CN105263578A - 确定放射敏感性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于体外确定受试者的放射敏感性的方法。更具体地，本发明涉及这样的方法，其包括在来自受试者的生物样本中诱导外源胁迫的步骤，接着在所述生物样本中以及在参考样本中比较一组限定化合物中所选的至少一种化合物的存在或水平。本发明还涉及所述至少一种化合物作为受试者的放射敏感性的预测生物标记物的用途。本发明还涉及可用在根据本发明的方法中的检测所述化合物中至少一种的存在或水平的试剂盒。

Description

确定放射敏感性的方法
技术领域
本发明涉及用于体外确定受试者放射敏感性的方法。更具体地说，本发明涉及一种方法，其包括在来自受试者的生物样本中诱导外源胁迫并比较所述生物样本和参考样本之间至少一种鉴定的化合物水平。本发明还涉及所述至少一种化合物作为受试者放射敏感性的预测生物标记物的用途。本发明还涉及可用在根据本发明方法中用于检测所述鉴定化合物中至少一个的水平的试剂盒。
背景技术
放射疗法的成功主要依赖于总施用剂量。在组织对电离放射损伤的敏感性上个体差异很大。每年在世界范围内，大约400万人通过放射疗法进行治疗。目前的估计表明，5-10％接受放射疗法的患者由于高度敏感显示不良反应。患者对电离放射的高度敏感可发展为严重的放射诱导副作用。目前仍然不可能预测这些副作用，其牵涉到限制给定的剂量具有降低患者治疗收益的风险。到现在为止，用于评估放射敏感性的实验方法对于待检查的大群体而言太费力。
已经开发了一些用于预测放射毒性的测试，但到目前为止，没有一个可使用在临床常规中。
克隆形成(clonogenic)测试评估放射之后淋巴细胞增殖能力的丧失(West等，1995)。其它测试基于放射后检测微核(Floyd和Cassoni，1994)。然而，常规实施中这些测试是有限的，其中没有用于临床的。
放射诱导的淋巴细胞凋亡(RILA)分析通过流式细胞术测量在放射(0.5-8Gy)之后CD4和CD8T-淋巴细胞的凋亡(Ozsahin等人，1997，Azria等人，2009)。在399个患者的群体中证实这种结果(Ozsahin等人，2005)。这种测量是基于伴随凋亡的特异性染色质变化导致的核DNA荧光减少并且能够鉴定过度敏感的患者。RILA分析的阳性预测值较弱，群体中80％患者检测出具有弱凋亡水平，这不代表任何晚期毒性。RILA分析具有0.70的灵敏度和低于0.50的特异性(Ozsahin等人，2005)。
研究了一些遗传变异(例如单核苷酸多态性(SNP)、拷贝数变异(CNV)或表观遗传修饰和放射毒性)之间的相关性(Azria等人，2008，Azria等人，2012)。已经鉴定了在氧化胁迫或炎症期间与DNA修复相关的、并与早期或晚期毒性相关的一些基因。然而，到现在为止，尚未证明基因型和放射毒性之间的关联以及缺少放射毒性的强遗传标记物。
一些蛋白质组学研究已初步解决了放射敏感性标记物的确定。WO2013/001507描述了一种方法，其包括为经受放射疗法的患者制定或调整治疗方案，其中所述方法是基于患者一组指示放射性毒性的血清多肽。在暴露至电离放射的小鼠模型的血清中，发现α1抗胰蛋白酶、APOA1和补体C3上调(Guipaud等人，2007)。Cai等人(2011)公开了接受放射的非小细胞肺癌患者的蛋白质组学分析。还发现在一小群放射诱导的肺毒性>2级的患者中，补体C3、C4b结合蛋白α链和玻璃体结合蛋白(Vitronectin)上调(Cai等，2010；Cai等，2011)。Skvortsova等人(2008)公开了前列腺癌细胞系和放射耐受的前列腺癌细胞系的蛋白质组谱。Stenmark等人(2011)公开了接受放射疗法的患者的循环(circulating)细胞因子水平。最后，Oh等人提出在硅(silico)分析中的原因(original)以及鉴定α-2巨球蛋白可能与肺癌患者放射诱导的肺部炎症风险增加相关，但没有在独立的群中证实这种结果(Oh等人，2011)。
针对放射敏感性的现有预测性测试中没有可用于临床常规的，由于两个主要的缺点：i)其缺乏灵敏度和/或特异性，没有同时具有足够好的阳性和阴性预测值，ii)其缺乏技术可行性以及需要长期延迟，需要训练有素的从业者、其成本高以及生物样本的侵入性采集。
因此，仍然需要显示受试者的放射敏感性的高度阳性和阴性预测值的简单、快速和可靠的方法。
本发明人已经证明，通过在来自受试者或患者的生物样本中诱导外源胁迫，确定至少一种鉴定的差异表达的化合物反映出所述受试者或患者的放射敏感性。因此，这种测试允许预测晚期放射诱导的毒性。
根据本发明的方法和用途将组织放射敏感性的详情提供给医师，从而有助于早期识别与恰当处理这些高度敏感性的患者。此外，对绝大多数被预测不具有高度敏感性的患者，这种方法或分析可以增加总放射剂量并可能在这些患者中会获得更高的治愈或控制率。在理论范围中，通过适度增加总放射剂量在一些患者中可以显著提高局部肿瘤控制。据建议，控制率增加20％是可行的。
本发明公开确认了来自RILA分析的结果并具有更高阳性预测能力的方法。此外，根据本发明的所述方法可以与其它测试组合使用，因此提高检测的预测值。RILA分析和根据本发明方法的组合可以以10％的患病率产生0.90的灵敏度和0.80的特异性。这个结果可允许所述测试在每天临床实践中实施。
根据本发明的方法代表在治疗性操作规程中的有用工具、在决策中的宝贵帮助并且可用于预防放射疗法诱导的毒性。
根据本发明的方法允许从简单的血液收集中以及在五天之内确定个体的组织放射敏感性的蛋白谱。这种测试的快速、重复性和逻辑简单性是有利于其在临床常规实施的有力论据。
发明内容
通过本文给出的详细描述和附图将使本发明得到更加透彻的理解，所述描述和附图仅以说明方式给出并不限制本发明的预期范围。
本发明首先涉及用于体外确定受试者的放射敏感性的方法，包括以下步骤：
a)在包含细胞的生物样本的第一部分诱导外源胁迫，
b)在步骤a)的部分中确定至少一种化合物的存在或水平，
c)在所述生物样本未承受所述外源胁迫的第二部分中确定所述至少一种化合物的存在或水平，
d)比较在所述第一部分以及在所述第二部分中确定的所述至少一种化合物的存在或水平的结果，并选择在所述第一和所述第二部分中差异表达的至少一种化合物，
e)在来自所述受试者的包含细胞的生物测试样本中诱导外源胁迫，
f)在步骤e)的测试样本中确定在步骤d)中选择的所述至少一种化合物的存在或水平，
g)将在步骤f)中确定的所述至少一种化合物的存在或水平的结果与在生物参考样本中相同化合物的存在或水平相比较，以及
h)通过步骤g)的比较确定所述受试者的放射敏感性。
术语“放射敏感性”涉及细胞、组织、器官和/或生物体对有害电离放射损伤(致死或亚致死)的内在易感性。在根据本发明的方法中，所述暴露至电离放射发生在治疗性放射电离期间，也被称为“放射治疗”或“辐射疗法”。根据临床实践，患者经受医疗使用的电离放射以控制或杀死靶细胞，特别是到放射剂量，对于医师和放射治疗师而言是详细描述和公知的。
本发明首先涉及用于确定和/或用于预测受试者的内在放射敏感性的方法。
在组织中放射作用背后的机制涉及分子损伤，特别是靶向DNA和质膜的分子损伤，其导致形成自由基和双链DNA断裂、以及多种细胞机制，如细胞防御、凋亡、胁迫反应和修复过程(Lacombe等人，2013)。
在根据本发明的方法中，“外源性胁迫”是通过电离放射或拟放射(radiomimetic)剂在细胞、组织和/或器官中诱导的胁迫。在根据本发明的方法中，“包含细胞的生物样本”是从人体分离的，以及向所述包含细胞的生物样本离体诱导所述外源胁迫。
在根据本发明的方法的具体方面，“包含细胞的生物样本”包括任何类型的细胞，其中所述细胞优选地选自以下：血细胞，更优选白血细胞，甚至更优选淋巴细胞，甚至更优选CD4+T淋巴细胞或CD8+T淋巴细胞。
