WO2023079655A1 - エクソソーム抽出方法 - Google Patents
エクソソーム抽出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2023079655A1 WO2023079655A1 PCT/JP2021/040669 JP2021040669W WO2023079655A1 WO 2023079655 A1 WO2023079655 A1 WO 2023079655A1 JP 2021040669 W JP2021040669 W JP 2021040669W WO 2023079655 A1 WO2023079655 A1 WO 2023079655A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- treatment liquid
- treatment
- platelets
- generate
- exosomes
- Prior art date
Links
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 105
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 110
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 claims abstract description 47
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 37
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 claims abstract description 22
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 14
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 63
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000012503 blood component Substances 0.000 claims description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 8
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 7
- GMVPRGQOIOIIMI-UHFFFAOYSA-N (8R,11R,12R,13E,15S)-11,15-Dihydroxy-9-oxo-13-prostenoic acid Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CCCCCCC(O)=O GMVPRGQOIOIIMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 6
- 229960000711 alprostadil Drugs 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 6
- GMVPRGQOIOIIMI-DWKJAMRDSA-N prostaglandin E1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1CCCCCCC(O)=O GMVPRGQOIOIIMI-DWKJAMRDSA-N 0.000 description 6
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 2
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 210000005061 intracellular organelle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000033667 organ regeneration Effects 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 238000000710 polymer precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
Definitions
- the present invention relates to an exosome extraction method that can efficiently extract exosomes.
- Exosomes are spherical structures with a particle diameter of several nanometers containing RNA, DNA, and cytokines, and have been found to play an important role in intercellular communication.
- cancer cells in the organ where the tumor first appeared (primary site) release exosomes into the blood and lymph. Released exosomes circulate throughout the body and colonize other organs and tissues. It has been revealed that cancer cells specifically adhere to other organs and tissues, targeting exosomes that have colonized other organs, etc., and metastasize.
- Exosomes contain cytokines and the like necessary for tissue regeneration and organ regeneration, and at the research level, it has also been known that they are greatly involved in differentiation induction and proliferation of tissues and organs.
- exosomes are synthesized and secreted by most somatic cells, they have been extremely difficult to isolate from cells.
- exosome research requires a technique for easily separating and concentrating a large amount of exosomes.
- exosome extraction methods include ultracentrifugation, polymer precipitation, and immunoprecipitation. All of the above methods require complicated operations and are not suitable for separating and purifying large amounts of exosomes.
- Patent Document 1 proposes a method for extracting exosomes. According to the method described in Patent Document 1, the liquid consisting of cell culture supernatant containing exosomes is filtered stepwise using a filtration device to concentrate the liquid containing exosomes.
- the purpose of the present invention is to provide an exosome extraction method that allows exosomes to be extracted simply and efficiently.
- one aspect of the present invention is to collect a predetermined amount of blood containing an anticoagulant, and centrifuge the blood at a first gravitational acceleration to separate plasma, platelets, white blood cells, and red blood cells.
- generating a first treatment liquid obtained by extracting the platelets and the plasma from the first treatment liquid generating a second treatment liquid obtained by extracting the platelets and the plasma from the first treatment liquid; Centrifugation is performed under gravitational acceleration to generate a third treatment liquid in which the platelets and the plasma are separated, a first supernatant containing the plasma is removed from the third treatment liquid, and a fourth treatment containing the platelets is obtained.
- exosomes can be easily and efficiently extracted.
- exosome extraction method is a technique for easily and efficiently separating and concentrating exosomes from cells or platelets without using a special device.
- the exosome extraction method according to the first embodiment is for extracting exosomes from collected blood.
- a predetermined amount of blood of 5 mL to 50 mL is collected from a subject.
- the amount of blood collected is an example and is adjusted as appropriate according to the amount of exosomes extracted.
- the blood is stored in a container containing an anticoagulant.
- Blood is, for example, peripheral blood or arterial blood.
- the blood is then centrifuged using a centrifuge at a first gravitational acceleration of 0-450 xg within 72 hours to produce a first treated liquid (centrifuged blood).
- the first treatment liquid is generated in a liquid in which plasma is accumulated in the upper layer (supernatant) and layers of platelets, white blood cells, and red blood cells are separated toward the lower layer.
- the upper liquid is extracted from the first treated liquid so as not to contain white blood cells and red blood cells, and a second treated liquid (platelet plasma) containing plasma and platelets is produced.
- the second treated liquid is centrifuged at a second gravitational acceleration of, for example, 500 to 2800 xg, which is larger than the first gravitational acceleration, to produce a third treated liquid (platelet sediment) in which platelets and plasma are separated.
- the second treated liquid may be processed using a separation device that separates blood components to produce a third treated liquid in which plasma and platelets are separated.
- the separation device is, for example, a device for separating platelet-rich plasma for transfusion.
- a plasma-containing upper supernatant (first supernatant) is removed from the third treated liquid to produce a fourth treated liquid (platelet sediment) containing platelets.
- a fourth treatment solution By making the fourth treatment solution, it is possible to remove exosomes secreted from other organs and released into the blood, and platelet-derived exosomes with high purity can be easily obtained.
