JP2019501179A - 細胞由来ベシクルの向上された生成および単離のための方法 - Google Patents

細胞由来ベシクルの向上された生成および単離のための方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、精製された細胞由来ベシクルの集団および組成物ならびにそれらの使用に関する。本開示の１つの態様は、細胞由来ベシクルを精製するための方法に関する。
【選択図】なし

Description

［関連出願の相互参照］
本願は、２０１５年１２月３０日に出願された米国特許仮出願第６２／２７３，３４２号（その内容は、すべての図面および表を含むその全体が参照により本明細書中に援用される）の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の利益を主張する。
［政府支援の陳述］
本発明は、米国国立衛生研究所に授与された政府助成金ＮＩＨ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｖｅ Ｒ０１ＧＭ０９９６８８、ＮＳＦ ＧＲＦＰ２０１１１１６０００、ＮＩＨ Ｔ３２−ＧＭ００８７９９、ＮＳＦ ＧＲＯＷ２０１１１１６００、Ｔ３２−ＨＬ０８６３５０の下、米国政府の助成でなされた。米国政府は、本発明の一定の権利を有する。
［配列表］
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に援用される配列表を含む。２０１６年１２月３０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０６０９３３＿０６４２＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、そのサイズは、４．０５メガバイトである。
本発明は、精製された細胞由来ベシクルの集団および組成物、ならびにそれらの使用に関する。本開示の１つの態様は、細胞由来ベシクルを精製するための方法に関する。
末梢動脈疾患（ＰＡＤ）などの虚血組織関連疾患は、米国において毎年８００〜１２００万人が罹患する疾患であり、これらの患者の多くが満足の行く処置の選択肢がないことが多い。ＰＡＤは、動脈硬化巣による動脈構造の狭小化または封鎖に起因して下肢への適切な血流が失われることを特徴とする（Ｍｉｌａｎｉ，Ｒ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １２（４）：３５１−３５８）。ＰＡＤを処置するために、血管形成術およびステント留置が通常用いられるが、しかしながら、その後の血餅形成およびステント過成長による再狭窄および再閉塞のせいで、多くの患者においてこれらの処置の有効性は限られる（Ｋａｔｚ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ １７（３）：４８５）。潜在的な代替の治療アプローチは、罹患組織への血流を回復させるための血管新生の局所的な誘導である（Ｂａｎｆｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６（６）：２４８６−２４９７）。ＰＡＤの動物モデルにおけるいくつかの研究が、組換え血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）治療を介した血管新生の局所的な誘導が有益であることを示した。しかしながら、この単純明快なアプローチは、これまで、後期の臨床試験においてヒトにおいて明らかな利点を示してこなかった（Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ４９（１０）：１０１５−１０２６）。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、少なくとも部分的に血管新生促進分泌タンパク質を介して、虚血組織関連疾患の治癒を促進する。最近の研究は、ＭＳＣ由来ベシクルが、血管新生のパラクリンエフェクターとして機能することを示した。エキソソームおよび微小小胞体は、エンドソーム起源の分泌型細胞ベシクルであり、分泌する細胞のサイトゾル由来の様々なタンパク質、脂質およびＲＮＡを含む。エキソソームおよび微小小胞体は、細胞外空間に放出されると、細胞間メッセンジャーとして機能し、それらの内容物をレシピエント標的細胞に送達する。
観察される治癒効果に関与するエキソソームおよび／または微小小胞体の構成要素（タンパク質を含む）の正体は、依然としてよく分かっていない。エキソソームおよび／または微小小胞体の構成要素の同定は、虚血組織関連疾患および他の疾患の処置に多大な影響を及ぼすことができるだろう。したがって、有望なベシクルベースの治療薬を開発するために、そのような構成要素を同定する必要性、および特定の疾患を処置するために、適切な因子を標的細胞に送達するようにエキソソームを改変する必要性が当該分野に残っている。
本開示は、分泌型細胞由来ベシクル（例えば、エキソソームおよび／または微小小胞体）の精製された集団、組成物、およびそのベシクルを使用して処置する方法に関する。
本開示の１つの態様は、細胞由来ベシクルを産生する幹細胞を低酸素条件および低血清条件下において培養することによって調製された細胞由来ベシクルの高度に精製された集団に関し、必要に応じて、その細胞由来ベシクルは、エキソソームおよび／または微小小胞体を含む。
本開示の別の態様は、改変された細胞由来ベシクルの高度に精製された集団に関し、必要に応じて、その細胞由来ベシクルは、エキソソームおよび／または微小小胞体を含む。
さらなる態様において、本開示は、本明細書中に記載される実施形態のいずれか１つに記載の細胞由来ベシクルの精製された集団、およびキャリア、保存剤または安定化剤のうちの１つ以上を含む組成物に関する。
１つの態様において、本開示は、細胞由来ベシクルの集団、１つの態様ではエキソソームを単離および／または精製するための方法に関し、その方法は、（ａ）適切な方法によって、例えば、単離された幹細胞の集団によって生成された条件培地にタンジェンシャルフロー濾過を適用して、細胞由来ベシクル含有画分を単離することによって、細胞由来ベシクルを含む条件培地から細胞由来ベシクルを単離する工程；および（ｂ）細胞由来ベシクル含有画分を濃縮して、細胞由来ベシクルの精製された集団を得る工程を含むか、またはそれらの工程から本質的になるか、またはなおもさらにはそれらの工程からなる。任意の適切な方法を使用して、細胞由来ベシクル、例えば、エキソソームを濃縮することができる。そのような方法の非限定的な例としては、遠心分離、限外濾過、濾過、分画遠心法、および１００ｋＤＡ〜３００ｋＤａのポアサイズまたは１００ｋＤＡ〜３００ｋＤａのポアサイズを有するカラム濾過が挙げられる。所望のエキソソーム集団によって発現される特定のマーカーに特異的な抗体または他の作用物質を用いて、さらなる部分集団を単離することができる。
別の態様において、細胞−ベシクルの単離および／または精製の前に、そのベシクルを産生する幹細胞が、当該分野で公知の任意の方法によって、例えば、条件培地から細胞由来ベシクルを単離および／または精製する前の中空糸バイオリアクターの使用を含む方法によって、生育または培養される。１つの態様において、細胞由来ベシクルは、エキソソームである。１つの態様において、幹細胞（細胞由来ベシクルおよび／またはエキソソームを含む条件培地を生成する）は、低血清および低酸素の条件下または低酸素条件下において培養される。
いくつかの実施形態において、上記集団の細胞由来ベシクルは、少なくとも１つの外来性核酸および／または少なくとも１つの外来性タンパク質、すなわち、天然に存在する細胞−ベシクルに存在しない核酸またはタンパク質をさらに含む。あるいは、それらの細胞由来ベシクルは、細胞由来ベシクルに天然に存在するがその発現が高められるかまたは阻害される内在性核酸および／または内在性タンパク質をさらに含み得る。核酸の非限定的な例としては、ＤＮＡおよびＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｐｃＲＮＡのうちの１つ以上またはすべてが挙げられる。いくつかの実施形態において、外来性核酸または内在性核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、例えば、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−２９６またはｌｅｔ−７のうちの１つ以上をコードする。いくつかの実施形態において、外来性タンパク質または内在性タンパク質は、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、コラーゲンタイプ１アルファ２（ＣＯＬ１Ａ２）、コラーゲンタイプＶＩアルファ３（ＣＯＬ６Ａ３）、ＥＧＦ様リピートおよびジスコイジンｉ様ドメイン含有タンパク質３（ＥＤＩＬ３）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、フィブロネクチン（ＦＮ１）、乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧＥ８）、レクチン，ガラクトシド結合可溶性３結合タンパク質（ＬＧＡＬＳ３ＢＰ）、核内因子カッパーＢ（ＮＦκＢ）、トランスフェリン（ＴＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦアイソフォーム１６５Ａまたは血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）のうちの１つ以上である。他の実施形態において、細胞由来ベシクルの集団は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲまたはその両方を発現しないか、または含まない。いくつかの実施形態において、本開示の細胞由来ベシクルは、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体において検出され得る、外来性または内在性のタンパク質、核酸、代謝産物、脂質および／または膜成分のうちの１つ以上を含むように改変されている。
いくつかの実施形態において、上記集団の細胞由来ベシクルは、少なくとも１つの外来性核酸および／または少なくとも１つの外来性タンパク質、すなわち、天然に存在する細胞−ベシクルに存在しない核酸またはタンパク質をさらに含む。あるいは、それらの細胞由来ベシクルは、細胞由来ベシクルに天然に存在するがその発現が高められるかまたは阻害される外来性核酸および／または外来性タンパク質をさらに含み得る。核酸の非限定的な例としては、ＤＮＡおよびＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｐｃＲＮＡのうちの１つ以上またはすべてが挙げられる。いくつかの実施形態において、外来性核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、例えば、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−２９６またはｌｅｔ−７のうちの１つ以上をコードする。いくつかの実施形態において、外来性タンパク質は、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、コラーゲンタイプ１アルファ２（ＣＯＬ１Ａ２）、コラーゲンタイプＶＩアルファ３（ＣＯＬ６Ａ３）、ＥＧＦ様リピートおよびジスコイジンｉ様ドメイン含有タンパク質３（ＥＤＩＬ３）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、フィブロネクチン（ＦＮ１）、乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧＥ８）、レクチン，ガラクトシド結合可溶性３結合タンパク質（ＬＧＡＬＳ３ＢＰ）、核因子カッパーＢ（ＮＦκＢ）、トランスフェリン（ＴＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦアイソフォーム１６５Ａまたは血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）のうちの１つ以上である。他の実施形態において、細胞由来ベシクルの集団は、外来性のＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲまたはその両方を発現しないか、または含まない。いくつかの実施形態において、本開示の細胞由来ベシクルは、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体において検出（および下記のエキソソームの項の分子組成に列挙）され得る、外来性のタンパク質、核酸、代謝産物、脂質および／または膜成分のうちの１つ以上を含むように改変されている。
少なくとも１つの外来性核酸を含む細胞由来ベシクルの精製および／または単離された集団を提供するための方法および組成物の非限定的な例は、幹細胞などの単離された宿主細胞を、コードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換することによるものである。配列番号１８は、そのようなベクターの例である。したがって、別の態様において、必要な調節エレメントを含むレンチウイルスベクターが、本明細書中に提供される。当業者に明らかであるように、マーカー配列（配列番号１８のヌクレオチド５８９４〜７３２１）は、エンハンサーエレメント（配列番号１８のヌクレオチド７３４５〜７９４１）と同様に省略され得るか、または代替のマーカーもしくはエンハンサーで置換され得る。さらに、ヌクレオチド５２０８〜５３６３は、ｍｉＲ−１３２エレメントに対応するが、本明細書中に記載されるようなまたは当該分野で公知であるような他のエレメントが、その中において置換され得る。代替のプロモーター（ヌクレオチド５３６４〜５８７４としてＰＧＫプロモーターが提供されている）も同様に置換され得る。代替のベクターは、米国特許公開番号２０１６／００４６６８５およびＷＯ２０１４／０３５４３３（その各々が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。ＷＯ２０１４／０３５４３３に開示されている１つのベクターは、ＶＥＧＦの１６５Ａアイソフォームをコードする遺伝子を含み、ＭＮＤＵ３プロモーターおよび自由選択のエンハンサーエレメントを含む。
そのようなベクターを含む、幹細胞などの単離された宿主細胞は、そのような細胞の集団単独で、または本明細書中に記載されるような単離もしくは精製された細胞由来ベシクルと組み合わせて、さらに提供される。これらの組成物は、キャリア、保存剤または安定剤とさらに組み合わされ得る。
本明細書中に提供されるように宿主細胞を培養してそれらの細胞を生育することによって細胞由来ベシクルを調製するための方法も提供される。本明細書中に詳細に述べられるように、１つの態様において、ｍｉＲ−１３２およびｔｄＴｏｍａｔｏマーカーを過剰発現するプラスミド発現ベクター（配列番号１８）で間葉系幹細胞をトランスフェクトした。超遠心分離を用いて、４８時間条件化された培地から微小小胞体を回収した。
いくつかの実施形態において、細胞由来ベシクルまたは単離された宿主細胞の集団は、実質的に均一である。他の実施形態において、細胞由来ベシクルまたは単離された宿主細胞の集団は、不均一である。
いくつかの実施形態において、上記集団におけるまたは上記集団から単離された細胞由来ベシクルの濃度は、およそ１０６個の細胞につき回収される約０．５マイクログラム〜約２００マイクログラムの細胞由来ベシクルタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、上記集団におけるまたは上記集団から単離された細胞由来ベシクルの濃度は、およそ１０６個の細胞につき回収される約２００マイクログラム〜約５０００マイクログラムの細胞由来ベシクルタンパク質を含む。他の実施形態において、上記集団におけるまたは上記集団から単離された細胞由来ベシクルの濃度は、およそ１０６個の細胞につき回収される約５０００マイクログラム未満、あるいは約１０００マイクログラム未満、あるいは約５００マイクログラム未満、あるいは約２００マイクログラム未満、あるいは約１５０マイクログラム未満、あるいは約１２５マイクログラム未満、あるいは約１００マイクログラム未満、あるいは約７５マイクログラム未満、あるいは約５０マイクログラム未満、あるいは約３０マイクログラム未満、あるいは約２５マイクログラム未満の細胞由来ベシクルタンパク質を含む。なおも他の実施形態において、上記集団におけるまたは上記集団から単離された細胞由来ベシクルタンパク質の濃度は、１０６個の細胞につき約２０マイクログラム未満である。
いくつかの実施形態において、上記集団におけるまたは上記集団から単離された細胞由来ベシクルの平均直径は、約０．１ｎｍ〜約１０００ｎｍ、あるいは約１．０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、あるいは約１．５ｎｍ〜約１０００ｎｍである。他の実施形態において、平均直径は、約２ｎｍ〜約８００ｎｍ、あるいは約２ｎｍ〜約７００ｎｍ、あるいは約２ｎｍ〜約６００ｎｍ、あるいは約２ｎｍ〜約５００ｎｍ、あるいは約２ｎｍ〜約４００ｎｍ、あるいは約２ｎｍ〜約３００ｎｍである。他の実施形態において、平均直径は、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、あるいは（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｙ）１００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、あるいは約３００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、あるいは約５００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、あるいは約７５０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、あるいは約８００ｎｍ〜約１０００ｎｍである。他の実施形態において、上記集団におけるまたは上記集団から単離された細胞由来ベシクルの平均直径は、約１００ｎｍ未満である。さらなる実施形態において、上記集団におけるまたは上記集団から単離された細胞由来ベシクルの平均直径は、約５０ｎｍ未満である。なおもさらなる実施形態において、上記集団における細胞由来ベシクルの平均直径は、約４０ｎｍ未満である。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される細胞由来ベシクルの精製された集団は、当該分野で公知の方法、例えば、タンジェンシャルフロー濾過または他の濾過方法を含む方法によって精製されている。単離の前に、細胞由来ベシクルを産生する細胞は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって、例えば、中空糸バイオリアクターにおいて、培養され得る。
いくつかの実施形態において、細胞由来ベシクル、例えば、エキソソームの集団は、１つの態様では長時間にわたって高い安定性を有する組成物を提供するキャリア、例えば、薬学的に許容され得るキャリアと組み合わされる。それらの組成物は、他の治療薬、例えば、１つの態様ではエキソソームによって被包された、血管新生促進物質、植物化学剤、化学療法剤および／またはＳｔａｔ３阻害剤とさらに組み合わされ得る。血管新生促進物質の非限定的な例としては、アンジオテンシン、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）、改変ＰＧＥ１（参照により本明細書中に援用される米国特許第６，２８８，１１３号を参照のこと）およびアンジオポエチン−１が挙げられる。作用物質をエキソソーム内に被包する方法は、当該分野で公知であり、例えば、２０１４年４月３日に公開され、参照により本明細書中に援用される米国特許公開番号２０１４／００９３５５７に記載されている。いくつかの実施形態において、上記組成物は、治療用途および／または安定性向上のために、例えば、乾燥、フリーズドライ、急速凍結または凍結乾燥によって、製剤化される。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される組成物は、単離された幹細胞、例えば、成体幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚様幹細胞、間葉系幹細胞または神経幹細胞のうちの１つ以上をさらに含む。１つの態様において、単離された幹細胞は、例えば、治療で使用するためにベクターおよび／または遺伝子の組み込みによってさらに改変される。そのような幹細胞の非限定的な例は、米国特許公開番号２０１６／００４６６８５およびＷＯ２０１４／０３５４３３（その各々が参照により本明細書中に援用される）に記載されているような、血管新生促進因子、例えば、ＶＥＧＦまたはその等価物を発現するように改変された幹細胞である。それらの組成物は、他の治療薬、例えば、血管新生促進物質、植物化学剤、化学療法剤および／またはＳｔａｔ３阻害剤とさらに組み合わされ得る。
さらなる態様において、本開示は、血管新生の促進を必要とする対象において血管新生を促進するための方法に関し、その方法は、有効量の、本明細書中に記載される実施形態のいずれか１つに記載の精製された集団および／または組成物をその対象に投与する工程を含む。それらの方法は、有効量の他の作用物質、例えば、血管新生を亢進または促進する作用物質、例えば、アンジオテンシン、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）、改変されたＰＧＥ１（参照により本明細書中に援用される米国特許第６，２８８，１１３号を参照のこと）およびアンジオポエチン−１の投与をさらに含み得る。その投与は、処置している医師によって判断される、同時投与または連続投与であり得る。対象は、そのような処置を必要とする、１つの態様では、処置している医師または他の医療専門家によってその治療のために予め選択された、動物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト患者）であり得る。
さらなる態様において、本開示は、末梢動脈疾患または脳卒中を処置するための方法に関し、その方法は、有効量の、本明細書中に記載される実施形態のいずれか１つに記載の精製された集団および／または組成物を対象に投与する工程を含む。それらの方法は、有効量の他の作用物質、例えば、血管新生を亢進または促進する作用物質、例えば、アンジオテンシン、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）、改変されたＰＧＥ１（参照により本明細書中に援用される米国特許第６，２８８，１１３号を参照のこと）およびアンジオポエチン−１の投与をさらに含み得る。その投与は、処置している医師によって判断される、同時投与または連続投与であり得る。対象は、そのような処置を必要とする、１つの態様では、処置している医師または他の医療専門家によってその治療のために予め選択された、動物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト患者）であり得る。
なおもさらなる態様において、本開示は、対象における皮膚創傷を処置するための方法に関し、その方法は、有効量の、本明細書中に記載される実施形態のいずれか１つに記載の精製された集団および／または組成物をその対象に投与する工程を含む。それらの方法は、有効量の他の作用物質、例えば、血管新生を亢進または促進する作用物質、例えば、アンジオテンシン、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）、改変されたＰＧＥ１（参照により本明細書中に援用される米国特許第６，２８８，１１３号を参照のこと）およびアンジオポエチン−１の投与をさらに含み得る。その投与は、処置している医師によって判断される、同時投与または連続投与であり得る。対象は、そのような処置を必要とする、１つの態様では、処置している医師または他の医療専門家によってその治療のために予め選択された、動物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト患者）であり得る。
いくつかの実施形態において、対象は、少なくとも１用量のおよそ０．１ｍｇ〜２００ｍｇの細胞由来ベシクルタンパク質を投与される。他の実施形態において、対象は、少なくとも１用量のおよそ５０ｍｇの細胞由来ベシクルタンパク質を投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような実施形態のいずれか１つに記載の精製された集団および／または組成物は、必要に応じて改変され得る単離された幹細胞の投与前または投与後に投与される。他の実施形態において、本明細書中に記載されるような実施形態のいずれか１つに記載の精製された集団および／または組成物は、単離された幹細胞と同時に投与される。１つの態様において、その幹細胞には、上に記載されたように、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦアイソフォームが形質導入されている。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような実施形態のいずれか１つに記載の精製された集団および／または組成物は、静脈内注射、直接注射、筋肉内注射、頭蓋内注射によってまたは局所的に投与される。
いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物、必要に応じてヒト患者である。さらなる態様において、その患者は、当業者に公知であるような診断基準によって治療のために選択されている。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法、例えば、（ａ）単離された幹細胞の集団によって生成された条件培地にタンジェンシャルフロー濾過を適用して、細胞由来ベシクル含有画分を単離する工程；および（ｂ）その細胞由来ベシクル含有画分を濃縮して、細胞由来ベシクルの精製された集団を得る工程を含む細胞由来ベシクルの集団を精製するための方法によると、工程（ａ）の後、工程（ｂ）の前に、細胞残屑および他の夾雑物（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｓ）が、細胞由来ベシクル含有画分から除去される。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法によると、幹細胞の集団は、工程（ａ）を行う前に、低酸素および低血清の条件下で最大約７２時間培養される。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法によると、工程（ａ）は、およそ２００ナノメートルフィルターを用いて行われる。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法によると、細胞由来ベシクルを産生する単離された幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、胚様幹細胞、神経幹細胞または人工多能性幹細胞のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態において、幹細胞は、１つの態様では低酸素および低血清の条件下で培養された、間葉系幹細胞である。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法によると、低酸素条件は、およそ１％〜約１５％ＣＯ２、例えば、約５％ＣＯ２、かつ約０．０５％〜約２０％酸素分圧である。いくつかの実施形態において、低血清条件は、無血清条件である。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法によると、細胞由来ベシクルの単離および／または精製のために使用されるタンジェンシャルフロー濾過ユニットは、約５０キロダルトン〜約４００キロダルトンの名目上の分子量限界濾過ユニット、例えば、約１００キロダルトンの名目上の分子量限界濾過ユニットまたは約３００キロダルトンの名目上の分子量限界濾過ユニットである。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法は、細胞由来ベシクルの精製された集団をキャリアおよび／または別の治療薬と、それらの構成要素の混合または当該分野で公知の方法を用いた治療薬の被包のいずれかによって、混合することによって、その集団を製剤化する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法は、細胞由来ベシクルの精製された集団および／または組成物を凍結またはフリーズドライする工程をさらに含む。
本明細書中に記載されるような実施形態のいずれか１つに記載の方法から入手可能な細胞由来ベシクルの集団も、本明細書中に提供される。
本明細書中に記載されるような実施形態のいずれか１つに記載の、精製された集団の細胞由来ベシクルの凍結乾燥もしくは凍結された集団または組成物が、さらに本明細書中に提供される。
本明細書中に記載されるような実施形態のうちのいずれか１つの細胞由来ベシクルの集団および使用するための指示書を含むキットが、なおもさらに本明細書中に提供される。
さらなる態様において、本開示は、細胞由来ベシクルの集団の大規模精製のための方法に関し、その方法は、バイオリアクターにおいて培養された単離された幹細胞の集団によって生成された条件培地にタンジェンシャルフロー濾過を適用して、細胞由来ベシクル含有画分を単離する工程；およびその細胞由来ベシクル含有画分を濃縮して、細胞由来ベシクルの精製された集団を得る工程を含む。
図１Ａは、実験計画のワークフローおよびＭＳＣプロテオミクスの比の分布を示している。（Ａ）プロテオミクスワークフローの模式図。ＭＳＣをヒト骨髄から単離し、拡大（ＥＸ）条件を用いて継代数６まで拡大した。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、拡大（ＥＸ）条件、中間（ＩＣ）条件またはＰＡＤ様（ＰＡＤ）条件のいずれかに４０時間切り換えた。次いで、細胞またはエキソソームを溶解し、トリプシン処理し、高分解能等電点電気泳動（ＨｉＲＩＥＦ）ストリップにおいて泳動したところ、７２個の個別の画分に分かれ、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）にかけた。同定されたタンパク質を、３つの異なるタイプの解析ソフトウェア：遺伝子オントロジー、カノニカルなシグナル伝達経路、およびアンジオームインタラクトーム（ａｎｇｉｏｍｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ）のネットワーク解析を用いて解析した。ＣｌｕｅＧＯ遺伝子オントロジー解析を用いて、それらの機能に基づいてタンパク質の濃縮を特徴づけた。ＰａｎｔｈｅｒおよびＩＰＡ経路解析を用いて、特定のカノニカルなシグナル伝達経路のタンパク質の濃縮を特徴づけた。アンジオームインタラクトームのＣｙｔｏＳｃａｐｅネットワーク解析を用いて、公知の血管新生媒介タンパク質（アンジオーム）と、物理的相互作用の実験的証拠があるタンパク質との物理的相互作用を可視化した。 図１Ｂは、実験計画のワークフローおよびＭＳＣプロテオミクスの比の分布を示している。（Ｂ）ＭＳＣタンパク質の面積（Ｌｏｇ１０、存在量）に対するＰＡＤ／ＥＸ比（Ｌｏｇ２、変化倍率）のプロット；ドットは、有意に差次的に発現されたタンパク質（ＦＤＲ１％）（すべてが有意ではなく異なって発現されたタンパク質）を表している。 図１Ｃは、実験計画のワークフローおよびＭＳＣプロテオミクスの比の分布を示している。（Ｃ）Ｐ値に対するＰＡＤ／ＥＸ比（Ｌｏｇ２、変化倍率）；平均変化倍率が＜＋／−０．５Ｌｏｇ２である差次的に発現されたタンパク質、および＞＋／−０．５Ｌｏｇ２の平均変化倍率かつｐ値＜０．０１である差次的に発現されたタンパク質、およびｐ値＞０．０１である青色のドット。
図２Ａは、コントロール条件ＥＸと比べたときの、ＩＣ条件およびＰＡＤ条件からのＨｉＲＩＥＦ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳプロテオミクスデータの解析を示している。（Ａ）ＥＸと比べたときの、ＩＣ条件およびＰＡＤ条件における、異なって制御されたタンパク質のＭＳＣクラスター解析のヒートマップ。 図２Ｂは、コントロール条件ＥＸと比べたときの、ＩＣ条件およびＰＡＤ条件からのＨｉＲＩＥＦ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳプロテオミクスデータの解析を示している。（Ｂ）ＰＡＤ様条件下のＭＳＣにおいてアップレギュレートされたタンパク質のＰａｎｔｈｅｒ経路解析は、多数のカノニカルな血管新生関連経路タンパク質：ＥＧＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦを示している（赤色のアスタリスクは、血管新生関連経路を示している）。各条件に対して、異なる３人のドナーの解析。差次的発現に対して、１％のＦＤＲで複数の検定補正を行うＴ検定を用いた。それらの関連する機能に従って円を色分けしている。円の数および直径がより大きい円は、より大きな過剰提示を示している。
図３Ａは、間葉系幹細胞が、ＰＡＤ様条件に曝露されるとエキソソームの分泌を増加させることを示している。（Ａ）ＤＣアッセイを用いた、ＥＸ、ＩＣおよびＰＡＤ培養条件下のＭＳＣに由来するベシクルの総タンパク質含有量の定量。 図３Ｂは、間葉系幹細胞が、ＰＡＤ様条件に曝露されるとエキソソームの分泌を増加させることを示している。（Ｂ）細胞表面からの微小小胞体の放出（矢印）を示している、ＥＸ培養条件において培養されたＭＳＣの走査型電子顕微鏡像（スケールバー５ｕｍ、５ｋＸ）。 図３Ｃは、間葉系幹細胞が、ＰＡＤ様条件に曝露されるとエキソソームの分泌を増加させることを示している。（Ｃ）細胞表面へのエキソソームの接着を示している（矢印）、ＰＡＤ条件下で培養されたＭＳＣの走査型電子顕微鏡像（スケールバー２ｕｍ、１０ｋＸ）。 図３Ｄは、間葉系幹細胞が、ＰＡＤ様条件に曝露されるとエキソソームの分泌を増加させることを示している。（Ｄ）２％酢酸ウラニルでネガティブ染色されたＭＳＣ由来エキソソームの透過型電子顕微鏡像（スケールバー２００ｎｍ、２５ｋＸ）。
図４は、ＰＡＤ条件とＩＣ条件を比較したＭＳＣエキソソームのＨｉＲＩＥＦ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳプロテオミクスデータの解析を示している。ＰＡＤエキソソームのＰａｎｔｈｅｒ経路解析は、多数の血管新生関連経路タンパク質：ＥＧＦＲ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦ経路関連タンパク質を示している（赤色のアスタリスクは血管新生関連経路を示している）。各条件に対する異なる３人のドナーの解析。差次的発現に対して、１％のＦＤＲとともに複数の検定補正を用いるＴ検定を用いた。
図５Ａ−Ｅは、ＭＳＣエキソソームによって誘導される、ＨＵＶＥＣのインビトロ細管形成を示している。（Ａ）基本培地（Ｎｅｇ）、（Ｂ）基本培地中の５μｇ／ｍｌのＭＳＣエキソソーム、（Ｃ）基本培地中の１０ｕｇ／ｍｌのＭＳＣエキソソーム、（Ｄ）基本培地中の２０ｕｇ／ｍｌのＭＳＣエキソソーム、（Ｅ）ＥｎｄｏＧＲＯ培地ポジティブコントロール（Ｐｏｓ）。刺激の１４時間後に、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭで染色し、４Ｘ対物レンズを用いて撮像した。 図５Ｆは、ＭＳＣエキソソームによって誘導される、ＨＵＶＥＣのインビトロ細管形成を示している。（Ｆ）ＩｍａｇｅＪのＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓプラグインを用いて解析された細管形成の総セグメント長の定量。ＥｎｄｏＧＲＯポジティブコントロール培地は、２％ＦＢＳ、５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦおよび０．７５Ｕ／ｍｌのヘパリン硫酸を含む。（＊）は、ＡＮＯＶＡ、ＬＳＤポストホック解析を用いたときのｐ値＜０．０５を示す（ｎ＝１２）。
図６Ａ−Ｆは、ＮＦｋＢ阻害が、インビトロのＨＵＶＥＣにおいてＭＳＣエキソソームによって媒介される細管形成を抑止することを示している。（Ａ）基本培地、（Ｂ）基本培地＋ＮＦｋＢ阻害剤、（Ｃ）１０ｕｇ／ｍｌ、（Ｄ）１０ｕｇ／ｍｌ＋ＮＦｋＢ阻害剤、（Ｅ）ＥｎｄｏＧＲＯ培地、（Ｆ）ＥｎｄｏＧＲＯ培地＋ＮＦｋＢ阻害剤。刺激の１４時間後に、ＨＵＶＥＣをＣａｌｃｅｉｎ ＡＭで染色し、４Ｘ対物レンズを用いて撮像した。 図６Ｇは、ＮＦｋＢ阻害が、インビトロのＨＵＶＥＣにおいてＭＳＣエキソソームによって媒介される細管形成を抑止することを示している。（Ｇ）ＩｍａｇｅＪのＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓプラグインを用いた細管形成の総セグメント長の定量。ＥｎｄｏＧＲＯ培地は、２％ＦＢＳ、５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦおよび０．７５Ｕ／ｍｌのヘパリン硫酸を含む。（＊）は、ＡＮＯＶＡ、ＬＳＤ事後解析を用いたときのｐ値＜０．０１を示す（ｎ＝６）。
図７は、ＭＳＣ膜結合性タンパク質の検出を示している。細胞のＭＳＣ ＨｉＲＩＥＦ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳコンセンサスデータ（９つすべてのサンプルにおいて検出された）とＭｉｎｄａｙｅらのＭＳＣプロテオームコンセンサスデータセット（４つすべてのサンプルにおいて検出された）と、Ｕｎｉｐｒｏｔヒトプロテオームデータベースとの間の、検出された膜結合性タンパク質の重複を示しているベン図。
図８Ａは、ＭＳＣドナー間の代表的な一致およびばらつきを示している。（Ａ）３人すべてのドナーにわたるＩＣ／ＥＸとＰＡＤ／ＥＸとの間の細胞の全体的なプロテオーム発現差のヒートマップは、いくらかのドナー間のばらつきならびに条件内およびドナー内の一致を明らかにしている。 図８Ｂは、ＭＳＣドナー間の代表的な一致およびばらつきを示している。（Ｂ）３人すべてのドナーからのＰＡＤ／ＥＸドナー比の比較は、いくらかのドナー間のばらつきならびに条件内およびドナー内の一致を明らかにしている。ドットは、ドナー３対ドナー１のＰＡＤ／ＥＸタンパク質発現比、およびドナー２対ドナー１のＰＡＤ／ＥＸタンパク質発現比を表している。線は、ドナー３対ドナー１のＰＡＤ／ＥＸタンパク質発現比の回帰分析、およびドナー２対ドナー１のＰＡＤ／ＥＸタンパク質発現比の回帰分析を表している。
図９Ａは、ＰＡＤ／ＥＸにおける解糖経路タンパク質のアップレギュレーションを示している。差次的に発現された細胞タンパク質（ＦＤＲ−１％）のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓは、ＥＸ条件と比べてＰＡＤ条件における解糖の重要な制御因子の高発現を明らかにした。この経路の前半が（Ａ）に図示されている。１条件あたり３人の異なるドナーの解析。差次的発現に対して、１％のＦＤＲとともに複数の検定補正を用いるＴ検定を用いた。 図９Ｂは、ＰＡＤ／ＥＸにおける解糖経路タンパク質のアップレギュレーションを示している。差次的に発現された細胞タンパク質（ＦＤＲ−１％）のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓは、ＥＸ条件と比べてＰＡＤ条件における解糖の重要な制御因子の高発現を明らかにした。この経路の後半が（Ｂ）に図示されている。１条件あたり３人の異なるドナーの解析。差次的発現に対して、１％のＦＤＲとともに複数の検定補正を用いるＴ検定を用いた。
図１０は、ＰＡＤ／ＥＸにおけるコレステロール生合成経路タンパク質のアップレギュレーションを示している。差次的に発現された細胞タンパク質（ＦＤＲ−１％）のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓは、ＥＸ条件と比べてＰＡＤ条件における、コレステロール生合成経路に関連するタンパク質のアップレギュレーションを明らかにした。暗灰色の四角は、高発現を示しており、薄灰色の四角は、不検出を示している。１条件あたり３人の異なるドナーの解析。差次的発現に対して、１％のＦＤＲとともに複数の検定補正を用いるＴ検定を用いた。
図１１Ａは、ＰＡＤ／ＥＸにおけるエキソソーム生合成タンパク質のアップレギュレーションを示している。（Ａ）公知のエキソソーム生合成タンパク質の相対的発現は、ＰＡＤ／ＥＸにおいて高発現の傾向を示した。 図１１Ｂは、ＰＡＤ／ＥＸにおけるエキソソーム生合成タンパク質のアップレギュレーションを示している。（Ｂ）ベシクル関連タンパク質ファミリーのメンバーは、ＰＡＤ／ＥＸにおいて高発現の傾向を示した。
図１２Ａは、ＭＳＣエキソソームのサイズ分布解析を示している。 図１２Ｂは、ＭＳＣエキソソームのサイズ分布および相対的強度を示しているｎａｎｏｓｉｇｈｔ ｔｒａｃｋｉｎｇ解析を示している。
図１３Ａは、内皮細胞への機能的な外来性ｍＲＮＡのエキソソーム送達を示している。（Ａ）レンチウイルスベクター発現ベクターを形質導入されたＭＳＣ−ＰＡＤに由来するエキソソーム内にｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡを詰め、内皮細胞に機能的に送達した。 図１３Ｂは、内皮細胞への機能的な外来性ｍＲＮＡのエキソソーム送達を示している。（Ｂ）エキソソーム曝露の８時間後にイメージングを行った。 図１３Ｃは、内皮細胞への機能的な外来性ｍＲＮＡのエキソソーム送達を示している。（Ｃ）エキソソーム曝露の７２時間後にイメージングを行った。
図１４は、ＭＳＣ微小小胞体におけるプラスミド発現ベクターのＰＣＲ検出を示している。
図１５は、内皮細胞への機能的なプラスミド発現ベクターの微小小胞体送達を示している。トランスフェクトされたＭＳＣに由来する微小小胞体内にｔｄＴｏｍａｔｏプラスミド発現ベクターを詰め、初代内皮細胞に機能的に送達した。微小小胞体曝露の４８時間後に細胞を撮像した。
図１６は、原形質膜からの直接的な出芽によって（例えば、微小小胞体）、または内部の多胞体エンドソーム（ＭＶＥ）と原形質膜との融合によって（例えば、エキソソーム）、真核細胞によって放出される異なるタイプの膜ベシクルの模式図を示している。
図１７は、ｍｉＲ−１３２レンチウイルスベクターで改変されたＭＳＣから単離された微小小胞体におけるｍｉＲ−１３２の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）検出を示している。
図１８Ａは、ＭＳＣ−脳卒中エキソソームの組成を示している。（Ａ）ＭＳＣ−脳卒中エキソソームのＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ解析は、低分子ＲＮＡの濃縮を実証した。 図１８Ｂは、ＭＳＣ−脳卒中エキソソームの組成を示している。（Ｂ）ｑＰＣＲ解析は、Ｕ６に対して正規化されたとき、様々な濃度での存在を示す血管新生ｍｉＲＮＡの存在を明らかにした。 図１８Ｃは、ＭＳＣ−脳卒中エキソソームの組成を示している。（Ｃ）ＭＳＣ−脳卒中エキソソームにおけるＲＮＡおよびタンパク質の対数スケールの相対存在量（ｎｇ）、Ｔ検定＊＝ｐ＜０．０５。