在根据本发明的方法的具体方面中，在步骤a)、b)、c)和d)中，包含细胞的生物样本是从受试者、或从一组受试者中分离，所述受试者与期望确定放射敏感性的受试者不同。根据本发明方法的这种具体方面，所述包含细胞的生物样本分离自人类的身体。在根据本发明方法的具体方面中，在步骤a)、b)、c)和d)中，包含细胞的生物样本是从患有相同疾病的一组受试者中分离的，而不是从期望确定放射敏感性的受试者中分离。
在根据本发明的方法中，根据步骤b)、c)、d)、f)和g)中任一项所述的化合物优选是细胞内化合物。在本发明的具体实施方案中，所述化合物是由其氨基酸序列所定义的蛋白。在一种更具体的实施方案中，本发明包括检测所述蛋白或其特定片段的存在或水平。“其特定片段”意指从例如前体(这样一种蛋白，它是预-前-蛋白(pre-pro-protein)和预蛋白(pre-protein)的片段)的细胞内切割所得的片段。在具体的实施方案中，“特定片段”是由蛋白的配体(如抗体)特异性识别的蛋白的片段或表位。在另一具体实施方案中，本发明包括检测编码所述蛋白的核酸分子的存在或水平，所述分子优选为mRNA或cDNA分子，以及所述蛋白通过其核苷酸序列被限定。
化合物“存在”的确定导致指示其在样本中存在或不存在。化合物“水平”的确定可以产生其在样本中数量的估计。样本中化合物的水平可以是相对于参考样本进行表达的，例如以比率或百分比。根据所述确定所用的方法，所述水平也可以表达为信号的强度或定位。所述水平也可以表达为样本中所述化合物的浓度。优选地，在将样本中相关化合物的总浓度归一化之后表达所述样本中所述化合物的浓度。在根据本发明的方法中，将所述生物样本的第一部分中化合物的水平与所述生物样本的第二部分中相同化合物的水平进行比较，其中所述比较可能表示为在第一和第二部分中所述化合物的比率估计，或表示为在部分之一中所述化合物水平的百分比。在优选的实施方案中，根据本领域技术人员已知的方法，将每一部分中所述化合物的定量水平进行统计学比较以证明所述两个部分中化合物的差异表达。
在根据本发明的方法中，在来自所述受试者的测试样本中确定所述化合物的水平(在步骤f)中)。在具体的实施方案中，所述测试样本是相同性质的生物样本，而不是用于选择差异表达的化合物(在步骤d)中)的生物样本。作为一个示例，可以根据相同的方法收集和制备步骤d)和f)的样本。在另一具体的实施方案中，步骤f)的所述测试样本和步骤d)的所述样本是根据不同的方法制备的生物样本。
在根据本发明方法的实施方案中，参考样本是从同一受试者在诱导任何外源胁迫前制备的样本，并且优选为来自所述受试者所述生物测试样本的未承受外源胁迫的部分。在另一实施方案中，参考样本是来自已确定放射敏感性(例如，通过临床检测)的不同受试者的样本。
在具体的实施方案中，本发明涉及用于在体外确定受试者的放射敏感性的方法，包括以下步骤：
a)在来自所述受试者的含有细胞的生物测试样本中诱导外源胁迫，
b)在步骤a)的样本中确定至少一种化合物的存在或水平，所述化合物是选自以下的蛋白：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)、膜联蛋白1(ANX1)、其特定片段、其编码核酸以及其组合，
c)将所述至少一种化合物的存在或水平与参考样本中相同化合物的存在或水平进行比较，以及
d)根据步骤c)的比较确定所述受试者的放射敏感性。
在根据本发明方法的实施方案中，在承受或未承受外源胁迫的所述生物样本中差异表达的至少一种化合物选自参与这样机制的蛋白，所述机制包括代谢、能源生产、凋亡、钙结合蛋白、DNA损伤修复和细胞内活性氧(ROS)水平的调节。在另一具体实施方案中，在承受或未承受外源胁迫的样本中差异表达的至少一种化合物选自线粒体蛋白。在一种具体实施方案中，参与细胞内活性氧(ROS)水平调节的蛋白选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、APEX、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)和热休克同源蛋白71kDa(HSC70)。
根据具体实施方案，本发明包括在生物测试样本中确定至少一种蛋白的水平，所述蛋白选自已知参与细胞对胁迫响应的蛋白。在更具体的实施方案中，参与细胞对胁迫响应的蛋白选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)和热休克同源蛋白71kDa(HSC70)。
线粒体异柠檬酸脱氢酶2(NADP+)(氨基酸序列：SEQIDN°1、mRNA序列：SEQIDN°6，GeneID：3418；UniProtID：P48735)也定义为IDH2、ICD-M、IDP、NADP+-特异性ICDH、草酰琥珀酸盐(Oxalosuccinate)脱羧酶或以基因名IDH2命名。它包含N-末端线粒体信号肽并定位于线粒体。它在多种组织中TCA循环调节中发挥重要作用，催化异柠檬酸可逆地转化为α-酮戊二酸、以及NADP+转化为NADPH。所以，因为NADPH是还原型谷胱甘肽(GSH)再生所必须的、以及是负责预防ROS损伤的主要抗氧化剂，所以IDH2是线粒体抗氧化剂途径的关键组分(Lee等人，2004)。IDH2由SIRT3调节，SIRT3能够脱乙酰化然后活化IDH2，导致在线粒体中NADPH水平增加以及还原型谷胱甘肽比氧化型谷胱甘肽的比率增加(Someya等人，2010)。IDH2也可以在调节电离放射诱导的凋亡中发挥重要作用(Lee等人，2007)。
APEX1(氨基酸序列：SEQIDN°2，mRNA序列：SEQIDN°7，GeneID：328；UniProtID：P27695)命名为APEX核酸酶(APEN)、脱嘌呤-脱嘧啶内切核酸酶1(AP内切核酸酶1，APE-1)、REF-1(氧化还原因子-1或基因名命名为APEX1、APE、APE1、APEX、APX、HAP1或REF1)。它是真核细胞中主要的脱嘌呤/脱嘧啶内切核酸酶，其在所有DNA损伤(尿嘧啶、烷基化和氧化、以及脱碱基位点)包括单链断裂的DNA碱基切除修复途径中起着核心作用，并且还通过调控由普遍存在(即，AP-1、Egr-1、NF-kB、p53和HIF)和组织特异性(即，PEBP-2、Pax-5和-8、以及TTF-1)的转录因子直接调节的基因表达而具有共转录活性。此外，其通过在Rac1上的抑制作用来抑制活性氧(ROS)产生进而控制细胞内氧化还原状态，所述Rac1是膜非吞噬(nonphagocytic)NAD(P)H氧化酶系统的调节亚基(Tell等人，2009)。这些活性都位于为两个功能上不同的结构域中：N-末端主要发挥氧化还原活性，而C末端对DNA脱碱基位点发挥酶活性。一些研究表明，APEX1的功能多态性可用作放射诱导的预测性生物标记物。Yin等人证明APEX1多态性可预测在接受明确的(definitive)放射疗法治疗的非小细胞肺癌患者中放射肺炎的风险(Yin等，2011)。Chang-Claude等人证明APE1148Glu等位基因可能保护免于发展为放射治疗后的急性副作用(Chang-Claude等人，2005)。
热休克同源71kDa蛋白(氨基酸序列：SEQIDN°3，mRNA序列：SEQIDN°8，GeneID：3312；UniProtID：P11142)命名为热休克70kDa蛋白8或以基因名命名为HSPA8、HSC70、HSP73或HSPA10。它是属于热休克蛋白70(HSP70)家族的组成型表达的分子伴侣。HSC70与HSP70具有一些结构和功能上的相似性，但与HSP70以及其它热休克家族成员相比也具有不同性质。HSC70通过共伴侣的合作来执行其全部功能。其与许多其它分子相互作用以及调节各种细胞功能(Liu等人，2012)。其也参与各种疾病以及可能成为用于诊断的生物标记物和设计、发现和开发用于治疗各种疾病的新药的潜在治疗靶标(Liu等，2012)。研究表明HSC70过表达提供保护免于内源和外源生成的ROS的作用(Chong等人，1998)。其促进Nox蛋白的泛素化和降解，从而减少ROS产生(Chen等人，2012)。
