CN109791155A - 用于预测放射治疗后发生乳房晚期效应的风险的体外方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的诊断方法和计算器，其通过使用放射诱导的晚期效应使用T淋巴细胞凋亡(RILA)和临床参数来用于预测在放射治疗(RT)后受试者中发生乳房晚期效应(BLE)的风险，所述乳房晚期效应被定义为萎缩性皮肤、毛细血管扩张、硬结(纤维化)、坏死或溃疡。本发明还涉及用于实施该方法的诊断试剂盒和列线图。

Description

用于预测放射治疗后发生乳房晚期效应的风险的体外方法
技术领域
本发明涉及一种新的诊断方法和计算器，其通过使用放射诱导的晚期效应使用T淋巴细胞凋亡(RILA)和临床参数来用于预测在放射治疗(RT)后受试者中发生乳房晚期效应(BLE)的风险，所述乳房晚期效应被定义为萎缩性皮肤、毛细血管扩张、硬结(纤维化)、坏死或溃疡。本发明还涉及用于实施该方法的诊断试剂盒和列线图(nomogram)。
背景技术
治疗目的RT后严重但也适度的毒性，例如乳癌后的不良美容结果，可对生活质量产生负面影响，并对随后的心理结果产生显著影响(Al-Ghazal，Fallowfield等人，1999)。已知许多因素会增加放射毒性的风险，包括内在放射敏感性(Azria，Betz等人，2012)。虽然已知患者群体的毒性风险，但是在治疗前很难确定个体的正常组织放射敏感性。因此，目前的实践标准通常根据标准建议的临床情况规定放射剂量，而不考虑被照射个体的基因型或表型。
在这方面，Azria等人(Azria，Riou等人，2015)显示基于RILA的流式细胞术评估的放射敏感性测定可以显著地预测个体之间乳纤维化的差异，并且可以用作对RT潜在的高反应性患者的快速筛查。在高RILA值和小于≥2级(less grade≥2)乳纤维化的情况下发现阴性预测值(Ozsahin，Crompton等人，2005)。此外，在低RILA值的患者中观察到所有严重的乳纤维化(≥2级)。进一步，这些结果用多中心试验证实，显示在高RILA值和小于≥2级乳纤维化的情况下阴性预测值为91％(Azria，Riou等人，2015)。然而，基于RILA的这种放射敏感性测定的预测在灵敏度和可靠性方面表现出一些限制。单独考虑，RILA在灵敏度和特异性方面不具备高预测能力。
因此，迫切需要开发一种诊断预测在RT后发生BLE的风险的具有增强的灵敏度和可靠性的方法。
Azria等人2015年的出版物在一项前瞻性多中心试验中评估了RILA作为辅助乳放射治疗后乳纤维化的独立预测因子的作用。但在多变量分析中，急性效应与RILA或其他临床相关参数之间未发现相关性。特别地，如该现有技术中所公开的，对纤维化和复发的多变量回归分析中，吸烟参数是不显著的。
本发明现在提供了一种用于预测发生乳房晚期效应(BLE)的概率的新诊断方法，其中RILA与临床参数组合，特别是与吸烟习惯和辅助激素疗法组合，具有改善的对患者发生BLE风险的全局评估。
如在说明性实施例中进一步公开所示，20％患有RILA(放射诱导的CD8T-淋巴细胞凋亡)而没有任何其他组合临床参数的患者是被认为在3年时没有任何BLE或复发风险的患者(BLE风险约为2-3％)，而使用根据本发明的新的体外诊断方法，组合RILA和临床参数特别是吸烟习惯和辅助激素疗法，发生BLE的风险主要为16％。对于12％患有RILA(BLE风险约为5％)而没有任何其他组合临床参数的患者，当与吸烟临床参数组合时，BLE的风险将主要为8％，甚至当与吸烟和辅助激素疗法组合时，BLE的风险将主要为22％。
这些数据显示了根据本发明的组合方法的兴趣和效率，以优化对患者的BLE风险的全局评估。
发明内容
本发明涉及一种用于诊断受试者放射治疗后发生乳房晚期效应(BLE)的风险的体外方法，其包括以下步骤：
a、从所述受试者的生物样品中确定至少一种生化标记物的值；
b、确定至少两个临床参数的水平；
c、通过多变量Cox函数组合所述数据以获得最终值(end value)以确定发生BLE的风险(概率)；
其中，通过以下方法获得来自所述多变量Cox函数的多变量Cox回归：
i)通过组合所述生化标记物和所述临床参数构建多变量Cox回归；和
ii)分析所述多变量Cox回归以评估生化标记物和临床参数的独立判别值。
根据本发明的“用于诊断发生BLE的风险(预测概率)的体外方法”，这意味着全局方法包括体外(RILA测定)或离体(用先前在患者上评估的临床参数获得的多变量cox回归模型)管理数据分析的步骤。
特别地，本发明涉及一种用于诊断受试者放射治疗后发生乳房晚期效应的风险的体外方法，其包括以下步骤：
a、从所述受试者的生物样品，优选所述受试者的血液样品中确定与评估受试者中放射毒性风险增加相关的至少一种生化标记物的值，所述生化标记物特别选自RILA、放射敏感性蛋白质和/或基因；
b、确定与评估受试者中放射毒性风险增加相关的至少两个临床参数的水平，所述临床参数特别选自年龄、乳房体积、辅助激素疗法、加强(boost)、淋巴结照射(nodeirradiation)和吸烟；
c、通过多变量Cox函数组合所述数据以获得最终值以确定发生BLE的风险；
其中，通过以下方法获得来自所述多变量Cox函数的多变量Cox回归：
i)通过组合所述生化标记物和所述临床参数构建多变量Cox回归；和
ii)分析所述多变量Cox回归以评估生化标记物和临床参数的独立判别值。
在一个优选的实施方案中，所述至少一种生化标记物包含RILA，并且所述至少两种临床参数为吸烟习惯和辅助激素疗法。
有利地，所述至少一种生化标记物RILA基于放射治疗(RT)后CD4和/或CD8，优选CD8的应答。
在一个特定实施方案中，所述至少一种生化标记物与放射敏感性蛋白质和/或基因组合使用。
