KR102396303B1 - 혈소판-유사 세포를 함유하는 혈액의 혈소판 풍부 분획을 이용하여 성체 세포를 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

혈소판-유사 세포를 함유하는 혈액의 혈소판 풍부 분획을 이용하여 성체 세포를 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

기재된 본 발명은 하나 이상의 배아 바이오마커를 발현하는 미성숙 세포 유형으로 성체 세포를 기능적으로 재프로그래밍하는 방법을 제공한다. 재프로그래밍은 제대혈 또는 말초 혈액으로부터의 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획과 성체 세포를 접촉시키고, 인간 베타-세포 특이적 전사 인자를 발현하고, 인간 췌장 베타-세포와 기능적으로 동등한 인슐린-생성 세포 집단을 생성시키기는 배양 조건하에서 시험관 내에서 미성숙 세포 유형을 확장시킴으로써 달성된다. 이론으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, 혈소판-유사 세포 및 이의 방출된 미토콘드리아는 면역 세포의 기능 및 분화를 조절할 수 있는 면역 내성-관련 마커를 나타낸다. 기재된 본 발명은 기능적으로 재프로그래밍된 성체 세포로부터 유래된 치료량의 인슐린-생성 세포 집단을 함유하는 세포 생성물을 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공하며, 상기 인슐린-생성 세포 집단은 인간 베타-세포 특이적 전사 인자를 발현하고, 인간 췌장 베타-세포와 기능적으로 동등하다.

Description

혈소판-유사 세포를 함유하는 혈액의 혈소판 풍부 분획을 이용하여 성체 세포를 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되는 2017년 6월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 62/520,241호, 및 2016년 8월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 62/380,913호에 대한 우선권의 이익을 주장한다.
분야
기재된 본 발명은 일반적으로 기능적으로 변형된 성체 단핵 세포를 생성시키고, 분리시키고, 이용하는 방법에 관한 것이다. 기재된 본 발명은 또한 성체 말초 혈액으로부터 유래된 인슐린 생성 세포를 생성시키고, 분리시키고, 이용하는 방법에 관한 것이다.
줄기 세포 기반 요법
조직 공학 및 재생 의학에서의 적용을 위한 줄기 세포 조작은 상당한 관심을 모으고 있다.
배아 줄기 세포(EmSC)는 다능성인 배아로부터 유래된 줄기 세포이며, 즉, 이들은 내배엽, 중배엽 및 외배엽 세포 유형으로 시험관 내에서 분화 가능하다. 배아 줄기(ES) 세포는 자가-재생에 대한 이의 높은 잠재성 및 이의 다능성 분화 능력으로 인해 매력적이나, 윤리적 우려로 인해 이의 이용 가능성 및 실제 유용성이 제한된다.
성체(체세포) 줄기 세포는 조직 또는 기관 내의 분화된 세포에서 발견되는 미분화 세포이다. 이의 생체 내에서의 주요 역할은 이들이 발견되는 조직을 유지하고 복구하는 것이다. 성체 줄기 세포는 뇌, 골수, 말초 혈액, 혈관, 골격근, 피부, 치아, 위장관, 간, 난소 상피 및 고환을 포함하는 많은 기관 및 조직에서 확인되었다. 이들은 줄기 세포 니치(niche)로 공지된 각각의 조직의 특정한 국소 미세환경에 존재하며, 여기서 이들은 이들이 조직을 유지하기 위한 더 많은 세포에 대한 정상적인 필요성에 의해 또는 질환 또는 조직 손상에 의해 활성화될 때까지 오랜 기간 동안 정지상태(비-분열)로 남아 있을 수 있다. 성체 줄기 세포의 예는 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 및 피부 줄기 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
골수는 둘 모두가 다른 세포 유형으로 분화할 수 있는 것으로 보이는 조혈 세포(성숙 혈액 세포의 전구체) 및 간질 세포(광범위한 결합 조직 세포의 전구체)를 포함하는 다양한 전구체 및 성숙 세포 유형으로 구성된다. 문헌[Wang, J. S. et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 122: 699-705 (2001); Tomita, S. et al., Circulation 100 (Suppl. II): 247-256 (1999); Saito, T. et al., Tissue Eng. 1: 327-43 (1995)].
CD34+ 세포는 골수 유래 유핵 세포의 약 1%를 차지한다. 조혈 줄기 세포(골수성 및 림프성 세포(CFU-M,L), 또는 CD34+ 세포의 집락-형성 단위로도 공지됨)는 생애 동안 혈액 세포의 지속적인 생성을 담당하는 혈액-형성 기관 내의 희귀한 다능성 세포이다. CD34 항원은 또한 미성숙 내피 세포 전구체에 의해 발현되며; 성숙 내피 세포는 CD34+를 발현하지 않는다. 문헌[Peichev, M. et al., Blood 95: 952-58 (2000)]. 시험관 내에서, 성체 골수로부터 유래된 CD34+ 세포는 대부분의 과립구/대식세포 전구 세포(CFU-GM), 일부 집락-형성 단위-혼합형(CFU-Mix) 및 소량 집단의 원시 적혈구 전구 세포(대집락 형성 단위, 적혈구 또는 BFU-E)를 발생시킨다. 문헌[Yeh, et al., Circulation 108: 2070-73 (2003)].
조혈 줄기 세포에 의해서만 발현되는 단일 세포 표면 마커는 없지만, 인간 HSC가 다음과 같은 항원성 프로파일을 갖는 것이 일반적으로 받아 들여진다: CD 34+, CD59+, Thy1+(CD90), CD38low/-, C-kit-/low 및, lin-. CD45는 또한 CD45-인 혈소판 및 적혈구 세포를 제외하고는 HSC의 일반적인 마커이다. HSC는 적혈구, 호중구, 호염기구, 호산구, 혈소판, 비만 세포, 단핵구, 조직 대식세포, 파골세포, T 림프구, 및 B 림프구를 포함하는 다양한 세포 유형을 발생시킬 수 있다. 조혈 줄기 세포의 조절은 자가-재생, 생존 및 증식, 계통 위임 및 분화를 수반하는 복잡한 과정이며, 내인성 세포 프로그래밍 및 외부 자극, 예를 들어, 미세환경 간질과의 부착성 상호작용 및 사이토카인의 작용을 포함하는 다양한 메커니즘에 의해 조율된다.
조혈 줄기 세포가 특정 경로를 따라 분화하도록 하는 데 있어 다양한 주변분비 인자가 중요하다. 혈액 세포 및 림프구 형성과 관련된 주변분비 인자는 사이토카인으로 언급된다. 사이토카인은 여러 세포 유형에 의해 제조될 수 있으나, 이들은 조혈 부위에서 간질(중간엽) 세포의 세포외 기질에 의해 수거되고 농축된다. 예를 들어, 과립구-대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF) 및 다계통 성장 인자 IL-3 둘 모두는 골수 간질의 헤파란 설페이트 글리코사미노글리칸에 결합한다. 이후, 세포외 기질은 이들 인자를 이의 수용체에 결합하기에 충분히 높은 농도로 줄기 세포에 제공한다.
HSC는 골수에 존재하나, 혈액으로 강제될 수 있으며, 이는 동원으로 언급되는 과정이다. 줄기 세포 동원은 줄기 세포가 골수에서 혈류로 자극되어, 이들이 향후의 재주입을 위해 말초 혈액으로부터의 수집에 이용 가능하도록 하는 과정이다. 임상에서 사용되는 현재의 동원 전략인 주로 G-CSF 사이토카인은 충분히 용인되나, 종종 최적 이하의 수의 수집된 HSC를 생성시킨다. 골수 니치 내의 HSC는 주로 혐기성 대사를 통해 에너지를 생성하며, 낮은 수준의 ROS를 가지고 있어, 이의 자가-재생을 촉진한다. 그러나, 말초 혈액으로의 모집시, 이의 대사 상태는 변하게 되어 더 높은 수준의 ROS의 생성을 발생시키며, 이는 세포를 분화하도록 유도하여 노화를 겪거나 아폽토시스를 발생시킬 수 있다. (Suda, T. et al, "Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche," Cell Devel. 2007; 134(14): 2541-7).
동원 및 호밍(homing)은 케모카인, 케모카인 수용체, 세포내 신호전달, 부착 분자 및 프로테아제 사이의 상호작용에 의존하는 거울상 공정이다. 골수로의 호밍은 세포 생착을 최적화시키는데 필요하다. SDF-1/CXCL12와 이의 수용체 CXCR4 사이의 상호작용은 골수 내에서 HSC를 유지시키는데 중요하다. (Suarez-Alvarez, B. et al, "mobilization and homing of hematopoietic stem cells," Adv. Exp. Med. Biol. 2012; 741: 152-70).
인간 제대혈은 여러 이유로 이식을 위한 줄기 세포의 중요한 공급원으로서 오랫 동안 관심이 집중되어 왔으며, 예를 들어, (1) 이는 골수보다 더욱 신속하게 증식하는 부피 단위 당 더 높은 수의 원시 조혈 줄기 세포(HSC)를 함유하고; (2) 이식 후 거부의 위험이 낮으며; (3) 이식은 완전한 HLA 항원 일치를 필요로 하지 않고(골수의 경우와 다름); (4) UC 혈액은 이미 선천성 대사 오류의 처리에서 성공적으로 사용되어 왔고; (5) 상기 방법이 오랜 기간 확립되어 있으므로 UC 혈액으로부터 단핵 세포의 수집 및 저장을 위한 새로운 기술이 필요하지 않다.
배아 분자 마커를 발현하는 줄기 세포는 조혈 세포의 제거 후에 재대혈로부터 보고되었다(모든 백혈구 공통 항원 CD45 양성 세포의 고갈을 포함함). (McGuckin, CP, et al, "Production of stem cells with embryonic characteristics from human umbilical cord blood," Cell Prolif. 2005; 38: 245-55). 그러나, 재대혈에서의 이러한 세포 집단의 부족은 이의 실제 적용을 유의하게 제한한다.
특정 조건하에서, 성체 분화 세포는 직접교차분화(transdifferentiation)에 의해 이의 표현형을 또 다른 성숙 세포 유형의 표현형으로 전환할 수 있다. 세포가 밀접하게 관련된 계통으로부터 유래되거나 동일한 배아층으로부터 유래되는 경우에 직접교차분화가 고도로 촉진된다. 예를 들어, 췌장 및 간 둘 모두는 내배엽-유래 기관이므로, 적절한 세트의 계통-특이적 재프로그래밍 전사 인자를 이용하여, 간세포는 췌장 베타 세포로 전환될 수 있으며, 그 반대도 마찬가지이다. (Yi, F. et al, "Rejuvenating liver and pancreas through cell transdifferentiation," Cell Res. 2012; 22(4): 616-619).
또한, 성체 체세포는, 예를 들어, Oct-3/4(또는 Pou5f1, 옥타머 전사 인자-3/4), Sox 계열의 전사 인자(예를 들어, Sox-1, Sox-2, Sox-3, 및 Sox-15), Klf 계열 전사 인자(Klf-1, Klf-2, Klf-4, 및 Klf-5), 및 Myc 계열의 전사 인자(예를 들어, c-Myc, N-Myc, 및 L-Myc)와 같은 일련의 전사 인자를 발현하도록 강제됨으로써 배아 줄기 세포-유사 상태로 진입하도록 재프로그래밍될 수 있다.
예를 들어, 인간 유도성 다능성 줄기 세포(iPSC)는 줄기 세포 마커를 발현하고, 3개 모두의 배아층(즉, 외배엽, 중배엽, 및 내배엽)의 특징적인 세포를 생성할 수 있는 전사 인자를 발현하도록 재프로그래밍된 세포이다. 다카하시 등(Takahashi et al)에 의해 원래 공개된 바와 같이(문헌[Takahashi, K., Yamanaka, S., "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors," Cell 2006; 126: 663-76]을 인용하는 문헌[Hawkins, K. et al, "Cell signalling pathways underlying iPSc reprogramming," World J. Stem Cells 2014; 6(5): 620-28]), Oct4, Sox2, Klf4 및 cMyc는 마우스 및 이후 인간 섬유모세포 둘 모두에서 레트로바이러스 통합 유전체를 이용하여 항시적으로 발현되었고, ES 세포 배양 조건하에서 다능성을 유도할 수 있었다. iPS 세포는 재프로그래밍 인자, 및 심지어 단백질(Id. Citing Zhou, H. et al, "Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins," Cell Stem Cell 2009; 4: 381-84) 또는 소분자(Hou, P. et al, "Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small molecule compounds," Science 2013; 341: 651-54) 단독을 전달하기 위해 에피솜 플라스미드(Id. Citing Yu, J. et al, "Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells," Science 2007; 318: 1917-20), 센다이 바이러스(Id. Citing Fusaki, N. et al, "Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome," Proc. Jpn Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 2009; 85: 348-62), 및 트랜스포존(Id. Citing Wang, W. et al, "Rapid and efficient reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells by retinoic acid receptor gamma and liver receptor homolog 2," Proc. Natl Acad. Sci. USA 2011; 108: 18283-288)을 이용하여 성공적으로 생성되었다. 바이러스 형질감염에 대한 최초 필요성은 최기형성(teratogenicity) 및 면역원성과 관련하여 안전성에 관한 우려를 발생시켰고, 세포의 생체 외 형질감염은 환자에서 안정적이지 않을 수 있다. 에피솜을 이용한 재프로그래밍은 동일한 우려를 발생시킨다. 마찬가지로, 화학적 재프로그래밍은 환자에서 안정적이지 않을 수 있다.
즉, 많은 다양한 세포 유형이 다능성으로 성공적으로 재프로그래밍되었다(Id.). 종종, 세포를 재프로그래밍하는데 필요한 최소 인자는 시작 세포의 내인성 "줄기세포능"에 의존하며; 예를 들어, 신경 줄기 세포는 이들이 높은 수준의 다른 인자를 발현하므로 Oct4 단독을 이용하여 재프로그래밍될 수 있다(Id. Citing Kim, JB, et al, "Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells, " Cell 2009; 136: 411-19).
호메오도메인 전사 인자 Oct4, Sox2 및 Nanog의 "코어 회로"는 마우스 및 인간 ES 세포 둘 모두에서 다능성을 지배한다(Id. Citing Chambers, I., Tomlinson, SR," The transcriptional foundation of pluripotency," Development 2009; 136: 2311022). 이들 전사 인자는 주머니배의 내부 세포 덩어리 내에서 생체 내 및 다능성 세포에서 시험관 내 둘 모두에서 발현된다. 이들의 밀접한 상호작용은 다능성 상태를 유지시키는데 필요한 코어 회로의 정밀한 조절을 촉진하며; 예를 들어, Oct4 과발현은 내배엽 및 중배엽 분화를 발생시키는 반면, Oct4의 차단은 영양막 분화를 유도한다(Id. Citing Niwa, H. et al, "Quantitative expression of Oct3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells," Nat. Genet. 2000; 24: 372-76). Oct4의 낮은 수준은 Nanog의 상향조절을 발생시키는 반면, Oct4의 높은 수준은 Nanog의 하향조절을 발생시킨다(Id. Citing Loh, YH, et al, "The Oct4 and Nanog transcriptin network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells," Nat. Genet. 2006’ 38: 431-440). 유사하게, Sox2 발현에서의 작은 증가 또는 Sox 2 발현의 제거 둘 모두는 다계통 분화를 유도한다(Id. Citing Klopp, JL et al, "Small increases in the level of Sox2 trigger the differentiation of mouse embryonic stem cells," Stem Cells 2008; 26: 903-11). 3개 모두의 인자는 서로뿐만 아니라 그들 자체의 발현을 조절하는 것으로 나타났다. (Id. Citing Boyer, LA et al, "Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells," Cell 2005; 122: 947-56; Loh, YH, et al, "The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells," Nat. Genet. 2006' 38: 431-440; Pan, G. et al, "A negative feedback loop of transcription factors that controls stem cell pluripotency and self-renewal," FASEB J. 2006; 20: 1730-32).
iPSc 재프로그래밍의 기반이 되는 세포 신호전달 경로
유도된 다능성 줄기 세포 재프로그램잉은 개시, 성숙, 및 안정화의 3개의 단계로 이루어진다. 문헌[Samavarchi-Tehrani et al (36)]을 인용하는 문헌[Hawkins, K. et al, "Cell signalling pathways underlying iPSc reprogramming," World J. Stem Cells 2014; 6(5): 620-28)].
개시 단계는 운동성과 같은 중간엽 특징의 상실, 및 세포 극성 및 E-카드헤린의 발현과 같은 상피 특징의 획득을 수반(Id. Citing Redmer, T et al, "E-cadherin is crucial for embryonic stemcell pluripotency and can replace OCT4 during somatic cell reprogramming," EMBO Rep. 2011; 12: 720-26)하는 메틸화에 의해 꺼지는 체세포 유전자, 세포 증식에서의 증가, 산화 인산화로부터 해당작용으로의 대사 전환, 텔로메라제 활성의 재활성화 및 중간엽-상피 이행(MET)(Id. Citing David, L, and Polo, JM, "Phases of reprogramming," Stem Cell Res. 2014; 12: 754-61)을 특징으로 한다. 기계적으로, Sox2는 EMT 유도인자인 Snail의 발현을 억제하고(Id. Citing Liu, X et al, "Sequential introduction of reprogramming factors reveals a time-sensitive requirement for individual factors and a sequential EMT-MET mechanism for optimal reprogramming," Nat. Cell Biol. 2013; 15: 829-38), Klf4는 E-카드헤린 발현을 유도하며, 이에 따라 MET를 촉진한다(Id. Citing Li, R et al., "A mesenchymal-to-epithelial transition initiates and is required for the nuclear reprogramming of mouse fibroblasts," Cell Stem Cell 2010; 7: 51-63). TGFβ 억제는 마우스(Id. Citing Maherali, N et al, "Tgfbeta signal inhibition cooperates in the induction of iPSCs and replaces Sox2 and cMyc," Curr. Biol. 2009; 19: 1718-23; Shi, Y. et al, "A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells," Cell Stem Cell 2008; 2: 525-28) 및 인간 체세포 재프로그래밍(Id. Citing Lin, T., et al, "A chemical platform for improved induction of human iPSCs," Nat. Methods 2009; 6: 805-808) 둘 모두의 개시 단계를 향상시킬 수 있으며, 이는 재조합 TGFβ의 첨가가 TGFβ 신호전달의 EMT-유도 작용으로 인해 iPS 세포 형성을 폐기하고, 이는 이후에 MET를 방지하는 것을 제시한다. TGFβ 억제제는 Nanog 발현, 및 TGFβ에 의해 활성화된 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK) 신호전달을 촉진하며, 추가로 중배엽 유전자의 발현을 유도한다(Id. Citing Thierry, JP, Sleeman, JP, "Complex networks orchestrate epitheial-mesenchymal transitions," Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 2006; 7: 131-42). 따라서, MAPK 신호전달의 억제제는 MET를 촉진하기 위해 TGFβ 억제제와 조합하여 사용되어 왔다(Id. Citing Lin, T., et al, "A chemical platform for improved induction of human iPSCs," Nat. Methods 2009; 6: 805-808).
골 형태형성 단백질(BMP) 신호전달은 또한 E-카드헤린, 오클루딘(occludin) 및 상피 세포 부착 분자와 같은 상피 유전자의 상향조절을 통해 MET를 촉진함으로써 마우스 iPS 세포 재프로그래밍의 개시 단계에서 중요한 역할을 한다(Id. Citing Samavarchi-Tehrani, P. et al, "Functional genomics reveals a BMP-driven mesenchymal-to-epithelial transition In the initiation of somatic cell reprogramming," Cell Stem Cell 2010; 7: 64-77). 그러나, 항시적 BMP 활성화는 인간 체세포 재프로그래밍을 방지한다.
섬유모세포 성장 인자(FGF) 신호전달이 또한 개시 단계와 관련되어 있다(Id. Citing Jiao, J. et al, "Promoting reprogramming by FGF2 reveals that the extracellular matrix is a barrier for reprogramming fibroblasts to pluripotency," Stem Cells 2013; 31: 729-740). FGF2가 세포 증식 가속화, MET 촉진 및 세포외 콜라겐 제거를 통해 재프로그래밍의 초기 단계를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 증가된 증식 속도에 더하여, 성공적인 재프로그래밍을 겪는 소수 세포는 또한 트랜스진(transgene) 발현에 의해 아폽토시스 및 노화에 대한 내성을 나타낸다(Id. Citing Papp, B, "Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape," Cell Res. 2011; 21: 486-501).
개시 단계는 또한 PI3K/AKT 신호전달(Id. Citing Zhu, S. et al, "Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds," Cell Stem Cell 2010; 7: 651-55; Chen, M. et al, "Promotion of the induction of cell pluripotency through metabolic remodeling by thyroid hormone triiodothyronine-activated PI3K/AKT signal pathway," Biomaterials 2012; 33: 5514-23)을 수반하는 산화적 인산화로부터 해당작용으로의 대사 전환(Id. Citing Panopoulos, AD et al, "The metabolome of induced pluripotent stem cells reveals metabolic changes occurring in somatic cell reprogramming," Cell Res. 2012; 22: 168-77)을 특징으로 한다.
성숙 단계 동안, 후성적 변화가 발생하여 첫 번째 다능성-관련 유전자의 발현을 가능하게 하며(Id. Citing David, L, and Polo, JM, "Phases of reprogramming," Stem Cell Res. 2014; 12: 754-61), 이는 Fbxo15, Sal4, Oct4, Nanog 및 Esrrb를 포함한다. 마우스 iPS 세포 재프로그래밍의 성숙 단계를 위해 LIF/STAT3 신호전달이 필요하다(Id. Citing Tang, Y and Tian, XC, "JAK-STAT3 and somatic cell reprogramming," JAK-STAT 2013; 2: e24935). Wnt 신호전달은 또한 마우스 체세포 재프로그래밍의 성숙 단계를 향상시킴으로써, 재프로그래밍의 유도 후 Wnt3a를 이용하는 경로의 외인성 자극이 Nanog 양성 집락의 형성을 향상시킨다(Id. Citing Ho, R, et al, "Stage-specific regulation of reprogramming to induced pluripotent stem cells by Wnt signaling and T cell factor proteins," Cell Rep. 2013; 3: 2113-26).
안정화 단계는 트랜스진 독립성을 특징으로 하며, 따라서, 내인성 다능성 유전자 발현을 활성화한 세포만 이러한 후기 단계에서 다능성을 유지할 수 있다.
혈소판
거대한(50 내지 100 μm 직경) 다핵(최대 128 N) 거대핵세포(MK)로부터 생성된 무핵의 원반-형태의 세포 단편인 혈소판은 지혈(혈관 손상 부위에서의 혈액 손실의 정지를 의미함) 및 혈관 복구에서 중추적인 역할을 한다. 문헌[Principles of Tissue Engineering, 4th Ed., Robert Lanza, Robert Langer, Joseph Vacanti, Eds, Elsevier, Inc.: New York, 2014 at 1047-1048]. 이들은 말초 혈액 리터 당 약 3 x 1011개의 세포로 존재하며, 즉, RBC에 이어 두 번째이다. 혈소판은 짧은 수명을 가지며, 순환에서 7-9일만 지속된다.
혈소판 기능
일차 지혈은 혈소판 부착 및 동시적인 혈소판 활성화, 인접한 혈소판을 활성화시키기 위한 혈소판 분비, 혈소판 응집, 및 궁극적으로 혈소판 플러그의 형성 및 응고 인자 복합체의 어셈블리를 가능하게 하는 표면의 생성을 발생시키는 수용체/리간드 상호작용의 상승작용적 네트워크를 통해 달성된다. 문헌[Haley, KM et al, "Neonatal platelets: mediators of primary hemostasis in the developing hemostatic system," Pediatr. Res. 2014; 76(3): 230-37].
혈소판 부착. 혈관 손상 및 수반하는 내피 손상 후, 일차 지혈의 과정을 개시하는 혈소판 부착이 단계적 방식으로 수용체/리간드 상호작용을 통해 매개된다. Id. 세포외 폰 빌레브란트 인자(VWF)-혈소판 당단백질(GP) Ib 결합은 손상된 영역으로의 초기 혈소판 모집을 매개한다. Id. 혈소판 GPVI는 원섬유 콜라겐과 상호작용하고, 혈소판 β1 인테그린은 라미닌, 콜라겐 및 섬유결합소와 상호작용하며, 이는 노출된 세포외 기질에 혈소판을 강하게 부착시킨다. Id.
혈소판 활성화. 혈소판 부착 후, 일련의 다운스트림 신호전달 사건은 응집 인자의 어셈블리를 가능하게 하는 혈소판 막 표면상에서의 음성으로 하전된 포스파티딜세린(PS)의 노출로 표시되는 세포내 칼슘의 증가 및 이후의 혈소판 활성화; 혈소판 알파 및 델타 과립 분비를 발생시키며, 이는 ADP, 칼슘, 세로토닌, VWF, 응집 인자 V 및 VIII, 및 섬유소원의 방출; VWF 및 섬유소원 결합을 위한 고 친화성 상태로의 혈소판 막 GPIIb/IIIa 인테그린 전환; 아라키돈산 대사를 통한 트롬복산 A2 생성; 및 확산 혈소판의 표면적을 증가시키는 세포골격 재구성을 발생시킨다. Id.
혈소판 응집. 안정적인 혈소판 응집체의 발달을 위한 핵심 단계는 GPIIb/IIIa 수용체의 이의 고 친화성 입체형태로의 전환이다. Id. 이는 수용체와 섬유소원, VWF, 및 섬유결합소 사이의 안정적인 산호작용을 가능하게 한다. 혈소판은 함께 응집하여 일차 지혈의 최종 생성물인 혈소판 플러그를 형성한다.
혈소판 마커
활성화 전에 혈소판 표면에 나타나는 마커 . 활성화 전에 혈소판 표면에 나타나는 혈소판 표면 마커는 CD41(GP IIb/IIIa), CD42a(GPIX), CD42b(GPIb), 및 CD61(avb3, 비트로넥틴 수용체)을 포함한다.
인테그린 알파 사슬 2b(CD41)는 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 폴리펩티드 사슬을 발생시키는 번역 후 변형을 겪는 이종이량체 통합 막 단백질이다. CD41은 혈소판 및 거대핵세포 및 초기 배아 조혈 줄기 세포에서 발현된다. 베타 3 사슬(CD61) 인테그린 αIIIbβ3와 회합된 인테그린 알파 사슬에 의해 형성된 CD41/CD61 복합체는 섬유결합소, 섬유소원, 폰 빌레브란트 인자, 비트로넥틴 및 트롬보스폰딘에 대한 수용체이며, 응고에서 중요한 역할을 한다. GPIIb/IIIa 수용체(인테그린 αIIbβ3)는 가장 풍부한 세포 표면 수용체 중 하나(혈소판 당 약 80,000개)이며[Wagner CL, Mascelli MA, Neblock DS, Weisman HF, Coller BS, Jordan RE. Analysis of GPIIb/IIIa receptor number by quantitation of 7E3 binding to human platelets. Blood. 1996;88:907-914], 이는 전체 표면 단백질의 약 15%를 차지한다. [Jennings, LK, Phillips, DR, "Purification of glycoproteins IIb and III from human platelet plasma membranes and characterization of a calcium-dependent glycoprotein IIb-III complex. J Biol Chem. 1982;257:10458-10466]. 휴지 혈소판에서, 이러한 수용체는 폰 빌레브란트 인자 및 혈장 섬유소원에 대해 최소의 결합 친화성을 나타낸다. [French, DL, Seligsohn, U, "Platelet Glycoprotein IIb/IIIa receptors and Glanzmann's throbasthenia," Arteriosclerosis, thrombosis and Vascular Biology 2000: 20: 607-610].
CD42a-d 복합체는 폰 빌레브란트 인자 및 트롬빈에 대한 수용체이다. CD42a는 또한 혈소판 당단백질 GPIX, GP9a로 언급된다. CD42b는 또한 혈소판 GPIb 알파, 또는 당단백질 1b-알파로 언급된다.
활성화 동안 혈소판 표면에 나타나는 마커 . 활성화 동안 혈소판 표면에 나타나는 마커의 예는 활성화된 IIb/IIIa, CD62P(P-셀렉틴), CD31(PECAM) 및 CD63을 포함한다.
활성화된 상태에서, "내부에서 외부로의" 신호 전달 메커니즘[Shattil SJ, Kashiwagi H, Pampori N. Integrin signaling: the platelet paradigm. Blood. 1998;91:2645-2657]은 부착성 당단백질을 결합시키고, 혈소판 플러그를 형성시키는데 적격인 고-친화성 리간드-결합 상태로의 GPIIb/IIIa 수용체(인테그린 αIIbβ3)에서의 입체형태적 변화를 촉발시킨다.
P-셀렉틴은 백혈구 표면 상의 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1) 대응수용체(counterreceptor)를 통해 단핵구 및 호중구에 대한 활성화된 혈소판의 초기 부착을 매개한다. [Michelson, AD and Furman, MI, "Markers of Platelet Activation and Granule Secretion," in Contemporary Cardiology: Platelet Function: Assessment, Diagnosis and Treatment, M. Quinn and D. Fitzgerald, Eds, Humana Press, Towaco NJ: 2005]. 이는 α 과립 분비 후에 혈소판 표면 막 상에서만 발현되는 휴지 혈소판의 α 과립 막의 구성요소이다. Id. 생체 내에서, 순환하는 탈과립화된 혈소판은 이의 표면 P-셀렉틴을 신속하게 상실하나, 계속 순환하고 작용한다. Id. 혈장에서의 가용성 P-셀렉틴은 내피 세포 기원일 수 있다. Id.
가용성 CD40 리간드(sCD40L, CD154)는 생체 내 혈소판 활성화의 혈장 마커이다. Id. 활성화된 혈소판에 의한 sCD40L의 방출은 혈장 sCD40L의 우세한 공급원이며; sCD40L 방출의 메커니즘은 혈소판 표면 CD40L의 단백질분해이다. Id. 생체 내 순환 sCD40L의 정확한 측정은 혈청보다는 혈장에서의 검정을 필요로 한다. Id.
리소좀 활성화 막 단백질(CD63)은 인테그린과 복합체화되는 것으로 공지된 세포 표면 당단백질이다. 이는 혈액 혈소판 활성화 마커로 작용할 수 있다.
혈소판 표면 P-셀렉틴(CD62P)은 α 과립 분비 후에 혈소판 표면 막 상에서만 발현되는 휴지 혈소판의 α-과립 막의 구성요소이다.
거대핵세포형성 및 혈소판형성
혈소판의 전구체인 거대핵세포(MK)는 혈액계에 혈소판의 일정한 공급원을 제공하며, 그 자체가 거대핵세포형성의 과정을 통해 생성된다. RBC와 마찬가지로, MK는 조혈 줄기 세포(HSC)의 골수성 공통전구세포(common myeloid progenitors; CMP)로의 초기 분화를 통해 생성된다. (Kaushansky, K., "Historical Review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis," Blood 2008; 111(3): 981-86). 거대핵세포 계통으로의 CMP의 점진적 위임(commitment)은 주로 트롬보포이에틴(TPO)에 의해 조절된다. 위임된 거대핵세포 전구 세포인 집락 형성 단위-거대핵세포(CFU-MK)가 증식하고, 거대핵세포로 분화한다. Id. 거대핵세포의 성숙은 세포 표면 마커 GPIIb/IIIa(CD41 또는 αIIb/βIII 인테그린 수용체로도 공지됨) 및 GPIb/GPIX/GPV 수용체의 발현에서의 증가, 및 세포 질량의 실질적인 증가를 수반하며, 이는 α 과립구, 치밀소체, 및 폰 빌레브란트 인자(vWF) 및 혈소판 인자-4와 같은 혈소판-관련 단백질의 세포질 축적을 발생시킨다. Id. 여러 라운드의 핵내분열은 다배체화 및 DNA 함량이 최대 128N인 세포를 발생시킨다. Id. 일단 다배수체 MK가 생성되면, '프로토혈소판(protoplatelet)'으로 언급되는 MK 몸체 상의 세포 과정이 나타나기 시작하며, 이의 궁극적인 단편화 및 방출이 발생하여 혈소판의 생성을 발생시킨다. Id.
말초 혈액(PB), 골수(BM) 및 CB로부터의 HSC가 또한 거대핵세포 및 기능성 혈소판을 생성시킬 수 있다. (문헌[Norol, F et al, Effects of cytokines on platelet production from blood and marrow CD34+ cells. Blood 1998; 91(3); 830-43; Bruno, S. et al, In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells; rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica 2003; 88(4): 379-87; Ungerer, M et al, Generation of functional culture-derived platelets from CD34+ progenitor cells to study transgenes in the platelet environment; Cir. Res. 2004; 95(5): e36-44] 참조).
거대핵세포형성의 세포 기원
거대핵세포만 함유하는 2개의 집락 형태가 반고체 배지에서 기재되었다. [Kaushansky, K., "Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis, Blood 2001; 111(3): 981-86]. 집락-형성 단위-거대핵세포(CFU-MK)는 3 내지 50개의 성숙 거대핵세포를 함유하는 간단한 집락으로 발달하는 세포이며; 거대핵세포의 위성 수집물을 포함하고 최대 수백개의 세포를 함유하는 더 크고 더 복잡한 집락이 대집락-형성 단위-거대핵세포(BFU-MK)로부터 유래된다. Id. 증식 잠재성의 차이 및 적혈구 전구체에 대한 유사함으로 인해, BFU-MK 및 CFU-MK는 계통으로 제한되는 원시 및 성숙 전구체를 각각 나타내는 것으로 생각된다. Id. 적혈구 대응물과 마찬가지로, CFU-MK에 대한 사이토카인 요건은 간단하며; 트롬보포이에틴은 모든 CFU-MK의 75%의 성장을 자극하며, 나머지에 대해서는 트롬보포이에틴과 함께 인터루킨(IL)-3을 필요로 한다. 원시 전구 세포로부터 더 복잡하고 더 큰 MK 집락 형성을 위해서는 트롬보포이에틴과 함께 IL-3 또는 스틸 인자(SF)를 필요로 한다.
거대핵세포는 또한 하나 이상의 추가 조혈 계통의 세포를 함유하는 클론 집락에서 발생한다. 가장 원시적인 시험관 내 집락-형성 세포는 집락-형성 단위-과립구-적혈구-단핵구-거대핵세포(CFU-GEMM), 혼합형 전구체 집락(CFU-Mix), 또는 골수성 공통전구세포(CMP; Id. Citing Akashi K, Traver D, Miyamoto T, Weissman IL. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 2000;404:193-19719)로 언급되며, 이러한 세포로부터 유래된 집락은 종종 여러 거대핵세포를 함유한다. CMP의 유도체는 혼합형 MK-적혈구 전구 세포이다(MEP; Id. Citing Nakorn TN, Miyamoto T, Weissman IL. Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100:205-210). 이의 정제 전에, MEP의 존재는 여러 일반적인 전사 인자(SCL, GATA1, GATA2, NF-E2), 세포 표면 분자(TER119), 및 사이토카인 수용체(예를 들어, IL-3, SF, 에리트로포이에틴, 및 트롬보포이에틴)의 발현을 포함하는 적혈구 및 거대핵세포 계통의 세포의 많은 일반적 특징, 및 대부분의 적혈구 및 MK 백혈구 세포주가 나타내거나, 나타내도록 유도될 수 있는 결과, 대안적 계통의 특징을 기초로 하여 가정되었다. (Id. Citing McDonald TP, Sullivan PS. Megakaryocytic and erythrocytic cell lines share a common precursor cell. Exp Hematol. 1993;21:1316-1320; Nakahata T, Okumura N. Cell surface antigen expression in human erythroid progenitors: erythroid and megakaryocytic markers. Leuk Lymphoma. 1994;13:401-409). 또한, 이들 2개의 계통의 발달을 가장 담당하는 사이토카인으로, 조혈 사이토카인 계열에서 2개의 가장 밀접하게 관련된 단백질인 에리트로포이에틴 및 트롬보포이에틴(Id. Citing Lok S, Kaushansky K, Holly RD, et al. Cloning and expression of murine thrombopoietin cDNA and stimulation of platelet production in vivo. Nature. 1994;369:565-568)은 둘 모두의 계통의 전구체의 성장을 자극하는데 있어서 상승작용을 나타낸다. (Id. Citing Broudy VC, Lin NL, Kaushansky K. Thrombopoietin (c-mpl ligand) acts synergistically with erythropoietin, stem cell factor, and interleukin-11 to enhance murine megakaryocyte colony growth and increases megakaryocyte ploidy in vitro. Blood. 1995;85:1719-1726).