在另一具体的实施方案中，本发明涉及检测至少一种化合物的水平，其中所述化合物是选自腺苷酸激酶(AK2)和膜联蛋白A1(ANX1)的蛋白。
腺苷酸激酶2(氨基酸序列：SEQIDN°4，mRNA序列：SEQIDN°：9，GeneID：204；UniProtID：P54819)命名为AK2、ATP-AMP磷酸转移酶2或以基因名命名为AK2或ADK2。它定位在线粒体膜间空间，其控制腺嘌呤核苷酸的水平。AK2是存在于从细菌到人类中的古老蛋白家族的成员，其催化ATP+AMP＝2ADP的可逆反应。AK的功能通常描述为维持腺嘌呤核苷酸的恒定浓度和固定比率以及通过核苷酸传感和信号传导来监测细胞能量状态，其是维持和细胞生长所必需的。最近的研究表明，AK2也是折叠蛋白反应(UPR)所需(Burkat等，2011)。在内质网(ER)动态平衡中的改变导致在ER中积累错误折叠/展开的蛋白，为保持ER动态平衡，细胞已经进化出UPR。所述UPR是响应代谢、氧化胁迫以及炎症应答途径中必需的适应性(adaptive)细胞内信号途径。
ANX1(氨基酸序列：SEQIDN°5、mRNA序列：SEQIDN°10，GeneID：301；UniProtID：P04083)命名为膜联蛋白I、膜联蛋白-1、依钙蛋白(Calpactin)II、依钙蛋白-2、嗜铬粒结合蛋白(Chromobindin)-9、脂皮质蛋白I、磷脂酶A2抑制蛋白、p35或者以基因名命名为ANXA1、ANX1或LPC1。它最早是在20世纪70年代末得以描述。这种37kDa的钙和磷脂结合蛋白是糖皮质激素诱导的类花生酸合成和PLA2的强抑制剂。最近对这种感兴趣分子的生物活性的兴趣已解开膜联蛋白1在以下中的重要功能特性：在多种炎症途径中、对细胞增殖机制、在细胞死亡信号传导的调节中、在凋亡细胞的吞噬清除中、以及最重要的癌变过程中(Lim等，2007)。
表1总结鉴定的蛋白及其参考
在本申请中，通过具体的氨基酸序列以及由相应的特定核酸序列，优选为mRNA或cDNA核酸序列来限定蛋白。本发明包括检测所述蛋白或核酸，包括所述具有选自SEQIDN°1至SEQIDN°5的序列的蛋白的任何天然变异体、或具有选自SEQIDN°6至SEQIDN°10的序列的核酸分子的变体。本发明还包括检测核酸分子的特定片段，所述核酸分子具有与选自SEQIDN°6至SEQIDN°10的序列的片段相对应的序列，其中所述核酸片段对应所述核酸分子的编码片段，或其中所述核酸片段编码具有选自SEQIDN°1至SEQIDN°5序列的蛋白的特定片段。
根据本发明的方法包括检测蛋白的变体，所述蛋白的变体包含或具有与选自SEQIDN°1至SEQIDN°5的序列具有至少80％、优选90％、更优选95％以及甚至更优选98％同一性的氨基酸序列。本发明包括检测mRNA的变体，其包含或具有与选自SEQIDN°6至SEQIDN°10的序列具有至少80％、优选90％、更优选95％以及甚至更优选98％同一性的核苷酸序列。如本文所使用，术语“同一性”在本文是指两条氨基酸序列或核酸序列在比较窗口中是相同的(即，在氨基酸以氨基酸计，或在核酸中以及核酸碱基计)。
术语“序列百分比同一性”是通过以下来计算：在比较窗口中比较两条最佳比对的序列，确定在两条序列中存在相同的氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数(即，窗口尺寸)，然后将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。氨基酸序列的序列同一性百分比也可以用BLAST软件使用默认或用户定义的参数计算出来。当应用于多肽时，术语基本相同是指当两条肽序列最佳比对时共享至少约80％序列同一性，优选至少约90％的序列同一性，更优选至少约95％的序列同一性或更多(例如，99％的序列同一性)。如本文所用，“衍生物”或“序列源自于”是指具有至少80％同一性，更优选至少90％同一性，甚至更优选至少95％同一性或更多，如99％同一性的氨基酸序列。
根据优选的实施方案，本发明包括在生物样本中确定选自以下的化合物的存在或水平：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、其特定片段、其编码核酸及其组合。
根据另一实施方案，本发明包括在生物样本中确定选自以下的化合物的存在或水平：DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、其特定片段、其编码核酸及其组合。
根据另一实施方案，本发明包括在生物样本中确定选自以下的化合物的存在或水平：热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、其特定片段、其编码核酸及其组合。
根据另一实施方案，本发明包括在生物样本中确定选自以下的化合物的存在或水平：腺苷酸激酶(AK2)、其特定片段、其编码核酸及其组合。
根据另一实施方案，本发明包括在生物样本中确定选自以下的化合物的存在或水平：膜联蛋白A1(ANX1)、其特定片段、其编码核酸及其组合。
根据另一优选的实施方案，本发明包括在生物样本中确定以下的存在或水平：
-至少一种化合物，其选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、其特定片段、其编码核酸及其组合，以及
-至少一种化合物，其选自：DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)、膜联蛋白A1(ANX1)、其特定片段、其编码核酸及其组合。
根据另一优选的实施方案，本发明包括在生物样本中确定以下的存在或水平：
-至少一种化合物，其选自：DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、其特定片段、其编码核酸及其组合，以及
-至少一种化合物，其选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)、膜联蛋白A1(ANX1)、其特定片段、其编码核酸及其组合。
根据另一优选的实施方案，本发明包括在生物样本中确定以下的存在或水平：
-至少一种化合物，其选自：热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、其特定片段、其编码核酸及其组合，以及
-至少一种化合物，其选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、腺苷酸激酶(AK2)、膜联蛋白A1(ANX1)、其特定片段、其编码核酸及其组合。
根据另一优选的实施方案，本发明包括在生物样本中确定以下的存在或水平：
-至少一种化合物，其选自：腺苷酸激酶(AK2)、其特定片段、其编码核酸及其组合，以及
-至少一种化合物，其选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、和热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、膜联蛋白A1(ANX1)、其特定片段、其编码核酸及其组合。
根据另一优选的实施方案，本发明包括在生物样本中确定以下的存在或水平：
-至少一种化合物，其选自：膜联蛋白A1(ANX1)、其特定片段、其编码核酸及其组合，以及
-至少一种化合物，其选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)、其特定片段、其编码核酸及其组合。