在一个特定实施方案中，所述至少一种生化标记物与放射敏感性蛋白质(优选选自AK2、HSPA8、ANX1、APEX1和ID2)组合使用。
在另一个特定实施方案中，所述至少一种生化标记物与放射敏感性基因(优选选自TGFβ、SOD2、TNFα、XRCC1)组合使用。
在一个特定实施方案中，所述至少一种生化标记物与至少一种放射敏感性蛋白质，特别是至少两种放射敏感性蛋白质，更特别是至少三种放射敏感性蛋白质，更特别是至少四种放射敏感性蛋白质，甚至更特别地选自AK2、HSPA8、ANX1、APEX1和ID2的五种放射敏感性蛋白质，组合使用。
详细描述
定义
“乳房晚期效应(Breast Late Effect，BLE)”是指放射治疗(RT)后受试者的萎缩性皮肤、毛细血管扩张、硬结(纤维化)，坏死或溃疡。“硬结”和“纤维化”是同义词(临床与医学语义学)。
“受试者”是指人。
“生物样品”特别是指血液样品，优选含有白细胞的全血提取物、含有淋巴细胞的全血提取物和含有T淋巴细胞的全血提取物。
“临床参数”是指与评估受试者中放射毒性风险增加相关的任何临床参数，特别是选自年龄、乳房体积、辅助激素疗法、加强(补充剂量的照射)、淋巴结照射和吸烟，如表1中进一步公开所示。根据本发明的临床参数优选选自吸烟习惯、辅助激素疗法及其组合。
“吸烟习惯”是指如下定义的吸烟患者或非吸烟患者。吸烟患者被定义为持续每日吸烟者、间歇性吸烟者或非每日吸烟者(在多变量Cox函数中给定值＝1)，而非吸烟患者被定义为偶尔吸烟者或从不每日吸烟者(在多变量Cox函数中给定值＝0)。
术语“每日吸烟者”定义了目前每日吸烟的受试者。
术语“间歇性吸烟者”被定义为不是每日吸烟(DiFranza等人,2007；Lindstrom,Isacsson,&the Malmo Shoulder-Neck Study Group,2002)或在前一个月的1至15天中吸烟(McCarthy,Zhou,&Hser,2001)。
术语“非每日吸烟者”定义受试者至少每周吸烟(但不是每日)或常常少于每周吸烟；在有生中吸烟至少100支且目前吸烟数天；有生中吸烟大于100支，目前吸烟数天，且过去30天吸烟少于30支；在有生中吸烟大于100支，在过去30天内吸烟数天或1-2天；或者在有生中吸烟少于100支，在过去30天内吸烟(Gilpin,White,&Pierce,2005；Hassmiller等人,2003；Husten,McCarty,Giovino,Chrismon,&Zhu,1998；Leatherdale,Ahmed,Lovato,Manske,&Jolin,2007；McDermott等人,2007；Tong,Ong,Vittinghoff,&Perez-Stable,2006；Wortley,Husten,Trosclair,Chrismon,&Pederson,2003)。
术语“偶尔吸烟者(some-day smoker)”定义受试者在吸烟者有生中已经吸烟100支且目前在某些日子吸烟(不是每天都吸烟；CDC,1993；Hassmiller,Warner,Mendez,Levy,&Romano,2003)。
术语“从不每日吸烟者”定义为受试者在持续6个月或更长时间内从不每天吸烟(Gilpin等人,1997)。
“辅助激素疗法”是指在手术、化学疗法和/或放射治疗后给予的治疗，以降低癌症的复发机会。激素受体阳性乳癌依赖于称为雌激素和/或黄体酮的激素来生长。辅助激素疗法可以降低体内这些激素的水平，或阻断激素进入任何其余癌细胞。用于激素受体阳性乳癌的激素疗法选自他莫昔芬，芳香酶抑制剂(AI)，例如阿那曲唑(Arimidex)，依西美坦(Aromasin)和来曲唑(Femara)，以及通过手术或通过选自促性腺激素、黄体化激素、戈舍瑞林(Zoladex)和亮丙瑞林(Lupron)的药物来抑制卵巢。
“生化标记物”是指与评估受试者中放射毒性风险增加相关的任何生化标记物。根据本发明的生化标记物选自RILA生化标记物(放射诱导的CD4和/或CD8，优选CD8T-淋巴细胞凋亡)，放射敏感性蛋白如AK2、HSPA8、IDH2、ANX1、APEX1和放射敏感性基因。
如本领域技术人员在该技术领域中所熟知的(Ozsahin等人,1997和2005)，RILA是生物样品(优选血液样品)用8Gy X-射线照射后放射诱导的淋巴细胞凋亡率和没有任何照射的淋巴细胞凋亡率(0Gy)之间的百分比(％)的差异。淋巴细胞包括CD4和/或CD8T淋巴细胞，特别是CD8T淋巴细胞。RILA也被定义为放射诱导的CD8T淋巴细胞凋亡(参见Azria等人,2015)。
因此，根据本发明的“对于RILA的生化标记物(biochemical marker consistingin RILA)”，也称为“RILA生化标记物(RILA biochemical marker)”，应当理解生物样品(优选血液样品)以8Gy X-射线照射后放射诱导的淋巴细胞凋亡率和没有任何照射的淋巴细胞凋亡率(0Gy)之间的百分比(％)的差异。
如实施例中进一步公开所示，根据本领域技术人员通常已知，根据RILA测定法来测量有和没有任何放射的淋巴细胞凋亡率(Ozsahin等人,1997和2005)。
“放射敏感性蛋白质”是指选自下面的蛋白质：腺苷酸激酶(AK2)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70或HSPA8)、线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、Anexin 1(ANX1)和DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)，其特定片段，编码它们的核酸，及其组合。这些蛋白质及其片段公开在WO2014/154854中。