- An isotonic buffer solution is added to the fourth treatment liquid to generate a fifth treatment liquid (PRP (Platelet Rich Plasma)) in which the platelets are washed at least once. By manipulating in this way, exosomes with higher purity can be obtained while exosomes are stabilized in platelets. Platelets are washed, for example, twice with isotonic buffer.
- An isotonic buffer solution is, for example, a solution that has a buffering action against the hydrogen ion concentration and whose osmotic pressure is approximately isotonic with the external fluid of platelets.
- an HBSS/HANKS buffer solution may be added to the fifth treatment liquid and cultured for a predetermined time of 24 to 240 hours at a predetermined temperature of about 37°C, which is close to the human body temperature. This manipulation can increase the content of exosomes in the platelets.
- the HBSS/HANKS buffer is, for example, an agent capable of supplying moisture and necessary inorganic ions to the cultured cells while maintaining the balance of pH and osmotic pressure in the culture medium. Similar to the HBSS/HANKS buffer, other buffers may be used as long as the environment in the culture can be adjusted.
- the platelets contained in the fifth treatment liquid are destroyed to generate the sixth treatment liquid (PRP crushed liquid).
- An arbitrary amount of distilled water or hypotonic buffer solution is added to the fifth treatment liquid, for example, to break the platelets and produce a sixth treatment liquid.
- the fifth treatment liquid may be frozen and then thawed to break the platelets to generate the sixth treatment liquid.
- the fifth treatment liquid may be subjected to ultrasonic wave input based on an ultrasonic wave transmitting device to destroy platelets to generate the sixth treatment liquid.
- the sixth treated liquid is centrifuged at a third gravitational acceleration of 15,000xg to 150000xg, which is larger than the second gravitational acceleration, to produce a seventh treated liquid (crushed PRP supernatant).
- the third gravitational acceleration is not limited to the above value as long as the broken platelets can be separated, and other values (preferably stronger gravitational acceleration) are preferably 150000 ⁇ g.
- intracellular organelles other than exosomes are removed, resulting in a more pure exosome concentrate.
- the supernatant (second supernatant) is collected, and the resulting supernatant is filtered using a sterile filter to generate the 8th treatment solution (PRP exosomes).
- a sterile filter is, for example, a filter having a hole diameter of about 0.1 to 0.45 um that allows exosomes to pass but does not allow bacteria to pass. Therefore, the eighth treatment liquid, exosomes are extracted. Exosomes may be concentrated in the eighth treatment liquid by further freeze-drying.
- the extracted exosomes are measured, for example, by a sandwich ELISA method that recognizes CD9 and CD63 molecules expressed on the exosome membrane surface.
- CD9 and CD63 molecules are surface markers of exosomes. Measurement by the sandwich ELISA method does not require a special device, and can be measured using an ordinary plate reader with a wavelength of 450 nm.
- exosomes are present in plasma obtained from 5 ml of blood.
- exosome extraction method for example, exosomes derived from platelets of 4000-6000 pg or more can be recovered from 5 mL of blood.
- the exosome extraction method by freeze-drying the further extracted exosome concentrate (eighth treatment solution), high-concentration platelet-derived exosomes exceeding 7500 to 10000 pg can be recovered. Further, according to the exosome extraction method, exosomes can be easily and efficiently extracted without using a special device.
- the exosome extraction method according to the second embodiment cultures adipose tissue-derived stromal cells to extract exosomes.
- Adipose tissue-derived stromal cells are removed from the subject's subcutaneous adipose tissue and cultured in a flask.
- the cells used at this time are not only adipose tissue-derived stromal cells, but also cells that can be induced to differentiate into somatic cells, i.e., iPS cells, ES cells, and other somatic stem cells (bone marrow stem cells, endometrial stem cells, etc.).
- a 1-1 treatment solution (culture solution) is produced by adding, for example, prostaglandin E1 (PGE1) at a predetermined ratio of 1 to 500 ug/mL to cultured cells based on adipose tissue-derived stromal cells.
- PGE1 prostaglandin E1
- PGE1 is a drug that suppresses platelet aggregation.
- Adipose tissue stromal cells are stimulated by using PGE1.
- the 1-1 treatment solution (culture solution) may be produced using agents other than PGE1, such as various appropriate concentrations of cytokines.
- the ratio of the buffer solution may be adjusted to other ratios as long as cell viability is possible.
- a Hanks BSS/HEPES (HBSS/HEPES) buffer solution is added to the 1-1 treatment solution (culture solution), and the cells are cultured at a predetermined temperature condition of 37°C, which is close to human body temperature, for a predetermined time of 24 hours or more.
- a 2-1 treatment solution (undiluted culture supernatant) is produced by culturing the HBSS/HEPES buffer is a buffer containing no phenol red or sodium bicarbonate, and is a physiological salt solution that contains inorganic salts and nutrients essential for cultured cells and maintains the balance of pH and osmotic pressure. Similar to HBSS/HEPES buffers, other buffers may be used as long as the environment in the culture can be adjusted.
- the obtained 2-1 treatment solution (culture supernatant undiluted solution) is centrifuged using a centrifuge under treatment conditions of, for example, 15000 rpm for 10 minutes, and the supernatant and cultured cells are separated 3-1 A treated liquid (centrifuged culture supernatant) is produced.
- the 2-1 treatment solution (undiluted culture supernatant) may be centrifuged under other treatment conditions as long as the supernatant and cultured cells can be separated.
