JP2019530438A - 血小板様細胞を含有する血液の血小板に富む画分を用いて成体細胞をプログラミングするための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年6月15日に出願された米国仮特許出願第62/520,241号、および2016年8月29日に出願された米国仮特許出願第62/380,913号の優先権の利益を主張し、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
記載される発明は、一般的には、機能的に改変された成体単核細胞を生成、単離および使用する方法に関する。記載される発明はまた、成体末梢血に由来するインスリン産生細胞を生成、単離、および使用する方法にも関する。
組織工学および再生医療における適用のための幹細胞操作は、かなりの注目を集めてきた。
胚性幹細胞(EmSC)は、多能性である胚に由来する幹細胞である、すなわち、それらはin vitroで、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞型に分化することができる。胚性幹(ES)細胞は、その高い自己再生能力およびその多能性の分化能力のため魅力的であるが、倫理的な問題がその利用性および実用的な有用性を制限してきた。
骨髄は、造血細胞(成熟血液細胞の前駆体)および間質細胞(様々な結合組織細胞の前駆体)を含む様々な前駆体および成熟細胞型からなり、それらは両方とも他の細胞型に分化することができると考えられる。Wang, J. S. et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 122: 699-705 (2001);Tomita, S. et al., Circulation 100 (Suppl. II): 247-256 (1999);Saito, T. et al., Tissue Eng. 1: 327-43 (1995)。
造血幹細胞によってのみ発現される単一の細胞表面マーカーは存在しないが、ヒトHSCが以下の抗原性プロファイル:CD34+、CD59+、Thy1+(CD90)、CD38low/−、C−kit−/lowおよびlin−を有することは一般的に受け入れられている。CD45はまた、CD45−である血小板および赤血球を除いて、HSCの一般的なマーカーでもある。HSCは、赤血球、好中球、好塩基球、好酸球、血小板、肥満細胞、単球、組織マクロファージ、破骨細胞、Tリンパ球、およびBリンパ球などの様々な細胞型を生成することができる。造血幹細胞の調節は、自己再生、生存および増殖、分化系列決定および分化を含む複雑なプロセスであり、固有の細胞プログラミングを含む多様な機構ならびに微小環境間質との接着相互作用およびサイトカインの作用などの外部刺激によって調整される。
動員および帰巣は、ケモカイン、ケモカイン受容体、細胞内シグナリング、接着分子およびプロテアーゼの間の相互作用に依存するミラープロセスである。骨髄への帰巣は、細胞生着を最適化するのに必須である。SDF−1/CXCL12と、その受容体CXCR4との相互作用は、骨髄内のHSCを保持するのに重要である(Suarez-Alvarez, B. et al, "mobilization and homing of hematopoietic stem cells," Adv. Exp. Med. Biol. 2012; 741: 152-70)。
胚性分子マーカーを発現する幹細胞は、造血細胞の除去(全ての白血球共通抗原CD45陽性細胞の欠失を含む)後の臍帯血から報告されている(McGuckin, CP, et al, "Production of stem cells with embryonic characteristics from human umbilical cord blood," Cell Prolif. 2005; 38: 245-55)。しかしながら、臍帯血中のこの細胞集団の不足は、その実際の適用を大きく制限する。
誘導多能性幹細胞再プログラミングは、3つの段階:初期化、成熟、および安定化からなる。Hawkins, K. et al, "Cell signalling pathways underlying iPSc reprogramming," World J. Stem Cells 2014; 6(5): 620-28、Samavarchi-Tehrani et al (36)を引用。
安定化段階は、トランスジーンの独立性を特徴とする;したがって、活性化された内因性多能性遺伝子発現を有する細胞のみが、この後期段階で多能性を維持することができる。
大きい(直径50〜100μm)多核性(最大128N)巨核細胞(MK)から生成される無核の円盤状の細胞断片である血小板(トロンボサイト)は、恒常性(血管傷害の部位での失血の停止を意味する)および血管修復において中心的な役割を果たしている。Principles of Tissue Engineering, 4th Ed., Robert Lanza, Robert Langer, Joseph Vacanti, Eds, Elsevier, Inc.: New York, 2014 at 1047-1048。それらは、末梢血中で約3x1011細胞/リットルを占める、すなわち、RBCのものに次いで2番目である。血小板の生存期間は短く、循環中で7〜9日しか続かない。
一次恒常性は、血小板接着および同時的血小板活性化、近隣の血小板を活性化するための血小板分泌、血小板凝集、ならびに最終的には、血小板血栓の形成および凝固因子複合体の集合に適する表面の生成をもたらす受容体/リガンド相互作用の相乗的ネットワークによって達成される。Haley, KM et al, "Neonatal platelets: mediators of primary hemostasis in the developing hemostatic system," Pediatr. Res. 2014; 76(3): 230-37。
血小板接着。血管傷害および付随する内皮損傷の後、一次恒常性のプロセスを開始させる血小板接着は、段階的様式での受容体/リガンド相互作用によって媒介される。同上。細胞外フォン・ヴィレブランド因子(VWF)−血小板糖タンパク質(GP)Ib結合は、傷害を受けた領域への初期血小板動員を媒介する。同上。血小板GPVIは、線維状コラーゲンと相互作用し、血小板β1インテグリンは、ラミニン、コラーゲンおよびフィブロネクチンと相互作用し、露出した細胞外マトリックスへの血小板の堅い接着を可能にする。同上。
血小板凝集。安定な血小板凝集体の発生のための重要なステップは、GPIIb/IIIa受容体の、その高親和性コンフォメーションへの転換である。同上。これは、受容体と、フィブリノゲン、VWF、およびフィブロネクチンとの安定な相互作用を可能にする。血小板は一緒に凝集し、一次恒常性の最終産物である血小板血栓を形成する。
活性化前に血小板表面上に出現するマーカー。活性化前に血小板表面上に出現する血小板表面マーカーとしては、CD41(GPIIb/IIIa)、CD42a(GPIX)、CD42b(GPIb)、およびCD61(avb3、ビトロネクチン受容体)が挙げられる。
インテグリンアルファ鎖2b(CD41)は、ジスルフィド結合により連結される2個のポリペプチド鎖をもたらす翻訳後改変を受けるヘテロ二量体内在性膜タンパク質である。CD41は、血小板および巨核球ならびに初期胚性造血幹細胞上に発現される。ベータ3鎖(CD61)インテグリンαIIIbβ3と会合したインテグリンアルファ鎖によって形成されるCD41/CD61複合体は、フィブロネクチン、フィブリノゲン、フォン・ヴィレブランド因子、ビトロネクチンおよびトロンボスポンジンのための受容体であり、凝固において重要な役割を果たしている。GPIIb/IIIa受容体(インテグリンαIIbβ3)は、総表面タンパク質の約15%を占める、最も豊富な細胞表面受容体(血小板1個あたり約80000個)[Wagner CL, Mascelli MA, Neblock DS, Weisman HF, Coller BS, Jordan RE. Analysis of GPIIb/IIIa receptor number by quantitation of 7E3 binding to human platelets. Blood. 1996;88:907-914]の1つである[Jennings, LK, Phillips, DR, "Purification of glycoproteins IIb and III from human platelet plasma membranes and characterization of a calcium-dependent glycoprotein IIb-III complex. J Biol Chem. 1982;257:10458-10466]。休止中の血小板上で、この受容体はフォン・ヴィレブランド因子および血漿フィブリノゲンに対する最小限の結合親和性を示す[French, DL, Seligsohn, U, "Platelet Glycoprotein IIb/IIIa receptors and Glanzmann's throbasthenia," Arteriosclerosis, thrombosis and Vascular Biology 2000: 20: 607-610]。
CD42a−d複合体は、フォン・ヴィレブランド因子およびトロンビンのための受容体である。CD42aは、血小板糖タンパク質GPIX、GP9aとも呼ばれる。CD42bは、血小板GPIbアルファ、または糖タンパク質1b−アルファとも呼ばれる。
活性化中の血小板表面上に出現するマーカー。活性化中の血小板表面上に出現するマーカーの例としては、活性化されたIIb/IIIa、CD62P(P−セレクチン)、CD31(PECAM)およびCD63が挙げられる。
リソソーム活性化膜タンパク質(CD63)は、インテグリンと複合体を形成することが知られる細胞表面糖タンパク質である。それは、血液血小板活性化マーカーとして機能し得る。
血小板表面P−セレクチン(CD62P)は、α顆粒分泌後の血小板表面膜上でのみ発現される休止血小板のα顆粒膜の成分である。
血小板の前駆体である巨核球(MK)は、血液系に対する血小板の定常的な供給源を提供し、それ自身、巨核球産生のプロセスによって産生される。RBCに関しては、MKは、造血幹細胞(HSC)の一般的な骨髄始原細胞(CMP)への初期分化によって生成される(Kaushansky, K., "Historical Review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis," Blood 2008; 111(3): 981-86)。CMPの巨核球系列への進行的系列決定は、トロンボポエチン(TPO)によって主に調節される。系列決定された巨核球始原細胞であるコロニー形成単位−巨核球(CFU−MK)は、増殖し、巨核球に分化する。同上。巨核球の成熟は、細胞表面マーカーGPIIb/IIIa(CD41またはαIIb/βIIIインテグリン受容体としても知られる)およびGPIb/GPIX/GPV受容体の発現の増加、ならびにα顆粒、濃密体、ならびにフォン・ヴィレブランド因子(vWF)および血小板因子−4のような血小板関連タンパク質の細胞質ゾル蓄積をもたらす細胞質量の実質的な増加を含む。同上。数回の核内分裂は、倍数化および最大128NのDNA含量を有する細胞をもたらす。同上。一度、倍数体MKが産生されたら、「プロト血小板」と呼ばれるMK体上での細胞プロセスが出現し始め、その最終的な断片化および放出は血小板の生成をもたらす。同上。
巨核球のみを含有する2つのコロニー形態が、半固形培地中で記載されている[Kaushansky, K., "Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis, Blood 2001; 111(3): 981-86]。コロニー形成単位−巨核球(CFU−MK)は、3〜50個の成熟巨核球を含有する単純なコロニーに発達する細胞である;巨核球のサテライト集団を含み、最大で数百個の細胞を含有するより大きく、より複雑なコロニーは、バースト形成単位−巨核球(BFU−MK)に由来する。同上。その増殖能力の差異のため、および赤血球始原細胞との類似性により、BFU−MKおよびCFU−MKは、それぞれ、系列に限定される原始および成熟始原細胞であると考えられる。同上。その赤血球対応物と同様、CFU−MKに関するサイトカイン要件は単純である;トロンボポエチンは全てのCFU−MKの75%の増殖を刺激し、残りに関してはインターロイキン(IL)−3がトロンボポエチンと共に必要とされる。原始始原細胞からのより複雑で、より大きいMKコロニー形成に関しては、IL−3またはスチール因子(SF)がトロンボポエチンと共に必要とされる。