계통으로의 위임을 가능하게 하는 거대핵세포 전구체에 의해 발현된 전사 인자는 GATA1, 및 FOG29를 포함한다. GATA1은 50 kDa 징크 핑거 DNA 결합 단백질을 인코딩하는 X-연관 유전자이다. (Id. Citing Martin DI, Zon LI, Mutter G, Orkin SH. Expression of an erythroid transcription factor in megakaryocytic and mast cell lineages. Nature. 1990;344:444-447). 전사 인자의 유전적 제거는 조혈에서의 이러한 전사 인자의 중요한 역할을 확립하였으며; GATA1-/- 조건은 적혈구생성의 실패로 인해 태아에 치명적이고(Id. Citing Pevny L, Simon MC, Robertson E, et al. Erythroid differentiation in chimaeric mice blocked by a targeted mutation in the gene for transcription factor GATA-1. Nature. 1991;349:257-260), GATA1의 거대핵세포-특이적 제거는 거대핵구형성이상으로 인해 심각한 혈소판감소증을 발생시킨다. (Id. Citing Shivdasani RA, Fujiwara Y, McDevitt MA, Orkin SH. A lineage-selective knockout establishes the critical role of transcription factor GATA-1 in megakaryocyte growth and platelet development. EMBO J. 1997;16:3965-3973). GATA1은 DNA에 결합하지 않고 전사에 영향을 미치는 또 다른 단백질인 friend of GATA(FOG29)와 함께 작용한다.
전사 인자의 ets 계열은 퓨린 박스 서열에 결합하고, 양성 및 길항적 방식 둘 모두로 상호작용하는 단백질로 구성된 약 30개의 구성원을 포함한다. 예를 들어, 비장 포커스-형성 바이러스 생성물과의 회합을 기초로 하여 Spi-1로 초기에 명명된 PU.1은 적혈구 분화를 차단하나, 거대핵세포 발달을 지원한다(Id. Citing Doubeikovski A, Uzan G, Doubeikovski Z, et al. Thrombopoietin-induced expression of the glycoprotein IIb gene involves the transcription factor PU. 1/Spi-1 in UT7-Mpl cells. J Biol Chem. 1997;272:24300-24307). 또한, ets 인자 Fli-1은 거대핵세포형성에 필수적이며(Id. Citing Athanasiou M, Clausen PA, Mavrothalassitis GJ, Zhang XK, Watson DK, Blair DG. Increased expression of the ETS-related transcription factor FLI-1/ERGB correlates with and can induce the megakaryocytic phenotype. Cell Growth Differ. 1996;7:1525-1534), 전사 인자의 유전 영역에서의 돌연변이는 인간에서의 선천성 혈소판감소증과 관련된다. (Id. Citing Hart A, Melet F, Grossfeld P, et al. Fli-1 is required for murine vascular and megakaryocytic development and is hemizygously deleted in patients with thrombocytopenia. Immunity. 2000;13:167-177).
혈소판형성
혈소판형성은 혈소판의 형성 과정이다. 분자 수준에서, 혈소판형성은 막과 미세소관의 정교한 재구성 및 과립과 세포소기관의 정확한 분포를 갖는 고도의 조정 과정이다. 혈소판은 막, 세포소기관, 과립, 및 가용성 거대분자의 거의 전체 세포질 보충물을 소비하는 과정에서 프로혈소판(proplatelet)으로 명명된 성숙 거대핵세포 막 슈도포디알 돌출부(pseudopodial projection)의 단편화에 의해 형성된다(Kaushansky citing Patel SR, Hartwig JH, Italiano JE., Jr The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 2005;115:3348-3354). 잔여 핵 물질이 대식세포-매개 포식작용에 의해 제거(Id. Citing Radley JM, Haller CJ. Fate of senescent megakaryocytes in the bone marrow. Br J Haematol. 1983;53:277-287)되기 전에 각각의 거대핵세포가 1000 내지 3000개의 혈소판을 발생시키는 것으로 추정되었다(Id. Citing Stenberg PE, Levin J. Mechanisms of platelet production. Blood Cells. 1989;15:23-47). 이러한 과정은 상기 과정의 말단이 분지되고, 혈소판을 배출하는 매우 활동적이고 운동성인 과정 동안 액틴 및 튜불린을 포함하는 세포골격 구성요소 및 거대핵세포 막의 대규모의 재구성을 수반한다(Id. Citing Italiano JE, Jr, Lecine P, Shivdasani RA, Hartwig JH. Blood platelets are assembled principally at the ends of proplatelet processes produced by differentiated megakaryocytes. J Cell Biol. 1999;147:1299-1312). 국소화된 아폽토시스는 액틴 세포골격의 제약으로부터의 프로혈소판 과정을 잠재적으로 발생시킴으로써 혈소판 형성의 최종 단계 개시에서 역할을 할 수 있다(Id. Citing Li J, Kuter DJ. The end is just the beginning: megakaryocyte apoptosis and platelet release. Int J Hematol. 2001;74:365-374; De Botton S, Sabri S, Daugas E, et al. Platelet formation is the consequence of caspase activation within megakaryocytes. Blood. 2002;100:1310-1317). 프로혈소판 성숙의 최종 단계 동안, 세포질 세포소기관 및 분비 과립은 프로혈소판 과정의 원위 말단으로 이동하여, 거기에 갇힌다(Id. Citing Richardson JL, Shivdasani RA, Boers C, Hartwig JH, Italiano JE., Jr Mechanisms of organelle transport and capture along proplatelets during platelet production. Blood. 2005;106:4066-4075). 서로 상에서 활주하는 미세소관은 프로혈소판 과정의 신장 및 세포소기관 수송을 구동시키는 엔진이다(Id. Citing Patel SR, Richardson JL, Schulze H, et al. Differential roles of microtubule assembly and sliding in proplatelet formation by megakaryocytes. Blood. 2005;106:4076-4085). 트롬보포이에틴은 혈소판형성의 주요 조절인자이나, 무엇이 성숙 혈소판의 크기를 결정하거나, 혈소판 형성의 메커니즘이 전사 인자 GATA1, 당단백질 Ib/IX 복합체, 비스코트 알드리치 증후군 단백질(Wiskott Aldrich syndrome protein; WASP), 및 혈소판 미오신(이들 유전자 각각의 결함은 비정상적으로 크거나 작은 혈소판을 발생시킴)에 의해 영향을 받는 방식에 대해 거의 공지된 바가 없다. (Id. Citing Geddis AE, Kaushansky K. Inherited thrombocytopenias: toward a molecular understanding of disorders of platelet production. Curr Opin Pediatr. 2004;16:15-22). 혈소판이 발생하는 완전히 성숙한 거대핵세포의 생성을 위한 트롬보포이에틴의 중요성에도 불구하고, 혈소판 형성의 최종 단계 동안 사이토카인의 제거는 유해하지 않다(Id. Citing Choi ES, Nichol JL, Hokom MM, Hornkohl AC, Hunt P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 1995;85:402-413).
제대혈
2개 유형의 제대 줄기 세포, 즉, 조혈 줄기 세포(UC-HS) 및 중간엽 줄기 세포가 발견될 수 있으며, 이는 차례로 제대혈(UC-MS) 또는 와튼 젤리(UC-MM)에서 발견될 수 있다.
제대(UC) 혈관 및 주위 중간엽(와튼 젤리로 공지된 결합 조직을 포함함)은 배아 및/또는 배아외 중피로부터 유래된다. 따라서, 이들 조직, 뿐만 아니라 원시 배세포는 MSC 및 심지어 다능성 잠재성을 갖는 일부 세포를 함유하는 배아의 원시 라인 형성시에 근위 배아덩이위판으로부터 분화된다. UC 기질 물질은 성체 골수 중간엽으로의 이행 상태에 있는 원시 중간엽에서 유래되는 것으로 추측된다(Mihu, C. et al., 2008, Romanian Journal of Morphology and Embryology, 2008, 49(4):441-446).
적혈구, 백혈구, 혈소판 및 혈장인 혈액의 일반 요소 모두를 함유하는 태반 및 제대로부터의 혈액은 항응고제 물질을 함유하는 일반적인 헌혈 백에서 수집하기에 비교적 용이하다. 이후, 단핵 세포가 밀도 구배 원심분리에 의해 분리된다. Ficoll-Paque 밀도 구배 원심분리에서, 항응고제-처리 및 희석된 제대혈은 Ficoll-Paque 용액 상에 놓고, 원심분리된다. 원심분리 동안, 적혈구 및 과립구는 바닥 층으로 침강한다. 제대혈 단핵 세포 및 낮은 밀도를 갖는 다른 천천히 침강하는 입자(예를 들어, 혈소판)는 혈장과 Ficoll-Paque 사이의 계면에 유지되고, 여기서 이들은 수집될 수 있다. (Jaatinen, T., Laine, J. "Isolation of Mononuclear Cells from Human Cord Blood by Ficoll-Paque Density Gradient," Unit 2A, Curr. Protocols in Stem Cell Biol., DOI: 10.1002/9780470151808.sc02a01s1). 혈소판 성장 인자에 대한 계면에서의 세포의 노출은 상기 세포의 기능적 특성에 영향을 미칠 잠재성을 갖는다(Aghideh, AN et al, "Platelet growth factors suppress ex vivo expansion and enhance differentiation of umbilical cord blood CD133+ stem cells to megakaryocyte progenitor cells," Growth Factors 2010; 28(6): 409-16, Citing Voss, et al, "Flow cytometric detection of platelet activation in patients undergoing diagnostic and interventional coronary angiography, "Platelets 1996; 7: 237-41 1996; Gutensohn, K. et al, "Flow cytometric analysis of platelet membrane antigens during and after continuous flow plateletpheresis," Transfusion 1997: 37: 809-15; Gutensohn, K. "Alteration ofplatelet-associated membrane glycoproteins during extracorporeal apheresis of peripheral blood progenitor cells," J. Hematother. 1997; 6: 315-21; Stroncek, et al., "/composition of peripheral blood progenitor cell components collected from a healthy donors [sic]," Transfusion 1997; 37: 411-17; Stroncek, DF et al, "Collection of two peripheral blood stem cell concentrates from healthy donors," Transfus. Med. 1999; 9: 37-50; Bruserud, O et al, "Autologous stem cell transplantation as post-remission therapy in adult acute myelogenous leukemia: Does platelet contamination of peripheral blood mobilized stem cell grafts influence the risk of leukemia relapse?, J. Hematother. Stem cell Res. 2000; 9: 433-43; Saigo, K., et al., "RANTES and p-Selectin in peripheral blood stem," Ther. Apher. Dial. 2001; 5: 517-18).
단핵 세포 분획은 2개의 줄기 세포 집단을 포함한다: (1) 특정한 특징적인 마커(CD34, CD133)를 발현하는 조혈 줄기 세포(HSC); 및 (2) 특정 조건(예를 들어, 소 태아 혈청(FBS) 또는 우 태아 혈청(FCS)을 갖는 혈관의 라이닝 및 변형된 맥코이(McCoy) 배지)하에서 배양 표면에 부착할 수 있는 중간엽 줄기 세포(MSC). (Munn, D. et al., Science, 1998, 281: 1191-1193; Munn, D. et al., J Exp Med, 1999, 189: 1363-1372). 제대혈 MSC(UC-MS)는 골수 MSC와 비교하여 공여자에서의 이식 및 시험관 내 HSC 생존을 촉진하는 사이토카인을 생성할 수 있다. (Zhang, X et al., Biochem Biophys Res Commun, 2006, 351: 853-859).
제대 기질(UC-MM)로부터의 MSC는 결합 기질, 제대 정맥으로부터의 내피하 세포 또는 심지어 전체 제대 체외이식편으로부터의 MSC와 같이 세포의 공급원에 따라 상이한 배양 방법에 의해 획득된다. 이들은 일반적으로 다양한 영양 및 성장 인자가 보충된 DMEM 배지에서 잘 배양되며, 특정 경우에, 히알루론산을 이용한 혈관의 사전 처리가 이로운 것으로 판명되었다(Baban, B. et al., J Reprod Immunol, 2004, 61: 67-77).
인간 제대혈(HUCB)은 대집락-형성 단위 및 과립구-대식세포 집락-형성 단위에 대한 표준 클론원성 검정에서 측정된 바와 같이 조혈 전구 세포에서 풍부하다. (문헌[Broxmeyer, HE et al, "Human umbilical cord blood as a potential source of transplantable hemopoietic stem/progenitor cells, " Proc. Natl Acad. Sci. USA (1989) 86: 3828-3719]을 인용하는 문헌[Cicuttini, FM and Boyd AW, "Hematopoietic and lymphoid progenitor cells in human umbilical cord blood," Devel. Immunol. 4: 1-11 (1994)]).
인간 제대혈의 시험관내 배양은 다분화능(CFU-GEMM), 적혈구(BFU-E), 및 과립구-대식세포(CFU-GM) 전구 세포를 입증하였다(Id. citing Leary, AG et al, "Single cell origin of multi-lineage colonies in culture. Evidence that differentiation of multipotent progenitors and restriction of proliferative potential of monopotent progenitors ar stochastic processes," J. Clin. Invest. (1984); 74: 2193-97). 일부분의 집락은 또한 이차 아가 배양으로 재플레이팅되는 경우 이차 집락을 형성하는 전구체를 함유하며, 이는 집락이 제한된 자가-재생 특성을 갖는 단일 세포로부터 발생함을 암시한다. 제대혈 전구체의 빈도(형성된 집락의 수/플레이팅된 세포의 수)는 골수의 빈도와 동등하거나 이를 초과하며, 성체 혈액의 빈도를 크게 능가한다. HUCB로부터의 전구 세포는 장기간 액체 배양 시스템에서 수주 동안 유지될 수 있으며, 이는 더욱 원시 세포로부터의 이의 생성을 암시한다(Id. citing Salahuddin, SZ et al, "Long term suspension cultures of human cord blood myeloid cells," 1981; Blood 58: 931-38; Smith, S & Broxmeyer, HE; "The influence of oxygen tension on the long-term growth in vitro of hemopoietic progenitor cells from human cord blood," Brit. J. Haematol. (1986): 63: 29-34).
면역고갈 후 양성 FACS 분류에 의한 HUCB로부터의 고도로 정제된 CD34+ 전구 세포의 정제는 집락-형성 세포(CFC)의 100배 초과의 농축을 발생시켰다. Id. 제대혈 전구 세포는 줄기 세포 인자(SCF) 및 최적 성장 인자의 존재하에서 성장된 제대혈 CD34+ 세포가 혼합된 집락(CFU-GEMM)의 50-80%를 발생시킨다는 점에서 매우 초기의 세포로 편중된 것으로 나타났고, 이는 제대혈 내의 줄기/전구 세포 푸울(pool)이 매우 초기의 전구 세포로 가중됨을 암시한다. Id.
제대혈 B 세포
인간 제대혈은 성체 말초 혈액과 비교하여 pre-B 및 B 세포에 대해 농축되는 것으로 나타났다. Id. pre-B 세포의 평균 빈도는 성체 혈액에서의 0.2%에 비해 제대혈에서 전체 림프구의 0.7%인 것으로 나타났다(Id. citing Okino, F, "Pre-B cells and B lymphocytes in human cord blood and adult peripheral blood," Acta Paediatr. Jpn (1987): 29: 195-201). 제대혈에서의 B 림프구의 평균 상대 빈도는 또한 더 높으며, 성체 혈액에서의 5.4%에 비해 전체 림프구의 11.4%이다 (Id). preB 세포의 절대 수의 관점에서, 제대혈은 성체 혈액에서 10배의 수를 함유한다. Id.
항원 CD1C, CD38, CD5 및 CD23은 제대혈 B 세포에서 고도로 발현되나, 정상 성체에서는 순환하는 B 세포의 적은 백분율에서만 일반적으로 발현된다. Id. 신생아 B 세포는 아마도 기능적으로 나이브인 반면, 성체 B 세포의 것에 근접한 이의 자극에 대한 고유한 잠재성은 충분히 강한 T-세포 도움이 이용 가능한 한 실현될 수 있음이 제안되었다. Id.
제대혈 T 세포
일반적으로, 제대혈 T 세포는 헬퍼 활성의 상대적 부재를 갖는다(Id. citing Anderson, U et al., Evidence for the ontogenic precedence of suppressor T cell functions in the human neonate," Eur. Immunol. 1983; 13: 6-13). CD2(모든 말초 혈액 T 세포에서 발현되는 인간 T-림프구 계통의 표면 항원), CD3(T 림프구 마커) 및 CD8(억제제 및 세포독성 활성을 갖는 T 세포에 대한 마커)을 발현하는 림프구의 백분율은 성체 혈액에서보다 제대혈에서 낮다. Id. 그러나, 제대혈에서의 증가된 백혈구 수로 인해, CD2+ 및 CD8+ 세포의 절대 수는 동등하다(Id. citing Gerli, R et al, Activation of cord T lymphocytes. I. Evidence for a defective T cell mitogens through the CD molecule," J. Immunol. 1989; 142: 2583-89). 대조적으로, 제대혈 및 성체 말초 혈액에서의 CD4+ 세포(헬퍼/유도인자 T 세포)의 백분율은 유사하나, CD4+ 세포의 절대 수는 제대혈에서 더 높다. Id. 그럼에도 불구하고, 제대혈 CD4+ 세포는 항체 생성에 도움을 제공하는 능력이 부족하다. Id.
제대혈 CD4+ 세포의 90% 초과는 높은 수준의 CD45RA 및 L-셀렉틴(Leu-8)을 발현하고(Id. citing Clement, LT et al, "Novel immunoregulatory functions of phenotypically distinct subpopulations of CD4+ cells in the human neonate," J. Immunol. (1990): 145: 102-108)), 낮은 수준의 CD45RO(citing Sanders et al 1988)를 갖는다. 이의 사이토카인 프로파일은 이들이 나이브 THp 세포임을 암시한다. 제대혈 CD4+ 세포의 우세한 면역조절성 표현형은 CD4+CD45RA+(및 CD38+) 세포의 우세와 일치하게 대부분 면역억제성인 것으로 나타났다(Id. citing Tostato, GI et al, "B cell differentiation and immunoregulatory T cell function in human cord blood lymphocytes," 1980; J. Clin. Invest. 66: 383-880; Jacoby, DR and Oldstone, MBA, ""Delineation of suppressor and helper activity within the OKTA4-defined T lymphocyte subset in human newborns," 1983; J. Immunol. 131: 1765-70; Clement, LT et al, "Novel immunoregulatory functions of phenotypically distinct subpopulations of CD4+ cells in the human neonate," J. Immunol. (1990): 145: 102-108)). 성체 B 세포 및 억새풀 분열제(PWM), 또는 항 CD4+ mAb와 함께 배양된 제대혈 CD4+ 세포는 헬퍼 기능을 나타내지 않았다(Clement, LT et al, "Novel immunoregulatory functions of phenotypically distinct subpopulations of CD4+ cells in the human neonate," J. Immunol. (1990): 145: 102-108)). 그러나, 식물적혈구응집소(PHA)를 이용한 활성화 및 IL-2에서의 배양 후, 제대혈 CD4+ + CD45RA+ 세포는 B 세포 분화를 돕는 능력을 획득하였다. 이러한 기능적 성숙은 CD4+CD45RA-CD45RO+ 표현형으로의 전환을 동반하였다. 제대혈 내의 적은 수의 CD4+CD45RA-CD45RO+ 세포가 정제되고, 유사하게 분석되는 경우, 성체 CD4+CD45RA-의 것과 동등한 헬퍼 활성이 발견되었다. Id. 이러한 헬퍼 기능은 제대혈(성체는 아님) CD4+CD45RA+ 세포의 비록 적은 수의 존재로도 차단되었다. 제대혈 CD4+CD45RA+ 세포의 방사선조사 또는 미토마이신 C 처리는 이의 억제 활성을 폐기하였으나, 헬퍼 능력을 유도하지는 않았다. 위임되지 않은 "나이브" CD4+CD45RA+ 세포는 헬퍼 기능할 수 있는 CD4+CD45RA- "기억" 세포로의 가정된 활성화-의존성 후-흉선 분화와 관련되지 않은 연령-관련 성숙 변화를 겪는다는 것이 제안되었다 (Id).
자연 살해(NK) 세포
인간 자연 살해(NK) 세포는 표면 마커 CD16 및 CD56의 상대 발현을 기초로 하여 상이한 집단으로 세분될 수 있다. (Poli, A. et al, "CD56bright natural killer (NK) cells: an important NK cell subset," Immunol. 2009 Apr; 126(4): 458-65). 제대혈 NK 세포는 이종성이다. NK 마커 CD57+를 갖는 세포는 제대혈에서 무시할 수 있으나(문헌[Abo, T et al, "Post natal expansion of the natural killer and killer cell population in humans identified by the monoclonal HNK-1 antibody," J. Exp. Med. 1982; 155: 321-26]을 인용하는 문헌[Cicuttini, FM and Boyd AW, "Hematopoietic and lymphoid progenitor cells in human umbilical cord blood," Devel. Immunol. 4: 1-11 (1994)]), CD16+ 림프구의 비율은 성체 말초 혈액의 비율과 동등하다(Id. citing Tarakkanan, J and Saksela, E, "Umbilical cord blood-derived suppressor cells of the human natural killer cell activity are inhibited by interferon," Scand. J. Immunol. 1982; 15: 149-57; Perussia, B et al., "Human natural killer cells analyzed by B73.1, a monoclonal antibody blocking Fcreceptor function. I. Characterization of the lymphocyte subset reactive with B73.1," J. Immunol. 1983; 130: 2133-41). 제대혈 세포의 자발적 NK 활성은 성체에 비해 현저히 감소된다. Id. CD7+NK+ 및 CD7+NK- 집단은 제대혈에서 가장 미성숙한 NK 전구 세포에 대한 후보로서 CD7+NK- 세포를 갖는 인간 제대혈에서의 NK 세포 전구체 사이에서의 발생 순서를 나타낼 수 있다고 생각된다. Id.
조혈 줄기 세포.
조혈 줄기 세포는 모든 혈액 세포의 공통 조상이다. 조혈 줄기 세포 성숙은 조혈 세포의 두개의 주요 분지인 림프성 및 골수성 세포 계통의 다양화를 포함한다. (Kondo, M. "Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors," Immunol. Rev. 2010 Nov; 238(1): 37-46). 림프성 계통 세포는 T, B, 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 골수성 계통은 거대핵세포 및 적혈구(MegE)뿐만 아니라 골수성 계통에 속하는 과립구(호중구, 호산구 및 호염기구), 단핵구, 대식세포, 및 비만 세포(GM)의 다양한 서브셋을 포함한다(Id. citing Kondo M, et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 2003;21:759-806., Weissman IL. Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: barriers and opportunities. Science (New York, NY. 2000 Feb 25;287(5457):1442-6; 또한 Iwaskaki, H. and Akashi, K. "Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell,", Immunity 26(6) June 2007, 726-40 참조).
림프성 및 골수성 계통은 전구체 수준에서 분리 가능하다. 림프성 공통전구세포(common lymphoid progenitors; CLP)는 생리학적 조건하에서 인지 가능한 골수모양 잠재성 없이 모든 유형의 림프구로 분화할 수 있으나(Kondo M, Scherer DC, Miyamoto T, King AG, Akashi K, Sugamura K, et al. Cell-fate conversion of lymphoid-committed progenitors by instructive actions of cytokines. Nature. 2000 Sep 21;407(6802):383-6), 일부 골수성 연관 유전자는 실험 조건에 따라 CLP에서 검출될 수 있다(Delogu A, Schebesta A, Sun Q, Aschenbrenner K, Perlot T, Busslinger M. Gene repression by Pax5 in B cells is essential for blood cell homeostasis and is reversed in plasma cells. Immunity. 2006 Mar;24(3):269-81).
유사하게, 골수성 공통전구세포(CMP)는 B-세포 잠재성 없이 또는 광범위하게 낮은 수준의 B-세포 잠재성으로 모든 부류의 골수성 세포를 발생시킬 수 있다(Akashi K, Traver D, Miyamoto T, Weissman IL. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 2000 Mar 9;404(6774):193-7). 또 다른 세포 유형인 수지상 세포(DC)는 DC가 CLP 또는 CMP로부터 발생할 수 있으므로 림프성 또는 골수성 계통으로 명백히 그룹화되지 않는다(Manz MG, Traver D, Miyamoto T, Weissman IL, Akashi K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 2001 Jun 1;97(11):3333-41, Traver D, Akashi K, Manz M, Merad M, Miyamoto T, Engleman EG, et al. Development of CD8alpha-positive dendritic cells from a common myeloid progenitor. Science (New York, NY. 2000 Dec 15;290(5499):2152-4).
CMP는 증식하고, 거대핵세포-적혈구(MegE) 전구체 및 과립구-단핵구(GM) 전구체로 분화할 수 있으며, 이는 추가로 거대핵세포, 적혈구, 과립구, 단핵구 및 기타 세포를 발생시킬 수 있다. (Iwasaki H, Akashi K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 2007;26:726-740).
단능성 거대핵세포 계통-위임된 전구체(megakaryocyte lineage-committed progenitor; MKP)는 거대핵세포-관련 표면 단백질인 CD9에 의해 MEP의 다운스트림에서 분리되었다. MKP는 표현형 CD9+IL-7Rα- Lin- Sca-1- c-Kit+ Thy1.1-을 가지며, 전체 골수 세포의 0.01%만 차지한다. (Iwasaki H, Akashi K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 2007;26:726-740). MKP는 다양한 크기의 거대핵세포 집락을 독점적으로 발생시킨다. (Id. Citing T.N. Nakorn, T. et al, Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 (2003), pp. 205-210). MEP는 대부분 8일의 CFU-S 활성을 나타내고; MKP는 CFU-S 활성을 갖지 않고, 시험관 내에서 거대핵세포만 발생시킨다. Id.
다른 원시 조혈 세포와 마찬가지로, 이능성 MEP는 작은 림프구와 유사하나, 세포 표면 단백질 제시의 특이적 패턴인 IL-7Rα-/Lin-/c-Kit+/Sca-1-/CD34-/FcRγlo에 의해 구별될 수 있다. (Kaushansky, K., "Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis," Blood 2008; 111(3): 981-86). 이후, 거대핵세포 계통으로 위임된 세포는 CD41 및 CD61(인테그린 αIIbβ3), CD42(당단백질 Ib) 및 당단백질 V를 발현하기 시작하였다. (Id. Citing Hodohara K, et al., Stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) acts together with thrombopoietin to enhance the development of megakaryocytic progenitor cells (CFU-MK). Blood 2000;95:769-775; Roth GJ, et al., The platelet glycoprotein Ib-V-IX system: regulation of gene expression. Stem Cells 1996;14 Suppl 1:188-193). 적혈구 계통으로 위임된 것은 트랜스페린 수용체(CD71)를 발현하기 시작하여, 성숙시 이들은 CD41 발현을 상실하지만 트롬보스폰딘 수용체(CD36), 글리코포린, 및 궁극적으로는 글로빈을 발현한다. Id.
인간 클론원성 골수성 공통전구세포(CMP) 및 이의 다운스트림 프로제니, 과립구/대식세포(GMP) 및 거대핵세포/적혈구 전구체(MEP)는 성체 골수의 계통-음성(lin-) CD34+CD38+ 분획뿐만 아니라 제대혈에 존재한다. 이들은 초기-작용 조혈 사이토카인의 수용체인 IL-3Rα 사슬, 및 사이토카인 신호전달의 음성 조절에 관여하는 포스포티로신 포스파타제의 아이소형인 CD45RA의 발현에 의해 구별 가능하다. (Manz, MG, et al, "Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors," Proc. Natl Acad. Sci. U.S. 2002 99(18): 11872-11877).
성인 인간 골수로부터 분리된 lin-CD34+CD38+IL-3RαloCD45RA+ 세포의 75%는 CFU-과립구, CFU-대식세포, 및 CFU-과립구/대식세포만 발생시키는 반면, 성인 인간 골수로부터 분리된 lin-CD34+CD38+IL-3Rα-CD45RA- 세포의 87%는 대집락-형성 단위 적혈구, CFU-거대핵세포, CFU-거대핵세포/적혈구, 및 2개의 CFU-과립구(0.5%)를 생성시켰다. 정의된 마우스 전구체와 유사하게, IL-3RαloCD45RA+ 세포는 GMP로 명명되고, IL-3Rα-CD45RA- 세포는 MEP로 명명되었다. 상이한 사이토카인 조합을 갖는 Sys-1 간질 세포 배양시, GMP 및 MEP 둘 모두의 발생이 72시간의 배양 후 SCF, IL-11, FL, Epo, 및 Tpo로 달성되었다. IL-3RαloCD45RA- 세포는 모든 유형의 집락(CFU-GEMM 제외)을 발생시켰고, GMP는 과립구/대식세포 집락만 발생시켰고, MEP는 거대핵세포/적혈구 집락 및 4개(1.6%)의 과립구 및 대식세포 집락을 발생시켰다. 따라서, CMP 집단을 나타내는 IL-3RαloCD45RA- 세포는 기능성 GMP 및 MEP를 발생시킬 수 있다. (Manz, MG, et al, "Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors," Proc. Natl Acad. Sci. U.S. 2002 99(18): 11872-11877).
유전자 발현 프로파일
과립구 집락-자극 인자 수용체인 C/EBPε, 및 MPO는 MEP가 아닌 GMP에 의해 발현된 반면, GATA-1, EpoR, c-mpl, β-글로빈, 및 폰 빌레브란트 인자는 GMP가 아닌 MEP에서 검출되었다. 골수성 전구체 중 어느 것도 TdT, GATA-3, preTα, IL-7Rα, 및 Pax-5와 같은 림프모양 발달과 관련된 유전자의 검출 가능한 수준을 발현시키지 않았으며, 이들은 림프성-위임된 lin-CD34+CD38+CD10+ 전구체에서 발현되었다. (Manz, MG, et al, "Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors," Proc. Natl Acad. Sci. U.S. 2002 99(18): 11872-11877).
유사한 계통 제한을 갖는 골수성 전구 세포가 제대혈에서 발견될 수 있다. 별개의 표면-마커 발현 프로파일은 성체 골수와 유사하였으나, 골수성 전구체 집단의 백분율은 제대혈에서 약간 상이하였다: IL-3RαloCD45RA- CMP는 제대혈의 단핵 세포 분획의 약 0.4%를 차지하고, IL-3RαloCD45RA+ GMP는 약 0.3%를 차지하고, IL-3Rα-CD45RA+ MEP는 약 0.05%를 차지하였다. HSC-농축된 lin-CD34+CD38- 세포 및 CMP는 각각 68 및 83%의 클로닝 효율을 갖는 모든 유형의 집락을 형성하였다. GMP는 과립구/대식세포 집락(클로닝 효율 41%)만 형성하였고, MEP는 단지 4% 과립구/대식세포 집락 판독값과 함께 거대핵세포/적혈구 집락(클로닝 효율 88%)을 형성하였다. (Manz, MG, et al, "Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors," Proc. Natl Acad. Sci. U.S. 2002 99(18): 11872-11877).
HSC의 서브셋은 한때 거대핵세포 계통으로 제한되는 것으로 생각된 혈소판-관련 펩티드인 폰 빌레브란트 인자에 대한 유전자를 발현하는 것으로 나타났다. (Smith, BW, and Murphy, GJ, "Stem cells, megakaryocytes, and platelets," Curr. Opin. Hematol. 2014; 21(5): 430-37). 이들 세포는 C-mpl의 더 큰 전사물 수준을 생성하고, 거대핵세포 계통 위임을 준비한다(Id. Citing Sanjuan-Pla, A., et al, "Platelet-biased stem cells reside at the apex of haematopoietic stem-cell hierarchy, "Nature 2013; 502: 232-36). 연구는 이식된 HSC가 내골성 골수 내의 인접한 거대핵세포로 우선적으로 이동하고, 여기서 TPO가 니치 확장을 촉진하고(Id. Citing Olson, TS, et al, "Megakaryocytes promote murine osteoblastic HSC niche expansion and stem cell engraftment after radio-ablative conditioning," Blood 2013; 121: 5238-49), 성숙 거대핵세포가 사이토카인을 방출하여 HSC 증식을 촉진(Heazlewood, SY et al, "Megakaryocytes co-localise with hemopoietic stem cells and release cytokines that up-regulate stem cell proliferation," Stem Cell Res. 2013; 11:782-92))하는 것을 나타낸다. 정상적인 조혈의 중요한 중간물인 것으로 생각되는 소능성(oligopotent) 전구체를 완전히 우회하는 HSC의 직접적인 자손일 수 있는 골수성-제한된 전구체(myeloid-restricted progenitor)에 대한 증거가 또한 존재한다(Yamamoto, R. et l al, "Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells," Cell. 2013; 154: 1112-26). 이러한 집단은 CD41+ HSC에서 유래될 수 있으며, 이는 일단 생각한 것보다 더 확고하고 덜 일시적이다(Gekas, C. and Graf, T., "CD41 expression marks myeloid-biased adult hematopoietic stem cells and increases with age," Blood. 2013; 121: 4463-62)).
전사 인자
Runx1, Gata1, Fli1 및 cMy를 포함하는 다수의 전사 인자는 거대핵세포의 분화를 양성 및 음성 둘 모두로 조절하는 복잡한 네트워크를 형성한다. (Geddis, A.E., "Megakaryopoiesis," Semin. Hematol. 2010; 47(3): 212-219). Runx1은 Gata1 및 Fli1을 포함하는 추가 거대핵세포 인자와 상호작용한다. Gata1 및 이의 보조인자인 Friend of Gata1(Fog1)은 거대핵세포-적혈구 분화를 촉진하면서, 동시에 Pu.1의 발현 및 골수성 분화를 억제하는데 중요하다. (Id. Citing Nerlov, C. et al, "GATA-1 interacts with the myeloid PU.1 transcription factor and represses PU.1-dependent transcription," Blood 2000; 95: 2543-51; Chou ST et al, "Graded repression of PU.1/SfpiI gene transcription by GATA factors regulates hematopoietic cell fate," Blood 2009; 114: 983-94). Gata1 및 Flli1에 대한 결합 부위는 많은 거대핵세포-특이적 유전자의 인핸서에서 발견될 수 있으며(Id. Citing Eisbacher, M. et al, "Protein-protein interaction between Fli-1 and GATA-1 mediates synergistic expression of megakaryocyte-specific genes through cooperative DNA binding," Mol. Cell Biol. 2003; 23: 3427-41), Fli1은 거대핵세포 프로모터에서 Gata1의 활성을 향상시키고, 적혈구 프로모터에서 적혈구 인자의 활성을 억제한다. 따라서, Fli1 발현은 MEP를 거대핵세포 계통으로 제한하도록 작용할 수 있다. 대조적으로, MEM에서의 원발암유전자 c-Myb의 발현은 적혈구형성을 선호하고, c-Myb 발현은 거대핵세포형성 동안 하향조절된다(Metcalf, D et al, "Anamaloous megakaryocytopoiesis in mice with mutations in the c-Myb gene," Blood 2005; 105: 3480-87).