- a sterile filter is, for example, a filter with a pore size of 0.1-0.45 um that allows exosomes to pass through but not bacteria.
- the 4-1 treatment solution (cell exosomes) is freeze-dried to concentrate exosomes.
- a solution containing trypsin is added to the cultured cells remaining in the culture vessel such as a culture dish after collecting the 1-1 supernatant from the 3-1 treatment solution (centrifuged culture supernatant).
- a 3-2 treatment liquid cell detachment liquid
- the 3-2 treatment solution may be generated using a solution other than trypsin as long as the cultured cells can be detached.
- the 3-3 treatment liquid (cell-containing liquid) containing cultured cells is recovered from the 3-2 treatment liquid (cell detachment liquid) on the culture dish using a pipette or the like.
- the culture dish may be petri dish-shaped, flask-shaped, or other vessels for culture as long as cells can be cultured.
- the 3-3 treatment liquid (cell-containing liquid) containing the collected cultured cells is centrifuged at a predetermined gravitational acceleration of 200 to 1200 x g to generate the 3-4 treatment liquid (centrifuged cell-containing liquid). .
- the supernatant (2-1 supernatant) is removed from the 3-4 treatment solution (centrifuged cell-containing solution), and the 5-1 treatment solution (cell suspension) in which the cultured cells are concentrated is recovered. be done.
- An isotonic buffer was added to the collected 5-1 treatment solution (cell suspension), and the cultured cells were washed at least once to obtain a 6-1 treatment solution (washed cell suspension). is generated. Cultured cells are washed, for example, twice with an isotonic buffer.
- the cultured cells washed in the 6-1 treatment solution (washed cell suspension) are disrupted to generate the 7-1 treatment solution (crushing supernatant).
- an arbitrary amount of distilled water or hypotonic buffer is added to disrupt the cultured cells 7-1 treatment solution (crushed supernatant) may be generated.
- the 6-1 treatment liquid (washed cell suspension) is frozen and then thawed to disrupt the cultured cells to generate the 7-1 treatment liquid (crushing supernatant). good.
- the cultured cells may be disrupted by inputting ultrasonic waves to the 6-1 treatment liquid (washed cell suspension) to generate a 7-1 treatment liquid (crushed supernatant).
- the 7th-1 treatment solution (crushing supernatant) is centrifuged at 200 xg or more using a centrifuge to generate the 8-1 treatment solution (cell exosomes). At this time, exosomes with higher purity can be recovered by centrifuging at a gravitational acceleration of 150000 x g or more.
- the supernatant (2-1 supernatant) of the 8-1 treatment solution (cell exosomes) was collected, the resulting supernatant was filtered with a sterile filter, and the exosomes were extracted 9-1 treatment solution (purification cell exosomes) are produced.