根据具体的实施方案，根据本发明的方法包括在生物样本中确定至少两种化合物的存在或水平，其中所述化合物是选自以下的蛋白：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、腺苷酸激酶(AK2)、膜联蛋白A1(ANX1)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、其特定片段、其编码核酸及其组合。
根据具体的实施方案，根据本发明的方法包括在生物样本中确定至少三种化合物的存在或水平，其中所述化合物是选自以下的蛋白：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、腺苷酸激酶(AK2)、膜联蛋白A1(ANX1)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、其特定片段、其编码核酸及其组合。
根据具体的实施方案，根据本发明的方法包括在生物样本中确定至少四种化合物的存在或水平，其中所述化合物是选自以下的蛋白：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、腺苷酸激酶(AK2)、膜联蛋白A1(ANX1)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、其特定片段、其编码核酸及其组合。
根据具体的实施方案，根据本发明的方法包括在生物样本中确定至少五种化合物的存在或水平，其中所述化合物是选自以下的蛋白：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、腺苷酸激酶(AK2)、膜联蛋白A1(ANX1)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、其特定片段、其编码核酸及其组合。
在另一实施方案中，本发明涉及用于确定受试者的放射敏感性的方法，包括以下步骤：
a)在来自所述受试者的含有淋巴细胞的生物测试样本中诱导外源胁迫，
b)在所述生物测试样本中确定诱导的凋亡的水平，
c)在来自相同受试者的生物测试样本中诱导外源胁迫，并确定至少一种化合物的存在或水平，其中所述化合物选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)、膜联蛋白1(ANX1)、其特定片段、其编码核酸及其组合，
d)将所述至少一种化合物的存在或水平与参考样本中相同化合物的存在或水平进行比较，以及
e)根据步骤b)诱导的凋亡水平以及步骤d)的比较，确定所述受试者的放射敏感性。
根据这种具体实施方案，根据本发明的方法包括检测外源胁迫诱导的淋巴细胞凋亡以及根据本发明的方法确定受试者的放射敏感性。在本发明更具体的实施方案中，通过电离放射诱导淋巴细胞凋亡。在甚至更具体的实施方案中，通过RILA分析检测放射诱导的淋巴细胞凋亡检测，如Ozsahin等人(2005)所述。在另一具体实施方案中，通过选自检测ADN片段化(Comet分析、TUNEL分析)以及检测线粒体途径的(检测半胱天冬酶3、检测细胞色素C)的方法检测凋亡。
在具体实施方案中，根据本发明的方法检测淋巴细胞凋亡和确定受试者的放射敏感性在来自相同受试者的不同生物样本上进行。在另一具体实施方案中，根据本发明的方法检测淋巴细胞凋亡和确定受试者的放射敏感性在相同性质的生物样本，例如提取自血液的白细胞上进行。在甚至更具体的实施方案中，在来自受试者的含有淋巴细胞的相同生物样本的不同部分进行根据本发明的方法和RILA分析。
在另一具体实施方案中，本发明涉及用于预测受试者晚期放射诱导毒性的易感性的方法，包括：
-根据本发明用于体外确定受试者放射敏感性的方法，以及
-如果所述至少一种化合物存在于所述生物测试样本中以及不存在于所述参考样本中、和/或如果在所述生物测试样本中所述至少一种化合物的水平高于所述参考样本中相同化合物的水平，则预测所述受试者对晚期放射诱导毒性的易感性的步骤。
本发明涉及用于确定受试者的组织和/或细胞的放射敏感性或放射灵敏度(radiosensibility)的方法，其中承受电离放射的组织和/或细胞包括放射特异性靶向的组织和/或细胞、还有由放射治疗非特异性靶向的正常或“健康”的组织和/或细胞，而且还包括在组织和/或细胞的放射体积中。在具体的实施方案中，本发明涉及用于确定患者的健康组织的放射敏感性或放射灵敏度的方法，其中“健康组织(或细胞)”定义为放射治疗非特异性靶向的组织(或细胞)。所述“健康组织”涉及靶组织相邻或周围的组织或细胞。“晚期副作用”或“长期副作用”或“晚期毒性”可在放射后3至6个月开始出现。症状是多重的，通常包括纤维化、组织坏死、萎缩、血管损伤以及在非常严重的情况下放射诱导的癌症，并且随着时间的推移显示恶化，甚至在放射治疗后20-34年(Lacombe等人，2013)。在具体的方面，晚期毒性是放射诱导的肺部炎症。
在具体的实施方案中，根据本发明的方法允许检测易被晚期放射超敏感性所影响的患者。晚期毒性症状的严重程度按等级分类。在具体方面中，根据本发明的方法允许确定2级或更高级(3级和更高)的晚期放射敏感性。
根据具体的实施方案，本发明涉及用于体外确定受试者的放射敏感性的方法，所述方法包括：
-确定选自以下的至少一种化合物的存在或水平：IDH2、APEX1、HSC70、AK2和ANX1，其特定片段、其编码核酸及其组合，
-如现有技术中描述的至少另一种放射敏感性的预测方法。所述其它预测方法可能但不局限于RILA分析或SNP检测分析。
根据具体实施方案，本发明涉及用于在体外确定受试者放射敏感性的方法，包括：
-确定IDH2的存在或水平的，其特定片段、其编码核酸及其组合，
-至少另一种放射敏感性的预测方法，优选RILA分析或SNP检测分析(Azria等人，2008)。
根据另一具体实施方案，本发明涉及用于在体外确定受试者放射敏感性的方法，包括：
-确定IDH2的存在或水平的，其特定片段、其编码核酸及其组合，
-确定选自以下的至少一种化合物的存在或水平：APEX1、HSC70、AK2和ANX1，其特定片段、其编码核酸及其组合，
-至少另一种放射敏感性的预测方法，优选RILA分析或SNP检测分析。
根据另一具体实施方案，本发明涉及用于在体外确定受试者的放射敏感性的方法，包括：
-确定以下的存在或水平：1)IDH2、其特定片段或其编码核酸，2)APEX1、其特定片段或其编码核酸，3)HSC70、其特定片段或其编码核酸，4)AK2、其特定片段或其编码核酸，5)ANX1、其特定片段或其编码核酸，以及
-至少另一种放射敏感性的预测方法，优选RILA分析或SNP检测分析。
在具体的实施方案中，在已知诱导的淋巴细胞凋亡测试结果的受试者的生物样本中进行根据本发明的放射敏感性的确定方法。在更具体的实施方案中，在受试者的生物样本中进行根据本发明的确定放射敏感性的方法，其中在所述受试者中RILA分析的结果表示低水平的诱导凋亡，以及优选诱导凋亡低于16％。
在具体的实施方案中，本发明涉及这样的方法，其中通过选自以下的至少一种方法诱导所述外源胁迫：进行放射以及接触至少一种拟放射剂。在第一具体实施方案中，所述外源胁迫由放射产生。在另一具体实施方案中，通过与至少一种拟放射剂接触产生所述外源胁迫。在另一具体实施方案中，通过放射以及通过与至少一种拟放射剂接触产生所述外源胁迫。
在更具体的实施方案中，所述外源胁迫由放射诱导，其中所述放射剂量包含在约0.1至约16Gy之间，优选在约2至约14Gy之间，更优选高于约4Gy，优选在约4至约12Gy之间，优选约6至约10Gy，以及更优选为约8Gy。术语“约”是指在使用剂量上可能+/-10％的变化。在根据本发明的方法中，生物样本是通过8Gy的X射线进行辐射。