所述放射敏感性蛋白质的存在或水平通过选自下面的至少一种方法确定：基于免疫检测的方法、基于蛋白质印迹的方法、基于质谱法的方法、基于色谱法的方法、或基于流式细胞术的方法，以及用于特异性核酸检测的方法。这些方法是检测和定量化合物，特别是蛋白质的领域的技术人员所熟知的，其中蛋白质的存在和表达水平可以直接测定或通过检测，优选定量蛋白质-特异性核酸，特别是mRNA在核酸水平上进行分析。在第一步中，从生物样品中分离蛋白质和/或核酸。根据本发明的方法可以包括使用公知的生化方法进行蛋白质提取、纯化和表征。
“放射敏感性基因”是指单核苷酸多态性(SNP)，其被鉴定为参与纤维化途径和ROS管理的基因。这些已经被单独鉴定为候选基因：TGFβ、SOD2、TNFα、XRCC1。如Azria等人，2008中所公开，通过基因组测定法对这些基因进行了分选。所述放射敏感性基因的存在或水平通过本领域技术人员已知的常规方法确定，特别是用于检测和定量特异性核酸的方法如PCR和定量PCR。在一个特定实施方案中，Azria等人，2008中公开的方法包括淋巴细胞分离，DNA提取和扩增，和变性高效液相色谱或使用Transgenomic WAVE高灵敏度核酸片段分析系统的Surveyor核酸酶测定。使用从NCBI获得的基因组序列来设计用于DNA扩增子的PCR引物，所述DNA扩增子包含上面公开的感兴趣的SNP。
“放射治疗”，它被称为涉及使用诸如X-射线，伽马射线，电子束或质子的高能放射的治疗，以杀死或破坏癌细胞并阻止它们生长和繁殖。
RILA测定
这种RILA测定通常包括以下步骤：
a)血液样品的细胞培养
b)使用线性加速器在8Gy下进行样品照射，和
c)进行样品标记以便评估T淋巴细胞凋亡，特别是用FACS分析。
本领域技术人员可以使用经典方法进行RILA测定。
在步骤c)中T淋巴细胞凋亡的评估可以使用替代方法，例如Anexin 5的剂量，半胱天冬酶的剂量或FACS分析，优选FACS分析。
以下公开了每个步骤a)至c)的一些细节作为特定实施方案。
血液样品的细胞培养：
-在放射治疗(RT)之前，从每个患者收集一份血液样品于肝素化管中，并将一定量的血液等分到孔板中；
-测定通常一式三份(0Gy和8Gy)进行。
-在6孔组织培养板中每孔加入培养基(例如：加入2ml补充有20％FCS的基质RPMI1640(Gibco))。
-将组织培养板在37℃，5％CO2下培养24小时。
使用线性加速器在8Gy下进行样品照射：
-培养15至30小时后，特别是24小时后，将板安全地运送至辐照器并交至放射技术人员，以1Gy/min的剂量率施加8Gy的放射。
在一个具体实施方案中，辐照条件是：
剂量率＝1Gy/min
能量＝6MV
深度＝细胞上15mm聚苯乙烯。
DSP(源和板之间的距离)＝145cm
场＝25*25cm2准直器。
线性加速器(机器输出：200UM/mn)：1Gy为200UM：8Gy为1600UM。
-从培养箱中取出对照细胞并放置相同的时间但不进行放射处理。
-将板在37℃，5％CO2下孵育40至50小时。
用于评估T淋巴细胞凋亡的样品标记，特别是用FACS分析：
-孵育40至50小时，特别是孵育48小时后，将板从培养箱中取出并置于室温下；
-将每个孔的内容物转移到预先标记的离心管中，并在离心后(例如：5分钟，1450rpm)，用抗人CD4和/或CD8-FITC抗体，优选CD8-FITC抗体标记内容物；
-在加入裂解缓冲液后，根据本领域技术人员已知的常规方法，特别是根据流式细胞术方法(FACS)，用碘化丙锭和RNase A作为试剂，将试剂加入每个试管中以评估淋巴细胞凋亡。
多变量Cox回归
多变量Cox回归是时间-事件(time-to-event)分析的常用统计模型之一(Cox等人,1984)。除了直接处理二元或多类结果的分类算法之外，多变量Cox回归定义了半参数模型，以直接将预测变量与实际结果相关联，其通常是生存时间(例如，数月或数年)。就区分时间-事件端点以组合独立参数而言，多变量Cox函数是最佳危害(hazard)函数。根据本发明，所述独立参数是与受试者中BLE发生相关的生化标记物和/或临床参数，例如，RILA、辅助激素疗法和吸烟习惯。
多变量Cox函数是当标记物与纤维化的观察结果呈负相关时，通过每个参数的相对权重(如多变量Cox回归中单独确定的)与负标志组合而获得的。
在本发明中，患者的分类是基于在临床随访研究期间检测BLE而进行的。
建模基于通过放射治疗和保乳术治疗的多中心乳癌患者群体(也称为“参考人群”)。构建模型的步骤包括：
-鉴定生物标记物(例如，RILA和与评估受试者中放射毒性风险增加相关的临床参数)；
-在多中心临床试验中使用所述鉴定的生物标记物，以确定相关的协变量作为BLE的预后因子；
-将这些变量应用于大型多中心临床试验，以确定组合生化标记物(RILA)和BLE临床参数的预测作用。
“多中心研究试验”是指在一个以上的医疗中心或诊所进行的临床试验。
根据本发明，多变量Cox函数是：
危害(hazard)(经历乳房晚期纤维化)＝基准危害*exp((β1*生化标记物)+β2*(临床参数1)+β3*(临床参数2)+...βn*(临床参数(n-1)其中n高于或等于3)，其中基准危害对应于当所有协变量为零时经历事件(BLE)的危害。
上述等式的右侧指定了模型的基础功能(underlying function)。等式的左侧是在列线图中呈现并传达给患者的预测概率。必须对每个协变量估计β系数，并将其转换为危害比率作为效果的量度，如任何统计报告中所述。为了获得所讨论事件的预测概率(经历乳房晚期纤维化)，使用患者的个体特征和模型推导的β系数来计算上述等式。