- the 9-1 treatment solution (purified cell exosomes) may be freeze-dried to concentrate exosomes by, for example, rapid freezing at a temperature of -80 to -196°C.
- exosome extraction method highly concentrated exosomes can be extracted, for example, by culturing adipose tissue stromal cells. Exosomes in the culture supernatant, for example, by using a T75 (75 cm 2) flask, about 1000 pg per 75 cm 2 can be recovered. According to the exosome extraction method, exosomes exceeding 2000 pg can be extracted by stimulating adipose tissue stromal cells with PGE1.
- the exosomes in the frozen solution can be concentrated up to 15 times, and the concentration of 70-90 pg / mL that is usually obtained can be reduced to 1000-1500 pg / It can be concentrated to mL.
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
抗凝固剤を含む所定量の血液を採血し、血液を、第１重力加速度で遠心分離し血漿、血小板、白血球、及び赤血球が分離された第１処理液を生成し、第１処理液から血小板及び血漿を抽出した第２処理液を生成し、第２処理液を第２重力加速度で遠心分離して血小板と血漿とに分離された第３処理液を生成し、第３処理液から血漿が含まれる第１上清を除去し血小板を含む第４処理液を生成し、第４処理液に等張性緩衝液を加え、血小板を少なくとも１回洗浄した第５処理液を生成し、第５処理液に含まれる血小板を破壊し第６処理液を生成し、第６処理液を第３重力加速度で遠心分離した第７処理液を生成し、第７処理液の第２上清を採取してエクソソームを通過させつつ細菌を通過させない穴径を有する滅菌フィルターで濾過しエクソソームを抽出した第８処理液を生成する、エクソソーム抽出方法である。
Description
本発明は、エクソソームを効率的に抽出可能なエクソソーム抽出方法に関する。
近年、細胞から分泌されるエクソソームと呼ばれるナノ粒子物質が注目されている。エクソソームは、ＲＮＡ，ＤＮＡ，サイトカインを含む、粒子直径数ｎｍ程度の球状構造体であり、細胞間の情報伝達に重要な役割を果たしていることが判明している。特に、エクソソームに関する研究は、癌研究分野で著しい発展が見られる。最初に腫瘍が発生した臓器（原発巣）の癌細胞は、流血やリンパ液中にエクソソームを放出する。放出されたエクソソームは、全身を循環し、他の臓器や組織に定着する。癌細胞は、他臓器等に定着したエクソソームを目標に他臓器や組織に特異的に接着し、転移を行うことが明らかとなった。
エクソソームに関する研究は、癌研究分野だけでなく他分野においても進められている。エクソソームは、組織再生や臓器再生に必要なサイトカイン等を含み、研究レベルにおいては、組織や臓器の分化誘導や増殖に大きく関与することも知られてきた。しかしながら、エクソソームは、ほとんどの体細胞により合成され分泌しているものの、細胞から分離することが極めて困難であった。
そのため、研究用に使用可能なエクソソームが不足しており、今後の再生医療等への臨床応用に関する研究を阻む大きな原因となっている。従って、エクソソーム研究においては、簡易に大量に分離濃縮する技術が求められている。
エクソソームの抽出方法には、現在、超遠心分離法、ポリマー沈殿法、免疫沈降法などが知られている。上記方法はいずれも操作が煩雑であり、大量のエクソソームを分離精製することには適していない。
例えば、特許文献１には、エクソソームを抽出する方法が提案されている。特許文献１に記載された方法によれば、濾過装置を用いてエクソソームを含む細胞培養上清からなる液体を段階的に濾過し、エクソソームを含む液体を濃縮している。
しかしながら、特許文献１に記載されたエクソソームの抽出方法によれば、エクソソームを含む液体を段階的に濾過するための特別な濾過装置が必要であり、エクソソームを抽出するコストが増大するという課題がある。
本発明は、エクソソームを簡便且つ効率的に抽出可能とするエクソソーム抽出方法を提供することを目的とする。
上記の目的を達するために、本発明の一態様は、抗凝固剤を含む所定量の血液を採血し、前記血液を、第１重力加速度で遠心分離し血漿、血小板、白血球、及び赤血球が分離された第１処理液を生成し、前記第１処理液から前記血小板及び前記血漿を抽出した第２処理液を生成し、前記第２処理液を前記第１重力加速度に比して大きい第２重力加速度で遠心分離して前記血小板と前記血漿とに分離された第３処理液を生成し、前記第３処理液から前記血漿が含まれる第１上清を除去し前記血小板を含む第４処理液を生成し、前記第４処理液に等張性緩衝液を加え、前記血小板を少なくとも１回洗浄した第５処理液を生成し、前記第５処理液に含まれる前記血小板を破壊し第６処理液を生成し、前記第６処理液を前記第２重力加速度に比して大きい第３重力加速度で遠心分離した第７処理液を生成し、前記第７処理液の第２上清を採取してエクソソームを通過させつつ細菌を通過させない穴径を有する滅菌フィルターで濾過し前記エクソソームを抽出した第８処理液を生成する、エクソソーム抽出方法である。
本発明によれば、エクソソームを簡便且つ効率的に抽出することができる。
以下、本発明に係るエクソソーム抽出方法の実施形態について説明する。以下の実施形態においては、特別な装置を用いることなく細胞や血小板からエクソソームを簡易かつ効率的に分離濃縮する技術である。
［第１実施形態］