在具体的实施方案中，样本以1Gy/分钟的剂量流量(debit)接受8Gy。用于放射的参数是指示性的，并且可以由本领域技术人员根据其实践以及用于线性加速度的设备进行调整。在具体的实施方案中，通过15mm厚的聚苯乙烯6孔细胞培养板进行放射。通过6MV的束(beam)，在准直仪中以源至表面为145cm的距离以及25×25cm的放射场对样本进行放射。作为用于输送8Gy剂量的示例，当使用“GESaturne43”线性加速器时，加速器必须输送1520MU(检测器计数(MonitorUnit))的剂量，而使用“Varian”线性加速器时，加速器必须输送1600MU的剂量。
在另一具体的实施方案中，通过将样本与至少一种拟放射剂接触来诱导所述外源胁迫。“拟放射剂”是在细胞上诱导与电离放射所引发的效果相似的那些效果的物质，拟放射剂可以视为“模拟”电离放射在细胞中的至少部分作用。作为非限制性示例，拟放射剂可以引发单链和/或双链DNA断裂或可导致细胞内存在自由基。在具体的实施方案中，样本与单一拟放射剂接触。在另一具体的实施方案中，样本与两种或更多拟放射剂接触，所述剂同时或相继使用。用于根据本发明方法的拟放射剂可选自：阿非迪霉素(aphidicolin)、博莱霉素(bleomycin)、烯二炔(enediyne)抗生素和过氧化氢。已知博萊霉素引发单或双链DNA断裂，而已知过氧化氢诱导自由基。根据本发明的方法不限于使用特定的拟放射剂，因此本领域技术人员将容易选择适合用于实施根据本发明具体方法的剂。根据所述具体实施方案，通过下列条件，如在Kennedy等人(2006)、Adema等人(2003)、CloosJ等人(1999)或Tedeschi等人(2004)所述的，进行与拟放射剂的所述接触。在具体的实施方案中，通过与拟放射剂(如在本申请中所描述的)相接触诱导根据本发明的方法中的淋巴细胞凋亡。
在另一具体实施方案中，根据本发明的方法包括生物样本的制备，所述样本选自：全血、含有细胞的全血提取物、含有白细胞的全血提取物、含有淋巴细胞的全血提取物和含有CD4+和/或CD8+T淋巴细胞的全血提取物。
含有细胞的全血提取物是根据本领域技术人员公知的方法操作血液样本来制备以用于生物测试。这样的方法可以包括，例如，在Ficoll梯度中的血液组份分离、使用来自StemCell的RosetteSepTM或使用流式细胞仪的快速血细胞分离。
根据本发明的方法包括制备生物样本和在所述样本的部分上诱导外源胁迫。
在更具体的实施方案中，本发明涉及其中生物样本是根据下列方法制备的方法：
a)从所述全血提取物分离淋巴细胞，
b)对步骤a)的所述分离的淋巴细胞进行放射，以及
c)从步骤b)的淋巴细胞提取蛋白。
在更具体的实施方案中，本发明涉及这样的方法，其中至少一种化合物的存在或水平由选自以下的至少一种方法确定：基于免疫检测的方法、基于western印迹的方法、基于色谱的方法，以及优选为液相色谱法、基于质谱的方法、基于流式细胞术的方法以及用于特定核酸检测的方法。
这些方法是本领域技术人员公知的检测和定量化合物，特别是蛋白质的方法，其中可直接确定蛋白表达的存在和水平，或者可通过检测(优选定量)蛋白特异性核酸特别是mRNA从而在核酸水平分析蛋白表达的存在和水平。
在第一步，从生物样本分离蛋白和/或核酸。根据本发明的方法可以包括使用公知的生物化学方法进行蛋白提取、纯化和鉴定。
基于质谱的用于检测蛋白特异性的方法包括但不限于选择反应监测(SelectedReactionMonitoring)(SRM)和多重反应监测(MultipleReactionMonitoring)(MRM)。基于流式细胞术的方法包括但不限于将流式细胞术与微球和激光结合的多重分析，如
用于核酸特异性检测的方法包括用于分析DNA和RNA特别是mRNA的方法。在分子生物学通常使用的方法是分析核酸的领域技术人员公知的，并在文献中有充分描述(ManiatisT.等人，1999年版)。包含与选自SEQIDN°6至SEQIDN°10的序列具有至少80％同一性的核酸序列的核酸分子，考虑到遗传密码子简并性，优选为编码相同氨基酸序列的序列，或者在强严谨条件下能够与选自SEQIDN°6至SEQIDN°10的序列特异性杂交的互补序列。强严谨条件是指选择温度和离子力的条件以允许在两条互补核酸分子或片段之间维持杂交。在一种实施方案中，根据本发明的方法包括使用能够与SEQIDN°6至SEQIDN°10的mRNA分子特异性杂交的短寡核苷酸序列。
在一种具体的实施方案中，根据本发明的方法包括从生物样本中提取RNA。使用Trizol试剂提取后，通过全局运行(globalrunon)测序进行基因组范围的转录反应。通过RNA测序(RNAseq)的转录组分析允许定量转录物。RNAseq允许检测可选择剪接的转录物以及SNP。此外，除了转录调节的编码基因，可以进行(follow)非编码基因，如产生长的非编码RNA或微小RNA的那些。
在一种具体实施方案中，本发明涉及用于体外确定受试者的放射敏感性、或用于预测受试者中晚期放射诱导毒性的易感性的方法，所述方法包括检测选自以下的至少两种蛋白的存在或水平：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)、和膜联蛋白1(ANX1)。
在另一具体实施方案中，本发明涉及用于体外确定受试者的放射敏感性、或用于预测受试者中晚期放射诱导毒性的易感性的方法，所述方法包括检测线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)以及DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)的存在或水平。在另一具体实施方案中，本发明涉及用于体外确定受试者的放射敏感性、或用于预测受试者中晚期放射诱导毒性的易感性的方法，所述方法包括检测线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)以及热休克同源蛋白71kDa(HSC70)的存在或水平。在另一具体实施方案中，本发明涉及用于体外确定受试者的放射敏感性、或用于预测受试者中晚期放射诱导毒性的易感性的方法，所述方法包括检测线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)以及腺苷酸激酶(AK2)的存在或水平。在另一具体实施方案中，本发明涉及用于体外确定受试者的放射敏感性、或用于预测受试者中晚期放射诱导毒性的易感性的方法，所述方法包括检测线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)以及膜联蛋白1(ANX1)的存在或水平。
在另一具体实施方案中，本发明涉及用于体外确定受试者的放射敏感性、或用于预测受试者中晚期放射诱导毒性的易感性的方法，所述方法包括检测选自以下的至少三种蛋白的存在或水平：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)、和膜联蛋白1(ANX1)。
在另一具体实施方案中，本发明涉及用于体外确定受试者的放射敏感性、或用于预测受试者中晚期放射诱导毒性的易感性的方法，所述方法包括检测选自以下的至少五种蛋白的存在或水平：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)、和膜联蛋白1(ANX1)。
根据本发明，所述方法允许检测患有对放射疗法治疗易感的疾病的受试者的放射敏感性。在具体实施方案中，所述疾病非限制性地选自：癌症、巴塞杜氏病(Basedow)(或格雷夫(Grave)氏病)、甲状腺功能亢进、垂体腺瘤(或腺瘤)、脑脊膜瘤(meningiome)(或脊膜瘤(meningioma))和talalgy(或足跟痛(talalgia))。