血小板産生は、トロンボサイト(血小板)の形成のプロセスである。分子レベルで、血小板産生は、膜および微小管の洗練された再編成ならびに顆粒およびオルガネラの正確な分布を含む、高度に協調的なプロセスである。血小板は、膜、オルガネラ、顆粒、および可溶性高分子のほぼ全ての細胞質補体を消費するプロセスにおける、前血小板と呼ばれる成熟巨核球膜仮足突起の断片化によって形成する(Kaushansky引用Patel SR, Hartwig JH, Italiano JE., Jr The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 2005;115:3348-3354)。それぞれの巨核球は、残りの核材料がマクロファージ媒介性食作用によって除去される(同上、Radley JM, Haller CJ. Fate of senescent megakaryocytes in the bone marrow. Br J Haematol. 1983;53:277-287を引用)前に、1000〜3000個の血小板を生じると見積もられている(同上、Stenberg PE, Levin J. Mechanisms of platelet production. Blood Cells. 1989;15:23-47を引用)。このプロセスは、プロセスの末端が分岐し、血小板を生じる高度に活発な運動プロセスの間に、アクチンおよびチューブリンを含む、巨核球膜および細胞骨格成分の大規模な再編成を含む(同上、Italiano JE, Jr, Lecine P, Shivdasani RA, Hartwig JH. Blood platelets are assembled principally at the ends of proplatelet processes produced by differentiated megakaryocytes. J Cell Biol. 1999;147:1299-1312を引用)。局所的アポトーシスは、アクチン細胞骨格の制約から前血小板プロセスの発生を潜在的に可能にすることによって、血小板形成の最終段階を開始させる役割を果たし得る(同上、Li J, Kuter DJ. The end is just the beginning: megakaryocyte apoptosis and platelet release. Int J Hematol. 2001;74:365-374;De Botton S, Sabri S, Daugas E, et al. Platelet formation is the consequence of caspase activation within megakaryocytes. Blood. 2002;100:1310-1317を引用)。前血小板成熟の最終段階中に、細胞質オルガネラおよび分泌顆粒は、前血小板プロセスの遠位端に移動し、そこで捕捉される(同上、Richardson JL, Shivdasani RA, Boers C, Hartwig JH, Italiano JE., Jr Mechanisms of organelle transport and capture along proplatelets during platelet production. Blood. 2005;106:4066-4075を引用)。互いの上を滑る微小管は、前血小板プロセスの伸長およびオルガネラ輸送を誘導するエンジンである(同上、Patel SR, Richardson JL, Schulze H, et al. Differential roles of microtubule assembly and sliding in proplatelet formation by megakaryocytes. Blood. 2005;106:4076-4085を引用)。トロンボポエチンは血小板産生の主な調節因子であるが、これらの遺伝子のそれぞれにおける欠陥は異常に大きいか、または小さい血小板をもたらすため、成熟血小板のサイズを決定するもの、または血小板形成の機構が転写因子GATA1、糖タンパク質Ib/IX複合体、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質(WASP)、および血小板ミオシンによってどのように影響されるかに関してはほとんど知られていない(同上、Geddis AE, Kaushansky K. Inherited thrombocytopenias: toward a molecular understanding of disorders of platelet production. Curr Opin Pediatr. 2004;16:15-22を引用)。血小板が生じる完全に成熟した巨核球の生成にとってトロンボポエチンが重要であるにもかかわらず、血小板形成の最終段階でのサイトカインの除去は有害ではない(同上、Choi ES, Nichol JL, Hokom MM, Hornkohl AC, Hunt P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 1995;85:402-413を引用)。
2つの型の臍帯幹細胞、すなわち、造血幹細胞(UC−HS)および間葉系幹細胞を見出すことができ、順に、臍帯血(UC−MS)またはホウォートンゼリー(UC−MM)中に見出すことができる。
臍帯(UC)血管および周囲の間葉(ホウォートンゼリーとして知られる結合組織を含む)は、胚性および/または胚外中胚葉に由来する。かくして、これらの組織、ならびに原始胚細胞は、MSCおよび多能性を有するさらに一部の細胞を含有する、胚の原線の形成の時点で、近位胚盤葉上層から分化する。UCマトリックス材料は、成体骨髄間葉に向かう遷移状態にある、原始的間葉に由来すると推測される(Mihu, C. et al., 2008, Romanian Journal of Morphology and Embryology, 2008, 49(4):441-446)。
ヒト臍帯血(HUCB)は、バースト形成単位および顆粒球−マクロファージコロニー形成単位のための標準的なクローン形成法において測定されるように、造血始原細胞に富む(Broxmeyer, HE et al, "Human umbilical cord blood as a potential source of transplantable hemopoietic stem/progenitor cells," Proc. Natl Acad. Sci. USA (1989) 86: 3828-3719を引用する、Cicuttini, FM and Boyd AW, "Hematopoietic and lymphoid progenitor cells in human umbilical cord blood," Devel. Immunol. 4: 1-11 (1994))。
ヒト臍帯血は、成体末梢血と比較してプレBおよびB細胞について富化されることが示されている。同上。プレB細胞の平均頻度は、成体血液中の0.2%と比較して、臍帯血中では総リンパ球の0.7%であることが示されている(同上、Okino, F, "Pre-B cells and B lymphocytes in human cord blood and adult peripheral blood," Acta Paediatr. Jpn (1987): 29: 195-201を引用)。臍帯血中のBリンパ球の平均相対頻度もまたより高く、成体血液中の5.4%と比較して総リンパ球の11.4%である(同上)。プレB細胞の絶対数に関して、臍帯血は成体血液中の10倍の数を含有する。同上。
一般に、臍帯血T細胞は、ヘルパー活性を相対的に有さない(同上、Anderson, U et al., Evidence for the ontogenic precedence of suppressor T cell functions in the human neonate," Eur. Immunol. 1983; 13: 6-13を引用)。CD2(全ての末梢血T細胞上で発現されるヒトTリンパ球系列の表面抗原)、CD3(Tリンパ球マーカー)およびCD8(サプレッサーおよび細胞傷害活性を有するT細胞のためのマーカー)を発現するリンパ球のパーセンテージは、成体血液中よりも臍帯血中で低い。同上。しかしながら、臍帯血中での白血球数の増加のため、CD2+およびCD8+細胞の絶対数は同等である(同上、Gerli, R et al, Activation of cord T lymphocytes. I. Evidence for a defective T cell mitogens through the CD molecule," J. Immunol. 1989; 142: 2583-89を引用)。対照的に、臍帯血および成体末梢血中のCD4+細胞(ヘルパー/誘導T細胞)のパーセンテージは類似しているが、CD4+細胞の絶対数は臍帯血中でより高い。同上。それにもかかわらず、臍帯血CD4+細胞は、抗体産生のための助けを提供するその能力に欠陥がある。同上。
ヒトナチュラルキラー(NK)細胞を、表面マーカーCD16およびCD56の相対的発現に基づいて異なる集団に細分することができる(Poli, A. et al, "CD56bright natural killer (NK) cells: an important NK cell subset," Immunol. 2009 Apr; 126(4): 458-65)。臍帯血NK細胞は異種性である。NKマーカーCD57+を担持する細胞は臍帯血中で無視できるほどのものである(Abo, T et al, "Post natal expansion of the natural killer and killer cell population in humans identified by the monoclonal HNK-1 antibody," J. Exp. Med. 1982; 155: 321-26を引用する、Cicuttini, FM and Boyd AW, "Hematopoietic and lymphoid progenitor cells in human umbilical cord blood," Devel. Immunol. 4: 1-11 (1994))が、CD16+リンパ球の割合は、成体末梢血のものと等しい(同上、Tarakkanan, J and Saksela, E, "Umbilical cord blood-derived suppressor cells of the human natural killer cell activity are inhibited by interferon," Scand. J. Immunol. 1982; 15: 149-57;Perussia, B et al., "Human natural killer cells analyzed by B73.1, a monoclonal antibody blocking Fcreceptor function. I. Characterization of the lymphocyte subset reactive with B73.1," J. Immunol. 1983; 130: 2133-41を引用)。臍帯血細胞の自発的NK活性は、成体と比較して顕著に低下している。同上。CD7+NK+およびCD7+NK−集団は、ヒト臍帯血中のNK細胞前駆体間で発生過程を表し、CD7+NK−細胞は、臍帯血中で最も未熟なNK前駆細胞のための候補であると考えられる。同上
造血幹細胞は、全ての血液細胞の共通の祖先である。造血幹細胞成熟は、造血細胞の2つの主要な分岐であるリンパ球および骨髄細胞系列の多様化を含む(Kondo, M. "Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors," Immunol. Rev. 2010 Nov; 238(1): 37-46)。リンパ球系細胞は、T、B、およびナチュラルキラー(NK)細胞を含む。骨髄細胞系列は、巨核球および赤血球(MegE)ならびに骨髄細胞系列に属する、様々なサブセットの顆粒球(好中球、好酸球および好塩基球)、単球、マクロファージ、および肥満細胞(GM)を含む(同上、Kondo M, et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 2003;21:759-806、Weissman IL. Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: barriers and opportunities. Science (New York, NY. 2000 Feb 25;287(5457):1442-6を引用;また、Iwaskaki, H. and Akashi, K. "Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell,", Immunity 26(6) June 2007, 726-40も参照)。
CMPは、巨核球−赤血球(MegE)始原細胞および顆粒球−単球(GM)始原細胞に増殖および分化し、さらに、巨核球、赤血球、顆粒球、単球その他を生じることができる(Iwasaki H, Akashi K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 2007;26:726-740)。
ヒトコロニー形成性共通骨髄始原細胞(CMP)およびその下流の子孫である顆粒球/マクロファージ(GMP)および巨核球/赤血球始原細胞(MEP)は、成体骨髄の系列陰性(lin−)CD34+CD38+画分ならびに臍帯血中に存在する。それらは、初期に作用する造血サイトカインの受容体であるIL−3Rα鎖、およびサイトカインシグナリングの負の調節に関与するホスホチロシンホスファターゼのアイソフォームであるCD45RAの発現によって識別可能である(Manz, MG, et al, "Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors," Proc. Natl Acad. Sci. U.S. 2002 99(18): 11872-11877)。
顆粒球コロニー刺激因子受容体、C/EBPε、およびMPOは、GMPによって発現され、MEPによって発現されなかったが、GATA−1、EpoR、c−mpl、β−グロビン、およびフォン・ヴィレブランド因子はMEP中では検出されたが、GMP中では検出されなかった。骨髄始原細胞はいずれも、リンパ球に系列決定されたlin−CD34+CD38+CD10+始原細胞中で発現されたTdT、GATA−3、プレTα、IL−7Rα、およびPax−5として、リンパ球発生において関連する検出可能なレベルの遺伝子を発現しなかった(Manz, MG, et al, "Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors," Proc. Natl Acad. Sci. U.S. 2002 99(18): 11872-11877)。