第１実施形態に係るエクソソーム抽出方法は、採血した血液からエクソソームを抽出するものである。先ず、被験者から５ｍＬ～５０ｍＬの所定量の血液を採血する。採血量は、一例であり、エクソソームの抽出量に応じて適宜調整される。
第１実施形態に係るエクソソーム抽出方法は、採血した血液からエクソソームを抽出するものである。先ず、被験者から５ｍＬ～５０ｍＬの所定量の血液を採血する。採血量は、一例であり、エクソソームの抽出量に応じて適宜調整される。
血液は、抗凝固剤を含む容器に収容される。血液は、例えば、末梢血または動脈血である。次に血液は、７２時間以内に０～４５０ｘｇの第１重力加速度で遠心分離機を用いて遠心分離され第１処理液（遠心分離血液）が生成される。第１処理液は、上層（上清）に血漿が溜まり、下層に向かうほど血小板、白血球、赤血球の層が分離している液体に生成される。第１処理液からは、白血球及び赤血球を含まないように上層の液が抽出され、血漿及び血小板を含む第２処理液（血小板血漿）が生成される。
第２処理液は、例えば、第１重力加速度に比して大きい５００～２８００ｘｇの第２重力加速度で遠心分離され、血小板と血漿とに分離された第３処理液（血小板沈殿液）が生成される。第２処理液は、血液成分を分離する分離装置を用いて処理され、血漿と血小板とが分離された第３処理液が生成されてもよい。分離装置は、例えば、輸血用の濃厚血小板血漿を分離する装置である。
第３処理液からは、血漿が含まれる上層の上清（第１上清）が除去され、血小板を含む第４処理液（血小板沈渣）が生成される。第４処理液が作られることで、他の臓器から分泌され血中に放出されたエクソソームの除去が可能で、純度の高い血小板由来エクソソームを、容易に得ることができる。第４処理液には、等張性緩衝液が加えられ、血小板を少なくとも１回洗浄した第５処理液（多血小板血漿：PRP（Platelet Rich Plasma））が生成される。この様に操作することで、血小板内にエクソソームを安定化した状態で、より一層純度の高いエクソソームが得られる。血小板は、例えば、等張性緩衝液により２回洗浄される。等張性緩衝液とは、例えば、浸透圧が血小板の外液とほぼ等張の水素イオン濃度に対する緩衝作用のある溶液である。
ここで、第５処理液には、ＨＢＳＳ／ＨＡＮＫＳ緩衝液が加えられ、人体温度に近い３７℃程度の所定温度において２４～２４０時間の所定時間の間に培養されてもよい。この操作によって、血小板内のエクソソームの含有量を増やすことができる。ＨＢＳＳ／ＨＡＮＫＳ緩衝液は、例えば、培養液中のｐＨや浸透圧のバランスを維持しつつ、培養細胞に水分と必要な無機イオンを供給可能な薬剤である。ＨＢＳＳ／ＨＡＮＫＳ緩衝液と同様に、培養液中の環境を調整可能であれば他の緩衝液が用いられてもよい。
第５処理液に含まれる血小板は、破壊され第６処理液（ＰＲＰ破砕液）が生成される。第５処理液には、例えば、任意の量の蒸留水もしくは低張緩衝液が加えられ、血小板が破壊され第６処理液が生成される。ここで、第５処理液は、凍結された後、融解されることにより血小板が破壊され第６処理液が生成されてもよい。また、第５処理液は、超音波の発信装置に基づいて超音波が入力されることにより血小板が破壊され第６処理液が生成されてもよい。
第６処理液は、第２重力加速度に比して大きい１５，０００ｘｇ～１５００００ｘｇの第３重力加速度で遠心分離した第７処理液（破砕ＰＲＰ上清）を生成する。第３重力加速度は、破壊された血小板を分離可能であれば上記値に限らず、他の値(好ましくはより強力な重力加速度)であっても、１５００００ｘｇであることが好ましい。この事により、エクソソーム以外の細胞内小器官が取り除かれ、より純度の高いエクソソーム濃縮液が得られる。第７処理液からは、上清（第２上清）が採取され、得られた上清は、滅菌フィルターを用いて濾過され第８処理液（ＰＲＰエクソソーム）が生成される。滅菌フィルターは、例えば、エクソソームを通過させつつ細菌を通過させない０．１～０．４５ｕｍ程度の穴径を有するフィルターである。従って、第８処理液には、エクソソームが抽出されている。第８処理液は、更に凍結乾燥することによりエクソソームが濃縮されてもよい。
抽出されたエクソソームは、例えば、エクソソーム膜表面に発現しているＣＤ９，ＣＤ６３分子を認識するサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって測定する。ＣＤ９，ＣＤ６３分子は、エクソソームの表面マーカーである。サンドイッチＥＬＩＳＡ法の測定において、特殊な装置は不要であり、波長：４５０ｎｍの通常のプレートリーダーを用いて測定可能である。
通常、５ｍｌの血液から得られた血漿には、約１００－２８０ｐｇ程度のエクソソームしか存在しない。上述したエクソソーム抽出方法によれば、例えば、５ｍＬの血液から４０００～６０００ｐｇ以上の血小板由来のエクソソームを回収することができる。エクソソーム抽出方法によれば、更に抽出されたエクソソームの濃縮液（第８処理液）を凍結乾燥することで、７５００～１００００ｐｇを超える高濃度の血小板由来のエクソソームを回収できる。また、エクソソーム抽出方法によれば、特殊な装置を用いることなく、エクソソームを簡便且つ効率的に抽出することができる。
［第２実施形態］
第２実施形態に係るエクソソーム抽出方法は、脂肪組織由来間質細胞を培養しエクソソームを抽出する。
第２実施形態に係るエクソソーム抽出方法は、脂肪組織由来間質細胞を培養しエクソソームを抽出する。
被験者の皮下脂肪組織から脂肪組織由来間質細胞が取り出され、フラスコ内において培養される。この時に用いる細胞は、脂肪組織由来間質細胞だけでなく、体性細胞に分化誘導可能な細胞、すなわちｉＰＳ細胞やＥＳ細胞、その他の体性幹細胞（骨髄幹細胞、子宮内膜幹細胞等々）であってもよい。脂肪組織由来間質細胞に基づく培養細胞に、例えば、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）を１～５００ｕｇ／ｍＬの所定の割合で添加した第１－１処理液（培養液）が生成される。ＰＧＥ１は、血小板の凝集を抑制する薬剤である。ＰＧＥ１を用いることにより、脂肪組織間質細胞が刺激される。第１－１処理液（培養液）は、ＰＧＥ１以外の薬剤、例えば、種々の適正な濃度のサイトカインなどを用いて生成されてもよい。また、緩衝液の割合は、細胞の生存が可能であれば、他の割合に調整されてもよい。