図１９は、ＭＳＣ−脳卒中エキソソームに、シグナル伝達機能を有する脂質膜成分が詰められていることを示している。親水性相互作用クロマトグラフィー質量分析（ＦＤＲ１％）は、ＭＳＣ−脳卒中エキソソームに、重要なシグナル伝達機能を有する脂質二重層膜成分およびそれらの誘導体が詰められていることを実証し、それらの膜成分としては、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジエタノールアミン（ＰＥ）および脂肪酸（ＦＡ）が挙げられ、これらの多くは、エキソソームの生合成にとっても重要である。
図２０は、標準的な細胞培養フラスコである５０ｘ Ｔ１７５対ＧＭＰグレードバイオリアクターのエキソソームタンパク質総含有量に基づくエキソソーム収量を示している。このデータは、中空糸リアクターシステムを用いたＧＭＰグレードの製造が、標準的な組織培養フラスコと比べてエキソソームの収量をかなり高めることを実証している。
図２１は、酢酸ウラニルネガティブ染色での透過型電子顕微鏡法を示している。この図は、中空糸リアクターシステムを用いたＧＭＰグレードの製造が、カノニカルな形態および直径のエキソソームを生成することを示している。
図２２は、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体内で検出された代謝産物のリストを示している。
図２３Ａは、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体内で検出された脂質および／または膜成分のリストを示している。（Ａ）は、そのリストの最初の３分の２を含んでいる。 図２３Ｂは、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体内で検出された脂質および／または膜成分のリストを示している。（Ｂ）は、そのリストの最後の３分の１を含んでいる。
図２４は、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体内で検出された血管新生に関連するタンパク質のリストを示している。
図２５は、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体内で検出された免疫調節に関連するタンパク質のリストを示している。
図２６は、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体内で検出された治療的タンパク質のリストを示している。
図２７は、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体内で検出されたカノニカルなエキソソーム関連タンパク質のリストを示している。
発明の詳細な説明
本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ限定されるので、本明細書中で使用される用語が、特定の実施形態のみを説明する目的であり、限定すると意図されていないことも理解されるべきである。
本発明の詳細な説明は、読み手の都合のためだけに様々な項に分けられており、任意の項に見られる開示は、別の項における開示と組み合わされてよい。別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料も、本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法および材料が、ここに記載される。本明細書中で言及されるすべての刊行物が、それらの刊行物が引用されている方法および／または材料を開示および説明するために、参照により援用される。
範囲を含むすべての数値表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、必要に応じて０．１または１．０だけ（＋）または（−）変動する近似値である。必ずしも明示的に述べられていないが、すべての数値表示の前に用語「約」が置かれることが理解されるべきである。必ずしも明示的に述べられていなくても、本明細書中に記載される試薬は、単に例示的なものであり、そのようなものの等価物は当該分野で公知であることも理解されるべきである。
本明細書中および添付の請求項において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の細胞を含む。
［定義］
以下の定義は、本明細書中に記載されるような本発明の境界線（ｍｅｅｔｓ ａｎｄ ｂｏｕｎｄｓ）の定義を支援する。詳細に述べられない限り、「細胞由来ベシクル」を説明している実施形態は、「エキソソーム」、「微小小胞体」を単独でまたは組み合わせて含むものとする。
用語「約」は、範囲を含む数値表示、例えば、温度、時間、量、濃度およびそのようなその他のものの前で使用されるとき、（＋）または（−）１０％、５％または１％変動し得る近似値を示す。
対象への細胞由来ベシクルの送達に関する用語「投与する」または「投与」は、意図された機能を発揮するために細胞由来ベシクルを対象に導入または送達する任意の経路を含む。投与は、任意の好適な経路によって行うことができ、その経路としては、経口的、鼻腔内、非経口的（静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下）、頭蓋内または局所的が挙げられる。さらなる投与経路としては、眼窩内、注入、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、肺内、脊髄内、胸骨内、鞘内、子宮内、静脈内、くも膜下、被膜下、皮下、経粘膜的または経気管的が挙げられる。投与は、自己投与および他人による投与を含む。
「含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、組成物、例えば培地、および方法が、詳述されたエレメントを含むがその他のものを排除しないことを意味すると意図されている。「〜から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用されるとき、述べられる目的のためにその組み合わせにとって本質的に重大な他の任意のエレメントを排除することを意味するものとする。したがって、本明細書中で定義されるようなエレメントから本質的になる組成物は、特許請求される発明の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響しない他の材料または工程を排除しない。「〜からなる」は、微量元素より多い他の成分および実質的な方法工程を排除することを意味するものとする。これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
本明細書中で使用されるとき、細胞由来ベシクルに対する用語「改変された」は、天然に存在する細胞由来ベシクルと異なるように変更された細胞由来ベシクル（例えば、エキソソームおよび／または微小小胞体）のことを指す。改変された細胞由来ベシクルの非限定的な例としては、あるタイプの核酸もしくはタンパク質を含むかまたは天然に存在するエキソソームおよび／もしくは微小小胞体に見られる量とは異なる量で含む、エキソソームおよび／または微小小胞体が挙げられる。
用語「患者」、「対象」または「哺乳動物対象」は、本明細書中で交換可能に使用され、本明細書中に記載される処置方法または予防方法（例えば、ＰＡＤの処置または予防のための方法）を必要とする任意の哺乳動物を含む。そのような哺乳動物には、特に、ヒト（例えば、ヒト胎児、ヒト乳児、１３〜１９歳のヒト、成人など）が含まれる。そのような処置または予防を必要とする他の哺乳動物としては、非ヒト哺乳動物（例えば、イヌ、ネコまたは他の飼い慣らされた動物）、ウマ、家畜、実験動物（例えば、ウサギ、非ヒト霊長類など）などが挙げられ得る。対象は、男性（雄）であっても女性（雌）であってもよい。ある特定の実施形態において、対象は、ＰＡＤのリスクがあるが、無症候である。ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１７（１９）２４８４−２４９１。ある特定の実施形態において、対象は、ＰＡＤの症状、例えば、間欠性跛行（腕または脚の筋痛、筋痙攣）、脚のしびれまたは衰弱、脚の色の変化、虚脈または脈がない状態、および男性の場合、勃起不全を示す。
本明細書中で使用されるとき、細胞由来ベシクルに対する用語「精製された集団」は、細胞由来ベシクルとともに培地培養培地中に通常見られる他のいくつかの構成要素の一部または全部に対して、所望のエキソソーム集団の濃縮または単離のための１つ以上の選択プロセスを受けた複数の細胞由来ベシクルのことを指す。あるいは、「精製された」とは、条件培地中に見られる残留している望まれない構成要素（例えば、細胞残屑、可溶性タンパク質など）の除去または減少のことを指し得る。「高度に精製された集団」は、本明細書中で使用されるとき、細胞由来ベシクルを伴う条件培地中の細胞残屑および可溶性タンパク質（例えば、ウシ胎児血清に由来するタンパク質など）の少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％が除去された細胞由来ベシクルの集団のことを指す。
用語「処置」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などは、本明細書中で使用されるとき、ある疾患もしくは状態（例えば、末梢動脈疾患（「ＰＡＤ」）またはＰＡＤに関連する状態）の症状の緩和、および／またはその疾患もしくは状態の進行、重症度および／もしくは範囲の減少、抑制、阻害、低減、回復または影響を含むがこれらに限定されない。さらなる処置には、血管新生の促進、脳卒中の処置、創傷の処置、虚血、急性および慢性肢虚血、バージャー病ならびに糖尿病における重大な肢虚血の処置が含まれる。「処置」とは、治療的な処置と予防的または防止的な措置の一方または両方のことを指す。処置を必要とする対象には、疾患または障害または望まれない生理学的状態にすでに罹患している対象、ならびにその疾患または障害または望まれない生理学的状態が予防されるべき対象が含まれる。
用語「幹細胞」とは、未分化な状態または部分的に分化した状態にあって、自己複製の能力および分化した子孫を産生する能力を有する細胞のことを指す。自己複製は、幹細胞が、その発生能（すなわち、全能、多能性、多分化能など）を維持しつつ、増殖して、より多くのそのような幹細胞を生じる能力と定義される。用語「体性幹細胞」は、胎性組織、若齢組織および成体組織を含む非胚組織に由来する任意の幹細胞のことを指すために本明細書中で使用される。天然の体性幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋および心筋をはじめとした多種多様の成体組織から単離されている。例示的な天然に存在する体性幹細胞としては、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および神経幹細胞（ＮＳＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、幹細胞または前駆細胞は、胚性幹細胞であり得る。本明細書中で使用されるとき、「胚性幹細胞」とは、受精の後であるが妊娠期間が終わる前に形成された組織（妊娠期間中の任意の時点（典型的には、およそ１０〜１２週間の妊娠期間より前であるが必ずしもそうではない）に採取された前胚組織（ｐｒｅ−ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｔｉｓｓｕｅ）（例えば、胚盤胞）、胚組織または胎性組織を含む）に由来する幹細胞のことを指す。最も頻繁には、胚性幹細胞は、初期胚または胚盤胞に由来する多能性細胞である。胚性幹細胞は、好適な組織（ヒト組織を含むがこれに限定されない）または確立された胚細胞株から直接得ることができる。「胚様幹細胞」とは、胚性幹細胞の１つ以上であるがすべてではない特徴を共有する細胞のことを指す。
「間葉系幹細胞」すなわちＭＳＣは、種々の細胞型に分化し得る多分化能の幹細胞である。ＭＳＣがインビトロまたはインビボにおいて分化すると示された細胞型としては、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞および脂肪細胞が挙げられる。間葉は、中胚葉に由来し、造血組織および結合組織に分化する胚性結合組織であるのに対して、ＭＳＣは、造血細胞に分化しない。ストローマ細胞は、当該組織の機能的な細胞が存在する支持構造を形成する結合組織細胞である。そのような細胞を単離する方法、そのような細胞を生育する方法および分化する方法は、技術文献および特許文献、例えば、米国特許公開番号２００７／０２２４１７１、２００７／００５４３９９、２００９／００１０８９５（これらの全体が参照により援用される）において公知である。１つの実施形態において、ＭＳＣは、標準的な培養条件で維持されるとき、プラスチック接着性である。１つの実施形態において、ＭＳＣは、表現型ＣＤ３４−／ＣＤ４５−／ＣＤ１０５＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ７３＋を有する。別の実施形態において、ＭＳＣは、表現型ＣＤ４５−／ＣＤ３４−／ＣＤ１４−またはＣＤ１１ｂ−／ＣＤ７９ａ−またはＣＤ１９−／ＨＬＡ−ＤＲ−またはＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ／ＣＤ１０５＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ７３＋を有する。
用語「人工多能性幹細胞」は、本明細書中で使用されるとき、その通常の意味が与えられ、少なくとも１つの多能性の特徴を示すように再プログラムされた分化した哺乳動物の体細胞（例えば、皮膚などの成体の体細胞）のことも指す。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ １３１（５）：８６１−８７２、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０８（１９）：７８３８−７８４３、Ｓｅｌｌ，Ｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１３．Ｐｒｉｎｔを参照のこと。
核酸またはタンパク質に関する用語「外来性」とは、細胞、細胞由来ベシクル、エキソソーム、微小小胞体またはそれらの組み合わせに人工的に導入されたポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のことを指す。細胞由来ベシクル内における外来性核酸または外来性タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と同じまたは実質的に類似の配列を有する内在性核酸または内在性タンパク質が存在し得るか、またはそれらは、細胞、細胞由来ベシクル、エキソソーム、微小小胞体またはそれらの組み合わせにとって天然に存在しない核酸またはタンパク質であり得る。例えば、間葉系幹細胞は、ＰＤＧＦＲをコードするポリヌクレオチドを過剰発現するように遺伝的に改変され得る。遺伝子またはタンパク質、例えば、ＰＤＧＦＲを過剰発現するように遺伝的に改変されたＭＳＣから回収された培養培地から単離された細胞由来ベシクルの精製された集団は、ＰＤＧＦＲをコードするポリヌクレオチドを過剰発現するように改変されていないＭＳＣから単離された細胞由来ベシクルと比べて、より高いレベルのＰＤＧＦＲを含み得ることが企図される。
本明細書中で使用されるとき、用語「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」とは、典型的には、標的メッセンジャーＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）の３プライム非翻訳領域（３’ＵＴＲ）における相補的配列に結合して、通常、遺伝子サイレンシングをもたらす、転写後制御因子のことを指す。典型的には、ｍｉＲＮＡは、低分子の非コードリボ核酸（ＲＮＡ）分子、例えば、２１または２２ヌクレオチド長である。用語「マイクロＲＮＡ」および「ｍｉＲＮＡ」は、交換可能に使用される。
本明細書中で使用されるとき、用語「過剰発現する」、「過剰発現」などは、核酸またはタンパク質の発現を、エキソソームが天然に含むレベルより高いレベルにまで増加させることを包含すると意図されている。この用語は、内在性ならびに異種の核酸およびタンパク質の過剰発現を包含すると意図されている。
本明細書中で使用されるとき、細胞由来ベシクルの集団に関する用語「均一な」は、同様の量の外来性核酸を有するか、同様の量の外来性タンパク質を有するか、同様のサイズであるか、またはそれらの組み合わせである、細胞由来ベシクルの集団のことを指す。同種の（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）集団は、細胞由来ベシクルの約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または１００％が少なくとも１つの特徴を共有している集団である。例えば、いくつかの実施形態において、同種の精製された集団中の細胞由来ベシクルの約９０％は、ｍｉＲ−１３２を過剰発現する。例えば、いくつかの実施形態において、同種の精製された集団中の細胞由来ベシクルの約９０％は、ｍｉＲ−１３２を過剰発現し、ここで、そのｍｉＲ−１３２は、細胞由来ベシクルに通常見られる量よりも少なくとも２倍多い量で発現される。同種の集団の別の例は、エキソソームの約９０％が５０ｎｍ未満の直径である集団である。
本明細書中で使用されるとき、細胞由来ベシクルの集団に関する用語「不均一な」とは、異なる量の外来性核酸を有するか、異なる量の外来性タンパク質を有するか、異なるサイズであるか、またはそれらの組み合わせである、細胞由来ベシクルの集団のことを指す。
用語「実質的に」は、ある特徴の完全なまたはほぼ完全な大きさまたは程度のことを指し、いくつかの態様では、エキソソームまたは微小小胞体の単離されたまたは精製された集団の純度を定義する。例えば、実質的に同種の細胞由来ベシクル集団は、少なくとも１つの外来性核酸、外来性タンパク質またはその両方を含む細胞由来ベシクルを６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８％超または１００％含む細胞由来ベシクル集団であり得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「タンジェンシャルフロー濾過」（ＴＦＦ）とは、濾過によって分離されるべき細胞由来ベシクルを含む流動性混合物が、膜の面に対して接線方向に高速で再循環されて、逆拡散に対する物質移動係数を高めるプロセスのことを指す。そのような濾過では、その膜の長さに沿って圧力差が適用されることにより、その流体および濾過可能な溶質が、そのフィルターを通過させる。この濾過は、バッチプロセスならびに連続フロープロセスとして適切に行われる。例えば、フィルターを通過した流体は、別個のユニット内に絶えず取り除かれつつ、溶液は、膜の上を繰り返し通過し得るか、または溶液は、膜の上を一度通過し、フィルターを通過した流体は、下流で連続的に処理される。タンジェンシャルフローは、膜が平行した中空糸のセットを形成している、カセットフィルターまたはカートリッジ（中空糸とも呼ばれる）フィルターを含み得る。供給流が、その繊維の内腔を通過し、透過物が、その繊維の外側から回収される。カートリッジは、繊維の長さ、内腔の直径および繊維の数、ならびにフィルターのポアサイズに関して特徴づけられる。
本明細書中で使用されるとき、用語「薬学的に許容され得るキャリア」とは、任意の標準的な薬学的キャリア（例えば、滅菌された溶液、錠剤、コーティング錠剤およびカプセル）のことを指す。典型的には、そのようなキャリアは、賦形剤、例えば、デンプン、乳、糖、ある特定のタイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸もしくはその塩、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウム、タルク、植物性脂肪もしくは植物油、ゴム、グリコールまたは他の公知の賦形剤を含む。そのようなキャリアには、香味添加物および着色添加物または他の成分も含まれ得る。薬学的に許容され得るキャリアの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水、食塩水、緩衝液、不活性な無毒性の固体（例えば、マンニトール、タルク）。そのようなキャリアを含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化される。意図される投与様式および意図される使用法に応じて、それらの組成物は、固体、半固体または液体の剤形、例えば、散剤、顆粒剤、結晶、液剤、懸濁剤、リポソーム、ペースト、クリーム、軟膏剤などの形態であり得、比較的正確な投与量の投与に適した単位剤形であり得る。
「有効量」は、有益な結果または所望の結果をもたらすのに十分な量を意図する。有効量は、１回以上の投与、１回以上の適用または１以上の投与量で投与され得る。そのような送達は、個別の投与量単位が用いられる期間、治療薬のバイオアベイラビリティ、投与経路などをはじめとしたいくつかの可変事項に依存する。しかしながら、任意の特定の対象に対する本発明の治療薬の特定の用量レベルは、使用される特定の化合物の活性、対象の齢、体重、全般的な健康状態、性別および食餌、投与時間、排泄速度、薬物の併用、ならびに処置される特定の障害の重症度、ならびに投与の形式をはじめとした種々の因子に依存することが理解される。処置用量は、通常、安全性および有効性を最適化するように用量設定され得る。典型的には、最初に、インビトロおよび／またはインビボ試験からの投与量と効果の関係性が、患者への投与にとっての適切な用量に対して有用な指針を提供し得る。一般に、インビトロにおいて有効であると見出された濃度に相応する血清レベルを達成するのに有効な化合物の量を投与することが望ましい。これらのパラメータの測定は、十分に当該分野の技術の範囲内である。これらの考慮すべき事柄、ならびに有効な製剤化および投与の手順は、当該分野で周知であり、標準的な教科書に記載されている。
本明細書中で使用されるとき、用語「末梢動脈疾患」または「ＰＡＤ」は、末梢血管疾患のサブセットのことを指す。末梢動脈疾患（Ｐｅｒｉｐｈｅａｒｌ ａｒｔｅｒｉａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）または末梢動脈疾患（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）は、心臓に血液を供給する動脈以外の動脈において生じ得るが、最も頻繁には、脚および足において生じる。この疾患は、通常、大動脈および中程度のサイズの動脈において、狭窄または閉塞を引き起こす分節性病変を特徴とする。アテローム性動脈硬化症は、ＰＡＤの主な原因であり、カルシウム沈着を伴う動脈硬化巣、培地の薄化、筋肉および弾性線維の斑状破壊、内弾性板の断片化、ならびに血小板およびフィブリンから構成される血栓をもたらす。ＰＡＤの通常の部位は、大腿動脈および膝窩動脈（８０〜９０％の患者）、腹大動脈および腸骨動脈（３０％の患者）、ならびに脛骨動脈および腓骨動脈を含む末端の動脈（４０〜５０％の患者）である。末端の病変の発生率は、糖尿病および年齢に伴って増加する。ＰＡＤに関連する状態は、閉塞性の状態または機能性の状態であり得る。閉塞性ＰＡＤの例としては、急性であり得る末梢動脈閉塞症（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｒｔｅｒｉａｌ ｏｃｃｌｕｓｉｓｏｎ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、およびバージャー病（閉塞性血栓血管炎（ｔｈｏｍｂｏａｎｇｉｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ））、レイノー病、レイノー現象、および先端チアノーゼが挙げられる。処置されるべき疾患のさらなる非限定的な例としては、急性および慢性の重大な肢虚血、バージャー病、ならびに糖尿病における重大な肢虚血が挙げられる。
本明細書中で使用されるとき、用語「皮膚創傷」とは、皮膚が切れるかまたは痛んでいる、皮膚への損傷のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、用語「血管新生の促進」とは、損傷した血管を修復するかまたは血管の数を増加させる、新しい血管の刺激のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、用語「培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）」および「培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」は、交換可能に使用され、細胞（例えば、幹細胞）の生育を支持するために使用される固体または液体の物質のことを指す。好ましくは、本明細書中で使用される培養培地とは、幹細胞を未分化な状態で維持できる液体物質のことを指す。それらの培養培地は、塩、栄養分、ミネラル、ビタミン、アミノ酸、核酸、タンパク質（例えば、サイトカイン、増殖因子およびホルモン）などの成分（これらはすべて、細胞の増殖に必要であり、幹細胞を未分化な状態で維持できる）の組み合わせを含む水性の媒体であり得る。例えば、培養培地は、本明細書中にさらに記載されるような必要な添加物が補充された、合成培養培地、例えば、最小必須培地α（ＭＥＭ−α）（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＫＯ−ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）であり得る。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、培養培地の混合物であり得る。好ましくは、本開示の培養培地に含まれるすべての成分が、実質的に純粋であり、組織培養グレードである。「条件培地」および「条件培養培地」は、交換可能に使用され、細胞がある時間にわたって培養された培養培地のことを指し、ここで、それらの細胞は、その培地中に成分（例えば、タンパク質、サイトカイン、化学物質など）を放出／分泌する。
本明細書中で使用されるとき、「バイオリアクター」とは、細胞の生育を支持するのに適した培養システムのことを指す。いくつかの実施形態において、細胞は、表面接着性細胞の大規模な生育のためのバイオリアクターシステムにおいて培養され得る。本明細書中に開示される方法を実施するのに適したバイオリアクターの非限定的な例は、中空糸バイオリアクターである。中空糸バイオリアクターは、中空糸の使用によって細胞を支持するのに必要な培養培地の量を最小にしつつ、細胞が接着する表面積を最大にする。中空糸は、ともに束ねられて、高い細胞密度を支持できるバイオリアクターカートリッジを形成し得る、半透性の毛細管膜である。細胞の生育のために中空糸バイオリアクターを使用するための方法は、技術文献および特許文献、例えば、全体が参照により援用されるＳｈｅｕ ｅｔ ａｌ．“Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ａ ｃｌｏｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ（２０１５）２：１５０２０において知られている。開示される方法を実施するのに適した他のバイオリアクターとしては、ロッキングバイオリアクターシステム、撹拌タンクバイオリアクターシステム、使い捨てバイオリアクターシステム、フロー培養バイオリアクターシステム、灌流培養条件に供される多孔性（ｐｏｒｕｓ）円筒状足場に適したチャンバーを有するバイオリアクター、および管状チャンバーを有するバイオリアクターが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書中で使用されるとき、用語「ベクター」とは、そのベクターが、例えば形質転換のプロセスによって、細胞内に入ったとき、複製され得るように、インタクトなレプリコンを含む非染色体核酸のことを指す。ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス（ｂａｃｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）、改変バキュロウイルス、パポウイルス（ｐａｐｏｖｉｒｕｓ）、またはその他の改変された天然に存在するウイルスが挙げられる。核酸を送達するための例示的な非ウイルスベクターとしては、裸のＤＮＡ；単独でまたはカチオン性ポリマーとともに、カチオン性脂質と複合体化したＤＮＡ；アニオン性およびカチオン性リポソーム；カチオン性ポリマー（例えば、いくつかの場合ではリポソームの中に含まれる、不均一なポリリジン、規定の長さのオリゴペプチドおよびポリエチレンイミン）と縮合したＤＮＡを含むＤＮＡ−タンパク質複合体および粒子；ならびにウイルスおよびポリリジン−ＤＮＡを含む三元複合体の使用が挙げられる。
「ウイルスベクター」は、インビボ、エキソビボまたはインビトロにおいて細胞に送達されるべきポリヌクレオチドを含む組換え的に産生されるウイルスまたはウイルス粒子と定義される。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどが挙げられる。アルファウイルスベクター（例えば、セムリキ森林ウイルスベースのベクターおよびシンドビスウイルスベースのベクター）は、遺伝子治療および免疫療法において使用するためにも開発された。Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｄｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４−４３９およびＹｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）：８２３−８２７を参照のこと。
細胞の改変がレンチウイルスベクターによって媒介される態様において、ベクター構築物とは、レンチウイルスゲノムまたはその一部および治療的遺伝子を含むポリヌクレオチドのことを指す。本明細書中で使用されるとき、外来性核酸の送達に関する「トランスフェクション」または「形質導入」は、同じ意味を有し、遺伝子または核酸配列が、細胞に侵入してそのゲノムを宿主細胞のゲノムにインテグレートするウイルスによって安定に宿主細胞に移行されるプロセスのことを指す。ウイルスは、その通常の感染機序を介して宿主細胞に侵入できるか、または異なる宿主細胞表面受容体もしくはリガンドに結合してその細胞に侵入するように改変され得る。レトロウイルスは、その遺伝情報をＲＮＡの形態で有しているが；しかしながら、このウイルスは、いったん細胞に感染すると、そのＲＮＡはＤＮＡの形態に逆転写され、そのＤＮＡが感染した細胞のゲノムＤＮＡにインテグレートされる。インテグレートされたＤＮＡの形態は、プロウイルスと呼ばれる。本明細書中で使用されるとき、レンチウイルスベクターとは、ウイルス侵入機構またはウイルス様侵入機構を介して外来性核酸を細胞に導入できるウイルス粒子のことを指す。「レンチウイルスベクター」は、他のレトロウイルスベクターと比べて、非分裂細胞に形質導入する際にある特定の利点を有する、当該分野で周知のレトロウイルスベクターの１タイプである。Ｔｒｏｎｏ Ｄ．（２００２）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇを参照のこと。
本発明のレンチウイルスベクターは、オンコレトロウイルス（ＭＬＶを含むレトロウイルスのサブグループ）およびレンチウイルス（ＨＩＶを含むレトロウイルスのサブグループ）に基づくかまたはそれらに由来する。例としては、ＡＳＬＶ、ＳＮＶおよびＲＳＶが挙げられ、これらはすべて、レンチウイルスベクター粒子産生系のためのパッケージング成分およびベクター成分に分けられている。本発明に係るレンチウイルスベクター粒子は、遺伝的にまたはその他の方法で（例えば、特定のパッケージング細胞系の選択によって）変更されたバージョンの特定のレトロウイルスに基づき得る。
［細胞由来ベシクル］
細胞由来ベシクルは、細胞外ベシクルとも称され、インビトロおよびインビボにおいて細胞によって放出される、膜に囲まれた構造である。細胞外ベシクルは、タンパク質、脂質および核酸を含み得、異なる細胞型をはじめとした体内の異なる細胞の間の細胞間コミュニケーションを媒介し得る。細胞外ベシクルの２タイプは、エキソソームおよび微小小胞体である。エキソソームは、タンパク質およびＲＮＡの細胞間の輸送によって細胞間コミュニケーションを媒介する、細胞によって分泌される脂質結合型の小さいベシクルである（Ｅｌ Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １２（５）：３４７−３５７）。エキソソームは、およそ３０ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲のサイズである。エキソソームは、多胞体エンドソーム（ＭＶＥ）と原形質膜との融合によって細胞から放出される。他方で、微小小胞体は、原形質膜（ＰＭ）からの直接的な出芽の際に細胞から放出される。微小小胞体は、通常、エキソソームより大きく、およそ１００ｎｍ〜１μｍの範囲である。
［細胞］
細胞由来ベシクル（例えば、エキソソームおよび／または微小小胞体）は、真核細胞から単離され得る。細胞由来ベシクルが単離され得る細胞の非限定的な例としては、幹細胞が挙げられる。そのような幹細胞の非限定的な例としては、成体幹細胞、胚性幹細胞、胚様幹細胞、神経幹細胞または人工多能性幹細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、幹細胞は、必要に応じて間葉系幹細胞である成体幹細胞である。１つの態様において、幹細胞、例えば、間葉系幹細胞は、低酸素条件かつ低血清または無血清の条件下において培養される。
本開示の細胞は、例えば、遺伝的改変によって改変され得る。いくつかの実施形態において、それらの細胞は、少なくとも１つの外来性核酸および／または少なくとも１つの外来性タンパク質を発現するように改変される。いくつかの実施形態において、それらの細胞は、少なくとも１つの内在性核酸および／または少なくとも１つの内在性タンパク質を発現するように改変される。その改変は、一過性の改変であり得る。他の実施形態において、その改変は、安定した改変であり得る。改変された細胞によって放出される細胞由来ベシクルの回収の前に細胞を改変することによって、改変されていない細胞と比べて異なる量および異なるタイプのタンパク質、脂質および核酸を含むエキソソームを回収できると企図される。当業者に公知の細胞改変のための任意の方法を用いて、細胞を改変することができる。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、少なくとも１つの外来性もしくは内在性の核酸および／または少なくとも１つの外来性もしくは内在性のタンパク質を発現するように改変される。核酸の非限定的な例としては、ＤＮＡおよびＲＮＡ、例えば、遺伝子または遺伝子フラグメント（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーのうちの１つ以上またはすべてが挙げられる。
いくつかの実施形態において、外来性または内在性の核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、例えば、ｍｉＲ−１５０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＲ＿０２９７０３．１（配列番号１））、ｍｉＲ−１２６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＲ＿０２９６９５．１（配列番号２））、ｍｉＲ−１３２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＲ＿０２９６７４．１（配列番号１７））ｍｉＲ−２９６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＲ＿０２９８４４．１（配列番号３））、ｌｅｔ−７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＲ＿０２９６９５．１（配列番号４））およびそれらの等価物をコードする。いくつかの実施形態において、外来性または内在性のタンパク質は、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）であり、ここで、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦをコードするトランスジーン（例えば、ＰＤＧＦＲ−Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００６２０６．４（配列番号５））、ＰＤＧＦＲ−Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２６０９．３（配列番号６）またはそれらの等価物）によって発現される。いくつかの実施形態において、外来性タンパク質は、コラーゲンタイプ１アルファ２（ＣＯＬ１Ａ２）、（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００００８９．３（配列番号７）またはそれらの等価物）である。いくつかの実施形態において、外来性または内在性のタンパク質は、コラーゲンタイプＶＩアルファ３（ＣＯＬ６Ａ３）、（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００４３６９．３（配列番号８）またはそれらの等価物）である。いくつかの実施形態において、外来性タンパク質は、ＥＧＦ様リピートおよびジスコイジンｉ様ドメイン含有タンパク質３（ＥＤＩＬ３）、（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００５７１１．４（配列番号９）またはそれらの等価物である。いくつかの実施形態において、外来性または内在性のタンパク質は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００５２２８．３（配列番号１０）またはそれらの等価物である。いくつかの実施形態において、外来性タンパク質または内在性は、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ６０４８５．１（配列番号１１）またはそれらの等価物である。いくつかの実施形態において、外来性または内在性のタンパク質は、フィブロネクチン（ＦＮ１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ１０９０５．１（配列番号１２）またはそれらの等価物である。いくつかの実施形態において、外来性または内在性のタンパク質は、乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧＥ８）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００５９２８（配列番号１３）またはそれらの等価物である。いくつかの実施形態において、外来性または内在性のタンパク質は、レクチン，ガラクトシド結合可溶性３結合タンパク質（ＬＧＡＬＳ３ＢＰ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００５５６７（配列番号１４）またはそれらの等価物である。いくつかの実施形態において、外来性または内在性のタンパク質は、トランスフェリン（ＴＦ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ１２５３０．１（配列番号１５）またはそれらの等価物である。いくつかの実施形態において、外来性または（ｏｒｅ）内在性のタンパク質は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ６２５６８．１およびＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ０４７５８）またはＶＥＧＦのアイソフォーム１６５Ａ（配列番号１９）またはそれらの等価物である。いくつかの実施形態において、外来性または内在性のタンパク質は、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０６３６５７（配列番号１６）またはそれらの等価物である。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、外来性または内在性のＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲまたはその両方を発現しない。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、タンパク質をコードする少なくとも１つの外来性もしくは内在性の核酸、または本開示のエキソソームおよび／もしくは微小小胞体において検出される（および下記のエキソソームの項の分子組成において列挙される）内在性もしくは外来性の核酸を発現するように改変される。
等価なまたは生物学的に等価な核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはペプチドは、参照核酸、参照ポリヌクレオチド、参照オリゴヌクレオチドまたは参照ペプチドと少なくとも８０％の配列同一性、あるいは少なくとも８５％の配列同一性、あるいは少なくとも９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９２％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性、あるいは少なくとも９７％の配列同一性、あるいは少なくとも９８％の配列同一性を有するものである。代替の実施形態において、等価物または生物学的等価物は、高ストリンジェンシー条件下において、参照ポリヌクレオチドまたは参照オリゴヌクレオチドまたはその相補鎖にハイブリダイズする。さらなる態様において、等価物または生物学的等価物は、参照ペプチドまたはその相補鎖をコードするポリヌクレオチドに高ストリンジェンシー条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるペプチドである。
本開示の細胞は、当業者に公知の任意の培養培地中で培養され得る。例えば、その細胞培養培地は、５％〜４０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、好ましくは、およそ２０％のＦＢＳ；０．５％〜５％Ｌ−グルタミン、好ましくは、およそ１％のＬ−グルタミン；および０．５％〜１％のペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｐｅｎｎ−ｓｔｒｅｐ）、好ましくは、およそ１％のｐｅｎｎ−ｓｔｒｅｐを基本培地中に含み得る。いくつかの実施形態において、ＦＢＳの少なくとも一部は、血清代替物、例えば、血小板溶解産物（例えば、ヒト血小板溶解産物（ｈＰＬ））で置換される。いくつかの実施形態において、培養培地中の血清代替物（例えば、ｈＰＬ）の量は、１％〜２０％である。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＦＢＳの非存在下において培養される。他の実施形態において、上記細胞は、高レベルの血清、例えば、３０％血清、４０％血清、５０％血清または６０％血清の存在下において培養される。