Runx1、Gata1、Fli1およびcMybを含む、複数の転写因子は、巨核球の分化を、正と負の両方で調節する複雑なネットワークを形成する(Geddis, A.E., "Megakaryopoiesis," Semin. Hematol. 2010; 47(3): 212-219)。Runx1は、Gata1およびFli1を含むさらなる巨核球因子と相互作用する。Gata1およびそのコファクター、Gata1の仲間(Fog1)は、巨核球−赤血球分化の促進において重要であるが、同時に、Pu.1の発現および骨髄分化を阻害する(同上、Nerlov, C. et al, "GATA-1 interacts with the myeloid PU.1 transcription factor and represses PU.1-dependent transcription," Blood 2000; 95: 2543-51;Chou ST et al, "Graded repression of PU.1/SfpiI gene transcription by GATA factors regulates hematopoietic cell fate," Blood 2009; 114: 983-94を引用)。Gata1およびFlli1のための結合部位を、多くの巨核球特異的遺伝子のエンハンサー中に見出すことができ(同上、Eisbacher, M. et al, "Protein-protein interaction between Fli-1 and GATA-1 mediates synergistic expression of megakaryocyte-specific genes through cooperative DNA binding," Mol. Cell Biol. 2003; 23: 3427-41を引用)、Fli1は巨核球プロモーターでGata1の活性を増強し、赤血球プロモーターで赤血球因子の活性を抑制する。かくして、Fli1発現は、MEPを巨核球系列に限定するように作用することができる。対照的に、MEM中の癌原遺伝子c−Mybの発現は、赤血球産生を好み、c−Myb発現は巨核球産生の間に下方調節される(Metcalf, D et al, "Anamaloous megakaryocytopoiesis in mice with mutations in the c-Myb gene," Blood 2005; 105: 3480-87)。
臍帯血由来巨核球の複数の異なる細胞集団がフローサイトメトリーによって観察されており、同様の集団は巨核球Meg−01細胞株においても観察された(Lindsay, C. et al, 2015; Blood 126(23): 4754)。最も大きい細胞(P1と呼ばれる)が最も豊富であり、培養物中で3日目に細胞のほぼ100%を占めていた。P1よりも小さく、より顆粒状であるP2細胞は、6日目に出現し、13日目までに全体の約50%であった。P3は6日目に出現し、最も小さく、そのサイズおよび顆粒性は血小板と大まかに類似していた;13日目までに、これらの細胞は全体の約30%であった。P2でもP3でもないP1は、培養物中で13日かけてCD61/CD41/CD42陽性およびCD34陰性になった。P2およびP3細胞の、それぞれ97%および93%が、ホスファチジルセリン(PS)陽性であったが、P1細胞の93%がPS陰性であった。PS陰性(P1)細胞は、電子顕微鏡により、大きいサイズ、ポリープ状核、ミトコンドリアおよび未熟顆粒などの、骨髄巨核球の多くの典型的な特徴を示したが、境界膜系はあまり発生していなかった。実質的に全てのPS陽性P2細胞がアポトーシス性であり、顆粒を欠き、識別できる核を有さなかった。P1はP2およびP3集団の両方を生じるが、P2は他の集団を生じないことがわかった。コラーゲン関連ペプチド、トロンビン、プロテアーゼ活性化受容体1活性化ペプチド(PAR1−AP)およびPAR4−APを用いるP1、P2およびP3集団の刺激は、P1細胞中での強力なインテグリン活性化を示したが、P2またはP3細胞中では示さなかった。かくして、ほんの一部の臍帯血由来巨核球が機能的である。
増殖因子は、増殖、分化、または他の細胞応答を誘導する、細胞内シグナリング経路を誘発する細胞表面受容体に結合する細胞外ポリペプチド分子である。これらの経路は、タンパク質および他の高分子の蓄積を刺激し、それらは、その合成速度を増大させることと、その分解速度を低下させることの両方によってそうする。
複数の増殖因子が巨核球産生を支援し、その最も重要なものは、トロンボポエチン(TPO)としても知られる、巨核球増殖および発生因子(MGDF)である。巨核球発生および血小板産生の主要な調節因子であり、血小板産生の強力な刺激因子であるトロンボポエチンは、Mpl受容体のリガンドである(Muench, M. and Barcena, A., "Megakaryocyte Growth and Development Factor is a Potent Growth Factor for Primitive Hematopoietic Progenitors in the Human Fetus," Ped. Res. 2004; 55(6): 1050-56)。それは、in vitroとin vivoの両方で、巨核球産生および巨核球倍数性の増加を刺激することができ、造血に対する広範囲の活性を有し(同上、Kaushansky, K. "Thrombopoietin: the primary regulator of platelet production," 1995; Blood 86: 419-311, 2; Kuter, DJ et al, 2002 Blood; 100: 3457-69を引用)、多能性造血始原細胞および幹細胞の増殖を支援する(同上)。
TGF−βファミリーメンバーである骨形成タンパク質(BMP)は、マウス足における発生中の指の間の組織を除去するアポトーシスを誘発するのを助ける。TGF−βと同様、BMPは細胞死を調節する遺伝子の転写の変化を刺激する。
線維芽細胞増殖因子(FGF)ファミリーは現在、12種を超える構造的に関連するメンバーを有する。FGF1は、酸性FGFとしても公知である;FGF2は塩基性FGF(bFGF)と呼ばれることもある;FGF7は、ケラチノサイト増殖因子の名称で通ることもある。12種を超える異なるFGF遺伝子が、脊椎動物において公知である;それらは異なる組織においてそのRNAスプライシングまたは開始コドンを変化させることによって数百個のタンパク質アイソフォームを生成することができる。FGFは、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)と呼ばれる受容体チロシンキナーゼのセットを活性化することができる。受容体チロシンキナーゼは、細胞膜を通って伸長するタンパク質である。パラクリン因子に結合するタンパク質の部分は細胞外側にあるが、休眠チロシンキナーゼ(すなわち、ATPを分割することによって別のタンパク質をリン酸化することができるタンパク質)は細胞内側にある。FGF受容体がFGFに結合する場合(およびそれがFGFに結合する場合のみ)、休眠キナーゼは活性化され、応答する細胞内のある特定のタンパク質をリン酸化し、これらのタンパク質を活性化する。
FGFは、血管新生(血管形成)、中胚葉形成、および軸索伸長などのいくつかの発生機能と関連する。FGFは互いに置き換わってもよいことが多いが、その発現パターンは、それらに別々の機能を与える。FGF2は血管新生において特に重要であるが、FGF8は中脳および手足の発生に関与する。
VEGF、IGF、PDGF、HGF、FGF、TGFm、アンギオポエチン−1、および幹細胞因子(SCF)などの血管形成因子の発現レベルは、骨由来、軟骨由来、および脂肪細胞由来MSCの中でも異なることがわかっている(Peng et al., 2008, Stems Cells and Development, 17: 761-774)。
インスリンと分子構造が似ているホルモンであるIGF−1は、体内のほぼ全ての細胞、特に、骨格筋、軟骨、骨、肝臓、腎臓、神経、皮膚、造血細胞、および肺に対する増殖促進効果を有する。それは、小児の成長において重要な役割を有し、成体において同化効果を継続的に有する。IGF−1は、主に内分泌ホルモンとして肝臓によって、ならびにパラクリン/オートクリン様式で標的組織中で産生される。産生は、増殖ホルモン(GH)によって刺激され、低栄養、増殖ホルモン不感受性、増殖ホルモン受容体の欠如、またはSHP2およびSTAT5Bを含む下流のシグナリング分子の不具合によって遅延され得る。その主な作用は、多くの組織の多くの細胞型上に存在する、その特定の受容体であるインスリン様増殖因子1受容体(IGF1R)に結合することによって媒介される。受容体チロシンキナーゼであるIGF1Rへの結合は、細胞内シグナリングを開始させる;IGF−1は、AKTシグナリング経路の最も強力な天然の活性化因子の1つであり、細胞の成長および増殖の刺激因子であり、プログラム細胞死の強力な阻害剤である。IGF−1は、増殖ホルモン(GH)の効果の主要なメディエータである。増殖ホルモンは、下垂体中で作られ、血流に放出された後、IGF−1を産生するように肝臓を刺激する。次いで、IGF−1は、全身の成長を刺激する。そのインスリン様効果に加えて、IGF−1はまた、特に、神経細胞中での細胞の増殖および発生、ならびに細胞DNA合成を調節することができる。
TGF−βスーパーファミリーの30種を超える構造的に関連するメンバーが存在し、それらは発生中に最も重要な相互作用の一部を調節する。TGF−βスーパーファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質は、カルボキシ末端領域が成熟ペプチドを含有するようにプロセッシングされる。これらのペプチドはホモ二量体(それ自身と)またはヘテロ二量体(他のTGF−βペプチドと)に二量体化し、細胞から分泌される。TGF−βスーパーファミリーは、TGF−βファミリー、アクチビンファミリー、骨形成タンパク質(BMP)、Vg−1ファミリー、ならびにグリア由来神経栄養因子(GDNF、腎臓および腸ニューロン分化にとって必要である)および哺乳動物の性別決定に関与するミュラー管抑制因子などの他のタンパク質を含む。TGF−βファミリーメンバーであるTGFβ1、2、3および5は、細胞間での細胞外マトリックスの形成の調節および細胞分裂の調節(正と負の両方)において重要である。TGF−β1は、コラーゲンおよびフィブロネクチン合成を刺激すること、およびマトリックス分解を阻害することの両方によって、細胞外マトリックス上皮細胞の量を増加させる。TGF−βは、上皮が分岐して腎臓、肺、および唾液腺の管を形成することができる場所および時を制御する際に重要であり得る。
BMPファミリーのメンバーは元々、骨形成を誘導するその能力によって発見された。しかしながら、骨形成は、それらの多くの機能の1つに過ぎず、それらは細胞分裂、アポトーシス(プログラム細胞死)、細胞移動、および分化を調節することが見出された。BMPを、成熟ポリペプチド中に9個というよりはむしろ7個の保存されたシステインを有することによってTGF−βスーパーファミリーの他のメンバーと区別することができる。BMPは、Nodal(左右軸形成を担う)およびBMP4(神経管極性、眼の発達、および細胞死において重要である)などのタンパク質を含む。
BMP4はSCFと協働して、他のサイトカインの非存在下でも原始造血幹細胞コンパートメントをモジュレートすることが示されている。同上。
巨核球産生の調節因子として関与する他の因子としては、P13K/PTENシグナリングの刺激因子である血小板内皮凝集受容体(PEAR−1)(Kauskot, A. et al, "PEAR1 attenuates megakaryopoiesis via control of the P13K/PTEN pathway," Blood. 2013; 121: 5208-17を引用する、Smith, BW, and Murphy, GJ, "Stem cells, megakaryocytes, and platelets," Curr. Opin. Hematol. 2014; 21(5): 430-37)およびmTOR阻害剤であるRAD001(同上、Su-Y-C et al, "RAD001-mediated STAT3 upregulation and megakaryocytic differentiation," Thromb. Haemost. 2013; 109: 540-49を引用)が挙げられる。Wnt3aは、CD41/CD235二重陽性始原細胞の産生を引き起こすin vitroでのiPSC誘導系におけるヒト巨核球始原細胞増殖のリプレッサーとして関与している(同上、Paluru, P. et al, "The negative impact of Wnt signaling on megakaryocyte and primitive erythroid progenitors derived from hyman embryonic stem cells," Stem Cell Res. 2014; 12: 441-51を引用)。iPSCに基づくin vitroでの巨核球産生の調節におけるアリール炭化水素受容体(AHR)の役割(同上、Smith, BW et al, "The aryl hydrocarbon receptor directs hematopoietic progenitor cell expansion and differentiation," Blood. 2013; 122: 376-85を引用)が記載されている。