基准危害(baseline hazard)是一个常数，对应于在没有任何协变量的情况下发生BLE的基础风险(basal risk)。根据Cox回归模型的建模从来自如上所述的参考人群的数据给出该基准危害。
临床参数“1”至“n”选自：年龄、乳房体积、辅助激素疗法、加强(照射补充剂量)、淋巴结照射和吸烟，如表1中进一步公开所示。
对于临床参数“年龄”，中位年龄为55岁，以确定55岁或以下的患者(多变量Cox函数中给定值＝0)和年龄超过55岁的患者(多变量Cox函数中给定值＝1)。
对于临床参数“吸烟”，吸烟患者被定义为每日吸烟者、间歇性吸烟者或非每日吸烟者(在多变量Cox功能中给定值＝1)，而非吸烟患者被定义为偶尔吸烟者或从不每日吸烟者(在多变量Cox函数中给定值＝0)。
在一个特定的实施方案中，危害(经历乳晚期纤维化)＝基准危害*exp((β1*生化标记物)+β2*(临床参数1[0＝否；1＝是])+β3*(临床参数2[0＝否；1＝是]))，其中基准危害对应于当所有协变量为零时经历事件(BLE)的危害，并且优选地
危害(经历乳房晚期纤维化)＝基准危害*exp(β1*RILA生化标记+β2*(吸烟[0＝否；1＝是])+β3*(辅助激素疗法[0＝否；1＝是])，其中基准风险对应于当所有协变量为零时经历事件(BLE)的危害。
危害(经历乳房晚期纤维化)也被称为在描述中的受试者发生BLE的瞬时风险。
基于该多变量Cox函数，技术人员将能够向所述多变量Cox函数引入任何另外的相关生化标记物和/或临床参数。
本发明的最佳模型的选择由Harrell的C-指数评估，用于检查观察，并且等于两个生存分布之间的一致性概率(Harrell和Shih,2001)。C-指数或一致性指数量化预测概率与具有感兴趣事件的实际机会之间的一致性水平。
在一个实施方案中，本发明的预后方法的Harrell C指数为0.6876。
如实施例中所述，可以通过统计分析来计算用于多变量Cox回归中不同标记物所得值的不同系数。
在优选实施方案中，根据本发明的所述多变量Cox函数包括：
多变量Cox函数(经历BLE)＝基准危害*exp(β1*RILA+β2*(辅助激素疗法[0＝否；1＝是])+β3*(吸烟习惯[0＝否；1＝是])，其中：
-β1介于-0.077和-0.010之间；
-β2介于0.283和1.980之间；
-β3介于-0.063和0.965之间。
上面公式中的“多变量Cox函数(经历BLE)”，其表示根据多变量Cox函数(经历BLE)的危害，也称为根据多变量Cox函数(经历BLE)危害比率；该模型比较了2个患者群体。
患者的最终值及其用途
考虑到基础风险(基准特征)和协变量(临床参数)，估计每个患者发生BLE或“最终值”的瞬时风险；
“最终值”是每个患者发生事件的预测概率。
利用这些组合参数，列线图是一种流行的视觉图，用于显示事件发生的预测概率以供决策支持。
为了在拟合cox多变量模型之后构建该列线图，根据Iasonos等人(2008)描述的方法获得线性预测器。
在特定实施方案中，用于确定每个患者发生BLE(“最终值”)的概率的方法包括：
1、描述RILA和与评估受试者中放射毒性风险增加相关的临床参数，特别是选自年龄、乳房体积、辅助激素疗法、加强(照射补充剂量)、淋巴结照射和吸烟，如表1中进一步公开所示；
2、在Cox回归模型下，单变量分析(逐个评估每个参数以选择p值<＝0.2的所有显著性参数)；
3、在Cox回归模型下的多变量分析(通过单变量分析评估包括所有选择的参数+添加临床相关的可选非显著性参数)；
4、选择显著性和/或临床相关参数以获得最终模型，其线性预测器被提取以评估发生BLE的风险(概率)；线性预测器集成在软件中；
5、根据Iasonos等人(2008)执行软件以建立列线图(每个参数的线性预测器在0-100之间，包括主效应、相互作用和分段线性效应)。该表示通过根据每个个体参数计算每个患者放射治疗后的最终值来给出发生BLE的风险(概率)。
依靠根据本发明的统计分析方法(多变量Cox函数和线性预测器的提取)获得的最终值和通过用多变量Cox回归的分析，可能预测患者在放射治疗后的随访期间发生BLE的风险。例如，92％的“最终值”意味着发生BLE的风险为8％。
确定患者的最终值将有助于医生使放射治疗的剂量和顺序适应患者以限制乳房晚期效应。
在一个特定实施方案中，其中根据本发明的方法的多变量Cox函数的最终值用于为患者选择合适的治疗，例如适当的放射治疗方案，或在乳房切除术或保乳术之间进行选择，优选地，如果所述最终值大于20％(由专家定义的截止值)，则将考虑乳房切除术的决定而不是保乳术，反之亦然。将根据风险水平讨论照射量和处方剂量，即当所述最终值大于8％(从列线图获得的截止值包括所有独立预测因子)时，存在放射治疗后发生BLE的风险。在BLE高风险和最佳临床获益复发风险低的情况下，没有加强放射治疗，没有淋巴结照射和小于2.5Gy的每次分割剂量(dose per fraction)将是不同的治疗可能性。
在一个特定实施方案中，所述多变量Cox函数的最终值用于为患者选择合适的治疗，例如适当的放射治疗剂量方案，其中：
-如果患者存在发生乳房晚期效应的风险，则例如通过提供部分乳房大分割(hypofractionated)治疗，将适当减少放射治疗剂量方案；
-如果患者呈现低风险或没有发生乳房晚期效应的风险，则例如通过提供大分割治疗(5或16次分割，这是此类治疗中常见的分割次数)，将增加适当的放射治疗剂量方案。
特别是，如果发生BLE的风险大于8％，那么我们认为它是一个(高)风险患者。
特别是，如果发生BLE的风险小于8％，那么我们认为它是一个低风险的患者。
在另一个实施例中，根据本发明的方法的多变量Cox回归的最终值用于在保乳术或乳房切除术后执行立即乳房重建的决定，优选地，如果所述最终值小于8％，则将在保乳术或乳房切除术后考虑立即乳房重建。