在一种具体实施方案中，根据本发明的方法允许确定患有癌症受试者的放射敏感性，所述癌症包括，但不限于乳癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肺癌、头颈部癌。
根据具体方面，本发明涉及至少一种化合物作为标记物用于体外确定受试者的放射敏感性或用于预测晚期放射诱导毒性的易感性的用途，所述化合物选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)、和膜联蛋白1(ANX1)或其组合。
根据另一实施方案，本发明涉及线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)以及选自APEX1、HSC70、AK2和ANX1或其组合的至少一种化合物作为标记物用于体外确定受试者的放射敏感性或用于预测受试者晚期放射诱导毒性的易感性的用途。
在更具体的实施方案中，本发明涉及选自IDH2、APEX1、HSC70、AK2和ANX1或其组合的至少两种化合物作为标记物用于体外确定受试者的放射敏感性、或用于预测晚期放射诱导毒性的易感性的用途。在甚至更具体的实施方案中，本发明涉及选自IDH2、APEX1、HSC70、AK2和ANX1或其组合的至少三种化合物作为标记物用于体外确定受试者的放射敏感性、或用于预测受试者中晚期放射诱导毒性的易感性的用途。在另一具体的实施方案中，本发明涉及选自IDH2、APEX1、HSC70、AK2和ANX1的至少四种化合物作为标记物用于体外确定受试者的放射敏感性、或用于预测受试者中晚期放射诱导毒性的易感性的用途。在甚至更具体的实施方案中，本发明涉及IDH2、APEX1、HSC70、AK2和ANX1的组合作为标记物用于体外确定受试者的放射敏感性、或用于预测受试者中晚期放射诱导毒性的易感性的用途。
根据另一实施方案，本发明涉及在根据本发明的方法中，选自IDH2、APEX1、HSC70、AK2和ANX1或其组合的至少一种化合物作为标记物用于体外确定受试者的放射敏感性、或用于预测受试者中晚期放射诱导毒性的易感性的用途。
根据另一具体实施方案，本发明涉及一种试剂盒，其可用于体外确定受试者的放射敏感性、或用于预测受试者中晚期放射诱导毒性的易感性，所述试剂盒包含用于特异性检测至少一种化合物的至少一种试剂以及用于诱导和/或检测细胞凋亡的试剂，所述化合物选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)、和膜联蛋白1(ANX1)。用于检测细胞凋亡的试剂可以是本领域技术人员在这种方法中所用的任何试剂。用于检测细胞凋亡的方法和试剂的示例是ADN片段化的检测(Comet分析，TUNEL分析)，线粒体途径的检测(半胱天冬酶3的检测、细胞色素C的检测)、膜联蛋白A5。
在所述具体实施方案中，在根据本发明的试剂盒中用于特异性检测选自IDH2、APEX1、HSC70、AK2和ANX1的至少一种化合物的试剂，是所述蛋白之一的特异性抗体或配体，包括其天然变体、或其特定片段。在另一具体实施方案中，在根据本发明的试剂盒中用于特异性检测选自IDH2、APEX1、HSC70、AK2和ANX1的至少一种化合物的试剂是核酸分子，其能够特异性结合编码选自IDH2、APEX1、HSC70、AK2和ANX1、或其片段的蛋白的核酸分子。
在一种更具体的实施方案中，在根据本发明的试剂盒中用于特异性检测至少IDH2、APEX1、HSC70、AK2和ANX1的试剂是核酸，其在严谨条件下杂交至包含选自SEQIDN°6至SEQIDN°10、或其片段的序列的核酸分子，其中所述序列编码IDH2、APEX1、HSC70、AK2或ANX1的特定片段。
在更具体的实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其包括至少用于特异性检测IDH2的试剂、以及用于特异性检测至少APEX1、HSC70、AK2和ANX1、或其特定片段的试剂。
在更具体的实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其包括至少用于特异性检测选自IDH2、APEX1、HSC70、AK2和ANX1、或其特定片段的至少两种化合物的试剂。
在更具体的实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其包括至少分别用于特异性检测选自IDH2、APEX1、HSC70、AK2和ANX1、或其特定片段的至少三种化合物的试剂。
在更具体的实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其包括至少分别用于特异性检测选自IDH2、APEX1、HSC70、AK2和ANX1、或其特定片段的至少四种化合物的试剂。
在甚至更具体的实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其包括至少分别用于特异性检测下列化合物：IDH2、APEX1、HSC70、AK2和ANX1、或其特定片段的试剂。
本文提供下列实施例仅用于说明目的，除非另行指出，否则并不意图限定。
附图说明
图1：从四个患者的全血采集中用来鉴定与晚期放射毒性相关蛋白的操作规程的示意图。患者1：在放射治疗(RT)后36个月毒性高于2级。患者2：在RT后48个月毒性高于2级。患者3：在RT后48个月无毒性。患者4：在RT后54个月无毒性。
图2：根据观察到的晚期放射毒性，验证AK2、ANX1、HSC70、IDH2以及APEX1的表达水平。B-肌动蛋白是蛋白量的对照。左图：来自患者的蛋白提取物的western印迹分析，所述患者的RILA分析结果(在图中＝TALRI)低于16％并且毒性高于2级毒性。中间图：来自患者的蛋白提取物的western印迹分析，所述患者的RILA分析结果低于16％并且毒性低于2级毒性。右图：来自患者的蛋白提取物的western印迹分析，所述患者的RILA分析结果高于16％并且毒性低于2级毒性。
图3：定量检测AK2、ANX1、HSC70、IDH2和APEX1。
柱状图表示从患有毒性低于2级的患者(浅左图)以及从患有毒性高于2级的患者(深右图)提取的蛋白水平，由左到右分别为AK2、ANX1、HSC70、IDH2和APEX1。
图4：用于检测生物标记物存在的测试操作规程的示意图。
图5A和5B：在诱导的纤维化中的蛋白检测。
图5A：在与诱导纤维组织形成(fibrose)的TGFb1接触过或没有接触过的组织中CTGF、a-sm肌动蛋白、HSC70、APEX1表达的western印迹分析。
图5B：在与诱导纤维组织形成的TGFb1接触过或没有接触过的组织中CTGF、a-sm肌动蛋白、HSC70、APEX1表达的柱状示意图。
具体实施方式
实施例1：淋巴细胞凋亡分析
本发明人之前开发了快速并可重复的分析称为RILA(放射诱导淋巴细胞凋亡)，其通过流式细胞术测量在放射(0.5-8Gy)之后CD4和CD8T-淋巴细胞的凋亡。这种测量是基于伴随凋亡的特异性染色质变化导致的核DNA荧光减少。在150位患者中，在传统手术之后与同时或依次使用来曲唑的手术后放射治疗进行比较，RILA用作早期乳癌II期随机研究中的主要分层(stratification)因子，主要结局(primaryend-point)是乳房纤维化(Azria等人，2010)。RILA>16％的患者没有发现表现出放射诱导的晚期影响，表明本次测试的高阴性预测值。所有具有2级或更差的皮下纤维化的患者具有<16％的RILA，证实了测试的预测值。然而，在RILA<16％的患者中，20％患有晚期放射毒性和80％没有晚期放射毒性，表示RILA的弱阳性预测值。RILA分析的灵敏度是0.70，而这种测试的特异性低于0.50。从上述前瞻性研究中选择接受乳癌治疗并且具有低RILA值的四名患者。两名患者发展为严重的(大于2级)纤维化毒性(患者N°1和N°2)，然而患者在放射治疗结束后的至少四年没有出现毒性(患者N°3和N°4)。