거대핵세포.
제대혈-유래 거대핵세포의 다수의 명백한 세포 집단이 흐름세포측정법에 의해 관찰되었고, 유사한 집단이 또한 거대핵세포 Meg-01 세포주에서 관찰되었다. (Lindsay, C. et al, 2015; Blood 126(23): 4754). 가장 큰 세포(P1으로 언급됨)가 가장 풍부하여, 배양 3일째에 세포의 거의 100%를 구성하였다. P1보다 작고 더 과립형인 P2 세포는 6일째에 나타났고, 13일까지 전체의 약 50%였다. P3은 6일째에 나타났고, 가장 작았으며, 크기 및 과립성은 혈소판과 대략 유사하였고; 13일까지 이들은 전체의 약 30%였다. P1은 배양 13일에 걸쳐 CD61/CD41/CD42 양성 및 CD34 음성이 되었으나, P2 또는 P3는 그렇지 않았다. P2 및 P3 세포 각각의 97% 및 93%는 포스파티딜세린(PS) 양성인 반면, P1 세포의 93%는 PS 음성이었다. PS 음성(P1) 세포는 전자현미경에 의해 큰 크기, 폴립모양 핵, 미토콘드리아 및 미성숙 과립을 포함하는 골수 거대핵세포의 많은 전형적인 특징을 나타내었으나, 구획막 시스템은 불량하게 발달하였다. 실질적으로 모든 PS 양성 P2 세포는 아폽토시스되었으며, 과립이 결여되었고, 식별 가능한 핵을 갖지 않았다. P1은 P2 및 P3 집단 둘 모두를 발생시키는 반면, P2는 다른 집단을 발생시키지 않은 것으로 밝혀졌다. 콜라겐 관련 펩티드, 트롬빈, 프로테아제 활성화 수용체 1-활성화 펩티드(PAR1-AP) 및 PAR4-AP를 이용한 P1, P2 및 P3 집단의 자극은 P1 세포에서 강한 인테그린 활성화를 나타내었으나, P2 또는 P3 세포에서는 그렇지 않았다. 따라서, 제대혈-유래 거대핵세포의 일부만이 기능적이다.
성장 인자
성장 인자는 세포-표면 수용체에 결합하여 세포내 신호전달 경로를 촉발시키고, 증식, 분화 또는 다른 세포 반응을 발생시키는 세포외 폴리펩티드 분자이다. 이들 경로는 단백질 및 다른 거대분자의 축적을 자극하며, 이들은 이의 합성 속도를 증가시키고 이의 분해 속도를 감소시킴으로써 그렇게 작용한다.
혈소판 α 과립은 혈소판에 의해 능동적으로 분비되는 혈소판-유래 성장 인자(PDGF-AA, PDGF-BB, BDGF-AB), 전환 성장 인자-β(TGF-β1 및 TGF-β2), 섬유모세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 상피 성장 인자(EGF), 및 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1)을 포함하는 여러 상이한 성장 인자를 함유한다(문헌[Martieau, I., et al, "Effects of calcium and thrombin on growth factor release from platelet concentrates: kinetics and regulation of endothelial cell proliferation," Biomaterials 2004; 25: 4489-4502]을 인용하는 문헌[Aghideh, AN et al, "Platelet growth factors suppress ex vivo expansion and enhance differentiation of umbilical cord blood CD133+ stem cells to megakaryocyte progenitor cells," Growth Factors 2010; 28(6): 409-16]). 거대핵세포는 알파 과립에서 거대핵세포형성 및 조혈 줄기 세포 조절의 음성 조절인자인 혈소판 인자 4(PF4)를 발현하고 저장한다(Lambert, MP et al, "Intramedullary megakaryocytes internalize released platelet factor 4 and store it in alpha granules," J. Thromb. Haemost. 2015; 13(10): 1888-99).
트롬보포이에틴
다수의 성장 인자가 거대핵세포형성을 뒷받침하며, 이 중 가장 중요한 것은 트롬보포이에틴(TPO)로도 공지된 거대핵세포 성장 및 발달 인자(MGDF)이다. 거대핵세포 발달 및 혈소판 생성의 주요 조절인자 및 혈소판형성의 강력한 자극인자인 트롬보포이에틴은 Mpl 수용체에 대한 리간드이다. (Muench, M. and Barcena, A., "Megakaryocyte Growth and Development Factor is a Potent Growth Factor for Primitive Hematopoietic Progenitors in the Human Fetus," Ped. Res. 2004; 55(6): 1050-56). 이는 시험관 내 및 생체 내 둘 모두에서 거대핵세포 생성 및 거대핵세포 배수성의 증가를 자극할 수 있고, 조혈에 대한 광범위한 활성을 가지며(Id. Citing Kaushansky, K. "Thrombopoietin: the primary regulator of platelet production," 1995; Blood 86: 419-311, 2); Kuter, DJ et al, 2002 Blood; 100: 3457-69)), 다능성 조혈 전구체 및 줄기 세포의 성장을 뒷받침한다(Id.).
TPO는 에리트로포이에틴, G-CSF, 성장 호르몬 및 백혈병 억제 인자를 특히 포함하는 4-헬릭스 다발 계열의 사이토카인에 속한다. (Geddis, A.E., "Megakaryyopoiesis," Semin. Hematol. 2010; 47(3): 212-219). TPO 수용체 c- Mpl은 뮤린 골수증식성 백혈병 바이러스의 전환 인자로 이미 공지된 종양유전자 v-Mpl과의 상동성을 기초로 하여 확인되었다(Id. Citing Vigon I, et al. Molecular cloning and characterization of MPL, the human homolog of the v-mpl oncogene: identification of a member of the hematopoietic growth factor receptor superfamily. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89:5640-5644). TPO 및 c- Mpl은 거대핵세포 성장 및 발달에 중요하며, 하나 또는 다른 하나가 부재하는 마우스 모델에서, 혈소판 및 거대핵세포는 정상 값의 약 10%로 감소된다(Gurney AL, et al. Thrombocytopenia in c-mpl-deficient mice. Science. 1994;265:1445-1447; Bunting S, et al. Normal platelets and megakaryocytes are produced in vivo in the absence of thrombopoietin. Blood. 1997;90:3423-3429). 거대핵세포에 더하여, HSC는 또한 c - Mpl을 발현하고, 이의 유지 및 확장을 위해 TPO 신호전달에 의존한다(Id. Citing Fox N, et al, Thrombopoietin expands hematopoietic stem cells after transplantation. J Clin Invest. 2002;110:389-394).
c-Mpl 유전자는 25개 아미노산의 신호 펩티드(1-25), 465개 아미노산의 세포외 도메인(26-491), 22개 잔기의 막횡단 도메인(492-513) 및 box 1(528-536) 및 box 2(565-574)로 명명된 2개의 보존된 모티프를 함유하는 세포내 도메인으로 구성된 635개 아미노산의 단백질을 인코딩한다. 세포외 도메인은 2개의 반복 모듈로 구성되며; 막 원위 모듈은 이의 고갈이 수용체의 항시적 활성을 발생시킴에 따라 신호전달에 대한 억제 효과를 갖는 것으로 보인다(Id. Citing Sabath DF, Kaushansky K, Broudy VC. Deletion of the extracellular membrane-distal cytokine receptor homology module of Mpl results in constitutive cell growth and loss of thrombopoietin binding. Blood. 1999;94:365-367). c-Mpl은 고유한 키나제 활성을 갖지 않지만, 대신 이의 box 1 도메인을 통해 세포질 티로신 키나제 Janus 키나제 2(Jak2)와 회합된다(Id. Citing Drachman JG, Kaushansky K. Structure and function of the cytokine receptor superfamily. Curr Opin Hematol. 1995;2:22-28). 추가 요소가 TPO 결합 후 수용체 내재화 및 이후의 분해를 조절한다. 이들은 box 2, Tyr591 및 Tyr625 내에 위치된 이류신(dileucine) 반복부를 포함한다(Id. Citing Dahlen DD, et al., Internalization of the thrombopoietin receptor is regulated by 2 cytoplasmic motifs. Blood. 2003;102:102-108; Hitchcock IS, et al, YRRL motifs in the cytoplasmic domain of the thrombopoietin receptor regulate receptor internalization and degradation. Blood. 2008).
TPO 신호전달은 Jak2의 활성화에 의존한다. Jak2는 이의 FERM(band 4.1/에즈린(ezrin)/라딕신(radixin)/모에신(moesin)) 도메인을 통해 c-Mpl의 box 1과 회합한다. 에리트로포이에틴 수용체의 X-선 결정 연구를 기초로 하여(Id. Citing Livnah O, et al, Crystallographic evidence for preformed dimers of erythropoietin receptor before ligand activation. Science. 1999;283:987-990), 리간드화되지 않은 상태에서 c-Mpl은 동종이량체로 존재하고, TPO 결합은 입체형태적 변화를 발생시켜 수용체의 세포질 꼬리를 더 근접시키는 것으로 생각된다. 결과로서, 수용체와 회합된 Jak2 분자는 트랜스-자가인산화를 통해 활성화되기에 서로 충분히 가까워진다(Id. Citing Witthuhn BA, Quelle FW, Silvennoinen O, Yi T, Tang B, Miura O, et al. JAK2 associates with the erythropoietin receptor and is tyrosine phosphorylated and activated following stimulation with erythropoietin. Cell. 1993;74:227-236). 이후, 활성 Jak2는 다수의 잔기에서 스스로 인산화하고, 적어도 Tyr625 및 Tyr630에서 c-Mpl을 인산화한다(Id. Citing Drachman JG, Kaushansky K. Dissecting the thrombopoietin receptor: functional elements of the Mpl cytoplasmic domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94:2350-2355). 이들 포스포티로신 잔기는 수용체 신호전달을 조절하는 src 상동성 2 (SH2)-도메인-함유 신호전달 단백질에 대한 도킹 부위를 제공한다.
Jak2의 활성화 후, 다수의 신호전달 분자가 활성화되고, TPO에 대한 세포 반응을 매개한다. 이들은 신호 변환기 및 전사 활성제(STAT), 미토겐-활성화 단백질키나제(MAPK) 및 포스포이노시톨-3 키나제(PI3K) 경로의 구성원을 포함한다(Id. Citing Geddis AE, et al, Thrombopoietin: a pan-hematopoietic cytokine. Cytokine Growth Factor Rev. 2002;13:61-73). Jak2는 STAT1, 3, 5a 및 5b를 포함하는 STAT 계열 구성원을 직접 인산화시킨다(Id. Citing Schulze H, et al., Thrombopoietin induces the generation of distinct Stat1, Stat3, Stat5a and Stat5b homo- and heterodimeric complexes with different kinetics in human platelets. Exp Hematol. 2000;28:294-304). 일단 인산화되면, 이들 STAT 단백질은 이량체화되고, 세포의 핵으로 전위되며, 여기서 이들은 p21(Id. Citing Matsumura I, et al. Thrombopoietin-induced differentiation of a human megakaryoblastic leukemia cell line, CMK, involves transcriptional activation of p21(WAF1/Cip1) by STAT5. Mol Cell Biol. 1997;17:2933-2943), Bcl-xL(Id. Citing Kirito K, et al, Thrombopoietin regulates Bcl-xL gene expression through Stat5 and phosphatidylinositol 3-kinase activation pathways. J Biol Chem. 2002;277:8329-8337) 및 사이클린 D1(Id. Citing Magne S, et al, STAT5 and Oct-1 form a stable complex that modulates cyclin D1 expression. Mol Cell Biol. 2003;23:8934-8945)와 같은 유전자 내의 STAT-반응성 전사 요소에 결합할 수 있다. Jak2/STAT 경로의 항시적 활성화는 골수증식성 장애에서의 돌연변이체 Jak2의 발견, 림프성 백혈구에서 Jak2를 수반하는 전위, 및 백혈병 세포주에서의 항시적 활성 STAT5에 의해 입증되는 바와 같이 사이토카인-독립적 성장을 발생시킬 수 있고, 형질전환에 기여할 수 있다(Id. Citing Harir N, et al. Constitutive activation of Stat5 promotes its cytoplasmic localization and association with PI3-kinase in myeloid leukemias. Blood. 2007;109:1678-1686; Najfeld V, et al, Numerical gain and structural rearrangements of JAK2, identified by FISH, characterize both JAK2617V>F-positive and -negative patients with Ph-negative MPD, myelodysplasia, and B-lymphoid neoplasms. Exp Hematol. 2007;35:1668-1676).
Jak2는 또한 작은 GTPase Ras 및 MAPK 캐스케이드를 활성화시켜, 세포외 신호-관련 키나제(ERK)1/2의 활성화를 이룬다. 다수의 연구에서 거대핵세포 분화에서 TPO-유도 MAPK 신호전달의 중요성이 입증되었다(Id. Citing Rouyez MC, et al, Control of thrombopoietin-induced megakaryocytic differentiation by the mitogen-activated protein kinase pathway. Mol Cell Biol. 1997;17:4991-5000; Rojnuckarin P, et al, Thrombopoietin-induced activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway in normal megakaryocytes: role in endomitosis. Blood. 1999;94:1273-1282; Fichelson S, et al. Megakaryocyte growth and development factor-induced proliferation and differentiation are regulated by the mitogen-activated protein kinase pathway in primitive cord blood hematopoietic progenitors. Blood. 1999;94:1601-1613). TPO 신호전달이 Ras를 활성화시키는 것으로 생각되는 고전 경로는 인산화된 c-Mpl Tyr625에 대한 어댑터 단백질 Shc의 결합(Id. Citing Drachman JG, Kaushansky K. Dissecting the thrombopoietin receptor: functional elements of the Mpl cytoplasmic domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94:2350-2355; Miyakawa Y, et al. Recombinant thrombopoietin induces rapid protein tyrosine phosphorylation of Janus kinase 2 and Shc in human blood platelets. Blood. 1995;86:23-27) 및 어댑터 단백질 Grb2 및 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 SOS를 함유하는 복합체의 어셈블리(Id. Citing Alexander WS, et al, Tyrosine-599 of the c-Mpl receptor is required for Shc phosphorylation and the induction of cellular differentiation. Embo J. 1996;15:6531-6540; Skolnik EY, et al. The function of GRB2 in linking the insulin receptor to Ras signaling pathways. Science. 1993;260:1953-1955)에 의존한다. 이후, Ras는 Raf-1, 미토겐-유도 세포외 키나제(MEK) 및 최종적으로 Erk 1/2를 활성화시킨다(Id. Citing Avruch J, et al. Ras activation of the Raf kinase: tyrosine kinase recruitment of the MAP kinase cascade. Recent Prog Horm Res. 2001;56:127-155). MAPK의 활성화는 c-Mpl Tyr625 및 Tyr630의 부재하에서 유의하게 감소되나, 제거되지 않으며(Id. Citing Luoh SM, et al. Role of the distal half of the c-Mpl intracellular domain in control of platelet production by thrombopoietin in vivo. Mol Cell Biol. 2000;20:507-515), 이는 Erk1/2의 활성화가 Shc-독립적 메커니즘을 통해, 가능하게는 Jak2에 모집된 Grb2/Sos 복합체를 통해 매개될 수 있음을 암시한다(Id. Citing Brizzi MF, et al, Discrete protein interactions with the Grb2/c-Cbl complex in SCF- and TPO-mediated myeloid cell proliferation. Oncogene. 1996;13:2067-2076). 대안적으로, 작은 GTPase Rap1은 Ras와 독립적으로 B-Raf를 통해 Erk1/2를 활성화시킬 수 있다(Id. Citing Garcia J, et al, Thrombopoietin-mediated sustained activation of extracellular signal-regulated kinase in UT7-Mpl cells requires both Ras-Raf-1- and Rap1-B-Raf-dependent pathways. Mol Cell Biol. 2001;21:2659-2670).
PI3K 경로는 또한 거대핵세포형성에 필수적이다(Id. Citing Geddis AE, Fox NE, Kaushansky K. Phosphatidylinositol 3-kinase is necessary but not sufficient for thrombopoietin-induced proliferation in engineered Mpl-bearing cell lines as well as in primary megakaryocytic progenitors. J Biol Chem. 2001;276:34473-34479). PI3K는 키나제(p110) 및 조절성 서브유닛(p85)으로 구성된다. TPO는 인산화된 p85와 어댑터 Gab사이의 복합체의 형성을 유도하나, 이러한 복합체는 c-Mpl에 직접 결합하는 것으로 밝혀지지 않았고(Id. Citing Miyakawa Y, et al, Thrombopoietin induces phosphoinositol 3-kinase activation through SHP2, Gab, and insulin receptor substrate proteins in BAF3 cells and primary murine megakaryocytes. J Biol Chem. 2001;276:2494-2502); 대안적으로, PI3K는 Ras를 통해 간접적으로 활성화될 수 있다(Id. Citing Kodaki T, et al, The activation of phosphatidylinositol 3-kinase by Ras. Curr Biol. 1994;4:798-806). TPO-유도 PI3K는 거대핵세포의 생존 및 증식을 공동으로 촉진하는, 기질이 Forkhead, 글리코겐 신타제 키나제 3 베타(GSK-3β) 및 Bad를 포함하는 세린/트레오닌 키나제 Akt를 인산화하고 활성화시킨다(Id. Citing Geddis AE, Fox NE, Kaushansky K. Phosphatidylinositol 3-kinase is necessary but not sufficient for thrombopoietin-induced proliferation in engineered Mpl-bearing cell lines as well as in primary megakaryocytic progenitors. J Biol Chem. 2001;276:34473-34479; Nakao T, et al, PI3K/Akt/FOXO3a pathway contributes to thrombopoietin-induced proliferation of primary megakaryocytes in vitro and in vivo via modulation of p27(Kip1) Cell Cycle. 2007;7; Soda M, et al, Inhibition of GSK-3beta promotes survival and proliferation of megakaryocytic cells through a beta-catenin-independent pathway. Cell Signal. 2008;20:2317-2323). PI3K는 또한 라파마이신의 포유동물 표적(mTOR)을 활성화시키며, 이의 표적 SK6 및 4E-BP1은 거대핵세포 전구체의 증식 및 성숙을 증가시킨다(Id. Citing Raslova H, et al. Mammalian target of rapamycin (mTOR) regulates both proliferation of megakaryocyte progenitors and late stages of megakaryocyte differentiation. Blood. 2006;107:2303-2310; Guerriero R, et al. Inhibition of TPO-induced MEK or mTOR activity induces opposite effects on the ploidy of human differentiating megakaryocytes. J Cell Sci. 2006;119:744-752). PI3K는 포스파타제 및 조혈 줄기 세포(HSC)에서 정지를 촉진하는 종양 억제인자인 텐신 동족체(PTEN)에 의해 자체적으로 음성 조절된다(Id. Citing Zhang J, et al. PTEN maintains haematopoietic stem cells and acts in lineage choice and leukaemia prevention. Nature. 2006;441:518-522). PTEN이 Akt 및 mTOR의 활성을 조절하나, TPO 신호전달 및 거대핵세포형성에서의 이의 역할은 아직 정의되지 않았다.
항상성 균형을 유지시키기 위해서는 TPO 신호전달 및 거대핵세포형성에 대한 확인이 필요하다. 신호가 적절하게 종료되는 것을 보장하기 위해, 많은 양성 조절인자가 또한 그 자신의 억제제를 유도한다. 예를 들어, Jak/STAT 경로의 활성화는 사이토카인 신호전달 억제제(SOCS) 계열의 구성원의 전사를 유도한다(Id. Citing Starr R, et al. A family of cytokine-inducible inhibitors of signalling. Nature. 1997;387:917-921; Endo TA, et al. A new protein containing an SH2 domain that inhibits JAK kinases. Nature. 1997;387:921-924). 이러한 계열은 Jak의 활성화 루프에 대한 결합 및 분해를 위한 이의 표적화, Jak에 대한 유사기질(pseudosubstrate)로서의 작용, 또는 사이토카인 수용체 자체 내의 인산화된 티로신에 대한 결합을 포함하는 다양한 방식으로 Jak 신호전달을 억제할 수 있는 적어도 8개의 구성원을 포함한다(Id. Citing Alexander WS, Hilton DJ. The role of suppressors of cytokine signaling (SOCS) proteins in regulation of the immune response. Annu Rev Immunol. 2004;22:503-529). 하나의 수용체로부터의 SOCS 반응의 유도는 다른 하나를 음성 조절할 수 있으며, 이에 의해 사이토카인 크로스-토크(cross-talk)에 대한 메커니즘을 제공하며; 이는 인터페론-α를 이용한 거대핵세포의 처리가 SOCS1을 유도하고, 이는 이후 Jak2의 억제를 통해 TPO 신호전달을 하향조절한다는 발견에 의해 예시된다(Id. Citing Wang Q, Miyakawa Y, Fox N, Kaushansky K. Interferon-alpha directly represses megakaryopoiesis by inhibiting thrombopoietin-induced signaling through induction of SOCS-1. Blood. 2000;96:2093-2099).
Jak2는 이의 활성을 조절하는 다른 결합 파트너를 갖는다. 예를 들어, Lnk는 HSC, 적혈구 및 거대핵세포에서의 성장을 억제하는 어댑터 단백질이다(Id. Citing Tong W, Lodish HF. Lnk inhibits Tpo-mpl signaling and Tpo-mediated megakaryocytopoiesis. J Exp Med. 2004;200:569-580; Seita J, et al. Lnk negatively regulates self-renewal of hematopoietic stem cells by modifying thrombopoietin-mediated signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104:2349-2354). Lnk는 이의 SH2-도메인을 통해 Jak2 내의 인산화된 티로신에 결합하나(Id. Citing Bersenev A, et al, Lnk controls mouse hematopoietic stem cell self-renewal and quiescence through direct interactions with JAK2. J Clin Invest. 2008;118:2832-2844); TPO 신호전달을 억제하는 정확한 메커니즘은 이해되어 있지 않다. 음성 조절인자 결합에 더하여, Jak2는 FERM 도메인 내에서 인산화되어, c-Mpl로부터의 이의 해리를 유도할 수 있고, 이에 따라 신호전달을 "끄기" 위한 또 다른 메커니즘을 제공할 수 있다(Id. Citing Funakoshi-Tago M, et al, Receptor specific downregulation of cytokine signaling by autophosphorylation in the FERM domain of Jak2. Embo J. 2006;25:4763-4772).
혈소판-유래 성장 인자(PDGF)를 포함하는 일부 세포외 신호 단백질은 성장 인자 및 미토겐 둘 모두로 작용하여 세포 성장 및 세포-주기 진행을 자극할 수 있다. 이러한 기능적 중첩은 이들 두 가지 과정을 제어하는 세포내 신호전달 경로에서의 중첩에 의해 부분적으로 달성된다. 신호전달 단백질 Ras는, 예를 들어, 성장 인자 및 미토겐 둘 모두에 의해 활성화된다. 이는 PI3-키나제 경로를 자극하여 세포 성장을 촉진시킬 수 있고, MAP-키나제 경로를 자극하여 세포-주기 진행을 촉발시킬 수 있다. 유사하게, Myc는 세포 성장 및 세포-주기 진행 둘 모두를 자극한다. 성장 인자 및 미토겐 둘 모두로 작용하는 세포외 인자는 세포가 이들이 증식할 때 이의 적절한 크기를 유지시키는 것을 보장하는 것을 돕는다.
많은 미토겐, 성장 인자, 및 생존 인자는 세포-주기 진행, 세포 성장, 및 세포 생존의 양성 조절인자이므로, 이들은 기관 및 유기체의 크기를 증가시키는 경향이 있다. 그러나, 일부 조직에서, 세포 및 조직 크기는 또한 양성 조절인자에 반대하고, 이에 의해 기관 성장을 억제하는 억제성 세포외 신호 단백질에 의해 영향을 받는다. 가장 잘 이해된 억제성 신호 단백질은 TGF-β 및 이의 관계물이다. TGF-β는 G1의 세포-주기 진행을 차단하거나 아폽토시스를 자극함으로써 여러 세포 유형의 증식을 억제한다. TGF-β는 세포-표면 수용체에 결합하고, 세포내 신호전달 경로를 개시시켜, Smad로 언급되는 유전자 조절성 단백질의 활성에서의 변화를 발생시킨다. 이는 세포 분열 및 세포 사멸의 조절인자를 인코딩하는 유전자의 전사에서의 복잡한 변화를 발생시킨다.
TGF-β 계열 구성원인 골 형태형성 단백질(BMP)은 마우스 발의 발달하는 발가락 사이의 조직을 제거하는 아폽토시스를 촉발하는 것을 돕는다. TGF-β와 마찬가지로 BMP는 세포 사멸을 조절하는 유전자의 전사에서의 변화를 자극한다.
섬유모세포 성장 인자(FGF)
섬유모세포 성장 인자(FGF) 계열은 현재 12개가 초과하는 구조적으로 관련된 구성원을 갖는다. FGF1은 또한 산성 FGF로 공지되어 있으며; FGF2는 때때로 염기성 FGF(bFGF)로 언급되고; FGF7은 때때로 각질세포 성장 인자의 명칭으로 사용된다. 12개 초과의 별개의 FGF 유전자가 척추동물에서 공지되어 있으며; 이들은 상이한 조직에서 이의 RNA 스플라이싱 또는 개시 코돈을 변화시킴으로써 수백개의 단백질 아이소형을 생성시킬 수 있다. FGF는 섬유모세포 성장 인자 수용체(FGFR)로 언급되는 수용체 티로신 키나제의 세트를 활성화시킬 수 있다. 수용체 티로신 키나제는 세포막을 통해 연장되는 단백질이다. 주변분비 인자에 결합하는 단백질의 일부는 세포외 측면에 있는 반면, 잠복 티로신 키나제(즉, ATP를 분할하여 또 다른 단백질을 인산화시킬 수 있는 단백질)는 세포내 측면에 있다. FGF 수용체가 FGF에 결합하는 경우(그리고 FGF에 결합하는 경우에만), 잠복 키나제가 활성화되고, 반응 세포 내의 특정 단백질을 인산화시키고, 이러한 단백질을 활성화시킨다.
FGF는 혈관형성(혈관 형성), 중배엽 형성, 및 축삭 확장을 포함하는 여러 발달 기능과 관련된다. FGF는 종종 서로 대체할 수 있으나, 이들의 발현 패턴은 이들에게 별개의 기능을 제공한다. FGF2는 혈관형성에 특히 중요한 반면, FGF8은 중뇌 및 사지의 발달과 관련된다.
혈관형성 인자, 예를 들어, VEGF, IGF, PDGF, HGF, FGF, TGFm 안지오포이에틴-1, 및 줄기 세포 인자(SCF)의 발현 수준은 골-유래, 연골-유래, 및 지방-유래 MSC 사이에서 상이한 것으로 밝혀졌다. (Peng et al., 2008, Stems Cells and Development, 17: 761-774).
인슐린-유사 성장 인자(IGF-1)
인슐린과 분자 구조가 유사한 호르몬인 IGF-1은 신체 내의 거의 모든 세포, 특히 골격근, 연골, 뼈, 간, 신장, 신경, 피부, 조혈 세포, 및 폐에 대해 성장-촉진 효과를 갖는다. 이는 유년기 성장에 중요한 역할을 하고, 성체에서 지속적으로 동화작용 효과를 갖는다. IGF-1은 내부비 호르몬으로서 주로 간에 의해서 뿐만 아니라 주변분비/자가분비 방식으로 표적 조직에서 생성된다. 생성은 성장 호르몬(GH)에 의해 자극되고, 영양부족, 성장 호르몬 둔감성, 성장 호르몬 수용체의 결핍, 또는 SHP2 및 STAT5B를 포함하는 다운스트림 신호전달 분자의 실패에 의해 지연될 수 있다. 이의 주요 작용은 많은 조직의 많은 세포 유형에 존재하는 이의 특정 수용체인 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF1R)에 대한 결합에 의해 매개된다. IGF1R에 결합시, 수용체 티로신 키나제는 세포내 신호전달을 개시하며; IGF-1은 AKT 신호전달 경로의 가장 강력한 자연 활성인자, 세포 성장 및 증식의 자극인자, 및 프로그램된 세포 사멸의 강력한 억제제 중 하나이다. IGF-1은 성장 호르몬(GH)의 효과의 일차 매개자이다. 성장 호르몬은 뇌하수체에서 만들어지고, 혈류로 방출된 후, 간을 자극하여 IGF-1을 생성시킨다. 이후, IGF-1은 전신 성장을 자극한다. 이의 인슐린-유사 효과에 더하여, IGF-1은 또한 특히 신경 세포에서의 세포 성장 및 발달뿐만 아니라 세포 DNA 합성을 조절할 수 있다.
전환 성장 인자 베타(TGF-β)
TGF-β 상과의 30개가 넘는 구조적으로 관련된 구성원이 존재하며, 이들은 발달에서 가장 중요한 상호작용의 일부를 조절한다. TGF-β 상과 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 카르복시-말단 영역이 성숙 펩티드를 함유하도록 처리된다. 이들 펩티드는 동종이량체(자체를 가짐) 또는 이종이량체(다른 TGF-β 펩티드를 가짐)로 이량체화되고, 세포로부터 분비된다. TGF-β 상과는 TGF-β 계열, 액티빈 계열, 골 형태형성 단백질(BMP), Vg-1 계열, 및 다른 단백질, 예를 들어, 아교세포-유래 신경영양 인자(GDNF, 신장 및 장 신경세포 분화에 필요함) 및 포유동물 성 결정에 관여하는 뮐러 억제 인자를 포함한다. TGF-β 계열 구성원 TGF-β1, 2, 3, 및 5는 세포 사이의 세포외 기질의 형성 조절 및 세포 분열 조절(양성 및 음성 둘 모두)에 중요하다. TGF-β1은 콜라겐 및 섬유결합소 합성을 자극하고, 기질 분해를 억제함으로써 세포외 기질 상피 세포의 양을 증가시킨다. TGF-β는 상피가 분기하여 신장, 폐 및 타액선의 관을 형성하는 장소 및 시간을 제어하는데 중요할 수 있다.
시험된 다양한 혈액조절성 사이토카인 중에서, TGF-β1은 계통 특이성의 위임인 골수 간질 TPO의 mRNA 발현의 단연 가장 강력한 증진인자였다. TPO는 차례로 중간 거대핵세포형성 단계에서 거대핵모세포에서 TGB-β 수용체 I 및 II를 유도하였다. 이러한 단계에서, TGF-β1은 거대핵세포 집락 형성 단위(GFU-Meg)의 성숙을 용량-의존적 방식으로 억제할 수 있었다. 이러한 효과는 대집락-형성 단위-적혈구(BFU-E) 또는 CFU-GM에 대한 이의 효과와 비교하는 경우 비교적 특이적이었다. (Sakamaki, S. et al, "Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) induces thrombopoietin from bone marrow stromal cells, which stimulates the expression of TGF-β receptor on megakaryocytes and, in turn, renders them susceptible to suppression by TGF-β itself with high specificity," Blood 1999; 94: 1961-70).
액티빈 A 및 BMP 2는 에리트로포이에틴(EPO)의 부재하에서도 적혈구형성에 대한 세포 위임 및 분화를 유도한다. 이의 생물학적 활성은 인간 골수에 의해 발현된 2개의 분비된 당단백질인 폴리스타틴(follistatin) 또는 FLRG(폴리스타틴-관련 유전자)과의 결합에 의해 길항되고, TGF-β 및 액티빈 A에 의해 조절된다(문헌[Maguer-Satta V, et al., Regulation of human erythropoiesis by activin A, BMP2, and BMP4, members of the TGFbeta family. Exp Cell Res 2003;282:110-120; Maguer-Satta V, Rimokh R., FLRG, member of the follistatin family, a new player in hematopoiesis. Mol Cell Endocrinol 2004;225:109-118]을 인용하는 문헌[Jeanpierre, S. et al, "BMP4 regulation of human megakaryocytic differentiation is involved in thrombopoietin signaling," Blood 2008; 112: 3154-63]). FLRG 및 폴리스타틴은 섬유결합소의 타입 I 모티프와 폴리스타틴 도메인 사이의 직접 상호작용을 통해 미성숙 조혈 전구체 및 줄기 세포에서 인간 조혈 세포 부착성의 조절에 관여한다. (Id. Citing Maguer-Satta V, et al., A novel role for fibronectin type I domain in the regulation of human hematopoietic cell adhesiveness through binding to follistatin domains of FLRG and follistatin. Exp Cell Res 2006;312:434-442 10).
골 형태형성 단백질(BMP)
BMP 계열의 구성원은 본래 골 형성을 유도하는 이의 능력에 의해 발견되었다. 그러나, 골 형성은 이의 많은 기능 중 단지 하나이며, 이들은 세포 분열, 아폽토시스(프로그램된 세포 사멸), 세포 이동, 및 분화를 조절하는 것으로 밝혀졌다. BMP는 성숙 폴리펩티드에서 9개가 아닌 7개의 보존된 시스테인을 가짐으로써 TGF-β 상과의 다른 구성원과 구별될 수 있다. BMP는 Nodal(좌우 축 형성을 담당함) 및 BMP4(신경관 극성, 눈 발달, 및 세포 사멸에 중요함)와 같은 단백질을 포함한다.
인간에서, BMP2, BMP4 및 BMP7은 CD34+CD38- 원시 조혈 집단의 증식, 유지(문헌[Hutton, JF, et al," Bone morphogenetic protein 4 contributes to the maintenance of primitive cord blood hematopoietic progenitors in an ex vivo stroma-non contact co-culture system," Stem Cell Dev. 2006; 15: 805-13]을 인용하는 문헌[Jeanpierre, S. et al, "BMP4 regulation of human megakaryocytic differentiation is involved in thrombopoietin signaling," Blood 2008; 112: 3154-63]), 클론원성, 및 재증식 능력을 조절한다(Id. Citing Bhatia, M. et al, "Bone morphogenetic proteins regulate the developmental program of human hematopoietic stem cells," J. Exp. Med. 1999; 189: 1139-48). 단독이거나 액티빈 A와 조합된 BMP2 및 BMP4는 다양한 모델에서 적혈구형성을 조절하는 것으로 나타났다(Id. Citing Maguer-Satta, V, and Rimokh, R, "FLRG, member of the follistatin family, a new player in hematopoiesis," Mol. Cell Endocrinol. 2004; 225: 109-11).
임의의 다른 사이토카인의 부재하에서 BMP4는 원시 조혈 줄기 세포 구획을 조절하기 위해 SCF와 협력하는 것으로 나타났다. Id.