血小板は、恒常性および凝固における明確に記載された生理学的役割を有するが、最近では、それらは免疫、組織修復および発生に関与することも示されている(Elzey BD, et al., The emerging role of platelets in adaptive immunity. Cell Immunol. 2005; 238:1-9;Jenne CN et al., Platelets: bridging hemostasis, inflammation, and immunity. Int J Lab Hematol. 2013;35:254-61;Bertozzi CC et al., Platelets regulate lymphatic vascular development through CLEC-2-SLP-76 signaling. Blood. 2010;116:661-70)。血小板由来細胞外ベシクル(EV)は、これらの多様な機能を指揮するのに必要な分子を提供することができる。血小板は、形質膜に由来するマイクロベシクルまたはマイクロパーティクル(MP)、およびエンドソーム経路に由来するエキソソーム(EXO)を生成することができる(Aatonen MT et al., Isolation and characterization of platelet-derived extracellular vesicles, J. Extracellular Vesicles, vol. 3 (2014) 24692)。
血小板は、活性化依存的様式でタンパク質に翻訳されるRNA分子、例えば、PMPプロテオームの全メンバーであるCD41、CD61、およびIL−1β33を担持する。血小板トランスレートームのアゴニスト依存的変化が、PMP種の分子的、またはさらには機能的な差異の基礎にあり得ることが提唱されている(Aatonen et al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis Vol. 38, No. 1 (2012))。
本発明者らの以前の研究において、本発明者らは、多能性細胞の特徴を示す、末梢血幹細胞(PB−SC)と命名された、ヒト成人末梢血から単離された胚様幹細胞を同定した。これらの細胞は、それらを幹細胞に基づく療法における使用にとって好適なものにする他の細胞型への増殖および分化の能力を有することが示された。胚性幹細胞の特徴および造血細胞の特徴を示すこれらの細胞は、リンパ球、マクロファージ、単球、および造血幹細胞とは表現型が異なる。
記載される発明は、患者に導入した場合に安定であり得るウイルスまたは薬物誘導性形質導入による誘導多能性幹細胞の生成に関与する安全性の懸念なく成体単核細胞から誘導多能性幹細胞を生成するために使用することができる臍帯血由来血小板様細胞を提供する。
用語「アルファ細胞」または「α細胞」は、血糖値が低すぎる場合にホルモンであるグルカゴンを作り、放出する膵臓中の細胞型を指すように本明細書では互換的に使用される。グルカゴンは、エネルギーのためにグルコースを血液中に放出するように肝臓を刺激する。
本明細書で使用される用語「ベータ細胞」または「β細胞」は、インスリンを作る膵臓細胞を指す。
本明細書で使用される用語「両能性」とは、2つの細胞系列に分化することができる細胞を指す。
インテグリンは、細胞と、その周囲の組織との結合を媒介する受容体であり、細胞間および細胞−マトリックス相互作用に関与する。哺乳動物においては、18αおよび8βサブユニットが特徴付けられている。αおよびβサブユニットは両方とも、2個の別々の尾部を含有し、それらは両方とも形質膜を貫通し、小さい細胞質ドメインを有する。
CD15(3−フコシル−N−アセチル−ラクトサミン;段階特異的胚抗原1(SSEA−1))は、糖タンパク質、糖脂質およびプロテオグリカン上に発現され得る炭水化物接着分子である。CD15は、一般的には、好中球上に認められ、食作用および走化性を媒介する。
CD16は、ナチュラルキラー細胞、好中球多形核白血球、単球およびマクロファージの表面上に見出されるFc受容体(FcγRIIIaおよびFcγRIIIb)である。Fc受容体は、IgG抗体のFc部分に結合する。
CD19は、濾胞樹状細胞およびB細胞上に発現されるヒトタンパク質である。この細胞表面分子は、抗原受容体依存的刺激の閾値を低下させるためにBリンパ球の抗原受容体と共に集合する。一般に、活性化の際に、CD19の細胞質尾部はリン酸化されるようになり、Srcファミリーのキナーゼによる結合およびホスホイノシチド3(PI−3)キナーゼの動員を可能にすると考えられる。
CD31(血小板/内皮細胞接着分子;PECAM1)は通常、内皮細胞、血小板、マクロファージおよびKupffer細胞、顆粒球、T細胞、ナチュラルキラー細胞、リンパ球、巨核球、破骨細胞および好中球上に認められる。CD31は、組織再生および体内からの好中球の安全な除去において重要な役割を果たしている。接触の際に、マクロファージおよび好中球のCD31分子が、好中球の健康状態をマクロファージに伝えるために使用される。
細胞間相互作用、細胞接着および移動に関与する細胞表面糖タンパク質であるCD44(「ヒアルロナン受容体」)は、特定の型の間葉細胞を同定するために使用される。
CD59は、補体媒介性溶解からヒト細胞を保護するグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)結合膜糖タンパク質を指す。
CD66b((CGM1);CD67、CGM6、NCA−95)は、免疫グロブリンスーパーファミリーおよびがん胎児抗原(CEA)様サブファミリーのメンバーであるグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)結合タンパク質である。顆粒球上に発現されるCD66bは、一般に、ヒト好酸球の接着および活性化の調節に関与すると考えられる。
本明細書で使用される用語「CXCR−4」とは、Gタンパク質結合ケモカイン受容体を指す。Gタンパク質共役CXCR4に結合するアルファ−ケモカインである間質由来因子−1(SDF−1)は、幹細胞/始原細胞輸送の調節において重要な役割を果たしている。
本明細書で使用される用語「細胞」とは、生きている生物の構造的および機能的単位を指し、生きているものとして分類される生物の最小単位である。
本明細書で使用される用語「ケモカイン」とは、特定の方向に移動するように白血球にシグナルを伝達する走化性サイトカインのクラスを指す。
用語「走化性」または「化学走性」とは、それが誘引的と見なす環境条件に向かう、および/またはそれが不快と見る周囲からの化学的濃度勾配に沿った運動性細胞またはその一部の指向的運動を指す。
本明細書で使用される用語「クローン形成能」およびその他の文法的形態は、自己再生による細胞のコロニーを産生する単一の幹細胞の特性を指す。
本明細書で使用される用語「成分」とは、構成要素、エレメントまたは成分を指す。
本明細書で使用される用語「接触」およびその様々な文法的形態は、接触またはすぐ近く、もしくは部分的な近くの状態または条件を指す。ある組成物と標的との接触は、当業者には公知の任意の投与手段によって行うことができる。
用語「臍帯血由来幹細胞(CB−SC)」および「臍帯血単核細胞」(CBMC)は、用語「臍帯血単核幹細胞」と互換的に使用される。
用語「検出可能マーカー」は、選択マーカーと、アッセイマーカーとの両方を包含する。用語「選択マーカー」とは、薬物耐性マーカー、蛍光活性化細胞選別において有用な抗原性マーカー、選択的接着を可能にする接着リガンドのための受容体などの接着マーカーなどの発現構築物で形質転換された細胞を選択またはスクリーニングすることができる様々な遺伝子産物を指す。
本明細書で使用される用語「示差標識」とは一般的には、単一の細胞または生物の構造、成分またはタンパク質を特徴付ける、または対比するために使用される染料、色素、マーカー、または抗体を指す。
本明細書で使用される用語「断片」とは、より大きい単位の所望の生物学的活性を保持するより大きい単位に由来する、それから切断された、またはそれから破壊された小さい部分を指す。
用語「機能的等価物」または「機能的に等価な」は、類似するか、または同一の効果または使用を有する物質、分子、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指すように本明細書では互換的に使用される。
本明細書で使用される用語「増殖因子」とは、細胞内シグナリング経路を誘発し、増殖、分化、または他の細胞応答を誘導する細胞表面受容体に結合する細胞外ポリペプチド分子を指す。増殖因子としては、限定されるものではないが、サイトカインおよびホルモンが挙げられる。
本明細書で使用される用語「標識化」とは、追跡可能な構成要素を導入することによって化合物、構造、タンパク質、ペプチド、抗体、細胞または細胞成分を識別するプロセスを指す。一般的な追跡可能な構成要素としては、限定されるものではないが、蛍光抗体、フルオロフォア、色素または蛍光色素、染料または蛍光染料、マーカー、蛍光マーカー、化学染料、分別染料、分別標識、および放射性同位体が挙げられる。
本明細書で使用される用語「不安定」とは、分解の増加を受けやすいことを指す。
用語「マトリックス」とは、何かが含有される、または包埋される周囲の物質を指す。
本明細書で使用される用語「機械的撹拌」とは、機械的手段によって組織が物理的に振とうまたはかき混ぜられるプロセスを指す。そのような機械的手段としては、限定されるものではないが、ミキサーまたは他の機械的デバイスが挙げられる。
本明細書で使用される用語「間葉系幹細胞(MSC)」とは、様々な組織中に認められる非血液性成体幹細胞を指す。それらは、その紡錘状の形態;その細胞表面上での特定のマーカーの発現により;および適切な条件下で少なくとも3つの系列(骨形成、軟骨形成および脂肪生成)に沿って分化するその能力を特徴とする。骨または軟骨に言及する場合、単一のMSCは培地に応じて、軟骨細胞または破骨細胞に分化する能力を示したため、MSCは一般的には、骨軟骨形成性、骨形成性、または軟骨形成性として知られる。
本明細書で使用される用語「多系列分化能力」とは、異なる型の成熟子孫を生成する単一幹細胞の特性を指す。
本明細書で使用される用語「多能性」とは、間葉系幹細胞および複数の細胞系列に分化することができるが、3つの胚葉に由来する全ての系列には分化することができないいくつかの他の成体幹細胞などの細胞を指す。
本明細書で使用される用語「非拡張」とは、細胞集団中の細胞数を増加させるために培養物(in vitro)で増殖させていない細胞集団を指す。
本明細書で使用される用語「多能性」とは、身体の臓器、神経系、皮膚、筋肉および骨格を形成する、3つの胚葉の全ての細胞に発生する能力を指す。例としては、胚盤胞、胚性幹細胞の内部細胞塊、およびiPS細胞などの再プログラミングされた細胞が挙げられる。
本明細書で使用される用語「増殖させる」とは、任意のプロセスによって数、量または程度を複製する、増加させる、または増大させることを指す。
本明細書で使用される用語「精製」とは、外来、外部、または好ましくないエレメントから単離する、または遊離させるプロセスを指す。
本明細書で使用される用語「自己再生」とは、親細胞と同じ特性を有する幹細胞の大規模な増殖および生成の能力を指す。
本明細書で使用される用語「分化全能性」とは、胚および胎盤のトロホブラストを形成することができる幹細胞を指す。
本明細書で使用される用語「トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGFβ)シグナリング経路」とは、細胞増殖、細胞分化、アポトーシス、細胞恒常性および他の細胞機能などの、成体生物と、発生中の胚との両方における多くの細胞プロセスに関与するシグナリング経路を指す。TGFβスーパーファミリーリガンドは、I型受容体を動員し、リン酸化するII型受容体に結合する。次いで、I型受容体は、受容体により調節されるSMAD(R−SMAD)をリン酸化し、ここで、coSMAD SMAD4に結合することができる。R−SMAD/coSMAD複合体は、核に蓄積し、そこでそれらは転写因子として作用し、標的遺伝子発現の調節に関与する。
本明細書で使用される用語「分化単能性」とは、ただ1つの成熟細胞系列に分化することができる細胞を指す。
一態様によれば、成体単核細胞を再プログラミングするための方法は、以下を含む。
1.血小板に富む画分を単離するためにUC血細胞または成体末梢血細胞を準備する。
2.UC血細胞または成体末梢血細胞から、血小板様細胞を含む血小板に富む画分を収集する。
3.対象由来末梢血を準備し、対象の末梢血から単核細胞画分を収集する。
4.再プログラミングにとって好適な細胞の対象の単核細胞画分と、血小板に富む画分とを接触させる。
5.接触は、バイオマーカーによって同定することができる細胞を再プログラミングするのに有効である。
6.場合により、再プログラミングされた成体単核細胞を拡張する。
一部の実施形態によれば、UC血細胞または成体末梢血細胞の収集ステップは、Ficoll−Paque勾配によって実施される。一部の実施形態によれば、臍帯血または成体末梢血の血小板に富む画分は、Ficoll−Paque勾配の画分から得られる。
一部の実施形態によれば、成体単核細胞と、臍帯血の血小板に富む画分との接触は、臍帯血の血小板に富む画分の1つまたは複数の成分を成体単核細胞に移動させるのに有効である。
一部の実施形態によれば、単離された単核細胞の接触は、溶解された血小板に富む画分とのものである。一部の実施形態によれば、血液の血小板に富む画分を、全細胞溶解バッファーを用いて溶解する。一部の実施形態によれば、血液の溶解された血小板に富む画分を、遠心分離によって清澄化する。
一部の実施形態によれば、接触ステップの後、単離された単核細胞をバッファー中で洗浄した後、培養して、再プログラミングされた細胞の総数を拡張する。
一部の実施形態によれば、方法は、in vitroの単離された成体末梢血単核細胞(PBMC)と、臍帯血に由来する血小板様細胞の富化された集団とを接触させることを含む。一部の実施形態によれば、PBMCを、接触前にトリプシン/EDTAで処理して、PBMCの表面から成熟または成体血小板を除去する。