第１－１処理液（培養液）には、例えば、Ｈａｎｋｓ ＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ（ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ）緩衝液が添加され、人体温度に近い３７℃の所定温度条件において２４時間以上の所定時間に培養細胞を培養した第２－１処理液（培養上清原液）が生成される。ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ緩衝液は、フェノールレッド、重炭酸ナトリウムを含まない緩衝液であり、培養細胞に不可欠な無機塩や栄養を含み、ｐＨや浸透圧のバランスを維持する生理的塩類溶液である。ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ緩衝液と同様に、培養液中の環境を調整可能であれば他の緩衝液が用いられてもよい。
得られた第２－１処理液（培養上清原液）は、遠心分離機を用いて例えば１５０００回転で１０分の処理条件において遠心分離され、上清、培養細胞が分離された第３－１処理液（遠心分離培養上清）が生成される。第２－１処理液（培養上清原液）は、上清、培養細胞が分離可能であれば他の処理条件により遠心分離されてもよい。
第３－１処理液（遠心分離培養上清）の上清（第１－１上清）を抽出し、得られた上清を滅菌フィルターで濾過しエクソソームが抽出された第４－１処理液（細胞エクソソーム）が生成される。滅菌フィルターは、例えば、エクソソームを通過させつつ細菌を通過させない０．１～０．４５ｕｍの穴径を有するフィルターである。第４－１処理液（細胞エクソソーム）は、凍結乾燥されエクソソームが濃縮される。
また、第３－１処理液（遠心分離培養上清）から第１－１上清を回収した後の培養皿等の培養用の容器に残留した培養細胞には、トリプシンを含む溶液が添加されることにより培養細胞が剥離された第３－２処理液（細胞剥離液）が生成される。第３－２処理液（細胞剥離液）は、培養細胞が剥離可能であればトリプシン以外の他の溶液が用いられて生成されてもよい。培養皿上の第３－２処理液（細胞剥離液）からは、培養細胞を含む第３－３処理液（細胞含有液）がピペット等を用いて回収される。培養皿は、シャーレ形状、フラスコ形状の他、細胞が培養可能であれば他の培養用の容器が用いられてもよい。
回収された培養細胞を含む第３－３処理液（細胞含有液）は、２００～１２００ｘｇの所定の重力加速度により遠心分離され、第３－４処理液（遠心分離細胞含有液）が生成される。第３－４処理液（遠心分離細胞含有液）からは、上清（第２－１上清）が取り除かれ、培養細胞が濃縮された第５－１処理液（細胞懸濁液）が回収される。回収された第５－１処理液（細胞懸濁液）には、等張性緩衝液が加えられ、培養細胞が少なくとも１回洗浄された第６－１処理液（洗浄済み細胞懸濁液）が生成される。培養細胞は、例えば、等張性緩衝液により２回洗浄される。
第６－１処理液（洗浄済み細胞懸濁液）において洗浄された培養細胞は、破壊され、第７－１処理液（破砕上清）が生成される。第６－１処理液（洗浄済み細胞懸濁液）には、例えば、任意の量の蒸留水もしくは低張緩衝液が加えられ培養細胞が破壊された第７－１処理液（破砕上清）が生成されてもよい。ここで、第６－１処理液（洗浄済み細胞懸濁液）は、凍結された後、融解されることにより培養細胞が破壊され第７－１処理液（破砕上清）を生成してもよい。また、第６－１処理液（洗浄済み細胞懸濁液）には、超音波が入力されることにより培養細胞が破壊され第７－１処理液（破砕上清）が生成されてもよい。
第７－１処理液（破砕上清）は、遠心分離機を用いて２００ｘｇ以上で遠心分離され第８－１処理液（細胞エクソソーム）が生成される。この時、１５００００ｘｇ以上の重力加速度で遠心分離される事で、より純度の高いエクソソームを回収できる。第８－１処理液（細胞エクソソーム）の上清（第２－１上清）は採取され、得られた上清は滅菌フィルターで濾過され、エクソソームが抽出された第９－１処理液（精製細胞エクソソーム）が生成される。第９－１処理液（精製細胞エクソソーム）は、例えば、-８０～-１９６℃の温度条件における急速凍結により凍結乾燥されエクソソームが濃縮されてもよい。
上述した第２実施形態に係るエクソソーム抽出方法によれば、例えば脂肪組織間質細胞を培養することにより、高濃度に濃縮されたエクソソームを抽出することができる。培養上清中のエクソソームは、例えばＴ７５（７５ｃｍ２）フラスコを用いることにより、７５ｃｍ２あたり１０００ｐｇ程度、回収することができる。エクソソーム抽出方法によれば、ＰＧＥ１を用いて脂肪組織間質細胞を刺激することにより２０００ｐｇを超えるエクソソームを抽出することができる。
エクソソーム抽出方法によれば、培養液中の上清を凍結乾燥することで、凍結溶液中のエクソソームを最大１５倍に濃縮可能であり、通常得られる７０～９０ｐｇ／ｍＬの濃度を１０００～１５００ｐｇ／ｍＬにまで濃縮することができる。
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は上記の一実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。例えば、上述した条件、装置、薬剤、細胞は、同様の結果が得られるのであれば適宜変更、置換されてもよい。
Claims (15)
- 抗凝固剤を含む所定量の血液を採血し、
前記血液を、第１重力加速度で遠心分離し血漿、血小板、白血球、及び赤血球が分離された第１処理液を生成し、
前記第１処理液から前記血小板及び前記血漿を抽出した第２処理液を生成し、
前記第２処理液を前記第１重力加速度に比して大きい第２重力加速度で遠心分離して前記血小板と前記血漿とに分離された第３処理液を生成し、
前記第３処理液から前記血漿が含まれる第１上清を除去し前記血小板を含む第４処理液を生成し、
前記第４処理液に等張性緩衝液を加え、前記血小板を少なくとも１回洗浄した第５処理液を生成し、
前記第５処理液に含まれる前記血小板を破壊し第６処理液を生成し、
前記第６処理液を前記第２重力加速度に比して大きい第３重力加速度で遠心分離した第７処理液を生成し、
前記第７処理液の第２上清を採取してエクソソームを通過させつつ細菌を通過させない穴径を有する滅菌フィルターで濾過し前記エクソソームを抽出した第８処理液を生成する、
エクソソーム抽出方法。 - 前記第２処理液を、血液成分を分離する分離装置を用いて処理し、前記血漿と前記血小板とが分離された前記第３処理液を生成する、
請求項１に記載のエクソソーム抽出方法。 - 前記第５処理液に任意の量の蒸留水もしくは低張緩衝液を加えて、前記血小板を破壊した前記第６処理液を生成する、