TGFβ 계열 중, BMP4만이 초기 및 후기 MK 마커를 유도하는 TPO와 동일한 능력, 및 다배체화, PF4의 분비, 및 혈소판 생성과 같은 유사한 말단 분화 특성을 갖는다. (Id). 인간 거대핵세포 및 혈소판에 국소화되고(Id. Citing Sipe, JB et al, "Localization of bone morphogenetic proteins (BMPs)-2, -4, and -6 within megakaryocytes and platelets," Bone 2004; 35: 1316-22), MK 전구체에 의해 자가 생성되는, 골수 간질에 의해 주로 생성되는(Id. Citing Martinovic, S. et al, "Expression of bone morphogenetic proteins in stromal cells from human bone marrow long-term culture," J. Histochem. Cytochem. 2004; 52: 1159-67), 조혈 "니치"의 조절과 관련된 핵심 신호전달 경로의 요소인 BMP4(Id. Citing Zhang, et al, "Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size," Nature 2003; 425: 836-41)는 원시의 미위임(uncommitted) 전구체의 유지로부터 MK 분화의 후기 단계까지 인간 거대핵세포형성의 모든 단계를 효율적으로 조절하는 것으로 입증되었다. 또한, 데이터는 JAK/STAT 및 mTOR 신호전달 경로가 TPO에 대해 확인된 바와 같이 BMP4에 의한 MK 성숙의 조절에 관여하는 것을 암시한다(Id. Citing Guerriero, R. et. Al., "Inhibition of TPO-induced MEK or mTOR activity induces opposite effects on the ploidy of human differentiating megakaryocytes," J. Cell Sci. 2006; 119: 744-52, Raslova, H et al, "Mammalian target of rapamycin (mTOR) regulates both proliferation of megakaryocyte progenitors and late stages of megakaryocyte differentiation," Blood 2006; 107: 2303-10). 따라서, 보고된 결과는 BMP4 및 TPO가 인간 MK 분화를 조절하기 위해 유사한 신호전달 경로를 이용하는 것을 나타낸다. Id. 또한, TPO 또는 BMP4의 특정 세포외 억제제를 이용하여, BMP4 신호전달 경로의 어느 한 억제제가 TPO의 효과를 효과적으로 억제한 반면, 항-TPO-R 항체는 MK 분화에 대한 BMP4의 효과를 차단할 수 없는 것으로 나타났다. Id. 또한, TPO는 MK 전구체에서 BMP4 합성 및 BMP 수용체 발현을 유도하였으며, 이는 TPO가 인간 MK를 조절하기 위해 BMP4 신호전달 경로를 이용하는 반면, 그 반대는 사실이 아닌 것으로 보임을 암시한다. Id.
PEAR-1, RAD001, Wnt3a, 및 AHR
거대핵세포형성의 조절인자로서 관여되는 다른 인자는 P13K/PTEN 신호전달의 자극인자인 혈소판 내피 응집 수용체-1(PEAR-1)(문헌[Kauskot, A. et al, "PEAR1 attenuates megakaryopoiesis via control of the P13K/PTEN pathway," Blood. 2013; 121: 5208-17]을 인용하는 문헌[Smith, BW, and Murphy, GJ, "Stem cells, megakaryocytes, and platelets," Curr. Opin. Hematol. 2014; 21(5): 430-37)]) 및 mTOR 억제제인 RAD001(Id. Citing Su-Y-C et al,"RAD001-mediated STAT3 upregulation and megakaryocytic differentiation," Thromb. Haemost. 2013; 109: 540-49))을 포함한다. Wnt3a는 CD41/CD235 이중 양성 전구체의 생성을 야기시키는 시험관 내 iPSC 유도 시스템에서 인간 거대핵세포 전구체 확장의 억제인자로서 관련되어 왔다(Id. Citing Paluru, P. et al, "The negative impact of Wnt signaling on megakaryocyte and primitive erythroid progenitors derived from hyman embryonic stem cells," Stem Cell Res. 2014; 12: 441-51). iPSC-기반 시험관 내 거대핵세포형성의 조절에서 아릴 탄화수소 수용체(AHR)에 대한 역할(Id. Citing Smith, BW et al, "The aryl hydrocarbon receptor directs hematopoietic progenitor cell expansion and differentiation," Blood. 2013; 122: 376-85)이 설명되었다.
혈소판 유도 미세입자 및 엑소솜
혈소판은 지혈 및 응고에서 잘 설명된 생리학적 역할을 갖지만, 최근에, 이들은 또한 면역, 조직 복구 및 발달에 참여하는 것으로 나타났다(Elzey BD, et al., The emerging role of platelets in adaptive immunity. Cell Immunol. 2005; 238:1-9; Jenne CN et al., Platelets: bridging hemostasis, inflammation, and immunity. Int J Lab Hematol. 2013;35:254-61; Bertozzi CC et al., Platelets regulate lymphatic vascular development through CLEC-2-SLP-76 signaling. Blood. 2010;116:661-70). 혈소판-유래 세포외 소포(EV)는 이들 다양한 기능을 조율하는데 필요한 분자를 제공할 수 있다. 혈소판은 형질막으로부터 유래되는 미세소포 또는 미세입자(MP), 및 엔도솜 경로로부터 유래되는 엑소솜(EXO)을 생성시킬 수 있다(Aatonen MT et al., Isolation and characterization of platelet-derived extracellular vesicles, J. Extracellular Vesicles, vol. 3 (2014) 24692).
혈소판 형질막 유래 미세입자(PMP)는 일반적으로 100 내지 1000 nm의 크기인 것으로 공지되어 있다. 혈소판은 또한 다소포체로부터 40 내지 100 nm 크기의 엑소솜을 생성하는 것으로 공지되어 있다. 이종성 PMP와 대조적으로, 엑소솜은 일반적으로 크기 및 분자 함량 둘 모두에 의해 더욱 균일한 집단을 형성하나, 혈소판에서는, α-과립으로 인해 상기 둘의 일반적으로 별개의 형성 과정이 뒤섞인다. 엑소솜의 공급원인 다소포체는 또한 α-과립의 전단계로 간주되며, 이는 형질막과의 융합시에 엑소솜을 방출할 수 있으며, 여러 α-과립-유래 분자가 또한 PMP에 존재한다. 혈소판-유래 미세소포, 형질막-유래 미세입자, 및 혈소판-유래 엑소솜 상에 또는 내에 존재하는 분자 마커는 다음을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 성장 인자, 예를 들어, VEGF, bFGF, PDGF, TGF-베타1; 면역 반응 인자, 예를 들어, CD40L(CD154); 케모카인/사이토카인, 예를 들어, Rantes(CCL5), CCL23, CXCL7, CXCR4, PF-4(CXCL4), TNF-RI-II, IL-1베타, CX3CR1, 및 베타-트롬보글로불린; 보체 단백질, 예를 들어, CD55, CD59, C5b-9, C1q, C3B, C1-INH, 인자 H; 아폽토시스 마커, 예를 들어, Caspace-3, Caspace-9, FasR(CD95); 응고 인자, 예를 들어, Fva, FVIII, TFPI, TF, PAR-1, FXIIIA; 활성 효소, 예를 들어, PDI, 12-LO, NADPH 산화효소, iNOS2, 헤파나제(Heparnase); 부착 단백질, 예를 들어, 알파-Iib/베타3(CD41/CD61), GPIb(CD42b), GPIX(CD42a), P-셀렉틴(CD62P), PECAM-1(CD31), GPIIIb(CD36), CD49, CD29, CD47, CD9, JAM-A, vWF, 섬유소원, 트롬보스폰딘, 비트로넥틴; 생체활성 지질, 예를 들어, PS, AA, LPA, TXA2; 특히, 달리 분류되지 않은 마커, 예를 들어, Peta-3(CD151), CD63, PPAR-감마, TIMP3, Lactadherin, PAI-1, PrPC, 베타2GPI(Aatonen et al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis Vol. 38, No. 1 (2012)). 일반적인 엑소솜 마커인 CD63은 혈소판-유래 엑소솜에 농축될 뿐만 아니라 PMP에도 존재하며, 그 반대의 경우에도, 많은 일반적인 PMP 단백질이 엑소솜의 서브셋에서 검출된다.
혈소판-유래 미세소포(PMV)는 응고, 부착, 염증, 면역, 및 아폽토시스와 같은 다양하고 때때로 모순적인 활성에 참여하는 것으로 보인다. 이들 항상성 활성 중 많은 활성에서, 여러 세포 유형이 함께 작용하며, 세포내 소통을 위해 미세소체(MV)를 제공할 수 있다. 이러한 대화는 목적을 위해 맞춤화된 기능적으로 가변적인 MV의 형성에 의존한다. PMV의 효과는 직접적일 수 있거나, 즉, 촉매 표면으로 작용하는 것과 같이 PMV 자체에 의해 매개될 수 있거나, 간접적일 수 있고, 즉, PMV 융합시 표현형을 변화시키는 수용자 세포에 의해 매개될 수 있다. 그러나, 분자의 존재는 CD40L(CD154)-함유 PMP에 의해 유도된 예기치 않은 항-염증 반응에 의해 입증된 바와 같이 이의 기능을 보장하지 않는다(Aatonen et al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis Vol. 38, No. 1 (2012)). PMV의 궁극적 효과는 세포 환경에 좌우될 수 있으며(시간적 및 공간적 둘 모두), 이는, 예를 들어, 동일한 PMV의 명백히 모순적인 응고촉진 및 항응고 능력을 설명할 수 있다.
PMV는 완전히 작동성인 표면 수용체(CXC4R, CD41)를 수용자 세포로 전달할 수 있다. PMV에 의한 수용체 전달은 세포의 기원을 혼란스럽게 할 수 있다: CD31 및 폰 빌레브란트 인자의 단핵구로의 PMP-매개 전달은 내피 전구 세포의 존재를 잘못 암시한다. PMV는 또한 활성 효소, 예를 들어, 혈소판 응집을 위한 단백질 디설파이드 이성화효소, 내피 기능이상 동안의 유도성 산화질소 신타제 II 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 산화효소, 및 비만 세포로부터의 리폭신(lipoxin) A4 생성에서의 12-리포-옥시게나제를 함유하고 전달한다. 선천 및 적응 면역에서의 PMV의 참여는 사이토카인 및 케모카인 및 이의 수용체, CD40L, 및 PF4과 같은 여러 분자 그룹의 존재에 의해 추가로 추측된다(Aatonen et al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis Vol. 38, No. 1 (2012)).
혈소판은, 예를 들어, 모두 PMP 단백체의 구성원인 CD41, CD61, 및 IL-1β33와 같은 단백질로 활성화-의존적 방식으로 번역되는 RNA 분자를 갖는다. 혈소판 번역체(translatome)에서의 작용제-의존성 변화가 PMP 종의 분자적 또는 심지어 기능적 차이의 근원일 수 있는 것으로 제안되어 왔다(Aatonen et al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis Vol. 38, No. 1 (2012)).
성체 말초 혈액 혈소판을 이용한 이전 연구
본 발명자의 이전 연구에서, 본 발명자는 다능성 세포의 특징을 나타내는 말초 혈액-줄기 세포(PB-SC)로 지정된 성인 인간 말초 혈액으로부터 분리된 배아-유사 줄기 세포를 확인하였다. 이들 세포는 다른 세포 유형으로의 증식 및 분화의 능력을 갖는 것을 나타내어, 이들을 줄기 세포 기반 요법에서 사용하기에 적합하게 만든다. 배아 줄기 세포 특징 및 조혈 세포 특징을 나타내는 이들 세포는 림프구, 대식세포, 단핵구, 및 조혈 줄기 세포와 표현형적으로 다르다.
기재된 본 발명은 환자로의 전달시 안정적일 수 있는 바이러스-유도 또는 약물-유도 형질도입에 의해 유도된 다능성 줄기 세포의 생성과 관련된 안전성 문제 없이 성체 단핵 세포로부터 유도된 다능성 줄기 세포를 생성시키는데 사용될 수 있는 제대혈 유래 혈소판-유사 세포를 제공한다.
일 양태에 따르면, 기재된 본 발명은 (a) 인간 대상체로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 집단을 분리시키는 단계; (b) 제대혈 또는 말초 혈액으로부터 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획을 분리시키는 단계; (c) 단계 (a)의 PBMC의 집단과 단계 (b)의 혈소판 풍부 분획을 시험관 내에서 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉이 하나 이상의 배아 바이오마커를 발현하는 미성숙 세포 유형으로 PBMC를 재프로그래밍하는데 효과적인, 단계; 및 (d) 인슐린-생성 세포 집단을 생성시키는데 효과적인 배양 조건하에서 시험관 내에서 미성숙 세포 유형을 확장시키는 단계로서, 상기 인슐린-생성 세포 집단이 인간 베타-세포 특이적 전사 인자를 발현하고, 인간 췌장 베타-세포와 기능적으로 동등한, 단계를 포함하는, 성체 세포를 인슐린-생성 세포로 기능적으로 재프로그래밍하기 위한 방법을 제공한다. 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 Ficoll-Paque 구배 분획으로부터 단계 (a)의 성체 PBMC를 분리시키는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에 따르면, 상기 방법은 Ficoll-Paque 구배 분획으로부터 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획을 분리시키는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에 따르면, 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획은 전체 세포, 미토콘드리아, 미세입자, 엑소솜, 용해된 세포, 및 알파 과립 중 하나 이상을 포함한다. 또 다른 구현예에 따르면, 전체 세포, 미토콘드리아, 미세입자, 엑소솜, 용해된 세포, 및 알파 과립 중 하나 이상을 포함하는 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판-풍부 분획은 전사 인자, 성장 인자, 또는 전사 인자 및 성장 인자 둘 모두를 함유한다. 또 다른 구현예에 따르면, 전체 세포는 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 림프성 공통전구세포, 골수성 공통전구세포, 거대핵세포-적혈구 전구체, 과립구-단핵구 전구체, 거대핵세포 계통-위임 전구체, 거대핵세포, 및 혈소판-유사 세포 중 하나 이상을 포함한다. 또 다른 구현예에 따르면, 단계 (c)로부터의 하나 이상의 배아 바이오마커를 발현하는 혈소판-유사 세포는 OCT3/4, NANOG, NKX6.1, MAFA, Sur1, Kir6.2, PD-L1, CD270, Galectin 9, TGF-β1, AIRE, CCR3, CXCR4, 및 CCL2 중 하나 이상을 포함한다. 또 다른 구현예에 따르면, 재프로그래밍된 성체 세포는 신경 세포, 내피 세포, 심근세포, 근육 세포, 상피 세포, 각막 내피 세포, 망막 색소 세포, 골모세포 세포, 각질세포, 모낭 세포, 및 샘 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포 유형을 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 기재된 본 발명은 (a) 인간 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 집단을 분리시키는 단계; (b) 공여자의 제대혈 또는 말초 혈액으로부터 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획을 분리시키는 단계; (c) 단계 (a)의 PBMC의 집단과 단계 (b)의 혈소판 풍부 분획을 시험관 내에서 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉이 하나 이상의 배아 바이오마커를 발현하는 미성숙 세포 유형으로 PBMC를 재프로그래밍하는데 효과적인, 단계; (d) 치료량의 인슐린-생성 세포 집단을 함유하는 세포 생성물을 생성시키는데 효과적인 배양 조건하에서 시험관 내에서 미성숙 세포 유형을 확장시키는 단계로서, 상기 인슐린-생성 세포 집단이 인간 베타-세포 특이적 전사 인자를 발현하고, 인간 췌장 베타-세포와 기능적으로 동등한, 단계; 및 (e) 단계 (d)로부터의 세포 생성물을 수용자 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 고혈당증을 특징으로 하는 질환으로 고통받는 수용자 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 치료적 유효량의 단계 (d)로부터의 인슐린-생성 세포 집단을 함유하는 세포 생성물은 고혈당증 질환의 증상을 감소시키는데 효과적이다. 일 구현예에 따르면, 공여자 및 수용자 대상체는 동일 개체이다. 또 다른 구현예에 따르면, 자가면역 질환은 당뇨병이다. 또 다른 구현예에 따르면, 자가면역 질환은 타입 1 당뇨병이다. 또 다른 구현예에 따르면, 공여자는 수용자 대상체와 동종이계이다. 또 다른 구현예에 따르면, 단계 (b)에서, 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획은 전체 세포, 미토콘드리아, 미세입자, 엑소솜, 용해된 세포, 및 알파 과립 중 하나 이상을 포함한다.
기재된 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 약학적 조성물은 공여자의 제대혈 또는 말초 혈액으로부터의 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획과의 접촉에 의해 하나 이상의 배아 바이오마커를 발현하고, 시험관 내에서 확장되고 재분화된 미성숙 세포 유형으로 기능적으로 재프로그래밍된 성체 PBMC로부터 유래된 치료량의 인슐린-생성 세포 집단을 함유하는 세포 생성물을 포함하며, 상기 인슐린-생성 세포 집단은 인간 베타-세포 특이적 전사 인자를 발현하고, 인간 췌장 베타-세포와 기능적으로 동등하며, 단계 (c)의 하나 이상의 배아 바이오마커를 발현하는 혈소판-풍부 분획은 OCT3/4, NANOG, NKX6.1, MAFA, Sur1, Kir6.2, PD-L1, CD270, Galectin 9, TGF-β1, AIRE, CCR3, CXCR4, 및 CCL2 중 하나 이상에 대해 양성이고; CXCL10, CCR4, CCR5, CCR7, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CD62L, 및 CXCL1에 대해 음성인 세포의 집단을 포함한다. 일 구현예에 따르면, 세포 생성물은 (a) 인간 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 집단을 분리시키는 단계; (b) 공여자의 제대혈 또는 말초 혈액으로부터 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획을 분리시키는 단계; (c) 단계 (a)의 PBMC의 집단과 단계 (b)의 혈소판 풍부 분획을 시험관 내에서 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉이 하나 이상의 배아 바이오마커를 발현하는 미성숙 세포 유형으로 PBMC를 재프로그래밍하는데 효과적인, 단계; (d) 치료적 유효량의 인슐린-생성 세포 집단을 함유하는 세포 생성물을 생성시키는데 효과적인 배양 조건하에서 시험관 내에서 미성숙 세포 유형을 확장시키는 단계로서, 상기 인슐린-생성 세포 집단이 인간 베타-세포 특이적 전사 인자를 발현하고, 인간 췌장 베타-세포와 기능적으로 동등한, 단계; 및 (e) 세포 생성물과 약학적으로 허용되는 담체를 제형화하여 약학적 조성물을 형성시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되며, 여기서 고혈당증을 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체로 투여되는 경우 단계 (d)로부터의 치료적 유효량의 인슐린-생성 세포 집단을 함유하는 세포 생성물은 고혈당증 질환의 증상을 감소시키는데 효과적이다. 또 다른 구현예에 따르면, 상기 방법의 단계 (b)에서, 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획은 전체 세포, 미토콘드리아, 미세입자, 엑소솜, 용해된 세포, 및 알파 과립 중 하나 이상을 포함한다. 또 다른 구현예에 따르면, 기능적으로 재프로그래밍된 성체 세포의 집단은 CXCL10, CCR4, CCR5, CCR7, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CD62L, 및 CXCL1에 대해 음성인 OCT3/4, NANOG, NKX6.1, MAFA, Sur1, Kir6.2, PD-L1, CD270, Galectin 9, TGF-β1, AIRE, CCR3, CXCR4, 및 CCL2 중 하나 이상을 제공한다. 또 다른 구현예에 따르면, 기능적으로 재프로그래밍된 세포는 인슐린을 생성할 수 있다.
또 다른 양태에 따르면, 기재된 본 발명은 고혈당 대상체로의 전달을 위해 제형화된 약제의 제조를 위한, 공여자의 제대혈 또는 말초 혈액으로부터의 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획과의 접촉에 의해 하나 이상의 배아 바이오마커를 발현하고, 시험관 내에서 확장되고 재분화된 미성숙 세포 유형으로 재프로그래밍된 성체 PBMC로부터 유래된 치료량의 인슐린-생성 세포 집단을 함유하는 세포 생성물을 포함하는 약학적 조성물의 용도를 제공하며, 상기 인슐린-생성 세포 집단은 인간 베타-세포 특이적 전사 인자를 발현하고, 인간 췌장 베타-세포와 기능적으로 동등하다. 일 구현예에 따르면, 고혈당증은 자가면역 질환으로부터 발생하며, 치료량은 자가면역 질환의 증상을 개선시키는데 효과적이다. 또 다른 구현예에 따르면, 자가면역 질환은 타입 1 당뇨병이다.
도 1의 패널 (a), (b), (c) 및 (d)는 모의 요법(CB-SC 교육 없음), CB-SC 교육, 및 통상적인 요법 후의 타입 1 당뇨병 및 타입 2 당뇨병 대상체(y-축)에서 부 착성 제대혈 줄기 세포(CB-SC)의 존재하에서 림프구를 간단히 공동 배양한 후 " 교육된 " 림프구를 환자의 순환으로 복귀시키는(" 줄기 세포 교육 요법") 생물반응기를 통한 환자의 혈액을 순환시킴에 의한 혈소판의 조절을 제시하는 데이터의 막대 그래프이다 . (a) 혈소판 수를 제시하는 데이터(y-축). (b) 혈소판 분포 폭(PDW, y-축)을 제시하는 데이터. (c) 평균 혈소판 부피(MPV, y-축)(y-축)를 제시하는 데이터. (d) CB-SC를 갖는 백인 T1D 대상체(N=8)의 처리 전 및 후의 혈소판 수를 제시하는 데이터.
도 2의 패널 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i)는 혈소판 유사 세포에서의 면역 조절-관련 마커의 발현을 제시하는 흐름세포측정법 데이터이 다. 혈소판-유사 세포는 인간 제대혈(a-d) 및 성체 말초 혈액 단위(e-i)로부터 정제되었다. (a) 제대혈 혈소판 유사 세포에서의 CD270과 CD41 및 CD270과 CD61의 공동-발현. (b) 제대혈 혈소판 유사 세포에서의 CD41과 TGF-β1 및 CD42와 TGF-β1의 공동-발현. (c) 7개의 제대혈 제조물에서의 AIRE의 발현을 제시하는 웨스턴 블롯. (d) CD41+ 제대혈 혈소판 유사-세포에서의 AIRE의 발현을 제시하는 이중 염색. 동형 매치된 IgG를 대조군으로 사용하였다. (e) CD41+ CD42+ 성체 혈액 혈소판 유사 세포에서의 공동-억제 표면 마커 CD270, 및 Galectin 9의 발현. 동형-매치된 IgG를 대조군으로 사용하였다. (f) 성체 혈액-유래 혈소판 유사 세포에서의 PD-L1 및 CD270의 높은 발현, Galectin 9의 낮은 발현, 및 ICOS의 발현 없음을 제시하는 이중 면역염색. 대표 데이터는 8개의 개별 제조물로부터의 것이었다. (g) CD41+ 성체 혈액 혈소판 유사 세포에서의 TGF-β1의 발현. (h) 9개의 성체 혈액 제조물에서의 AIRE의 발현을 제시하는 웨스턴 블롯. (i) CD41+ 성체 혈액 혈소판 유사 세포에서의 AIRE의 발현을 제시하는 이중 염색. 동형-매치된 IgG를 대조군으로 사용하였다. (j) 성체 혈액 혈소판 유사 세포에서의 다양한 수준의 케모카인 수용체 CCR3, CCR4, 및 CCR5(하단) 및 리간드 CCL2, CXCL1 및 CXCL10(상단)의 발현(좌측에서 우측으로); (k) 성체 혈액 혈소판 세포에서의 케모카인 수용체(상단) CCR7, CXCR1, CXCR2, (하단) CXCR3, 및 CXCR4) 및 CD62L 리간드(하단 우측)의 발현(좌측에서 우측으로).
도 2의 패널 l, m, n, o, p 및 q는 혈소판-유래 미토콘드리아가 면역 조절 특성을 나타내는 실험적 증거를 도시한다. 도 2l은 T 세포 무반응 및 면역 내성-관련 유전자의 발현을 제시하는 CB-혈소판 및 PB-혈소판으로부터의 미토콘드리아 DNA의 실시간 PCR 어레이 분석을 제시한다. 미토콘드리아는 면역 마커-관련 유전자의 기원을 확인하기 위해 미토콘드리아 DNA(MitoDNA)의 유전자 전사를 위해 CB-혈소판 및 PB-혈소판으로부터 정제되었고, 미토콘드리아는 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 Qproteome Mitochondria Isolation 키트(Qiagen, Hidden, Germany)를 이용하여 PB-혈소판으로부터 분리되었다. 흐름세포측정법 분석은 미토콘드리아를 방출하는 혈소판이 면역 내성-관련 마커 CD270 및 CD274(PD-L1)를 나타낸 것을 제시한다(도 2m).
말초 혈액-유래 단핵 세포(PBMC)는 항-CD3 + 항-CD28 항체 + 재조합 인간 IL-2(rIL-2)와 커플링된 Dynabead의 존재하에서 동종이계 PB-혈소판-유래 미토콘드리아로 처리되었다. 4일 동안의 생체-외 확장 후, 많은 수의 세포 클러스터가 관찰되었고, 상층액에 상이한 크기가 부유하며(도 2n, 하단 중간 패널), 이는 유의한 T 세포 증식을 암시한다. 미토콘드리아의 존재하에서, 이러한 현상은 명백하지 않았다(도 2n, 우측 패널). 도 2o는 미토콘드리아와의 조합 처리 후, 세포 수가 현저히 감소된 것을 제시한다.
도 2p는 미토콘드리아 처리 후 CD4+PD1+ T 세포의 백분율이 15%±0.64%로 증가된 것을 제시한다(도 2p)(P=0.001). 도 2q는 미토콘드리아의 존재하에서 CD8+PD1+ T 세포의 백분율이 또한 2.43%±1.18%로부터 6.46%±0.28%로 개선된 것을 흐름세포측정법에 의해 제시한다(도 2q)(P=0.034).
도 3의 패널 a 내지 p는 혈액에서 혈소판-유사 세포와 면역 세포의 상호작용을 제시하는 흐름세포측정법 데이터(패널 a-c, e, f), 막대 그래프(패널 d 및 m), 조직 섹션(패널 g-l), 및 세포의 현미경사진(패널 n, o 및 p)을 제공한다.
패널 (a)는 CBMC의 게이팅되지 않은 도트 플롯이다. 4개의 주요 집단이 제시된다: 림프구(Ly, 자주색 원), 단핵구(Mo, 흑색 원), 과립구(Gr, 황색 원), 및 혈소판-유사 세포(PI, 청색 원). 가장 우측에 있는 패널은 4개의 집단의 상이한 영역 사이에서 광범위한 분포(녹색)를 제시하는 게이팅된 도트 플롯이다;
패널 (b)는 CBMC의 도트 플롯에서의 게이팅된 CD42+ 혈소판 유사 세포의 분포를 제시하는 히스토그램이다.
패널 (c)는 새로이 분리된 CBMC로부터의 혈소판-유사 세포 및 다른 면역 세포의 공동-분포를 예시하는 흐름세포측정법 데이터를 제시한다. 데이터는 혈소판이 CD14+ 단핵구 및 CD66b+ 과립구뿐만 아니라 일부 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD19+ B 세포 및 CD56+ NK 세포에 부착하는 것을 제시한다.
패널 (d)는 혈소판 마커 CD41+ 및 계통 마커에 대해 양성인 세포를 정량화하는 막대 그래프이다. 대표 데이터는 3개의 실험으로부터의 것이었다.
패널 (e)는 흐름세포측정법 데이터를 제시한다. 대표 데이터는 3개의 실험으로부터의 것이었다. CBMC는 실온에서 5분 동안 EDTA/트립신으로 처리되고, 5분 동안 1000 rpm에서 PBS로 세척되었다. 대조군(좌측 패널)은 EDTA/트립신으로 처리되지 않은 CBMC였다. 중간 패널은 과립구 상에서의 CD41의 발현이 EDTA/트립신을 이용한 처리 후에 현저히 감소된 것을 제시한다. 단핵구에 부착하는 CD41+ 혈소판 유사 세포(CD14+)의 유의한 수가 관찰되었다. 우측 패널은 게이팅된 CD14+CD41+ 세포(청색)를 제시하는 도트 플롯이다.
패널 f-m은 혈소판과 단핵구/대식세포(Mo/Mφ)(CD14+)의 상호작용을 예시하는 데이터를 제시한다. 혈소판은 건강한 공여자(뉴욕 혈액 은행)의 성체 혈액 단위로부터 정제되었다.
패널 (f)는 흐름세포측정법 데이터를 제시한다. CD14+CD41b+ 및 CD14+CD42a+ 세포의 백분율은 투과화 후에 증가되었다. 동형-매치된 IgG를 대조군으로 사용하였다. 대표 데이터는 3개의 실험으로부터의 것이었다.
패널 (g) 내지 (l)은 혈소판과 Mφ의 상호작용을 나타내는 투과 전자 현미경사진이다.
패널 (g)는 혈소판(상단 패널) 및 Mφ의 미세구조를 제시하는 전자 현미경사진이다.
패널 (h)는 혈소판으로 연장된 Mφ(황색 화살표)로부터의 위족을 제시하는 전자 현미경사진이다.
패널(i-k)는 혈소판과 Mφ 막의 융합을 제시하는 전자 현미경사진이다. 적색 화살표는 혈소판과 Mφ의 융합을 확인한다. (패널 i) 상단 패널, 점선은 하단 패널에 제시된 더 높은 배율의 영역을 제시한다. (패널 j) 상단 패널 좌측의 박스는 패널 우측 및 하단 패널 좌측에 확대되어 제시된다. (패널 k) 좌측 패널의 박스는 우측 패널에서 확대된다.
패널 (l)의 좌측 패널은 Mφ에 의한 혈소판의 포식작용을 제시한다. 우측 패널은 고배율이다.
패널 (m), (n), (o), 및 (p): 제대혈로부터의 정제된 Mo/Mφ는 트립신/EDTA로 처리되어 Mo/Mφ로부터 부착된 혈소판을 분리시켰다. 트립신/EDTA 처리된 Mo/Mφ는 이후 50 ng/ml의 대식세포 집락-자극 인자(M-CSF)의 존재하에서 배양되었다. 트립신/EDTA 미처리 Mo/Mφ를 대조군으로 사용하였다. 패널 m은 EDTA-트립신 처리 세포 및 EDTA-트립신 미처리 세포에서의 섬유모세포-유사 대식세포(f-Mφ)의 백분율을 비교하는 막대 그래프이다. f-Mφ의 백분율은 트립신/EDTA를 이용한 처리 후에 현저히 감소되었다.
f-Mφ 형성의 백분율은 8-웰 챔버 슬라이드에서 2일 동안 배양 후에 정량되었다. 대표 데이터는 4개의 실험으로부터의 것이었다.
패널 (n)은 24-웰 조직-배양-처리 플레이트에서 7일 동안 배양 후의 EDTA/트립신 처리 MoMφ(좌측 패널) 및 EDTA/트립신 미처리 Mo/Mφ(대조군)의 위상차 현미경사진이다. 대표 데이터는 5개의 실험으로부터의 것이었다. 트립신/EDTA 처리 후에 세포 수는 뚜렷이 감소되었다.
패널 (o) f-Mφ는 트립신/EDTA 처리된 Mo/Mφ 그룹에서 100 ng/ml의 상피 성장 인자(EGF)로 처리되었다(좌측 패널). 세포는 24-웰 조직-배양-처리 플레이트에서 10일 동안 분화 후에 검사되었고, 이후 1:100 희석으로 마우스 항-Pan-카드헤린 Ab로 면역염색되었다, 배율, x 100. 대표 데이터는 4개의 실험으로부터의 것이었다. EGF 처리 후 상피-유사 세포로의 트립신/EDTA 처리된 Mo/Mφ의 분화가 감소되었다.
패널 (p)는 삼중 면역염색 후 Mφ에서의 혈소판 마커 CD42a 및 전사 인자 OCT4의 발현을 제시하는 공초점 현미경검사로 시각화된 세포를 함유한다. 대표 데이터는 4개의 실험으로부터의 것이었다.
도 4의 패널 (a)-(h)는 인간 제대혈(패널 a, b, d 및 e) 및 성체 말초 혈액(패널 c, f 및 g)으로부터 정제된 혈소판 유사 세포에 의해 발현된 세포 마커를 제시한다. 대표 이미지는 4개의 실험으로부터의 것이었다.
패널 (a)는 흐름세포측정법에 의한 정제된 혈소판 유사 세포의 분석이다. 제시된 도트 플롯 내의 게이팅된 혈소판 유사 세포(상단 좌측 패널, 청색)는 제시된 바와 같이 ES 마커 OCT4와 함께 혈소판 마커 CD41 및 CD42를 이용하여 분석되었다.
패널 (b)는 CB 혈소판 유사 세포에서의 CD41 및 ES 마커 SOX2(중간 패널) 및 NANOG(우측 패널)를 이용한 이중 염색 후의 흐름세포측정법 분석을 제시한다. 동형-매치된 IgG를 대조군으로 사용하였다(좌측 패널).
패널 (c)는 PB 혈소판 유사 세포에서의 CD41 및 ES 마커 OCT4(상단 우측 패널), SOX2(하단 좌측 패널) 및 NANOG(하단 우측 패널)를 이용한 이중 염색 후의 흐름세포측정법 분석을 제시한다. 동형-매치된 IgG를 대조군으로 사용하였다(상단 좌측 패널).
패널 (d)는 실시간 PCR 생성물의 전기영동 후의 제대혈로부터 유래된 혈소판 유사 세포에서의 ES 마커의 발현을 제시한다.
패널 (e)는 제대혈로부터 유래된 혈소판 유사 세포에서의 ES 마커의 발현을 제시하는 웨스턴 블롯을 제시한다.
패널 (f)는 실시간 PCR 생성물의 전기영동 후의 말초 혈액으로부터 유래된 혈소판 유사 세포에서의 ES 마커의 발현을 제시한다.
패널 (g)는 말초 혈액으로부터 유래된 혈소판 유사 세포에서의 ES 마커의 발현을 제시하는 웨스턴 블롯을 제시한다.
패널 (h) 및 (i)는 제대혈 및 말초 혈액-유래 혈소판 유사 세포로부터 정제된 미토콘드리아 DNA의 PCR 어레이 분석을 제시한다. 유전자 전사물을 RT2 Profiler PCR Array로 분석하였다. 발현 값을 β-액틴에 대해 표준화시켰다. 색은 키에 제시된 바와 같이 유전자 발현의 수준을 나타낸다. 높은 발현을 갖는 유전자는 적색으로 도시되고, 낮은 발현을 갖는 유전자는 녹색으로 도시되고, 발현을 갖지 않는 유전자는 십자기호와 함께 흑색으로 도시된다. 패널 (h) 인간 줄기 세포 전사 인자에 대한 PCR 어레이 데이터. 패널 (i) 인간 줄기 세포 유전자에 대한 PCR 어레이 데이터. 5개의 제조물 중 하나로부터의 제시된 데이터.
도 5의 패널 a 내지 k는 제대혈(패널 a-f 및 k, 상단 및 중간 열) 및 말초 혈액(패널 g-j 및 k, 하단 열)로부터 유래된 혈소판 제조물에서의 췌장 섬 β 세포-관련 마커의 발현을 제시하는 데이터를 도시한다. n = 6;
패널 (a)는 CB-유래 혈소판 유사 세포에서의 췌장 섬-관련 호르몬 생성물 및 β-세포-관련 기능성 마커의 실시간 PCR 분석 후, 전기영동으로부터의 데이터를 제시한다.