一部の実施形態によれば、方法は、成体末梢血単核細胞(PBMC)と、血小板様細胞のアルファ顆粒とを接触させることを含む。一部の実施形態によれば、アルファ顆粒を、臍帯血の血小板に富む画分から獲得する。
一部の実施形態によれば、PBMCは、マーカーCD14、CD66、CD4、CD8、CD19、CD56、CD41b、およびCD42aのうちの1つまたは複数を含む。
一部の実施形態によれば、血液の血小板に富む画分と接触させて、テトラスパニンCD9、白血球共通抗原CD45、および幹細胞因子受容体CD117のうちの1つまたは複数を展示することによって、PBMCを再プログラミングする。
一部の実施形態によれば、方法は、末梢血インスリン産生細胞(PB−IPC)と、血小板に富む細胞画分とを接触させることを含む。一部の実施形態によれば、PBMCを、疎水性表面を有する容器内に培養することによって単離されたPB−IPCを誘導する。一部の実施形態によれば、PB−IPCを、成体ヒト末梢血の試料を準備すること;試料から赤血球を除去して、単核細胞を取得すること;正味の正電荷を有する疎水性表面上の単核細胞を培養すること、および表面に結合した細胞集団を取得することによって取得することができる(全体が参照により本明細書に組み込まれるZhou Y. et al.の米国特許第8,835,163号)。
一部の実施形態によれば、本発明は、成体血液に由来するPB−IPCと、臍帯血の血小板に富む画分または成体血液の血小板に富む画分とを接触させることにより、PB−IPCのインスリン産生特性を増強し、高血糖を軽減し、膵島に移動する能力を改善する方法を開示する。一部の実施形態によれば、PB−IPCを、全臍帯血または全成体血液から直接得る。一部の実施形態によれば、PB−IPCを、疎水性組織培養表面上で単核細胞を培養することによって全血から単離する。一部の実施形態によれば、PB−IPCを、血液の血小板に富む画分と接触させ、1つまたは複数の転写因子および核酸を血小板に富む画分からPB−IPCに移動させる。一部の実施形態によれば、血小板に富む画分に由来する血小板様細胞は、PB−IPCと融合し、それによって、転写因子および核酸を血小板様細胞からPB−IPCに移動させる。一部の実施形態によれば、血小板に富む画分に由来するマイクロパーティクルは、PB−IPCと融合し、それによって、1つまたは複数の転写因子または核酸を、PB−IPCに移動させる。一部の実施形態によれば、血小板に富む画分に由来するエキソソームはPB−IPCと融合し、それによって、1つまたは複数の転写因子または核酸を移動させる。
一部の実施形態によれば、血小板に富む画分と接触したPB−IPCは、膵島に移動し、インスリンの機能的産生細胞になる増強された能力を有する。一部の実施形態によれば、血小板に富む画分と接触したPB−IPCは、ベータ細胞に分化する。
一部の実施形態によれば、PBMCと、ヒト血液の血小板に富む画分との接触は、線維芽細胞様マクロファージを産生する。
一部の実施形態によれば、PBMCと、血液の血小板に富む画分との接触は、未分化の細胞および/または分化した細胞の特定のマーカーについてある割合の細胞を含む細胞集団を産生する。例えば、Oct4などの未分化細胞のマーカー、ネスチンおよびNgn−3などの神経始原細胞マーカー、ならびにベータ−チューブリンおよびTPH2などの成熟ニューロンマーカーのマーカーに関する転写産物の相対比率を、定量的RT−PCRによって評価することができる。また、未分化細胞のマーカーの産生および局在化を、免疫細胞化学によって評価することができる。
一部の実施形態によれば、PBMCと、血液の血小板に富む画分との接触は、対象に投与した場合、再プログラミングされた細胞に対する免疫応答を最小化する、または除去するためのPBMCを含む1つまたは複数の細胞型の再プログラミングをもたらす。
一部の実施形態によれば、機能的に調節された成体血液単核細胞は、以下の分子:OCT3/4、NANOG、NKX6.1、MAFA、Sur1、Sur2、PDL−1、CD270、ガレクチン9のうちの1つまたは複数を展示する。
一部の実施形態によれば、機能的に調節される成体血液単核細胞は、限定されるものではないが、インスリン産生細胞などの他の細胞型に分化することができる。一部の実施形態によれば、インスリン産生細胞である機能的に調節される成体血液単核細胞は、グルカゴン様ペプチド1(GLP−1)受容体を展示する。一部の実施形態によれば、GLP−1の長期作用型アゴニストであるエキセンジン−4の投与は、機能的に調節される成体血液単核細胞のインスリン産生および細胞分化を増加させる。
一部の実施形態によれば、再プログラミングされた機能的に調節される成体血液単核細胞は、臍帯血小板様細胞に由来する1つまたは複数の胚性幹細胞マーカー、ヒト膵島ベータ細胞特異的転写因子またはその両方を含む。一部の実施形態によれば、再プログラミングされた機能的に調節される成体血液単核細胞は、免疫寛容関連マーカーを発現する。
一態様によれば、成体単核細胞を再プログラミングするための方法は、以下を含む:
1.血小板に富む画分を単離するためにUC血を準備する。
2.1つまたは複数の血小板様細胞および単核細胞を含む血小板に富む画分を、UC血細胞から収集する。
3.バイオマーカーによって同定することができる、再プログラミングされた単核細胞を選択する。
4.場合により、再プログラミングされた成体単核細胞を拡張する。
一部の実施形態によれば、機能的に調節される臍帯血単核細胞は、以下の分子:OCT3/4、NANOG、NKX6.1、MAFA、Sur1、Sur2、PDL−1、CD270、ガレクチン9のうちの1つまたは複数を展示する。
一部の実施形態によれば、臍帯血単核細胞は、マーカーCD14、CD66、CD4、CD8、CD19、CD56、CD41b、およびCD42aのうちの1つまたは複数を含む。
別の態様によれば、記載される発明は、記載される発明の機能的に調節される成体血液単核細胞を含有する医薬組成物を含む細胞生成物を開示する。
一部の実施形態によれば、それを必要とする対象を処置するための方法は、対象の膵臓中での機能的細胞集団を増加させるのに有効であり得る細胞生成物を、糖尿病の哺乳動物対象に投与することを含む。一部の実施形態によれば、細胞生成物は、対象の膵臓中の機能的β細胞の集団を増加させるのに有効であり得る。一部の実施形態によれば、細胞生成物は、投与後に対象の膵臓に移動するのに有効であり得る。
本明細書で使用される用語「治療有効」または「薬学的有効量」とは、対象へのその投与後に治療効果または有益な効果をもたらす本発明の組成物の量を指す。組成物の有効量は、処置される生物学的対象の年齢および身体状態、状態の重篤度、処置の持続期間、併用療法の性質、注入のタイミング、使用される特定の化合物、組成物または他の活性成分、使用される特定の担体などの因子に応じて変化してもよい。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の、それぞれの介在する値、本文が別途明確に記述しない限り、下限の単位の10分の1まで、およびその記述された範囲中の任意の他の記述された値または介在する値が本発明に包含されることが理解される。より小さい範囲に独立に含まれていてもよいこれらのより小さい範囲の上限および下限も、記述された範囲中の任意の特に排除される限界に依存して、本発明に包含される。記述された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界のいずれかの両方を含まない範囲も、本発明に含まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「1つの(a)」、「1つの(and)」および「その(the)」は、本文が別途明確に記述しない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日以前のその開示についてのみ提供されるものであり、それぞれその全体が参照により組み込まれる。本明細書の何も、記載される発明が以前の発明との理由でそのような刊行物に先行する資格がないとの承認と解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、独立に確認される必要がある実際の発行日とは異なっていてもよい。
血液画分の単離
簡単に述べると、抗凝固剤処理された成体血液または臍帯血を、PBS/EDTAで1:2〜1:4の範囲で希釈して、赤血球の凝集を軽減する。次いで、希釈された血液を、混合せずに、遠心チューブ中、Ficoll−Paque溶液上に層化する。層化した血液/Ficoll−Paqueを、遠心ブレーキを使用せずに、18〜20℃、400xgで40分間遠心分離する。これにより、上から下に、血漿および血小板様細胞を含む第1の画分;単核細胞および血小板様細胞を含む第2の画分;Ficoll−Paque媒体を含む第3の画分;ならびに顆粒球および赤血球を含む第4の画分を含む血液画分が形成される。
一部の実施形態によれば、画分をさらにプロセッシングして、血小板様細胞を単離する。簡単に述べると、血漿および血小板様細胞を含む第1の画分を、Ficoll−Paque勾配から取り出す。次いで、1μMのプロスタグランジンE1(PGE1)を含む等量のHEPバッファーを、血小板に富む画分に添加し、穏やかに混合する。次いで、画分を、ブレーキを用いずに室温で15〜20、100xgで遠心分離して夾雑している赤血球または白血球を沈降させる。次いで、上清を新しい容器に移し、室温で15〜20分間、800xgで遠心分離する。次いで、沈降した血小板様細胞を、血小板活性化を避けるために再懸濁せずに2回洗浄する。
フローサイトメトリー分析を、以前に記載されたように実施した(Zhao Y. et al., Exp. Cell Res., 312, 2454 (2006))。簡単に述べると、トリプシン/EDTAで処理した、または未処理のままである細胞を、遠心分離によって収集し、PBS中に再懸濁した。細胞を、37℃で10分間、4%ホルムアルデヒド中で固定した。抗体を用いる細胞外染色のために、細胞を透過処理しなかった。細胞内染色のために、氷冷100%メタノールを予め冷やした細胞に、90%メタノールの最終濃度で添加することによって細胞を透過処理し、氷上で30分間インキュベートした。最初にインキュベーションバッファー中に細胞を再懸濁し、製造業者の推奨される希釈率に従って一次抗体を添加することにより、細胞を免疫染色した。細胞を室温で1時間、一次抗体と共にインキュベートした後、インキュベーションバッファーで3回洗浄した。次いで、細胞を、室温で30分間、製造業者の推奨された希釈率でコンジュゲート化二次抗体を含むインキュベーションバッファー中に再懸濁した後、インキュベーションバッファー中で3回洗浄した。次いで、染色された細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
標準的な免疫蛍光プロトコールを使用した。簡単に述べると、接着細胞を、室温で15分間、温めたPBS中に希釈した4%ホルムアルデヒドで固定した。固定剤を吸引し、細胞をそれぞれ5分間、PBSで3回洗浄した。細胞を室温で60分間、ブロッキングバッファーでブロックした。次いで、ブロッキングバッファーを吸引し、製造業者の指示書に従って希釈された一次抗体の溶液を、4℃で終夜、細胞と共にインキュベートした。次いで、細胞をそれぞれ5分間、PBSで3回すすいだ後、室温で1〜2時間、製造業者の指示書に従って希釈された蛍光色素コンジュゲート化二次抗体と共にインキュベートした。次いで、細胞をそれぞれ5分間、PBSで3回洗浄し、蛍光顕微鏡によって可視化した。
糖尿病患者に由来する膵臓組織のパラフィンスライドを、BioChain(Newark、CA)から購入した。Zhao Y, et al., Identification of stem cells from human umbilical cord blood with embryonic and hematopoietic characteristics. Exp Cell Res 2006, 312: 2454-2464に以前に記載されたように、免疫染色を実施した。非特異的染色を遮断するために、室温で20分間、2.5%ウマ血清(Vector Laboratories)を含有するバッファー中で切片をインキュベートした。一次抗体は、モルモットポリクローナル抗インスリンAb(DakoCytomation、Carpinteria、CA)、血小板マーカーであるFITCコンジュゲート化CD42a(Beckman Coulter)、血小板α顆粒マーカーであるフォン・ヴィレブランド因子(vWf)Ab(Sigma)、および血小板高密度顆粒マーカーであるADP Ab(GenScript、Piscataway、NJ)を含み、二次Abは、Cy3コンジュゲート化AffiniPureロバ抗モルモットIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories、West Grove、PA)を含んでいた。アイソタイプ一致させた対照のために、マウスIgG1κを、BD Biosciencesから、モルモット血清をSanta Cruz Biotechnologyから購入した。全ての実験について、アイソタイプ一致抗体を、陰性対照として使用した。細胞を、AxioCam MRcカメラおよびAxioCam MR Rev3ソフトウェアを備えたZEISS Imager M1を用いて写真撮影したか、またはNikon A1R共焦点顕微鏡によって写真撮影した。