本開示の細胞は、当業者に公知の任意の条件下で培養され得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、約１〜２０％酸素（Ｏ２）かつ約５％二酸化炭素（ＣＯ２）の条件において培養される。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、低酸素（ｈｙｐｏｘｉｃ）条件または低酸素（ｌｏｗ ｏｘｙｇｅｎ）条件下（例えば、１０％未満のＯ２の存在下）において培養される。いくつかの実施形態において、低酸素条件は、およそ１％〜約１５％ＣＯ２かつ０．０５％〜２０％酸素分圧である。いくつかの実施形態において、本細胞は、低血清条件下で培養される。いくつかの実施形態において、その低血清条件は、無血清条件である。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、約３７℃において培養される。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、約３７℃、５％ＣＯ２かつ１０〜２０％Ｏ２において培養され得る。好ましい実施形態において、本開示の細胞は、約５％ＣＯ２において培養される。
いくつかの実施形態において、細胞は、ある時間にわたって低酸素条件において培養される。例えば、細胞は、ベシクル単離の前に最大約７２時間、またはベシクル単離の前に最大約４０時間、低酸素かつ低血清条件下において培養され得る。他の実施形態において、細胞は、ある時間にわたって正常酸素圧条件下において培養され、次いで、低酸素条件に切り替えられ、ある時間にわたって培養され得る。
低酸素かつ／または無血清条件において培養された幹細胞が、従来の培養条件と比べて、より多いエキソソームを放出したことは、驚くべきことである。例えば、図３Ａを参照のこと。これらのストレスのかかった条件が、治療薬として使用するために望ましい構成要素を含む細胞由来ベシクルを産生し得ることは、さらに驚くべきことである。
［細胞外ベシクルの単離］
本開示の細胞由来ベシクル（例えば、エキソソームおよび／または微小小胞体）の精製された集団は、当業者に公知の任意の方法を用いて単離され得る。非限定的な例としては、超遠心分離による分画遠心法（Ｔｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３０：３．２２．１−３．２２．２９；Ｗｉｔｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖ．２）、スクロース勾配精製（Ｅｓｃｏｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２０１２１−２０１２７）および濾過／濃縮の組み合わせ（Ｌａｍｐａｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７０：２１１−２２６）が挙げられる。
本明細書中に開示される細胞由来ベシクルの精製された集団は、中空糸フィルターまたはカートリッジフィルターを含み得るタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を含む方法によって精製され得る。いくつかの実施形態において、細胞由来ベシクルの集団を精製するための方法は、（ａ）単離された幹細胞の集団によって生成された条件培地にタンジェンシャルフロー濾過を適用して、細胞由来ベシクル含有画分を単離する工程；および（ｂ）その細胞由来ベシクル含有画分を濃縮して、細胞由来ベシクルの精製された集団を得る工程を含む。１つの態様において、それらの細胞は、細胞集団から条件培地を回収する前に、ある時間にわたって、低血清かつ低酸素（ｈｙｐｏｘｉｃ）または低酸素（ｌｏｗ ｏｘｙｇｅｎ）の条件下において生育される。
いくつかの実施形態において、工程（ａ）の後、工程（ｂ）の前に、細胞残屑および他の夾雑物が、細胞由来ベシクル含有画分から除去される。
いくつかの実施形態において、幹細胞の集団は、工程（ａ）を行う前に、最大約７２時間、低酸素かつ低血清の条件下において培養された。いくつかの実施形態において、低酸素条件は、およそ１％〜１５％ＣＯ２かつ０．０５％〜２０％酸素分圧である。いくつかの実施形態において、低血清条件は、無血清条件である。
本明細書中に記載される方法のために使用される単離された幹細胞は、当業者に公知の任意の幹細胞であり得る。幹細胞の非限定的な例としては、成体幹細胞、胚性幹細胞、胚様幹細胞、神経幹細胞または人工多能性幹細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、幹細胞は、間葉系幹細胞である。
タンジェンシャルフロー濾過ユニットは、約５０キロダルトン〜約４００キロダルトンの名目上の分子量限界濾過ユニットであり得る。例えば、タンジェンシャルフロー濾過ユニットは、約１００キロダルトンの名目上の分子量限界濾過ユニットまたは約３００キロダルトンの名目上の分子量限界濾過ユニット（例えば、ＭｉｎｉｍａｔｅＴＭタンジェンシャルフロー濾過カプセル（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）およびペリコン限外濾過カセット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ））である。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法の工程（ａ）は、およそ２００ナノメートルフィルターを用いて行われる。
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法の工程（ｂ）は、濾過デバイスを用いて行われる。例えば、その濾過デバイスは、およそ１００キロダルトンの名目上の分子量限界濾過デバイスまたはおよそ３００キロダルトンの名目上の分子量限界濾過デバイスであり得る。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞由来ベシクル（例えば、エキソソームおよび／または微小小胞体）の精製された集団は、膜濾過デバイス（例えば、ＶｉｖａＳｐｉｎ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｖｉｖａｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ））を用いた直接的な単離を介して条件培地から単離され得る。例えば、５００〜６０００×ｇの遠心力で使用される１００〜３００ｋＤａ膜濾過デバイスが、本明細書中に開示される方法を行うために使用され得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、培地を条件化するために、２０％ＦＢＳ（または４％ｈＰＬ）中、大気の酸素パーセンテージ（約２１％Ｏ２）においておよそ２４〜７２時間、生育される。次いで、その条件培地は、５００×ｇで１０分間遠心分離することによって、事前に清澄化される。次いで、その培地は、２０００×ｇで１５分間遠心分離することによって、再度、清澄化され得る。次いで、そのサンプルは、１７，０００×ｇで４５分間遠心分離され、得られたペレットが、溶液（例えば、ＰＢＳ）に再懸濁される。
他の実施形態において、細胞は、培地を条件化するために、２０％ＦＢＳ（または４％ｈＰＬ）中、大気の酸素パーセンテージ（約２１％Ｏ２）においておよそ２４〜７２時間、生育される。次いで、その条件培地は、５００×ｇで１０分間遠心分離することによって、事前に清澄化される。次いで、その培地は、２０００×ｇで１５分間遠心分離することによって、再度、清澄化され得る。次いで、事前に清澄化された培地は、より大きな細胞由来ベシクルを維持しつつ可溶性タンパク質およびより小さい細胞由来ベシクルの少なくとも一部がフィルターを通過できる２２０ｎｍのカットオフサイズ（およそ２２００ｋＤａと等価）を有するＴＦＦフィルターに置かれ得る。次いで、細胞由来ベシクルは、滅菌された溶液（例えば、ＰＢＳ）で洗浄されて、サンプルをダイアフィルトレーションし得る。次いで、そのサンプルは、２００ｎｍフィルター（例えば、Ｖｉｖａｓｐｉｎカラム（Ｖｉｖａ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ））を用いてさらに濃縮され得る。
いくつかの実施形態において、微小小胞体は、高レベルの血清、例えば、３０％血清、４０％血清、５０％血清または６０％血清の存在下において培養された細胞から単離される。他の実施形態において、微小小胞体は、約５％〜約２５％血清（例えば、ＦＢＳ）の存在下において培養された細胞から単離される。いくつかの実施形態において、その血清の少なくとも一部は、血清代替物、例えば、血小板溶解産物（例えば、ヒト血小板溶解産物（ｈＰＬ））で置換される。微小小胞体は、約１００ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲のサイズであり得る。微小小胞体は、当業者に公知の任意の方法、特に本開示に記載されている方法によって単離され得る。いくつかの実施形態において、微小小胞体は、所望の微小小胞体集団を選択するためのカットオフサイズ、例えば、約１００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約８００ｎｍ、約４００ｎｍ〜約７００ｎｍ、約５００ｎｍ〜約６００を有するタンジェンシャルフロー濾過およびフィルター（例えば、中空糸濾過またはカートリッジフィルター）を用いて単離される。いくつかの実施形態において、そのフィルターは、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約３００ｎｍ、約４００ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍまたは約１０００ｎｍのカットオフサイズを有する。
単離後、細胞由来ベシクル、例えば、エキソソームを濃縮することにより、細胞由来ベシクルの精製された集団を得ることができる。任意の適切な方法を用いることにより、細胞由来ベシクル、例えば、エキソソームを濃縮することができる。そのような方法の非限定的な例としては、遠心分離、限外濾過、濾過、分画遠心法、および１００ｋＤＡ〜３００ｋＤａポアサイズまたは１００ｋＤＡ〜３００ｋＤａポアサイズを有するカラム濾過が挙げられる。所望のエキソソーム集団によって発現される特定のマーカーに特異的な抗体または他の作用物質を用いて、さらなる部分集団を単離することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法は、細胞由来ベシクルの精製された集団をキャリアおよび／または血管新生促進剤などの治療薬と混合することによって、その集団を製剤化する工程をさらに含む。非限定的な例は、下記に記載される好適なキャリアである。さらにまたはあるいは、エキソソーム組成物は、安定性向上のためにトレハロースと、例えば、キャリア（例えば、ＰＢＳ）中の約１５ｎＭ〜約５０ｎＭの濃度のトレハロース、あるいはキャリア（例えば、ＰＢＳ）中の約２５ｎＭのトレハロースと組み合わされ得る。トレハロースを用いてエキソソームを製剤化する方法は、参照により本明細書中に援用されるＢｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）“Ｔｒｅｈａｏｌｏｓｅ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｃｒｙｏｄａｍａｇｅ”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ６，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ３６１６２，ｄｏｅ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３６１６２に記載されている。
［細胞由来ベシクルの分子組成］
いくつかの実施形態において、本開示の細胞由来ベシクル（例えば、エキソソームおよび／または微小小胞体）の精製された集団は、タンパク質、脂質、代謝産物および／または核酸を含む（図２２〜２７）。いくつかの実施形態において、それらの細胞由来ベシクルは、治療的タンパク質ならびに／または血管新生および免疫調節に関連するタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本開示の細胞由来ベシクルの精製された集団のタンパク質含有量は、細胞由来ベシクルの核酸含有量より多い。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞由来ベシクル（例えば、エキソソームおよび／または微小小胞体）の精製された集団は、外来性核酸の以下の非限定的な例：ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２９６およびｍｉＲ−４２４のうちの１つ以上、あるいは２つ以上、あるいは３つ以上、あるいは４つ以上、あるいは５つ以上、あるいは６つ以上、すべてを含み得る（図１８Ｂを参照のこと）。上に列挙されたｍｉＲＮＡのいくつかは、血管新生を媒介すると当該分野で公知である。上に列挙されたｍｉＲＮＡは、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ解析およびｑＰＣＲ解析を用いて、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体において検出された。エキソソームのＢｉｏａｎａｌｚｅｒ解析によって、ｒＲＮＡ２およびｒＲＮＡ１を含む低分子ＲＮＡの濃縮が実証された（図１８Ａを参照のこと）。
驚いたことに、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体におけるタンパク質の相対存在量は、ＲＮＡの相対存在量をはるかに上回ると見出された（図１８Ｃを参照のこと）。この相対存在量の差は、統計学的に有意だった。いくつかの実施形態において、タンパク質の相対存在量は、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体における核酸の相対存在量を上回る。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞由来ベシクル（例えば、エキソソームおよび／または微小小胞体）の精製された集団は、代謝産物の以下の非限定的な例：３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、４−アミノ酪酸、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン、５−メトキシトリプタミン、ｓ−アデノシルメチオニン、ｓ−アデノシルホモシステイン、アジピン酸、アミノマロネート、アラビノース、アスパラギン酸、ベータ−アラニン、コレステロール、クエン酸、クレアチニン、システイン、シチジン−５−一リン酸、エリトリトール、フルクトース、フマル酸、ガラクツロン酸、グルコース、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン、グリセリン酸、グリセロール−アルファ−リン酸、グリシン、グアノシン、ヘキシトール、ヘキスロン酸、イノシン、イソヘキソン酸（ｉｓｏｈｅｘｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、イソマルトース、ラクトアミド、乳酸、ラクトース、ロイシン、レボグルコサン、マレイミド、リンゴ酸、マルトトリオース、マンノース、リン酸メタノール、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、ニコチンアミド、Ｎ−メチルアラニン、オキソプロリン、パントテン酸、ペンタデカン酸、フェノール、プトレッシン、ピルビン酸、リビトール、リボース、ソルビトール、スクアレン、コハク酸、トレイトール、トレオン酸、トレオニン、チミン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、トレハロース、尿素、ウリジン、バリン、キシリトール、および／または図２２に列挙されている代謝産物のいずれかのうちの１つ以上、あるいは２つ以上、あるいは３つ以上、あるいは４つ以上、あるいは５つ以上、あるいは６つ以上、あるいは７つ以上、あるいは８つ以上、あるいは９つ以上、あるいは１０個以上、あるいはすべて（およびそれらの間の整数個）を含み得る。上に列挙された代謝産物は、偏りのないメタボロミクスアプローチを用いて、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体において検出された。上に列挙された代謝産物のいくつかは、ヒストンテイルに対するエピジェネティックなメチル化マークを介して遺伝子発現を調節すると示された（例えば、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）およびＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ））。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞由来ベシクル（例えば、エキソソームおよび／または微小小胞体）の精製された集団は、脂質および膜成分の以下の非限定的な例：
セラミド（ｄ３２：１）、セラミド（ｄ３３：１）、セラミド（ｄ３４：０）、セラミド（ｄ３４：１）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３６：１）、セラミド（ｄ３８：１）、セラミド（ｄ３９：１）、セラミド（ｄ４０：０）、セラミド（ｄ４０：１）、セラミド（ｄ４０：２）、セラミド（ｄ４１：１），セラミド（ｄ４２：１）、セラミド（ｄ４２：２）Ｂ、セラミド（ｄ４４：１）、脂肪酸（２０：４）、脂肪酸（２２：０）、脂肪酸（２２：６）、脂肪酸（２４：０）、脂肪酸（２４：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４０：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４１：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：２）、リゾホスファチジルコリン（１６：０）、リゾホスファチジルコリン（１８：０）Ａ、リゾホスファチジルコリン（１８：１）、リゾホスファチジルエタノールアミン（２０：４）、ホスファチジルコリン（３２：１）、ホスファチジルコリン（３３：１）、ホスファチジルコリン（３４：０）、ホスファチジルコリン（３４：１）、ホスファチジルコリン（３４：２）、ホスファチジルコリン（３５：２）、ホスファチジルコリン（３６：１）、ホスファチジルコリン（３６：２）、ホスファチジルコリン（３６：３）、ホスファチジルコリン（３８：２）、ホスファチジルコリン（３８：３）、ホスファチジルコリン（３８：５）、ホスファチジルコリン（３８：６）、ホスファチジルコリン（４０：５）、ホスファチジルコリン（４０：６）、ホスファチジルコリン（４０：７）、ホスファチジルコリン（ｐ−３４：０）、ホスファチジルコリン（ｏ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：３）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（３８：４）、Ｂホスファチジルエタノールアミン（３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：８）、スフィンゴミエリン（ｄ３０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３３：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３４：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３８：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４２：２）、Ｂスフィンゴミエリン（ｄ４２：３）のうちの１つ以上、あるいは２つ以上、あるいは３つ以上、あるいは４つ以上、あるいは５つ以上、あるいは６つ以上、あるいは７つ以上、あるいは８つ以上、あるいは９つ以上、あるいは１０個以上、あるいはすべて（およびそれらの間の整数個）を含み得る。上に列挙された脂質および膜成分は、偏りのないリピドミクスアプローチを用いて、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体において検出された（図１９および図２３Ａ〜Ｂを参照のこと）。上に列挙された脂質のいくつかは、複数のモデル系において治療効果を有すると示された（例えば、スフィンゴミエリンおよびホスファチジルコリン））。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞由来ベシクル（例えば、エキソソームおよび／または微小小胞体）の精製された集団は、エキソソーム関連タンパク質の以下の非限定的な例：ＣＤ９、ＨＳＰＡ８、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＡＮＸＡ２、ＣＤ６３、ＳＤＣＢＰ、ＥＮＯ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＴＳＧ１０１、ＰＫＭ、ＬＤＨＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＹＷＨＡＺ、ＰＧＫ１、ＥＥＦ２、ＡＬＤＯＡ、ＡＮＸＡ５、ＦＡＳＮ、ＹＷＨＡＥ、ＣＬＴＣ、ＣＤ８１、ＡＬＢ、ＶＣＰ、ＴＰＩ１、ＰＰＩＡ、ＭＳＮ、ＣＦＬ１、ＰＲＤＸ１、ＰＦＮ１、ＲＡＰ１Ｂ、ＩＴＧＢ１、ＨＳＰＡ５、ＳＬＣ３Ａ２、ＧＮＢ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＷＨＡＱ、ＦＬＯＴ１、ＦＬＮＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＤＣ４２、ＣＣＴ２、Ａ２Ｍ、ＹＷＨＡＧ、ＲＡＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＮＡＩ２、ＡＮＸＡ１、ＲＨＯＡ、ＭＦＧＥ８、ＰＲＤＸ２、ＧＤＩ２、ＥＨＤ４、ＡＣＴＮ４、ＹＷＨＡＢ、ＲＡＢ７Ａ、ＬＤＨＢ、ＧＮＡＳ、ＴＦＲＣ、ＲＡＢ５Ｃ、ＡＮＸＡ６、ＡＮＸＡ１１、ＫＰＮＢ１、ＥＺＲ、ＡＮＸＡ４、ＡＣＬＹ、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＲＡＢ１４、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ、ＧＮＢ１、ＵＢＡ１、ＴＨＢＳ１、ＲＡＮ、ＲＡＢ５Ａ、ＰＴＧＦＲＮ、ＣＣＴ５、ＣＣＴ３、ＢＳＧ、ＲＡＢ５Ｂ、ＲＡＢ１Ａ、ＬＡＭＰ２、ＩＴＧＡ６、ＧＳＮ、ＦＮ１、ＹＷＨＡＨ、ＴＫＴ、ＴＣＰ１、ＳＴＯＭ、ＳＬＣ１６Ａ１、ＲＡＢ８Ａ、及び／又は図２７に列記されたタンパク質のうちの１つ以上、あるいは２つ以上、あるいは３つ以上、あるいは４つ以上、あるいは５つ以上、あるいは６つ以上、あるいは７つ以上、あるいは８つ以上、あるいは９つ以上、あるいは１０個以上、あるいはすべて（およびそれらの間の整数個）を含み得る。上に列挙されたタンパク質は、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析によって、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体において検出された。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞由来ベシクル（例えば、エキソソームおよび／または微小小胞体）の精製された集団は、エキソソームの同一性にこれまで関連しなかったタンパク質を含む特有のタンパク質の以下の非限定的な例：ＦＮ１、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＶＣＡＮ、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＢＦＲ２、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＩＴＧＡ３、ＦＢＮ１、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ５、ＮＯＴＣＨ２、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＮＲＰ１、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＨＳＰＧ２、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＤＡＭ９、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、及びＭＶＰのうちの１つ以上、あるいは２つ以上、あるいは３つ以上、あるいは４つ以上、あるいは５つ以上、あるいは６つ以上、あるいは７つ以上、あるいは８つ以上、あるいは９つ以上、あるいは１０個以上、あるいはすべて（およびそれらの間の整数個）を含み得る。上に列挙されたタンパク質は、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析によって、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体において検出された。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞由来ベシクル（例えば、エキソソームおよび／または微小小胞体）の精製された集団は、血管新生に関連するタンパク質の以下の非限定的な例：ＦＢＬＮ２、ＴＩＭＰ１、ＮＩＤ１、ＩＧＦＢＰ３、ＬＴＢＰ１、ＤＵＳＰ３、ＩＴＧＡＶ、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲＧ１、ＥＲＢＢ２、ＣＯＬ４Ａ２、ＬＤＬＲ、ＴＳＢ、ＭＭＰ２、ＴＩＭＰ２、ＴＰＩ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＩＮＨＢＡ、ＥＧＦＲ、ＡＰＨ１Ａ、ＮＣＳＴＮ、ＴＧＦＢ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＧＦＢ１、Ｆ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＤＣ４、ＳＤＣ３、ＡＣＡＮ、ＩＦＩ１６、ＭＭＰ１４、ＰＬＡＴ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＮＯＴＣＨ３、ＤＳＰ、ＰＫＰ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＳＲＧＮ、ＮＲＰ２、ＥＰＨＡ２、ＩＴＧＡ５、ＮＲＰ１、ＰＬＡＵ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＣＤ４７、ＳＤＣ１、ＰＳＭＡ７、ＥＮＧ、Ｓ１００Ａ１３、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＤ１０、ＴＧＦＢＩ、ＣＴＧＦ、ＤＣＮ、ＩＴＧＢ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＪＡＧ１、ＴＧＦＢＲ２、ＰＬＡＵＲ、ＰＤＧＦＲＢ、ＦＹＮ、ＴＨＹ１、ＨＳＰＧ２、ＴＥＮＣ１、ＴＧＦＢＲ１、ＰＬＸＮＡ１、ＬＲＰ１、ＳＴＡＴ１、ＣＸＣＬ１２、ＶＣＡＮ、ＭＥＴ、ＦＮ１、ＣＤ３６、ＳＴＡＴ３、ＴＨＢＳ１、ＦＧＦＲ１、ＧＲＢ１４、ＦＧＢ、ＡＰＩ５、ＨＡＰＬＮ１、ＲＥＣＫ、ＬＡＭＣ１、ＣＹＲ６１、ＧＰＣ１、ＩＧＦＢＰ４、ＩＴＧＡ４、ＭＦＡＰ２、ＳＤＣ２、ＥＦＮＢ２、ＦＧＡ、ＰＬＸＮＤ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＮＰＥＰ、ＥＰＨＢ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｄ、ＡＮＴＸＲ２、ＩＧＦＢＰ７、ＣＯＬ６Ａ３、ＬＡＭＢ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭ１０、Ａ２Ｍ、ＥＦＮＢ１、ＩＴＧＡ３、ＣＬＵ、ＫＨＳＲＰ、及びＥＦＥＭＰ１（図２４）のうちの１つ以上、あるいは２つ以上、あるいは３つ以上、あるいは４つ以上、あるいは５つ以上、あるいは６つ以上、あるいは７つ以上、あるいは８つ以上、あるいは９つ以上、あるいは１０個以上、あるいはすべて（およびそれらの間の整数個）を含み得る。上に列挙されたタンパク質は、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析によって、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体において検出された。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞由来ベシクル（例えば、エキソソームおよび／または微小小胞体）の精製された集団は、免疫調節に関連するタンパク質の以下の非限定的な例：ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＲＧ１、ＣＤ２７４、ＥＩＦ２Ａ、ＥＰＨＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＩＲＡＫ１、ＬＧＡＬＳ１、ＰＳＭＥ４、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３（図２５）のうちの１つ以上、あるいは２つ以上、あるいは３つ以上、あるいは４つ以上、あるいは５つ以上、あるいは６つ以上、あるいは７つ以上、あるいは８つ以上、あるいは９つ以上、あるいは１０個以上、あるいはすべて（およびそれらの間の整数個）を含み得る。上に列挙されたタンパク質は、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析によって、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体において検出された。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞由来ベシクル（例えば、エキソソームおよび／または微小小胞体）の精製された集団は、治療的タンパク質の以下の非限定的な例：ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＢＦＲ２、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＦＢＮ１、ＩＴＧＢ５、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、及びＭＶＰ（図２６）のうちの１つ以上、あるいは２つ以上、あるいは３つ以上、あるいは４つ以上、あるいは５つ以上、あるいは６つ以上、あるいは７つ以上、あるいは８つ以上、あるいは９つ以上、あるいは１０個以上、あるいはすべて（およびそれらの間の整数個）を含み得る。上に列挙されたタンパク質は、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析によって、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体において検出された。
さらなる実施形態において、精製された集団は、上記の１つ以上の組み合わせを発現する。
［製剤および薬学的組成物］
本開示は、細胞由来ベシクル（例えば、エキソソームおよび／または微小小胞体）の精製された集団を提供する。いくつかの実施形態において、細胞由来ベシクルの集団は、実質的に均一である。他の実施形態において、細胞由来ベシクルの集団は、不均一である。
いくつかの実施形態において、実質的に均一な集団は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０ＨＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ａｍｅｓｂｕｒｙ，ＭＡ，ＵＳＡから入手可能）によって測定したとき細胞由来ベシクルの少なくとも９０％が１００ｎｍ未満の直径を有する精製された集団である。
いくつかの実施形態において、上記集団中の細胞由来ベシクルの濃度は、ＤＣアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって測定したとき、およそ１０６個の細胞につき回収される約０．５マイクログラム〜１００マイクログラムのエキソソームおよび／または微小小胞体タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、上記集団中の細胞由来ベシクルの濃度は、およそ１０６個の細胞につき回収される約１００マイクログラム〜５０００マイクログラムのエキソソームおよび／または微小小胞体タンパク質を含む。他の実施形態において、上記集団中の細胞由来ベシクルの濃度は、およそ１０６個の細胞につき回収される約１００マイクログラム〜５００マイクログラムのエキソソームおよび／または微小小胞体タンパク質を含む。他の実施形態において、上記集団中の細胞由来ベシクルの濃度は、およそ１０６個の細胞につき回収される約５００マイクログラム〜１０００マイクログラムのエキソソームおよび／または微小小胞体タンパク質を含む。他の実施形態において、上記集団中の細胞由来ベシクルの濃度は、およそ１０６個の細胞につき回収される約１０００マイクログラム〜５０００マイクログラムのエキソソームおよび／または微小小胞体タンパク質を含む。他の実施形態において、上記集団中の細胞由来ベシクルの濃度は、およそ１０６個の細胞につき回収される約４０マイクログラム〜１００マイクログラムのエキソソームおよび／または微小小胞体タンパク質を含む。他の実施形態において、上記集団中の細胞由来ベシクルの濃度は、およそ１０６個の細胞につき回収される約３００マイクログラム未満の細胞由来ベシクルを含む。他の実施形態において、上記集団中の細胞由来ベシクルの濃度は、およそ１０６個の細胞につき回収される約２００マイクログラム未満の細胞由来ベシクルを含む。他の実施形態において、上記集団中の細胞由来ベシクルの濃度は、およそ１０６個の細胞につき回収される約１０マイクログラム〜４０マイクログラムのエキソソームおよび／または微小小胞体タンパク質を含む。なおも他の実施形態において、上記集団中の細胞由来ベシクルの濃度は、およそ１０６個の細胞につき回収される約３０マイクログラム未満の細胞由来ベシクルを含む。なおも他の実施形態において、上記集団中の細胞由来ベシクルの濃度は、１０６個の細胞につき約２０マイクログラム未満である。
細胞由来ベシクルの精製された集団は、組成物中の細胞由来ベシクルの平均サイズに基づいて精製され得る。理論に拘束されるものではないが、異なるサイズの細胞由来ベシクルは、異なるタイプおよび／または量の核酸、タンパク質、脂質および他の構成要素を含み得ると企図される。したがって、ある平均サイズの細胞由来ベシクルを含む組成物は、異なる平均サイズの細胞由来ベシクルを含む組成物とは異なる治療効果を有し得ることが企図される。いくつかの実施形態において、集団中の細胞由来ベシクルの平均直径は、約０．１ｎｍ〜約１０００ｎｍである。他の実施形態において、集団中の細胞由来ベシクルの平均直径は、約２ｎｍ〜約２００ｎｍである。他の実施形態において、集団中の細胞由来ベシクルの平均直径は、１００ｎｍ未満である。なおも他の実施形態において、集団中の細胞由来ベシクルの平均直径は、５０ｎｍ未満である。なおも他の実施形態において、集団中の細胞由来ベシクルの平均直径は、約４０ｎｍ未満である。
本明細書中に開示される組成物は、キャリア、例えば、薬学的に許容され得るキャリアをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、１つより多い薬学的に許容され得るキャリアが使用され得る。当業者に公知の任意の薬学的に許容され得るキャリアを使用することができる。
いくつかの実施形態において、薬学的に許容され得るキャリアは、保存剤、例えば、ポリマー保存剤または安定化剤である。
いくつかの実施形態において、薬学的に許容され得るキャリアは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ジステアリン酸ＰＥＧ１５０）、ハチミツ、高分子量タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたは大豆タンパク質）、ポリビニルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ヒアルロン酸、グリセリン、好ましくは、植物由来タンパク質、好ましくは、加水分解されたタンパク質（例えば、大豆タンパク質および絹タンパク質）、バソリン（ｖａｓｏｌｉｎｅ）、シトロセプト（ｃｉｔｒｏｓｅｐｔ）、パラベン、キサンタンガム、ｉ−カレガアン（ｃａｒｒｅｇａａｎ）、フィタゲル（ｐｈｙｔａｇｅｌ）、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）ポリマーおよびポリビニルピロリドンからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、エキソソームは、血清アルブミン中で保存される。エキソソームの保存に適した血清アルブミンの非限定的な例としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、オバルブミン（ＯＶＡ）およびラクトアルブミンが挙げられる。
生体適合性ゲル化剤としては、熱感受性ゾルゲル可逆性ヒドロゲル、例えば、ポロキサマーの水溶液が挙げられる。１つの態様において、ポロキサマーは、２本のポリオキシエチレン（例えば、ポリ（エチレンオキシド））の親水性鎖に隣接したポリオキシプロピレン（例えば、（ポリ（プロピレンオキシド））の中央の疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロック共重合体である。１つの態様において、ポロキサマーは、式
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＯＨ
を有する。
式中、ａは、１０〜１００、２０〜８０、２５〜７０または２５〜７０または５０〜７０であり；ｂは、５〜２５０、１０〜２２５、２０〜２００、５０〜２００、１００〜２００または１５０〜２００である。別の態様において、ポロキサマーは、２，０００〜１５，０００、３，０００〜１４，０００または４，０００〜１２，０００の分子量を有する。本明細書中で有用なポロキサマーは、ＢＡＳＦが製造する商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）として販売されている。本明細書中で有用なポロキサマーの非限定的な例としては、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、Ｐ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１２３、Ｆ１２７およびＬ１２１が挙げられるが、これらに限定されない。
１つの態様において、生体適合性ゲル化剤は、対象への適用前（例えば、室温またはそれ以下において）は液体であり、対象への適用後に（例えば、体温では）ゲルになる作用物質である。１つの実施形態において、生体適合性ゲル化剤は、ヒドロゲルである。
別の態様において、エキソソームおよび／または微小小胞体ならびにポロキサマーを含む組成物が、本明細書中に開示され、ここで、その組成物は、約０℃〜約２０℃ではゾル（液体）相であり、体温もしくは体温付近またはそれ以上（例えば、約２５℃〜約４０℃または約３０℃〜約３７℃）ではゲル（固体）相に転移する。
いくつかの態様において、薬学的に許容され得るキャリアは、水または水性キャリアなどの薬学的に許容され得る水性キャリアである。薬学的に許容され得る水性キャリアの例としては、滅菌水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ヒアルロン酸水溶液、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス液および他の生理平衡塩類水溶液が挙げられる。いくつかの実施形態において、薬学的に許容され得る水性キャリアは、ＮｏｒｍｏｓｏｌＴＭ−Ｒである。
非水性の薬学的に許容され得るキャリアとしては、固定油、植物油（例えば、オリーブ油およびゴマ油）、トリグリセリド、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられ、それらも使用できる。
薬学的に許容され得るキャリアは、少量の添加物（例えば、等張性、化学的安定性または細胞安定性を高める物質）も含み得る。緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、炭酸水素緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液が挙げられ、保存剤の例としては、チメロソール（ｔｈｉｍｅｒｏｓｏｌ）、クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが挙げられる。ある特定の態様では、投与様式に応じてｐＨが改変され得る。ある態様では、組成物は、ｐＨ７〜９などの生理学的ｐＨの範囲内のｐＨを有する。
１つの態様において、使用される薬学的に許容され得るキャリアのタイプに応じて、本明細書中に記載される組成物は、組成物の総重量において約０．１〜１００％、０．１〜５０％または０．１〜３０％（例えば、０．１％、０．２５％、０．５％、０．７５％、１％、２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％）またはこれらの数字のうちの２つの間の任意の範囲（終点を含む）の薬学的に許容され得るキャリアが使用され得る。
いくつかの実施形態において、上に列挙された薬学的に許容され得るキャリアのいずれか１つが、明確に除外される。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される細胞由来ベシクルは、安定性を高めるため、保存性を高めるため、および貯蔵寿命を延長するために、凍結（例えば、急速凍結）またはフリーズドライ（例えば、凍結乾燥）される。当業者であれば、凍結乾燥された生成物を使用前に再構成する方法を理解しているだろう。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される細胞由来ベシクルの集団は、単離の直後に使用される。他の実施形態において、細胞由来ベシクルの集団は、例えば、当業者に周知の任意の冷凍保存法を用いて、冷凍保存（例えば、凍結）される。いくつかの実施形態において、細胞および／または細胞残屑のすべてまたは実質的が、冷凍保存の前に培養培地から除去される。いくつかの実施形態において、細胞および／または細胞残屑のすべてまたは実質的が、冷凍保存の後に培養培地から除去される。
［用途および使用］
本明細書中に記載される細胞由来ベシクルの集団は、対象における血管新生の促進、末梢動脈疾患または脳卒中の処置および皮膚創傷の処置をはじめとした数多くの医学的用途において使用され得る。
対象は、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、ヒツジまたはブタ）であり得る。好ましい実施形態において、対象は、ヒト患者である。さらなる態様において、対象は、処置している医師または医療専門家によって判断された、診断基準による治療のために選択されている。