实施例2：鉴定晚期诱导的细胞毒性的预测标记物
用于鉴定预测标记物的操作规程示意在图1中。从前述四位患者中，在肝素化的管中总共收集40ml血。根据制造商的说明使用花环(rosette)(StemCellTechnology)进行阴性选择，接着通过Ficoll梯度(GEHealthcare)从全血中分离T-淋巴细胞。然后，淋巴细胞在具有10％FCS的RPMI介质中在37℃和5％CO2中培养24小时。随后，一半的淋巴细胞在体外经8Gy放射。然后，放射和非放射的淋巴细胞再次在37℃和5％CO2中培养48小时。在此孵育时间之后，然后将来自每个患者的淋巴细胞提交至亚细胞分馏(fraction)(亚细胞蛋白质组提取试剂盒(目录539790)，Merckmillipore)允许分离胞浆、膜和核的馏分。然后，通过定量蛋白质组学工作流程使用8-plexiTRAQ标记将各个这些馏分进行分析。经过数次分馏以优化分析的分辨率(脱胶(offgel)分馏，随后是纳米流体色谱)，通过串联质谱法(4800plusMALDITOF/TOF)鉴定蛋白。
简言之，来自每个患者的放射和非放射的淋巴细胞的50μg蛋白在用iTRAQ标签标记之前进行还原、烷基化和胰酶消化。对每个馏分(细胞质、膜和核)、每个患者的8种标记(包括放射和非放射的淋巴细胞的馏分)在液体介质型脱离胶(Offgel)中通过分离电泳(isoelectrofocalisation)进行合并和分馏(Agilent3100Offgel分馏分离仪)。因此获得12种亚馏分。然后，通过与自动点样装置(spottingautomat)相连的反相高效液相纳米层析法(HPLC)(Ultimate3000LCSystems,Dionex)将这些亚分馏中的每一种进行分离。然后将12种脱离胶亚馏分放置在MALDI板上，每一种600个点。一式两份进行HPLC。对于每个馏分(细胞质、膜和核)使用8个MALDI板，从而产生共24个板。然后，在系统MALDI蛋白质组学分析仪d’AbSciex上进行质谱分析法来鉴定。以正电模式(positivemode)使用1500激光脉冲来获得m/z700-1400的谱。具有大于或等于50信/噪比的十种丰度(abundant)最大的肽的前体离子被选择使用m/z300-1500的3500激光脉冲进行MS/MS分析。使用ProteinPilot2.0软件和Paragon方法(AbSciex，软件版本50861)将MS/MS谱与来自欧洲生物信息研究所的Uniprot蛋白数据库(uniprot_sprot300108)进行比较。以高置信区间(>95％)，将对应独特肽的蛋白认定为阳性鉴定。
结果：
在具有发展成晚期毒性的两个患者和没有任何毒性影响的两个患者之间，在0Gy以及8Gy时差异表达的蛋白之间的比进行比较。以高置信度(95％，唯一的肽)鉴定出总共超过1300种的蛋白。在0Gy时，具有或不具有严重放射诱导毒性的患者之间有135种蛋白差异表达(p<0.05)。在放射的T淋巴细胞(8Gy)中，具有或不具有严重放射诱导毒性的患者之间有107种蛋白差异表达(p<0.05)。选择用于验证步骤的蛋白是以最高蛋白表达率(>1.5)在8Gy时差异表达的那些，以及在0Gy对照中没有显示差异表达比率的那些。
选择五种蛋白用于连续验证：异柠檬酸脱氢酶2(NADP+)(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶2(AK2)和膜联蛋白1(ANX1)。这些蛋白都参与了一些机制，包括代谢和能量产生、凋亡、钙结合蛋白和DNA损伤修复。
实施例3：放射治疗后在更大数目的患者中确认生物标记物的差异表达
通过western印迹分析在18位患者的额外群体中来验证这五种蛋白，其中5位患者已经发展为≥2级乳腺纤维化以及13位患者发展为仅有弱毒性或无毒性。所有这些10位患者呈现低RILA值。如前述实施例所述，收集和处理血液样本，直到放射后进行孵育。然后，在RIPA缓冲液中裂解淋巴细胞。然后，再定量蛋白，之后每10μg放在12％聚丙烯酰胺凝胶中用于Western印迹。迁移之后，在300mA中在4℃转移至PVDF膜上1小时，然后在PBS-吐温0.05％-乳5％中使膜饱和2小时，在相同的饱和缓冲液中针对感兴趣蛋白的抗体在搅拌下在4℃孵育过夜。在PBS-吐温0.05％缓冲液中5次连续的5分钟洗涤之后，然后将二抗加入PBS-吐温0.05％缓冲液中在室温下1小时。在PBS-吐温0.05％的缓冲液中另外5次5分钟洗涤之后，通过ECL进行显色。
结果：
结果表明，与没有晚期毒性的患者相比，来自患有严重毒性患者的经过放射的T-淋巴细胞中，这5种蛋白全部过度表达(图2)。定量表达分析证实这些差异的统计显著性(表2和图3)。
表2
总之，所鉴定的五种生物标记物允许在具有弱RILA的初步鉴定为放射敏感的易感患者中进行区分。因此，本测试不仅证实RILA的结果，还显示出更加的区分能力。
实施例4：患者样本的蛋白质组学分析
样本采集：从每个患者采集21ml肝素化的全血，优选在放射治疗开始之前。
T淋巴细胞分离：立即通过使用Rosette四聚体复合系统(RosetteSep,StemCellTechnologies)按照制造商建议通过阴性选择纯化T淋巴细胞。这种操作规程允许每个患者回收七百五十万至一千五百万个细胞。
T淋巴细胞原代细胞培养：将纯化的T淋巴细胞在含有RPMI1640介质(GibcoBRLInvitrogen)的补充有10％FCS的两个皿中培养24小时。
T淋巴细胞培养物的放射：对于每个患者，1个细胞培养皿以8Gy进行放射并孵育48小时。另一个细胞培养皿遮蔽(shamed)放射，视为对照(0Gy)。
Western印迹分析：通过RIPA缓冲液从三分之二的细胞提取T淋巴细胞蛋白(三分之一可保存用于补充研究)。使用BCA蛋白分析试剂盒根据制造商的操作规程(ThermoFisherScientific，Rockford,IL)定量细胞裂解物。然后，上样10μg的蛋白并在12％的SDS-PAGE中进行分离，然后转移到PVDF膜上。膜上的非特异性结合在室温下用5％脱脂乳封闭1小时。在4℃下将膜与如下稀释的一抗孵育过夜：AK2(1/100，sc-28786；SantaCruzBiotechnology,Inc.,SantaCruz，CA)、膜联蛋白-1(1/100，sc-11387；SantaCruzBiotechnology,Inc.,SantaCruz，CA)、HSC70(1/200，sc-7298，SantaCruzBiotechnology,Inc.,SantaCruz，CA)、IDH2(1/100，sc-134923；SantaCruzBiotechnology,Inc.,SantaCruz，CA)和Ref-1(1/200，sc-5572，SantaCruzBiotechnology,Inc.,SantaCruz，CA)。然后，用二抗(山羊抗兔IgG(H+L)G21234；Invitrogen对于AK2、膜联蛋白-1、IDH2、Ref-1和山羊抗小鼠IgG(H+L)，115-035-146；JacksonImmunoResearch对于HSC70)在室温下与膜一起孵育1小时。使用增强的化学发光检测系统通过采用SuperSignalWestPico化学发光底物试剂盒(Pierce)将免疫印迹显影。使用ImageJ软件(国立卫生研究院,Bethesda,MD)进行图像分析。
开发用于五种候选蛋白的ELISA分析：为了提出可靠的、快速的和易于使用的分析，开发出ELISA策略。通过Abnova对每个蛋白产生针对抗原肽的两种抗体。所述抗体已经测试用于ELISA。使用用于产生抗体的抗原，在96孔格式中建立夹心ELISA测试。后者还作为定量标准。对于每种蛋白，一种抗体用于捕获靶标和用于包被孔。另一种抗体通过来自Pierce的EZ-Link磺基-NHS-生物素化试剂盒与生物素相连。链霉亲和素-HRP与适当底物缓冲液一起用于检测。在上述使用这种测试获得的细胞提取物中测量五种候选蛋白的浓度。