細胞懸濁液を沈降させた後、pH7.0のリン酸バッファー中の過剰量の2.5%グルタルアルデヒド中に細胞を再懸濁し、室温で10分間インキュベートすることによって固定した。次いで、細胞を沈降させ、新鮮な固定剤を添加した。細胞を4℃で2〜3時間、新鮮な固定剤中でインキュベートした後、細胞損傷を防止するために試料の浸透圧に調整されたリン酸バッファー中で洗浄した。固定および洗浄の後、4%の低融点アガロースを細胞に添加し、すぐに遠心分離して細胞を沈降させた。次いで、細胞沈降物を氷に20分間移して、アガロースを固化させた後、バッファー中で穏やかに洗浄した。次いで、細胞を4℃で1〜2時間、リン酸バッファー中の1%四酸化オスミウムで処理した後、蒸留水中で少なくとも5回洗浄した。次いで、細胞を、暗室中、4℃で2時間、2%水性酢酸ウラニルで染色した。次いで、細胞を、以下の系列のアセトン洗浄:30%アセトンで15分間;50%アセトンで15分間;70%アセトンで15分間;90%アセトンで15分間;100%アセトンで30分間を3回により脱水した。次いで、細胞を、以下の系列のプロピレンオキシドおよび樹脂混合物:2:1のプロピレンオキシド:樹脂で1時間;1:1のプロピレンオキシド:樹脂で1時間;1:2のプロピレンオキシド:樹脂で1時間;100%樹脂で終夜;新鮮な100%樹脂で1時間により、樹脂に埋め込んだ。次いで、樹脂を、60〜70℃で12〜24時間にわたって重合させた。次いで、細胞沈降物をスライスに切断し、電子顕微鏡によって画像化した。
標準的なウェスタンブロッティングプロトコールを使用した。簡単に述べると、細胞を冷やした溶解バッファーで溶解し、遠心分離して、細胞破片を沈降させた。上清のタンパク質濃度を、タンパク質定量アッセイ(例えば、Bradford Protein Assay、Bio−Rad Laboratories)によって決定した。次いで、溶解物上清を等量の2X SDS試料バッファーと混合し、100℃で5分間沸騰させた。試料バッファー中の等量のタンパク質を、分子量マーカーと共にSDS−PAGEゲルのウェル中にロードし、100Vで1〜2時間、電気泳動した。次いで、タンパク質をニトロセルロースまたはPVDF膜に転移させた。次いで、ブロッキングバッファーを使用して室温で1時間、膜をブロックした。次いで、膜を、製造業者の指示書に従ってブロッキングバッファー中の一次抗体の適切な希釈液と共にインキュベートした後、20Mn Tris、pH7.5;150mM NaCl、0.1%Tween20(TBST)中で5分間、3回洗浄した。次いで、膜を、室温で1時間、ブロッキングバッファー中の製造業者により推奨された希釈率のコンジュゲート化二次抗体と共にインキュベートした後、それぞれ5分間、TBST中で3回洗浄した。化学発光検出のための暗室現像技術を使用して、または比色もしくは蛍光検出のための画像走査技術を使用して、ブロットの画像を取得した。
リアルタイムPCR技術を、以前に記載されたように実施して、mRNAの発現レベルを分析した(Zhao Y. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 360 (2007) 205-211)。簡単に述べると、総RNAを、Quiagenキット(Valencia CA)を使用して細胞から抽出した後、ランダムヘキサマープライマー(Fermentas、Hanover MD)を使用して第1鎖cDNAを合成した。目的の各遺伝子のための検証された遺伝子特異的RT−PCRプライマーセットを使用して40サイクルにわたって、Mx3000p Quantitative PCR system(Stratagene、La Jolla、CA)を使用して、各試料に対してリアルタイムPCRを実施した。各転写物の相対発現レベルを、内部対照としてのハウスキーピング遺伝子ベータ−アクチンのものについて補正した。
f−Mφの培養を、Zhao Y, et al., A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003, 100: 2426-2431に以前に記載されたように実施した。簡単に述べると、精製された単球を、1x105細胞/ml、50ng/mlのM−CSFを含む無血清X−VIVO15培地(Lonza)中に0.5ml/ウェルで8ウェルのLab−Tek II Chamber Slide(Fisher Scientific)中に播種した。血小板と、単球/マクロファージとの相互作用を調査するために、精製された単球を0.25%トリプシン/EDTAで予備処理した後、50ng/mlのM−CSFの存在下で無血清X−VIVO15培地で処理した。単球/マクロファージによる血小板様細胞の食作用を決定するために、精製された単球/マクロファージを、27mmのNunc Glass Base Dish(Thermo Scientific、Rochester、NY)上に播種した後、血小板マーカーCD42aおよびES細胞関連マーカーOCT4で免疫染色した。試料を、Nikon A1R共焦点顕微鏡によって観察し、写真撮影した。透過型電子顕微鏡(TEM)によって血小板と単球/マクロファージとの相互作用をさらに決定するために、精製された血小板および単球(トリプシン/EDTAで処理しない)を、TEMバッファー(0.1Mカコジル酸ナトリウムバッファー、pH7.4中の2%ホルムアルデヒドおよび2.5%グルタルアルデヒド)で固定した。細胞試料を、包埋および切片化のために提供した。試料を、AMT−XR41デジタルカメラを備えたJEOL 1200EX透過型電子顕微鏡を用いて観察した。
Zhao et alは、全血からリンパ球を分離し、接着CB−SCの存在下でリンパ球を簡単に同時培養した後、「教育された」リンパ球を患者の循環中に戻すバイオリアクターデバイスと呼ばれる連続密閉ループシステムを介して患者の血液を循環させる手順を開発した[Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med, Vol. 10:3, (2012)]。非盲検1/2相試験において、T1Dを有するアジア系統の12人の患者が、バイオリアクターデバイスによる単回処置を受け、アジア系統の3人の患者が、接着CB−SCを含まないバイオリアクターデバイスによる単回処置(すなわち、プロセスのみの対照)を受けた。16ゲージのIV針を、左(または右)肘正中皮静脈に入れ、製造後業者の推奨プロトコールに従って、患者の血液を、35mL/分で6〜7時間、Blood Cell Separator MCS+(Haemonetics(登録商標)、Braintree、MA)に通過させて、リンパ球を単離した。収集されたリンパ球を、同種異系CB−SC(またはCB−SCを用いないプロセス対照)への曝露のためにデバイスに移し、他の血液成分を患者に戻した。デバイス中で2〜3時間後、リンパ球を、生理食塩水を用いる重力流対照(2〜3mL/分)の下、手の中の背部静脈を介して患者の循環に戻した。約10,000mLの血液を、手順の間に処理したところ、リンパ球画分の約2回の反復教育が得られた。患者を2日間入院させて、体温をモニタリングし、そのような処置の後の有害反応に関する日常的な臨床血液検査を行った。
幹細胞教育療法による血小板の調節
血小板の調節を、偽療法を受けた対象(n=3)と比較して19人の1型糖尿病(T1D)および20人の2型糖尿病(T2D)患者において分析した。従来の療法を受けた、年齢および性別を一致させたT1D(n=8)およびT2D(n=10)対象を、それぞれ、追加の対照として使用した。臨床結果により、血小板数は幹細胞教育療法を受けた後にT2D対象において顕著に増加する(P=0.027)が、対象の5/8はT1D処置において改善することが示された(図1A)。血小板分布幅(PDW)の値は、幹細胞教育療法による処置後にT1DとT2D対象の両方において有意に増加した(図1B)が、その平均血小板体積(MPV)は、T1DとT2D対象の両方において減少した(図1C)。処置後にT1DとT2D対象の両方において、血小板クリット(PCT)に関しては顕著な変化はなかった。白人のT1D対象(N=8)に由来する臨床データもまた、SCE療法を受けた後に血小板数の増加を示した(P=0.04、図1D)。このデータは、血小板の調節が、糖尿病患者の自己免疫および代謝制御における幹細胞教育療法の臨床効能に寄与し得ることを示唆している(Zhao Y, et al., Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Med 2012, 10: 3;Zhao Y, et al.,Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Med 2013, 11: 160)。
血小板様細胞中での免疫寛容関連マーカーの発現
臍帯血の細胞成分が免疫応答を調節することができるかどうかを探索するために、血小板様細胞中での免疫寛容関連マーカーの発現を精査した。
血小板様細胞(図2A〜D)または成体末梢血(図2E〜I)を含むヒト臍帯血に由来する血小板に富む画分を、上記のように調製した。次いで、血小板様細胞を、様々な免疫関連マーカーについて検査した。
フローサイトメトリーにより、臍帯血由来(図2A)および成体血液由来(図2E)血小板様細胞の両方が、同時阻害的免疫調節表面分子を展示することが示された。図2Aに示されるように、フローサイトメトリーは、血小板様細胞がCD270/CD41およびCD270/CD61を発現することを示す。図2Bに示されるように、透過処理された臍帯血血小板様細胞の細胞内染色により、TGF−β1/CD41、TGF−β1/CD42、Foxp3/CD41、およびFoxp3/CD42の発現が示された。
かくして、フローサイトメトリーにより、成体血液由来血小板様細胞上でのPD−L1およびCD270の高発現、ガレクチン9の低発現、ならびにICOSの無発現が示された。代表的なデータは、8つの個々の調製物に由来するものであった。
図2Gに示されるように、細胞内染色およびフローサイトメトリーにより、98%を超えるヒト成体末梢血血小板様細胞が、CD41とTGFβ1とを同時発現することも示された(右パネル)。IgG−APC/IgG−PC7を陰性対照として使用した(左パネル)。
追加的なフローサイトメトリーデータにより、臍帯血由来血小板様細胞および成体血液由来血小板様細胞の両方を含む血小板に富む細胞画分が、同時阻害的表面分子であるプログラム細胞死リガンド1(PD−L1)を展示することが示された(データは示さない)。プログラム細胞死リガンド1(PD−L1)は、多くのがん細胞型、ならびに活性化T細胞および抗原提示細胞によって発現される(Coombs, MR. et al, "Apigenin inhibits the inducible expression of programmed death ligand 1 by human and mouse mammary carcinoma cells," Cancer Lett. 2016; 380(2): 424-33)。
理論によって限定されるものではないが、血小板様細胞を含む臍帯血の血漿に富む画分と接触する成体単核細胞は、免疫調節分子の移動、またはその誘導により免疫寛容を誘導することができることが想定できる。
ミトコンドリアを、免疫マーカー関連遺伝子の起源を同定するためのミトコンドリアDNA(MitoDNA)の遺伝子転写のために、CB−血小板およびPB−血小板から精製した。ミトコンドリアを、製造業者の推奨プロトコールに従ってQproteome Mitochondria Isolationキット(Qiagen、Hidden、Germany)を使用してPB−血小板から単離した。リアルタイムPCRアレイ分析により、T細胞アネルギーおよび免疫寛容関連遺伝子の発現が示された(図2L)。フローサイトメトリーはさらに、ミトコンドリアを放出する血小板が免疫寛容関連マーカーCD270およびCD274(PD−L1)を展示したことを示した(図2M)。
理論によって限定されるものではないが、これらの知見は、血小板およびそのミトコンドリアの分子含量が、免疫調節因子として作用し、免疫寛容を誘導することができることのさらなる証拠を提供する。
血小板による単球分化の調節
血小板様細胞と他の血液免疫細胞との相互作用を特徴付けるために、臍帯血単核細胞(CBMC)を、マーカーCD41bおよびCD42aと共に様々な系列特異的マーカーで免疫染色した。CD41bは、糖タンパク質IIIa(またはインテグリンβ3、CD61)と会合する糖タンパク質IIb(CD41として知られる)のβ鎖であり、ヒト巨核球および血小板上に存在するヘテロ二量体gpIIb/gpIIIa複合体を形成する;血小板糖タンパク質GPIXとも呼ばれるCD42a GP−IX(CD42a)、GP9は、GP−Ib(CD42b)と非共有複合体を形成する低分子膜タンパク質糖タンパク質である。CD42a−d複合体は、フォン・ヴィレブランド因子およびトロンビンの受容体であり、損傷した内皮中に露出する内皮下マトリックスへの血小板の接着を媒介し、トロンビンに対する血小板応答を増幅する。
以前の研究により、ヒト成人単球/マクロファージ(Mo/Mφ)が、誘導因子によるex vivoでの処理の後に多能性幹細胞(線維芽細胞様Mφ、f−Mφと命名された)に脱分化することができることが示された(Zhao Y, Glesne D, Huberman E: A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 2426-2431)。血小板とMo/Mφとの相互作用がこの脱分化に寄与するかどうかを決定するために、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、細胞固定および透過処理後にフローサイトメトリーによって分析した。透過処理したPBMC中のCD14+CD41+およびCD14+CD42+Mo/Mφのパーセンテージは、新鮮に単離されたPBMC中のものと比較して4倍増加した(図3F)。
精製されたMφを、透過型電子顕微鏡(図3G〜L)および共焦点顕微鏡(図3P)によって検査した。電子顕微鏡により、細胞融合(図3I〜K)およびMφによる血小板様細胞の食作用(図3L)を含む、血小板様細胞とMφとの密接な相互作用が示された。
図3Lは、血小板様細胞(P)と密接に接触している/それを飲み込んだように見えるマクロファージのズームアウト(左パネル)およびズームイン(右パネル)画像を示す。マクロファージの波状の核が示される(N)。図3Lに示されるように、血小板様細胞は、Mφ膜の境界によって完全に取り囲まれている。