１つの態様において、血管新生の促進を必要とする対象において血管新生を促進するための方法が、本明細書中に提供され、その方法は、精製された集団もしくは有効量の集団および／または本明細書中に記載される組成物をその対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象は、少なくとも１用量のおよそ０．１ｍｇ〜２００ｍｇの細胞由来ベシクルタンパク質を投与される。他の実施形態において、対象は、少なくとも１用量のおよそ５０ｍｇの細胞由来ベシクルタンパク質を投与される。いくつかの実施形態において、細胞由来ベシクルの組成物は、単離された幹細胞の投与前または投与後に投与される。他の実施形態において、細胞由来ベシクルの組成物は、単離された幹細胞と同時に投与される。本明細書中の組成物は、当業者に公知の任意の方法によって対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、それらの組成物は、静脈内注射、直接注射、筋肉内注射、頭蓋内注射によってまたは局所的に投与される。
１つの態様において、末梢動脈疾患または脳卒中の処置を必要とする対象において末梢動脈疾患または脳卒中を処置するための方法が、本明細書中に提供され、その方法は、精製された集団もしくは有効量の集団および／または本明細書中に記載される組成物をその対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象は、少なくとも１用量のおよそ０．１ｍｇ〜２００ｍｇの細胞由来ベシクルタンパク質を投与される。他の実施形態において、対象は、少なくとも１用量のおよそ５０ｍｇの細胞由来ベシクルタンパク質を投与される。いくつかの実施形態において、細胞由来ベシクルの組成物は、単離された幹細胞の投与前または投与後に投与される。他の実施形態において、細胞由来ベシクルの組成物は、単離された幹細胞と同時に投与される。本明細書中の組成物は、当業者に公知の任意の方法によって対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、それらの組成物は、静脈内注射、直接注射、筋肉内注射、頭蓋内注射によってまたは局所的に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書中の組成物は、脳卒中に罹患した対象に脳卒中発生後２４時間以内に投与され得る。他の実施形態において、本明細書中の組成物は、脳卒中に罹患した対象に脳卒中発生の約２４〜４８時間後に投与され得る。他の実施形態において、本明細書中の組成物は、脳卒中に罹患した対象に脳卒中発生後約４８〜７２時間以内に投与され得る。他の実施形態において、本明細書中の組成物は、脳卒中に罹患した対象に脳卒中発生後約７２〜９６時間以内に投与され得る。
１つの態様において、皮膚創傷の処置を必要とする対象において皮膚創傷を処置するための方法が、本明細書中に提供され、その方法は、精製された集団もしくは有効量の集団および／または本明細書中に記載される組成物をその対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象は、少なくとも１用量のおよそ０．１ｍｇ〜２００ｍｇの細胞由来ベシクルタンパク質を投与される。他の実施形態において、対象は、少なくとも１用量のおよそ５０ｍｇの細胞由来ベシクルタンパク質を投与される。いくつかの実施形態において、細胞由来ベシクルの組成物は、単離された幹細胞の投与前または投与後に投与される。他の実施形態において、細胞由来ベシクルの組成物は、単離された幹細胞と同時に投与される。本明細書中の組成物は、当業者に公知の任意の方法によって対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、それらの組成物は、静脈内注射、直接注射、筋肉内注射、頭蓋内注射によってまたは局所的に投与される。
［キット］
本明細書中に記載される作用物質は、いくつかの実施形態において、治療、診断または研究の用途で使用することを容易にする、薬学的キットまたは診断用キットまたは研究用キットにアセンブルされ得る。キットは、本発明の構成要素を収容する１つ以上の容器および使用するための指示書を含み得る。詳細には、そのようなキットは、本明細書中に記載される１つ以上の作用物質を、これらの作用物質の意図される用途および適切な使用法を説明している指示書とともに含み得る。ある特定の実施形態において、キットの中の作用物質は、それらの作用物質の特定の用途および投与方法に適した、薬学的製剤および投与量で存在し得る。研究目的のキットは、様々な実験を行うために適した濃度または量で、それらの構成要素を含み得る。
キットは、本明細書中に記載される方法の使用を容易にするように設計されている場合があり、多くの形を取り得る。キットの各組成物は、当てはまる場合、液体の形態（例えば、溶液）または固体の形態（例えば、乾燥粉末）で提供され得る。ある特定の場合、それらの組成物のいくつかは、例えば、そのキットに提供されているかもしれないし、提供されていないかもしれない、好適な溶媒または他の種（例えば、水または細胞培養培地）を加えることによって、構成可能（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔａｂｌｅ）であり得るか、またはその他の方法で処理可能であり得る（例えば、活性な形態に）。いくつかの実施形態において、それらの組成物は、保存液（例えば、冷凍保存液）中に提供され得る。保存液の非限定的な例としては、ＤＭＳＯ、パラホルムアルデヒドおよびＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、保存液は、ある量のメタロプロテアーゼ阻害剤を含む。
本明細書中で使用されるとき、「指示書」は、指示および／または奨励の構成要素を定義し得、典型的には、本発明の包装上のまたは本発明の包装に付随した書面の指示書を含み得る。指示書は、ユーザーが、その指示書がキットに付随していると明確に認識するような任意の様式、例えば、視聴覚（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネットおよび／またはウェブベースの伝達などで提供される任意の口頭でのまたは電子的な指示も含み得る。書面の指示書は、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制している行政機関が定める形式であり得、それらの指示書は、動物投与に対する製造、使用または販売の機関による承認も反映し得る。
キットは、１つ以上の容器内に、本明細書中に記載される構成要素のいずれか１つ以上を含み得る。一例として、１つの実施形態において、キットは、そのキットの１つ以上の構成要素を混合するため、ならびに／またはサンプルを単離および混合するため、ならびに対象に適用するための指示書を含み得る。キットは、本明細書中に記載される作用物質を収容している容器を含み得る。それらの作用物質は、液体、ゲルまたは固体（粉末）の形態であり得る。それらの作用物質は、無菌的に調製され、シリンジに詰められ、冷蔵保存された状態で発送され得る。あるいは、それらの作用物質は、バイアルまたは貯蔵用の他の容器に収容され得る。第２の容器が、無菌的に調製された他の作用物質を有し得る。あるいは、キットは、シリンジ、バイアル、チューブまたは他の容器において予め混合され、発送される活性な作用物質を含み得る。キットは、対象にそれらの作用物質を投与するために必要な構成要素（例えば、シリンジ、局所適用デバイスまたはＩＶ針状管およびバッグ）の１つ以上またはすべてを有し得る。
本明細書中に記載されるような治療は、その治療のための患者を特定し、選択するために、適切な診断法と組み合わされ得る。例えば、足関節−上腕血圧指数（ＡＢＩ）検査が、患者の足関節における血圧を患者の腕における血圧と比較するために行われ得るか、またはドップラー超音波検査によって、肢の主要な動脈および静脈における血流が調べられ得る。したがって、症状が現れる前または疾患が進行する前に、変異を有する患者を特定することができる。
以下の実施例は、本開示を例証するために提供されるのであって、本開示を限定するために提供されるのではない。
骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、免疫細胞および内皮細胞を含む内在性細胞集団へのシグナル伝達を介して組織治癒能を示す（Ｍｅｙｅｒｒｏｓｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６２（１２）：１１６７−１１７４）。ＭＳＣは、ロバストなプロファイルの血管新生シグナル伝達タンパク質の分泌を介したＰＡＤに対する潜在的な治療薬としての有望さも示したが、しかしながら、どの因子が、ＭＳＣによって誘導される血管新生の主要な駆動物質であるかは、不明なままである（Ｌｉｅｗ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ ３（４）：２８）。エキソソームは、タンパク質およびＲＮＡの細胞間輸送によって細胞間コミュニケーションを媒介する、細胞によって分泌される脂質結合型の小さいベシクルである（Ｅｌ Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １２（５）：３４７−３５７）。興味深いことに、エキソソームは、最近、ＭＳＣのいくつかの組織治癒特性も媒介すると示された（Ｂｉａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９２（４）：３８７−３９７；Ｋｏｒｄｅｌａｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８（４）：９７０−９７３；Ｚｈａｎｇ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３３（７）：２１５８−２１６８）が、しかしながら、ＭＳＣ由来エキソソームがそれらの組織治癒特性を発揮する基本的な機構は、不明なままである。
さらに、ＭＳＣの血管新生能は、それらの微小環境の違いに起因して、様々であり得る（Ｒｏｓｏｖａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６（８）：２１７３−２１８２）。ＭＳＣは、一般に、動物モデルへの注射の前に、大気酸素（正常酸素圧）の条件（２１％Ｏ２）下における高血清（１０〜２０％）含有培地中で拡大される（Ｉｋｅｂｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２０１４：９５１５１２）。しかしながら、ＭＳＣは、適切な血流が失われることに起因して酸素分圧が有意に低く、血清中に含まれる因子が低濃度である状態に曝されるＰＡＤに罹患した組織に注射されると、著しく異なる環境的ニッチを経験する（Ｂａｎｆｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７（３）：２２７−２３４）。内皮細胞の血管新生能は、低酸素条件下で刺激されると向上することが認識されている（Ｈｕｍａｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００２）ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６（８）：７７１−７８０）。低酸素の刺激が、内皮細胞において血管新生シグナル伝達タンパク質の発現を誘導するという証拠があるが、そのような環境的ニッチの変化がＭＳＣのプロテオームにどの程度影響するかは、明らかではない（Ｙａｍａｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９３（７）：６６４−６７３；Ｂｅｅｇｌｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３３（６）：１８１８−１８２８）。ゆえに、正常酸素圧で高血清の拡大条件と比べてＰＡＤ様の培養条件に曝露されたＭＳＣにおいてタンパク質レベルで異なって発現されるシグナル伝達経路および遺伝子ネットワークを解析した。
タンパク質は、大抵の細胞内活性および細胞間コミュニケーションを媒介するので、質量分析プロテオミクスアプローチは、異なる細胞状態および細胞コミュニケーションの異なるパターンを解明する際に非常に貴重である（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｈ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ４：２１７５）。しかしながら、質量分析に基づくプロテオミクスアプローチには、解析の深さに限界があり、かなり高いレベルで存在する構造タンパク質などの他のクラスのタンパク質と比べて、シグナル伝達タンパク質は低レベルで存在すること多いので、細胞内のシグナル伝達タンパク質の特徴づけが大きく制限されていた（Ｈｕｌｔｉｎ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ＭＣＰ １２（７）：２０２１−２０３１）。高分解能等電点電気泳動液体連結クロマトグラフィータンデム質量分析（ＨｉＲＩＥＦ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）と呼ばれる新しい質量分析アプローチが最近開発され、そのアプローチは、細胞溶解産物の深いプロテオームカバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を可能にする（Ｂｒａｎｃａ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１（１）：５９−６２）。このアプローチは、細胞溶解産物１つあたり＞１０，０００個のタンパク質を定量的に特徴づけることが可能であることがＢｒａｎｃａらによって実証されたのに対して、他の質量分析の方法は、より小さいカバレッジデプス（ｄｅｐｔｈ ｏｆ ｃｏｖｅｒａｇｅ）を含むデータセットを生成する（Ｂｒａｎｃａ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１（１）：５９−６２）。
ＭＳＣ内およびそれらの分泌エキソソーム内の血管新生シグナル伝達タンパク質の発現に対するＰＡＤ様微小環境の影響を調べた。ＨｉＲＩＥＦ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、ＰＡＤに罹患した組織に注射したときＭＳＣが経験する微小環境を模倣する条件と比べて、正常酸素圧で高血清の拡大条件下で培養されたときのＭＳＣプロテオミクス発現の変化を調べた。ＭＳＣをＰＡＤ様微小環境に曝露すると、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含むいくつかの血管新生促進シグナル伝達関連タンパク質の発現が増加することが見出された。さらに、ＭＳＣをＰＡＤ様微小環境に曝露すると、エキソソーム分泌の増加が誘導されること、およびこれらの分泌エキソソームが、ロバストな血管新生シグナル伝達プロファイルを含み、活性化Ｂ細胞の核因子カッパー軽鎖エンハンサー（ＮＦｋＢ）経路を介してインビトロにおいて血管新生を誘導できることが観察された。
［実施例１］
（材料および方法）
（細胞培養および試薬）
非喫煙の若年成人男性由来のヒト骨髄穿刺液をＬｏｎｚａ（Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）から入手した。ＭＳＣの単離および拡大に向けて、骨棘を単離するために、骨髄穿刺液を９０μｍポアストレーナーに通した。次いで、漉された骨髄穿刺液を、等体積のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、フィコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ，ＵＳＡ）の上に乗せて３０分間、７００ｇで遠心分離した。次に、単核細胞および骨棘を、最適なＭＳＣ生育のためにスクリーニングされた１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ，ＧＡ，ＵＳＡ）が補充された最小必須培地α（ＭＥＭ−α）（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてプラスチック培養フラスコにプレーティングした。２日後、ＰＢＳによる２〜３回の洗浄工程によって、非接着性細胞を除去した。継代数２の後、ＭＳＣを２０％ＦＢＳ中で拡大し、継代数５〜６のＭＳＣを実験に使用した。血清飢餓研究に向けて、ＭＳＣをＰＢＳで３回洗浄し、フェノールレッドを含まず１％Ｌ−Ｇｌｕｔ（ＩＣ）を含むＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）からなるエキソソーム単離培地中で４０時間培養した。血清飢餓＋低酸素条件（ＰＡＤ）の場合は、ＭＳＣを１％酸素分圧下のエキソソーム単離培地中で４０時間培養した。プールされたヒトＨＵＶＥＣＳをＬｏｎｚａ（Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入し、製造者の指示書に従って、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）製のＥｎｄｏＧＲＯ−ＬＳ完全培地を用いて培養した。
（ベシクルの単離および特徴づけ）
ＭＳＣをＰＢＳで３回洗浄し、エキソソーム単離培地；１８時間の１２０，０００×ｇでの遠心分離によって事前にエキソソームを除去した２０％ＦＢＳ培地、またはＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）のいずれかに切り替え、ベシクル単離の前に４０時間条件化した（Ｋｏｒｄｅｌａｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８（４）：９７０−９７３）。以前の研究（Ｗｉｔｗｅｒ，Ｋ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２：２０３６０）におけるように、微小小胞体（ＭＶ）を単離した。簡潔には、条件培地から細胞および細胞残屑を遠心分離（それぞれ５００×ｇおよび１０００×ｇ）によって除去し、次いで、１７，０００×ｇでの遠心分離でペレットにしてＭＶを単離した。以前の研究（Ｗｉｔｗｅｒ，Ｋ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２：２０３６０）におけるように、エキソソームを単離した。簡潔には、プロテオミクス研究に向けて、０．２２μｍ濾過を用いて細胞、細胞残屑および微小小胞体を除いた後、１２０，０００×ｇで２時間遠心分離してエキソソームを単離し、次いで、そのペレットを３９ｍＬのＰＢＳで洗浄し、再度、１２０，０００×ｇで２時間遠心分離した。すべての超遠心工程を、ポリアロマークイックシールチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）においてＴｉ７０ローターを用いて行った。ＤＣ（界面活性剤対応（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ））アッセイ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてベシクル濃度を測定し、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０ＨＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，Ａｍｅｓｂｕｒｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてサイズ分布を評価した。
（電子顕微鏡法）
Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ３０ ＴＭＰ（ＦＥＩ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＯＲ，ＵＳＡ Ｓｐｕｔｔｅｒ Ｃｏａｔｅｒ：Ｐｅｌｃｏ Ａｕｔｏ Ｓｐｕｔｔｅｒ Ｃｏａｔｅｒ ＳＣ−７（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ ＵＳＡ）を用いて、ＳＥＭ像を得た。Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｄａｖｉｓにおける設備を使用し、２％酢酸ウラニル染色液を用いてＰｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１２０ Ｂｉｏｔｗｉｎ Ｌｅｎｓ，９（ＦＥＩ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＯＲ，ＵＳＡ）においてＴＥＭ像を得た。
（プロテオミクスのためのサンプル調製）
細胞ペレットを、４％ＳＤＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＤＴＴで溶解した。ＥＶを２％ＳＤＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＤＴＴで溶解した。溶解産物を５分間９５℃に加熱した後、超音波処理を１分間行い、１４，０００ｇで１５分間遠心分離した。上清を１ｍＭ ＤＴＴ、８Ｍ尿素、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．６と混合し、１０ｋＤａのカットオフの遠心分離濾過ユニット（Ｎａｎｏｓｅｐ（登録商標），Ｐａｌｌ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）に移し、１４．０００ｇで１５分間遠心分離した後、さらに８Ｍ尿素緩衝液を加え、遠心分離した。タンパク質を、８Ｍ尿素、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ中の５０ｍＭ ＩＡＡによって１０分間アルキル化し、１４．０００ｇで１５分間遠心分離した後、さらに２回、８Ｍ尿素、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳの添加および遠心分離を行った。２５０ｍＭ尿素、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ中のその細胞溶解産物に、１：５０トリプシン：タンパク質であるトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を加え、３７℃で一晩インキュベートした。濾過ユニットを１４，０００ｇで１５分間遠心分離した後、ＭＱでさらに遠心分離し、フロースルーを回収した（Ｂｒａｎｃａ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１（１）：５９−６２）。製造者の指示書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に従って、ＥＶ由来のペプチドをＴＭＴ６で標識し、ＭＳＣ細胞をＴＭＴ１０で標識した。ｓｔｒａｔａ−Ｘ−Ｃ−カートリッジ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）（Ｂｒａｎｃａ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１（１）：５９−６２；Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６（５）：３５９−３６２）によってペプチドを清浄にした。
（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＶｅｌｏｓにおけるｎＬＣ−ＭＳ／ＭＳでのプロテオミクス）
ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）におけるエキソソームの解析の前に、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ｎａｎｏ−ＬＣシステムを用いてペプチドを分離した。サンプルをＺｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８に捕捉し、ＮＴＣＣ−３６０／１００−５−１５３（Ｎｉｋｋｙｏ Ｔｅｃｈｎｏｓ．，Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）カラムにおいて、Ａ（５％ＤＭＳＯ、０．１％ＦＡ）およびＢ（９０％ＡＣＮ、５％ＤＭＳＯ、０．１％ＦＡ）の、４５分間の３％〜４０％Ｂという範囲のグラジエントを０．４μｌ／分の流速で用いて、分離した。ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓをデータ依存的様式で作動させ、ＣＩＤおよびＨＣＤによる連続的な断片化のために５つのプリカーサーを選択し、それぞれリニアイオントラップおよびオービトラップによって解析した。サーベイスキャンを、Ｏｒｂｉｔｒａｐにおいて３０．０００分解能（プロファイルモード）で３００〜２０００ｍ／ｚ、５００ｍｓの最大注入時間、および１×１０６イオンに設定されたＡＧＣで行った。ＨＣＤ断片化スペクトルの生成のために、５００ｍｓという最大イオン注入時間および５×１０４のＡＧＣを用いた後、３７．５％の正規化衝突エネルギーにおいて断片化した。ＦＴＭＳ ＭＳ２スペクトルの場合、通常の質量範囲を使用し、データを７５００分解能でセントロイドした（ｃｅｎｔｒｏｉｄｉｎｇ）。ＣＩＤ用のペプチドを、２００ｍｓという最大イオン注入時間にわたって３×１０４のＡＧＣで蓄積し、３５％衝突エネルギー、広帯域活性化オン、活性化ｑ０．２５、活性化時間１０ｍｓで断片化した後、リニアイオントラップにおいて通常のスキャン速度および質量範囲で解析した。プリカーサーを２ｍ／ｚの幅で単離し、６０秒間にわたって排除リストに掲載した。割り当てられていない単一電荷状態をプリカーサー選択から却下した。
（プロテオミクスデータ解析）
ＧｒａｐｈＰＡＤ Ｐｒｉｓｍを使用し、複数のｔ検定および１％という厳しい誤発見カットオフ（ＧｒａｐｈＰＡＤ Ｐｒｉｓｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて差次的発現を計算した。Ｐａｎｔｈｅｒ経路解析を用いて、各サンプルにおいて検出される経路の数および各サンプルに現れる各経路のタンパク質の数を検出した（ｗｗｗ．ｐａｎｔｈｅｒｄｂ．ｃｏｍ）。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して、シグナル伝達経路タンパク質の濃縮ならびに各サンプルに存在するおよび各サンプル間に存在するタンパク質の推定上の機能を解析した（Ｑｉａｇｅｎ，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）。ＣｌｕｅＧＯソフトウェアを、各サンプルの遺伝子オントロジー解析のために使用して、広範囲のクラスのタンパク質の機能を検出した（ｗｗｗ．ｉｃｉ．ｕｐｍｃ．ｆｒ／ｃｌｕｅｇｏ／ｃｌｕｅｇｏＤｏｗｎｌｏａｄ．ｓｈｔｍｌ）。ＣｙｔｏＳｃａｐｅを使用して、ＭＳＣおよびエキソソームの血管新生のインタラクトームならびにＮＦｋＢ経路のインタラクトームについてネットワークインタラクトームマップを作成した（ｗｗｗ．ｃｙｔｏｓｃａｐｅ．ｏｒｇ）。Ｃｈｕらの構築したアンジオームデータセットを使用し、Ｃｈｕらのデータセットに見られない物理的に相互作用するタンパク質を加えて、本明細書中に提示されるデータの中にカノニカルな血管新生媒介タンパク質が存在するか探した。Ｓｐｉｋｅデータベースを用いて、Ｃｈｕらのデータセットと物理的相互作用（すなわち、酵母−２−ハイブリッド、免疫共沈降）の実験的証拠が存在したタンパク質を検出し、ＣｙｔｏＳｃａｐｅを介して入手した。
（細管形成遊走アッセイ）
初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＬｏｎｚａ（Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入し、ＥｎｄｏＧＲＯ−ＬＳ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）培地中で製造者のプロトコルに従って培養し、増殖因子低減マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）上にプレーティングし、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で染色し、刺激の１６時間後に、Ｋｅｎｙｅｎｃｅ ＢＺ−９０００Ｆ（Ｋｅｙｅｎｃｅ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）において４Ｘで像を得た。ＥｎｄｏＧＲＯ基本培地をコントロールウェルおよびエキソソーム刺激ウェルのために使用し、ＥｎｄｏＧＲＯ−ＬＳ Ｃｏｍｐｌｅｔｅをポジティブコントロールとして使用した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）。ＮＦｋＢ阻害剤実験の場合、ピロリジンジチオカルバメートを５０μＭの濃度で使用した。
（結果）
（ＰＡＤ様条件に曝露されたＭＳＣは、ダイナミックなプロテオミクスの変化を示す）
ＰＡＤ様微小環境条件がＭＳＣのプロテオミクスプロファイルに対してどのような影響を及ぼすかに応えるために、ＨｉＲＩＥＦ ＬＣ／ＭＳ−ＭＳを用いて、ＭＳＣのプロテオームを定量した。３人の非喫煙の若年成人男性ドナーの骨髄に由来するヒトＭＳＣを、正常酸素圧の高血清拡大条件下で継代数６まで培養した。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＭＳＣを、３つの培養条件のうちの１つにおいて４０時間培養した：正常酸素圧の高血清拡大条件（ＥＸ：２０％ＦＢＳ、２１％Ｏ２）、ＰＡＤ様条件（ＰＡＤ：０％ＦＢＳ、１％Ｏ２）または中間条件（ＩＣ：０％ＦＢＳ、２１％Ｏ２）（図１Ａ）。
９つ（３つの条件の各々に対する３人のドナー）のＭＳＣサンプルの各々において、合計６，３４２個のタンパク質が同定され、定量した。９つのＭＳＣサンプルの各々において、カノニカルなＭＳＣ表面マーカー：ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９０（ＴＨＹ１）およびＣＤ１０５（ＥＮＧ）を含む、合計５８０個の膜結合性タンパク質が検出された（図７）。示されたデータは、Ｍｉｎｄａｙｅらのものとオーバーラップし、さらに広いものであった。１％という誤発見率（ＦＤＲ１％）を用いたタンパク質の発現レベルの統計解析によって、ＥＸ対ＩＣおよびＥＸ対ＰＡＤ条件の間でそれぞれ３１５および８４３個の差次的に発現されたタンパク質が明らかになった。存在量に対するＭＳＣ差次的発現比（面積）の解析から、差次的に発現されたタンパク質が、すべての細胞タンパク質の存在量の範囲にわたって分布したことが明らかになった（図１）。これは、タンパク質発現に対する培養条件の影響が、低発現タンパク質に限定されないことを示唆した。Ｐ値に対するＭＳＣ差次的発現比の解析から、有意に差次的に発現されたタンパク質（ＦＤＲ１％）が、すべての細胞タンパク質に対する比の範囲にわたって分布したことが実証された。これは、タンパク質発現に対する培養条件の影響が、多くの高度に有意な新しい知見を含んでいることを示唆した（図１）。
ＰＡＤ／ＥＸ比のグローバルヒートマップクラスター解析および線形回帰分析は、ドナー毎のＭＳＣのばらつきを明らかにしたが、ドナー間の（図２、８）、特に、有意に差次的に発現されたタンパク質のロバストな条件内一致も明らかにした。ＰＡＤ様条件に曝露されたＭＳＣは、解糖の律速タンパク質（ＡＬＤＯＢ、ＥＮＯ３およびＰＧＫ１）およびＮＲＦ２／グルタチオン経路の律速タンパク質（ＡＳＫ１、ＭＫＫ３／６およびＦＴＨ１）の有意な増加（ＦＤＲ１％）を示し、これらの経路は、より低い酸素分圧への曝露によって調節されると示された、代謝経路および抗酸化関連経路である（図１および図９）（Ｌａｉ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｄｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５（３−５）：１８１−１９３；Ｈａｙｅｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．３９（４）：１９９−２１８）。差次的に発現された細胞タンパク質のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＦＤＲ−１％）は、ＥＸ条件と比べてＰＡＤ条件において、ＮＲＦ２経路の重要な制御因子（グルタチオン合成のマスター制御因子である）の高発現を明らかにした。解析は、１条件につき異なる３人のドナーに対して行った。差次的発現に対して、１％のＦＤＲで複数の検定補正を行うＴ検定を用いた。対照的に、ＩＣ条件のＭＳＣは、ＥＸ条件と比べて、解糖およびグルタチオン関連経路タンパク質のそのような増加（ＦＤＲ１％）は示さなかった。有意に差次的に発現されたタンパク質（ＦＤＲ１％）のＣｙｔｏｓｃａｐｅのＣｌｕｅＧＯプラグインを用いた遺伝子オントロジー解析は、細胞増殖の制御に関わる数多くの細胞周期チェックポイント関連経路（Ｇ１期、Ｇ２／Ｍ期および細胞質分裂）が、ＩＣ条件とＰＡＤ条件の両方においてＥＸ条件と比べてダウンレギュレートされたことを明らかにした。差次的に発現された細胞タンパク質（ＦＤＲ−１％）のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓは、ＥＸ条件と比べてＰＡＤ条件における、増殖および細胞周期チェックポイント関連経路、Ｇ１期の進行、Ｇ２／Ｍ期の進行、細胞質分裂、染色体分離に関わるタンパク質のダウンレギュレーションを明らかにした。コレステロールおよび脂質生合成経路は、ＥＸ条件と比べてＩＣ条件とＰＡＤ条件の両方においてアップレギュレートされた（図２および１０）（Ｓａｉｔｏ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９（１１）：１０６９−１０７６）。差次的に発現された細胞タンパク質（ＦＤＲ−１％）のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓは、ＥＸ条件と比べてＰＡＤ条件において、脂質生合成に関連するタンパク質のダウンレギュレーションを明らかにした。
ＰＡＤ様環境へのＭＳＣの曝露は、それらのプロテオームの有意な変化を誘導した。以前の研究は、ＭＳＣが血管新生を誘導できることを示唆していたので、本出願人は、このＰＡＤ様微小環境が、どのように血管新生シグナル伝達タンパク質のレベルを調節するかを解析した（Ｄｕｆｆｙ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ａ １５（９）：２４５９−２４７０；Ｉｗａｓｅ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｒａｄｉａｔ Ｐｒｏｔ Ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ １１６（１−４ Ｐｔ２）：６４０−６４６；Ｋｗｏｎ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６３（１）：１９−２８）。ＭＳＣにおける公知の血管新生タンパク質の相互作用パターンを調べるため、およびこれらの公知の血管新生タンパク質と物理的に相互作用するタンパク質を解明するために、ＭＳＣプロテオームの血管新生インタラクトームネットワークマップを作成した。血管新生インタラクトームネットワークマップを作成するために、ＭＳＣプロテオームに存在すると示されたＣｈｕらからの公知の血管新生タンパク質のリスト（Ｃｈｕ，Ｌ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４４（１９）：９１５−９２４）を得た。次いで、ＣｙｔｏＳｃａｐｅを用いて、これらのＭＳＣエキソソーム血管新生タンパク質との物理的相互作用の実験的証拠を有したタンパク質を含め、それらがどのように互いに相互作用したかを示した（Ｃｌｉｎｅ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２（１０）：２３６６−２３８２）。このアプローチの利点は、それが、カノニカルな血管新生タンパク質の物理的相互作用を解明するだけでなく、アンジオームと物理的に相互作用する他の非カノニカルタンパク質をさらに明らかにすることによって、血管新生の潜在的な新規メディエーターを明らかにすることである。３つの各条件に曝露された３人すべてのドナーのＭＳＣに存在するタンパク質の血管新生インタラクトームの解析から、シグナル伝達タンパク質相互作用の最もロバストなクラスタリングが、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）およびＮＦｋＢノードであることが明らかになった。これは、これらの経路が、ＭＳＣの血管新生促進能力の有望な駆動物質であることを示唆している。さらに、Ｐａｎｔｈｅｒ経路解析を用いて、本出願人は、ＰＤＧＦ、ＥＧＦおよびＦＧＦのカノニカルな血管新生関連経路を含む、いくつかの血管新生経路が、ＰＡＤ様条件に曝露されたＭＳＣにおいて有意に（ＦＤＲ１％）アップレギュレートされることを見出した（図２）（Ｍｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．８（８）：１５５１−１５６６）。まとめると、これらのデータは、従来のＥＸ条件と比べてＰＡＤ条件に曝露されたＭＳＣにおけるいくつかの血管新生シグナル伝達経路およびコレステロール／脂質生合成経路の有意な高発現を実証する。
（ＭＳＣエキソソーム分泌は、ＰＡＤ様条件下で増加する）
新しく合成される膜の成分（例えば、脂質およびコレステロール）は、小胞体におけるそれらの発生部位から小胞輸送を介して原形質膜に輸送される（Ｓｏｃｃｉｏ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２４（７）：１１５０−１１６０；Ｌｅｖ，Ｓ．（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．４（１０））。しかしながら、細胞が増殖速度を低下させているときは、新しく合成される原形質膜成分の必要性も低下するはずである（Ｂａｅｎｋｅ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｄｉｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ．６（６）：１３５３−１３６３）。細胞を、より低い酸素分圧に曝露し、増殖因子刺激を行わなかったので、本出願人は、予想通り、種々の細胞周期経路がＩＣ条件およびＰＡＤ条件において発現を減少させたことを観察した。しかしながら、興味深いことに、本出願人は、コレステロール／脂質生合成タンパク質が、拡大条件ＥＸと比べてＩＣ条件とＰＡＤ条件の両方において、実際に発現を有意に（ＦＤＲ１％）増加させ、減少させなかったことを観察した（図１０）。これにより、本出願人は、エキソソーム生合成の増加が、コレステロール／脂質生合成に関わるタンパク質の高発現を説明し得ると推測するに至った。実際に、本出願人は、エキソソームの生合成に関わるタンパク質の高発現の傾向を観察したことから、ＭＳＣのベシクル分泌を解析するように促された（図１１）。
ＭＳＣから分泌された細胞外ベシクル（微小小胞体、エキソソーム）を、ＥＸ、ＩＣおよびＰＡＤ培養条件下において４０時間条件化された培地から、超遠心分離を用いて単離した。ＢＣＡタンパク質濃縮アッセイを介したベシクル収率の解析によって、ＭＳＣの微小小胞体分泌が減少したのに対して、ＥＸ条件と比べてＩＣ条件およびＰＡＤ条件に曝露されたＭＳＣによるエキソソーム分泌は実質的に増加したことが明らかになった（図３）。しかしながら、ＥＸ条件から単離されたエキソソームは、培地からＦＢＳタンパク質とともに単離された。ＰＡＤ条件に曝露されたＭＳＣの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像は、ＥＸ条件に曝露されたＭＳＣと比べて、微小小胞体分泌が減少し、エキソソーム分泌が増加することと一致したベシクル構造を示した（図３）。さらに、ネガティブ染色された単離されたＰＡＤ由来ＭＳＣエキソソームの透過型電子顕微鏡は、カノニカルなエキソソームの形態と一致する；さらに、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ解析は、ＭＳＣエキソソームが予想サイズ範囲であり、ＭＳＣがすべての条件において低レベルのアポトーシスを維持したことを明らかにした（図３、１２）。
（ＭＳＣエキソソームプロテオームは、ロバストなプロファイルの血管新生シグナル伝達タンパク質を含む）
最近の２つの研究は、ＭＳＣエキソソームが、インビトロとインビボの両方において血管新生促進であることを実証したので、本出願人は、ＭＳＣ ＨｉＲＩＥＦ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して、ＩＣ条件およびＰＡＤ条件に曝露されたＭＳＣからＭＳＣ由来エキソソームのプロテオームを特徴づけた（Ｂｉａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９２（４）：３８７−３９７；Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２１（１８）：３２８９−３２９７）。ＰＡＤ条件とＩＣ条件の両方における３人のドナー由来の細胞から生成された６つのサンプルの各々において、合計１９２７個のタンパク質を定量し、そのうち４５７個が、ＭＳＣでは検出されなかったことから、エキソソームの濃縮が示唆された。本出願人は、ＥｘｏＣａｒｔａデータベースから、ＩＣとＰＡＤの両方の条件の本出願人の各エキソソームサンプルにおいて、最も多い特定された上位１００個のエキソソームマーカータンパク質のうち９２個を検出した（Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ １：１８３７４；Ｍａｔｈｉｖａｎａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１２４１−１２４４；Ｍａｔｈｉｖａｎａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ９（２１）：４９９７−５０００）。ＩＣ条件およびＰＡＤ条件からのエキソソームの差次的発現解析は、ＩＣ条件とＰＡＤ条件のエキソソーム間で発現の有意差（ＦＤＲ１％）がほとんどないことを明らかにした。
両方の条件の３人すべてのドナー由来のＭＳＣエキソソームプロテオームにおける最も豊富な４００個のタンパク質の、ＣｙｔｏｓｃａｐｅのＣｌｕｅＧＯプラグインを用いる遺伝子オントロジー解析は、血管および内皮関連タンパク質の表示を示した（Ｂｉｎｄｅａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５（８）：１０９１−１０９３）。ＧＯ解析は、通常、広範囲にわたり、そのデータの概説に役立つが、一般に、特定のシグナル伝達経路を特定する能力は限定的である。ゆえに、本出願人は、ＭＳＣエキソソームプロテオームに対してＰａｎｔｈｅｒ経路解析を行ったところ、いくつかのカノニカルな血管新生関連経路：カドヘリン、ＥＧＦＲ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦの高表示を見出した（図４）。
Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）は、公知のタンパク質の関連および機能の、手作業でキュレーションされた専門的なデータベースに基づいて、様々な細胞活性の誘導または阻害を予測できるロバストなハイスループットデータ解析ソフトウェアである。ＩＰＡ解析によって、ＭＳＣエキソソームが、血管新生、血管発生、細胞遊走および内皮細胞増殖の誘導をはじめとした種々の血管新生関連機能を有する数多くのタンパク質を含むことが示された。
次に、本出願人は、ＭＳＣエキソソームの血管新生インタラクトームのネットワーク解析をＭＳＣプロテオームと同様に行った。本出願人は、ＮＦＫＢ１／２、トリ細網内皮症ウイルス癌遺伝子ホモログＡ（ＲＥＬＡ）、ＰＤＧＦＲＢおよびＥＧＦＲのカノニカルな血管新生経路の近くにクラスタリングされたタンパク質ノードの最もロバストな表示を示した。さらに、ＮＦｋＢ経路のネットワーク解析は、ＲＥＬＡ、ＮＦＫＢ１／２およびＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）の近くにクラスタリングされたＭＳＣエキソソームタンパク質のロバストな表示を示した。まとめると、これらのデータは、ＰＡＤ様条件に曝露されたＭＳＣに由来するエキソソームが、ロバストなプロファイルの血管新生シグナル伝達タンパク質およびＭＳＣに見られるものを厳密に反映する推定機能を含むことを示した。
（ＭＳＣエキソソームは、内皮細胞におけるＮＦｋＢ経路を介して血管新生を誘導する）
ＭＳＣエキソソームの血管新生能を調べるために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をインビトロにおいてＰＡＤ由来ＭＳＣエキソソームで刺激した。それらが細管形成を誘導する能力を評価するために、血管新生のカノニカルなインビトロアッセイを適用した。伝統的に、推定治療薬は、治療指数を有すると知られており、それらは、用量依存的様式で振る舞い、一般に高用量では有効性の低下が観察される（Ｊｉａｎｇ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＡＡＰＳ Ｊ １７（４）：８９１−９０１）。有効量の範囲を調べるために、用量を上げながらＰＡＤ由来ＭＳＣエキソソームでＨＵＶＥＣを処置した。低用量のＰＡＤ由来ＭＳＣエキソソーム（１μｇ／ｍＬ）は、総セグメント長によって測定したとき、無刺激コントロールと比べて有意な細管形成を誘導し、中程度の用量（１０μｇ／ｍＬ）も同様であった（図５）。しかしながら、高用量のＰＡＤ由来ＭＳＣエキソソーム（１００μｇ／ｍＬ）は、中程度の用量よりも有効でなかったことから、有効量の範囲の上限が示唆された（図５）。
ＭＳＣエキソソーム血管新生インタラクトームの本出願人のネットワーク解析マップにおいて、本出願人は、血管新生シグナル伝達を媒介すると知られているＮＦｋＢ複合体のノードの近くにクラスタリングされたいくつかのハブを観察した。これらの特定のノード（ＮＦｋＢ複合体のコア成分である）が、ＭＳＣエキソソームにおいて検出されなかったにもかかわらず、本出願人は、数多くのＮＦｋＢ相互作用タンパク質の存在が、ＨＵＶＥＣ細管形成においてこの経路の潜在的なエフェクターの役割を示唆し得ると仮定した。この仮説を検証するために、細管形成アッセイにおいてＰＡＤ由来ＭＳＣエキソソームで刺激する前に、ＨＵＶＥＣをＮＦｋＢシグナル伝達の特異的阻害剤であるピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）またはビヒクルコントロールで処置した。ＰＡＤ由来ＭＳＣエキソソームは、ビヒクルコントロールで処置されたＨＵＶＥＣにおいて細管形成を誘導したが、ＰＤＴＣで処置されたＨＵＶＥＣでは細管形成を誘導しなかったことから、ＮＦｋＢシグナル伝達が、インビトロにおける細管形成のＭＳＣエキソソーム誘導に必要であることが実証された（図６）。これらの結果は、ＭＳＣエキソソームが、ＮＦｋＢ経路を介して用量依存的様式で血管新生を媒介することを示唆している。
（考察）
この研究は、本出願人の知る限りでは、現在までのところ、ＭＳＣおよびエキソソームの最もロバストなプロテオミクスの特徴づけを提供する（ＭＳＣ＝６，３４２対１０２４、ＭＳＣエキソソーム＝１９２７対２３６）（Ｋｉｍ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１（２）：８３９−８４９；Ｍｉｎｄａｙｅ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１（２）：７９３−８０５）。本出願人は、９つすべてのＭＳＣサンプルにわたってＭＳＣの分類のための最小の基準を満たすために必要な膜結合性タンパク質（ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５）を含む５８０個の膜結合性タンパク質を検出した。これは、現在までのところ、ＭＳＣ膜タンパク質の最もロバストなプロテオミクスのプロファイリングである（５８０対１７２）（Ｍｉｎｄａｙｅ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ７８：１−１４）。ＭＳＣは、ＰＡＤの治療薬として提案されてきたが、しかしながら、ＭＳＣの生理機能とＭＳＣによって誘導される血管新生との両方に及ぼすＰＡＤ微小環境の影響は、十分に理解されていない（Ｃａｐｏｃｃｉａ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１３（２１）：５３４０−５３５１）。いくつかの研究が、虚血組織関連疾患に対してＭＳＣを使用する有効性を実証したにもかかわらず、ＭＳＣによるＶＥＧＦおよびＰＤＧＦの分泌に多くの焦点が当てられてきた（Ｂｅｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ９９（４）：６２２−６３１；Ｄｅｕｓｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２０（１１ Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ２４７−Ｓ２５４；Ｆｉｅｒｒｏ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２９（１１）：１７２７−１７３７；Ｄｉｎｇ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ １１６（１６）：２９８４−２９９３）ので、ＭＳＣによって誘導される血管新生の基本的な機構の特定に向けた取り組みは、しっかりと行われていない。本出願人が用いたプロテオミクスの定量的方法は、本研究において、ＰＡＤ様微小環境に曝露されると、ＭＳＣプロテオームが調節され、複数の経路が、ＭＳＣに媒介される血管新生におそらく関わっているという知見に至らせた、偏りのないアプローチの必要性を強調する。
本出願人は、ＰＡＤ様条件に曝露されたＭＳＣにおいて、様々な細胞周期の開始および解糖遺伝子ネットワークの減弱を示す。３つすべての培養条件の３人のドナー全員（合計９つのサンプル）のネットワーク解析から、ＭＳＣ血管新生インタラクトームが、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲおよびＮＦｋＢに関連するノードについて濃縮されることが実証された。これは、これらの公知の血管新生媒介経路が、おそらくＭＳＣ内の細胞内血管新生シグナル伝達の中心的なハブであることを示唆した（Ｇｉａｎｎｉ−Ｂａｒｒｅｒａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ４２（６）：１６３７−１６４２；Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ，Ｊ．（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５（３）：２０３−２２０；Ｆｕｊｉｏｋａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１）：３４６−３５４；Ｈｏｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２３７（１０）：２９２６−２９３５）。さらに、ＭＳＣをＰＡＤ様条件に曝露したとき、それらは、血管新生シグナル伝達経路のサブセットに関連するタンパク質ＥＧＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦの発現を有意に増加させた。
ＭＳＣは、脳卒中および末梢動脈疾患などの様々な血管疾患モデルにおいてセクレトームを介して組織治癒効果の多くを媒介すると知られている（Ｍｅｙｅｒｒｏｓｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６２（１２）：１１６７−１１７４；Ｂｒｏｎｃｋａｅｒｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １４３（２）：１８１−１９６）。最近の研究は、エキソソームによって媒介される新しい細胞間コミュニケーションシステムが、これらの疾患モデルにおいてＭＳＣの有益な治療効果の多くを再現することができることを実証した（Ｂｉａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９２（４）：３８７−３９７；Ｋｏｒｄｅｌａｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８（４）：９７０−９７３；Ｚｈａｎｇ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３３（７）：２１５８−２１６８；Ｌａｉ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４（３）：２１４−２２２）。しかしながら、ＭＳＣエキソソームがこれらの組織治癒効果を調節する基本的な機構は、まだ解明されていない。
本出願人は、ＰＡＤ様条件（ＰＡＤ）および中間条件（ＩＣ）に曝露されたＭＳＣに由来するエキソソームのプロテオームを特徴づけたが、拡大条件（ＥＸ）に曝露されたＭＳＣに由来するエキソソームのプロテオームを特徴づけなかった。なぜなら、本出願人のＨｉＲＩＥＦ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法は、大量の入力材料を必要とし、この条件からのエキソソームの収量が少なすぎたからである。本出願人は、ＩＣ条件とＰＡＤ条件の両方にわたって、３人のドナー全員からのＭＳＣエキソソームにおいて１，９２７個のタンパク質を定量的に特徴づけ、そのうち４５７個は、ＭＳＣプロテオームにおいて検出されなかった。ＭＳＣエキソソームにおけるこの観察されたタンパク質濃縮に対して考えられる説明は、質量分析法を用いたとき、より複雑な溶解産物中のいくつかのタンパク質がマスクされ得るが、これは、これらのタンパク質のうちのいくつかが分泌のためにエキソソーム内に直接輸送される可能性を排除しないということである（Ｈｕｌｔｉｎ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ＭＣＰ １２（７）：２０２１−２０３１）。注目すべきは、ＭＳＣに由来するエキソソームのプロテオームが、サイトカインおよび増殖因子などの多くのカノニカルな分泌シグナル伝達タンパク質を欠いているらしいが、その代わりに、これらの経路の下流のメディエーターを含んでいるという事実である。
本出願人は、ＰＡＤ様条件に曝露されたＭＳＣからのエキソソームが、ＰＡＤ様条件に曝露されたＭＳＣに見られるアップレギュレートされた血管新生経路（ＥＧＦＲ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦ経路を含む）を厳密に反映するロバストなプロファイルの血管新生関連タンパク質を含むことを示した。これらの知見は、虚血組織条件に曝露されると、エキソソームの分泌を介して、より血管新生促進の状態をもたらそうとすることにより、局所的な組織治癒が促されることを示唆している。さらに、ＭＳＣエキソソームによって誘導される血管新生の主要な駆動物質は、内皮細胞集団に対する直接的なシグナル伝達を介して、または単球などの免疫細胞の走化性を誘導することによって間接的に、作用し得る。
本出願人は、コレステロール／脂質の生合成および代謝を媒介するタンパク質が、ＰＡＤ様条件に曝露されたＭＳＣにおいて有意にアップレギュレートされるのと同時に、いくつかの公知のエキソソーム生合成タンパク質は、これらの同じ条件下において高発現に傾くことも示した。数多くの細胞周期経路が、ＰＡＤ様条件に曝露されたＭＳＣにおいて有意にダウンレギュレートされ、様々な細胞型が、同様の条件に曝露されたとき、実質的に低い増殖率を有する（Ｒｏｓｏｖａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６（８）：２１７３−２１８２；Ｂｅｅｇｌｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３３（６）：１８１８−１８２８）。明示的には、そのような高エネルギーコスト膜成分に対する需要はそれほどないはずであり、エキソソームは、コレステロールなどの脂質ラフト成分が濃縮されていると知られているので（Ｔａｎ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２：２２６１４）、ゆえに、本出願人は、これらのコレステロール／脂質生合成タンパク質のアップレギュレーションが、エキソソームの分泌に関連し得ると推測した。本出願人は、カノニカルなサイズおよび形態であるＭＳＣが、ＰＡＤ様条件に曝露されるとエキソソームの分泌を増加させることを示した。あるいは、観察された脂質生合成の増加は、ＰＡＤ条件における低酸素への細胞の適応であり得る可能性がある（Ｍａｓｓｏｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｂ ２（１）：３）。
従来の広範囲の小分子用量曲線と一致して、本出願人は、ＰＡＤ様条件に曝露されたＭＳＣに由来するエキソソームが、インビトロにおいて用量依存的様式で血管新生を誘導できたことを示す。最高濃度（１００μｇ／ｍＬ）においてＭＳＣエキソソームは、より低い用量と比べて細管形成を誘導しなかったことから、有効な用量範囲の上限が示唆され得る。
本出願人のネットワーク解析は、ＰＡＤ様条件に由来するＭＳＣエキソソームが、血管新生の重要なメディエーターであると以前に示された（Ｈｏｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２３７（１０）：２９２６−２９３５）ＮＦｋＢシグナル伝達に関連するいくつかのノードについて濃縮されていることを示唆した。ＮＦｋＢシグナル伝達の特異的な化学的阻害剤は、インビトロにおいてＭＳＣエキソソームが細管形成を誘導する能力を完全に抑止するので、本出願人は、ＭＳＣエキソソームによって誘導される血管新生が、ＮＦｋＢシグナル伝達に依存することを実証した。しかしながら、ＭＳＣによって誘導される血管新生がどの程度エキソソームによって媒介される効果に起因し得るのかは、不明なままである。全体的に見て、本出願人のデータは、より多くのシグナル伝達経路が関わっていることを示唆しており、これらは、さらなる調査に値する。
（結論）
ＭＳＣエキソソームの文献にわたって明らかになっている共通の傾向は、ＭＳＣに由来するエキソソームが、ＭＳＣセクレトームの増殖因子などのカノニカルな分泌タンパク質に伝統的に関連する機能の多くを媒介できるということである（Ｂｉａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９２（４）：３８７−３９７；Ｋｏｒｄｅｌａｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８（４）：９７０−９７３；Ｚｈａｎｇ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３３（７）：２１５８−２１６８Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２１（１８）：３２８９−３２９７；Ｌｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２２（６）：８４５−８５４；Ｋａｔｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３：１１９７；Ｌｉｎ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｒｅｓ．３９（５）：９２２−９３１；Ｂｒｕｎｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ：ＪＡＳＮ ２００９；２０（５）：１０５３−１０６７；Ｘｉｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３１（１２）：２７３７−２７４６）。カノニカルな分泌タンパク質がＭＳＣセクレトームの機能の主要な駆動物質であるのか、またはエキソソームによって送達されるタンパク質がそうであるのかは、なおもさらなる調査を必要とする；本明細書中に提示されるデータに基づくと、それはおそらく微小環境依存的である。
興味深い未解決の問題は、ＰＡＤ様培養条件に由来するＭＳＣエキソソームを、ＭＳＣの代わりに様々な疾患のための治療薬として使用できるのか、そうだとしたら、基本的な治療機構が何であり得るかである。移植片対宿主病に対してＭＳＣエキソソームで首尾良く処置された最初のヒト患者について２０１４年に発表された研究は、この研究領域が実行可能であり、さらなる調査に値することを示唆していると見られるだろう（Ｋｏｒｄｅｌａｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８（４）：９７０−９７３）。本明細書中のデータは、ＭＳＣ由来のエキソソームが、ＭＳＣ自体の使用に対してさらなる利点を提供する有望な治療プラットフォームであり得ることを示唆している。本明細書中のデータは、循環器疾患に対してより有益な治療薬になるようにＭＳＣエキソソームを操作する試みを目指す将来の研究の計画も提供し得る。
［実施例２］
（末梢動脈疾患）
下肢の末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は、心臓血管の公衆衛生上の負担の主要な一因になっている。下肢の末梢動脈疾患は、高い罹患率を伴い、主な心臓血管の虚血性イベントのリスクが高い患者のコホートを特定する。ＰＡＤは、米国の６５歳を超える人の１２％〜１５％、およそ８００〜１０００万人が罹患していると推定される。その集団が、年をとるにつれて、より肥満になるにつれて、および真性糖尿病がより一般的になるにつれて、有病率は、有意に上昇すると予想される。
ＰＡＤは、動脈硬化巣による動脈構造の狭小化または封鎖に起因して下肢への適切な血流が失われることを特徴とする。ＰＡＤを処置するために、血管形成術およびステント留置が通常用いられるが、しかしながら、その後の血餅形成および新生内膜形成による再狭窄および再閉塞のせいで、多くの患者においてこれらの処置の有効性は限られる。
ＰＡＤを処置するための潜在的な代替の治療アプローチは、罹患組織への血流を回復させるための血管新生の局所的な誘導である。ＰＡＤの動物モデルにおける研究が、組換えＶＥＧＦ治療を介した血管新生の局所的な誘導を示した。しかしながら、この単純明快なアプローチは、これまで、ＰＡＤにおける組織治癒プロセスの一部分に関与する単一のシグナル伝達経路だけを標的とした単独療法アプローチを用いたことにおそらく起因して、後期の臨床試験においてヒトにおいて明らかな利点を示してこなかった（Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ４９（１０）：１０１５−１０２６）。
骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、免疫細胞および内皮細胞を含む内在性細胞集団へのシグナル伝達を介して組織治癒の向上を促す。ＭＳＣは、エキソソームを含む、多様なプロファイルの血管新生シグナル伝達因子の分泌を介したＰＡＤに対する潜在的な治療的処置としての有望さを示した。エキソソームは、タンパク質、ＲＮＡ、脂質および代謝産物の細胞間輸送によって細胞間コミュニケーションを媒介する、細胞によって分泌される脂質結合型の小さいベシクルである。しかしながら、これらの分泌される因子のどれが、ＭＳＣによって誘導される血管新生において一番重要であるかは、不明なままである。興味深いことに、エキソソームは、最近、ＭＳＣの組織治癒特性のいくつかも媒介すると示されたが、しかしながら、ＭＳＣエキソソームがそれらの組織治癒特性を発揮する基本的な機構は、不明なままである。
臨床でのＭＳＣの治療的適用は、それらの細胞がどのようにして組織治癒を媒介するかの現場での理解よりも速く進み、現在は、ＭＳＣエキソソームがどのようにしてＰＡＤなどの循環器疾患のモデルにおいて血管新生を媒介するかが明らかになっていない。エキソソームは、幹細胞由来の治療薬を送達するためのより安全かつ潜在的により有効なビヒクルとしておそらく役立つ、心臓血管の徴候に対する潜在的な治療薬としての関心を急速に獲得している。さらに、ＭＳＣエキソソームの効果的な操作は、今まで臨床では送達することが実用的でなかった新規の治療的に妥当な生物製剤（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミド、膜タンパク質およびサイトゾルタンパク質）の送達を可能にする潜在能力を有している。
ここで、ＭＳＣに由来するエキソソームおよび微小小胞体を、外来性の生物学的成分を用いて操作した。ＭＳＣに、蛍光マーカータンパク質であるｔｄＴｏｍａｔｏおよびｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１３２を過剰発現するレンチウイルスを形質導入した。１６時間後、それらの細胞を所与の新鮮なエキソソーム単離培地（無血清）で３回洗浄し、低酸素（１％Ｏ２）によって、ＭＳＣによるエキソソームの分泌を増加させる。４８時間後、タンジェンシャルフロー濾過を用いて、条件培地からエキソソームを単離し、精製した。次いで、内皮細胞をこれらの単離されたエキソソームに曝露し、８および７２時間後の時点において撮像した（図１３）。エキソソーム曝露の８時間後に撮像された内皮細胞は、少量の蛍光を示すことから、細胞へのタンパク質レベルでのｔｄＴｏｍａｔｏの送達が示唆される。しかしながら、曝露の７２時間後、内皮細胞は、いっそう高い蛍光シグナルを示すことから、さらなるｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質が、エキソソームを介して送達された機能的なｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡから翻訳されたことが示唆される。
別個の実験において、ＭＳＣを、ｍｉＲ−１３２およびｔｄＴｏｍａｔｏを過剰発現するプラスミド発現ベクター（配列番号１８）でトランスフェクトした。１６時間後、それらの細胞を所与の新鮮な微小小胞体単離培地で３回洗浄した。４８時間条件化された培地から、超遠心分離を用いて微小小胞体を回収した。精製された微小小胞体からＤＮＡを単離し、ＰＣＲによって、その発現プラスミドの存在を実証した（図１４）。本明細書中のデータは、これらの微小小胞体が、４８時間の曝露後に蛍光顕微鏡法によって検出されたとき、ｔｄＴｏｍａｔｏおよびｍｉＲ−１３２を発現する機能的なプラスミドを内皮細胞に送達したことを実証している（図１５）。
［実施例３］
（中空糸リアクターを用いた大規模製造）
エキソソームおよび／または微小小胞体の生成をスケールアップするために、中空糸バイオリアクターが使用され得る。この方法によって、人員の労働および培地の使用量（この両方はコスト支出であり得る）が減少する。この実施例では、中空糸カートリッジを、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質コーティングでコーティングした。適切なＥＣＭおよびこの方法での使用に適した他のコーティングの非限定的な例としては、フィブロネクチン、ゼラチン、ビトロネクチン、マトリゲルおよびコラーゲンが挙げられる。１０００万個〜１億個の幹細胞を、コーティングされた中空糸カートリッジ上に播種した。細胞を、拡大培地：５〜２０％ＦＢＳを０〜５％Ｌ−Ｇｌｕｔとともに含む基本培地中、２０％酸素、５％ＣＯ２および７５％窒素の気体混合物を用いて生育した。あるいは、５％のＣＯ２とともに、より低い酸素パーセンテージ（１％〜２０％）を用いて細胞を培養してもよい。細胞拡大の数日後、培地を、０〜５％Ｌ−Ｇｌｕｔを含む基本培地である単離培地に切り換え、１〜２０％酸素、５％ＣＯ２の気体混合物（バランスは窒素でとる）を用いる。１５〜９６時間後、得られた条件培地からエキソソームおよび／または微小小胞体を回収する。エキソソームおよび／または微小小胞体は、ＴＦＦによって、または５００〜６０００×ｇの遠心力を用いて１００〜３００ｋＤａ膜濾過デバイス（例えば、ＶｉｖａＳｐｉｎ）を用いる直接単離によって条件培地から単離されてもよい。
中空糸リアクターシステムにおいて培養された細胞は、標準的な組織培養フラスコと比べて、より高い収量のエキソソームおよび／または微小小胞体を産生する（図２０）。さらに、中空糸リアクターシステムを使用すると、カノニカルな形態および直径のエキソソームおよび／または微小小胞体が産生される（図２１）。エキソソームは、タンパク質濃縮キット（例えば、ＤＣアッセイ）および／またはＮａｎｏＳｉｇｈｔ装置を用いて定量され得る。エキソソームのサイズ分布は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ装置または他の粒子分析装置（例えば、Ｉｚｏｎまたはフローサイトメーター）を用いて得られる。エキソソームが、カノニカルな形態およびサイズであることを実証するために、電子顕微鏡法が用いられる。インビボ研究の前に、さらなる検証が、遊走アッセイ、細管形成および免疫調節（例えば、混合リンパ球反応）を含むインビトロアッセイを用いて行われ得る。
［実施例４］
（エキソソームおよび／または微小小胞体の凍結乾燥）
いくつかの実施形態において、本開示のエキソソームおよび／または微小小胞体の凍結乾燥が、冷却器、真空ポンプおよびフリーズドライヤーを使用して行われる。上記方法では、良好な真空（１００μｂａｒ以下）が確実に達成されるようにマニフォールドがアセンブルされる。冷却器は、−５０℃以下に設定されるべきである。濃縮されたエキソソームおよび／または微小小胞体溶液を、微量遠心管、または使用される冷却器（ｃｏｎｄｅｎｓｅ）、真空ポンプおよび／もしくはフリーズドライヤーのスケールに適した他の好適な容器に分注する。それらのチューブは、３３％を超えて満たされるべきでない。チューブの蓋に穴をあけるか、またはその蓋を除去し、いくつかの穴を空けたパラフィルムもしくは他の覆いで置き換える。微量遠心管を、当該分野で周知の任意の方法によって、例えば、液体窒素または無水／アセトンに部分的に浸されるまで浸漬するか、あるいはマイナス４０℃以下に設定された好適なｓｐａｒｋ−ｐｒｏｏｆディープフリーザー内で凍結することによって、急速凍結する。凍結されたら、チューブを、Ｑｕｉｃｋｆｉｔスタイルの丸底フラスコ、または使用されるチューブのサイズに適した他の容器に入れる。ガラスの外側を−６０℃以下に冷却し、マニフォールドに取り付ける。真空を適用し、確実に１００μｂａｒ以下に戻ったかを確認する。次いで、サンプルを、揮発性溶媒のために、一晩（およそ１６時間）またはそれ以下にわたって室温まで完全に加温した。この加温の後、材料がチューブから除去されないようにマニフォールドのバルブをゆっくり開くことによって真空を開放する。いくつかの実施形態では、このシステムを放置し、一部を数日間にわたって乾燥させた後、冷却器を解凍する。いくつかの実施形態では、マニフォールド上の複数のフラスコを使用し、それらが完全に乾燥したときに応じて、異なるフラスコを異なる時点で取り出す。
［実施例５］
（脳卒中）
中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）を有する脳卒中のラットモデルを確立するために、まず、吸入イソフラン（ｉｎｈａｌｅｄ ｉｓｏｆｕｒａｎｅ）（誘導のために３％、続いて維持のために２％）を用いてラットを麻酔する。Ｎａｉｒを用いて、切開部位上の毛を除去し、滅菌されたＰＢＳ、７５％エタノールおよびベタジンで連続的に皮膚を清浄にし、滅菌する。頸部の正中切開を行い、軟部組織を引き離す。左総頚動脈（ＬＣＣＡ）を周囲の神経から慎重に切り離して切開し（迷走神経を傷つけずに）、６．０／７．０縫合糸で結紮を行う。５．０縫合糸も使用できる。次いで、左外頚動脈（ＬＥＣＡ）を分離し、第２の結び目を作る。次に、左内頚動脈（ＬＩＣＡ）を単離し、６．０フィラメントで結び目を作る。左内頚動脈（ＬＩＣＡ）および左翼口蓋動脈（ＬＰＡ）の良好な視野を得た後、両方の動脈を微小血管クリップで留める。ＬＣＣＡに小さな穴をあけた後、それがＬＥＣＡおよびＬＩＣＡに二叉に分岐する。次いで、シリコン硬化剤混合物でコーティングされた８．０ナイロンでできているモノフィラメントを、クリップに突き当たるまでＬＩＣＡに挿入する。後頭動脈に入らないように注意を払わなければならない。クリップで留められた動脈を開放するが、そのフィラメントをＬＩＣＡに挿入して、ウィリス動脈輪におけるＬＭＣＡの起点を閉塞する。ＬＩＣＡにおける第３の結び目を閉じて、フィラメントを適所に固定する。
上記のＭＣＡＯモデルを用いて、本出願人は、脳卒中のラットモデルにおけるエキソソームの治療効果を実証した。妥当な標的細胞集団によってエキソソームが取り込まれるかを調べるために、ＭＳＣが虚血関連疾患に罹患している組織に注入された際に経験する微小環境を模倣する条件（低酸素、血清飢餓）にＭＳＣを曝露することによって、ＭＳＣ−脳卒中エキソソームを調製する。非喫煙の若年成人男性由来のヒト骨髄穿刺液をＬｏｎｚａ（Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ）から入手した。ＭＳＣの単離および拡大に向けて、骨棘を単離するために、骨髄穿刺液を９０μｍポアストレーナーに通した。次いで、漉された骨髄穿刺液を、等体積のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、フィコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ）の上に乗せて３０分間、７００ｇで遠心分離した。次に、単核細胞および骨棘を、最適なＭＳＣ生育のためにスクリーニングされた１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ，ＧＡ）が補充された最小必須培地α（ＭＥＭ−α）（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてプラスチック培養フラスコにプレーティングした。２日後、ＰＢＳによる２〜３回の洗浄工程によって、非接着性細胞を除去した。継代数２の後、ＭＳＣを２０％ＦＢＳ中で拡大し、継代数５〜６のＭＳＣを実験に使用した。血清飢餓に向けて、ＭＳＣをＰＢＳで３回洗浄し、フェノールレッドを含まず１％Ｌ−Ｇｌｕｔ（ＩＣ）を含むＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からなるエキソソーム単離培地中で４０時間培養した。血清飢餓＋低酸素条件（ＰＡＤ）の場合は、ＭＳＣを１％酸素分圧下のエキソソーム単離培地中で４０時間培養した。プールされたヒトＨＵＶＥＣＳをＬｏｎｚａ（Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ）から購入し、製造者の指示書に従って、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）製のＥｎｄｏＧＲＯ−ＬＳ完全培地を用いて培養した。
ＭＳＣをＰＢＳで３回洗浄し、エキソソーム単離培地；１８時間の１２０，０００×ｇでの遠心分離によって事前にエキソソームを除去した２０％ＦＢＳ培地、またはＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のいずれかに切り替え、ベシクル単離の前に４０時間条件化した。本明細書中に記載されるように、微小小胞体（ＭＶ）を単離した。簡潔には、条件培地から細胞および細胞残屑を遠心分離（それぞれ５００×ｇおよび１０００×ｇ）によって除去し、次いで、１７，０００×ｇでの遠心分離でペレットにしてＭＶを単離した。本明細書中に記載されるように、エキソソームを単離した。簡潔には、プロテオミクス研究に向けて、０．２２μｍ濾過を用いて細胞、細胞残屑および微小小胞体を除いた後、１２０，０００×ｇで２時間遠心分離してエキソソームを単離し、次いで、そのペレットを３９ｍＬのＰＢＳで洗浄し、再度、１２０，０００×ｇで２時間遠心分離した。すべての超遠心工程を、ポリアロマークイックシールチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）においてＴｉ７０ローターを用いて行った。ＤＣアッセイ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いてベシクル濃度を測定し、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０ＨＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，Ａｍｅｓｂｕｒｙ，ＭＡ）を用いてサイズ分布を評価した。
ＭＳＣエキソソームが標的細胞集団に影響する能力を評価するために、エキソソームを蛍光標識で標識し、ヒト初代内皮細胞に曝露した。１時間後、蛍光顕微鏡法を用いて、エキソソームの取り込みを観察することができる。この結果は、エキソソームが、虚血性脳卒中のヒトを処置するための治療標的である細胞によって吸収されることを実証する。さらに、ＭＳＣ−脳卒中エキソソームへの標的細胞集団（例えば、内皮細胞）の曝露は、６時間以内に遊走を誘導し、１５時間以内に細管形成を誘導することから、エキソソームが、脳卒中の潜在的な治療薬の重要な特徴である血管新生効果を誘導できることが実証される。
エキソソーム処置は、ＭＣＡＯモデルにおいて治療的応答を誘導できる。ＭＳＣ−脳卒中由来のエキソソーム（１００ｕｇ／ｍＬ）が、ＭＣＡＯラットの頭蓋内、動脈内または静脈内に注射され得る。エキソソームによる処置は、非対称の足を使用する円筒試験におけるラットの成績を改善し、脳卒中梗塞（ｓｔｒｏｋｅ ｉｎｆａｒｃｔ）の周囲の領域における炎症性サイトカインＩＬ−１βを減少させた。このデータは、エキソソームが、複数の送達経路によって脳卒中にとって妥当な治療効果（例えば、運動技能アッセイを介した機能回復および炎症の減少）をもたらす能力の頑健性および再現性を示唆する。
（等価物）
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。
本明細書中に例証的に記載された本発明は、本明細書中に具体的に開示されていない任意のエレメント、制限の非存在下において適切に実施され得る。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、制限なく拡張的に読解されるものとする。さらに、本明細書中で使用される用語および表現は、説明の用語として使用されているのであって、限定の用語として使用されているのではなく、そのような用語および表現の使用に、示されるおよび記載される特徴またはその一部の任意の等価物を排除するという意図はなく、特許請求される本発明の範囲内で様々な改変が可能であると認識される。
したがって、本発明は、好ましい実施形態および自由選択の特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書中で例示された本発明の改変、改善および変形が当業者によって行われ得ること、ならびにそのような改変、改善および変形が本発明の範囲内であると見なされることが理解されるべきである。本明細書中に提供された材料、方法および例は、好ましい実施形態の代表であり、例示的であり、本発明の範囲に対する制限として意図されていない。
本発明は、本明細書中で広く一般に説明されてきた。属の開示の範囲内に入るより狭い種および亜属群の各々も、本発明の一部を形成する。これは、切り取られた材料が本明細書で具体的に述べられているか否かを問わず、その属から任意の主題を除く条件付きまたは消極的な限定つきで、本発明の属の説明を含む。
すべての式および図面を含む、本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、各々が個別に参照により援用されたのと同程度に、それらの全体が参照により明示的に援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配するものとする。
他の実施形態は、以下の請求項に示される。

Claims (143)

  1. 細胞由来ベシクルを産生する幹細胞を低酸素条件および低血清条件下において培養することによって調製された細胞由来ベシクルの高度に精製された集団であって、必要に応じて、該細胞由来ベシクルは、エキソソームおよび／または微小小胞体を含む、精製された集団。
  2. 必要に応じて、前記細胞由来ベシクルが、エキソソームおよび／または微小小胞体を含む、改変された細胞由来ベシクルの高度に精製された集団。
  3. 前記細胞由来ベシクルが、成体幹細胞、胚性幹細胞、胚様幹細胞、神経幹細胞または人工多能性幹細胞の群の１つ以上の幹細胞から単離される、請求項１に記載の精製された集団。
  4. 前記幹細胞が、必要に応じて間葉系幹細胞である成体幹細胞である、請求項１に記載の精製された集団。
  5. 前記集団の細胞由来ベシクルが、少なくとも１つの外来性核酸および／または少なくとも１つの外来性タンパク質をさらに含む、請求項１に記載の精製された集団。
  6. 前記外来性核酸が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする、請求項５に記載の精製された集団。
  7. 前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−２９６およびｌｅｔ−７からなる群より選択される、請求項６に記載の精製された集団。
  8. 前記外来性タンパク質が、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、コラーゲンタイプ１アルファ２（ＣＯＬ１Ａ２）、コラーゲンタイプＶＩアルファ３（ＣＯＬ６Ａ３）、ＥＧＦ様リピートおよびジスコイジンｉ様ドメイン含有タンパク質３（ＥＤＩＬ３）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、フィブロネクチン（ＦＮ１）、乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧＥ８）、レクチン，ガラクトシド結合可溶性３結合タンパク質（ＬＧＡＬＳ３ＢＰ）、核内因子カッパーＢ（ＮＦκＢ）またはトランスフェリン（ＴＦ）のうちの１つ以上である、請求項５に記載の精製された集団。
  9. 前記細胞由来ベシクルの集団が、ＶＥＧＦＲおよび／またはＶＥＧＦを含まない、請求項１に記載の精製された集団。