列线图
本发明的另一个目的是提供用户友好界面，即实施所述多变量Cox函数的列线图、计算机或计算器，以帮助医生解释在RT后发生BLE的风险。因此，本发明包括实现根据本发明的所述多变量Cox函数的列线图。
如本文所用，“列线图”是指来自多变量Cox建模的预后公式的图形表示，其允许评估受试者中发生BLE的风险，例如，基于一个或多个容易获得的参数，包括但不限于RILA、辅助激素疗法、吸烟习惯和放射敏感性蛋白质如AK2、HSPA8、IDH2、ANX1、APEX1和/或放射敏感性基因。
列线图的有用之处在于它在用户友好的图形界面中将预测概率映射到0到100范围内的点。由各种协变量累积的总点数对应于患者的预测概率。
根据一个优选的实施方案，根据本发明的方法的步骤b)和c)可以通过将步骤a)中获得的数据实施到计算机或计算器来执行，所述计算机或计算器将计算多变量Cox回归和发生BLE的风险。因此，医生获得的数据更容易解释，并且将允许对方法改进从而在保乳术或乳房切除术后决定进行立即乳房重建的需要。
试剂盒
本发明的另一个目的涉及一种用于收集受试者数据的试剂盒，所述试剂盒进一步用于检测所述受试者中发生BLE的风险，包含：
-适用于生物样品(特别是血液样品)的生物运输的盒子/容器和袋子，和
-由患者和/或护士和/或医生完成的表格，其是专门设计的和进行放射敏感性试验和列线图分析所需的。
例如，表格可以包含旨在收集进行预测分析所需的信息的特定问题，例如患者是否已接受或将接受辅助治疗(化学疗法，激素疗法)，吸烟习惯以及采集血液样品时的日期和时间。
本发明的另一个目的涉及一种用于检测受试者中发生BLE风险的试剂盒，其包含：
-用于确定根据本发明的至少一种生化标记物的值的试剂，
-任选地收集关于根据本发明的至少两个临床参数的信息(例如调查)的工具，和
-任选地，根据本发明的列线图。
用于确定根据本发明的至少一种生化标记物的值的“试剂”，其表示在特定实施方案中，在独立实验室中进行RILA测定所需的一些或所有特定试剂，其中样品的照射将由线性加速器或实验室辐照器进行。
根据本发明的至少两个临床参数的“收集信息的工具”，其表示着在特定实施方案中，由患者和/或护士和/或医生完成的特定表格，其是专门设计的和进行放射敏感性试验和列线图分析所需的。在优选的实施方案中，这些表格可以包含旨在收集进行预测分析所需的信息的特定问题，例如患者是否已接受或将要接受辅助治疗(化学疗法，激素疗法)和吸烟习惯。
在一个特定实施方案中，一种用于检测受试者中发生BLE风险的试剂盒，其包括：
-在独立实验室中进行RILA测定所需的部分或全部特定试剂，其中样品的照射将由线性加速器或实验室辐照器进行，和
-任选地由患者和/或护士和/或医生完成的特定表格，其是专门设计的和进行放射敏感性试验和列线图分析所需的。
例如，进行根据本发明的RILA测定所需的特定试剂可包含PBS、抗人CD8-FITC和碘化丙锭。
有利地，本发明涉及一种用于检测受试者中发生BLE风险的试剂盒，其包含用于确定RILA浓度值的试剂，关于吸烟习惯和辅助激素疗法消耗的调查，以及根据本发明所述的列线图。
任选地，根据本发明的试剂盒还包括所述试剂盒的使用通知。
计算机系统
本发明的另一个目的是提供一种系统，其包含机器可读存储器，例如计算机或/和计算器，以及配置成计算根据本发明所述多变量Cox函数的处理器。该系统专用于执行根据本发明的方法诊断在受试者中放射治疗后发生乳房晚期效应(BLE)的风险。
在特定实施方案中，所述系统另外包含用于执行软件的模块以构建列线图(每个参数的线性预测器在0-100之间，包括主效应、相互作用和分段线性效应)并计算受试者在放射治疗后发生BLE的瞬时风险(‘最终值’)。
附图说明
图1：合并数据的ROC曲线。通过绘制患者分类后的灵敏度相比于1-特异性以及根据不同阈值(从0到1)的逻辑函数获得的值来绘制ROC曲线。
图2：根据合并数据的乳房晚期效应状态的RILA散点图。
具体实施方式
材料和方法
·患者分析
在多中心PHRC(‘Programme Hospitalier de Recherche Clinique’)研究中纳入的502名乳癌患者中进行了分析(合并数据)，该研究评估了在接受放射治疗和保乳术的患者中在随访期间针对BLE的预测性RILA试验。434名患者符合本研究的资格。患者包括在2007年1月15日和2011年7月11日之间，接着进行中位值为38.6个月的随访。为每位患者填写一份特定的问卷(病例报告表)，包括一般社会人口统计学管理数据、风险因子、以及每次就诊时的临床和生物学和治疗项目、和表1中描述的组织学数据。在基准处，由于重大偏差16名患者被排除，1名患者在任何治疗前撤回同意，并且29名参与者在技术上没获得血液样品。所有这些患者(n＝46)均按照现行指南进行治疗，因为未收集数据，因此未纳入分析。因此，在进入随访之前，对456名患者(90.8％)进行RILA和完全RT。根据方案，434名(86.5％)患者被随访至少36个月。其他22名患者在36个月之前中断了计划的随访。
为总共415名患者(“参考人群”)建立了多变量模型，其中包含所选参数的完整数据。
·放射诱导的CD8T淋巴细胞凋亡(RILA)程序
该方案改编自Ozsahin等人(Ozsahin，Crompton等人，2005年)的研究。在RT之前，在5ml肝素化管中收集来自每位患者的一份血液样品。将200μL血液等分到6孔板中。对于0和8Gy，所有测试一式三份进行。使用线性加速器(2100EX，200UM/min，Varian，美国)在放射科在24小时(H24)后提供照射(剂量率1Gy/min，区域大小25cm×25cm，单剂量8Gy)。从培养箱中取出对照细胞，并在Linac下放置相同的时间但不进行放射处理。照射后，立即将烧瓶在37℃(5％CO2)下孵育。再过48小时后(H72)，用抗人CD8-FITC抗体(10μL/测试，BectonDickinson，美国)标记。加入裂解缓冲液(Becton Dickinson，美国)后，向每个管中加入碘化丙锭(Sigma，法国)和RNAse(Qiagen，法国)并制备用于流式细胞术(FACS)。