総合すると、理論によって限定されるものではないが、データは、血小板様細胞を含む臍帯血の血小板に富む画分が、Mo/Mφと接触することにより、Mo/Mφの再プログラミングならびにf−Mφの増殖および分化を誘導する、ES関連転写因子を提供し得ることを示唆する。
血小板様細胞はヒトES細胞マーカーを発現する
ヒト血小板のマーカーCD41およびCD42を使用するフローサイトメトリーにより、ヒト臍帯血に由来する高精製血小板(98%を超える純度)がES関連多能性遺伝子マーカーを高度に展示することが示された。例えば、転写因子であるオクタマー結合タンパク質4(OCT4)は、98%を超える細胞中で発現されることが見出され、SRY−ボックス含有遺伝子2(SOX2)は96%を超える細胞中で発現されることが見出された(図4AおよびB)。あったとしてもわずかな細胞(0.1%未満)がNANOGを発現した(図4B)。成体ヒト末梢血由来血小板からも同様のデータが得られた(図4C)。
図4Hおよび4Iのレーン1〜6はそれぞれ、6つの別々の血小板様細胞試料に由来する遺伝子発現プロファイルである。クラスタグラムに示された遺伝子はそれぞれ、6つの血小板様細胞試料の少なくとも1つにおいて高度に発現されることが見出された。
血小板様細胞はヒト膵島β細胞関連マーカーを展示する
1型糖尿病(T1D)は、膵島細胞の不足を引き起こすT細胞媒介性自己免疫疾患である。世界中で数百万人もの個人がT1Dを有し、その発生率は様々な集団の間で年々増大している。膵島移植、細胞再生の薬物媒介性促進、およびヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)または胚性幹(ES)細胞株から分化した機能的膵島細胞の移植が、T1Dを処置するための可能性のある手法として提唱および試験されている(Pagliuca FW, et al., Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell 2014, 159: 428-439;Quiskamp N, et al., Differentiation of human pluripotent stem cells into beta-cells: Potential and challenges. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2015, 29: 833-847)。しかしながら、ドナーの不足、免疫拒絶、ならびに循環中の自己反応性エフェクターT細胞およびB細胞の持続的存在は、これらの手法によって生成されたインスリン産生細胞を破壊し、それによって、その治療能力を最小化し得る。これらの障壁を回避するために、免疫抑制薬、宿主免疫応答の操作、および免疫キメラ現象の構成を含むいくつかの手法が精査されている。
通常、グルコース摂取後、血漿グルコース濃度の増加はインスリン放出を誘発し、内臓(肝臓および消化管組織)および末梢のグルコース取込みを刺激し、内因性(主に、肝臓)グルコース産生を抑制する。健康な成人では、血糖値は70〜99mg/dLの範囲内に厳密に調節され、代謝要求を満たすために、特定のホルモン(例えば、インスリン、グルカゴン、インクレチン)ならびに中枢および末梢神経系によって維持される。脳、筋肉、消化管、肝臓、腎臓および脂肪組織内の様々な細胞および組織も、取込み、代謝、貯蔵および分泌により血中グルコース調節に関与する[DeFronzo R.A., "Pathogenesis of type 2 diabetes mellitus" Med. Clin. N. Am., Vol. 88: 787-835 (2004);Gerich J.E., "Physiology of glucose homeostasis", Diabetes Obes. Metab. Vol. 2: 345-350, (2000)]。正常な生理的環境下では、高炭水化物の食事を消費した後でも、グルコースレベルが140mg/dLを超えることは稀である。
グルコース恒常性においても役割を果たすホルモンであるグルカゴンは、低い正常グルコースレベルまたは低血糖に応答してランゲルハンス島内のα細胞によって産生され、グリコーゲン分解を加速し、糖新生を促進することによってグルコースレベルを増加させるように作用する。グルコースを含有する食事の後、グルカゴン分泌は、肝臓でのグルコース産生の抑制および正常な食後耐糖能の維持に寄与する高インスリン血症によって阻害される。
グルコースは全ての細胞膜を通って容易に拡散することができないため、多くの細胞に進入するためには、インスリンと、輸送タンパク質ファミリー(容易化グルコース輸送体[GLUT]分子)との両方からの援助が必要である[Bryant, et al, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. "Regulated transport of the glucose transporter GLUT 4", Vol. 3(4): 267-277, (2002)]。GLUTは、グルコースがより容易に移動することができる、そうでなければ疎水性の細胞膜を横断する水性孔を形成するシャトルとして作用する。12種の公知のGLUT分子のうち、GLUT4は脂肪、筋肉、および心臓組織のための主要な輸送体であると考えられるが、GLUT1、2、3および8は他の臓器(例えば、脳、肝臓)へのグルコース進入を容易にする。GLUT4の活性化、順に、筋肉および脂肪組織への容易化されたグルコース拡散は、インスリンの存在に依存するが、他のGLUTの機能は、インスリンにより多く依存しない[Uldry M. et al., "The SLC2 family of facilitated hexose and polyol transporters", Thorens B, Eur. J. Physiol. 2004; Vol. 447: 480-489, (2004)]。
肝臓はグルコース取込みを容易にするためにインスリンを必要としないが、グルコース産生を調節するためにインスリンを必要とする。かくして、例えば、インスリン濃度が低い場合、肝臓でのグルコース産生は上昇する。さらに、インスリンは、肝臓がグリコーゲンの形態で吸収されたグルコースの多くを貯蔵するのを助ける。
腎臓は、循環中へのグルコースの放出(糖新生)、腎臓でのエネルギー要求を満たすための循環からのグルコースの取込み、および尿細管でのグルコースの再吸収により、グルコース恒常性において役割を果たす。腎臓はまた、尿中へのその排出を容易にすることによって、過剰のグルコースの除去を補助する(レベルが約180mg/dLを超える場合であるが、この閾値は慢性高血糖の間は上昇し得る)。
ヒト膵島においては、インスリン含有β細胞は、膵島内の他の細胞型、すなわち、インスリン、グルカゴン、およびソマトスタチン含有細胞と混ざり合い、ヒト膵島中に分布することがわかっている[Cabrera O. et al., "The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function", Proc. Natl Acad. Sci. U.S., Vol. 103: 2334-2339, (2006)]。ヒト膵島は、明白な下位区分を示さないが、α細胞の90%はβ細胞と直接接触し、β細胞は膵島中の他の内分泌細胞と自由に混ざり合う。β、α、およびδ細胞は、膵島内の血管への同等で無作為なアクセスを有し、異なる内分泌細胞が血管周囲の層中に編成される可能性を排除する。これらの結果は、膵島かん流の設定された順序がなく、任意の所与の細胞型が、その自身の細胞型を含む他の細胞型に影響し得るモデルを支援する[G. da Silva Xavier et al., "Per-arnt-sim (PAS) domain-containing protein kinase is downregulated in human islets in type 2 diabetes and regulates glucagon secretion", Diabetologia, Vol. 54: 819-827, (2011)]。
自己免疫疾患としての糖尿病
糖尿病は、高血糖を特徴とする代謝疾患群である。慢性高血糖症は、眼、腎臓、神経、心臓および血管などの、長期損傷、機能障害、および潜在的な臓器不全と関連する。糖尿病を処置するための理想的な治療剤は未だ開発されていない。
1型糖尿病では、β細胞は自己免疫プロセスによって破壊され、大部分はα細胞によって置き換えられる[Unger R.H. et al., "Paracrinology of islets and the paracrinopathy of diabetes", Proc. Natl Acad. Sci., U.S., Vol. 107(37): 16009-16012, (2010)]。これらのα細胞は、通常は並列されたβ細胞に由来する高い局所濃度のインスリンによって提供される強直性拘束を欠き、不適切な高グルカゴン血症をもたらし[Raskin P. et al. Glucagon and diabetes. The Medical Clinics of North America 62, 713 (1978)];[Habener J. F. et al., "Alpha cells some of age", Trends in Endocrinology & Metabolism: TEM Vol. 24, 153-163 (2013)];[Unger R.H. et al., "Glucagonocentric restructuring of diabetes: a pathophysiologic and therapeutic makeover", J. Clinical Investig. Vol. 122(1): 4-12, (2012)];[Vuguin P.M. et al. "Novel insight into glucagon receptor action: lessons from knockout and transgenic mouse models", Diabetes, Obesity & Metabolism, Vol. 13(1), 144-150, (2011)]、グルカゴン分泌を増加させる高血糖の急上昇を誘導する[Unger R.H. et al., "Glucagonocentric restructuring of diabetes: a pathophysiologic and therapeutic makeover", J. Clinical Investig. Vol. 122(1): 4-12, (2012)]。近隣のβ細胞が正常な膵島中でα細胞に与えるインスリンと適合するには、平均以上のインスリンレベルが必要である。これは、生涯にわたる高インスリン血症をもたらし、対象を、高血糖の頻繁な発生に曝露し、アテローム性動脈硬化症、および冠動脈疾患の遮断を引き起こす、血管壁における低密度リポタンパク質(LDL)の蓄積としてそのような後遺症を増加させる。
T1Dにおける免疫機能障害は複雑であり、膵島内と膵臓外の両方に影響する。免疫系の様々な成分[例えば、CD4+、CD8+T細胞、調節性T細胞(Treg)、B細胞、樹状細胞(DC)、単球/マクロファージ(Mo/Mφ)、ナチュラルキラーT細胞(NKT)]は全て、T1Dにおける自己免疫応答に積極的に寄与すると想定され、かくして、疾患を有する個体間で機能し得る有効かつ成功裏の処置または治癒を開発するための潜在的な努力を複雑にしている。いくつかの臨床試験[Bach J.F., "Anti-CD3 antibodies for type 1 diabetes: beyond expectations", Lancet., Vol. 378: 459-460, (2011)];[Wherrett D.K. et al., "Antigen-based therapy with glutamic acid decarboxylase (GAD) vaccine in patients with recent-onset type 1 diabetes: a randomized double-blind trial", Lancet., Vol. 378: 319-327, (2011)]は、T1Dのための療法を開発し、治癒を発見する際の障害を強調し、免疫系の1種または数種の成分の膵臓効果を標的化することよりもむしろ、局所膵臓レベルと全身レベルとの両方において包括的な免疫調節をもたらす手法の必要性を指摘している。
幹細胞療法は破壊された膵島β細胞を置き換える手段として活用されてきたが、この手法は、根本的な自己免疫応答の軽減の非存在下では役に立たない。
2型糖尿病(T2D)は、β細胞が存在する高血糖障害であり、かくして、1型糖尿病とは区別される。いくつかの因子がT2Dの発生に寄与するが、中心的な欠陥は、ホルモン作用の複雑な経路における1つまたは複数の点での、不十分なインスリン分泌(インスリン欠乏)および/またはインスリンに対する組織応答の低下(インスリン耐性)である[Triplitt C.L., "Examining the mechanisms of glucose regulation", Am. J. Manag. Care, Vol. 18 (1 Suppl) S4-S10, (2012)]。高血糖への寄与はT2Dの範囲と共に広く変化し得るが、インスリン欠乏およびインスリン耐性は同時に存在することが多い。
本発明者らは、血小板様細胞を含む臍帯血に由来する血小板に富む画分を、末梢血細胞を再プログラミングするために使用することができるかどうか、および再プログラミングされた細胞が、糖尿病対象の膵島におけるβ細胞の存在する/枯渇した集団を補完するように分化することができるかどうかを探索することに興味を持った。
血小板様細胞が膵島β細胞の再生に寄与することができるかどうかを探索するために、本発明者らは、RT−PCRによって、インスリンおよびC−ペプチド産物、転写因子(MAFA、PDX1、NKX6.1、NEUROD1、およびNGN3)、KATPチャネルタンパク質(Sur1およびKir6.2)ならびにグルコキナーゼ(GCK)などのヒト膵島β細胞特異的マーカーを検査した。臍帯血由来血小板様細胞を、上記のように単離し、リアルタイムPCRおよびウェスタンブロットにより分析した。
ウェスタンブロッティングにより、タンパク質レベルでの成熟ベータ細胞マーカーMAFAの発現がさらに示された(図5C)。各ブロットの右側の数字は、相対強度単位で同定されたタンパク質の定量された平均量を表す。
ヒト成人末梢血由来血小板様細胞におけるさらなる試験により、臍帯血由来血小板様細胞中のものと同じマーカーおよびパターンの発現が示された(図5G〜J)。臍帯血由来試料とは対照的に、末梢血由来試料のGSK mRNAは、多くの試料(5/6)中で示された。少ない試料(1/6)は、SSTについて陽性であり、Sur1の発現はなかった(図5G)。
記載されたデータは、臍帯血血小板様細胞を含む臍帯血に由来する血小板に富む画分を、PB−IPCと接触させた後、機能的膵島細胞様細胞に分化するよう促すことができることを示す。さらに、記載されるデータは、臍帯血血小板様細胞を含む臍帯血に由来する血小板に富む画分と接触させた成体単核細胞がPB−IPCを生成することができることを示す。
血小板により放出されるミトコンドリアはヒト膵島の機能および生存を改善する
新鮮に単離されたヒト膵島を、Lonza(San Francisco、CA)から購入した。膵島を、室温で5分間、0.25%トリプシン/EDTAを用いて単一細胞に解離させた。膵島細胞(1x105細胞/ml)を、0.4μm孔径のトランスウェル培養システム(EMD Millipore、Billerica、MA)の上インサートに播種した。膵島を、MitoTracker Deep Redで標識された血小板様細胞と同時培養し、トランスウェル培養システムの下チャンバーに入れた。膵島細胞を、1、2、4、6、20、24時間で動的フローサイトメトリーのために異なる時点で収集した。7日後、処理された、および処理されていない膵島細胞を収集して、TC20自動細胞計数装置(Bio−Rad、Hercules、CA)を使用することによって細胞生存能力および生細胞数を検査した。
フローサイトメトリーにより、血小板様細胞が基底レベルのミトコンドリアを放出することができることが示された(図6A)。図6Aに示されるように、フローサイトメトリーは、上記のように血小板様細胞から得られたゲート化されたミトコンドリア(前方散乱および側方散乱によって決定される)が、MitoTracker蛍光染色について陽性であることを示した。
膵島および血小板様細胞を、トランスウェルシステム中で同時培養した。図6Cに示されるように、ヒト膵島細胞を、トランスウェルの上チャンバーで培養し、血小板様細胞を下チャンバーに入れた。トランスウェル同時培養システム(図6C)を使用して、1、2、4、6、20または24時間にわたって同時培養した後、膵島細胞を収獲し、膵島へのミトコンドリア結合の動力学をフローサイトメトリーによって決定した。
フローサイトメトリーにより、ヒト膵島β細胞が、フィブロネクチンリガンドであるCD29(インテグリンβ1)、Toll様受容体4(TLR4)、およびTLR6を発現することが示された(図6F;垂直軸はそれぞれの受容体の定量された量を表すが、膵島ベータ細胞は水平軸上で定量されるインスリンの発現によって同定された)。II型膜貫通糖タンパク質CD38、トロンボスポンジン受容体CD36、C−Cモチーフケモカインリガンド2(CCL2)、C−Cモチーフケモカイン受容体CCR4、およびCCR6の発現レベルは低いか、または陰性であった(図6F)。
膵島β細胞に対する血小板様細胞由来ミトコンドリアの生物学的効果を決定するために、トリプシン/EDTAで解離させた単一の膵島β細胞を、図6Cに示されるようにトランスウェル中で血小板と同時培養した。その結果、対照膵島細胞と比較して、7日間同時培養した後に、細胞生存能力と生細胞数の両方が実質的に増加することが示された(図6HおよびI)。ミトコンドリア処理された膵島は、未処理対照の膵島と比較した場合、細胞生存能力が40%より多く増加した(図6H)。生細胞の総数は、約2.4x104個の細胞/mLから約4.5x104個の細胞/mLまで増加した(図6I)。
全膵島(トリプシン処理された解離した細胞とは反対である)を、図6Jに図示されるようにトランスウェル中で単離されたミトコンドリアと同時培養した。データは、膵島細胞生存能力が、7日間のミトコンドリアの存在下、統計的に有意な量まで増加することを示していた(図6K)。平均膵島サイズの定量は、膵島がミトコンドリアによる処理後に統計的に有意な量だけ拡大したことを示した(P=0.026、図6L)。
Claims (23)
- 成体細胞をインスリン産生細胞に機能的に再プログラミングする方法であって、
(a)ヒト対象から末梢血単核細胞(PBMC)の集団を単離するステップ;
(b)臍帯血または末梢血から血小板様細胞を含む血小板に富む画分を単離するステップ;
(c)接触がPBMCを、1つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する未熟細胞型に再プログラミングするのに有効である、ステップ(a)のPBMCの集団と、ステップ(b)の血小板に富む画分とをin vitroで接触させるステップ;および
(d)インスリン産生細胞集団がヒトベータ細胞特異的転写因子を発現し、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等である、インスリン産生細胞集団を生成するのに有効な培養条件下、in vitroで未熟細胞型を増殖させるステップ
を含む、方法。 - Ficoll−Paque勾配画分からステップ(a)の成体PBMCを単離するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- Ficoll−Paque勾配画分から血小板様細胞を含む血小板に富む画分を単離するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 血小板様細胞を含む血小板に富む画分が、全細胞、ミトコンドリア、マイクロパーティクル、エキソソーム、溶解した細胞、およびアルファ顆粒のうちの1つまたは複数を含む、請求項1に記載の方法。
- 全細胞、ミトコンドリア、マイクロパーティクル、エキソソーム、溶解した細胞、およびアルファ顆粒のうちの1つまたは複数を含む、血小板様細胞を含む血小板に富む画分が、転写因子、増殖因子、またはその両方を含む、請求項4に記載の方法。
- 全細胞が、造血幹細胞、造血始原細胞、共通リンパ球始原細胞、共通骨髄始原細胞、巨核球−赤血球始原細胞、顆粒球−単球始原細胞、巨核球系列に決定された始原細胞、巨核球、および血小板様細胞のうちの1つまたは複数を含む、請求項4に記載の方法。
- ステップ(c)に由来する1つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する血小板様細胞が、OCT3/4、NANOG、NKX6.1、MAFA、Sur1、Kir6.2、PD−L1、CD270、ガレクチン9、TGF−β1、AIRE、CCR3、CXCR4、およびCCL2のうちの1つまたは複数を含む、請求項1に記載の方法。
- 再プログラミングされた成体細胞が、神経細胞、内皮細胞、心筋細胞、筋細胞、上皮細胞、角膜内皮細胞、網膜色素細胞、破骨細胞、ケラチノサイト、毛嚢細胞、および腺細胞からなる群から選択される1つまたは複数の細胞型を含む、請求項1に記載の方法。
- 高血糖を特徴とする疾患に罹患するレシピエント対象を処置するための方法であって、
(a)ヒトドナーから末梢血単核細胞(PBMC)の集団を単離するステップ;
(b)ドナーの臍帯血または末梢血から血小板様細胞を含む血小板に富む画分を単離するステップ;
(c)接触がPBMCを、1つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する未熟細胞型に再プログラミングするのに有効である、ステップ(a)のPBMCの集団と、ステップ(b)の血小板に富む画分とをin vitroで接触させるステップ;
(d)インスリン産生細胞集団がヒトベータ細胞特異的転写因子を発現し、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等である、治療量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物を生成するのに有効な培養条件下、in vitroで未熟細胞型を増殖させるステップ;および
(e)ステップ(d)に由来する細胞生成物をレシピエント対象に投与するステップ
を含み、
ステップ(d)に由来する治療有効量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物が、高血糖症の症状を軽減するのに有効である、方法。 - ドナーとレシピエント対象が同じ個体である、請求項9に記載の方法。
- 高血糖症が自己免疫疾患である、請求項9に記載の方法。
- 自己免疫疾患が糖尿病である、請求項11に記載の方法。
- 自己免疫疾患が1型糖尿病である、請求項11に記載の方法。
- ドナーがレシピエント対象に対して同種異系である、請求項9に記載の方法。
- ステップ(b)において、血小板様細胞を含む血小板に富む画分が、全細胞、ミトコンドリア、マイクロパーティクル、エキソソーム、溶解した細胞、およびアルファ顆粒のうちの1つまたは複数を含む、請求項9に記載の方法。
- ドナーの臍帯血または末梢血に由来する血小板様細胞を含む血小板に富む画分との接触により1つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する未熟細胞型に機能的に再プログラミングされ、in vitroで増殖および再分化させた成体細胞に由来する治療量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物を含む医薬組成物であって、インスリン産生細胞集団がヒトベータ細胞特異的転写因子の発現を特徴とし、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等であり、
ステップ(c)の1つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する血小板に富む画分が、OCT3/4、NANOG、NKX6.1、MAFA、Sur1、Kir6.2、PD−L1、CD270、ガレクチン9、TGF−β1、AIRE、CCR3、CXCR4、およびCCL2のうちの1つまたは複数について陽性であり、CXCL10、CCR4、CCR5、CCR7、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CD62L、およびCXCL1について陰性である細胞の集団を含む、医薬組成物。 - 細胞生成物が、
(a)ヒトドナーから末梢血単核細胞(PBMC)の集団を単離するステップ;
(b)ドナーの臍帯血または末梢血から血小板様細胞を含む血小板に富む画分を単離するステップ;
(c)接触がPBMCを、1つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する未熟細胞型に再プログラミングするのに有効である、ステップ(a)のPBMCの集団と、ステップ(b)の血小板に富む画分とをin vitroで接触させるステップ;
(d)インスリン産生細胞集団がヒトベータ細胞特異的転写因子を発現し、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等である、治療有効量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物を生成するのに有効な培養条件下、in vitroで未熟細胞型を増殖させるステップ;および
(e)細胞生成物を薬学的に許容される担体と共に製剤化して、医薬組成物を形成させるステップ
を含むプロセスによって産生され、
ステップ(d)に由来する治療有効量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物が、高血糖を特徴とする疾患を有する対象に投与した場合、高血糖の症状を軽減するのに有効である、請求項16に記載の医薬組成物。 - 前記プロセスのステップ(b)において、血小板様細胞を含む血小板に富む画分が、全細胞、ミトコンドリア、マイクロパーティクル、エキソソーム、溶解した細胞、およびアルファ顆粒のうちの1つまたは複数を含む、請求項16に記載の医薬組成物。
- 機能的に再プログラミングされた成体細胞の集団が、CXCL10、CCR4、CCR5、CCR7、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CD62L、およびCXCL1について陰性である、OCT3/4、NANOG、NKX6.1、MAFA、Sur1、Kir6.2、PD−L1、CD270、ガレクチン9、TGF−β1、AIRE、CCR3、CXCR4、およびCCL2のうちの1つまたは複数を提示する、請求項16に記載の医薬組成物。
- 機能的に再プログラミングされた細胞がインスリンを産生することができる、請求項16に記載の医薬組成物。
- インスリン産生細胞集団がヒトベータ細胞特異的転写因子を発現し、ヒト膵臓ベータ細胞と機能的に同等である、高血糖の対象への送達のために製剤化される薬剤の調製のための、ドナーの臍帯血または末梢血に由来する血小板様細胞を含む血小板に富む画分との接触により1つまたは複数の胚性バイオマーカーを発現する未熟細胞型に再プログラミングされ、in vitroで増殖および再分化させた成体PBMCに由来する治療量のインスリン産生細胞集団を含有する細胞生成物を含む医薬組成物の使用。
- 高血糖が、自己免疫疾患の結果生じ、治療量が、自己免疫疾患の症状を改善するのに有効である、請求項20に記載の使用。
- 自己免疫疾患が1型糖尿病である、請求項21に記載の使用。
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