請求項１または２に記載のエクソソーム抽出方法。 - 前記第５処理液を凍結した後、融解し前記血小板を破壊し前記第６処理液を生成する、
請求項１または２に記載のエクソソーム抽出方法。 - 前記第５処理液に超音波を入力し前記血小板を破壊し前記第６処理液を生成する、
請求項１または２に記載のエクソソーム抽出方法。 - 前記第５処理液に緩衝液を加え、所定温度において所定時間培養する、
請求項１から５のうちいずれか１項に記載のエクソソーム抽出方法。 - 前記第８処理液を凍結乾燥し前記エクソソームを濃縮する、
請求項１から６のうちいずれか１項に記載のエクソソーム抽出方法。 - 体性細胞に分化誘導可能な細胞が培養された培養細胞に添加するための血小板の凝集を抑制する薬剤などを所定の割合で添加した第１－１処理液を調整し、
前記第１－１処理液を添加し所定温度条件において所定時間培養した第２－１処理液を生成し、
前記第２－１処理液を遠心分離し第３－１処理液を生成し、
前記第３－１処理液の第１－１上清を抽出しエクソソームを通過させつつ細菌を通過させない穴径を有する滅菌フィルターで濾過し前記エクソソームを抽出した第４－１処理液を生成する、
エクソソーム抽出方法。 - 前記第４－１処理液を凍結乾燥し前記エクソソームを濃縮する、
請求項８に記載のエクソソーム抽出方法。 - 前記第３－１処理液から前記第１－１上清が回収された後に残留した前記培養細胞を回収し、前記培養細胞を含む第５－１処理液を生成し、
前記第５－１処理液の第２－１上清を取り除いて等張性緩衝液を加え、前記培養細胞を少なくとも１回洗浄した第６－１処理液を生成し、
前記第６－１処理液に含まれる前記培養細胞を破壊し第７－１処理液を生成し、
前記第７－１処理液を遠心分離した第８－１処理液を生成し、
前記第８－１処理液の第２上清を採取して前記エクソソームを通過させつつ細菌を通過させない穴径を有する滅菌フィルターで濾過し前記エクソソームを抽出した第９－１処理液を生成する、
請求項８に記載のエクソソーム抽出方法。 - 前記第５－１処理液は、
前記第３－１処理液から前記第１－１上清が回収されて残留した溶液に前記培養細胞を剥離可能な溶液を添加して前記培養細胞を剥離させた第３－２処理液を生成し、
前記第３－２処理液から前記培養細胞を含む第３－３処理液を回収し、
前記第３－３処理液から所定の重力加速度により前記培養細胞を遠心分離した第３－４処理液を生成し、
前記第３－４処理液から第２－１上清を取り除いて生成される、
請求項１０に記載のエクソソーム抽出方法。 - 前記第９－１処理液を凍結乾燥し前記エクソソームを濃縮する、
請求項１０又は１１に記載のエクソソーム抽出方法。 - 前記第６－１処理液に任意の量の蒸留水もしくは低張緩衝液を加えて、前記培養細胞を破壊した前記第７－１処理液を生成する、
請求項１０又は１１に記載のエクソソーム抽出方法。 - 前記第６－１処理液を凍結した後、融解し前記血小板を破壊し前記第７－１処理液を生成する、
請求項１０又は１１に記載のエクソソーム抽出方法。 - 前記第６－１処理液に超音波を入力し前記血小板を破壊し前記第７－１処理液を生成する、
請求項１０又は１１に記載のエクソソーム抽出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2021/040669 WO2023079655A1 (ja) | 2021-11-04 | 2021-11-04 | エクソソーム抽出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2021/040669 WO2023079655A1 (ja) | 2021-11-04 | 2021-11-04 | エクソソーム抽出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2023079655A1 true WO2023079655A1 (ja) | 2023-05-11 |
Family
ID=86240829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2021/040669 WO2023079655A1 (ja) | 2021-11-04 | 2021-11-04 | エクソソーム抽出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2023079655A1 (ja) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017171597A (ja) * | 2016-03-22 | 2017-09-28 | 株式会社細胞応用技術研究所 | 血小板濃縮製剤の製造方法 |
| JP2018522071A (ja) * | 2015-07-31 | 2018-08-09 | エクソシューティカルズ インコーポレイテッドＥｘｏｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | エキソソーム組成物ならびに調製方法ならびに皮膚および毛髪の調節および調整のためのその使用 |
| JP2019517488A (ja) * | 2016-06-08 | 2019-06-24 | リザート ファーマ ゲーエムベーハー（リザートファーマ）Ｌｙｓａｔ Ｐｈａｒｍａ Ｇｍｂｈ（Ｌｙｓａｔｐｈａｒｍａ） | 医学に使用するためのヒト血小板溶解物由来細胞外小胞 |
| WO2019198077A1 (en) * | 2018-04-10 | 2019-10-17 | Brainstorm Cell Therapeutics Ltd. | Cell-type specific exosomes and use thereof |
| JP2019530438A (ja) * | 2016-08-29 | 2019-10-24 | ハッケンサック ユニヴァーシティ メディカル センター | 血小板様細胞を含有する血液の血小板に富む画分を用いて成体細胞をプログラミングするための組成物および方法 |
| JP2019201631A (ja) * | 2018-01-26 | 2019-11-28 | アシュラフ, ムハンマドASHRAF, Muhammad | 治療用微小胞と幹細胞の合成 |
| WO2020166700A1 (ja) * | 2019-02-15 | 2020-08-20 | テルモ株式会社 | 血小板溶解物の製造方法、製造システム及びバッグセット |