·放射治疗的准备和提供
RT以仰卧位提供，以确保模拟和治疗期间的重复性。如有必要，计划目标体积包括整个乳房(WB)和区域淋巴结(RLN)。仅允许光子进行WB照射，从而允许跨中心的治疗标准化。
建议中位剂量为目标体积50Gy。区域安排涉及在锁骨上区域使用前光子场，并且以44-50Gy对内乳淋巴结使用前电子/光子的组合。通过两个相对的切向区域向WB提供每日50Gy的剂量；必要时给予手术床加强达到10-16Gy。每周5天，每次分割量为2Gy。使用3-D剂量测定法计算。ICRU报告62个处方点用于处方剂量。作为最低限度，在前三天每天获得在线门(portal)成像，在其余治疗过程中每周一次获得在线门成像。
·辅助系统疗法
指定的化学疗法(CT)方案(在结阳性和3级的情况下)包括或者在第1天，6个循环的FEC 100[5FU(500mg/m2)，表柔比星(100mg/m2)，环磷酰胺(500mg/m2)]，每21天重复进行，或者3个循环的FEC 100，接着每3周3个循环的多西紫杉醇(100mg/m2)。在HER2过表达或基因扩增的情况下，将曲妥珠单抗(以8mg/kg的负荷剂量开始)添加到方案中(每3周6mg/kg，持续1年)。激素疗法(HT：他莫昔芬或芳香酶抑制剂)在手术后或RT结束后开始，每天进行，持续5年。
·终点评估：鉴定生物标记物和相关协变量作为参考人群BLE的预后因子
主要目标是在放射诱导的≥2级BLE(定义为萎缩性皮肤、毛细血管扩张、硬化(纤维化)、坏死或溃疡)中的RILA预测作用。次要目标是急性副作用、局部复发、无复发生存(RFS)、无乳纤维化生存(BF-FS)、乳纤维化-无复发生存(BF-RFS)和总生存(OS)的发生率。评估急性和晚期副作用，并根据CTC v3.0量表进行分级(Trotti，Colevas等人，2003)。
在基准，每周在RT期间，最后一次分割RT后一个月，三个月和六个月，每6个月至36个月进行毒性评估。每个评估由医生进行评估，医生对RILA是遮盲的。在RT后的随访期间观察到的最严重的BLE被认为是主要终点。在RT后12周至3年观察到的最严重的晚期效应(肺、心脏)以及从RT开始至RT后12周观察到的最严重的急性副作用(主要是皮肤和肺)被认为是次要终点。使用在“皮肤病学/皮肤区域”，“肺/上呼吸道”和“心脏常规”(Trotti，Colevas等人，2003)范畴(scale)中描述的所有可能定义来评估毒性。
所有终点定义为RT开始和第一次事件之间的间隔：OS死亡，RFS局部或对侧或远处复发或死亡，BF-FS的≥2级BLE，以及BF-RFS的RFS和BF-FS的首次事件(Peto，Pike等人，1977)。检查的患者是在OS的最后一次随访时存活的患者、存活且无RFS复发的患者、从未经历过BF-FS≥2级BLE的存活的患者和从未经历≥2级BLE或BF-RFS复发的存活的患者。
·样品量计算和统计分析
为了测试RILA率对BLE发生的预测值，我们从我们的初步研究结果开始(Azria，Gourgou等，2004)。详细信息在以下方案中提供。简而言之，基于σ2＝0.54，估计的并发症率为ψ15％，双侧α误差为0.05，β误差为0.05(幂＝0.95)，必须包括430名患者。考虑到随访失败和加强对BLE的影响，患者数量增加至少15％(n＝494)。
σ2是研究变量(logCD8)的方差，ψ是并发症/毒性预期事件的比率。
使用非参数模型计算作为预后变量函数的并发症的累积发生率(Pepe和Mori，1993)。主要统计程序包括使用Fine等人(Fine，2001)的竞争风险模型的多变量分析，用于评估RILA率在其他事件(如复发或死亡)存在时对BLE发生的影响，所述其他事件被认为是该病理中的竞争风险事件。对于多变量分析，选择的因子是基准参数，在单变量分析中p-值(统计显著性)小于0.20。使用向后逐步选择(p<0.15)定义最终模型，并且使用逐步方法仅包括显著参数(p<0.05)或临床相关和/或(p<0.10)。
数据通过分类变量的频率和百分比以及通过连续变量的中值和范围进行汇总。照射前后RILA计数的绝对变化被评估为连续和分类变量。围绕33％分位数构建了三个类别(<12，12-20和≥20)，然后合并为两个类别(<12和≥12)。
OS、RFS、BF-FS和BF-RFS率通过Kaplan-Meier方法估算(Kaplan和Meier，1958)。还确定了百分之九十五的置信区间(95％CI)。
使用Cox比例危害回归模型(Cox等，1984)进行单变量分析和多变量分析以估计危害比率，包括基准特征和治疗参数。使用对数秩检验进行比较以进行单变量分析。从似然比统计数据评估独立影响。
评估了RILA对乳纤维化-无复发生存(BF-RFS)的影响。BLE和复发或死亡的累积发生率是根据竞争风险模型，使用从原因特异性危害函数和复合RFS和BF-FS分布(Arriagada，Rutqvist等1992)获得的估计值来估算的，并使用Gray’s检验进行比较。
使用逆Kaplan-Meier方法估算中位随访。p-值小于0.05被认为是显著的。所有统计检验都是双侧的。Stata用于所有统计分析(版本13.0)，SAS macro％cif用于Gray’s检验。