  10. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２９６およびｍｉＲ−４２４のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  11. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２９６およびｍｉＲ−４２４のうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  12. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２９６およびｍｉＲ−４２４のうちの３つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  13. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２９６およびｍｉＲ−４２４のうちの４つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  14. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２９６およびｍｉＲ−４２４のうちの５つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  15. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２９６およびｍｉＲ−４２４のうちの６つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  16. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２９６およびｍｉＲ−４２４を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  17. 前記集団の細胞由来ベシクルが、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、４−アミノ酪酸、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン、５−メトキシトリプタミン、ｓ−アデノシルメチオニン、ｓ−アデノシルホモシステイン、アジピン酸、アミノマロネート、アラビノース、アスパラギン酸、ベータ−アラニン、コレステロール、クエン酸、クレアチニン、システイン、シチジン−５−一リン酸、エリトリトール、フルクトース、フマル酸、ガラクツロン酸、グルコース、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン、グリセリン酸、グリセロール−アルファ−リン酸、グリシン、グアノシン、ヘキシトール、ヘキスロン酸、イノシン、イソヘキソン酸、イソマルトース、ラクトアミド、乳酸、ラクトース、ロイシン、レボグルコサン、マレイミド、リンゴ酸、マルトトリオース、マンノース、リン酸メタノール、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、ニコチンアミド、Ｎ−メチルアラニン、オキソプロリン、パントテン酸、ペンタデカン酸、フェノール、プトレッシン、ピルビン酸、リビトール、リボース、ソルビトール、スクアレン、コハク酸、トレイトール、トレオン酸、トレオニン、チミン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、トレハロース、尿素、ウリジン、バリンおよびキシリトールのうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  18. 前記集団の細胞由来ベシクルが、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、４−アミノ酪酸、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン、５−メトキシトリプタミン、ｓ−アデノシルメチオニン、ｓ−アデノシルホモシステイン、アジピン酸、アミノマロネート、アラビノース、アスパラギン酸、ベータ−アラニン、コレステロール、クエン酸、クレアチニン、システイン、シチジン−５−一リン酸、エリトリトール、フルクトース、フマル酸、ガラクツロン酸、グルコース、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン、グリセリン酸、グリセロール−アルファ−リン酸、グリシン、グアノシン、ヘキシトール、ヘキスロン酸、イノシン、イソヘキソン酸、イソマルトース、ラクトアミド、乳酸、ラクトース、ロイシン、レボグルコサン、マレイミド、リンゴ酸、マルトトリオース、マンノース、リン酸メタノール、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、ニコチンアミド、Ｎ−メチルアラニン、オキソプロリン、パントテン酸、ペンタデカン酸、フェノール、プトレッシン、ピルビン酸、リビトール、リボース、ソルビトール、スクアレン、コハク酸、トレイトール、トレオン酸、トレオニン、チミン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、トレハロース、尿素、ウリジン、バリンおよびキシリトールのうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  19. 前記集団の細胞由来ベシクルが、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、４−アミノ酪酸、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン、５−メトキシトリプタミン、ｓ−アデノシルメチオニン、ｓ−アデノシルホモシステイン、アジピン酸、アミノマロネート、アラビノース、アスパラギン酸、ベータ−アラニン、コレステロール、クエン酸、クレアチニン、システイン、シチジン−５−一リン酸、エリトリトール、フルクトース、フマル酸、ガラクツロン酸、グルコース、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン、グリセリン酸、グリセロール−アルファ−リン酸、グリシン、グアノシン、ヘキシトール、ヘキスロン酸、イノシン、イソヘキソン酸、イソマルトース、ラクトアミド、乳酸、ラクトース、ロイシン、レボグルコサン、マレイミド、リンゴ酸、マルトトリオース、マンノース、リン酸メタノール、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、ニコチンアミド、Ｎ−メチルアラニン、オキソプロリン、パントテン酸、ペンタデカン酸、フェノール、プトレッシン、ピルビン酸、リビトール、リボース、ソルビトール、スクアレン、コハク酸、トレイトール、トレオン酸、トレオニン、チミン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、トレハロース、尿素、ウリジン、バリンおよびキシリトールのうちの３つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  20. 前記集団の細胞由来ベシクルが、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、４−アミノ酪酸、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン、５−メトキシトリプタミン、ｓ−アデノシルメチオニン、ｓ−アデノシルホモシステイン、アジピン酸、アミノマロネート、アラビノース、アスパラギン酸、ベータ−アラニン、コレステロール、クエン酸、クレアチニン、システイン、シチジン−５−一リン酸、エリトリトール、フルクトース、フマル酸、ガラクツロン酸、グルコース、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン、グリセリン酸、グリセロール−アルファ−リン酸、グリシン、グアノシン、ヘキシトール、ヘキスロン酸、イノシン、イソヘキソン酸、イソマルトース、ラクトアミド、乳酸、ラクトース、ロイシン、レボグルコサン、マレイミド、リンゴ酸、マルトトリオース、マンノース、リン酸メタノール、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、ニコチンアミド、Ｎ−メチルアラニン、オキソプロリン、パントテン酸、ペンタデカン酸、フェノール、プトレッシン、ピルビン酸、リビトール、リボース、ソルビトール、スクアレン、コハク酸、トレイトール、トレオン酸、トレオニン、チミン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、トレハロース、尿素、ウリジン、バリンおよびキシリトールのうちの４つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  21. 前記集団の細胞由来ベシクルが、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、４−アミノ酪酸、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン、５−メトキシトリプタミン、ｓ−アデノシルメチオニン、ｓ−アデノシルホモシステイン、アジピン酸、アミノマロネート、アラビノース、アスパラギン酸、ベータ−アラニン、コレステロール、クエン酸、クレアチニン、システイン、シチジン−５−一リン酸、エリトリトール、フルクトース、フマル酸、ガラクツロン酸、グルコース、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン、グリセリン酸、グリセロール−アルファ−リン酸、グリシン、グアノシン、ヘキシトール、ヘキスロン酸、イノシン、イソヘキソン酸、イソマルトース、ラクトアミド、乳酸、ラクトース、ロイシン、レボグルコサン、マレイミド、リンゴ酸、マルトトリオース、マンノース、リン酸メタノール、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、ニコチンアミド、Ｎ−メチルアラニン、オキソプロリン、パントテン酸、ペンタデカン酸、フェノール、プトレッシン、ピルビン酸、リビトール、リボース、ソルビトール、スクアレン、コハク酸、トレイトール、トレオン酸、トレオニン、チミン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、トレハロース、尿素、ウリジン、バリンおよびキシリトールのうちの５つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  22. 前記集団の細胞由来ベシクルが、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、４−アミノ酪酸、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン、５−メトキシトリプタミン、ｓ−アデノシルメチオニン、ｓ−アデノシルホモシステイン、アジピン酸、アミノマロネート、アラビノース、アスパラギン酸、ベータ−アラニン、コレステロール、クエン酸、クレアチニン、システイン、シチジン−５−一リン酸、エリトリトール、フルクトース、フマル酸、ガラクツロン酸、グルコース、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン、グリセリン酸、グリセロール−アルファ−リン酸、グリシン、グアノシン、ヘキシトール、ヘキスロン酸、イノシン、イソヘキソン酸、イソマルトース、ラクトアミド、乳酸、ラクトース、ロイシン、レボグルコサン、マレイミド、リンゴ酸、マルトトリオース、マンノース、リン酸メタノール、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、ニコチンアミド、Ｎ−メチルアラニン、オキソプロリン、パントテン酸、ペンタデカン酸、フェノール、プトレッシン、ピルビン酸、リビトール、リボース、ソルビトール、スクアレン、コハク酸、トレイトール、トレオン酸、トレオニン、チミン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、トレハロース、尿素、ウリジン、バリンおよびキシリトールのうちの６つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  23. 前記集団の細胞由来ベシクルが、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、４−アミノ酪酸、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン、５−メトキシトリプタミン、ｓ−アデノシルメチオニン、ｓ−アデノシルホモシステイン、アジピン酸、アミノマロネート、アラビノース、アスパラギン酸、ベータ−アラニン、コレステロール、クエン酸、クレアチニン、システイン、シチジン−５−一リン酸、エリトリトール、フルクトース、フマル酸、ガラクツロン酸、グルコース、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン、グリセリン酸、グリセロール−アルファ−リン酸、グリシン、グアノシン、ヘキシトール、ヘキスロン酸、イノシン、イソヘキソン酸、イソマルトース、ラクトアミド、乳酸、ラクトース、ロイシン、レボグルコサン、マレイミド、リンゴ酸、マルトトリオース、マンノース、リン酸メタノール、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、ニコチンアミド、Ｎ−メチルアラニン、オキソプロリン、パントテン酸、ペンタデカン酸、フェノール、プトレッシン、ピルビン酸、リビトール、リボース、ソルビトール、スクアレン、コハク酸、トレイトール、トレオン酸、トレオニン、チミン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、トレハロース、尿素、ウリジン、バリンおよびキシリトールのうちの７つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  24. 前記集団の細胞由来ベシクルが、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、４−アミノ酪酸、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン、５−メトキシトリプタミン、ｓ−アデノシルメチオニン、ｓ−アデノシルホモシステイン、アジピン酸、アミノマロネート、アラビノース、アスパラギン酸、ベータ−アラニン、コレステロール、クエン酸、クレアチニン、システイン、シチジン−５−一リン酸、エリトリトール、フルクトース、フマル酸、ガラクツロン酸、グルコース、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン、グリセリン酸、グリセロール−アルファ−リン酸、グリシン、グアノシン、ヘキシトール、ヘキスロン酸、イノシン、イソヘキソン酸、イソマルトース、ラクトアミド、乳酸、ラクトース、ロイシン、レボグルコサン、マレイミド、リンゴ酸、マルトトリオース、マンノース、リン酸メタノール、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、ニコチンアミド、Ｎ−メチルアラニン、オキソプロリン、パントテン酸、ペンタデカン酸、フェノール、プトレッシン、ピルビン酸、リビトール、リボース、ソルビトール、スクアレン、コハク酸、トレイトール、トレオン酸、トレオニン、チミン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、トレハロース、尿素、ウリジン、バリンおよびキシリトールのうちの８つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  25. 前記集団の細胞由来ベシクルが、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、４−アミノ酪酸、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン、５−メトキシトリプタミン、ｓ−アデノシルメチオニン、ｓ−アデノシルホモシステイン、アジピン酸、アミノマロネート、アラビノース、アスパラギン酸、ベータ−アラニン、コレステロール、クエン酸、クレアチニン、システイン、シチジン−５−一リン酸、エリトリトール、フルクトース、フマル酸、ガラクツロン酸、グルコース、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン、グリセリン酸、グリセロール−アルファ−リン酸、グリシン、グアノシン、ヘキシトール、ヘキスロン酸、イノシン、イソヘキソン酸、イソマルトース、ラクトアミド、乳酸、ラクトース、ロイシン、レボグルコサン、マレイミド、リンゴ酸、マルトトリオース、マンノース、リン酸メタノール、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、ニコチンアミド、Ｎ−メチルアラニン、オキソプロリン、パントテン酸、ペンタデカン酸、フェノール、プトレッシン、ピルビン酸、リビトール、リボース、ソルビトール、スクアレン、コハク酸、トレイトール、トレオン酸、トレオニン、チミン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、トレハロース、尿素、ウリジン、バリンおよびキシリトールのうちの９つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  26. 前記集団の細胞由来ベシクルが、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、４−アミノ酪酸、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン、５−メトキシトリプタミン、ｓ−アデノシルメチオニン、ｓ−アデノシルホモシステイン、アジピン酸、アミノマロネート、アラビノース、アスパラギン酸、ベータ−アラニン、コレステロール、クエン酸、クレアチニン、システイン、シチジン−５−一リン酸、エリトリトール、フルクトース、フマル酸、ガラクツロン酸、グルコース、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン、グリセリン酸、グリセロール−アルファ−リン酸、グリシン、グアノシン、ヘキシトール、ヘキスロン酸、イノシン、イソヘキソン酸、イソマルトース、ラクトアミド、乳酸、ラクトース、ロイシン、レボグルコサン、マレイミド、リンゴ酸、マルトトリオース、マンノース、リン酸メタノール、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、ニコチンアミド、Ｎ−メチルアラニン、オキソプロリン、パントテン酸、ペンタデカン酸、フェノール、プトレッシン、ピルビン酸、リビトール、リボース、ソルビトール、スクアレン、コハク酸、トレイトール、トレオン酸、トレオニン、チミン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、トレハロース、尿素、ウリジン、バリンおよびキシリトールのうちの１０個以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  27. 前記集団の細胞由来ベシクルが、
    セラミド（ｄ３２：１）、セラミド（ｄ３３：１）、セラミド（ｄ３４：０）、セラミド（ｄ３４：１）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３６：１）、セラミド（ｄ３８：１）、セラミド（ｄ３９：１）、セラミド（ｄ４０：０）、セラミド（ｄ４０：１）、セラミド（ｄ４０：２）、セラミド（ｄ４１：１）、セラミド（ｄ４２：１）、セラミド（ｄ４２：２）Ｂ、セラミド（ｄ４４：１）、脂肪酸（２０：４）、脂肪酸（２２：０）、脂肪酸（２２：６）、脂肪酸（２４：０）、脂肪酸（２４：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４０：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４１：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：２）、リゾホスファチジルコリン（１６：０）、リゾホスファチジルコリン（１８：０）Ａ、リゾホスファチジルコリン（１８：１）、リゾホスファチジルエタノールアミン（２０：４）、ホスファチジルコリン（３２：１）、ホスファチジルコリン（３３：１）、ホスファチジルコリン（３４：０）、ホスファチジルコリン（３４：１）、ホスファチジルコリン（３４：２）、ホスファチジルコリン（３５：２）、ホスファチジルコリン（３６：１）、ホスファチジルコリン（３６：２）、ホスファチジルコリン（３６：３）、ホスファチジルコリン（３８：２）、ホスファチジルコリン（３８：３）、ホスファチジルコリン（３８：５）、ホスファチジルコリン（３８：６）、ホスファチジルコリン（４０：５）、ホスファチジルコリン（４０：６）、ホスファチジルコリン（４０：７）、ホスファチジルコリン（ｐ−３４：０）、ホスファチジルコリン（ｏ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：３）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（３８：４）、Ｂ ホスファチジルエタノールアミン（３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：８）、スフィンゴミエリン（ｄ３０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３３：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３４：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３８：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４２：２），及びＢ スフィンゴミエリン（ｄ４２：３）のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  28. 前記集団の細胞由来ベシクルが、
    セラミド（ｄ３２：１）、セラミド（ｄ３３：１）、セラミド（ｄ３４：０）、セラミド（ｄ３４：１）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３６：１）、セラミド（ｄ３８：１）、セラミド（ｄ３９：１）、セラミド（ｄ４０：０）、セラミド（ｄ４０：１）、セラミド（ｄ４０：２）、セラミド（ｄ４１：１）、セラミド（ｄ４２：１）、セラミド（ｄ４２：２）Ｂ、セラミド（ｄ４４：１）、脂肪酸（２０：４）、脂肪酸（２２：０）、脂肪酸（２２：６）、脂肪酸（２４：０）、脂肪酸（２４：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４０：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４１：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：２）、リゾホスファチジルコリン（１６：０）、リゾホスファチジルコリン（１８：０）Ａ、リゾホスファチジルコリン（１８：１）、リゾホスファチジルエタノールアミン（２０：４）、ホスファチジルコリン（３２：１）、ホスファチジルコリン（３３：１）、ホスファチジルコリン（３４：０）、ホスファチジルコリン（３４：１）、ホスファチジルコリン（３４：２）、ホスファチジルコリン（３５：２）、ホスファチジルコリン（３６：１）、ホスファチジルコリン（３６：２）、ホスファチジルコリン（３６：３）、ホスファチジルコリン（３８：２）、ホスファチジルコリン（３８：３）、ホスファチジルコリン（３８：５）、ホスファチジルコリン（３８：６）、ホスファチジルコリン（４０：５）、ホスファチジルコリン（４０：６）、ホスファチジルコリン（４０：７）、ホスファチジルコリン（ｐ−３４：０）、ホスファチジルコリン（ｏ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：３）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（３８：４）、Ｂ ホスファチジルエタノールアミン（３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：８）、スフィンゴミエリン（ｄ３０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３３：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３４：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３８：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４２：２），及びＢ スフィンゴミエリン（ｄ４２：３）のうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  29. 前記集団の細胞由来ベシクルが、
    セラミド（ｄ３２：１）、セラミド（ｄ３３：１）、セラミド（ｄ３４：０）、セラミド（ｄ３４：１）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３６：１）、セラミド（ｄ３８：１）、セラミド（ｄ３９：１）、セラミド（ｄ４０：０）、セラミド（ｄ４０：１）、セラミド（ｄ４０：２）、セラミド（ｄ４１：１）、セラミド（ｄ４２：１）、セラミド（ｄ４２：２）Ｂ、セラミド（ｄ４４：１）、脂肪酸（２０：４）、脂肪酸（２２：０）、脂肪酸（２２：６）、脂肪酸（２４：０）、脂肪酸（２４：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４０：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４１：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：２）、リゾホスファチジルコリン（１６：０）、リゾホスファチジルコリン（１８：０）Ａ、リゾホスファチジルコリン（１８：１）、リゾホスファチジルエタノールアミン（２０：４）、ホスファチジルコリン（３２：１）、ホスファチジルコリン（３３：１）、ホスファチジルコリン（３４：０）、ホスファチジルコリン（３４：１）、ホスファチジルコリン（３４：２）、ホスファチジルコリン（３５：２）、ホスファチジルコリン（３６：１）、ホスファチジルコリン（３６：２）、ホスファチジルコリン（３６：３）、ホスファチジルコリン（３８：２）、ホスファチジルコリン（３８：３）、ホスファチジルコリン（３８：５）、ホスファチジルコリン（３８：６）、ホスファチジルコリン（４０：５）、ホスファチジルコリン（４０：６）、ホスファチジルコリン（４０：７）、ホスファチジルコリン（ｐ−３４：０）、ホスファチジルコリン（ｏ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：３）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（３８：４）、Ｂ ホスファチジルエタノールアミン（３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：８）、スフィンゴミエリン（ｄ３０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３３：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３４：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３８：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４２：２），及びＢ スフィンゴミエリン（ｄ４２：３）のうちの３つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  30. 前記集団の細胞由来ベシクルが、
    セラミド（ｄ３２：１）、セラミド（ｄ３３：１）、セラミド（ｄ３４：０）、セラミド（ｄ３４：１）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３６：１）、セラミド（ｄ３８：１）、セラミド（ｄ３９：１）、セラミド（ｄ４０：０）、セラミド（ｄ４０：１）、セラミド（ｄ４０：２）、セラミド（ｄ４１：１）、セラミド（ｄ４２：１）、セラミド（ｄ４２：２）Ｂ、セラミド（ｄ４４：１）、脂肪酸（２０：４）、脂肪酸（２２：０）、脂肪酸（２２：６）、脂肪酸（２４：０）、脂肪酸（２４：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４０：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４１：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：２）、リゾホスファチジルコリン（１６：０）、リゾホスファチジルコリン（１８：０）Ａ、リゾホスファチジルコリン（１８：１）、リゾホスファチジルエタノールアミン（２０：４）、ホスファチジルコリン（３２：１）、ホスファチジルコリン（３３：１）、ホスファチジルコリン（３４：０）、ホスファチジルコリン（３４：１）、ホスファチジルコリン（３４：２）、ホスファチジルコリン（３５：２）、ホスファチジルコリン（３６：１）、ホスファチジルコリン（３６：２）、ホスファチジルコリン（３６：３）、ホスファチジルコリン（３８：２）、ホスファチジルコリン（３８：３）、ホスファチジルコリン（３８：５）、ホスファチジルコリン（３８：６）、ホスファチジルコリン（４０：５）、ホスファチジルコリン（４０：６）、ホスファチジルコリン（４０：７）、ホスファチジルコリン（ｐ−３４：０）、ホスファチジルコリン（ｏ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：３）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（３８：４）、Ｂ ホスファチジルエタノールアミン（３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：８）、スフィンゴミエリン（ｄ３０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３３：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３４：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３８：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４２：２），及びＢ スフィンゴミエリン（ｄ４２：３）のうちの４つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  31. 前記集団の細胞由来ベシクルが、
    セラミド（ｄ３２：１）、セラミド（ｄ３３：１）、セラミド（ｄ３４：０）、セラミド（ｄ３４：１）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３６：１）、セラミド（ｄ３８：１）、セラミド（ｄ３９：１）、セラミド（ｄ４０：０）、セラミド（ｄ４０：１）、セラミド（ｄ４０：２）、セラミド（ｄ４１：１）、セラミド（ｄ４２：１）、セラミド（ｄ４２：２）Ｂ、セラミド（ｄ４４：１）、脂肪酸（２０：４）、脂肪酸（２２：０）、脂肪酸（２２：６）、脂肪酸（２４：０）、脂肪酸（２４：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４０：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４１：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：２）、リゾホスファチジルコリン（１６：０）、リゾホスファチジルコリン（１８：０）Ａ、リゾホスファチジルコリン（１８：１）、リゾホスファチジルエタノールアミン（２０：４）、ホスファチジルコリン（３２：１）、ホスファチジルコリン（３３：１）、ホスファチジルコリン（３４：０）、ホスファチジルコリン（３４：１）、ホスファチジルコリン（３４：２）、ホスファチジルコリン（３５：２）、ホスファチジルコリン（３６：１）、ホスファチジルコリン（３６：２）、ホスファチジルコリン（３６：３）、ホスファチジルコリン（３８：２）、ホスファチジルコリン（３８：３）、ホスファチジルコリン（３８：５）、ホスファチジルコリン（３８：６）、ホスファチジルコリン（４０：５）、ホスファチジルコリン（４０：６）、ホスファチジルコリン（４０：７）、ホスファチジルコリン（ｐ−３４：０）、ホスファチジルコリン（ｏ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：３）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（３８：４）、Ｂ ホスファチジルエタノールアミン（３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：８）、スフィンゴミエリン（ｄ３０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３３：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３４：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３８：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４２：２），及びＢ スフィンゴミエリン（ｄ４２：３）のうちの５つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  32. 前記集団の細胞由来ベシクルが、
    セラミド（ｄ３２：１）、セラミド（ｄ３３：１）、セラミド（ｄ３４：０）、セラミド（ｄ３４：１）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３６：１）、セラミド（ｄ３８：１）、セラミド（ｄ３９：１）、セラミド（ｄ４０：０）、セラミド（ｄ４０：１）、セラミド（ｄ４０：２）、セラミド（ｄ４１：１）、セラミド（ｄ４２：１）、セラミド（ｄ４２：２）Ｂ、セラミド（ｄ４４：１）、脂肪酸（２０：４）、脂肪酸（２２：０）、脂肪酸（２２：６）、脂肪酸（２４：０）、脂肪酸（２４：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４０：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４１：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：２）、リゾホスファチジルコリン（１６：０）、リゾホスファチジルコリン（１８：０）Ａ、リゾホスファチジルコリン（１８：１）、リゾホスファチジルエタノールアミン（２０：４）、ホスファチジルコリン（３２：１）、ホスファチジルコリン（３３：１）、ホスファチジルコリン（３４：０）、ホスファチジルコリン（３４：１）、ホスファチジルコリン（３４：２）、ホスファチジルコリン（３５：２）、ホスファチジルコリン（３６：１）、ホスファチジルコリン（３６：２）、ホスファチジルコリン（３６：３）、ホスファチジルコリン（３８：２）、ホスファチジルコリン（３８：３）、ホスファチジルコリン（３８：５）、ホスファチジルコリン（３８：６）、ホスファチジルコリン（４０：５）、ホスファチジルコリン（４０：６）、ホスファチジルコリン（４０：７）、ホスファチジルコリン（ｐ−３４：０）、ホスファチジルコリン（ｏ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：３）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（３８：４）、Ｂ ホスファチジルエタノールアミン（３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：８）、スフィンゴミエリン（ｄ３０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３３：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３４：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３８：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４２：２），及びＢ スフィンゴミエリン（ｄ４２：３）のうちの６つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  33. 前記集団の細胞由来ベシクルが、
    セラミド（ｄ３２：１）、セラミド（ｄ３３：１）、セラミド（ｄ３４：０）、セラミド（ｄ３４：１）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３６：１）、セラミド（ｄ３８：１）、セラミド（ｄ３９：１）、セラミド（ｄ４０：０）、セラミド（ｄ４０：１）、セラミド（ｄ４０：２）、セラミド（ｄ４１：１）、セラミド（ｄ４２：１）、セラミド（ｄ４２：２）Ｂ、セラミド（ｄ４４：１）、脂肪酸（２０：４）、脂肪酸（２２：０）、脂肪酸（２２：６）、脂肪酸（２４：０）、脂肪酸（２４：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４０：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４１：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：２）、リゾホスファチジルコリン（１６：０）、リゾホスファチジルコリン（１８：０）Ａ、リゾホスファチジルコリン（１８：１）、リゾホスファチジルエタノールアミン（２０：４）、ホスファチジルコリン（３２：１）、ホスファチジルコリン（３３：１）、ホスファチジルコリン（３４：０）、ホスファチジルコリン（３４：１）、ホスファチジルコリン（３４：２）、ホスファチジルコリン（３５：２）、ホスファチジルコリン（３６：１）、ホスファチジルコリン（３６：２）、ホスファチジルコリン（３６：３）、ホスファチジルコリン（３８：２）、ホスファチジルコリン（３８：３）、ホスファチジルコリン（３８：５）、ホスファチジルコリン（３８：６）、ホスファチジルコリン（４０：５）、ホスファチジルコリン（４０：６）、ホスファチジルコリン（４０：７）、ホスファチジルコリン（ｐ−３４：０）、ホスファチジルコリン（ｏ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：３）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（３８：４）、Ｂ ホスファチジルエタノールアミン（３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：８）、スフィンゴミエリン（ｄ３０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３３：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３４：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３８：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４２：２），及びＢ スフィンゴミエリン（ｄ４２：３）のうちの７つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  34. 前記集団の細胞由来ベシクルが、
    セラミド（ｄ３２：１）、セラミド（ｄ３３：１）、セラミド（ｄ３４：０）、セラミド（ｄ３４：１）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３６：１）、セラミド（ｄ３８：１）、セラミド（ｄ３９：１）、セラミド（ｄ４０：０）、セラミド（ｄ４０：１）、セラミド（ｄ４０：２）、セラミド（ｄ４１：１）、セラミド（ｄ４２：１）、セラミド（ｄ４２：２）Ｂ、セラミド（ｄ４４：１）、脂肪酸（２０：４）、脂肪酸（２２：０）、脂肪酸（２２：６）、脂肪酸（２４：０）、脂肪酸（２４：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４０：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４１：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：２）、リゾホスファチジルコリン（１６：０）、リゾホスファチジルコリン（１８：０）Ａ、リゾホスファチジルコリン（１８：１）、リゾホスファチジルエタノールアミン（２０：４）、ホスファチジルコリン（３２：１）、ホスファチジルコリン（３３：１）、ホスファチジルコリン（３４：０）、ホスファチジルコリン（３４：１）、ホスファチジルコリン（３４：２）、ホスファチジルコリン（３５：２）、ホスファチジルコリン（３６：１）、ホスファチジルコリン（３６：２）、ホスファチジルコリン（３６：３）、ホスファチジルコリン（３８：２）、ホスファチジルコリン（３８：３）、ホスファチジルコリン（３８：５）、ホスファチジルコリン（３８：６）、ホスファチジルコリン（４０：５）、ホスファチジルコリン（４０：６）、ホスファチジルコリン（４０：７）、ホスファチジルコリン（ｐ−３４：０）、ホスファチジルコリン（ｏ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：３）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（３８：４）、Ｂ ホスファチジルエタノールアミン（３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：８）、スフィンゴミエリン（ｄ３０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３３：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３４：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３８：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４２：２），及びＢ スフィンゴミエリン（ｄ４２：３）のうちの８つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  35. 前記集団の細胞由来ベシクルが、
    セラミド（ｄ３２：１）、セラミド（ｄ３３：１）、セラミド（ｄ３４：０）、セラミド（ｄ３４：１）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３６：１）、セラミド（ｄ３８：１）、セラミド（ｄ３９：１）、セラミド（ｄ４０：０）、セラミド（ｄ４０：１）、セラミド（ｄ４０：２）、セラミド（ｄ４１：１）、セラミド（ｄ４２：１）、セラミド（ｄ４２：２）Ｂ、セラミド（ｄ４４：１）、脂肪酸（２０：４）、脂肪酸（２２：０）、脂肪酸（２２：６）、脂肪酸（２４：０）、脂肪酸（２４：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４０：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４１：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：２）、リゾホスファチジルコリン（１６：０）、リゾホスファチジルコリン（１８：０）Ａ、リゾホスファチジルコリン（１８：１）、リゾホスファチジルエタノールアミン（２０：４）、ホスファチジルコリン（３２：１）、ホスファチジルコリン（３３：１）、ホスファチジルコリン（３４：０）、ホスファチジルコリン（３４：１）、ホスファチジルコリン（３４：２）、ホスファチジルコリン（３５：２）、ホスファチジルコリン（３６：１）、ホスファチジルコリン（３６：２）、ホスファチジルコリン（３６：３）、ホスファチジルコリン（３８：２）、ホスファチジルコリン（３８：３）、ホスファチジルコリン（３８：５）、ホスファチジルコリン（３８：６）、ホスファチジルコリン（４０：５）、ホスファチジルコリン（４０：６）、ホスファチジルコリン（４０：７）、ホスファチジルコリン（ｐ−３４：０）、ホスファチジルコリン（ｏ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：３）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（３８：４）、Ｂ ホスファチジルエタノールアミン（３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：８）、スフィンゴミエリン（ｄ３０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３３：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３４：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３８：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４２：２），及びＢ スフィンゴミエリン（ｄ４２：３）のうちの９つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  36. 前記集団の細胞由来ベシクルが、
    セラミド（ｄ３２：１）、セラミド（ｄ３３：１）、セラミド（ｄ３４：０）、セラミド（ｄ３４：１）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３６：１）、セラミド（ｄ３８：１）、セラミド（ｄ３９：１）、セラミド（ｄ４０：０）、セラミド（ｄ４０：１）、セラミド（ｄ４０：２）、セラミド（ｄ４１：１）、セラミド（ｄ４２：１）、セラミド（ｄ４２：２）Ｂ、セラミド（ｄ４４：１）、脂肪酸（２０：４）、脂肪酸（２２：０）、脂肪酸（２２：６）、脂肪酸（２４：０）、脂肪酸（２４：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４０：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４１：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：１）、グルコシルセラミドｓ（ｄ４２：２）、リゾホスファチジルコリン（１６：０）、リゾホスファチジルコリン（１８：０）Ａ、リゾホスファチジルコリン（１８：１）、リゾホスファチジルエタノールアミン（２０：４）、ホスファチジルコリン（３２：１）、ホスファチジルコリン（３３：１）、ホスファチジルコリン（３４：０）、ホスファチジルコリン（３４：１）、ホスファチジルコリン（３４：２）、ホスファチジルコリン（３５：２）、ホスファチジルコリン（３６：１）、ホスファチジルコリン（３６：２）、ホスファチジルコリン（３６：３）、ホスファチジルコリン（３８：２）、ホスファチジルコリン（３８：３）、ホスファチジルコリン（３８：５）、ホスファチジルコリン（３８：６）、ホスファチジルコリン（４０：５）、ホスファチジルコリン（４０：６）、ホスファチジルコリン（４０：７）、ホスファチジルコリン（ｐ−３４：０）、ホスファチジルコリン（ｏ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：３）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（３８：４）、Ｂ ホスファチジルエタノールアミン（３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：８）、スフィンゴミエリン（ｄ３０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３３：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３４：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３８：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４２：２），及びＢ スフィンゴミエリン（ｄ４２：３）のうちの１０個以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  37. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＣＤ９、ＨＳＰＡ８、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＡＮＸＡ２、ＣＤ６３、ＳＤＣＢＰ、ＥＮＯ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＴＳＧ１０１、ＰＫＭ、ＬＤＨＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＹＷＨＡＺ、ＰＧＫ１、ＥＥＦ２、ＡＬＤＯＡ、ＡＮＸＡ５、ＦＡＳＮ、ＹＷＨＡＥ、ＣＬＴＣ、ＣＤ８１、ＡＬＢ、ＶＣＰ、ＴＰＩ１、ＰＰＩＡ、ＭＳＮ、ＣＦＬ１、ＰＲＤＸ１、ＰＦＮ１、ＲＡＰ１Ｂ、ＩＴＧＢ１、ＨＳＰＡ５、ＳＬＣ３Ａ２、ＧＮＢ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＷＨＡＱ、ＦＬＯＴ１、ＦＬＮＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＤＣ４２、ＣＣＴ２、Ａ２Ｍ、ＹＷＨＡＧ、ＲＡＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＮＡＩ２、ＡＮＸＡ１、ＲＨＯＡ、ＭＦＧＥ８、ＰＲＤＸ２、ＧＤＩ２、ＥＨＤ４、ＡＣＴＮ４、ＹＷＨＡＢ、ＲＡＢ７Ａ、ＬＤＨＢ、ＧＮＡＳ、ＴＦＲＣ、ＲＡＢ５Ｃ、ＡＮＸＡ６、ＡＮＸＡ１１、ＫＰＮＢ１、ＥＺＲ、ＡＮＸＡ４、ＡＣＬＹ、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＲＡＢ１４、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ、ＧＮＢ１、ＵＢＡ１、ＴＨＢＳ１、ＲＡＮ、ＲＡＢ５Ａ、ＰＴＧＦＲＮ、ＣＣＴ５、ＣＣＴ３、ＢＳＧ、ＲＡＢ５Ｂ、ＲＡＢ１Ａ、ＬＡＭＰ２、ＩＴＧＡ６、ＧＳＮ、ＦＮ１、ＹＷＨＡＨ、ＴＫＴ、ＴＣＰ１、ＳＴＯＭ、ＳＬＣ１６Ａ１、及びＲＡＢ８Ａタンパク質のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  38. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＣＤ９、ＨＳＰＡ８、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＡＮＸＡ２、ＣＤ６３、ＳＤＣＢＰ、ＥＮＯ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＴＳＧ１０１、ＰＫＭ、ＬＤＨＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＹＷＨＡＺ、ＰＧＫ１、ＥＥＦ２、ＡＬＤＯＡ、ＡＮＸＡ５、ＦＡＳＮ、ＹＷＨＡＥ、ＣＬＴＣ、ＣＤ８１、ＡＬＢ、ＶＣＰ、ＴＰＩ１、ＰＰＩＡ、ＭＳＮ、ＣＦＬ１、ＰＲＤＸ１、ＰＦＮ１、ＲＡＰ１Ｂ、ＩＴＧＢ１、ＨＳＰＡ５、ＳＬＣ３Ａ２、ＧＮＢ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＷＨＡＱ、ＦＬＯＴ１、ＦＬＮＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＤＣ４２、ＣＣＴ２、Ａ２Ｍ、ＹＷＨＡＧ、ＲＡＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＮＡＩ２、ＡＮＸＡ１、ＲＨＯＡ、ＭＦＧＥ８、ＰＲＤＸ２、ＧＤＩ２、ＥＨＤ４、ＡＣＴＮ４、ＹＷＨＡＢ、ＲＡＢ７Ａ、ＬＤＨＢ、ＧＮＡＳ、ＴＦＲＣ、ＲＡＢ５Ｃ、ＡＮＸＡ６、ＡＮＸＡ１１、ＫＰＮＢ１、ＥＺＲ、ＡＮＸＡ４、ＡＣＬＹ、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＲＡＢ１４、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ、ＧＮＢ１、ＵＢＡ１、ＴＨＢＳ１、ＲＡＮ、ＲＡＢ５Ａ、ＰＴＧＦＲＮ、ＣＣＴ５、ＣＣＴ３、ＢＳＧ、ＲＡＢ５Ｂ、ＲＡＢ１Ａ、ＬＡＭＰ２、ＩＴＧＡ６、ＧＳＮ、ＦＮ１、ＹＷＨＡＨ、ＴＫＴ、ＴＣＰ１、ＳＴＯＭ、ＳＬＣ１６Ａ１、及びＲＡＢ８Ａタンパク質のうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  39. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＣＤ９、ＨＳＰＡ８、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＡＮＸＡ２、ＣＤ６３、ＳＤＣＢＰ、ＥＮＯ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＴＳＧ１０１、ＰＫＭ、ＬＤＨＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＹＷＨＡＺ、ＰＧＫ１、ＥＥＦ２、ＡＬＤＯＡ、ＡＮＸＡ５、ＦＡＳＮ、ＹＷＨＡＥ、ＣＬＴＣ、ＣＤ８１、ＡＬＢ、ＶＣＰ、ＴＰＩ１、ＰＰＩＡ、ＭＳＮ、ＣＦＬ１、ＰＲＤＸ１、ＰＦＮ１、ＲＡＰ１Ｂ、ＩＴＧＢ１、ＨＳＰＡ５、ＳＬＣ３Ａ２、ＧＮＢ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＷＨＡＱ、ＦＬＯＴ１、ＦＬＮＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＤＣ４２、ＣＣＴ２、Ａ２Ｍ、ＹＷＨＡＧ、ＲＡＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＮＡＩ２、ＡＮＸＡ１、ＲＨＯＡ、ＭＦＧＥ８、ＰＲＤＸ２、ＧＤＩ２、ＥＨＤ４、ＡＣＴＮ４、ＹＷＨＡＢ、ＲＡＢ７Ａ、ＬＤＨＢ、ＧＮＡＳ、ＴＦＲＣ、ＲＡＢ５Ｃ、ＡＮＸＡ６、ＡＮＸＡ１１、ＫＰＮＢ１、ＥＺＲ、ＡＮＸＡ４、ＡＣＬＹ、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＲＡＢ１４、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ、ＧＮＢ１、ＵＢＡ１、ＴＨＢＳ１、ＲＡＮ、ＲＡＢ５Ａ、ＰＴＧＦＲＮ、ＣＣＴ５、ＣＣＴ３、ＢＳＧ、ＲＡＢ５Ｂ、ＲＡＢ１Ａ、ＬＡＭＰ２、ＩＴＧＡ６、ＧＳＮ、ＦＮ１、ＹＷＨＡＨ、ＴＫＴ、ＴＣＰ１、ＳＴＯＭ、ＳＬＣ１６Ａ１、及びＲＡＢ８Ａタンパク質のうちの３つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  40. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＣＤ９、ＨＳＰＡ８、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＡＮＸＡ２、ＣＤ６３、ＳＤＣＢＰ、ＥＮＯ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＴＳＧ１０１、ＰＫＭ、ＬＤＨＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＹＷＨＡＺ、ＰＧＫ１、ＥＥＦ２、ＡＬＤＯＡ、ＡＮＸＡ５、ＦＡＳＮ、ＹＷＨＡＥ、ＣＬＴＣ、ＣＤ８１、ＡＬＢ、ＶＣＰ、ＴＰＩ１、ＰＰＩＡ、ＭＳＮ、ＣＦＬ１、ＰＲＤＸ１、ＰＦＮ１、ＲＡＰ１Ｂ、ＩＴＧＢ１、ＨＳＰＡ５、ＳＬＣ３Ａ２、ＧＮＢ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＷＨＡＱ、ＦＬＯＴ１、ＦＬＮＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＤＣ４２、ＣＣＴ２、Ａ２Ｍ、ＹＷＨＡＧ、ＲＡＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＮＡＩ２、ＡＮＸＡ１、ＲＨＯＡ、ＭＦＧＥ８、ＰＲＤＸ２、ＧＤＩ２、ＥＨＤ４、ＡＣＴＮ４、ＹＷＨＡＢ、ＲＡＢ７Ａ、ＬＤＨＢ、ＧＮＡＳ、ＴＦＲＣ、ＲＡＢ５Ｃ、ＡＮＸＡ６、ＡＮＸＡ１１、ＫＰＮＢ１、ＥＺＲ、ＡＮＸＡ４、ＡＣＬＹ、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＲＡＢ１４、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ、ＧＮＢ１、ＵＢＡ１、ＴＨＢＳ１、ＲＡＮ、ＲＡＢ５Ａ、ＰＴＧＦＲＮ、ＣＣＴ５、ＣＣＴ３、ＢＳＧ、ＲＡＢ５Ｂ、ＲＡＢ１Ａ、ＬＡＭＰ２、ＩＴＧＡ６、ＧＳＮ、ＦＮ１、ＹＷＨＡＨ、ＴＫＴ、ＴＣＰ１、ＳＴＯＭ、ＳＬＣ１６Ａ１、及びＲＡＢ８Ａタンパク質のうちの４つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  41. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＣＤ９、ＨＳＰＡ８、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＡＮＸＡ２、ＣＤ６３、ＳＤＣＢＰ、ＥＮＯ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＴＳＧ１０１、ＰＫＭ、ＬＤＨＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＹＷＨＡＺ、ＰＧＫ１、ＥＥＦ２、ＡＬＤＯＡ、ＡＮＸＡ５、ＦＡＳＮ、ＹＷＨＡＥ、ＣＬＴＣ、ＣＤ８１、ＡＬＢ、ＶＣＰ、ＴＰＩ１、ＰＰＩＡ、ＭＳＮ、ＣＦＬ１、ＰＲＤＸ１、ＰＦＮ１、ＲＡＰ１Ｂ、ＩＴＧＢ１、ＨＳＰＡ５、ＳＬＣ３Ａ２、ＧＮＢ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＷＨＡＱ、ＦＬＯＴ１、ＦＬＮＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＤＣ４２、ＣＣＴ２、Ａ２Ｍ、ＹＷＨＡＧ、ＲＡＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＮＡＩ２、ＡＮＸＡ１、ＲＨＯＡ、ＭＦＧＥ８、ＰＲＤＸ２、ＧＤＩ２、ＥＨＤ４、ＡＣＴＮ４、ＹＷＨＡＢ、ＲＡＢ７Ａ、ＬＤＨＢ、ＧＮＡＳ、ＴＦＲＣ、ＲＡＢ５Ｃ、ＡＮＸＡ６、ＡＮＸＡ１１、ＫＰＮＢ１、ＥＺＲ、ＡＮＸＡ４、ＡＣＬＹ、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＲＡＢ１４、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ、ＧＮＢ１、ＵＢＡ１、ＴＨＢＳ１、ＲＡＮ、ＲＡＢ５Ａ、ＰＴＧＦＲＮ、ＣＣＴ５、ＣＣＴ３、ＢＳＧ、ＲＡＢ５Ｂ、ＲＡＢ１Ａ、ＬＡＭＰ２、ＩＴＧＡ６、ＧＳＮ、ＦＮ１、ＹＷＨＡＨ、ＴＫＴ、ＴＣＰ１、ＳＴＯＭ、ＳＬＣ１６Ａ１、及びＲＡＢ８Ａタンパク質のうちの５つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  42. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＣＤ９、ＨＳＰＡ８、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＡＮＸＡ２、ＣＤ６３、ＳＤＣＢＰ、ＥＮＯ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＴＳＧ１０１、ＰＫＭ、ＬＤＨＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＹＷＨＡＺ、ＰＧＫ１、ＥＥＦ２、ＡＬＤＯＡ、ＡＮＸＡ５、ＦＡＳＮ、ＹＷＨＡＥ、ＣＬＴＣ、ＣＤ８１、ＡＬＢ、ＶＣＰ、ＴＰＩ１、ＰＰＩＡ、ＭＳＮ、ＣＦＬ１、ＰＲＤＸ１、ＰＦＮ１、ＲＡＰ１Ｂ、ＩＴＧＢ１、ＨＳＰＡ５、ＳＬＣ３Ａ２、ＧＮＢ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＷＨＡＱ、ＦＬＯＴ１、ＦＬＮＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＤＣ４２、ＣＣＴ２、Ａ２Ｍ、ＹＷＨＡＧ、ＲＡＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＮＡＩ２、ＡＮＸＡ１、ＲＨＯＡ、ＭＦＧＥ８、ＰＲＤＸ２、ＧＤＩ２、ＥＨＤ４、ＡＣＴＮ４、ＹＷＨＡＢ、ＲＡＢ７Ａ、ＬＤＨＢ、ＧＮＡＳ、ＴＦＲＣ、ＲＡＢ５Ｃ、ＡＮＸＡ６、ＡＮＸＡ１１、ＫＰＮＢ１、ＥＺＲ、ＡＮＸＡ４、ＡＣＬＹ、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＲＡＢ１４、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ、ＧＮＢ１、ＵＢＡ１、ＴＨＢＳ１、ＲＡＮ、ＲＡＢ５Ａ、ＰＴＧＦＲＮ、ＣＣＴ５、ＣＣＴ３、ＢＳＧ、ＲＡＢ５Ｂ、ＲＡＢ１Ａ、ＬＡＭＰ２、ＩＴＧＡ６、ＧＳＮ、ＦＮ１、ＹＷＨＡＨ、ＴＫＴ、ＴＣＰ１、ＳＴＯＭ、ＳＬＣ１６Ａ１、及びＲＡＢ８Ａタンパク質のうちの６つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  43. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＣＤ９、ＨＳＰＡ８、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＡＮＸＡ２、ＣＤ６３、ＳＤＣＢＰ、ＥＮＯ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＴＳＧ１０１、ＰＫＭ、ＬＤＨＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＹＷＨＡＺ、ＰＧＫ１、ＥＥＦ２、ＡＬＤＯＡ、ＡＮＸＡ５、ＦＡＳＮ、ＹＷＨＡＥ、ＣＬＴＣ、ＣＤ８１、ＡＬＢ、ＶＣＰ、ＴＰＩ１、ＰＰＩＡ、ＭＳＮ、ＣＦＬ１、ＰＲＤＸ１、ＰＦＮ１、ＲＡＰ１Ｂ、ＩＴＧＢ１、ＨＳＰＡ５、ＳＬＣ３Ａ２、ＧＮＢ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＷＨＡＱ、ＦＬＯＴ１、ＦＬＮＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＤＣ４２、ＣＣＴ２、Ａ２Ｍ、ＹＷＨＡＧ、ＲＡＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＮＡＩ２、ＡＮＸＡ１、ＲＨＯＡ、ＭＦＧＥ８、ＰＲＤＸ２、ＧＤＩ２、ＥＨＤ４、ＡＣＴＮ４、ＹＷＨＡＢ、ＲＡＢ７Ａ、ＬＤＨＢ、ＧＮＡＳ、ＴＦＲＣ、ＲＡＢ５Ｃ、ＡＮＸＡ６、ＡＮＸＡ１１、ＫＰＮＢ１、ＥＺＲ、ＡＮＸＡ４、ＡＣＬＹ、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＲＡＢ１４、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ、ＧＮＢ１、ＵＢＡ１、ＴＨＢＳ１、ＲＡＮ、ＲＡＢ５Ａ、ＰＴＧＦＲＮ、ＣＣＴ５、ＣＣＴ３、ＢＳＧ、ＲＡＢ５Ｂ、ＲＡＢ１Ａ、ＬＡＭＰ２、ＩＴＧＡ６、ＧＳＮ、ＦＮ１、ＹＷＨＡＨ、ＴＫＴ、ＴＣＰ１、ＳＴＯＭ、ＳＬＣ１６Ａ１、及びＲＡＢ８Ａタンパク質のうちの７つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  44. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＣＤ９、ＨＳＰＡ８、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＡＮＸＡ２、ＣＤ６３、ＳＤＣＢＰ、ＥＮＯ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＴＳＧ１０１、ＰＫＭ、ＬＤＨＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＹＷＨＡＺ、ＰＧＫ１、ＥＥＦ２、ＡＬＤＯＡ、ＡＮＸＡ５、ＦＡＳＮ、ＹＷＨＡＥ、ＣＬＴＣ、ＣＤ８１、ＡＬＢ、ＶＣＰ、ＴＰＩ１、ＰＰＩＡ、ＭＳＮ、ＣＦＬ１、ＰＲＤＸ１、ＰＦＮ１、ＲＡＰ１Ｂ、ＩＴＧＢ１、ＨＳＰＡ５、ＳＬＣ３Ａ２、ＧＮＢ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＷＨＡＱ、ＦＬＯＴ１、ＦＬＮＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＤＣ４２、ＣＣＴ２、Ａ２Ｍ、ＹＷＨＡＧ、ＲＡＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＮＡＩ２、ＡＮＸＡ１、ＲＨＯＡ、ＭＦＧＥ８、ＰＲＤＸ２、ＧＤＩ２、ＥＨＤ４、ＡＣＴＮ４、ＹＷＨＡＢ、ＲＡＢ７Ａ、ＬＤＨＢ、ＧＮＡＳ、ＴＦＲＣ、ＲＡＢ５Ｃ、ＡＮＸＡ６、ＡＮＸＡ１１、ＫＰＮＢ１、ＥＺＲ、ＡＮＸＡ４、ＡＣＬＹ、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＲＡＢ１４、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ、ＧＮＢ１、ＵＢＡ１、ＴＨＢＳ１、ＲＡＮ、ＲＡＢ５Ａ、ＰＴＧＦＲＮ、ＣＣＴ５、ＣＣＴ３、ＢＳＧ、ＲＡＢ５Ｂ、ＲＡＢ１Ａ、ＬＡＭＰ２、ＩＴＧＡ６、ＧＳＮ、ＦＮ１、ＹＷＨＡＨ、ＴＫＴ、ＴＣＰ１、ＳＴＯＭ、ＳＬＣ１６Ａ１、及びＲＡＢ８Ａタンパク質のうちの８つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  45. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＣＤ９、ＨＳＰＡ８、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＡＮＸＡ２、ＣＤ６３、ＳＤＣＢＰ、ＥＮＯ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＴＳＧ１０１、ＰＫＭ、ＬＤＨＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＹＷＨＡＺ、ＰＧＫ１、ＥＥＦ２、ＡＬＤＯＡ、ＡＮＸＡ５、ＦＡＳＮ、ＹＷＨＡＥ、ＣＬＴＣ、ＣＤ８１、ＡＬＢ、ＶＣＰ、ＴＰＩ１、ＰＰＩＡ、ＭＳＮ、ＣＦＬ１、ＰＲＤＸ１、ＰＦＮ１、ＲＡＰ１Ｂ、ＩＴＧＢ１、ＨＳＰＡ５、ＳＬＣ３Ａ２、ＧＮＢ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＷＨＡＱ、ＦＬＯＴ１、ＦＬＮＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＤＣ４２、ＣＣＴ２、Ａ２Ｍ、ＹＷＨＡＧ、ＲＡＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＮＡＩ２、ＡＮＸＡ１、ＲＨＯＡ、ＭＦＧＥ８、ＰＲＤＸ２、ＧＤＩ２、ＥＨＤ４、ＡＣＴＮ４、ＹＷＨＡＢ、ＲＡＢ７Ａ、ＬＤＨＢ、ＧＮＡＳ、ＴＦＲＣ、ＲＡＢ５Ｃ、ＡＮＸＡ６、ＡＮＸＡ１１、ＫＰＮＢ１、ＥＺＲ、ＡＮＸＡ４、ＡＣＬＹ、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＲＡＢ１４、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ、ＧＮＢ１、ＵＢＡ１、ＴＨＢＳ１、ＲＡＮ、ＲＡＢ５Ａ、ＰＴＧＦＲＮ、ＣＣＴ５、ＣＣＴ３、ＢＳＧ、ＲＡＢ５Ｂ、ＲＡＢ１Ａ、ＬＡＭＰ２、ＩＴＧＡ６、ＧＳＮ、ＦＮ１、ＹＷＨＡＨ、ＴＫＴ、ＴＣＰ１、ＳＴＯＭ、ＳＬＣ１６Ａ１、及びＲＡＢ８Ａタンパク質のうちの９つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  46. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＣＤ９、ＨＳＰＡ８、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＡＮＸＡ２、ＣＤ６３、ＳＤＣＢＰ、ＥＮＯ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＴＳＧ１０１、ＰＫＭ、ＬＤＨＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＹＷＨＡＺ、ＰＧＫ１、ＥＥＦ２、ＡＬＤＯＡ、ＡＮＸＡ５、ＦＡＳＮ、ＹＷＨＡＥ、ＣＬＴＣ、ＣＤ８１、ＡＬＢ、ＶＣＰ、ＴＰＩ１、ＰＰＩＡ、ＭＳＮ、ＣＦＬ１、ＰＲＤＸ１、ＰＦＮ１、ＲＡＰ１Ｂ、ＩＴＧＢ１、ＨＳＰＡ５、ＳＬＣ３Ａ２、ＧＮＢ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＷＨＡＱ、ＦＬＯＴ１、ＦＬＮＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＤＣ４２、ＣＣＴ２、Ａ２Ｍ、ＹＷＨＡＧ、ＲＡＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＮＡＩ２、ＡＮＸＡ１、ＲＨＯＡ、ＭＦＧＥ８、ＰＲＤＸ２、ＧＤＩ２、ＥＨＤ４、ＡＣＴＮ４、ＹＷＨＡＢ、ＲＡＢ７Ａ、ＬＤＨＢ、ＧＮＡＳ、ＴＦＲＣ、ＲＡＢ５Ｃ、ＡＮＸＡ６、ＡＮＸＡ１１、ＫＰＮＢ１、ＥＺＲ、ＡＮＸＡ４、ＡＣＬＹ、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＲＡＢ１４、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ、ＧＮＢ１、ＵＢＡ１、ＴＨＢＳ１、ＲＡＮ、ＲＡＢ５Ａ、ＰＴＧＦＲＮ、ＣＣＴ５、ＣＣＴ３、ＢＳＧ、ＲＡＢ５Ｂ、ＲＡＢ１Ａ、ＬＡＭＰ２、ＩＴＧＡ６、ＧＳＮ、ＦＮ１、ＹＷＨＡＨ、ＴＫＴ、ＴＣＰ１、ＳＴＯＭ、ＳＬＣ１６Ａ１、及びＲＡＢ８Ａタンパク質のうちの１０個以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  47. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＦＮ１、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＶＣＡＮ、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＢＦＲ２、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＩＴＧＡ３、ＦＢＮ１、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ５、ＮＯＴＣＨ２、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＮＲＰ１、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＨＳＰＧ２、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＤＡＭ９、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、及びＭＶＰタンパク質のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  48. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＦＮ１、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＶＣＡＮ、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＢＦＲ２、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＩＴＧＡ３、ＦＢＮ１、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ５、ＮＯＴＣＨ２、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＮＲＰ１、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＨＳＰＧ２、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＤＡＭ９、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、及びＭＶＰタンパク質のうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  49. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＦＮ１、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＶＣＡＮ、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＢＦＲ２、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＩＴＧＡ３、ＦＢＮ１、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ５、ＮＯＴＣＨ２、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＮＲＰ１、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＨＳＰＧ２、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＤＡＭ９、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、及びＭＶＰタンパク質のうちの３つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  50. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＦＮ１、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＶＣＡＮ、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＢＦＲ２、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＩＴＧＡ３、ＦＢＮ１、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ５、ＮＯＴＣＨ２、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＮＲＰ１、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＨＳＰＧ２、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＤＡＭ９、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、及びＭＶＰタンパク質のうちの４つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  51. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＦＮ１、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＶＣＡＮ、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＢＦＲ２、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＩＴＧＡ３、ＦＢＮ１、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ５、ＮＯＴＣＨ２、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＮＲＰ１、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＨＳＰＧ２、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＤＡＭ９、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、及びＭＶＰタンパク質のうちの５つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  52. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＦＮ１、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＶＣＡＮ、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＢＦＲ２、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＩＴＧＡ３、ＦＢＮ１、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ５、ＮＯＴＣＨ２、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＮＲＰ１、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＨＳＰＧ２、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＤＡＭ９、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、及びＭＶＰタンパク質のうちの６つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  53. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＦＮ１、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＶＣＡＮ、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＢＦＲ２、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＩＴＧＡ３、ＦＢＮ１、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ５、ＮＯＴＣＨ２、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＮＲＰ１、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＨＳＰＧ２、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＤＡＭ９、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、及びＭＶＰタンパク質のうちの７つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  54. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＦＮ１、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＶＣＡＮ、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＢＦＲ２、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＩＴＧＡ３、ＦＢＮ１、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ５、ＮＯＴＣＨ２、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＮＲＰ１、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＨＳＰＧ２、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＤＡＭ９、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、及びＭＶＰタンパク質のうちの８つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  55. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＦＮ１、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＶＣＡＮ、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＢＦＲ２、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＩＴＧＡ３、ＦＢＮ１、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ５、ＮＯＴＣＨ２、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＮＲＰ１、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＨＳＰＧ２、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＤＡＭ９、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、及びＭＶＰタンパク質のうちの９つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  56. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＦＮ１、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＶＣＡＮ、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＢＦＲ２、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＩＴＧＡ３、ＦＢＮ１、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ５、ＮＯＴＣＨ２、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＮＲＰ１、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＨＳＰＧ２、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＤＡＭ９、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、及びＭＶＰタンパク質のうちの１０個以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  57. 前記集団の細胞由来ベシクルが、血管新生に関連するＦＢＬＮ２、ＴＩＭＰ１、ＮＩＤ１、ＩＧＦＢＰ３、ＬＴＢＰ１、ＤＵＳＰ３、ＩＴＧＡＶ、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲＧ１、ＥＲＢＢ２、ＣＯＬ４Ａ２、ＬＤＬＲ、ＴＳＢ、ＭＭＰ２、ＴＩＭＰ２、ＴＰＩ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＩＮＨＢＡ、ＥＧＦＲ、ＡＰＨ１Ａ、ＮＣＳＴＮ、ＴＧＦＢ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＧＦＢ１、Ｆ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＤＣ４、ＳＤＣ３、ＡＣＡＮ、ＩＦＩ１６、ＭＭＰ１４、ＰＬＡＴ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＮＯＴＣＨ３、ＤＳＰ、ＰＫＰ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＳＲＧＮ、ＮＲＰ２、ＥＰＨＡ２、ＩＴＧＡ５、ＮＲＰ１、ＰＬＡＵ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＣＤ４７、ＳＤＣ１、ＰＳＭＡ７、ＥＮＧ、Ｓ１００Ａ１３、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＤ１０、ＴＧＦＢＩ、ＣＴＧＦ、ＤＣＮ、ＩＴＧＢ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＪＡＧ１、ＴＧＦＢＲ２、ＰＬＡＵＲ、ＰＤＧＦＲＢ、ＦＹＮ、ＴＨＹ１、ＨＳＰＧ２、ＴＥＮＣ１、ＴＧＦＢＲ１、ＰＬＸＮＡ１、ＬＲＰ１、ＳＴＡＴ１、ＣＸＣＬ１２、ＶＣＡＮ、ＭＥＴ、ＦＮ１、ＣＤ３６、ＳＴＡＴ３、ＴＨＢＳ１、ＦＧＦＲ１、ＧＲＢ１４、ＦＧＢ、ＡＰＩ５、ＨＡＰＬＮ１、ＲＥＣＫ、ＬＡＭＣ１、ＣＹＲ６１、ＧＰＣ１、ＩＧＦＢＰ４、ＩＴＧＡ４、ＭＦＡＰ２、ＳＤＣ２、ＥＦＮＢ２、ＦＧＡ、ＰＬＸＮＤ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＮＰＥＰ、ＥＰＨＢ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｄ、ＡＮＴＸＲ２、ＩＧＦＢＰ７、ＣＯＬ６Ａ３、ＬＡＭＢ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭ１０、Ａ２Ｍ、ＥＦＮＢ１、ＩＴＧＡ３、ＣＬＵ、ＫＨＳＲＰ、及びＥＦＥＭＰ１タンパク質のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  58. 前記集団の細胞由来ベシクルが、血管新生に関連するＦＢＬＮ２、ＴＩＭＰ１、ＮＩＤ１、ＩＧＦＢＰ３、ＬＴＢＰ１、ＤＵＳＰ３、ＩＴＧＡＶ、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲＧ１、ＥＲＢＢ２、ＣＯＬ４Ａ２、ＬＤＬＲ、ＴＳＢ、ＭＭＰ２、ＴＩＭＰ２、ＴＰＩ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＩＮＨＢＡ、ＥＧＦＲ、ＡＰＨ１Ａ、ＮＣＳＴＮ、ＴＧＦＢ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＧＦＢ１、Ｆ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＤＣ４、ＳＤＣ３、ＡＣＡＮ、ＩＦＩ１６、ＭＭＰ１４、ＰＬＡＴ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＮＯＴＣＨ３、ＤＳＰ、ＰＫＰ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＳＲＧＮ、ＮＲＰ２、ＥＰＨＡ２、ＩＴＧＡ５、ＮＲＰ１、ＰＬＡＵ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＣＤ４７、ＳＤＣ１、ＰＳＭＡ７、ＥＮＧ、Ｓ１００Ａ１３、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＤ１０、ＴＧＦＢＩ、ＣＴＧＦ、ＤＣＮ、ＩＴＧＢ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＪＡＧ１、ＴＧＦＢＲ２、ＰＬＡＵＲ、ＰＤＧＦＲＢ、ＦＹＮ、ＴＨＹ１、ＨＳＰＧ２、ＴＥＮＣ１、ＴＧＦＢＲ１、ＰＬＸＮＡ１、ＬＲＰ１、ＳＴＡＴ１、ＣＸＣＬ１２、ＶＣＡＮ、ＭＥＴ、ＦＮ１、ＣＤ３６、ＳＴＡＴ３、ＴＨＢＳ１、ＦＧＦＲ１、ＧＲＢ１４、ＦＧＢ、ＡＰＩ５、ＨＡＰＬＮ１、ＲＥＣＫ、ＬＡＭＣ１、ＣＹＲ６１、ＧＰＣ１、ＩＧＦＢＰ４、ＩＴＧＡ４、ＭＦＡＰ２、ＳＤＣ２、ＥＦＮＢ２、ＦＧＡ、ＰＬＸＮＤ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＮＰＥＰ、ＥＰＨＢ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｄ、ＡＮＴＸＲ２、ＩＧＦＢＰ７、ＣＯＬ６Ａ３、ＬＡＭＢ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭ１０、Ａ２Ｍ、ＥＦＮＢ１、ＩＴＧＡ３、ＣＬＵ、ＫＨＳＲＰ、及びＥＦＥＭＰ１タンパク質のうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  59. 