패널 (b)는 CB-유래 혈소판 유사 세포에서의 췌장 섬 β-세포-관련 전사 인자의 실시간 PCR 분석 후 전기영동으로부터의 데이터를 제시한다.
패널 (c)는 CB-유래 혈소판 유사 세포에서의 섬 β 세포-특이적 전사 인자 MAFA에 대한 웨스턴 블롯이다.
패널 (d)는 새로이 분리된 인간 췌장 섬 세포에서의 인간 췌장 섬-관련 호르몬 생성물에 대한 흐름세포측정법 데이터를 제시한다. 동형-매치된 IgG(회색 히스토그램)를 음성 대조군으로 사용하였다.
패널 (e)는 CB-유래 혈소판 유사 세포에서의 혈소판 마커 CD41 또는 CD42에 대해 이중 염색된 췌장 섬-관련 호르몬 생성물에 대한 흐름세포측정법 데이터를 제시한다.
패널 (f)는 CB-유래 혈소판 유사 세포에서의 혈소판 마커 CD41 또는 CD42에 대해 이중 염색된 췌장 섬 β-세포-관련 전사 인자에 대한 흐름세포측정법 데이터를 제시한다.
패널 (g)는 PB-유래 혈소판 유사 세포에서의 췌장 섬-관련 호르몬 생성물 및 β-세포-관련 기능성 마커의 실시간 PCR 분석 후, 전기영동으로부터의 데이터를 제시한다.
패널 (h)는 PB 유래 혈소판 유사 세포에서의 혈소판 마커 CD41 또는 CD42에 대해 이중 염색된 췌장 섬-관련 호르몬 생성물에 대한 흐름세포측정법 데이터를 제시한다.
패널 (i)는 PB-유래 혈소판 유사 세포에서의 췌장 섬 β-세포-관련 전사 인자의 실시간 PCR 분석 후 전기영동으로부터의 데이터를 제시한다.
패널 (j)는 PB-유래 혈소판 유사 세포에서의 췌장 섬 β-세포-관련 전사 인자의 흐름세포측정법 데이터를 제시한다.
패널 (k)는 인슐린(청색), 치밀 과립 마커 ADP(적색), 및 α 과립 마커 vWF(녹색)를 이용한 삼중 면역염색 후의 인간 CB- 및 PB-유래 혈소판 유사 세포의 공초점 현미경검사로부터의 데이터를 제시한다. 동형-매치된 IgG를 이용한 면역염색을 음성 대조군(삽입된 황색 점선 직사각형)으로 사용하였다. 축척 막대, 5 μm. 대표 데이터는 6개의 실험으로부터의 것이었다.
도 6의 패널 a-o는 혈소판 유사 세포에 의해 방출된 미토콘드리아에 의한 개선된 췌장 섬 β-세포 기능을 입증하는 데이터를 도시한다.
패널 (a)는 도트 플롯(좌측 패널) 및 히스토그램(우측 패널) 포맷으로 혈소판 유사 세포로부터의 미토콘드리아의 기저 방출을 제시하는 흐름세포측정법 데이터를 제시한다.
패널 (b)는 대조군에 비한 효능제 ADP, ARA 및 트롬빈의 존재 하에서의 상이한 혈소판 응집제를 이용한 자극 후의 미토콘드리아의 방출 수준을 나타내는 막대 그래프 플롯을 제시한다.
패널 (c)는 트랜스웰에서 MitoTracker Deep Red(하단)로 표지된 혈소판 유사 세포와 함께 새로이 분리된 인간 췌장 섬 세포(상단)의 공동-배양을 위한 트랜스웰 배양 시스템의 실험 설정을 도시한다.
패널 (d)는 패널 (c)에 도시된 실험으로부터의 흐름세포측정법에 의한 동역학 측정을 제시한다. 데이터는 인간 췌장 섬 세포가 트랜스웰 공동-배양에서 혈소판 유사 세포(하단)로부터 방출된 MitoTracker Deep Red-표지된 미토콘드리아를 흡수하는 것을 제시한다.
패널 (e)는 혈소판-유사 세포로부터 유래된 미토콘드리아에서의 케모카인 및 케모카인 수용체(좌측으로부터 우측으로, 섬유결합소, CXCR2, CXCR4, CCR7) 및 CD62L(부착을 매개하는 L-셀렉틴)의 발현에 대한 흐름세포측정법 데이터를 제시한다.
패널 (f)는 인간 섬 β 세포에서의 부착 분자(CD29, CD38, CD36), 케모카인 CCL2, 및 케모카인 수용체(TLR4, TLR6, CCR4 및 CCR6)의 발현에 대한 흐름세포측정법 데이터를 제시한다.
패널 (g) CD29 또는 TLR4에 대한 차단 항체의 존재하에서 혈소판-유래 미토콘드리아와 혈소판 섬을 공동배양함으로서 획득된 데이터. 인간 섬 β 세포에 의한 미토콘드리아의 이동 및 흡수는 항-CD29, 항-TLR4, 또는 둘 모두의 존재하에서 현저히 감소되었다.
패널 (h)는 패널 6(c)에 도시된 바와 같이 트랜스웰에서 혈소판-유사 세포 및 대조군 섬 세포와 공동 배양된 트립신/EDTA-분리된 단일 췌장 섬 β 세포에 대한 세포 생활력을 나타내는 막대 그래프를 제시한다. 세포 생활력은 단일 섬 β 세포가 트랜스웰에서 혈소판 유사 세포와 공동 배양된 후에 증가되었다.
패널 (i)는 패널 6(c)에 도시된 바와 같이 트랜스웰에서 혈소판-유사 세포 및 대조군 섬 세포와 공동 배양된 트립신/EDTA-분리된 단일 췌장 섬 β 세포에 대한 살아 있는 세포 수를 나타내는 막대 그래프를 제시한다. 섬 β 세포의 수는 트랜스웰에서 혈소판 유사 세포와 공동 배양된 후에 증가되었다.
패널 (j)는 트랜스웰에서 새로이 분리된 전체 인간 췌장 섬(상단)과 미토콘드리아로 표지된 혈소판 유사 세포(하단)의 공동-배양을 도시하는 개략도이다.
패널 (k)는 패널 6j에서 도시된 바와 같이 트랜스웰에서 혈소판-유사 세포 유래 미토콘드리아와 공동-배양된 대조군 섬 및 전체 섬에 대한 세포 생활력(%)을 나타내는 막대 그래프를 제시한다. 트랜스웰에서 전체 섬이 혈소판 유사 세포 유래 미토콘드리아와 공동-배양된 경우에 세포 생활력이 증가되었다.
패널 (l)은 패널 6j에서 도시된 바와 같이 트랜스웰에서 혈소판-유사 세포 유래 미토콘드리아와 공동-배양된 대조군 섬 및 전체 섬에 대한 평균 섬 크기를 정량하는 데이터를 제시한다. 평균 섬 크기는 패널 6(j)에 도시된 바와 같이 전체 섬이 트랜스웰에서 혈소판 유사 세포 유래 미토콘드리아(하단)와 공동 배양된 후에 증가되었다.
패널 (m)은 대조군 섬 및 미토콘드리아 처리된 인간 섬에 대한 Ki67 대 C-펩티드의 흐름세포측정법 플롯이다. 데이터는 패널 6(j)에 도시된 바와 같이 전체 섬이 트랜스웰에서 혈소판 유사 세포 유래 미토콘드리아(하단)와 공동 배양된 후에 인슐린+Ki67+ 섬 β 세포의 백분율이 증가한 것을 제시한다.
패널 (n)은 인슐린 분비촉진제 5.5 mM 글루코스(백색), 16.7 mM 글루코스(회색), 및 5.5 mM 글루코스+톨부타미드(흑색)의 존재하에서의 대조군 섬 및 미토콘드리아-처리된 섬에 대한 C-펩티드 방출의 막대 그래프를 제시한다. 기능 분석은 섬 β 세포로부터의 C-펩티드 방출에 의해 측정된 바와 같이 췌장 섬 β 세포 기능이 도 6(j)에 도시된 바와 같이 대조군 섬에 비해 트랜스웰에서 혈소판-유래 미토콘드리아(하단)와 함께 전체 섬이 공동-배양된 후에 5 mM 글루코스+톨부타미드로 처리된 세포에서 개선된 것을 제시한다.
패널 (o)는 당뇨병 환자로부터의 인간 췌장 조직의 섬 β-세포 마커 인슐린(적색) 및 혈소판 마커 CD42a(녹색)의 면역조직화학 공동국소화를 도시한다. 축척 막대, 10 μm.
어휘
용어 "알파 세포" 또는 "α-세포"는 혈당 수준이 너무 낮게 떨어진 경우에 호르몬 글루카곤을 제조하고 방출하는 췌장 내의 한 세포 유형을 나타내기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 글루카곤은 에너지를 위해 혈액으로 글루코스를 방출시키도록 간을 자극한다.
본원에서 사용되는 용어 "베타 세포" 또는 "β-세포"는 인슐린을 제조하는 췌장 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "이능성"은 2개의 세포 계통으로 분화할 수 있는 세포를 나타낸다.
CD3(TCR 복합체)는 4개의 별개의 사슬로 구성된 단백질 복합체이다. 포유동물에서, 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 및 2개의 CD3ε 사슬을 함유하며, 이는 T 세포 수용체(TCR) 및 ζ-사슬과 회합하여 T 림프구에서 활성화 신호를 생성시킨다. 함께, TCR, ζ-사슬 및 CD3 분자는 TCR 복합체를 포함한다. CD3 분자의 세포내 꼬리는 TCR의 신호전달 능력에 필수적인 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)으로 공지된 보존된 모티프를 함유한다. ITAM의 인산화시, CD3 사슬은 T 세포의 신호전달 캐스케이드와 관련된 키나제인 ZAP70(제타 회합 단백질)을 결합시킬 수 있다.
인테그린은 세포와 이를 둘러싼 조직 사이의 부착을 매개하고, 세포-세포 및 세포-기질 상호작용에 관여하는 수용체이다. 포유동물에서, 18개의 α 및 8개의 β 서브유닛이 특성규명되었다. α 및 β 서브유닛 둘 모두는 2개의 별개의 꼬리를 함유하며, 이들 둘 모두는 형질막을 투과하고, 작은 세포질 도메인을 갖는다.
인테그린 αM(ITGAM; CD11b; 대식세포-1 항원(Mac-1); 보체 수용체 3(CR3))은 이종이량체 인테그린 αMβ2 분자의 단백질 서브유닛이다. αMβ2의 두 번째 사슬은 일반 인테그린 β2 서브유닛(CD18)이다. αMβ2는 단핵구, 과립구, 대식세포 및 자연 살해 세포를 포함하는 많은 백혈구의 표면에서 발현된다. 일반적으로, αMβ2는 백혈구 부착 및 이동을 조절함으로써 염증을 매개하는 것으로 생각된다. 또한, αMβ2는 포식작용, 세포-매개 세포독성, 화학주성 및 세포 활성화에서 역할을 할 뿐만 아니라 비활성화된 보체 성분 3b(iC3b)를 결합시키는 이의 능력으로 인해 보체 시스템과 관련된 것으로 생각된다. 인테그린 αMβ2의 ITGAM 서브유닛은 세포의 부착 및 확산을 야기시키는데 직접 관여하나, β2(CD18) 서브유닛의 존재 없이 세포 이동을 매개할 수 없다.
CD14는 주로 대식세포, 및 덜한 정도로 호중구 과립구에 의해 발현되는 세포 표면 단백질이다. CD14+ 세포는 상이한 세포의 숙주로 분화할 수 있는 단핵구이며, 예를 들어, 수지상 세포로의 분화는 GM-CSF 및 IL-4와 같은 사이토카인에 의해 촉진된다. CD14는 박테리아 지질다당류(LPS)의 검출을 위한 공동-수용체(toll-유사 수용체(TLR) 4 및 림프구 항원 96(MD-2)과 함께)로 작용한다. CD14는 지질다당류 결합 단백질(LBP)의 존재하에서만 LPS에 결합할 수 있다.
CD15(3-푸코실-N-아세틸-락토사민; 단계 특이적 배아 항원 1(SSEA-1))는 당단백질, 당지질 및 프로테오글리칸에서 발현될 수 있는 탄수화물 부착 분자이다. CD15는 일반적으로 호중구에서 발견되며, 포식작용 및 화학주성을 매개한다.
CD16은 자연 살해 세포, 호중구 다형핵 백혈구, 단핵구 및 대식세포의 표면에서 발견되는 Fc 수용체(FcγRIIIa 및 FcγRIIIb)이다. Fc 수용체는 IgG 항체의 Fc 부분에 결합한다.
CD19는 난포성 수지상 세포 및 B 세포에서 발현되는 인간 단백질이다. 이러한 세포 표면 분자는 항원 수용체-의존성 자극에 대한 역치를 감소시키기 위해 B 림프구의 항원 수용체와 어셈블리된다. 이는 일반적으로 활성화시 CD19의 세포질 꼬리가 인산화되며, 이는 Src-계열 키나제에 의한 결합 및 포스포이노시티드 3(PI-3) 키나제의 모집을 가능하게 하는 것으로 생각된다.
CD20은 모든 성숙 B-세포의 표면에서 발현되는 당화되지 않은 인단백질이다. 연구는 CD20이 형질 세포로의 B-세포의 발달 및 분화에서 역할을 하는 것을 암시한다. CD20은 막-스패닝 4A 유전자 계열(MS4A)의 구성원에 의해 인코딩된다. 이러한 단백질 계열의 구성원은 공통의 구조적 특징을 특징으로 하며, 조혈 세포 및 비림프성 조직 사이에서 독특한 발현 패턴을 나타낸다.
CD31(혈소판/내피 세포 부착 분자; PECAM1)은 일반적으로 내피 세포, 혈소판, 대식세포 및 쿠퍼 세포, 과립구, T 세포, 자연 살해 세포, 림프구, 거대핵세포, 파골세포 및 호중구에서 발견된다. CD31은 조직 재생 및 신체로부터 호중구를 안전하게 제거하는데 있어서 핵심 역할을 한다. 접촉시, 대식세포 및 호중구의 CD31 분자는 호중구의 건강 상태를 대식세포에 전달하는데 사용된다.
CD34는 조혈 세포, 내피 전구 세포, 혈관의 내피 세포, 및 비만 세포에서 일반적으로 발견되는 단량체 세포 표면 당단백질이다. CD34 단백질은 단일-통과 막횡단 시알로뮤신 단백질 계열의 구성원이며, 세포-세포 부착 인자로 작용한다. 연구는 CD34가 또한 골수 세포외 기질 또는 직접적으로 간질 세포로의 줄기 세포의 부착을 매개할 수 있음을 암시한다.
세포-세포 상호작용, 세포 부착 및 이동에 관여하는 세포-표면 당단백질인 CD44("히알루로난 수용체")가 중간엽 세포의 특정 유형을 확인하는데 사용된다.
CD45(단백질 티로신 포스파타제, 수용체 타입, C; PTPRC) 세포 표면 분자는 조혈 세포에서 특이적으로 발현된다. CD45는 세포외 도메인, 단일 막횡단 세그먼트, 및 2개의 탠덤 세포질내 촉매 도메인을 갖는 단백질 티로신 포스파타제(PTP)이며, 따라서 수용체 타입 PTP에 속한다. 연구는 이것이 항원 수용체 복합체의 성분과의 직접 상호작용에 의해, 또는 항원 수용체 신호전달에 필요한 다양한 Src 계열 키나제를 활성화시킴으로써 작용하는 T-세포 및 B-세포 항원 수용체 신호전달의 필수 조절인자임을 암시한다. CD45는 또한 JAK 키나제를 억제하며, 따라서 사이토카인 수용체 신호전달의 조절인자로서 작용한다. CD45 계열은 모두 단일 복합체 유전자의 생성물인 다수의 구성원으로 구성된다. CD45의 다양한 공지된 아이소형은 CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RAB, CD45RAC, CD45RBC, CD45RO, 및 CD45R(ABC)을 포함한다. 상이한 아이소형이 상이한 세포에서 발견될 수 있다. 예를 들어, CD45RA는 나이브 T 세포에서 발견되고, CD45RO는 기억 T 세포에서 발견된다.
CD56(신경 세포 부착 분자, NCAM)은 신경세포, 아교세포, 골격근 및 자연 살해 세포의 표면에서 발현되는 동종친화성 결합 당단백질이다. 일반적으로, NCAM은 세포-세포 부착, 신경돌기 생성, 및 시냅스 가소성에서 역할을 하는 것으로 생각된다. 각각이 이의 세포질 도메인 내에서만 가변적인 NCAM의 3개의 공지된 주요 아이소형이 존재한다: NCAM-120kDA(글리코실포스파리딜이노시톨(GPI) 고정); NCAM-140kDa(짧은 세포질 도메인); 및 NCAM(긴 세포질 도메인). NCAM의 상이한 도메인은 상이한 역할을 가지며, Ig 도메인은 NCAM에 대한 동종친화성 결합에 관여하고, 섬유결합소 타입 III(FNIII) 도메인은 신경돌기 생성을 발생시키는 신호전달에 관여한다.
CD59는 인간 세포를 보체-매개 용해로부터 보호하는 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-연결된 막 당단백질을 나타낸다.
CD66 항원 계열은 면역글로불린 유전자 상과 내에 속하는 부착 분자의 암배아 항원 계열의 구성원에 의해 발현되는 조혈 시스템 내에서 호중구-특이적 에피토프를 확인한다. 모든 CD66(a-f) 분자의 세포외 부분은 CD-2 계열의 표준 b-시트내 디설파이드가 결여된 N-말단 V-세트 IgSF 도메인을 갖는다. CD66a는 시알화된 Lex(sLe x, CD15s) 구조를 갖는 N-연결된 글리칸에 의해 기여되는 질량의 60% 초과를 차지하는 과도하게 당화된 타입 1 당단백질이다. CD66a에서, 이들은 VxYxxLx21IxYxxV와 같이 추가로 이격되어 있으며, SHIP-1 및 -2와 같은 티로신 포스파타제에 결합하는 모티프와 유사하다. 호중구의 활성화는 CD66a 세포질 도메인에서 티로신 잔기의 인산화를 발생시킨다. CD66a는 과립구 및 상피 세포에서 발현된다. 7개의 기능성 암배아 항원(CEA) 계열 유전자 중 4개의 생성물인 CD66a-d는 조혈 세포에서 발현되는 것으로 공지되어 있다. 조혈 세포에서의 이들 분자의 발현은 일반적으로 골수성 계통으로 제한된다. 이들 분자는 휴지 성숙 과립구에서 낮은 수준으로 존재하지만, 아마도 저장 과립으로부터의 세포외유출의 결과로서 염증성 효능제를 이용한 활성화 후에 발현이 신속히 증가한다. CD66a는 조직 절편에서 일부 대식세포에서 검출되며, T 세포 및 활성화된 NK 세포의 부분모집단에서 보고되었다.
CD66b((CGM1); CD67, CGM6, NCA-95)는 면역글로불린 상과 및 암배아 항원(CEA)-유사 상과의 구성원인 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-연결된 단백질이다. 과립구 상에서 발현되는 CD66b는 일반적으로 인간 호산구의 부착 및 활성화를 조절하는데 관여한다고 생각된다.
CD90 또는 Thy-1은 본래 흉선세포 항원에서 발견된 단일 V-유사 면역글로불린 도메인을 갖는 25-37 kDa의 과도하게 N-당화된, 글리코포스파티딜이노시톨(GPI) 고정 보존 세포 표면 단백질이다. 이는 면역글로불린 유전자 상과에 속한다. 복합 탄수화물 측쇄는 조직과 종 사이에서 조성이 다양하다. 일반적으로, CD90은 조혈 줄기 세포 및 신경세포에서 발현된다. CD90은 결합 조직 내, 또는 다양한 섬유모세포 및 간질 세포주 상에서 고도로 발현되며, 마우스에서 모든 흉선세포 및 말초 T 세포에서 발현된다. 인간에서, CD90은 적은 수의 태아 흉선세포, 골수에서 혈액 CD34+ 세포의 10%-40%, 및 말초 순환에서 CD3+CD4+ 림프구의 1% 미만에서만 발현된다. CD90은 또한 인간 림프절 HEV 내피에서 발현되나, 다른 내피에서는 발현되지 않으며, 결국에는 제한된 수의 림프모구모양 및 백혈병 세포주에서 발현된다.
CD105(엔도글린(endoglin))는 90-95 kDa의 이황화-연결된 서브유닛으로 구성된 동종이량체 통합 막 당단백질이다. 인간에서, 이는 혈관 내피 세포 및 용어 태반의 융합세포영양막에서 높은 수준으로 발현된다. 인간 심장 발달 동안, 이는 심장 중격형성 및 판막 형성 동안 심내막융기 조직 중간엽에서 높은 수준으로 발현되고; 이후, 발현은 판막이 성숙함에 따라 하락한다. 이는 또한 전적혈모구, 림프성 및 골수성 계통의 백혈병 세포, 및 골수 간질 섬유모세포의 집단에 의해 발현된다. 엔도글린은 TGF-β 상과의 다수의 키나제 수용체 복합체의 부속 단백질이다. 구조적으로 관련된 펩티드의 TGF-β1 상과는 TGF-β 아이소형, β1, β2, β3, 및 β5, 액티빈 및 골 형태형성 단백질(BMP)을 포함한다. TGF-β-유사 인자는 배아형성, 기관형성, 뼈 및 연골과 같은 조직의 형태형성, 혈관 생성, 상처 복구 및 혈관형성, 조혈, 및 면역 조절과 같은 생물학적 과정을 제어하는 보존된 성장 및 분화 인자의 다기능성 세트이다. TGF-β 상과의 리간드에 의한 신호전달은 2개의 아과인 타입 I 및 타입 II로 나뉘는 관련 Ser/Thr 키나제 수용체로 구성된 고 친화성, 리간드-유도, 이종 복합체에 의해 매개된다. 타입 II 수용체는 Gly/Ser-풍부 영역에서 타입 I 수용체를 인산전달시키고, 활성화시킨다. 타입 I 수용체는 차례로 인산화되고, Smad로 명명된 최근에 확인된 다운스트림 표적의 신규한 계열에 신호를 전달한다. 엔도글린은 TGF-β 타입 II 수용체와 회합함으로써 전환 성장 인자(TGF) TGF-β1 및 -β3에 결합하고, 액티빈-A와 상호작용하고, 액티빈 타입 II 수용체인 ActRII 및 ActRIIB를 통해 골 형태형성 단백질(BMP)-7과 상호작용하고, 리간드 결합 타입 I 수용체 ALK3 및 ALK6와 상호작용함으로써 BMP-2에 결합한다.
면역글로불린 유전자 상과에 속하는 556개의 아미노산 당단백질인 CD166 항원(ALCAM)은 인간에서 활성화된 백혈구-세포 부착 분자(ALCAM) 유전자에 의해 인코딩된다. 이는 분비 신호 서열, 3개의 Ig-유사 C2-타입 도메인, 2개의 Ig-유사 V-타입 도메인 및 9개의 잠재적 N-연결된 당화 부위를 함유하는 세포외 도메인, 소수성 막횡단 스패닝 도메인 및 공지된 모티프가 없는 32개 아미노산의 세포질 도메인을 함유한다. N-말단 Ig 도메인은 동종친화성 및 CD166-CD6 상호작용 둘 모두에 대한 결합 부위이다. CD166은 세포질 도메인을 통해 액틴 세포골격에 고정되나, 이러한 상호작용과 관련된 수용체는 공지되어 있지 않다. 가용성 CD166은 세포외 도메인의 단백질분해성 절단 또는 대안적 스플라이싱에 의해 생성된다. 이는 중간엽 줄기 세포 및 전구 세포 및 피질 흉선 상피 세포 및 수질 흉선 상피 세포, 신경세포, 활성화된 T 세포, B 세포, 단핵구, 섬유모세포, 내피, 상피, 다능성 줄기 세포를 포함하는 조혈 세포의 원시 서브셋, 주머니배 및 자궁내막에서 발현된다.
TR2, 헤르페스바이러스 진입 매개체 A(HVEMA), 종양 괴사 인자 수용체 상과, 구성원 14, TNFRSF14, 종양 괴사 인자 수용체 유사 2로도 공지된 CD270은 약 30 kD의 예측 분자량을 갖는 2개의 TNF 수용체 도메인을 함유하는 타입 I 막횡단 단백질이다. HVEM은 혈관, 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 전립선, 비장, 흉선 및 다른 기관에서 광범위하게 발현된다. 휴지 T 세포 및 나이브 및 기억 B 세포는 높은 수준의 HVEM을 또한 발현한다. 인간에서, HVEM은 배중심 B 세포에서 발현되지 않는다. 미성숙 수지상 세포는 성숙시에 하향조절되는 높은 수준의 HVEM을 발현한다. 시험관 내에서, 이는 TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF5, B 및 T 림프구 관련 단백질(BTLA), 및 에스트로겐 수용체 알파와 직접 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. [http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd270-hvem-tr2-antibody-3873.html]
본원에서 사용되는 용어 "CXCR-4"는 G-단백질 결합 케모카인 수용체를 나타낸다. G-단백질-결합 CXCR4에 결합하는 알파-케모카인인 간질-유래 인자-1(SDF-1)은 줄기/전구 세포 트래피킹(trafficking)의 조절에서 중요한 역할을 한다.
용어 "세포"는 살아 있는 유기체이 구조적 및 기능적 단위를 나타내기 위해 본원에서 사용되며, 생체로 분류되는 유기체의 가장 작은 단위이다.
본원에서 사용되는 용어 "케모카인"은 백혈구가 특정 방향으로 이동하도록 신호하는 화학쏠림 사이토카인의 부류를 나타낸다.
용어 "화학주성" 또는 "화학쏠림"은 매력적이라고 판단되는 환경 조건을 향하고/향하거나 혐오감을 갖는 주위로부터 멀어지는 화학 농도 구배를 따른 운동성이 있는 세포 또는 부분의 지시된 이동을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "클론원성" 및 이의 다른 문법적 형태는 자가-재생을 통해 세포의 집락을 생성하는 단일 줄기 세포의 특성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "성분"은 구성 부분, 요소 또는 성분을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "연결 펩티드" 또는 "C-펩티드"는 프로인슐린 분자에서 인슐린의 A-사슬을 이의 B-사슬에 연결시키는 짧은 31개 아미노산의 폴리펩티드를 나타낸다. 이는 당뇨병과 같은 자가면역 질환에서 마커로 사용된다. 증가된 수준은 이들이 등몰량으로 방출됨에 따라 인슐린 방출에 대한 지표이며, 환자에 대한 더 나은 결과이다. 매우 낮은 C-펩티드는 타입 1 당뇨병 및 인슐린 의존성을 확인하며, 높은 글루코스 변동성, 글루코스 항상성의 결여 및 불량한 결과를 갖는 증가된 합병증과 관련된다. C-펩티드 수준의 측정은 적절한 β-세포 기능의 평가에 의해 임상적으로 검증된다[Wahren J. et al., "The clinical potential of C-peptide in replacement in type 1 diabetes", Diabetes, Vol. 61(4), 761-772, (2012)].
본원에서 사용되는 용어 "접촉" 및 이의 다양한 문법적 형태는 닿거나 즉각적 또는 국소적 근접 상태 또는 조건을 나타낸다. 조성물을 표적 목적지에 접촉시키는 것은 당업자에게 공지된 임의의 투여 방법에 의해 발생할 수 있다.
용어 "제대혈-유래 줄기 세포(CB-SC)" 및 "제대혈 단핵 세포(CBMC)"는 용어 "제대혈 단핵 줄기 세포"와 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "사이토카인"은 다른 세포에 대한 다양한 효과를 갖는 세포에 의해 분비되는 작은 가용성 단백질 물질을 나타낸다. 사이토카인은 성장, 발달, 상처 치유, 및 면역 반응을 포함하는 많은 중요한 생리학적 기능을 매개한다. 이들은 세포막에 위치된 이의 세포-특이적 수용체에 결합함으로써 작용하며, 이는 세포에서 별개의 신호전달 캐스케이드를 시작하도록 하며, 이는 결국에는 표적 세포에서 생화학적 및 표현형적 변화를 발생시킬 것이다. 일반적으로, 사이토카인은 국소적으로 작용한다. 이들은 많은 인터루킨 뿐만 아니라 여러 조혈 성장 인자를 포함하는 타입 I 사이토카인; 인터페론 및 인터루킨-10을 포함하는 타입 II 사이토카인; TNFα 및 림프독소를 포함하는 종양 괴사 인자("TNF")-관련 분자; 인터루킨 1("IL-1")을 포함하는 면역글로불린 상과 구성원; 및 다양한 면역 및 염증 기능에서 결정적인 역할을 하는 분자의 계열인 케모카인을 포함한다. 동일한 사이토카인은 세포 상태에 따라 세포에 대한 상이한 효과를 가질 수 있다. 사이토카인은 종종 다른 사이토카인의 발현을 조절하고, 이의 캐스케이드를 촉발시킨다. 사이토카인의 비제한적인 예는, 예를 들어, IL-1.알파., IL-.베타., IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12/IL-23 P40, IL13, IL-17, IL-18, TGF-베타., IFN-감마., GM-CSF, Gro.알파., MCP-1 및 TNF-알파를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "유래된"은 기원으로부터 무엇인가를 수신하거나, 획득하거나, 변형시키기 위한 임의의 방법을 포함한다. 예를 들어, 혈소판-유사 분획으로부터의 혈소판-유사 세포는 제대혈로부터 유래될 수 있고, 이는 혈소판-유사 세포가 제대혈로부터 직접적 또는 간접적으로 유래되는 것을 의미한다. 또 다른 예로서, 전체 혈소판-유사 세포, 용해된 혈소판-유사 세포, 엑소솜, 미세입자, 핵산, 성장 인자 등을 포함하는 혈소판-유사 세포의 성분은 제대혈로부터 유래될 수 있고, 이는 상기 성분 각각이 제대혈로부터 직접적 또는 간접적으로 유래될 수 있음을 의미한다. 또 다른 예로서, 용해된 혈소판-유사 세포는 전체 혈소판-유사 세포로부터 유래될 수 있고, 이는 용해된 혈소판-유사 세포가 전체 혈소판-유사 세포로부터 직접적 또는 간접적으로 유래될 수 있음을 의미한다.
용어 "검출 가능한 마커"는 선택 가능한 마커 및 검정 마커 둘 모두를 포함한다. 용어 "선택 가능한 마커"는 발현 작제물로 형질전환된 세포가 선택되거나 스크리닝될 수 있는 다양한 유전자 생성물을 나타내며, 약물-내성 마커, 형광-활성화 세포 분류에 유용한 항원 마커, 선택적 부착을 가능하게 하는 부착 리간드에 대한 수용체와 같은 부착 마커 등을 포함한다.
용어 "검출 가능한 반응"은 검출 시약과 함께 또는 검출 시약 없이 수행될 수 있는 검정에서 검출될 수 있는 임의의 신호 또는 반응을 나타낸다. 검출 가능한 반응은 방사성 붕괴 및 에너지(예를 들어, 형광, 자외선, 적외선, 가시광선) 방출, 흡수, 편광, 형광, 인광, 투과, 반사 또는 공명 전달을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 검출 가능한 반응은 또한 크로마토그래피 이동도, 혼탁도, 전기영동 이동도, 질량 스펙트럼, 자외선 스펙트럼, 적외선 스펙트럼, 핵 자기 공명 스펙트럼 및 x-선 회절을 포함한다. 대안적으로, 검출 가능한 반응은 융점, 밀도, 전도도, 표면 음향 파, 촉매 활성 또는 원소 조성과 같은 생물학적 물질의 하나 이상의 특성을 측정하기 위한 검정의 결과일 수 있다. "검출 시약"은 관심 물질의 존재 또는 부재를 나타내는 검출 가능한 반응을 발생시키는 임의의 분자이다. 검출 시약은 항체, 핵산 서열 및 효소와 같은 다양한 분자 중 임의의 것을 포함한다. 검출을 촉진하기 위해, 검출 시약은 마커를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "차별적 표지"는 일반적으로 단일 세포 또는 유기체의 구조, 성분 또는 단백질을 특성규명하거나 대비시키는데 사용되는 염색, 염료, 마커, 또는 항체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "분화"는 더욱 특화된 기능을 동반하는, 세포 또는 조직의 구성 또는 복잡성의 수준에서의 증가를 갖는 발달 과정을 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "분화 유도인자"는 세포 분화 과정의 직접적 또는 간접적 원인 물질인 화합물을 나타낸다. "분화 유도인자"는 분화를 야기시키기에는 충분하나, 분화에 필수적인 것은 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "농축"은, 예를 들어, 세포 집단에서의 이의 자연 빈도에 비해 세포의 서브타입의 상대적 빈도를 증가시키기 위해 원하는 물질의 비율을 증가시키는 것을 나타낸다. 양성 선택, 음성 선택, 또는 둘 모두는 일반적으로 임의의 농축 방식에 필요한 것으로 간주된다. 선택 방법은 자기적 분리 및 FACS를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 농축에 사용되는 특정 기술과 관계 없이, 선택 방법에 사용되는 특정 마커는 중요한데, 이는 발달 단계 및 활성화-특이적 반응이 세포의 항원성 프로파일을 변화시킬 수 있기 때문이다. 일부 구현예에 따르면, 음성 자기 선택은 항체에 의해 표지된 세포 집단과 항체 태그에 결합하는 상자성 입자의 현탁액을 혼합함으로써 달성될 수 있다. 이후, 자기장의 적용은 표지되지 않은 세포로부터 비드-세포 응집물을 분리시킬 것이며, 이는 흡인에 의해 수집될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 양성 자기 선택은 관심 세포를 공지된 세포 마커에 특이적인 항체-표지된-자기 입자로 표지함으로써 달성될 수 있으며; 일반적으로, 선택된 세포의 생물학에 대한 항체-입자 복합체의 잠재적 효과를 최소화시키는데 작은 입자(예를 들어, 50 nm)가 사용된다. (Spangrude, Gerald J. and Slayton, William B, "Isolation and Characterization of Hematopoietic Stem Cells," Handbook of Stem Cells, , Vol. 2, Robert Paul Lanza, Ed. Elsevier Inc. (2004) Chapter 54, pages 610-11). 예를 들어, 상업적 자기 양성 선택 시스템은 유도에 의해 자기장이 도입되는 섬유성 금속으로 패킹된 유동 컬럼을 이용하며, 이는 표지된 세포와 자기화된 컬럼 매트릭스 사이에 짧은 거리를 갖는 높은-플럭스 자기장을 생성시킨다. 이는 컬럼 내에 표지된 세포의 보유를 발생시킨다. 표지되지 않은 세포가 컬럼을 통해 통과하고 세척되면, 컬럼은 자기장에서 분리되고, 선택된 세포가 수집된다. 일부 구현예에 따르면, FACS 분리는 다양한 표면 마커에 대한 양성 및 음성 선택의 동시 적용을 가능하게 한다. 일부 구현예에 따르면, FACS에 의한 양성 및 음성 선택은 동일한 조합의 항체를 이용하여 자기 선택을 대체함으로써 변형될 수 있다. 상기 일부 구현예에 따르면, 컨쥬게이션되지 않은 일차 항체는 음성 선택을 위해 이차 면역글로불린에 컨쥬게이션된 자기 비드와 조합하여 사용되며; 양성 선택을 위해, 비오티닐화된 항체를 이용한 아비딘-비오틴 시스템 후 아비딘-컨쥬게이션된 마이크로비드가 사용될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 샘플의 세포충실성을 감소시키기 위해 FACS 분류 전에 음성 선택이 이용될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 양성 선택에 적용되는 샘플은 이후 FACS에 의해 특정 세포 서브셋을 분리시키기 위해 처리될 수 있다. FACS 전의 표적 집단의 사전 농축은 분리된 세포 집단의 최종 순도에 유의한 영향을 미칠 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "인자"는 화학적 또는 물리적 효과를 갖는 비생물 성분을 나타낸다. 예를 들어, "주변분비 인자"는 조직에서 또 다른 세포 유형에 작용하는 한 세포 유형으로부터 분비되는 확산성 신호전달 분자이다. "전사 인자"는 특정 DNA 서열에 결합하여 DNA에서 mRNA로의 유전 정보의 전달을 제어하는 단백질이다.