-
2021
- 2021-11-04 WO PCT/JP2021/040669 patent/WO2023079655A1/ja unknown
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018522071A (ja) * | 2015-07-31 | 2018-08-09 | エクソシューティカルズ インコーポレイテッドＥｘｏｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | エキソソーム組成物ならびに調製方法ならびに皮膚および毛髪の調節および調整のためのその使用 |
| JP2017171597A (ja) * | 2016-03-22 | 2017-09-28 | 株式会社細胞応用技術研究所 | 血小板濃縮製剤の製造方法 |
| JP2019517488A (ja) * | 2016-06-08 | 2019-06-24 | リザート ファーマ ゲーエムベーハー（リザートファーマ）Ｌｙｓａｔ Ｐｈａｒｍａ Ｇｍｂｈ（Ｌｙｓａｔｐｈａｒｍａ） | 医学に使用するためのヒト血小板溶解物由来細胞外小胞 |
| JP2019530438A (ja) * | 2016-08-29 | 2019-10-24 | ハッケンサック ユニヴァーシティ メディカル センター | 血小板様細胞を含有する血液の血小板に富む画分を用いて成体細胞をプログラミングするための組成物および方法 |
| JP2019201631A (ja) * | 2018-01-26 | 2019-11-28 | アシュラフ, ムハンマドASHRAF, Muhammad | 治療用微小胞と幹細胞の合成 |
| WO2019198077A1 (en) * | 2018-04-10 | 2019-10-17 | Brainstorm Cell Therapeutics Ltd. | Cell-type specific exosomes and use thereof |
| WO2020166700A1 (ja) * | 2019-02-15 | 2020-08-20 | テルモ株式会社 | 血小板溶解物の製造方法、製造システム及びバッグセット |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108671224B (zh) | 血小板裂解物的组合物、用途和制备 | |
| CN107988153A (zh) | 人脐带血间充质干细胞源分离外泌体的方法和使用的试剂 | |
| CN113583951A (zh) | 通过超声空化从脂肪组织分离干细胞及使用方法 | |
| JP6649257B2 (ja) | 濃厚血小板から誘導可能な生理活性組成物並びにその調製方法及び使用方法 | |
| JP3218433U (ja) | 間質血管画分を分離するための機械装置 | |
| US9687511B2 (en) | Acellular biologic composition and method of manufacture | |
| CN114591905B (zh) | 一种人红细胞制备凋亡囊泡的方法与应用 | |
| CN114729317A (zh) | 脐带血血浆制品、组织和细胞外泌体的分离方法，其组合物及使用方法 | |
| CN107114357A (zh) | 一种牙周膜干细胞的冻存液及其冻存方法 | |
| US20200360445A1 (en) | Acellular biologic composition and method of manufacture | |
| US20040152190A1 (en) | Method of separating and concentrating cells for kidney regfneration | |
| US20220008475A1 (en) | Methods for preparing platelet releasate | |
| WO2023079655A1 (ja) | エクソソーム抽出方法 | |
| KR20120002530A (ko) | 활성화된 백혈구 조성물 | |
| EP3271454B1 (en) | System and method for providing isolated concentrated multipotent stromal cells for administration | |
| CN108143751B (zh) | 雄蚕蛾外泌体的制备方法及其应用 | |
| WO2021011779A2 (en) | Mesenchymal stem cell compositions | |
| CN113133443A (zh) | 一种脂肪组织保护液及其应用 | |
| US11253548B1 (en) | Method of producing the constituents of a therapeutic product from mammalian cells | |
| CN117660314A (zh) | 一种用于体外提取细胞线粒体的试剂盒和方法 | |
| US20160130557A1 (en) | Formulations Containing and Kit for Using Adipose-Derived Stem Cells and Use Thereof | |
| Mao et al. | Advances in the study of plant-derived extracellular vesicles in the skeletal muscle system | |
| KR20240052103A (ko) | 편도 유래 중간엽 줄기세포 제조 방법 | |
| CN117736981A (zh) | 大熊猫精液冷冻保护添加剂外泌体的制备方法 | |
| CN1570088A (zh) | 神经细胞提取物及其在间充质干细胞诱导分化中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 21963251 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2023557517 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |