Pharmaceuticals Corporation RECOMBINANT ANTIBODIES COEXPRESSED WITH GnTIII
WO2003008537A2 (en) 2001-04-06 2003-01-30 Mannkind Corporation Epitope sequences
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
JP4281869B2 (ja) 2001-06-22 2009-06-17 中外製薬株式会社 抗グリピカン３抗体を含む細胞増殖抑制剤
WO2003029462A1 (en) 2001-09-27 2003-04-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of human neutrophil gelatinase-associated lipocalin and related proteins
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
EP2305710A3 (en) 2002-06-03 2013-05-29 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
JP3991280B2 (ja) 2002-06-05 2007-10-17 中外製薬株式会社 抗体作製方法
US20060141456A1 (en) 2002-06-12 2006-06-29 Cynthia Edwards Methods and compositions for milieu-dependent binding of a targeted agent to a target
AU2002328429A1 (en) 2002-09-04 2004-03-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha CONSTRUCTION OF ANTIBODY USING MRL/lpr MOUSE
DK2345671T3 (en) 2002-09-27 2016-02-15 Xencor Inc Optimized Fc variants and methods for their formation
AU2003286467B2 (en) 2002-10-15 2009-10-01 Abbvie Biotherapeutics Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
JP2006524039A (ja) 2003-01-09 2006-10-26 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 変異型Ｆｃ領域を含む抗体の同定および作製ならびにその利用法
NZ541503A (en) 2003-01-22 2008-09-26 Glycart Biotechnology Ag Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased Fc receptor binding affinity and effector function
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
CA2543360A1 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Joost A. Kolkman Ldl receptor class a and egf domain monomers and multimers
US20080089892A1 (en) 2004-01-12 2008-04-17 Eli Lilly And Co. Fc Region Variants
JP2005292087A (ja) 2004-04-05 2005-10-20 Shionogi & Co Ltd ５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンに対する抗体
KR20070038453A (ko) 2004-04-16 2007-04-10 마크로제닉스, 인크. ＦｃγＲＩＩＢ-특이적 항체 및 그의 사용 방법
NZ579543A (en) 2004-07-09 2011-07-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-glypican 3 antibody
DK1776384T3 (da) 2004-08-04 2013-09-02 Mentrik Biotech Llc VARIANT-Fc-REGIONER
CA2577370A1 (en) 2004-08-16 2006-03-02 Medimmune, Inc. Integrin antagonists with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity
KR20070057839A (ko) 2004-08-19 2007-06-07 제넨테크, 인크. 변경된 이펙터 기능을 갖는 폴리펩티드 변이체
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
RU2412200C2 (ru) 2004-11-12 2011-02-20 Ксенкор, Инк. Fc-ВАРИАНТЫ С ИЗМЕНЕННЫМ СВЯЗЫВАНИЕМ С FcRn
DK1817340T3 (da) 2004-11-12 2012-08-13 Xencor Inc Fc-varianter med ændret binding til fcrn
JPWO2006067847A1 (ja) 2004-12-22 2008-06-12 中外製薬株式会社 フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
AU2006230413B8 (en) 2005-03-31 2011-01-20 Xencor, Inc Fc variants with optimized properties
US8008443B2 (en) 2005-04-26 2011-08-30 Medimmune, Llc Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
DK1919503T3 (en) 2005-08-10 2014-12-15 Macrogenics Inc Identification and preparation of antibodies with variant fc regions and methods of use thereof
EP1931709B1 (en) 2005-10-03 2016-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
CA2627890A1 (en) 2005-10-31 2007-05-10 The Government Of The United States As Represented By The Secretary Of H Ealth And Human Services, National Institutes Of Health Antibodies and immunotoxins that target human glycoprotein nmb
JP2009519236A (ja) 2005-11-30 2009-05-14 キャン−ファイト・バイオファーマ・リミテッド Ａ３アデノシンレセプター抗体の治療的使用
AU2007281284A1 (en) 2006-08-02 2008-02-07 The Uab Research Foundation Methods and compositions related to soluble monoclonal variable lymphocyte receptors of defined antigen specificity
PL2099823T5 (pl) 2006-12-01 2023-02-20 Seagen Inc. Wariant środków wiążących cel i jego zastosowania
CN103408661B (zh) 2007-01-05 2016-04-06 苏黎世大学 提供疾患特异性结合分子和靶的方法
WO2008092117A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Xencor, Inc. Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region
WO2008119353A1 (en) 2007-03-29 2008-10-09 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
AU2008260498B2 (en) 2007-05-30 2012-11-29 Xencor, Inc. Methods and compositions for inhibiting CD32b expressing cells
CL2008002153A1 (es) 2007-07-24 2009-06-05 Amgen Inc Anticuerpo aislado o fragmanto de unión de antigeno del mismo que se une al receptor de il-18 (il-18r); molecula de ácido nucleico codificante; celula huesped que la comprende; composición farmaceutica; uso médico para tratar o prevenir una condición asociada con il-18r; método in vitro para inhibir la unión de il-18 al il-18r.
US10457719B2 (en) 2007-09-18 2019-10-29 The Jackson Laboratory Antibodies and FC fusion protein modifications with enhanced persistence or pharmacokinetic stability in vivo and methods of use thereof
MX2010003099A (es) 2007-09-21 2010-05-17 Univ California Interferon de objetivo demuestra actividades potentes apoptoticas y antitumorales.
WO2009043051A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Biogen Idec Ma Inc. Cd23 binding molecules and methods of use thereof
ES2532461T3 (es) 2007-12-26 2015-03-27 Xencor, Inc. Variantes de FC con enlazamiento alterado a FCRN
EP4238993A3 (en) 2008-04-11 2023-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US8541178B2 (en) 2008-05-13 2013-09-24 Genentech, Inc. Analysis of antibody drug conjugates by bead-based affinity capture and mass spectrometry
CA2736277C (en) 2008-09-10 2016-06-21 Philochem Ag Display library for antibody selection
EP2385955B1 (en) 2009-01-12 2020-08-12 CytomX Therapeutics, Inc. Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
ES2661310T3 (es) 2009-03-09 2018-03-28 Bioatla, Llc Proteínas mirac
JP5787446B2 (ja) 2009-03-19 2015-09-30 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
KR20120044294A (ko) 2009-05-01 2012-05-07 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
US8926976B2 (en) 2009-09-25 2015-01-06 Xoma Technology Ltd. Modulators
JP2011097869A (ja) 2009-11-05 2011-05-19 Japan Science & Technology Agency 抗ヒトアデノシンＡ２ａ受容体モノクローナル抗体
JP2011184418A (ja) * 2010-03-11 2011-09-22 Tokyo Institute Of Technology 親和性可変抗体
CN102844332B (zh) * 2010-03-11 2015-08-19 瑞纳神经科学公司 呈pH依赖性抗原结合的抗体
TWI667257B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
JP6121904B2 (ja) 2010-09-08 2017-04-26 ハロザイム インコーポレイテッド 条件的活性治療用タンパク質を評価および同定する、または発展させる方法
SG10201506906VA (en) 2010-09-09 2015-10-29 Pfizer 4-1bb binding molecules
SG190727A1 (en) 2010-11-30 2013-07-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
KR102147548B1 (ko) 2011-02-25 2020-08-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
EP2698431B1 (en) 2011-03-30 2020-09-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Retention of antigen-binding molecules in blood plasma and method for modifying immunogenicity
TWI687441B (zh) 2011-06-30 2020-03-11 中外製藥股份有限公司 異源二聚化多胜肽
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
KR102366029B1 (ko) * 2011-09-30 2022-02-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 표적 항원에 대한 면역응답을 유도하는 항원 결합 분자
CA3186007A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ion concentration-dependent binding molecule library
KR102219987B1 (ko) 2012-02-24 2021-02-25 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩＢ를 매개로 항원의 소실을 촉진하는 항원 결합 분자
JP6774164B2 (ja) 2012-08-24 2020-10-21 中外製薬株式会社 マウスＦｃγＲＩＩ特異的Ｆｃ抗体
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
JP7060317B2 (ja) 2013-12-04 2022-04-26 中外製薬株式会社 化合物の濃度に応じて抗原結合能の変化する抗原結合分子及びそのライブラリ
EP3156072B1 (en) 2014-06-11 2020-08-19 IDAC Theranostics, Inc. Method for reducing side effects of immune checkpoint control agent
ES2746340T3 (es) 2015-04-22 2020-03-05 Curevac Ag Composición que contiene ARN para el tratamiento de enfermedades tumorales
WO2016194992A1 (ja) 2015-06-05 2016-12-08 中外製薬株式会社 免疫活性化剤の併用
PE20181336A1 (es) 2015-09-18 2018-08-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos que se unen a interleucina 8 (il-8) y sus usos
CA3006743A1 (en) 2015-12-03 2017-06-08 Agios Pharmaceuticals, Inc. Mat2a inhibitors for treating mtap null cancer
WO2017104783A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
KR102259473B1 (ko) 2018-08-10 2021-06-02 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항cd137 항원 결합 분자 및 그의 사용
EP3943108A4 (en) 2019-03-19 2023-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIGEN-BINDING MOLECULE CONTAINING AN ANTIGEN-BINDING DOMAIN WHOSE ANTIGEN-BINDING ACTIVITY IS ALTERED DEPENDING ON THE MTA, AND BANK FOR OBTAINING SUCH ANTIGEN-BINDING DOMAIN
WO2021131021A1 (ja) 2019-12-27 2021-07-01 中外製薬株式会社 抗ｃｔｌａ－４抗体およびその使用
TW202144395A (zh) 2020-02-12 2021-12-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子
KR20240024255A (ko) 2021-06-25 2024-02-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항ctla-4 항체의 사용
US20240002510A2 (en) 2021-06-25 2024-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-ctla-4 antibody and use thereof
CR20240026A (es) 2021-06-25 2024-03-14 Chugai Seiyaku Kk Anticuerpo anti-ctla-4

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040241759A1 (en) * 1997-06-16 2004-12-02 Eileen Tozer High throughput screening of libraries
US20110245108A1 (en) * 2004-07-06 2011-10-06 Roberto Crea Universal Antibody Libraries
US20100216159A1 (en) * 2009-02-20 2010-08-26 General Electric Company Switchable affinity binders
US20130203609A1 (en) * 2010-09-30 2013-08-08 Board Of Trustees Of Northern Illinois University Library-based methods and compositions for introducing molecular switch functionality into protein affinity reagents
CN104487457A (zh) * 2012-05-30 2015-04-01 中外制药株式会社 靶组织特异性抗原结合分子
GB201211120D0 (en) * 2012-06-22 2012-08-01 Bessede Alban Antagonist to an enzyme and/or a metabolite of the kynurenine pathway

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
夏耀耀;宾朋;朱国强;任文凯;: "氨基酸代谢调控猪免疫细胞命运研究进展", no. 09 *

Also Published As

Publication number Publication date
BR112016012094A2 (pt) 2017-09-26
EP3078744A1 (en) 2016-10-12
KR20220142539A (ko) 2022-10-21
TWI702316B (zh) 2020-08-21
CN105980557B (zh) 2020-04-07
WO2015083764A1 (ja) 2015-06-11
EP3078744B1 (en) 2020-08-26
US11912989B2 (en) 2024-02-27
KR102454360B1 (ko) 2022-10-12
US20210180049A1 (en) 2021-06-17
AU2014358191A1 (en) 2016-06-02
JP2022115883A (ja) 2022-08-09
TWI664331B (zh) 2019-07-01
TW201937018A (zh) 2019-09-16
JPWO2015083764A1 (ja) 2017-03-16
SG11201604495PA (en) 2016-07-28
AU2021201173A1 (en) 2021-03-11
MX2016007312A (es) 2017-01-13
CN105980557A (zh) 2016-09-28
JP7060317B2 (ja) 2022-04-26
KR20160093666A (ko) 2016-08-08
DK3078744T3 (da) 2020-09-28
US10961530B2 (en) 2021-03-30
JP2020146061A (ja) 2020-09-17
EP3763813A1 (en) 2021-01-13
US20160304862A1 (en) 2016-10-20
CA2931296A1 (en) 2015-06-11
AU2014358191B2 (en) 2020-12-24
KR102284503B1 (ko) 2021-07-30
JP7065150B2 (ja) 2022-05-11
EP3078744A4 (en) 2017-06-07
CA2931296C (en) 2024-04-23
KR20210096309A (ko) 2021-08-04
TW201610247A (zh) 2016-03-16
TW202043467A (zh) 2020-12-01
EA201691154A1 (ru) 2016-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105980557B (zh) 抗原结合能力根据化合物的浓度而变化的抗原结合分子及其文库
CN107964042B (zh) 靶组织特异性抗原结合分子
US20230151112A1 (en) Immunoactivating antigen-binding molecule
WO2020189748A1 (ja) Ｍｔａ依存的に抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子及び当該抗原結合ドメイン取得用ライブラリ
US20240158785A1 (en) Antigen-binding molecules, the antigen-binding activity of which varies according to the concentration of compounds, and libraries of said molecules
EA041811B1 (ru) Антигенсвязывающие молекулы, активность связывания антигена которых варьируется в зависимости от концентрации соединений, и библиотеки указанных молекул

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40024798

Country of ref document: HK