본원에서 사용되는 용어 "단편"은 더 큰 단위의 바람직한 생물학적 활성을 보유하는 더 큰 단위로부터 유래되거나, 절단되거나, 분해된 작은 부분을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "흐름세포측정법"은 세포의 표현형 및 특징을 조사하기 위한 수단을 나타낸다. 이는 세포 또는 입자가 레이저(방사선의 자극된 방출에 의한 광 증폭)/광선을 통해 액체 흐름에서 감지 영역을 통과하여 이동함에 따라 세포 또는 입자를 감지한다. 현미경적 입자의 상대 광-산란 및 색-판별 형광이 측정된다. 세포의 흐름 분석 및 구분은 크기, 입도, 및 세포가 항체 또는 염료의 형태로 형광 분자를 운반하는지의 여부를 기초로 한다. 세포가 레이저 광선을 통과함에 따라, 광은 모든 방향으로 산란되며, 축으로부터 낮은 각도(0.5-10°)에서 전방 방향으로 산란된 광은 구의 반경의 제곱에 비례하므로 세포 또는 입자의 크기에 비례한다. 광은 세포로 진입할 수 있고; 따라서, 90° 광(직각, 측면) 산란은 형광색소-결합 항체로 표지될 수 있거나, 형광 막, 세포질, 또는 핵 염료로 염색될 수 있다. 따라서, 세포 유형, 막 수용체 및 항원의 존재, 막 전위, pH, 효소 활성, 및 DNA 함량이 구분이 촉진될 수 있다. 흐름세포측정기는 각각의 셀에서 여러 측정치를 기록하는 다중파라미터이며; 따라서, 이종성 집단 내의 동종성 부분모집단을 확인하는 것이 가능하다[Marion G. Macey, Flow cytometry: principles and applications, Humana Press, 2007]. 물리적 특징에 있어서 너무 유사한 별개의 세포 집단의 분리가 크기 또는 밀도에 의해 분리되는 것을 가능하게 하는 형광-활성화 세포 분류(FACS)는 차별적으로 발현되는 표면 단백질을 검출하기 위해 형광 태그를 이용하며, 이는 세포의 물리적으로 균일한 집단 사이에서 미세한 구별이 이루어지는 것을 가능하게 한다.
용어 "기능성 동등물" 또는 "기능적으로 동등한"은 유사하거나 동일한 효과 또는 용도를 갖는 물질, 분자, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드를 나타내기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "성장 인자"는 세포-표면 수용체에 결합하여 세포내 신호전달 경로를 촉발시키고, 증식, 분화 또는 다른 세포 반응을 발생시키는 세포외 폴리펩티드 분자를 나타낸다. 성장 인자는 사이토카인 및 호르몬을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "조혈 줄기 세포"(HSC)는 자체적으로 재생할 수 있고, 다양한 특수 세포로 분화할 수 있고, 골수에서 순환 혈액으로 동원될 수 있고, 프로그래밍된 세포 사멸(아폽토시스)를 겪을 수 있는 혈액 또는 골수로부터 분리된 세포를 나타낸다. 기재된 본 발명의 일부 구현예에서, 인간 대상체로부터 유래된 조혈 줄기 세포는 CD34, CD38, HLA-DR, c-kit, CD59, Sca-1, Thy-1, 및/또는 CXCR-4, 또는 이들의 조합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 세포 표면 마커 중 적어도 하나의 유형을 발현한다.
본원에서 사용되는 용어 "분리된"은, 비제한적인 예로, 기계적 분리 또는 선택적 배양과 같은 하나 이상의 분리 방법을 통한 집단으로부터의 세포의 분리를 나타낸다. 세포의 "분리된" 집단은 순수할 필요는 없다. 다른 세포 유형이 존재할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 특정 세포 유형의 분리된 집단은 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과로 순수한 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "표지화"는 추적 가능한 성분을 도입시킴으로써 화합물, 구조, 단백질, 펩티드, 항체, 세포 또는 세포 성분을 구별하는 방법을 나타낸다. 일반적인 추적 가능한 성분은 형광 항체, 형광단, 염료 또는 형광 염료, 염색 또는 형광 염색, 마커, 형광 마커, 화학적 염색, 차별 염색, 차별 표지, 및 방사성동위원소를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "불안정한"은 분해의 증가를 나타낸다.
용어 "마커" 또는 "세포 표면 마커"는 특정 유형의 세포의 표면에서 발견되는 항원 결정기 또는 에피토프를 나타내기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 세포 표면 마커는 세포 유형의 특성규명, 이의 확인, 및 결국에는 이의 분리를 촉진할 수 있다. 세포 분류 기술은 세포 표면 마커(들)가 세포 집단으로부터의 양성 선택 또는 음성 선택, 즉, 포함 또는 배제를 위해 사용될 수 있는 세포 생체마커를 기초로 한다.
용어 "기질"은 무엇인가가 함유되어 있거나 엠베딩되어 있는 주위 물질을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "기계적 진탕"은 조직이 기계적 수단을 통해 물리적으로 흔들리거나 휘저어지는 방법을 나타낸다. 상기 기계적 수단은 혼합기 또는 다른 기계적 장치를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "중간엽 줄기 세포(MSC)"는 다양한 조직에서 발견되는 비-혈액 성체 줄기 세포를 나타낸다. 이들은 최소 3개의 계통(골형성, 연골발생 및 지방생성) 사이에서 구별하기 위해 이의 형태학적인 방추체-형태; 이의 세포 표면 상에서의 특정 마커의 발현; 및 적절한 조건 하에서의 이의 능력에 의해 특성규명된다. 뼈 또는 연골을 언급하는 경우, MSC는 일반적으로 골연골형성, 골형성, 또는 연골형성으로 공지되어 있는데, 이는 단일 MSC가 배지에 따라 연골세포 또는 골모세포로 분화하는 능력을 나타내기 때문이다.
MSC는 인터루킨 6, 7, 8, 11, 12, 14, 및 15, M-CSF, Flt-3 리간드, SCF, LIF, bFGF, VEGF, PlGF 및 MCP1을 포함하는 많은 생물학적으로 중요한 분자를 분비한다(Majumdar, et al., J. Cell Physiol. 176: 57-66 (1998), Kinnaird et al, Circulation 109: 1543-49 (2004)). 2004년에는, MSC 표현형의 다양한 문서화로부터의 일치의 결여로 인해 MSC를 명확하기 확인하는 단일 마커가 아직 확인되지 않은 것으로 보고되었었다. 문헌[Baksh, et al., J. Cell. Mol. Med. 8(3): 301-16, 305 (2004)]. MSC에는 전형적인 조혈 항원, 즉, CD14, CD34, 및 CD45가 결여되어 있다는 일반적인 동의가 존재한다. (Id.; citing Pittenger, M.F. et al., Science 284: 143-47 (1999)).
본원에서 사용되는 용어 "다중계통 분화 능력"은 상이한 유형의 성숙 자손을 발생시키는 단일 줄기 세포의 특성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "다능성"은 다수의 세포 계통으로 분화할 수 있으나, 3개의 배아층으로부터 유래된 모든 계통으로는 분화할 수 없는 중간엽 줄기 세포 및 여러 다른 성체 줄기 세포와 같은 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "확장되지 않은"은 세포 집단에서 세포의 수를 증가시키기 위해 (시험관 내에서) 배양되지 않은 세포 집단을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "혈소판 유래 성장 인자"(PDGF)는 결합 조직 세포 및 특정한 다른 세포 유형에 대한 주요 미토겐을 나타낸다. 이는 동종이량체 및 이종이량체로 조합되는 이황화-결합된 구조적으로 유사한 A 및 B-폴리펩티드 사슬로 구성된 이량체 분자이다. PDGF 아이소형은 2개의 구조적으로 관련된 단백질 티로신 키나제 수용체인 α-수용체 및 β-수용체에 결합하여 이를 활성화시킴으로써 이의 세포 효과를 발휘한다. PDGF 수용체의 활성화는 세포 성장의 자극을 발생시키나, 또한 세포 형태 및 운동성도 변화시키며; PDGF는 액틴 필라멘트 시스템의 재구성을 유도하고, 화학주성, 즉, PDGF의 구배를 향한 지향성 세포 운동을 자극한다. 생체 내에서, PDGF는 배아 발달 동안 그리고 상처 치유 동안 역할을 한다.
본원에서 사용되는 용어 "혈액의 혈소판 풍부 분획" 또는 "혈소판 풍부 혈액 분획" 또는 "혈소판 풍부 분획"은 혈소판이 분획 내의 세포의 전체 수의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%를 차지하는 혈액의 하나 이상의 성분을 분리시키는 분획화 방법을 통해 획득된 인간 또는 동물 혈액의 분획을 나타낸다. 혈액의 혈소판 풍부 분획은 혈청, 단핵 세포, 예를 들어, 전구 세포, 과립구, 적혈구, 미세입자, 엑소솜, 단백질(예를 들어, 성장 인자, 전사 인자), 지질, 및 핵산을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 혈액의 다른 성분을 포함할 수 있다. 혈액의 혈소판 풍부 분획은 혈소판 풍부 분획에 존재하는 혈액의 하나 이상의 성분을 분리시키거나 제거하기 위해 추가로 가공될 수 있다. 비제한적인 예로서, 일부 구현예에 따르면, 혈액의 혈소판 풍부 분획은 Ficoll-Paque 구배 분리를 통해 획득될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 혈액의 Ficoll-Paque 분리된 분획은 혈장 분획, 단핵 세포 분획, Ficoll-Paque 매질 분획, 및 과립구/적혈구 분획을 (위에서 아래로) 포함할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 혈액의 Ficoll-Paque 분리된 혈소판 풍부 분획은 혈장 분획 및 단핵 세포 분획 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 제대혈로부터의 혈소판-풍부 분획은 제대혈 혈소판-유사 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "혈소판-유사 세포"는 혈소판 기능(예를 들어, 부착, 활성화, 응집)이 가능한 Ficoll-Paque 구배의 혈소판-풍부 분획 내의 세포, 또는 하나 이상의 혈소판 마커, 혈소판 성장 인자, 또는 혈소판 핵산을 포함하는 세포를 나타낸다. 이러한 정의의 목적상, 혈소판-유사 세포는 세포 전구체 및 하나 이상의 엑소솜 또는 미세입자를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "다능성"은 3개의 배아층의 모든 세포로 발달하여 신체 기관, 신경계, 피부, 근육 및 골격을 형성하는 능력을 나타낸다. 예로는 주머니배, 배아 줄기 세포, 및 재프로그래밍된 세포, 예를 들어, iPS 세포의 내부 세포 집단을 포함한다.
본원에서 사용되는 "전구 세포"는 단지 분화할 수 있으나, 더 이상 자체적으로 재생할 수 없는 줄기 세포의 초기 자손을 나타낸다. 전구 세포는 성숙한 표현형으로 성숙하는 전구 세포로 성숙한다. 조혈 전구 세포는 집락-형성 단위(CFU) 또는 집락-형성 세포(CFC)로 언급된다. 전구 세포의 특정 계통은, 비제한적인 예로, CFU-E(적혈구), CFU-F(섬유모세포), CFU-GM(과립구/대식세포), 및 CFU-GEMM(다능성 조혈 전구체)와 같은 접미사로 표시된다. 혈소판 계통의 예는 골수성 공통전구세포(CMP), 거대핵세포/적혈구 전구체(MEP), 거대핵세포-적혈구 전구체(MegE), 및 거대핵세포 계통-위임된 전구체(MKP)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "증식하다"는 임의의 방법에 의해 수, 양 또는 정도가 재생하거나, 증식하거나, 증가하는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "정제"는 외래, 외인성, 또는 불쾌한 요소를 분리시키거나 유리시키는 방법을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "자가-재생"은 모 세포와 동일한 특성을 갖는 줄기 세포의 광범위한 증식 및 생성에 대한 능력을 나타낸다.
용어 "줄기 세포"는 다-계통 분화가 가능한 자가-재생 및 클론원성 특성과 함께 높은 증식 잠재성을 갖는 미분화된 세포를 나타낸다. 줄기 세포는 2개의 특징에 의해 다른 세포 유형과 구별된다. 첫째로, 이들은 때때로 장기간의 비활성 후에 세포 분열을 통해 스스로를 재행할 수 있는 미분화된 세포이다. 둘째로, 특정한 생리학적 또는 실험 조건하에서, 이들은 특수 기능을 가진 조직- 또는 기관-특이적 세포가 되도록 유도될 수 있다. 장 및 골수와 같은 일부 기관에서, 줄기 세포는 정기적으로 분열하여 마모되거나 손상된 조직을 복구하고 대체한다. 그러나, 췌장 및 심장과 같은 다른 기관에서, 줄기 세포는 특수한 조건하에서만 분열한다.
본원에서 사용되는 용어 "전능성"은 태아 및 태반의 영양막을 형성할 수 있는 줄기 세포를 나타낸다.
용어 "전환 성장 인자 베타(TGFβ) 신호전달 경로"는 세포 성장, 세포 분화, 아폽토시스, 세포 항상성 및 다른 세포 기능을 포함하는 성체 유기체 및 발달하는 배아 둘 모두에서 많은 세포 과정에 관여하는 신호전달 경로를 나타내기 위해 본원에서 사용된다. TGFβ 상과 리간드는 타입 II 수용체에 결합하며, 이는 타입 I 수용체를 모집하고 인산화시킨다. 이후, 타입 I 수용체는 수용체-조절 SMAD(R-SMAD)를 인산화시키며, 이는 이제 coSMAD SMAD4를 결합시킬 수 있다. R-SMAD/coSMAD 복합체는 핵에 축적되고, 여기서 이들은 전사 인자로 작용하고, 표적 유전자 발현의 조절에 관여한다.
본원에서 사용되는 용어 "단능성"은 오직 하나의 성숙 세포 계통으로 분화할 수 있는 세포를 나타낸다.
성체 단핵 세포를 재프로그래밍하기 위한 방법
일 양태에 따르면, 성체 단핵 세포를 재프로그래밍하기 위한 방법은 하기 단계를 포함한다:
1. 혈소판-풍부 분획을 분리시키기 위해 UC 혈액 세포 또는 성체 말초 혈액 세포를 제공하는 단계.
2. UC 혈액 세포 또는 성체 말초 혈액 세포로부터 혈소판 풍부 분획을 수집하는 단계로서, 혈소판 풍부 분획이 혈소판-유사 세포를 포함하는, 단계.
3. 대상체로부터 말초 혈액을 제공하고, 대상체의 말초 혈액으로부터 단핵 세포 분획을 수집하는 단계.
4. 재프로그래밍에 적합한 세포의 대상체의 단핵 세포 분획과 혈소판-풍부 분획을 접촉시키는 단계.
5. 접촉이 바이오마커에 의해 확인될 수 있는 세포를 재프로그래밍하기에 효과적인 단계.
6. 선택적으로, 재프로그래밍된 성체 단핵 세포를 확장시키는 단계.
일부 구현예에 따르면, 재프로그래밍에 적합한 세포의 단핵 분획은 성체 단핵 세포를 함유한다. 일부 구현예에 따르면, 성체 단핵 세포는 말초 혈액, 골수, 간, 비장, 췌장, 신장, 뇌, 척수, 갑상선, 폐, 위장, 또는 자가면역 질환에 의해 영향을 받을 수 있는 임의의 다른 신체 부분으로부터 분리된다.
일부 구현예에 따르면, UC 혈액 세포 또는 성체 말초 혈액 세포의 수집 단계는 Ficoll-Paque 구배에 의해 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 제대혈 또는 성체 말초 혈액의 혈소판 풍부 분획은 Ficoll-Paque 구배의 분획으로부터 획득된다.
일부 구현예에 따르면, 성체 단핵 세포와 제대혈의 혈소판 풍부 분획의 접촉은 성체 단핵 세포로 제대혈의 혈소판 풍부 분획의 하나 이상의 성분의 전달하는데 효과적이다.
일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 혈소판 풍부 분획의 접촉은 10분 내지 2시간 동안 37℃에서 2mM CaCl2의 존재하에서 수행된다(Baj-Krzyworzeka et al., Platelet derived microparticles stimulate proliferation, survival, adhesion, and chemotaxis of hematopoietic cells, Exp. Hematology 30 (2002) 450-459). 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 10분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 20분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 30분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 40분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 50분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 60분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 70분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 80분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 90분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 100분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 110분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 120분 동안 수행된다.
일부 구현예에 따르면, 접촉은 진탕 없이 37℃에서 세포 현탁액에서 발생한다. 일부 구현예에 따르면, 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획은 접촉 전에 활성화된다. 일부 구현예에 따르면, 접촉은 혈소판의 포식작용에 충분한 시간, 예를 들어, 적어도 10분, 적어도 20분, 적어도 30분, 적어도 40분, 적어도 50분, 적어도 60분 동안 진탕 없이 37℃에서 세포 현탁액에서 발생한다.
일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포의 접촉은 용해된 혈소판 풍부 분획과 접촉된다. 일부 구현예에 따르면, 혈액의 혈소판 풍부 분획은 전체 세포 용해 완충액으로 용해된다. 일부 구현예에 따르면, 혈액의 용해된 혈소판 풍부 분획은 원심분리에 의해 투명화된다.
일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 용해된 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 10분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 용해된 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 20분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 용해된 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 30분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 용해된 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 40분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 용해된 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 50분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 용해된 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 60분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 용해된 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 70분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 용해된 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 80분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 용해된 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 90분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 용해된 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 100분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 용해된 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 110분 동안 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 단핵 세포와 용해된 혈소판 풍부 분획의 접촉은 적어도 120분 동안 수행된다.
일부 구현예에 따르면, 접촉 단계 후, 분리된 단핵 세포는 완충액에서 세척된 후, 배양되어 재프로그래밍된 세포의 전체 수를 확장시킨다.
일부 구현예에 따르면, 성체 단핵 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 시험관 내에서 분리된 성체 PBMC와 제대혈의 혈소판 풍부 분획을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, PBMC 및 제대혈의 혈소판 풍부 분획은 유전적으로 별개의 개체로부터 유래된다. 일부 구현예에 따르면, PBMC 및 제대혈의 혈소판 풍부 분획은 동일 개체로부터 유래된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 시험관 내에서 분리된 성체 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 제대혈로부터 유래된 혈소판-유사 세포의 농축된 집단을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, PBMC는 PBMC의 표면으로부터 성숙 또는 성체 혈소판을 제거하기 위해 접촉 전에 트립신/EDTA로 처리된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 시험관 내에서 성체 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 혈액의 혈소판 풍부 분획의 용해질을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 말초 혈액 단핵 세포는 혈액의 혈소판 풍부 분획으로부터 유래된 전체 세포 용해질과 접촉된다. 일부 구현예에 따르면, 혈액의 혈소판 풍부 분획의 용해질은 미토콘드리아 및 알파 과립 함유물을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 접촉은 PBMC와 혈액의 혈소판 풍부 분획의 용해질의 성분 중 하나 이상을 융합시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 성체 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 혈소판-풍부 분획으로부터 유래된 미세입자 및 엑소솜 중 하나 이상을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 미세입자 및 엑소솜은 제대혈의 혈소판 풍부 분획으로부터 유래된다. 일부 구현예에 따르면, 미세입자 및 엑소솜은 배아 줄기 세포 유사 mRNA 및 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 미세입자 및/또는 엑소솜은 성장 인자, 예를 들어, VEGF, bFGF, PDGF, TGF-베타1; 면역 반응 인자, 예를 들어, CD40L(CD154); 케모카인/사이토카인, 예를 들어, Rantes(CCL5), CCL23, CXCL7, CXCR4, PF-4(CXCL4), TNF-RI-II, IL-1베타, CX3CR1, 및 베타-트롬보글로불린; 보체 단백질, 예를 들어, CD55, CD59, C5b-9, C1q, C3B, C1-INH, 인자 H; 아폽토시스 마커, 예를 들어, Caspace-3, Caspace-9, FasR(CD95); 응고 인자, 예를 들어, Fva, FVIII, TFPI, TF, PAR-1, FXIIIA; 활성 효소, 예를 들어, PDI, 12-LO, NADPH 산화효소, iNOS2, 헤파나제(Heparnase); 부착 단백질, 예를 들어, 알파-Iib/베타3(CD41/CD61), GPIb(CD42b), GPIX(CD42a), P-셀렉틴(CD62P), PECAM-1(CD31), GPIIIb(CD36), CD49, CD29, CD47, CD9, JAM-A, vWF, 섬유소원, 트롬보스폰딘, 비트로넥틴; 생활성 지질, 예를 들어, PS, AA, LPA, TXA2; 다른 달리 분류되지 않은 마커, 예를 들어, Peta-3(CD151), CD63, PPAR-감마, TIMP3, Lactadherin, PAI-1, PrPC, 베타2GPI 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 성체 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 혈소판-유사 세포의 알파 과립을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 알파 과립은 제대혈의 혈소판 풍부 분획으로부터 획득된다.
일부 구현예에 따르면, 인간 혈액의 혈소판 풍부 분획은 혈소판, 혈소판 유사 세포 또는 줄기 세포와 관련된 다른 성분을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 인간 혈액의 혈소판 풍부 분획은 유도된 다능성 줄기 세포 재프로그래밍의 기초가 되는 신호전달 경로와 관련된 세포 신호전달 분자를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 인간 혈액의 혈소판 풍부 분획은 배아 줄기 세포 마커를 포함하는 혈소판-유사 세포를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 인간 혈액의 혈소판 풍부 분획은 전사 인자 OCT3/4 및 SOX2를 포함한다(도 1a 및 1b). 일부 구현예에 따르면, 인간 혈액의 혈소판 풍부 분획은 단백질 OCT3/4, SOX2, NANOG, CRIPTO, GATA-4, 및 C-myc 중 하나 이상을 포함한다(도 1c). 일부 구현예에 따르면, 인간 혈액의 혈소판 분획은 단백질 OCT3/4, SOX2, NANOG, 및 C-myc 중 하나 이상을 포함한다(도 1d, 1e, 및 1f 참조).
일부 구현예에 따르면, PBMC는 마커 CD14, CD66, CD4, CD8, CD19, CD56, CD41b, 및 CD42a 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 혈액의 혈소판 풍부 분획을 접촉시켜 단핵구 및 대식세포를 더욱 줄기-유사 상태로 재프로그래밍하는 것을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, PBMC는 혈액의 혈소판 풍부 분획과 접촉되어 단핵구 및 대식세포를 말초 혈액 인슐린 생성 세포(PB-IPC)로 재프로그래밍한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 PBMC를 혈액의 혈소판 풍부 분획과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 전사 인자 및 핵산 중 하나 이상이 혈소판 풍부 분획으로부터 단핵 세포로 전달된다. 일부 구현예에 따르면, 혈소판 풍부 분획으로부터의 혈소판-유사 세포는 PBMC와 융합되어 혈소판으로부터 PBMC로 전사 인자 및 핵산을 전달한다. 일부 구현예에 따르면, 혈소판 풍부 분획으로부터의 미세입자는 단핵 세포와 융합되어 PBMC로 전사 인자 및 핵산 중 하나 이상을 전달한다. 일부 구현예에 따르면, 혈소판 풍부 분획으로부터의 엑소솜은 PBMC와 조합되어 전사 인자 또는 핵산 중 하나 이상을 전달한다.
일부 구현예에 따르면, PBMC는 테트라스패닌(tetraspanin) CD9, 백혈구 공통 항원 CD45, 및 줄기 세포 인자 수용체 CD117 중 하나 이상을 나타내도록 혈액의 혈소판 풍부 분획과 접촉시킴으로써 재프로그래밍된다.
혈소판 풍부 분획과 접촉된 PB-IPC
일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 말초 혈액 인슐린-생성 세포(PB-IPCs)와 혈소판-풍부 세포 분획을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 분리된 PB-IPC는 소수성 표면을 갖는 용기 내에서 PBMC를 배양함으로써 유래된다. 일부 구현예에 따르면, PB-IPC는 성인 인간 말초 혈액의 샘플을 제공하고; 샘플로부터 적혈구를 제거하여 단핵 세포를 획득하고; 순수 양성 전하를 갖는 소수성 표면 상에서 단핵 세포를 배양하고, 표면에 부착되는 세포 집단을 획득함으로써 획득될 수 있다(Zhou Y. et al., US Pat. No. 8,835,163, 전체내용이 참조로서 본원에 포함됨).
일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 PBMC로부터 분리된 PB-IPC와 제대혈의 혈소판 풍부 분획을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 PBMC로부터 분리된 PB-IPC와 제대혈의 혈소판 풍부 분획으로부터 획득된 미세입자 및 엑소솜 중 하나 이상을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 PBMC로부터 분리된 PB-IPC와 성체 말초 혈액으로부터 획득된 미세입자 및 엑소솜 중 하나 이상을 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 말초 혈액 인슐린 생성 세포(PB-IPC)와 혈액의 혈소판 풍부 분획을 접촉시켜 인슐린 생성을 위한 잠재성을 향상시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, PB-IPC는 조혈 마커 CD9, CD45, 및 CD117과 함께 OCT-4 및 NANOG를 포함하는 배아 줄기 세포-관련 전사 인자를 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, PB-IPC는 조혈 줄기 세포 마커 CD34 뿐만 아니라 림프구 및 단핵구/대식세포 마커의 발현이 결여되어 있다. 일부 구현예에 따르면, PB-IPC는 베타-세포 특이적 인슐린 유전자 전사 인자 및 프로호르몬 전환효소의 발현, 인슐린의 생성, 및 인슐린 과립의 형성을 포함하는 섬 베타-세포 전구체의 특징을 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, PB-IPC는 고혈당증을 감소시키고, 당뇨병 마우스로 이식 후 췌장 섬으로 이동하는 능력을 갖는다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명은 PB-IPC의 인슐린-생성 특징을 향상시키고, 제대혈의 혈소판 풍부 분획 또는 성체 혈액의 혈소판 풍부 분획과 성체 혈액으로부터의 PB-IPC를 접촉시킴으로서 고혈당증을 감소시키고 췌장 섬으로 이동하는 능력을 개선시키는 방법을 개시한다. 일부 구현예에 따르면, PB-IPC는 전체 제대혈 또는 전체 성체 혈액으로부터 직접 획득된다. 일부 구현예에 따르면, PB-IPC는 소수성 조직 배양 표면 상에서 단핵 세포를 배양함으로써 전체 혈액으로부터 분리된다. 일부 구현예에 따르면, PB-IPC는 혈액의 혈소판 풍부 분획과 접촉되며, 여기서 전사 인자 및 핵산 중 하나 이상이 혈소판 풍부 분획으로부터 PB-IPC로 전달된다. 일부 구현예에 따르면, 혈소판 풍부 분획으로부터의 혈소판-유사 세포는 PB-IPC와 융합되어 혈소판-유사 세포로부터 PB-IPC로 전사 인자 및 핵산을 전달한다. 일부 구현예에 따르면, 혈소판 풍부 분획으로부터의 미세입자는 PB-IPC와 융합되어 PB-IPC로 전사 인자 또는 핵산 중 하나 이상을 전달한다. 일부 구현예에 따르면, 혈소판 풍부 분획으로부터의 엑소솜은 PB-IPC와 조합되어 전사 인자 또는 핵산 중 하나 이상을 전달한다.
일부 구현예에 따르면, 혈소판 풍부 분획과 접촉된 PB-IPC는 췌장 섬으로 이동하고, 인슐린의 기능성 생산자가 되는 향상된 능력을 갖는다. 일부 구현예에 따르면, 혈소판 풍부 분획과 접촉된 PB-IPC는 베타-세포로 분화한다.
접촉의 결과:
일부 구현예에 따르면, PBMC와 인간 혈액의 혈소판 풍부 분획의 접촉은 섬유모세포-유사 대식세포를 생성한다.
일부 구현예에 따르면, PBMC와 혈액의 혈소판 풍부 분획의 접촉은 미분화 세포 및/또는 분화된 세포의 특정 마커에 대한 일정 비율의 세포를 포함하는 세포의 집단을 생성한다. 예를 들어, Oct4와 같은 미분화 세포의 마커, 네스틴(nestin) 및 Ngn-3와 같은 신경전구세포 마커, 및 베타-튜불린 및 TPH2와 같은 성숙 신경세포 마커의 마커에 대한 전사 생성물의 상대 비가 정량 RT-PCR에 의해 평가될 수 있다. 또한, 미분화 세포의 마커의 생성 및 국소화가 면역세포화학에 의해 평가될 수 있다.
미분화 및 분화된 세포의 마커는 특정 마커에 특이적인 항체를 이용하는 항체-기반 검출 기술과 같은 임의의 다양한 방법에 의해 검정된다. 항체-기반 기술은 면역형광 및 면역블로팅을 포함한다. 추가 검정은 특정 마커를 인코딩하는 mRNA의 검출을 위한 검정을 포함한다. 상기 검정은 중합효소 연쇄 반응, 블롯 하이브리드화(노던 블롯으로도 공지됨) 및 인 시츄 하이브리드화를 포함한다. 이들 및 다른 상기 검정의 세부사항은 본원 및 문헌[J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd ed., 2001; F. M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5th ed., 2002; 및 E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988]을 포함하는 표준 참고문헌에 기재되어 있다.
일부 구현예에 따르면, PBMC와 혈액의 혈소판 풍부 분획을 접촉시키는 것은 단핵구, 대식세포, 및 림프구와 같은 PBMC를 포함하는 세포 유형 중 하나 이상의 재프로그래밍을 발생시킨다. 일부 구현예에 따르면, PBMC와 혈액의 혈소판 풍부 분획을 접촉시키는 것은 PBMC를 포함하는 하나 이상의 세포 유형의 기능성 인슐린 생성 세포로의 재프로그래밍을 발생시킨다. 일부 구현예에 따르면, PBMC와 혈액의 혈소판 풍부 분획을 접촉시키는 것은 PBMC를 포함하는 하나 이상의 세포 유형의 기능성 섬 베타-세포로의 재프로그래밍을 발생시킨다.
일부 구현예에 따르면, PBMC와 혈액의 혈소판 풍부 분획을 접촉시키는 것은 PBMC를 포함하는 세포 유형 중 하나 이상을 재프로그래밍하여 대상체로 투여시 제프로그래밍된 세포에 대한 면역 반응을 최소화시키거나 제거한다.
일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포는 줄기-유사, 조혈, 또는 분화된 표현형 특징을 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포는 MafA, Nkx6.1, Pdx-1, Onecut1, NeuroD1, Nkx2.2, 인슐린, 글루카곤, 췌장 폴리펩티드, 소마토스타틴, 그렐린(ghrelin), Sur-1 및 Kir6.2의 췌장 마커 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포는 테트라-스패닌 CD9, 백혈구 공통 항원 CD45, 줄기 세포 인자 수용체 CD117의 배아/조혈 마커 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포는 조혈 줄기 세포 마커 CD34, 림프구 마커 CD3(T 세포) 및 CD20(B 세포) 중 하나 이상의 소량 또는 부재를 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포는 말초 혈액으로부터의 중간엽 계통이 아닌 조혈 계통으로부터 유래된다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 성체 단핵 세포는 단핵구/대식세포 특이적 항원 CD14 및 CD11b/Mac-1의 소량 또는 부재를 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 성체 단핵 세포는 HLA-DR, CD40, 및 CD80의 소량 또는 부재를 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 성체 단핵 세포는 배아 줄기 세포 관련 전사 인자 Oct-4 및 NANOG를 나타낸다.
일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포는 OCT3/4, NANOG, NKX6.1, MAFA, Sur1, Sur2, PDL-1, CD270, Galectin 9의 분자 중 하나 이상을 나타낸다.
일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 성체 혈액 세포는 줄기 세포 마커 Oct-4, Nanog, 및 Sox-2와 함께 다른 배아 줄기(ES) 세포-관련 유전자, 예를 들어, 징크 핑거 및 SCAN 도메인 함유 10(ZNF206, ZSCAN10으로도 명명됨), Zic 계열 구성원 3 헤테로택시(heterotaxy) 1(ZIC3), Zic 계열 구성원 2(ZIC2), 성장 관련 단백질 43(GAP43), PR 도메인 함유 14(PRDM14), 단백질 티로신 포스파타제, 수용체-타입, Z 폴리펩티드 1(PTPRZ1), 포도칼릭신(Podocalyxin)-유사(PODXL), 폴리호메오틱(Polyhomeotic) 동족체 1(PHC1), 및 징크 핑거 단백질 589(ZNF589) 중 하나 이상을 포함하는 배아 줄기 특징을 나타낸다. Oct-4, Nanog, 및 Sox-2에 대한 서열은 각각 GenBank Accession Nos. NM_002701, Z11898 및 Q01860; GenBank Accession Nos. NM_024865 및 NP_079141; 및 GenBank Accession Nos. Z31560 및 CAA83435에서 발견될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포는 CD45+이다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포는 이들이 CD3, CD20(B-림프구 세포-표면 항원 B1, Accession No. M27394), CD11c(인테그린, 알파 X, Accession No. NM_000887), CD11b/Mac-1(보체 성분 3 수용체 3 서브유닛, Accession No. NM_000632) 및 CD14(Accession Nos. NM_001040021 및 P08571) 마커의 항원 마커 중 하나 이상에 대해 음성이라는 점에서 림프구, 수지상 세포, 대식세포 및 단핵구와 표현형적으로 상이하다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포는 이들이 CD34 음성이라는 점에서 조혈 줄기 세포와 표현형적으로 상이하다(조혈 전구 세포 항원 CD34, Accession No. P28906)(Craig et al. 1994, British Journal of Haematology, 88:24-30; Lansdorp, P. A I. and Dragowaka, W. (1992) J. Exp. Med. 175:1501-1509; Sutherland, H. J., et al. (1989), Blood 74.1563-1570)).
일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포는 인슐린 생성 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다른 세포 유형으로 분화할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 인슐린-생성 세포인 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포는 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1) 수용체를 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, GLP-1의 장기 작용 효능제인 엑센딘-4의 투여는 기능적으로 변형된 성체 혈액 단핵 세포의 인슐린 생성 및 세포 분화를 증가시킨다.
일부 구현예에 따르면, 재프로그래밍된 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포는 배양물에서 확장될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 확장된 재프로그래밍된 성체 말초 혈액 단핵 세포는 기능성 췌장 섬 베타-세포로 분화할 수 있는 다능성 줄기 세포의 특징을 갖는 세포를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 재프로그래밍된 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포는 제대 혈소판-유사 세포로부터 유래된 하나 이상의 배아 줄기 세포 마커, 인간 섬 베타-세포 특이적 전사 인자 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 재프로그래밍된 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포는 면역 내성-관련 마커를 발현한다.