前記集団の細胞由来ベシクルが、血管新生に関連するＦＢＬＮ２、ＴＩＭＰ１、ＮＩＤ１、ＩＧＦＢＰ３、ＬＴＢＰ１、ＤＵＳＰ３、ＩＴＧＡＶ、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲＧ１、ＥＲＢＢ２、ＣＯＬ４Ａ２、ＬＤＬＲ、ＴＳＢ、ＭＭＰ２、ＴＩＭＰ２、ＴＰＩ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＩＮＨＢＡ、ＥＧＦＲ、ＡＰＨ１Ａ、ＮＣＳＴＮ、ＴＧＦＢ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＧＦＢ１、Ｆ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＤＣ４、ＳＤＣ３、ＡＣＡＮ、ＩＦＩ１６、ＭＭＰ１４、ＰＬＡＴ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＮＯＴＣＨ３、ＤＳＰ、ＰＫＰ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＳＲＧＮ、ＮＲＰ２、ＥＰＨＡ２、ＩＴＧＡ５、ＮＲＰ１、ＰＬＡＵ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＣＤ４７、ＳＤＣ１、ＰＳＭＡ７、ＥＮＧ、Ｓ１００Ａ１３、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＤ１０、ＴＧＦＢＩ、ＣＴＧＦ、ＤＣＮ、ＩＴＧＢ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＪＡＧ１、ＴＧＦＢＲ２、ＰＬＡＵＲ、ＰＤＧＦＲＢ、ＦＹＮ、ＴＨＹ１、ＨＳＰＧ２、ＴＥＮＣ１、ＴＧＦＢＲ１、ＰＬＸＮＡ１、ＬＲＰ１、ＳＴＡＴ１、ＣＸＣＬ１２、ＶＣＡＮ、ＭＥＴ、ＦＮ１、ＣＤ３６、ＳＴＡＴ３、ＴＨＢＳ１、ＦＧＦＲ１、ＧＲＢ１４、ＦＧＢ、ＡＰＩ５、ＨＡＰＬＮ１、ＲＥＣＫ、ＬＡＭＣ１、ＣＹＲ６１、ＧＰＣ１、ＩＧＦＢＰ４、ＩＴＧＡ４、ＭＦＡＰ２、ＳＤＣ２、ＥＦＮＢ２、ＦＧＡ、ＰＬＸＮＤ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＮＰＥＰ、ＥＰＨＢ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｄ、ＡＮＴＸＲ２、ＩＧＦＢＰ７、ＣＯＬ６Ａ３、ＬＡＭＢ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭ１０、Ａ２Ｍ、ＥＦＮＢ１、ＩＴＧＡ３、ＣＬＵ、ＫＨＳＲＰ、及びＥＦＥＭＰ１タンパク質のうちの３つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  60. 前記集団の細胞由来ベシクルが、血管新生に関連するＦＢＬＮ２、ＴＩＭＰ１、ＮＩＤ１、ＩＧＦＢＰ３、ＬＴＢＰ１、ＤＵＳＰ３、ＩＴＧＡＶ、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲＧ１、ＥＲＢＢ２、ＣＯＬ４Ａ２、ＬＤＬＲ、ＴＳＢ、ＭＭＰ２、ＴＩＭＰ２、ＴＰＩ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＩＮＨＢＡ、ＥＧＦＲ、ＡＰＨ１Ａ、ＮＣＳＴＮ、ＴＧＦＢ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＧＦＢ１、Ｆ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＤＣ４、ＳＤＣ３、ＡＣＡＮ、ＩＦＩ１６、ＭＭＰ１４、ＰＬＡＴ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＮＯＴＣＨ３、ＤＳＰ、ＰＫＰ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＳＲＧＮ、ＮＲＰ２、ＥＰＨＡ２、ＩＴＧＡ５、ＮＲＰ１、ＰＬＡＵ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＣＤ４７、ＳＤＣ１、ＰＳＭＡ７、ＥＮＧ、Ｓ１００Ａ１３、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＤ１０、ＴＧＦＢＩ、ＣＴＧＦ、ＤＣＮ、ＩＴＧＢ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＪＡＧ１、ＴＧＦＢＲ２、ＰＬＡＵＲ、ＰＤＧＦＲＢ、ＦＹＮ、ＴＨＹ１、ＨＳＰＧ２、ＴＥＮＣ１、ＴＧＦＢＲ１、ＰＬＸＮＡ１、ＬＲＰ１、ＳＴＡＴ１、ＣＸＣＬ１２、ＶＣＡＮ、ＭＥＴ、ＦＮ１、ＣＤ３６、ＳＴＡＴ３、ＴＨＢＳ１、ＦＧＦＲ１、ＧＲＢ１４、ＦＧＢ、ＡＰＩ５、ＨＡＰＬＮ１、ＲＥＣＫ、ＬＡＭＣ１、ＣＹＲ６１、ＧＰＣ１、ＩＧＦＢＰ４、ＩＴＧＡ４、ＭＦＡＰ２、ＳＤＣ２、ＥＦＮＢ２、ＦＧＡ、ＰＬＸＮＤ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＮＰＥＰ、ＥＰＨＢ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｄ、ＡＮＴＸＲ２、ＩＧＦＢＰ７、ＣＯＬ６Ａ３、ＬＡＭＢ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭ１０、Ａ２Ｍ、ＥＦＮＢ１、ＩＴＧＡ３、ＣＬＵ、ＫＨＳＲＰ、及びＥＦＥＭＰ１タンパク質のうちの４つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  61. 前記集団の細胞由来ベシクルが、血管新生に関連するＦＢＬＮ２、ＴＩＭＰ１、ＮＩＤ１、ＩＧＦＢＰ３、ＬＴＢＰ１、ＤＵＳＰ３、ＩＴＧＡＶ、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲＧ１、ＥＲＢＢ２、ＣＯＬ４Ａ２、ＬＤＬＲ、ＴＳＢ、ＭＭＰ２、ＴＩＭＰ２、ＴＰＩ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＩＮＨＢＡ、ＥＧＦＲ、ＡＰＨ１Ａ、ＮＣＳＴＮ、ＴＧＦＢ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＧＦＢ１、Ｆ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＤＣ４、ＳＤＣ３、ＡＣＡＮ、ＩＦＩ１６、ＭＭＰ１４、ＰＬＡＴ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＮＯＴＣＨ３、ＤＳＰ、ＰＫＰ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＳＲＧＮ、ＮＲＰ２、ＥＰＨＡ２、ＩＴＧＡ５、ＮＲＰ１、ＰＬＡＵ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＣＤ４７、ＳＤＣ１、ＰＳＭＡ７、ＥＮＧ、Ｓ１００Ａ１３、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＤ１０、ＴＧＦＢＩ、ＣＴＧＦ、ＤＣＮ、ＩＴＧＢ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＪＡＧ１、ＴＧＦＢＲ２、ＰＬＡＵＲ、ＰＤＧＦＲＢ、ＦＹＮ、ＴＨＹ１、ＨＳＰＧ２、ＴＥＮＣ１、ＴＧＦＢＲ１、ＰＬＸＮＡ１、ＬＲＰ１、ＳＴＡＴ１、ＣＸＣＬ１２、ＶＣＡＮ、ＭＥＴ、ＦＮ１、ＣＤ３６、ＳＴＡＴ３、ＴＨＢＳ１、ＦＧＦＲ１、ＧＲＢ１４、ＦＧＢ、ＡＰＩ５、ＨＡＰＬＮ１、ＲＥＣＫ、ＬＡＭＣ１、ＣＹＲ６１、ＧＰＣ１、ＩＧＦＢＰ４、ＩＴＧＡ４、ＭＦＡＰ２、ＳＤＣ２、ＥＦＮＢ２、ＦＧＡ、ＰＬＸＮＤ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＮＰＥＰ、ＥＰＨＢ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｄ、ＡＮＴＸＲ２、ＩＧＦＢＰ７、ＣＯＬ６Ａ３、ＬＡＭＢ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭ１０、Ａ２Ｍ、ＥＦＮＢ１、ＩＴＧＡ３、ＣＬＵ、ＫＨＳＲＰ、及びＥＦＥＭＰ１タンパク質のうちの５つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  62. 前記集団の細胞由来ベシクルが、血管新生に関連するＦＢＬＮ２、ＴＩＭＰ１、ＮＩＤ１、ＩＧＦＢＰ３、ＬＴＢＰ１、ＤＵＳＰ３、ＩＴＧＡＶ、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲＧ１、ＥＲＢＢ２、ＣＯＬ４Ａ２、ＬＤＬＲ、ＴＳＢ、ＭＭＰ２、ＴＩＭＰ２、ＴＰＩ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＩＮＨＢＡ、ＥＧＦＲ、ＡＰＨ１Ａ、ＮＣＳＴＮ、ＴＧＦＢ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＧＦＢ１、Ｆ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＤＣ４、ＳＤＣ３、ＡＣＡＮ、ＩＦＩ１６、ＭＭＰ１４、ＰＬＡＴ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＮＯＴＣＨ３、ＤＳＰ、ＰＫＰ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＳＲＧＮ、ＮＲＰ２、ＥＰＨＡ２、ＩＴＧＡ５、ＮＲＰ１、ＰＬＡＵ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＣＤ４７、ＳＤＣ１、ＰＳＭＡ７、ＥＮＧ、Ｓ１００Ａ１３、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＤ１０、ＴＧＦＢＩ、ＣＴＧＦ、ＤＣＮ、ＩＴＧＢ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＪＡＧ１、ＴＧＦＢＲ２、ＰＬＡＵＲ、ＰＤＧＦＲＢ、ＦＹＮ、ＴＨＹ１、ＨＳＰＧ２、ＴＥＮＣ１、ＴＧＦＢＲ１、ＰＬＸＮＡ１、ＬＲＰ１、ＳＴＡＴ１、ＣＸＣＬ１２、ＶＣＡＮ、ＭＥＴ、ＦＮ１、ＣＤ３６、ＳＴＡＴ３、ＴＨＢＳ１、ＦＧＦＲ１、ＧＲＢ１４、ＦＧＢ、ＡＰＩ５、ＨＡＰＬＮ１、ＲＥＣＫ、ＬＡＭＣ１、ＣＹＲ６１、ＧＰＣ１、ＩＧＦＢＰ４、ＩＴＧＡ４、ＭＦＡＰ２、ＳＤＣ２、ＥＦＮＢ２、ＦＧＡ、ＰＬＸＮＤ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＮＰＥＰ、ＥＰＨＢ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｄ、ＡＮＴＸＲ２、ＩＧＦＢＰ７、ＣＯＬ６Ａ３、ＬＡＭＢ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭ１０、Ａ２Ｍ、ＥＦＮＢ１、ＩＴＧＡ３、ＣＬＵ、ＫＨＳＲＰ、及びＥＦＥＭＰ１タンパク質のうちの６つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  63. 前記集団の細胞由来ベシクルが、血管新生に関連するＦＢＬＮ２、ＴＩＭＰ１、ＮＩＤ１、ＩＧＦＢＰ３、ＬＴＢＰ１、ＤＵＳＰ３、ＩＴＧＡＶ、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲＧ１、ＥＲＢＢ２、ＣＯＬ４Ａ２、ＬＤＬＲ、ＴＳＢ、ＭＭＰ２、ＴＩＭＰ２、ＴＰＩ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＩＮＨＢＡ、ＥＧＦＲ、ＡＰＨ１Ａ、ＮＣＳＴＮ、ＴＧＦＢ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＧＦＢ１、Ｆ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＤＣ４、ＳＤＣ３、ＡＣＡＮ、ＩＦＩ１６、ＭＭＰ１４、ＰＬＡＴ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＮＯＴＣＨ３、ＤＳＰ、ＰＫＰ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＳＲＧＮ、ＮＲＰ２、ＥＰＨＡ２、ＩＴＧＡ５、ＮＲＰ１、ＰＬＡＵ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＣＤ４７、ＳＤＣ１、ＰＳＭＡ７、ＥＮＧ、Ｓ１００Ａ１３、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＤ１０、ＴＧＦＢＩ、ＣＴＧＦ、ＤＣＮ、ＩＴＧＢ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＪＡＧ１、ＴＧＦＢＲ２、ＰＬＡＵＲ、ＰＤＧＦＲＢ、ＦＹＮ、ＴＨＹ１、ＨＳＰＧ２、ＴＥＮＣ１、ＴＧＦＢＲ１、ＰＬＸＮＡ１、ＬＲＰ１、ＳＴＡＴ１、ＣＸＣＬ１２、ＶＣＡＮ、ＭＥＴ、ＦＮ１、ＣＤ３６、ＳＴＡＴ３、ＴＨＢＳ１、ＦＧＦＲ１、ＧＲＢ１４、ＦＧＢ、ＡＰＩ５、ＨＡＰＬＮ１、ＲＥＣＫ、ＬＡＭＣ１、ＣＹＲ６１、ＧＰＣ１、ＩＧＦＢＰ４、ＩＴＧＡ４、ＭＦＡＰ２、ＳＤＣ２、ＥＦＮＢ２、ＦＧＡ、ＰＬＸＮＤ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＮＰＥＰ、ＥＰＨＢ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｄ、ＡＮＴＸＲ２、ＩＧＦＢＰ７、ＣＯＬ６Ａ３、ＬＡＭＢ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭ１０、Ａ２Ｍ、ＥＦＮＢ１、ＩＴＧＡ３、ＣＬＵ、ＫＨＳＲＰ、及びＥＦＥＭＰ１タンパク質のうちの７つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  64. 前記集団の細胞由来ベシクルが、血管新生に関連するＦＢＬＮ２、ＴＩＭＰ１、ＮＩＤ１、ＩＧＦＢＰ３、ＬＴＢＰ１、ＤＵＳＰ３、ＩＴＧＡＶ、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲＧ１、ＥＲＢＢ２、ＣＯＬ４Ａ２、ＬＤＬＲ、ＴＳＢ、ＭＭＰ２、ＴＩＭＰ２、ＴＰＩ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＩＮＨＢＡ、ＥＧＦＲ、ＡＰＨ１Ａ、ＮＣＳＴＮ、ＴＧＦＢ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＧＦＢ１、Ｆ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＤＣ４、ＳＤＣ３、ＡＣＡＮ、ＩＦＩ１６、ＭＭＰ１４、ＰＬＡＴ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＮＯＴＣＨ３、ＤＳＰ、ＰＫＰ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＳＲＧＮ、ＮＲＰ２、ＥＰＨＡ２、ＩＴＧＡ５、ＮＲＰ１、ＰＬＡＵ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＣＤ４７、ＳＤＣ１、ＰＳＭＡ７、ＥＮＧ、Ｓ１００Ａ１３、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＤ１０、ＴＧＦＢＩ、ＣＴＧＦ、ＤＣＮ、ＩＴＧＢ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＪＡＧ１、ＴＧＦＢＲ２、ＰＬＡＵＲ、ＰＤＧＦＲＢ、ＦＹＮ、ＴＨＹ１、ＨＳＰＧ２、ＴＥＮＣ１、ＴＧＦＢＲ１、ＰＬＸＮＡ１、ＬＲＰ１、ＳＴＡＴ１、ＣＸＣＬ１２、ＶＣＡＮ、ＭＥＴ、ＦＮ１、ＣＤ３６、ＳＴＡＴ３、ＴＨＢＳ１、ＦＧＦＲ１、ＧＲＢ１４、ＦＧＢ、ＡＰＩ５、ＨＡＰＬＮ１、ＲＥＣＫ、ＬＡＭＣ１、ＣＹＲ６１、ＧＰＣ１、ＩＧＦＢＰ４、ＩＴＧＡ４、ＭＦＡＰ２、ＳＤＣ２、ＥＦＮＢ２、ＦＧＡ、ＰＬＸＮＤ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＮＰＥＰ、ＥＰＨＢ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｄ、ＡＮＴＸＲ２、ＩＧＦＢＰ７、ＣＯＬ６Ａ３、ＬＡＭＢ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭ１０、Ａ２Ｍ、ＥＦＮＢ１、ＩＴＧＡ３、ＣＬＵ、ＫＨＳＲＰ、及びＥＦＥＭＰ１タンパク質のうちの８つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  65. 前記集団の細胞由来ベシクルが、血管新生に関連するＦＢＬＮ２、ＴＩＭＰ１、ＮＩＤ１、ＩＧＦＢＰ３、ＬＴＢＰ１、ＤＵＳＰ３、ＩＴＧＡＶ、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲＧ１、ＥＲＢＢ２、ＣＯＬ４Ａ２、ＬＤＬＲ、ＴＳＢ、ＭＭＰ２、ＴＩＭＰ２、ＴＰＩ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＩＮＨＢＡ、ＥＧＦＲ、ＡＰＨ１Ａ、ＮＣＳＴＮ、ＴＧＦＢ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＧＦＢ１、Ｆ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＤＣ４、ＳＤＣ３、ＡＣＡＮ、ＩＦＩ１６、ＭＭＰ１４、ＰＬＡＴ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＮＯＴＣＨ３、ＤＳＰ、ＰＫＰ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＳＲＧＮ、ＮＲＰ２、ＥＰＨＡ２、ＩＴＧＡ５、ＮＲＰ１、ＰＬＡＵ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＣＤ４７、ＳＤＣ１、ＰＳＭＡ７、ＥＮＧ、Ｓ１００Ａ１３、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＤ１０、ＴＧＦＢＩ、ＣＴＧＦ、ＤＣＮ、ＩＴＧＢ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＪＡＧ１、ＴＧＦＢＲ２、ＰＬＡＵＲ、ＰＤＧＦＲＢ、ＦＹＮ、ＴＨＹ１、ＨＳＰＧ２、ＴＥＮＣ１、ＴＧＦＢＲ１、ＰＬＸＮＡ１、ＬＲＰ１、ＳＴＡＴ１、ＣＸＣＬ１２、ＶＣＡＮ、ＭＥＴ、ＦＮ１、ＣＤ３６、ＳＴＡＴ３、ＴＨＢＳ１、ＦＧＦＲ１、ＧＲＢ１４、ＦＧＢ、ＡＰＩ５、ＨＡＰＬＮ１、ＲＥＣＫ、ＬＡＭＣ１、ＣＹＲ６１、ＧＰＣ１、ＩＧＦＢＰ４、ＩＴＧＡ４、ＭＦＡＰ２、ＳＤＣ２、ＥＦＮＢ２、ＦＧＡ、ＰＬＸＮＤ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＮＰＥＰ、ＥＰＨＢ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｄ、ＡＮＴＸＲ２、ＩＧＦＢＰ７、ＣＯＬ６Ａ３、ＬＡＭＢ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭ１０、Ａ２Ｍ、ＥＦＮＢ１、ＩＴＧＡ３、ＣＬＵ、ＫＨＳＲＰ、及びＥＦＥＭＰ１タンパク質のうちの９つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  66. 前記集団の細胞由来ベシクルが、血管新生に関連するＦＢＬＮ２、ＴＩＭＰ１、ＮＩＤ１、ＩＧＦＢＰ３、ＬＴＢＰ１、ＤＵＳＰ３、ＩＴＧＡＶ、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲＧ１、ＥＲＢＢ２、ＣＯＬ４Ａ２、ＬＤＬＲ、ＴＳＢ、ＭＭＰ２、ＴＩＭＰ２、ＴＰＩ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＩＮＨＢＡ、ＥＧＦＲ、ＡＰＨ１Ａ、ＮＣＳＴＮ、ＴＧＦＢ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＧＦＢ１、Ｆ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＤＣ４、ＳＤＣ３、ＡＣＡＮ、ＩＦＩ１６、ＭＭＰ１４、ＰＬＡＴ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＮＯＴＣＨ３、ＤＳＰ、ＰＫＰ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＳＲＧＮ、ＮＲＰ２、ＥＰＨＡ２、ＩＴＧＡ５、ＮＲＰ１、ＰＬＡＵ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＣＤ４７、ＳＤＣ１、ＰＳＭＡ７、ＥＮＧ、Ｓ１００Ａ１３、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＤ１０、ＴＧＦＢＩ、ＣＴＧＦ、ＤＣＮ、ＩＴＧＢ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＪＡＧ１、ＴＧＦＢＲ２、ＰＬＡＵＲ、ＰＤＧＦＲＢ、ＦＹＮ、ＴＨＹ１、ＨＳＰＧ２、ＴＥＮＣ１、ＴＧＦＢＲ１、ＰＬＸＮＡ１、ＬＲＰ１、ＳＴＡＴ１、ＣＸＣＬ１２、ＶＣＡＮ、ＭＥＴ、ＦＮ１、ＣＤ３６、ＳＴＡＴ３、ＴＨＢＳ１、ＦＧＦＲ１、ＧＲＢ１４、ＦＧＢ、ＡＰＩ５、ＨＡＰＬＮ１、ＲＥＣＫ、ＬＡＭＣ１、ＣＹＲ６１、ＧＰＣ１、ＩＧＦＢＰ４、ＩＴＧＡ４、ＭＦＡＰ２、ＳＤＣ２、ＥＦＮＢ２、ＦＧＡ、ＰＬＸＮＤ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＮＰＥＰ、ＥＰＨＢ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｄ、ＡＮＴＸＲ２、ＩＧＦＢＰ７、ＣＯＬ６Ａ３、ＬＡＭＢ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭ１０、Ａ２Ｍ、ＥＦＮＢ１、ＩＴＧＡ３、ＣＬＵ、ＫＨＳＲＰ、及びＥＦＥＭＰ１タンパク質のうちの１０個以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  67. 前記集団の細胞由来ベシクルが、免疫調節に関連する、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＲＧ１、ＣＤ２７４、ＥＩＦ２Ａ、ＥＰＨＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＩＲＡＫ１、ＬＧＡＬＳ１、ＰＳＭＥ４、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３タンパク質のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  68. 前記集団の細胞由来ベシクルが、免疫調節に関連する、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＲＧ１、ＣＤ２７４、ＥＩＦ２Ａ、ＥＰＨＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＩＲＡＫ１、ＬＧＡＬＳ１、ＰＳＭＥ４、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３タンパク質のうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  69. 前記集団の細胞由来ベシクルが、免疫調節に関連する、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＲＧ１、ＣＤ２７４、ＥＩＦ２Ａ、ＥＰＨＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＩＲＡＫ１、ＬＧＡＬＳ１、ＰＳＭＥ４、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３タンパク質のうちの３つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  70. 前記集団の細胞由来ベシクルが、免疫調節に関連する、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＲＧ１、ＣＤ２７４、ＥＩＦ２Ａ、ＥＰＨＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＩＲＡＫ１、ＬＧＡＬＳ１、ＰＳＭＥ４、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３タンパク質のうちの４つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  71. 前記集団の細胞由来ベシクルが、免疫調節に関連する、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＲＧ１、ＣＤ２７４、ＥＩＦ２Ａ、ＥＰＨＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＩＲＡＫ１、ＬＧＡＬＳ１、ＰＳＭＥ４、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３タンパク質のうちの５つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  72. 前記集団の細胞由来ベシクルが、免疫調節に関連する、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＲＧ１、ＣＤ２７４、ＥＩＦ２Ａ、ＥＰＨＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＩＲＡＫ１、ＬＧＡＬＳ１、ＰＳＭＥ４、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３タンパク質のうちの６つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  73. 前記集団の細胞由来ベシクルが、免疫調節に関連する、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＲＧ１、ＣＤ２７４、ＥＩＦ２Ａ、ＥＰＨＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＩＲＡＫ１、ＬＧＡＬＳ１、ＰＳＭＥ４、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３タンパク質のうちの７つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  74. 前記集団の細胞由来ベシクルが、免疫調節に関連する、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＲＧ１、ＣＤ２７４、ＥＩＦ２Ａ、ＥＰＨＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＩＲＡＫ１、ＬＧＡＬＳ１、ＰＳＭＥ４、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３タンパク質のうちの８つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  75. 前記集団の細胞由来ベシクルが、免疫調節に関連する、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＲＧ１、ＣＤ２７４、ＥＩＦ２Ａ、ＥＰＨＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＩＲＡＫ１、ＬＧＡＬＳ１、ＰＳＭＥ４、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３タンパク質のうちの９つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  76. 前記集団の細胞由来ベシクルが、免疫調節に関連する、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＲＧ１、ＣＤ２７４、ＥＩＦ２Ａ、ＥＰＨＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＩＲＡＫ１、ＬＧＡＬＳ１、ＰＳＭＥ４、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３タンパク質のうちの１０個以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  77. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＢＦＲ２、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＦＢＮ１、ＩＴＧＢ５、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰおよびＭＶＰ治療的タンパク質のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  78. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＢＦＲ２、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＦＢＮ１、ＩＴＧＢ５、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰおよびＭＶＰ治療的タンパク質のうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  79. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＢＦＲ２、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＦＢＮ１、ＩＴＧＢ５、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰおよびＭＶＰ治療的タンパク質のうちの３つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  80. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＢＦＲ２、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＦＢＮ１、ＩＴＧＢ５、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰおよびＭＶＰ治療的タンパク質のうちの４つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  81. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＢＦＲ２、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＦＢＮ１、ＩＴＧＢ５、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰおよびＭＶＰ治療的タンパク質のうちの５つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  82. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＢＦＲ２、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＦＢＮ１、ＩＴＧＢ５、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰおよびＭＶＰ治療的タンパク質のうちの６つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  83. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＢＦＲ２、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＦＢＮ１、ＩＴＧＢ５、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰおよびＭＶＰ治療的タンパク質のうちの７つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  84. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＢＦＲ２、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＦＢＮ１、ＩＴＧＢ５、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰおよびＭＶＰ治療的タンパク質のうちの８つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  85. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＢＦＲ２、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＦＢＮ１、ＩＴＧＢ５、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰおよびＭＶＰ治療的タンパク質のうちの９つ以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  86. 前記集団の細胞由来ベシクルが、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＢＦＲ２、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＦＢＮ１、ＩＴＧＢ５、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰおよびＭＶＰ治療的タンパク質のうちの１０個以上を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  87. 前記細胞由来ベシクルの集団が、実質的に均一である、請求項１に記載の精製された集団。
  88. 前記細胞由来ベシクルの集団が、不均一である、請求項１に記載の精製された集団。
  89. 前記集団中の細胞由来ベシクルの濃度が、およそ１０６個の細胞につき回収される約０．５マイクログラム〜５０００マイクログラムのエキソソームおよび／または微小小胞体タンパク質を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  90. 前記集団中の細胞由来ベシクルの濃度が、およそ１０６個の細胞につき回収される約３００マイクログラム未満のエキソソームおよび／または微小小胞体タンパク質を含む、請求項１に記載の精製された集団。
  91. 前記集団中の細胞由来ベシクルの濃度が、１０６個の細胞につき約２００マイクログラム未満である、請求項１に記載の精製された集団。
  92. 前記集団中の細胞由来ベシクルの平均直径が、約０．１ｎｍ〜約１０００ｎｍである、請求項１に記載の精製された集団。
  93. 前記集団中の細胞由来ベシクルの平均直径が、１００ｎｍ未満である、請求項１に記載の精製された集団。
  94. 前記集団中の細胞由来ベシクルの平均直径が、５０ｎｍ未満である、請求項１に記載の精製された集団。
  95. 前記集団中の細胞由来ベシクルの平均直径が、約４０ｎｍ未満である、請求項１に記載の精製された集団。
  96. 前記細胞由来ベシクルが、濾過、必要に応じてタンジェンシャルフロー濾過を含む方法によって精製されている、請求項１に記載の精製された集団。
  97. 請求項１に記載の細胞由来ベシクルの精製された集団およびキャリアならびに必要に応じてさらなる治療薬を含む、組成物。
  98. 前記キャリアが、薬学的に許容され得るキャリアである、請求項９７に記載の組成物。
  99. 単離された幹細胞をさらに含む、請求項９７に記載の組成物。
  100. 前記幹細胞が、成体幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚様幹細胞、間葉系幹細胞または神経幹細胞の群から選択される、請求項９９に記載の組成物。
  101. 血管新生の促進を必要とする対象において血管新生を促進するための方法であって、請求項１〜８６のいずれか１項に記載の精製された集団を該対象に投与する工程を含む、方法。
  102. 前記対象が、少なくとも１用量のおよそ０．１ｍｇ〜２００ｍｇの細胞由来ベシクルタンパク質を投与される、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記対象が、少なくとも１用量のおよそ５０ｍｇの細胞由来ベシクルタンパク質を投与される、請求項１０２に記載の方法。
  104. 請求項１〜８６のいずれか１項に記載の精製された集団が、単離された幹細胞の投与前または投与後に投与される、請求項１０１に記載の方法。
  105. 請求項１〜８６のいずれか１項に記載の精製された集団が、単離された幹細胞と同時に投与される、請求項１０１に記載の方法。
  106. 請求項１〜８６のいずれか１項に記載の精製された集団が、静脈内注射、直接注射、筋肉内注射、頭蓋内注射によってまたは局所的に投与される、請求項１０１に記載の方法。
  107. 前記対象が、哺乳動物、必要に応じてヒト患者である、請求項１０１に記載の方法。
  108. 末梢動脈疾患または脳卒中を処置するための方法であって、請求項１〜８６のいずれか１項に記載の精製された集団および必要に応じてさらなる治療薬を対象に投与する工程を含む、方法。
  109. 前記対象が、少なくとも１用量のおよそ０．１ｍｇ〜２００ｍｇの細胞由来ベシクルタンパク質を投与される、請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記対象が、少なくとも１用量のおよそ５０ｍｇの細胞由来ベシクルタンパク質を投与される、請求項１０９に記載の方法。
  111. 請求項１〜８６のいずれか１項に記載の精製された集団が、幹細胞の投与前または投与後に投与される、請求項１０８に記載の方法。
  112. 請求項１〜８６のいずれか１項に記載の精製された集団が、前記幹細胞と同時に投与される、請求項１０８に記載の方法。
  113. 請求項１〜８６のいずれか１項に記載の精製された集団が、静脈内注射によって投与される、請求項１０８に記載の方法。
  114. 前記請求項１〜８６のいずれか１項に記載の精製された集団が、局所的に投与される、請求項１０８に記載の方法。
  115. 前記対象が、哺乳動物、必要に応じてヒト患者である、請求項１０８に記載の方法。
  116. 対象における皮膚創傷を処置するための方法であって、請求項１〜８６のいずれか１項に記載の精製された集団および必要に応じてさらなる治療薬を該対象に投与する工程を含む、方法。
  117. 前記対象が、少なくとも１用量のおよそ０．１ｍｇ〜２００ｍｇの細胞由来ベシクルタンパク質を投与される、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記対象が、少なくとも１用量のおよそ５０ｍｇの細胞由来ベシクルタンパク質を投与される、請求項１１６に記載の方法。
  119. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の精製された集団が、幹細胞の投与前または投与後に投与される、請求項１１６に記載の方法。
  120. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の精製された集団が、単離された幹細胞と同時に投与される、請求項１１６に記載の方法。
  121. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の精製された集団が、局所的に投与される、請求項１１６に記載の方法。
  122. 前記対象が、哺乳動物、必要に応じてヒト患者である、請求項１１６に記載の方法。
  123. 細胞由来ベシクルの集団を精製するための方法であって、該方法は、
    （ａ）単離された幹細胞の集団によって生成された条件培地にタンジェンシャルフロー濾過を適用して、細胞由来ベシクル含有画分を単離する工程；および
    （ｂ）該細胞由来ベシクル含有画分を濃縮して、細胞由来ベシクルの精製された集団を得る工程
    を含む、方法。
  124. 工程（ａ）の後、工程（ｂ）の前に、細胞残屑および他の夾雑物が、前記細胞由来ベシクル含有画分から除去される、請求項１２３に記載の方法。
  125. 工程（ａ）を行う前に、前記幹細胞の集団を低酸素かつ低血清条件下で最大約７２時間培養した、請求項１２３に記載の方法。
  126. 工程（ａ）が、およそ２００ナノメートルフィルターを用いて行われる、請求項１２３に記載の方法。
  127. 前記単離された幹細胞が、成体幹細胞、胚性幹細胞、胚様幹細胞、神経幹細胞または人工多能性幹細胞のうちの１つ以上である、請求項１２３に記載の方法。
  128. 前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１２３に記載の方法。
  129. 前記低酸素条件が、およそ１％〜１５％ＣＯ２かつ０．０５％〜２０％酸素分圧である、請求項１２３に記載の方法。
  130. 前記低血清条件が、無血清条件である、請求項１２９に記載の方法。
  131. 前記タンジェンシャルフロー濾過ユニットが、約５０キロダルトン〜約４００キロダルトンという名目上の分子量限界濾過ユニットである、請求項１２３に記載の方法。
  132. 前記タンジェンシャルフロー濾過ユニットが、約１００キロダルトンという名目上の分子量限界濾過ユニットである、請求項１２３に記載の方法。
  133. 前記タンジェンシャルフロー濾過ユニットが、約３００キロダルトンという名目上の分子量限界濾過ユニットである、請求項１２３に記載の方法。
  134. 工程（ｂ）が、濾過デバイスを用いて行われる、請求項１２３に記載の方法。
  135. 前記濾過デバイスが、およそ１００キロダルトンの名目上の分子量限界濾過デバイスである、請求項１３４に記載の方法。
  136. 前記濾過デバイスが、およそ３００キロダルトンの名目上の分子量限界濾過デバイスである、請求項１３４に記載の方法。
  137. 前記細胞由来ベシクルの精製された集団をキャリアおよび／または安定剤と混合することによって、該集団を製剤化する工程をさらに含む、請求項１２３に記載の方法。
  138. 前記細胞由来ベシクルの精製された集団を乾燥、凍結または凍結乾燥する工程をさらに含む、請求項１３７に記載の方法。
  139. 請求項１２３〜１３７のいずれか１項に記載の方法によって入手可能な細胞由来ベシクルの集団。
  140. 請求項１〜８６のいずれか１項に記載の精製された集団の乾燥された、凍結乾燥された、または凍結された細胞由来ベシクルの集団。
  141. 請求項１４０に記載の集団および使用するための指示書を含む、キット。
  142. 細胞由来ベシクルの集団の大規模精製のための方法であって、該方法は、
    （ａ）バイオリアクターにおいて培養された単離された幹細胞の集団によって生成された条件培地にタンジェンシャルフロー濾過を適用して、細胞由来ベシクル含有画分を単離する工程；および
    （ｂ）該細胞由来ベシクル含有画分を濃縮して、細胞由来ベシクルの精製された集団を得る工程
    を含む、方法。
  143. 前記バイオリアクターが、中空糸バイオリアクターである、請求項１４２に記載の方法。
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