为了补充分析，进行RILA的接受者-操作者特征(ROC)曲线分析以鉴定在随访期间经历至少2级BLE的患者(Kramar，Faraggi等人，2001)。ROC曲线下的经验区域(AUC)和相应的95％CI用于RILA以确定灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。
实施例1：用于建模的描述性统计分析
对来自观察自变量的所有患者的研究的选定数据进行分析，如下表1所示。
表1：BLE的预后因子特征
根据CTCAE V3.0(Trotti，Colevas等人，2003)，评估毒性并将患者分为两组(有或没有BLE)。
主要终点是在随访期间确定有或无BLE的患者。第一阶段包括通过一维分析和使用对数秩检验确定这些组之间显著不同的因子。
第二阶段包括分析多变量Cox比例危害模型，以评估BLE诊断的独立参数，并评估定义为危害比率(HR)的效应大小。
此外，通过接收操作特性曲线(ROC曲线)评估总体诊断值。通过灵敏度(Se)、特异性(Sp)、阳性和阴性预测值(PPV、NPV)评估RILA的诊断值。
对于应答表型的这种诊断或预后，应答条件或测试结果被认为是阳性结果，而无应答条件或测试结果被认为是阴性结果。真假阳性结果、NPV、PPV、特异性、灵敏度被定义和计算如下：
PPV＝TP/(TP+FP)
NPV＝TN/(TN+FN)
特异性＝TN/(TN+FP)
灵敏度＝TP/(TP+FN)
“ROC”或“ROC曲线”是用于诊断测试评估的工具，其中真实阳性率(灵敏度)是患者分类后针对参数的不同截止点的假阳性率(1-特异性)的函数绘制的(图1)。ROC曲线上的每个点代表对应于特定决策阈值(从0到1)的灵敏度/特异性对。ROC曲线下面积(AUC)是参数区分两个诊断组(患病/正常)程度好坏的量度。测试的准确性取决于测试将被测试组分为有无所讨论疾病的好坏程度。准确性由ROC曲线下面积判断。面积为1表示完美测试；面积为0.5代表一个毫无价值的测试。
通常认为具有值大于0.7的曲线下ROC面积是对诊断的良好预测曲线。必须将ROC曲线确认为允许预测方法的诊断质量的曲线。
RILA标记物的诊断值(曲线下面积)如表2所示。
表2：随访期间患者显著BLE的生化标记物的诊断值(ROC曲线下面积±sd)；RILA作为BLE函数的灵敏度、特异性和预测值
Se：灵敏度；Sp：特异性；PPV：阳性预测值；NPV：阴性预测值。
结果
在分析中，已经证实阴性预测值(截止值≥20的RILA)非常好，大于90％，可能对患者有用。
在临床应用方面，高RILA(RILA≥20)的患者将不会观察到BLE并且将被建议用于大分割方案。
结论
在随访期间，RILA标记物是BLE的良好标记物，导致根据患者概况开发个性化治疗。
本发明人还证明了RILA标记物和两个临床参数(为吸烟习惯和辅助激素疗法)的组合，与单独的RILA(0.61)相比，AUC改善了0.68IC95％[0.608-0.749]，并且对于最佳阈值：
Se：0.80
Sp：0.487
VPP：0.209
VPN：0.935
这些结果表明，三个参数(RILA和两个临床参数(为吸烟习惯和辅助激素疗法))的组合，体外方法的特异性得到改善，阴性预测值甚至大于93％。
以415名患者的参考人群制作的以下实施例是说明性实施例，但不限制本发明的范围。
实施例2：多变量Cox函数的确定
通过多元Cox回归分析，采用独立参数，选择总共415名乳癌患者，所述患者保乳术后通过辅助放射疗法治疗。
BLE的总患病率为14.5％(415名患者中有60例)。
显著乳房晚期效应(BLE)的诊断
绘制每个研究的散点图以比较根据BLE状态的RILA水平。BLE患者呈现低水平的RILA。
此外，随着RILA值的降低，BLE的风险更高。与若干临床参数组合(吸烟习惯和辅助激素疗法；表3)，BLE的风险显著增加。
临床上由专业临床医生评估乳房晚期效应(BLE)，并使用本领域技术人员熟知的毒性的国际分级评分CTCAE V3.0来进行分级(Trotti，Colevas等人，2003)。NCI不良事件通用术语标准(NCI Common Terminology Criteria for Adverse Events，CTCAE)v3.0是一个描述性术语，其可用于不良事件(AE)报告。为每个AE术语提供分级(严重性)尺度。
表3：使用比例危害Cox模型(合并数据)检测无乳纤维化生存
(BF-FS)的独立预后因子的多变量分析。
HR＝由多变量Cox回归评估的危害比率。RILA＝放射诱导的CD8T淋巴细胞凋亡
*纳入模型的患者数量/纳入的人群中
**年龄(55)调整后的多变量模型，加强(N/Y)，结照射(N/Y)
结果
多变量模型确定三个参数(RILA、吸烟和辅助激素疗法)作为独立参数，活跃的/从前的吸烟患者的BLE风险增加(HR＝1.57CI95％[0.939-2.625])和激素疗法治疗的患者(HR＝3.10CI95％[1.327-7.243])和RILA水平升高的风险降低(HR＝0.96CI95％[0·926-0·990])。由于临床相关性，其他临床参数(年龄、加强和结照射)被整合到多变量模型中以进行调整。最后，没有为最终模型选择这些参数。
结论
临床参数(吸烟习惯和辅助激素疗法)和RILA的组合允许预测发生乳房晚期效应的概率以及临床和治疗参数的整合。所有这些参数都改善了仅由RILA评估的风险评估。
已经证实，阴性预测值非常好(大于90％)，可能对患者有用。在临床应用方面，乳癌复发风险较低且RILA较高的患者将提出大分割方案或部分乳房照射。分割的次数将减少，并且将提出更高的每次分割剂量。由于RILA测定，该方案将安全提供。
此外，只有在使用高RILA值评估认为乳纤维化风险低(风险小于约8％)的情况下，才会给患者提供需要立即乳房重建和放射治疗的策略。
实施例3：构建列线图，确定患者在放射治疗后随访期间发生乳纤维化的概率
根据Iasonos等人(2008)描述的方法构建列线图，作为说明性示例，多变量Cox函数评估的参数包括根据实施例2被鉴定为相关的所选参数：
-RILA p-值＝0.01
-吸烟 p-值＝0.085
-辅助激素疗法 p-值＝0.009。
可以通过经典统计分析来获得最佳β系数，并且本领域技术人员可以基于这些系数和所导致的危害(经历BLE)容易地构建列线图。
例如，RILA＝10％(如上所述在血液样品中确定)，非吸烟者和辅助激素疗法治疗的患者，我们可以逐步计算以下风险：
1/RILA＝10％ ＝>82分
2/非吸烟者/吸烟＝0 ＝>0分
3/辅助激素疗法治疗/Adj_HRM＝1 ＝>46分
4/总分：82+0+46＝128分
5/3y-BF-FS的概率为0.85至0.80，相当于发生乳房晚期效应的风险为15％至20％。
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Claims (15)

1.一种用于诊断受试者放射治疗后发生乳房晚期效应(BLE)的风险的体外方法，包括以下步骤：
a、从所述受试者的生物样品，优选所述受试者的血液样品中确定与评估受试者中放射毒性风险增加相关的至少一种生化标记物的值，所述生化标记物特别选自RILA、放射敏感性蛋白质和/或基因；
b、确定与评估受试者中放射毒性风险增加相关的至少两个临床参数的水平，所述临床参数特别选自年龄、乳房体积、辅助激素疗法、加强、淋巴结照射和吸烟；
c、通过多变量Cox函数组合所述数据以获得最终值以确定发生BLE的风险；
其中，通过以下方法获得来自所述多变量Cox函数的多变量Cox回归：
i)通过组合所述生化标记物和所述临床参数构建多变量Cox回归；和
ii)分析所述多变量Cox回归以评估生化标记物和临床参数的独立判别值。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种生化标记物包含RILA，其基于放射治疗(RT)后CD4和/或CD8的应答，优选基于放射治疗(RT)后CD8的应答。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两个临床参数至少为吸烟习惯和辅助激素疗法。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生化标记物与放射敏感性蛋白质和/或基因组合使用。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述放射敏感性蛋白质选自AK2、HSPA8、ANX1、APEX1和ID2。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述放射敏感性基因选自TGFβ、SOD2、TNFα和XRCC1。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述多变量Cox函数包括：
危害(经历BLE)＝基准危害*exp(β1*RILA+β2*(辅助激素疗法[0＝否；1＝是])+β3*(吸烟习惯[0＝否；1＝是])，其中：
β1介于-0.077和-0.010之间；
β2介于0.283和1.980之间；
β3介于-0.063和0.965之间。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述多变量Cox函数的最终值用于为患者选择合适的治疗，例如适当的放射治疗剂量方案，其中：
-当患者存在发生乳房晚期效应的风险时，则例如通过提供部分乳房大分割治疗，将减少适当的放射治疗剂量方案；
-当患者呈现低风险或没有发生乳房晚期效应的风险时，则例如通过提供大分割治疗(5或16次分割)，将增加适当的放射治疗剂量方案。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述多变量Cox函数的最终值用于在乳房切除术或保乳术之间进行选择，优选地，当所述最终值大于20％时，则将考虑乳房切除术的决定而不是保乳术，反之亦然。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述多变量Cox回归的最终值用于在保乳术或乳房切除术后决定执行立即乳房重建，优选地，当所述最终值小于8％时，则将考虑在保乳术或乳房切除术后立即乳房重建。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述函数表示为列线图。
12.一种适用于收集受试者数据的试剂盒，其包含：
-适用于生物样品，特别是血液样品，生物运输的盒子/容器和袋子，和
-由患者和/或护士和/或医生完成的表格，其是专门设计的和进行放射敏感性试验和列线图分析所需的。
13.一种适用于检测受试者发生乳房晚期效应(BLE)的风险的试剂盒，其包含：
-用于确定权利要求1、2和4-6所述的至少一种生化标记物的值的试剂；和
-任选地收集关于权利要求1或3所述的至少两个临床参数的信息的工具。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其包含：
-在独立实验室中进行RILA测定所需的部分或全部特定试剂，其中样品的照射将由线性加速器或实验室辐照器进行，和
-任选地由患者和/或护士和/或医生完成的特定表格，其是专门设计的和进行放射敏感性试验和列线图分析所需的。
15.一种系统，其包含机器可读存储器，例如计算机或/和计算器，以及配置成计算权利要求1到7所述的多变量Cox函数的处理器，并且优选地另外还包含用于执行软件的模块以构建列线图并计算受试者在放射治疗后发生BLE的瞬时风险。
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