제대혈 단핵 세포
일 양태에 따르면, 성체 단핵 세포를 재프로그래밍하기 위한 방법은 하기를 포함한다:
1. 혈소판-풍부 분획을 분리시키기 위해 UC 혈액을 제공하는 단계.
2. UC 혈액 세포로부터 혈소판 풍부 분획을 수집하는 단계로서, 혈소판 풍부 분획이 혈소판-유사 세포 및 단핵 세포 중 하나 이상을 포함하는, 단계.
3. 바이오마커에 의해 확인될 수 있는 재프로그래밍된 단핵 세포를 선택하는 단계.
4. 선택적으로, 재프로그래밍된 성체 단핵 세포를 확장시키는 단계.
일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 제대혈 단핵 세포는 줄기-유사, 조혈, 또는 분화된 표현형 특징을 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 제대혈 단핵 세포는 MafA, Nkx6.1, Pdx-1, Onecut1, NeuroD1, Nkx2.2, 인슐린, 글루카곤, 췌장 폴리펩티드, 소마토스타틴, 그렐린(ghrelin), Sur-1 및 Kir6.2의 췌장 마커 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 제대혈 단핵 세포는 테트라-스패닌 CD9, 백혈구 공통 항원 CD45, 줄기 세포 인자 수용체 CD117의 배아/조혈 마커 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 제대혈 단핵 세포는 조혈 줄기 세포 마커 CD34, 림프구 마커 CD3(T 세포) 및 CD20(B 세포) 중 하나 이상의 소량 또는 부재를 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 제대혈 단핵 세포는 말초 혈액으로부터의 중간엽 계통이 아닌 조혈 계통으로부터 유래된다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 제대혈 단핵 세포는 단핵구/대식세포 특이적 항원 CD14 및 CD11b/Mac-1의 소량 또는 부재를 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 제대혈 단핵 세포는 HLA-DR, CD40, 및 CD80의 소량 또는 부재를 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 제대혈 단핵 세포는 배아 줄기 세포 관련 전사 인자 Oct-4 및 NANOG를 나타낸다.
일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 제대혈 단핵 세포는 OCT3/4, NANOG, NKX6.1, MAFA, Sur1, Sur2, PDL-1, CD270, Galectin 9의 분자 중 하나 이상을 나타낸다.
일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 제대혈 세포는 줄기 세포 마커 Oct-4, Nanog, 및 Sox-2와 함께 다른 배아 줄기(ES) 세포-관련 유전자, 예를 들어, 징크 핑거 및 SCAN 도메인 함유 10(ZNF206, ZSCAN10으로도 명명됨), Zic 계열 구성원 3 헤테로택시(heterotaxy) 1(ZIC3), Zic 계열 구성원 2(ZIC2), 성장 관련 단백질 43(GAP43), PR 도메인 함유 14(PRDM14), 단백질 티로신 포스파타제, 수용체-타입, Z 폴리펩티드 1(PTPRZ1), 포도칼릭신(Podocalyxin)-유사(PODXL), 폴리호메오틱(Polyhomeotic) 동족체 1(PHC1), 및 징크 핑거 단백질 589(ZNF589) 중 하나 이상을 포함하는 배아 줄기 특징을 나타낸다. Oct-4, Nanog, 및 Sox-2에 대한 서열은 각각 GenBank Accession Nos. NM_002701, Z11898 및 Q01860; GenBank Accession Nos. NM_024865 및 NP_079141; 및 GenBank Accession Nos. Z31560 및 CAA83435에서 발견될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 제대혈 단핵 세포는 CD45+이다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 제대혈 단핵 세포는 이들이 CD3, CD20(B-림프구 세포-표면 항원 B1, Accession No. M27394), CD11c(인테그린, 알파 X, Accession No. NM_000887), CD11b/Mac-1(보체 성분 3 수용체 3 서브유닛, Accession No. NM_000632) 및 CD14(Accession Nos. NM_001040021 및 P08571) 마커의 항원 마커 중 하나 이상에 대해 음성이라는 점에서 림프구, 수지상 세포, 대식세포 및 단핵구와 표현형적으로 상이하다. 일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 제대혈 단핵 세포는 이들이 CD34 음성(조혈 전구 세포 항원 CD34, Accession No. P28906)이라는 점에서 조혈 줄기 세포와 표현형적으로 상이하다.
일부 구현예에 따르면, 제대혈의 혈소판 풍부 분획은 혈소판, 혈소판 유사 세포 또는 줄기 세포와 관련된 다른 성분을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 제대혈의 혈소판 풍부 분획은 유도된 다능성 줄기 세포 재프로그래밍의 기초가 되는 신호전달 경로와 관련된 세포 신호전달 분자를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 제대혈의 혈소판 풍부 분획은 배아 줄기 세포 마커를 포함하는 혈소판-유사 세포를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 제대혈의 혈소판 풍부 분획은 전사 인자 OCT3/4 및 SOX2를 포함한다(도 1a 및 1b 참조). 일부 구현예에 따르면, 제대혈의 혈소판 풍부 분획은 단백질 OCT3/4, SOX2, NANOG, CRIPTO, GATA-4, 및 C-myc 중 하나 이상을 포함한다(도 1c 참조). 일부 구현예에 따르면, 제대혈의 혈소판 분획은 단백질 OCT3/4, SOX2, NANOG, 및 C-myc 중 하나 이상을 포함한다(도 1d, 1e, 및 1f 참조).
일부 구현예에 따르면, 제대혈 단핵 세포는 마커 CD14, CD66, CD4, CD8, CD19, CD56, CD41b, 및 CD42a 중 하나 이상을 포함한다.
세포 생성물
또 다른 양태에 따르면, 기재된 본 발명은 기재된 본 발명의 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포를 함유하는 약학적 조성물을 포함하는 세포 생성물을 개시한다.
일부 구현예에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 방법은 당뇨병 포유동물 대상체에 세포 생성물을 투여하는 것을 포함하며, 세포 생성물은 대상체의 췌장에서 기능성 세포의 집단을 증가시키는데 효과적일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 세포 생성물은 대상체의 췌장에서 기능성 β 세포의 집단을 증가시키는데 효과적일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 세포 생성물은 투여 후 대상체의 췌장으로 이동하는데 효과적일 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포를 함유하는 약학적 조성물은 용매를 포함하나 이에 제한되지는 않는 부형제, 담체 또는 비히클과 함께 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "부형제", "담체" 또는 "비히클"은 본원에 기재된 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포 생성물의 제형화 및 투여에 적합한 담체 물질을 나타낸다. 본원에서 유용한 담체 및 비히클은 비독성이고, 다른 성분과 상호작용하지 않는 당 분야에 공지된 임의의 상기 물질을 포함한다. 본원에서 사용되는 어구 "약학적으로 허용되는 담체"는 기재된 본 발명의 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포 생성물이 안정적이고 생체 이용 가능하게 유지되는 기재된 본 발명의 조성물의 제형화 및 투여에 이용 가능한 임의의 실질적으로 비독성의 담체를 나타낸다.
약학적으로 허용되는 담체는 치료되는 포유동물로의 투여에 적합하게 하기에 충분히 높은 순도 및 충분히 낮은 독성을 가져야 한다. 이는 또한 활성제의 안정성 및 생체이용률을 유지시켜야 한다. 약학적으로 허용되는 담체는 액체 또는 고체일 수 있고, 제공된 조성물의 활성제 및 다른 성분과 조합되는 경우 원하는 벌크, 일관성 등을 제공하기 위해 계획된 투여 방식을 염두에 두고 선택된다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 담체는 결합제(예를 들어, 전호화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 등), 충전제(예를 들어, 락토스 및 다른 당, 미정질 셀룰로스, 펙틴, 젤라틴, 칼슘 설페이트, 에틸 셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 칼슘 하이드로겐 포스페이트 등), 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탤크, 실리카, 콜로이드성 실리콘 디옥사이드, 스테아르산, 금속 스테아레이트, 수소화된 식물성 오일, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트 등), 붕해제(예를 들어, 전분, 소듐 전분 글리콜레이트 등), 또는 습윤제(예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트 등)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 기재된 본 발명의 조성물에 대한 다른 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 물, 염 용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 탤크, 실리식산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 담체 용액은 또한 완충액, 희석제 및 다른 적합한 첨가제를 함유할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "완충액"은 화학적 구성이 pH에서의 유의한 변화 없이 산 또는 염기를 중화시키는 용액 또는 액체를 나타낸다. 기재된 본 발명에 의해 구상되는 완충액의 예는 둘베코 인산염 완충 염수(PBS), 링거액, 물 중 5% 덱스트로스(D5W), 및 식염수/생리식염수(0.9% NaCl)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에 따르면, 주입 용액은 대상체 조직에 등장성이다. 일부 구현예에 따르면, 주입 용액은 대상체 조직에 고장성이다. 비경구 투여용인 기재된 본 발명의 조성물은 멸균 수용액, 알콜과 같은 통상적인 용매 중 비-수성 용액, 또는 액체 오일 베이스 중 용액과 같은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
기재된 본 발명의 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포 생성물은 멸균의 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액의 형태로 비경구 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구" 또는 "비경구적"은 주입 기술을 포함하나 이에 제한되지는 않는 주사(즉, 주사에 의한 투여)에 의한 신체 내로의 도입을 나타낸다.
기재된 본 발명의 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포 생성물은 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용액 중의 멸균 용액 또는 현탁액일 수 있다. 용액은 일반적으로 2개 이상의 물질의 균일한 혼합물로 간주되며; 이는 필수적이지는 않지만 종종 액체이다. 용액에서, 용질(또는 용해된 물질)의 분자는 용매의 분자 사이에서 균일하게 분포된다. 현탁액은 미세하게 나누어진 종이 또 다른 종과 조합되는 분산액(혼합물)이며, 전자는 매우 미세하게 나누어져 신속하게 침전되지 않도록 혼합된다. 일상 생활에서, 가장 흔한 현탁액은 액체 물 중 고형물의 현탁액이다. 사용될 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액, 및 등장성 염화나트륨(염수) 용액이 있다. 일부 구현예에 따르면, 고장성 용액이 사용된다. 또한, 용매 또는 현탁 매질로서 멸균 고정유가 통상적으로 사용된다. 비경구 적용을 위해, 적합한 비히클은 용액, 예를 들어, 유성 또는 수성 용액, 뿐만 아니라 현탁액, 에멀젼, 또는 이식물로 구성된다. 수성 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있으며, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함한다.
기재된 본 발명의 추가의 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포 생성물은 당 분야에 공지된 기술, 예를 들어, 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th or 19th editions, published by the Mack Publishing Company of Easton, Pa.]에 기재된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료적으로 효과적인" 또는 "약학적 유효량"은 대상체로의 투여 후 치료 또는 이로운 효과를 발생시키는 본 발명의 조성물의 양을 나타낸다. 조성물의 유효량은 치료되는 생물학적 대상체의 연령 및 신체 상태, 질환의 중증도, 치료 기간, 동반 요법의 특성, 주입 시기, 사용되는 특정 화합물, 조성물 또는 다른 활성 성분, 이용되는 특정 담체, 및 기타 요인에 따라 가변적일 수 있다.
당업자는 이후에 "단위 용량"으로 언급되는 제공된 효과 강도를 유도하는 투여량 단위(사용 단위를 의미함)의 용량을 결정함으로써 본 발명의 조성물의 약학적 유효량을 결정할 수 있다. 용어 "용량-강도 상관관계"는 개별 수용자에서의 효과의 강도가 용량과 관련되는 방식을 나타낸다. 일반적으로 지정되는 효과의 강도는 최대 강도의 50%이다. 해당 용량은 50% 유효 용량 또는 개별 ED50으로 언급된다. 용어 "개별"의 사용은 집단 내 응답 데이터의 빈도로부터 결정된 ED50으로도 약어화되는 중간 유효 용량으로부터 본원에서 사용되는 바와 같은 효과 강도를 기초로 하는 ED50을 구별한다. 본원에서 사용되는 "효능"은 원하는 반응을 달성하기 위한 기재된 본 발명의 조성물의 특성을 나타내며, "최대 효능"은 달성 가능한 최대 효과를 나타낸다. 특정 장애 또는 질환의 치료에서 효과적일 기재된 본 발명의 약학적 조성물 내의 화학주성 조혈 줄기 세포 생성물의 양은 장애 또는 질환의 특성에 좌우될 것이며, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. (예를 들어, 각각이 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Joel G. Harman, Lee E. Limbird, Eds.; McGraw Hill, New York, 2001; THE PHYSICIAN'S DESK REFERENCE, Medical Economics Company, Inc., Oradell, N.J., 1995; 및 DRUG FACTS AND COMPARISONS, FACTS AND COMPARISONS, INC., St. Louis, Mo., 1993]을 참조한다). 기재된 본 발명의 제형에서 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 질병 또는 장애의 심각성에 좌우될 것이며, 개업의의 판단 및 각각의 대상체의 상황에 따라 결정되어야 한다.
일부 구현예에 따르면, 기재된 본 발명의 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포 생성물은 초기에 투여될 수 있고, 이후 추가 투여에 의해 유지될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에 따르면, 기재된 본 발명의 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포 생성물은 한 가지 주사 방법에 의해 투여될 수 있고, 이후 동일한 방법 또는 상이한 방법에 의해 추가로 투여될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 기재된 본 발명의 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포 생성물은 원하는 부위에 전신적으로 직접 주사하거나 약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 대상체에 투여될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 기재된 본 발명의 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포 생성물의 성장 및/또는 분화, 및 기재된 본 발명의 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포 생성물의 치료 효과가 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 당뇨병을 치료하기 위해 투여되는 기재된 본 발명의 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포 생성물은 대상체에서 혈당 및/또는 인슐린 수준을 검사함으로써 모니터링될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 투여 후 기재된 본 발명의 기능적으로 조절되는 성체 혈액 단핵 세포 생성물에 대한 대상체의 면역학적 내성은 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 검사될 수 있다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 달리 명백히 지시되지 않는 한, 상기 범위의 상한과 하한 사이의 하한 단위의 1/10까지의 각각의 사이에 존재하는 값 및 상기 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급되거나 사이에 존재하는 값이 본 발명에 포함되는 것이 이해된다. 언급된 범위 내의 임의의 특별히 배제되는 한계를 조건으로 하여, 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있는 상기 작은 범위의 상한 및 하한이 본 발명에 또한 포함된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 포함된 한계 둘 모두 중 어느 하나를 배제한 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 기재된 본 발명의 실시 또는 시험에서 또한 이용될 수 있으나, 예시적 방법 및 물질이 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용한 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하기 위해 참조로서 본원에 포함된다.
본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함하는 것이 인지되어야 한다.
본원에 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 이들의 개시를 위해서만 제공되며, 각각은 전체내용이 참조로서 포함된다. 본원에서 기재된 본 발명이 종래 발명에 의해 상기 공개에 앞설 자격이 없는 것으로 인정하는 것으로 해석되어선 안된다. 또한, 제공되는 간행물의 날짜는 실제 간행물 날짜와 상이할 수 있으며, 이는 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있다.
실시예
하기 실시예는 기재된 본 발명을 제조하고 사용하기 위한 방법의 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제공되며, 본 발명자가 이들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하거나, 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내고자 함이 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 대한 정확성을 보장하기 위해 노력하였으나, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 지시하지 않는 한, 부(parts)는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.
프로토콜
혈액 분획의 분리
간단히, 항응고제-처리 성체 혈액 또는 제대혈을 PBS/EDTA를 이용하여 1:2 내지 1:4 범위로 희석하여 적혈구의 응집을 감소시킨다. 이후, 희석된 혈액은 혼합 없이 원심분리 튜브 내의 Ficoll-Paque 용액 상에 올린다. 층을 이룬 혈액/Ficoll-Paque는 원심분리기 브레이크를 사용하지 않고 18℃ 내지 20℃ 사이에서 400 x g로 40분 동안 원심분리한다. 이는 위에서부터 아래로 혈장 및 혈소판-유사 세포를 포함하는 제1 분획; 단핵 세포 및 혈소판-유사 세포를 포함하는 제2 분획; Ficoll-Paque 매질을 포함하는 제3 분획; 및 과립구 및 적혈구를 포함하는 제4 분획을 포함하는 혈액 분획의 형성을 발생시킨다.
일부 구현예에 따르면, 분획은 추가로 처리되어 특정 분획 성분을 분리시킨다. 간단히, 단핵 세포를 추가로 처리하기 위해, 단핵 세포 및 혈소판-유사 세포를 포함하는 제2 분획을 파스퇴르 피펫을 이용하여 Ficoll-Paque 구배로부터 조심스럽게 분리시킨다. 이후, 제2 분획을 세척하고, PBS/EDTA로 3회 300 x g, 18℃ 및 20℃에서 원심분리하고, 각각의 라운드 후에 상층액을 폐기한다.
일부 구현예에 따르면, 분획은 추가로 처리되어 혈소판-유사 세포를 분리시킨다. 간단하게, 혈장 및 혈소판-유사 세포를 포함하는 제1 분획을 Ficoll-Paque 구배로부터 분리시킨다. 이후, 1 μM 프로스타글란딘 E1(PGE1)을 갖는 동일 부피의 HEP 완충액을 혈소판 풍부 분획에 첨가하고, 가볍게 혼합한다. 이후, 분획을 브레이크 없이 실온에서 15-20 동안 100 x g에서 원심분리하여 임의의 오염 적혈구 또는 백혈구 세포를 펠렛화시킨다. 이후, 상층액을 새로운 용기로 옮기고, 실온에서 15-20분 동안 800 x g에서 원심분리하였다. 이후, 펠렛화된 혈소판-유사 세포를 재현탁 없이 2회 세척하여 혈소판 활성화를 피한다.
흐름세포측정법
흐름세포측정법 분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Zhao Y. et al., Exp. Cell Res., 312, 2454 (2006)). 간단하게, 트립신/EDTA로 처리되거나 처리되지 않은 채로 남아 있는 세포를 원심분리에 의해 수집하고, PBS에 재현탁시켰다. 세포를 37℃에서 10분 동안 4% 포름알데하이드에서 고정시켰다. 항체로 세포외 염색을 위해, 세포를 투과화시키지 않았다. 세포내 염색을 위해, 세포를 미리 냉각된 세포에 얼음 저온 100% 메탄올을 90% 메탄올의 최종 농도로 첨가하여 투과화시키고, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 완충액 중에서 세포를 먼저 재현탁시키고, 제조업체의 권장된 희석법에 따라 일차 항체를 첨가하여 세포를 면역염색하였다. 세포를 실온에서 1시간 동안 일차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 인큐베이션 완충액으로 3회 세척하였다. 이후, 세포를 실온에서 30분 동안 제조업체의 권장된 희석법으로 컨쥬게이션된 이차 항체와 함께 인큐베이션 완충액에 재현탁시킨 후, 인큐베이션 완충액으로 3회 세척하였다. 이후, 염색된 세포를 흐름세포측정법으로 분석하였다.
표면 및 세포내 마커의 흐름세포측정법 분석을 문헌[Zhao Y, et al., Human cord blood stem cell modulated regulatory T lymphocytes reverse the autoimmune-caused type 1 diabetes in non-obese diabetic (NOD) mice. PLoS ONE 2009, 4: e4226]에 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히, 혈소판을 15분 동안 3000 rpm에서 PBS로 세척하였다. 인간 섬을 반복된 피펫팅과 함께 실온에서 5분 동안 0.25% 트립신/EDTA로 분리시킨 후, PBS에서 세척하였다. 세포를 FITC-컨쥬게이션된 항-CD42a, 항-CD61, 피코에리트린(PE)-컨쥬게이션된 항-CD8β, 항-CXCR4, 항-CCR7 및 피코에리트린-Cy7(PE-Cy7)-컨쥬게이션된 항-CD41, 항-CD56 및 항-CCR7, APC-컨쥬게이션된 항-ICOS, APC-Alexa Fluor 750-컨쥬게이션된 항-CD4 및 항-CD66b, 퍼시픽 블루(PB)-컨쥬게이션된 항-CD38, Krome Orange-컨쥬게이션된 항-CD8α, 항-CD14, 및 항-CD19를 포함하는 마우스 항-인간 모노클로날 항체(mAb; Beckman Coulter, Brea, CA)와 함께 인큐베이션하였다. 다른 항체, 예를 들어, AF647-컨쥬게이션된 항-Foxp3, PerCP-Cy5.5-컨쥬게이션된 마우스 항-인간 PDX-1, Alexa Fluor 488-컨쥬게이션된 마우스 항-인간 소마토스타틴 및 항-PDX-1, PE-컨쥬게이션된 마우스 항-NEUROD1 및 항-글루카곤, 및 항-FOXA2, 및 항-NKX6.1, BV421-컨쥬게이션된 마우스 항-인간 글루카곤, Alexa Fluor 647-컨쥬게이션된 마우스 항-인간 인슐린, 항-인간 C-펩티드, 항-NKX6.1, 항-SOX9, 항-PTFA1, 및 항-NANOG, 및 PerCP-Cy5.5-컨쥬게이션된 마우스 항인간 SOX17 mAb를 BD Biosciences(San Jose, CA)로부터 구입하였다. FITC 컨쥬게이션된 마우스 항-인간 인테그린 β1(CD29), PE-컨쥬게이션된 마우스 항-인간 CD270(HVEM) mAb, 항-TLR4, 항-TLR6 및 항-CXCL10, APC-컨쥬게이션된 항-TGF-β1, 및 APC/Fire 750-컨쥬게이션된 항-CD36 mAb를 Biolegend(San Diego, CA)로부터 구입하였다. 토끼 항-AIRE 폴리클로날 항체를 Abcam(Cambridge, MA)으로부터 구입하였다. FITC 컨쥬게이션된 항-CXCR1 및 항-SOX2, PE-컨쥬게이션된 항-CD274 (PD-L1), 항-CXCR2, 항-CCR3, 항-CCR5, 및 항-섬유결합소, APC-컨쥬게이션된 항-CCL2, eFluor660-컨쥬게이션된 항-Galectin 9, CXCR3, 및 항-CXCL1, PerCP-eFluor710-컨쥬게이션된 항-CCR4, Alexa Fluor 647-컨쥬게이션된 래트 항-인간 Oct 3/4 mAb 및 컨쥬게이션되지 않은 마우스 항-인간 NANOG를 eBioscience(San Diego, CA)로부터 구입하였다. FITC-컨쥬게이션된 항-인간 MAFA ab를 United States Biological(Salem, MA)로부터 구입하였다. DyLight 405-컨쥬게이션된 항-ki67을 Novus Biologicals(Littleton, CO)로부터 구입하였다.
세포를 실온에서 30분 동안 염색한 후, 흐름 분석 전에 PBS로 세척하였다. 동형-매치된 마우스 항-인간 IgG 항체(Beckman Coulter)를 모든 형광물질-컨쥬게이션된 IgG mAb에 대한 음성 대조군으로 사용하였다. 세포내 염색을 위해, 세포를 고정시키고, PerFix-nc 키트(Beckman Coulter)를 이용하여 투과화시켰다. 염색 후, 세포를 수집하고, 최대 10개의 색의 동시 판독을 위한 3개의 레이저(488 nm 청색, 638 적색, 및 405 보라색 레이저)가 장착된 Gallios Flow Cytometer(Beckman Coulter)를 이용하여 분석하였다. 최종 데이터를 Kaluza Flow Cytometry Analysis Software(Beckman Coulter)를 이용하여 분석하였다.
형광 염료를 이용한 혈소판의 미토콘드리아 염색을 위해, 혈소판-분획을 15분 동안 37℃에서 MitoTracker Deep Red FM(100 nM) 또는 MitoTracker Green FM(100 nM)(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)으로 표지한 후, 3000 rpm x 15분에서 PBS로 2회 세척하였다. 혈소판에 의한 미토콘드리아의 방출을 결정하기 위해, MitoTracker Deep Red-표지된 혈소판을 15분 동안 37℃에서 0.5 ml 혈청-비함유 X-VIVO 15 배양 배지(Lonza) 중 혈소판 응집제, 예를 들어, 20 μM ADP, 0.5 mM 아라키돈산(ARA), 및 1 유닛/ml 트롬빈으로 처리하였다. 상기 처리 후, 혈소판을 15분 동안 4℃에서 2.7g에서의 원심분리에 의해 제거하였다. 상층액을 수집하고, 4℃에서 15분 동안 14g에서 재원심분리하여 흐름 분석을 위한 방출된 미토콘드리아를 수확하였다.
면역형광
표준 면역형광 프로토콜을 이용하였다. 간단하게, 부착 세포를 실온에서 15분 동안 따뜻한 PBS에 희석된 4% 포름알데하이드로 고정시켰다. 고정액을 흡인하고, 세포를 각각 5분 동안 PBS로 3회 세척하였다. 세포를 실온에서 60분 동안 차단 완충액으로 차단하였다. 이후, 차단 완충액을 흡인시키고, 제조업체의 설명서에 따라 희석된 일차 항체의 용액을 4℃에서 밤새 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 각각 5분 동안 PBS로 3회 헹구고, 이후 실온에서 1-2시간 동안 제조업체의 설명서에 따라 희석된 형광색소 컨쥬게이션된 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 각각 5분 동안 PBS로 3회 세척하고, 형광 현미경검사로 시각화시켰다.
면역세포화학 및 조직학
당뇨병 환자로부터의 췌장 조직의 파라핀 슬라이드를 BioChain(Newark, CA)으로부터 구입하였다. 면역염색을 문헌[Zhao Y, et al., Identification of stem cells from human umbilical cord blood with embryonic and hematopoietic characteristics. Exp Cell Res 2006, 312: 2454-2464]에 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 비특이적 염색을 차단하기 위해, 절편을 실온에서 20분 동안 2.5% 말 혈청(Vector Laboratories)을 함유하는 완충액 중에서 인큐베이션하였다. 일차 항체는 기니아피그 폴리클로날 항-인슐린 Ab(DakoCytomation, Carpinteria, CA), 혈소판 마커 FITC-컨쥬게이션된 CD42a(Beckman Coulter), 혈소판 α 과립 마커 폰 빌레브란트 인자(vWf) Ab(Sigma), 및 혈소판 치밀 과립 마커 ADP Ab(GenScript, Piscataway, NJ)를 포함하였고, 이차 Ab는 Cy3-컨쥬게이션된 AffiniPure 당나귀 항-기니아피그 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)를 포함하였다. 동형-매치된 대조군을 위해, 마우스 IgG1κ를 BD Biosciences로부터 구입하였고, 기니아피그 혈청을 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입하였다. 모든 실험에 대해, 동형-매치된 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 AxioCam MRc 카메라 및 AxioCam MR Rev 3 소프트웨어가 장착된 ZEISS Imager M1으로 사진을 찍거나, Nikon A1R 공초점 현미경으로 사진을 찍었다.
트랜스웰에서 미토콘드리아를 이용한 처리 후에 췌장 섬의 크기를 비교하기 위해, 섬을 EC500 디지털 카메라가 장착된 Nikon Diaphot으로 사진을 찍었다. 췌장 섬의 크기를 NIH 웹사이트(http://rsbweb.nih.gov/ij/)로부터 다운로드된 Image J 소프트웨어를 이용하여 포인트-카운팅 계측 분석(Meier JJ, et al., Direct evidence of attempted beta cell regeneration in an 89-year-old patient with recent-onset type 1 diabetes. Diabetologia 2006, 49: 1838-1844)에 의해 측정하고 계산하였다.
전자 현미경검사
세포 현탁액을 펠렛화시킨 후, 과량의 부피의 pH 7.0의 인산염 완충액 중 2.5% 글루타르알데하이드에 세포를 재현탁시키고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 고정시켰다. 이후, 세포를 펠렛화시키고, 신선한 고정액을 첨가하였다. 세포를 2-3시간 동안 4℃에서 신선한 고정액 중에서 인큐베이션한 후, 세포 손상을 방지하기 위해 샘플의 오스몰농도로 조정된 인산염 완충액 중에서 세척하였다. 고정 및 세척 후, 4% 저 융점 아가로스를 세포에 첨가하고, 즉시 원심분리하여 세포를 펠렛화시켰다. 이후, 세포 펠렛을 20분 동안 얼음으로 옮겨 아가로스를 고형화시킨 후, 완충액 중에서 가볍게 세척하였다. 이후, 세포를 4℃에서 1-2시간 동안 인산염 완충액 중 1% 오스뮴 테트록사이드로 처리한 후, 증류수 중에서 적어도 5회 세척하였다. 이후, 세포를 어두운 곳에서 4℃에서 2시간 동안 2% 수성 우라닐 아세테이트로 염색하였다. 이후, 세포를 다음과 같은 일련의 아세톤 세척을 통해 탈수시켰다: 15분 동안 30% 아세톤; 15분 동안 50% 아세톤; 15분 동안 70% 아세톤; 15분 동안 90% 아세톤; 30분 동안 100% 아세톤 3회. 이후, 세포를 다음과 같은 일련의 프로필렌 옥사이드 및 수지 혼합물을 통해 엠베딩시켰다: 1시간 동안 2:1의 프로필렌 옥사이드:수지; 1시간 동안 1:1의 프로필렌 옥사이드:수지; 1시간 동안 1:2의 프로필렌 옥사이드:수지; 100% 수지 밤새; 1시간 동안 신선한 100% 수지. 이후, 수지를 60℃-70℃에서 12-24시간 동안 중합시켰다. 이후, 세포 펠렛을 절편으로 절단하고, 전자 현미경검사로 이미지화시켰다.
웨스턴 블로팅
표준 웨스턴 블로팅 프로토콜을 이용하였다. 간단하게, 세포를 저온 용해 완충액으로 용해시키고, 원심분리하여 세포 찌꺼기를 펠렛화하였다. 상층액의 단백질 농도를 단백질 정량 검정(예를 들어, 브래드포드 단백질 검정, Bio-Rad Laboratories)으로 결정하였다. 이후, 용해질 상층액을 동일 부피의 2X SDS 샘플 완충액과 조합하고, 5분 동안 100℃에서 비등시켰다. 샘플 완충액 중 동일량의 단백질을 분자량 마커와 함께 SDS-PAGE 젤의 웰에 로딩하고, 100 V에서 1-2시간 동안 전기영동시켰다. 이후, 단백질을 니트로셀룰로스 또는 PVDF 막으로 옮겼다. 이후, 막을 차단 완충액을 이용하여 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 이후, 막을 제조업체의 설명서에 따라 차단 완충액 중 일차 항체의 적절한 희석액과 함께 인큐베이션한 후, 5분 동안 20 Mn Tris, Ph 7.5; 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20(TBST)에서 3회 세척하였다. 이후, 막을 실온에서 1시간 동안 차단 완충액 중 제조업체 권장 희석액의 컨쥬게이션된 이차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 각각 5분 동안 TBST에서 3회 세척하였다. 블롯의 이미지를 화학발광 검출을 위해 암실 현상 기술 또는 비색 또는 형광 검출을 위한 이미지 스캐닝 기술을 이용하여 획득하였다.
혈소판-유사 세포를 함유하는 분획을 인간 제대혈 단위(Cord:Use Cord Blood Bank, Orlando, FL) 및 성체 말초 혈액 샘플(New York Blood Bank, New York)로부터 수집하였다. 혈소판-유사 세포를 프로테아제 억제제의 칵테일(Sigma)을 갖는 세포 추출 완충액(Invitrogen)으로 가용화시켰다. 샘플(각각 20 μg 단백질)을 1:1의 부피비로 Laemmli 샘플 완충액(Bio-Rad)과 혼합하고, 비등시키고, 로딩하고, 10% Tris-HCl Criterion Precast Gel(Bio-Rad)에서 전기영동에 의해 분리시켰다. 이후, 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 1시간 동안 TBST 중 5% 탈지 분유로 차단하고, 실온에서 2시간 동안 5% 밀크-TBS 중 1:1,000 희석으로 토끼 항-AIRE 폴리클로날 Ab, 항-CRIPTO pAb, 및 항-GATA4 pAb(Abcam), 래트 항-인간 OCT4 Ab, 래트 항-인간 SOX2 Ab, 마우스 항-인간 NANOG Ab, 마우스 항-인간 C-myc Ab(eBiosciences), 및 토끼 항-MAFA pAb(Novus Biologicals)를 포함하는 다양한 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 블롯을 5% 밀크-TBS 중 호스라디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 이차 항체(1:2,000; Pierce)에 노출시켰다. 결합된 면역복합체를 증강된 화학발광(ECL, GE healthcare) 방법으로 시각화시켰다. β-액틴을 내부 로딩 대조군으로 사용하였다.
실시간 PCR
실시간 PCR을 이전에 기재된 바와 같이 수행하여 mRNA의 발현 수준을 분석하였다(Zhao Y. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 360 (2007) 205-211). 간단하게, 전체 RNA를 Quiagen 키트(Valencia CA)를 이용하여 세포로부터 추출한 후, 무작위 헥사머 프라이머(Fermentas, Hanover MD)를 이용하여 첫 번째 가닥 cDNA 합성을 수행하였다. 각각의 관심 유전자에 대한 검증된 유전자 특이적 RT-PCR 프라이머 세트를 이용하여 40 주기로 Mx3000p Quantitative PCR 시스템(Stratagene, La Jolla, CA)을 이용하여 각각의 샘플에 대해 실시간 PCR을 수행하였다. 각각의 전사물의 상대 발현 수준을 내부 대조군으로서 하우스 키핑(house keeping) 유전자 베타-액틴의 상대 발현 수준에 대해 보정하였다.
혈소판-유사 세포에서의 상이한 mRNA의 발현을 정량 실시간 PCR로 분석하였다. 각각의 샘플로부터의 전체 RNA를 Qiagen 키트(Valencia, CA)를 이용하여 추출하였다. iScript gDNA Clear cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 전체 RNA로부터 첫 번째 가닥의 cDNA를 합성하였다. 실시간 PCR을 ES 세포 관련 마커(예를 들어, OCT4, NANOG, SOX2, KLF4, 및 C-myc) 및 췌장 섬 세포 관련 마커(예를 들어, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, PPY, Ghrelin, GCK, Sur1, Kir6.2, MAFA, NKX6.1, PDX-1, NEUROD1, 및 NGN3)를 포함하는 각각의 유전자에 대한 검증된 유전자-특이적 RT2 PCR 프라이머 세트(Qiagen Valencia, CA)를 이용하여 10분 동안 95℃, 이후 15초 동안 95℃ 및 60초 동안 60℃의 40주기의 조건하에서 StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems, CA)을 이용하여 삼중으로 각각의 샘플에 대해 수행하였다. 내부 대조군으로서 β-액틴에 비한 각각의 유전자의 발현 수준을 결정하였다. 유전자 발현을 확인하기 위해, 실시간 PCR 생성물을 1.5% 아가로스 겔 전기영동으로 검사하였다.