蛋白分析的操作规程显示在图4中，以及包括以下步骤中的至少一种、优选全部步骤的评估：在鉴定的蛋白标记物的至少一种以及优选至少二、三、四或五种的组合上进行western印迹分析、ELISA和RNA测序。来自显示晚期毒性的患者以及来自匹配供体如上获得的细胞的三分之一(每患者2.5至5百万个细胞)使用Trizol试剂提取RNA。测量转录反应基因组范围的最好实验是全局运行(globalrunon)测序。通过RNA测序(RNAseq)可以进行转录组学分析，其中可选择的测试是微阵列，即使这后一种技术比较不敏感。重要的是，RNAseq允许检测可选剪接转录物以及SNP。
实施例5：确认鉴定的蛋白的预测作用。
在≥2级的皮下组织纤维化情况下，在针对局部乳癌进行保乳手术以及按照标准指南以治愈为目的的辅助放射治疗之后，确认5种蛋白(AK2、IDH2、ANX1、APEX1和HSC70)在放射诱导的晚期副作用中的预测作用。在放射治疗之前取得所有血液样本。研究AK2、IDH2、ANX1、APEX1和HSC70经电离放射诱导的转录。在成纤维细胞和人类间质光滑肌纤维中研究用TgFb1诱导后AK2、IDH2、ANX1、APEX1和HSC70的表达(图5A和5B)。
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Claims (15)

1.一种用于体外确定受试者的放射敏感性的方法，包括以下步骤：
a)在包含细胞的生物样本的第一部分诱导外源胁迫，
b)在步骤a)的部分中确定至少一种化合物的存在或水平，
c)在所述生物样本未承受所述外源胁迫的第二部分中确定所述至少一种化合物的存在或水平，
d)比较在所述第一部分以及在所述第二部分中确定所述至少一种化合物的存在或水平的结果，并选择在所述第一和所述第二部分中差异表达的至少一种化合物，
e)在来自所述受试者的包含细胞的生物测试样本中诱导外源胁迫，
f)在步骤e)的测试样本中确定在步骤d)中选择的所述至少一种化合物的存在或水平，
g)将所述步骤f)中确定的所述至少一种化合物的存在或水平的结果与在生物参考样本中相同化合物的存在或水平相比较，以及
h)根据步骤g)的比较确定所述受试者的放射敏感性。
2.一种用于体外确定受试者的放射敏感性的方法，包括以下步骤：
a)在来自所述受试者的含有细胞的生物测试样本中诱导外源胁迫，
b)在步骤a)的样本中确定至少一种化合物的存在或水平，所述化合物是选自以下的蛋白：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)、膜联蛋白1(ANX1)、其特定片段、其编码核酸以及其组合，
c)将所述至少一种化合物的存在或水平与参考样本中相同化合物的存在或水平进行比较，以及
d)根据步骤c)的比较确定所述受试者的放射敏感性。
3.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在来自所述受试者的含有淋巴细胞的生物测试样本中诱导外源胁迫，
b)在所述生物测试样本中确定诱导的凋亡的水平，
c)在来自相同受试者的生物测试样本中诱导外源胁迫，并确定所述生物测试样本中至少一种化合物的存在或水平，其中所述化合物选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)、膜联蛋白1(ANX1)、其特定片段、其编码核酸以及其组合，
d)将所述至少一种化合物的存在或水平与参考样本中相同化合物的存在或水平进行比较，以及
e)根据步骤b)诱导的凋亡水平以及步骤d)的比较确定所述受试者的放射敏感性。
4.一种用于预测受试者对晚期放射诱导毒性的易感性的方法，其包括根据权利要求1至3中任一项所述的方法，以及当所述至少一种化合物存在于所述生物测试样本中以及不存在于所述参考样本中时和/或当所述生物测试样本中所述至少一种化合物的水平高于所述参考样本中相同化合物的水平时，预测所述受试者对晚期放射诱导毒性的易感性的步骤。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过选自以下的至少一种方法诱导所述外源胁迫：放射、与至少一种拟放射剂接触及其组合。
6.根据权利要求5所述的方法，其中放射剂量包含在约0.1至约16Gy之间，优选在约2至约14Gy之间，更优选高于约4Gy，以及更优选为约8Gy。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一种拟放射剂选自：阿非迪霉素、博莱霉素、烯二炔抗生素和过氧化氢。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述生物样本选自：全血、含有白细胞的全血提取物、含有淋巴细胞的全血提取物以及含有T淋巴细胞的全血提取物。
9.根据权利要求1至6和8中任一项所述的方法，其中所述生物样本通过包含以下步骤的方法进行制备：
a)从全血提取物中分离淋巴细胞，
b)对步骤a)的所述分离的淋巴细胞进行放射，以及
c)从步骤b)的淋巴细胞中提取蛋白。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述至少一种化合物的存在或水平由选自以下的至少一种方法确定：基于免疫检测的方法、基于western印迹的方法、基于质谱的方法、基于色谱的方法、基于流式细胞术的方法以及用于特异性检测核酸的存在或水平的方法。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测下列的存在或水平：
-线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、其特定片段或其编码核酸，以及
-选自以下的至少一种化合物：DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)、膜联蛋白A1(ANX1)、其特定片段、其编码核酸以及其组合。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述受试者患有对放射疗法治疗易感的疾病，所述疾病选自：癌症、巴塞杜氏病、垂体腺瘤、脑脊膜瘤和talalgy。
13.至少一种化合物作为标记物在用于确定受试者的放射敏感性的方法中的用途，所述化合物选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)和膜联蛋白1(ANX1)、其特定片段、其编码核酸分子及其组合。
14.一种适用于确定受试者的放射敏感性的方法的试剂盒，其包括用于特异性检测至少一种化合物的至少一种试剂、以及用于检测细胞凋亡的试剂，所述化合物选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)、膜联蛋白1(ANX1)、其特定片段、其编码核酸分子及其组合。
15.一种适用于确定受试者的放射敏感性的方法的试剂盒，其至少包括用于检测至少两种化合物的试剂、以及用于检测细胞凋亡的试剂，所述化合物选自：线粒体异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、DNA-(脱嘌呤或脱嘧啶位点)裂解酶(APEX1)、热休克同源蛋白71kDa(HSC70)、腺苷酸激酶(AK2)、膜联蛋白1(ANX1)、其特定片段、其编码核酸及其组合。
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