RT2 Profiler 실시간 PCR 어레이를 위해, 인간 줄기 세포 키트(Qiagen, Cat. No. PAHS-405Z, 제품 330231)(유전자 목록: 줄기 세포 특이적 마커: 세포 주기의 조절: APC, AXIN1, CCNA2, CCND1, CCND2, CCNE1, CDK1 (CDC2), CDC42, EP300, FGF1, FGF2 (BFGF), FGF3, FGF4, MYC, NOTCH2, PARD6A, RB1; 염색질 변형 효소 & 리모델링 인자: KAT2A(GCN5L2), HDAC2, KAT8(MYST1), KAT7(MYST2), RB1, TERT; 대칭 & 비대칭 세포 분열: DHH, NOTCH1, NOTCH2, NUMB, PARD6A; 자가-재생 마커: HSPA9, KAT8(MYST1), KAT7(MYST2), NEUROG2, SOX1, SOX2; 사이토카인 & 성장 인자: BMP1, BMP2, BMP3, CXCL12(SDF1), FGF1, FGF2(BFGF), FGF3, FGF4, GDF2(BMP9), GDF3(VGR-2), IGF1, JAG1; 세포-세포 소통: DHH, DLL1(DELTA1), GJA1(CX43), GJB1(CX32), GJB2(CX26), JAG1; 세포 부착 분자: APC, BGLAP, CD4, CD44, CDH1(E-카드헤린), CDH2(N-카드헤린), COL9A1, CTNNA1, CXCL12(SDF1), NCAM1; 대사 마커: ABCG2(BCRP), ALDH1A1(RALDH1), ALDH2, FGFR1. 줄기 세포 분화 마커: 배아 세포 계통 마커: ACTC1, ASCL2, FOXA2(HNF3B), PDX1(IPF1), ISL1, KRT15, MSX1, MYOD1, T(Brachyury); 조혈 세포 계통 마커: CD3D, CD4, CD8A, CD8B, MME; 중간엽 세포 계통 마커: ACAN(AGC1), ALPI, BGLAP, COL1A1, COL2A1, COL9A1, PPARG; 신경 세포 계통 마커: CD44, NCAM1, SIGMAR1, S100B, TUBB3; 줄기 세포 유지에 중요한 신호전달 경로: Notch 신호전달: DLL1(DELTA1), DLL3, DTX1, DTX2, DVL1, EP300, KAT2A(GCN5L2), HDAC2, JAG1, NOTCH1, NOTCH2, NUMB; WNT 신호전달: ADAR, APC, AXIN1, BTRC(bTrCP), CCND1, FRAT1, FZD1, MYC, PPARD, WNT1). 및 인간 줄기 세포 전사 인자 키트(Qiagen, Cat. No. PAHS-501Z, 제품 번호 330231)(96-웰 포맷)(유전자 목록: 체세포 줄기 세포 유지: CDX2, NANOG, POU5F1(Oct4), SOX2; 태반 발달: CDX2; 태반 발달: HAND1, PPARG, SP1, VDR; 유도된 다능성 & 배아 줄기 세포: NANOG, POU5F1(Oct4), SOX2, STAT3; 축/대칭/분할: CDX2, DLX1, DLX2, FOXA2(HNF3B), HOXA11, HOXA2, HOXA3, HOXA7, HOXA9, HOXA10, HOXB1, HOXB3, HOXB5, HOXB8, HOXC10, HOXC4, HOXC5, HOXC6, HOXC9, HOXD10, HOXD4, LMX1B, NEUROD1, NOTCH2, NR2F2, PAX1, PITX2, SMAD2(MADH2), TBX5, TDGF1, ZIC1; 배아 발달: CDX2, DLX1, DLX2, FOXA2(HNF3B), GATA6, GLI2, HAND1, HOXA11, HOXA2, HOXA3, HOXA7, HOXA9, HOXA10, HOXB1, HOXB3, HOXB5, HOXB8, HOXC10, HOXC4, HOXC5, HOXC6, HOXC9, HOXD1, HOXD10, HOXD4, KLF4, LMX1B, MSX2, NANOG, NEUROD1, NOTCH2, PAX1, SIX2, SMAD2(MADH2), SOX2, SP1, TBX5, TDGF1, ZFPM2, ZIC1; 외배엽, 내배엽 & 중배엽 형성 & 분화: FOXA2(HNF3B), GATA6, HAND1, HOXA7, HOXB13, ISL1, KLF4, SMAD2(MADH2), SOX9; 기관 형태형성: CDX2, DLX1, DLX2, GLI2, HAND1, HOXA11, HOXA2, HOXA3, HOXA7, HOXB1, HOXB13, HOXB3, HOXB5, HOXB8, HOXC4, HOXC9, HOXD10, HOXD4, ISL1, JUN, KLF4, MSX2, MYC, NEUROD1, NOTCH2, NR2F2, PAX1, PAX5, PAX6, PITX2, PITX3, PPARG, RUNX1(AML1), SIX2, SMAD2(MADH2), SOX2, SOX9, SP1, STAT3, TBX5, TDGF1, VDR, WT1, ZFPM2, ZIC1; 혈관형성: CDX2, HAND1, JUN, NR2F2, RUNX1(AML1), WT1; 신경발생: DLX1, DLX2, DNMT3B, FOXA1, FOXA2(HNF3B), FOXP3, GLI2, HOXA2, HOXC10, HOXD10, ISL1, LMX1B, NEUROD1, NKX2-2, NR2F2, OLIG2, PAX6, PITX3, POU4F1, POU4F2, PPARG, SOX2, STAT3, TLX3; 조혈: RB1, RUNX1(AML1), SOX6, SP1, STAT1; 골형성: GLI2, HOXA2, SOX2, SP1; 다른 줄기 세포 전사 인자: DACH1, EGR3, ESR1(ERα), EZH2, FOXP1, FOXP2, GATA1, HOXC12, HTR7, IRX4, KLF2, LIN28B, NFATC1, PAX9, PCNA, TERT, WRN)를 제조업체의 설명서에 따라 사용하였다. 제조업체에 의해 제공된 웹-기반 PCR 어레이 데이터 분석 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다.
f-대식세포 배양 및 분화
f-Mφ 배양을 문헌[Zhao Y, et al., A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2003, 100: 2426-2431]에 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단하게, 정제된 단핵구를 50ng/ml M-CSF를 갖는 혈청-비함유 X-VIVO15 배지(Lonza) 중 1 x 105 세포/ml, 0.5 ml/웰로 8-Well Lab-Tek II Chamber Slide(Fisher Scientific)에 시딩하였다. 혈소판과 단핵구/대식세포 사이의 상호작용을 조사하기 위해, 정제된 단핵구를 0.25% 트립신/EDTA로 전처리한 후, 50 ng/ml M-CSF의 존재하에서 혈청-비함유 X-VIVO15 배지로 처리하였다. 단핵구/대식세포에 의한 혈소판-유사 세포의 포식작용을 결정하기 위해, 정제된 단핵구/대식세포를 27 mm Nunc Glass Base Dish(Thermo Scientific, Rochester, NY)에 플랜팅한 후, 혈소판 마커 CD42a 및 ES 세포-관련 마커 OCT4로 면역염색하였다. 샘플을 Nikon A1R 공초점 현미경으로 관찰하고 사진을 찍었다. 투과 전자 현미경(TEM)의 의한 혈소판과 단핵구/대식세포 사이의 상호작용을 추가로 결정하기 위해, 정제된 혈소판 및 단핵구(트립신/EDTA 처리 없음)를 TEM 완충액(0.1M 소듐 카코딜레이트 완충액 중 2% 포름알데하이드 및 2.5% 글루타르알데하이드, pH 7.4)으로 고정시켰다. 세포 샘플을 엠베딩 및 절편화를 위해 제공하였다. 샘플을 AMT-XR41 디지털 카메라가 장착된 JEOL 1200EX 투과 전자 현미경으로 관찰하였다.
부착성 제대혈- 줄기 세포의 존재하에서의 림프구의 공동-배양에 의한 전체 혈액으로부터 획득된 림프구의 " 교육"( " 줄기 세포 교육자 요법")
자오 등(Zhao et al)은 전체 혈액으로부터 림프구를 분리시키고, 간단히 부착성 CB-SC의 존재하에서 림프구를 공동-배양한 후, 환자의 순환으로 "교육된" 림프구를 복귀시키는, 생물반응기 장치로 언급되는 연속 폐쇄 루프 시스템을 통해 환자의 혈액을 순환시키는 절차를 개발하였다[Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med, Vol. 10:3, (2012]. 개방-라벨 단계 1/2 연구에서, T1D를 갖는 아시아 출신의 12명의 환자에게 생물반응기 장치를 이용한 단일 치료를 제공하였고, 아시아 출신의 3명의 환자에게 부착성 CB-SC가 없는 생물반응기 장치를 이용한 단일 치료(즉, 공정 단독 대조군)를 제공하였다. 16-게이지 IV 바늘을 좌측(또는 우측) 팔오금 중간 정맥에 놓고, 6 내지 7시간 동안 35 mL/min로 환자의 혈액을 Blood Cell Separator MCS+(Haemonetics®, Braintree, MA)를 통해 통과시켜, 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 림프구를 분리시켰다. 수집된 림프구를 동종이계 CB-SC에 대한 노출(또는 CB-SC가 없는 공정 대조군)을 위해 장치로 옮기고, 다른 혈액 성분을 환자에게 복귀시켰다. 장치에서 2 내지 3시간 후, 림프구를 생리식염수로 중력 흐름 제어(2 내지 3 mL/min) 하에서 손의 등 정맥을 통해 환자의 순환으로 복귀시켰다. 약 10,000 mL의 혈액을 절차 동안 처리하여 림프구 분획에 대해 약 2회의 반복 교육을 발생시켰다. 환자는 온도를 모니터링하고, 치료. 한 상기 치료 후 유해한 반응에 대한 정기적인 실험 혈액 검사를 수행하기 위해 2일 동안 입원하였다.
환자가 미국 당뇨병 협회의 진단 기준을 충족하는 경우에 환자를 선택하였고, 혈액 검사로 T1D 대상체에 대해 췌장 섬 β-세포에 대한 적어도 하나의 자가항체의 존재를 확인하였다. 배제 기준은 임상적으로 유의한 간, 신장, 또는 심장 질환; 임신; 면역억제 약물; 바이러스 질환, 또는 면역결핍과 관련된 질환을 포함하였다. 줄기 세포 교육자(SCE) 요법의 실행가능성 및 안전성에 대한 일차 연구 종점은 다른 곳에서 공개되었다(Zhao Y, et al.: Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Med 2012, 10: 3; Zhao Y, et al.: Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Med 2013, 11: 160; Delgado E, et al.: Modulation of Autoimmune T-Cell Memory by Stem Cell Educator Therapy: Phase 1/2 Clinical Trial. EBioMedicine 2015, 2: 2024-2036). 현재의 연구 종점은 T1D 및 T2D 대상체에서 혈소판에 대한 SCE 요법의 효과의 예비 증거였다. 기준선 혈액 샘플을 SCE 요법 전에 수집하였다.
줄기 세포 교육자 요법 및 인간 환자의 치료를 문헌[Zhao et al., BMC Medicine 2013, 11:160]에 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단하게, 바늘을 환자의 정맥에 놓고, 환자의 혈액을 6 내지 7시간 동안 혈액 세포 분리기 MCS®+(Haemonetics, Braintree, MA, USA)를 통해 통과시켜, 단핵 세포를 분리시켰다. 수집된 단핵 세포를 인간 제대혈 유래 줄기 세포(CB-SC)와 같은 교육자 세포 유형에 대한 노출을 위해 줄기 세포 교육자 장치로 옮겼다. 이후, 교육된 단핵 세포를 환자의 정맥을 통해 생리식염수에서 환자의 순환으로 복귀시켰다.
CB-SC를 획득하고, 줄기 세포 교육자 장치에서 8% CO2에서 37℃에서 혈청-비함유 배양 배지에서 배양하였다. 일부 구현예에 따르면, 줄기 세포 교육자 장치는 적층된 조직 배양 플레이트의 폐쇄 시스템을 포함하며, 적층된 플레이트에 의해 형성된 챔버는 각각의 인접한 챔버를 통해 연속적이다. 환자의 혈액으로부터 분리된 말초 혈액 단핵 세포를 줄기 세포 교육자 장치의 한 말단에 도입하고, 강한 부착성 CB-SC로 덮인 적층된 플레이트를 통해 통과시키고, 교육자 장치의 다른 말단에서 수집하였다. 이후, 교육된 말초 혈액 단핵 세포를 환자의 정맥에 재도입시켰다.
실시예 1. 줄기 세포 교육자 요법에 의한 혈소판의 조절
혈소판의 조절을 모의 요법에 제공된 대상체(n=3)와 비교하여 19명의 타입 1 당뇨병(T1D) 및 12명의 타입 2 당뇨병(T2D) 환자에서 분석하였다. 통상적인 요법이 제공된 연령- 및 성별-매치된 T1D(n=8) 및 T2D (n=10) 대상체를 각각 추가 대조군으로 사용하였다. 임상 결과는 혈소판 수가 줄기 세포 교육자 요법을 받은 후에 T2D 대상체에서 현저히 증가하였으나(P = 0.027), T1D 치료에서는 8명의 대상체 중 5명이 개선되었음을 입증하였다(도 1a). 혈소판 분포 폭(PDW)의 값은 줄기 세포 교육자 요법을 이용한 치료 후에 T1D 및 T2D 대상체 둘 모두에서 유의하게 증가된 반면(도 1b), 이들의 평균 혈소판 부피(MPV)는 T1D 및 T2D 대상체 둘 모두에서 감소되었다(도 1c). 치료 후 T1D 및 T2D 대상체 둘 모두에서 혈소판용적치(PCT)에 대해 현저한 변화가 없었다. 백인 T1D 대상체(N=8)로부터의 임상 데이터는 또한 SCE 요법을 받은 후 혈소판 수에서의 증가를 나타내었다(P = 0.04, 도 1d). 데이터는 혈소판의 조절이 당뇨병 환자의 자가면역 및 대사 조절에서 줄기 세포 교육자 요법의 임상 효능에 기여할 수 있음을 암시한다(Zhao Y, et al., Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Med 2012, 10: 3; Zhao Y, et al., Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Med 2013, 11: 160).
실시예 2. 혈소판-유사 세포에서의 면역 내성-관련 마커의 발현.
제대혈의 세포 성분이 면역 반응을 조절할 수 있는지 조사하기 위해, 혈소판-유사 세포에서의 면역 내성-관련 마커의 발현을 연구하였다.
혈소판 유사 세포를 포함하는 인간 제대혈(도 2a-d) 또는 성체 말초 혈액(도 2e-i)으로부터의 혈소판-풍부 분획을 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 이후, 혈소판-유사 세포를 다양한 면역-관련 마커에 대해 검사하였다.
흐름세포측정법은 제대혈 유래(도 2a) 및 성체 혈액 유래(도 2e) 혈소판-유사 세포 둘 모두가 공동-억제 면역조절 표면 분자를 나타냄을 제시하였다. 도 2a에 제시된 바와 같이, 흐름세포측정법은 혈소판-유사 세포가 CD270/CD41 및 CD270/CD61을 발현하는 것을 제시한다. 도 2b에 제시된 바와 같이, 투과화된 제대혈 혈소판-유사 세포의 세포내 염색은 TGF-β1/CD41, TGF-β1/CD42, Foxp3/CD41, 및 Foxp3/CD42의 발현을 나타내었다.
인간 제대혈 유래 혈소판-유사 세포는 자가면역 조절인자 AIRE를 발현한다(도 2c 및 d). 도 2c에 제시된 바와 같이, 웨스턴 블롯 분석은 제대혈 혈소판-유사 세포의 7개의 상이한 샘플 각각이 AIRE 단백질을 포함한 것을 나타내었다. 도 2c의 각각의 블롯의 우측에 있는 숫자는 임의의 상대 강도 단위의 단백질의 정량된 평균 양을 나타낸다. 도 2d에 제시된 바와 같이, 혈소판 마커 CD41에 대해 양성인 제대혈 혈소판-유사 세포의 85% 이상이 또한 AIRE 단백질에 대해 양성이었다(우측 패널). 동형-매치된 IgG, IgG-FITC/IgG-PC7을 음성 대조군으로 사용하였다(좌측 패널).
도 2e에 제시된 바와 같이, 성체 말초 혈액 혈소판-유사 세포의 99% 이상은 CD42 및 CD41 둘 모두를 발현하고(상단 우측 패널), 이들 세포중 89% 이상은 또한 공동-억제 분자 CD270 및 Galectin 9을 발현한다(하단 우측 패널). 동형-매치된 IgG를 대조군으로 사용하였다(좌측 패널). 또한, 도 2f에 제시된 바와 같이, 성체 말초 혈액 혈소판-유사 세포의 95% 이상은 PD-L1 또는 CD270과 함께 CD41 둘 모두를 발현한다(상단 패널). 대조적으로, CD41 발현 혈소판-유사 세포의 0.2% 미만은 또한 ICOS를 발현하고(하단 좌측 패널), CD41 발현 혈소판-유사 세포의 약 20%는 또한 Galectin 9을 발현한다(하단 우측패널). IgG-FITC/IgG-PC7(상단 좌측 패널) 및 IgG-PE/IgG-APC(하단 좌측 패널)를 음성 대조군으로 사용하였다.
따라서, 흐름세포측정법은 성체 혈액-유래 혈소판 유사 세포에서의 PD-L1 및 CD270의 높은 발현, Galectin 9의 낮은 발현, 및 ICOS의 발현 없음을 나타내었다. 대표 데이터는 8개의 개별 제조물로부터의 것이었다.
Galectin 9은 2개의 탄수화물-인지 도메인을 갖는 탠덤-반복 유형 갈렉틴으로, 호산구 화학유인물질 및 활성화 인자로 처음 확인되었으며; 이는 세포 응집 및 부착 뿐만 아니라 종양 세포의 아폽토시스를 포함하는 다양한 생물학적 기능을 조절한다. (Fujihara, S. et al, "Galectin-9 in cancer therapy," Recent Pat. Endocr. Metab. Immune Drug Discov. (2013); 7(2): 130-7). Galectin 9은 림프구에 대한 면역조절 역할을 하며, 여기서 이는 TIM-3와 특정한 상호작용을 나타내고, Th1 면역을 음성적으로 조절할 수 있다. (Zhu, C. et al, "The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates T helper type 1 immunity," Nat. Immunol. 2005; 6(1220: 1245-62).
도 2g에 제시된 바와 같이, 세포내 염색 및 흐름세포측정법은 또한 인간 성체 말초 혈액 혈소판-유사 세포의 98% 이상이 TGFβ1과 함께 CD41을 공동 발현한 것을 나타내었다(우측 패널). IgG-APC/IgG-PC7을 음성 대조군으로 사용하였다(좌측 패널).
인간 성체 말초 혈액 혈소판은 또한 자가면역 조절인자 AIRE를 발현하는 것으로 나타났다(도 2h 및 i). 도 2h에 제시된 바와 같이, 웨스턴 블롯 분석은 인간 성체 말초 혈액 혈소판의 9개의 상이한 샘플 각각이 AIRE 단백질을 포함한 것을 나타내었다. 각각의 블롯의 우측에 있는 숫자는 임의의 상대 강도 단위의 단백질의 정량된 평균 양을 나타낸다. 또한, 도 2i에 제시된 바와 같이, 인간 성체 말초 혈액 혈소판의 96% 이상은 CD41 및 AIRE 단백질에 대해 양성이다(우측 패널). IgG-FITC/IgG-PC7을 음성 대조군으로 사용하였다.
추가의 흐름세포측정법 데이터는 제대혈 및 성체 혈액으로부터 유래된 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판-풍부 세포 분획이 공동-억제 표면 분자인 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1)을 나타낸 것을 입증하였다(데이터는 제시하지 않음). 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1)은 많은 암세포 유형, 뿐만 아니라 활성화된 T 세포 및 항원-제시 세포에 의해 발현된다. (Coombs, MR. et al, "Apigenin inhibits the inducible expression of programmed death ligand 1 by human and mouse mammary carcinoma cells," Cancer Lett. 2016; 380(2): 424-33).
인간 성체 말초 혈액 혈소판은 케모카인 수용체의 어레이를 다양한 정도로 발현하는 것으로 나타났다. 도 2j-k에 제시된 바와 같이, 흐름세포측정법 데이터는 인간 성체 말초 혈액-유래 혈소판의 높은 백분율이 높은 수준의 CCR3(82% 이상) 및 CXCR4(94% 이상)를 발현하는 것을 나타내었다(도 2j, 하단 좌측; 도 2k 하단 중간). 61% 이상의 인간 성체 혈소판이 높은 수준의 CCL2를 발현하는 것으로 또한 밝혀졌다(도 2j, 상단 좌측 패널). 높은 수준의 CXCL10(9.9%), CCR4(2.01%), CCR5(6.79%), CCR7(27.37%), CXCR1(9.95%), CXCR2(10.57%), CXCR3(22.77%), 및 CD62L(4.36%)을 발현하는 것으로 확인된 인간 성체 혈소판의 백분율이 괄호 내에 표시된다. 사실상, 성체 혈소판 중 어느 것도 높은 수준의 CXCL1을 발현하지 않았다(1% 미만). 도 2j 및 k의 흐름세포측정법 차트 각각에 대한 x-축은 마커 CD41을 나타낸다. 따라서, 흐름세포측정법은 성체 혈액 혈소판-유사 세포 상에서의 다양한 수준의 케모카인 수용체 및 리간드의 발현을 제시한다.
이론으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, 혈소판-유사 세포를 포함하는 제대혈의 혈장 풍부 분획과 접촉하는 성체 단핵 세포는 면역 조절 분자의 전달, 또는 이의 유도를 통해 면역 내성을 유도할 수 있는 것으로 생각할 수 있다.
흐름세포측정법은 제대혈(CB)- 및 성체 말초 혈액(PB)-혈소판 유사 세포 둘 모두가 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1), CD270(헤르페스 바이러스 진입 매개체, HVEM) 및 Galectin 9과 같은 공동-억제성 표면 분자 중 하나 이상을 나타낸 것을 제시하였다. 도 2f에 제시된 바와 같이, 성체 혈액-유래 혈소판에서 PD-L1(95.42%) 및 CD270(95.81%)의 발현은 ICOS(0.20%)의 발현보다 훨씬 높았다(도 2e 및 f).
Galectin 9의 발현은 4명의 개체의 혈소판 유사 세포에서 양성이었다(4/8 공여자, 54.07% +/- 27.59)(데이터는 제시하지 않음). 세포내 염색은 혈소판-유사 세포가 또한 사이토카인 전환 성장 인자 β1(TGF-β1)을 발현하는 것을 나타내었다(도 2b 및 g). 본 발명자는 또한 CD42+Foxp3+ 혈소판의 96.22% 및 CD41+Foxp3+ 혈소판의 96.44%가 각각 면역 조절-관련 전사 인자 Foxp3를 나타내는 것을 발견하였다(도 2b). 특히, 웨스턴 블로팅 및 흐름세포측정법은 제대혈 혈소판 유사 세포(도 2c 및 d) 및 성체 혈액 혈소판 유사 세포(도 2h 및 i)에서의 자가면역 조절인자(AIRE)의 발현을 나타내었다. 추가의 흐름세포측정법은 혈소판이 높은 수준의 케모카인 수용체 CCR3 및 CXCR4, 중간 수준의 CCL2, 낮은 수준의 CXCL10, CCR4, CCR5, CCR7, CXCR1, CXCR2, CXCR3, 및 CD62L, 및 CXCL1의 발현에 대해 음성을 나타낸 것을 제시하였다(도 2j-k). 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이들 데이터는 마커 발현을 기초로 하여 혈소판-유사 세포가 면역 조절인자로 작용하고 면역 내성을 유도할 수 있다는 결론에 도움을 준다.
면역 조절을 나타내는 혈소판-유래 미토콘드리아
미토콘드리아는 면역 마커-관련 유전자의 기원을 확인하기 위해 미토콘드리아 DNA(MitoDNA)의 유전자 전사를 위해 CB-혈소판 및 PB-혈소판으로부터 정제되었고, 미토콘드리아는 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 Qproteome Mitochondria Isolation 키트(Qiagen, Hidden, Germany)를 이용하여 PB-혈소판으로부터 분리되었다. 실시간 PCR 어레이 분석은 T 세포 무반응 및 면역 내성-관련 유전자의 발현을 나타내었다(도 2l). 흐름세포측정법 또한 미토콘드리아를 방출하는 혈소판이 면역 내성-관련 마커 CD270 및 CD274(PD-L1)를 나타낸 것을 제시하였다(도 2m).
T 세포에서 미토콘드리아의 면역 조절 활성을 결정하기 위해, 말초 혈액-유래 단핵 세포(PBMC)를 항-CD3 + 항-CD28 항체 + 재조합 인간 IL-2(rIL-2)와 커플링된 Dynabead의 존재하에서 동종이계 PB-혈소판-유래 미토콘드리아로 처리하였다. 4일 동안의 상기 모노클로날 항체(mAb) 조합물을 이용한 T 세포의 생체-외 확장 후, 많은 수의 세포 클러스터가 관찰되었고, 상층액에 상이한 크기가 부유하며(도 2n, 하단 중간 패널), 이는 유의한 T 세포 증식을 암시한다. 미토콘드리아의 존재하에서, 이러한 현상은 명백하지 않았다(도 2n, 우측 패널). 대신에, 미토콘드리아와의 조합 처리 후, 세포 수가 현저히 감소되었다(도 2o).
다음으로, 세포에서의 면역 체크포인트 수용체 PD-1(프로그래밍된 사멸 수용체-1)의 발현을 T 세포에서 검사하였다. PD-1은 PD-L1(CD274)의 리간드이다. 미토콘드리아 처리 후 CD4+PD1+ T 세포의 백분율은 15%±0.64%로 증가되었다(도 2p)(P=0.001). 추가의 흐름세포측정법은 미토콘드리아의 존재하에서 CD8+PD1+ T 세포의 백분율이 또한 2.43%±1.18%로부터 6.46%±0.28%로 개선된 것을 나타내었다(도 2q)(P=0.034).
이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이들 발견은 혈소판 및 이의 미토콘드리아의 분자 함유물이 면역 조절인자로 작용하고, 면역 내성을 유도할 수 있다는 추가 증거를 제공한다.
실시예 3. 혈소판에 의한 단핵구 분화의 조절
혈소판-유사 세포와 다른 혈액 면역 세포의 상호작용을 특성규명하기 위해, 제대혈 단핵 세포(CBMC)를 마커 CD41b 및 CD42a와 조합된 상이한 계통-특이적 마커로 면역염색하였다. CD41b는 당단백질 IIIa(또는 인테그린 β3, CD61)와 회합되고, 인간 거대핵세포 및 혈소판에 존재하는 이종이량체 gpIIb/gpIIIa 복합체를 형성하는 당단백질 IIb(CD41로 공지됨)의 β 사슬이며; 혈소판 당단백질 GPIX, GP9로도 언급되는 CD42a GP-IX(CD42a)는 GP-Ib(CD42b)와 비-공유 복합체를 형성하는 작은 막 단백질 당단백질이다. 폰 빌레브란트 인자 및 트롬빈에 대한 수용체인 CD42a-d 복합체는 손상된 내피세포에 노출된 내피하 기질에 대한 혈소판의 부착을 매개하며, 트롬빈에 대한 혈소판 반응을 증폭시킨다.
흐름세포측정법에 의해, 혈소판-유사 세포는 대부분의 CD14+ 단핵구 및 CD66b+ 과립구, 뿐만 아니라 일부 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD19+ B 세포, 및 CD56+ NK 세포에 부착한다(도 3a-c). 도 3a는 CBMC의 게이팅되지 않은 도트 플롯이며, 림프구(Ly, 자주색 원), 단핵구(Mo, 흑색 원), 과립구(Gr, 황색 원), 및 혈소판(PI, 청색 원)의 4개의 주요 세포 집단이 존재한다. 세포 분리 시약인 트립신-EDTA(0.25%)로 처리한 후, CBMC에서의 CD66b+CD41+ 과립구의 백분율은 미처리 CBMC의 것에 비해 현저히 감소되었으나(P = 0.007, 도 3d); CBMC에서의 CD14+CD41+ 단핵구의 백분율은 유의한 변화를 나타내는데 실패하였다(P = 0.95, 도 3d 및 e). 데이터는 혈소판-유사 세포가 과립구 및 다른 면역 세포보다 단핵구에 더욱 강하게 부착함을 암시한다.
이전 연구는 성인 인간 단핵구/대식세포(Mo/Mφ)가 유도인자를 이용한 생체 외 처리 후 다능성 줄기 세포(섬유모세포-유사 Mφ, f-Mφ로 지정됨)로 분화할 수 있음을 입증하였다(Zhao Y, Glesne D, Huberman E: A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 2426-2431). 혈소판과 Mo/Mφ 사이의 상호작용이 상기 탈분화에 기여하는지의 여부를 결정하기 위해, 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 세포 고정 및 투과화 후 흐름세포측정법에 의해 분석하였다. 투과화된 PBMC에서의 CD14+CD41+ 및 CD14+CD42+ Mo/Mφ의 백분율은 새로이 분리된 PBMC에서의 것에 비해 4배 증가되었다(도 3f).
정제된 Mφ를 투과 전자 현미경검사(도 3g-l) 및 공초점 현미경검사(도 3p)로 검사하였다. 전자 현미경검사는 세포 융합(도 3i-k) 및 Mφ에 의한 혈소판-유사 세포의 포식작용(도 3l)을 포함하는 혈소판-유사 세포와 Mφ 사이의 밀접한 상호작용을 나타내었다.
도 3i는 전자 현미경검사에 의한 대식세포(Mφ)와 혈소판-유사 세포(P)의 밀접한 회합의 축소(상단 패널) 및 확대(하단 패널)된 이미지를 제시한다. 하단 패널은 상단 패널의 점선 박스로 표시된 이미지를 나타낸다. 문자 "N"은 Mφ의 핵을 나타낸다. 도 3i에 제시된 바와 같이, 대식세포(Mφ)의 막 경계는 혈소판-유사 세포(P)의 막 경계와 합병된 것으로 보인다(화살표로 표시된 명백한 융합의 접합부 참조, 하단 패널). 유사하게, 도 3j는 상단 좌측에서 우측으로 이어서 하단 좌측으로 증가하는 배율의 일련의 확대 이미지를 제시하며, 이는 Mφ와 혈소판-유사 세포의 상호작용을 제시한다. 도 3j에 제시된 바와 같이, Mφ 및 혈소판-유사 세포의 막은 융합된 것으로 보인다(화살표에 의해 표시된 명백한 융합된 막 참조, 우측 패널, 하단 좌측 패널). 어떤 곳에는, 세포막 경계가 소실되었다(도 3j 참조, 우측 및 하단 좌측 패널, 삼각형 화살표에 의해 표시됨). 도 3k는 또한 Mφ와 혈소판-유사 세포 사이의 밀접한 회합의 축소(좌측 패널) 및 확대(우측 패널) 이미지를 제시한다. 도 3k에 제시된 바와 같이, Mφ 및 혈소판-유사 세포의 막은 밀접하게 회합되거나 융합된 것으로 보인다(예를 들어, 화살표 참조, 우측 패널).
도 3l은 포식된 혈소판-유사 세포(P)와 밀접하게 접촉하고/이를 갖는 것으로 보이는 대식세포의 축소(좌측 패널) 및 확대(우측 패널)된 이미지를 제시한다. 대식세포의 물결 모양 핵이 표시된다(N). 도 3l에 제시된 바와 같이, 혈소판-유사 세포는 Mφ 막의 경게에 의해 완전히 둘러싸여 있다.
이전 연구에서 성인 인간 단핵구/대식세포(Mo/Mφ)가 섬유모세포-유사 Mφ(f-Mφ)로 명명된 다능성 줄기 세포로 탈분화할 수 있음이 입증되었으므로, 유도인자를 이용한 생체 외 처리 후(Zhao Y, Glesne D, Huberman E: A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100: 2426-2431), 혈소판-유사 세포의 줄기세포능으로부터 유래된 f-Mφ의 다능성을 연구하였다. 제대혈의 혈소판 풍부 분획과 접촉된 대식세포(Mφ)를 트립신/EDTA로 처리하거나 미처리된 채로 두었다. 트립신화 및 미처리 Mφ를 2일 동안 50 ng/ml의 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF)의 존재하에서 배양한 후, f-Mφ 형태의 존재 또는 부재를 시각적으로 평가하였다. 도 3m에 제시된 바와 같이, f-Mφ의 백분율은 트립신/EDTA로 처리된 대식세포의 그룹에서 유의하게 감소하였다. 이론으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, 이러한 데이터는 f-Mφ의 다능성이 f-Mφ에 줄기세포능 특징을 부여하는 혈액의 혈소판 풍부 분획 내의 성분과의 접촉 및 이의 줄기세포능으로부터 유래됨을 암시한다.
도 3n에 제시된 바와 같이, 대식세포의 전체 세포수는 또한 트립신/EDTA를 이용한 처리 및 7일 동안의 배양 후에 감소되었다(1.75 ± 0.35 x 104 세포/ml 대 미처리 그룹에서의 5.13 ± 0.75 x 104 세포/ml, P = 0.0044). 트립신/EDTA 처리(좌측 패널) 및 미처리(우측 패널) 세포의 전체 세포 집단에서의 차이를 제시하는 대표적 위상차 현미경검사 이미지가 도 3n에 제시된다. 이론으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, 데이터는 f-Mφ의 형성이 Mφ와의 접촉으로부터의 혈액의 혈소판 풍부 분획 내의 부착된 성분의 (적어도 부분적인) 제거 후에 감소된 것을 나타낸다.
또한, 데이터는 상피-유사 세포로의 f-Mφ의 분화에 대한 잠재성이 트립신/EDTA를 이용한 처리를 통한 혈소판 풍부 혈액 분획 성분의 제거 후에 감소된 것을 나타낸다. Mφ는 제대혈로부터 획득되었고, 트립신/EDTA로 처리되거나 처리되지 않은 채로 두었다. 처리 및 미처리 Mφ를 10일 동안 100 ng/ml 상피 성장 인자(EGF)에서 배양하고, 마우스 항-Pan-카드헤린 항체(1:100 희석)로 면역염색하고, 위상차 현미경검사로 검사하였다. 도 3o에 제시된 바와 같이, 트립신/EDTA로 처리된 대표적 세포(좌측 패널)는 미처리 그룹의 대표적 세포(우측 패널)와 비교하는 경우 카드헤린에 대한 감소된 염색을 나타낸다.
공초점 현미경검사 데이터는 Mφ 세포 내에서 CD41b, CD42 마커 및 줄기성 마커의 존재를 확인하였다. 구체적으로, 공초점 데이터는 Mφ 내부의 CD42a+OCT3/4+ 및 CD42a+NANOG+의 분포 및 Mφ의 핵으로의 OCT3/4 및 NANOG의 번역을 확인하였다(도 3p). 도 3p에 제시된 바와 같이, Mφ는 CD42a 및 OCT4에 대해 면역형광적으로 염색되었다. 핵은 각각의 그룹에 대해 DAPI로 염색되었다. 도 3p의 좌측 패널은 CD42a의 강한 핵주위 염색을 나타내는 반면, 중간 패널은 OCT4에 대한 강한 핵 염색을 나타낸다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이들 결과는 Mφ가 포식작용, 혈소판과의 막 융합을 통하거나, 혈소판 미세입자 및/또는 엑소솜을 수용함으로써 혈소판-유사 세포에 존재하는 단백질 및/또는 mRNA를 통합할 수 있고, OCT3/4 및 NANOG mRNA 및 단백질의 전달이 Mφ를 더욱 줄기-유사 상태로 재프로그래밍할 수 있음을 암시한다.
전체적으로, 이론으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, 데이터는 혈소판-유사 세포를 포함하는 제대혈의 혈소판 풍부 분획이 ES-관련 전사 인자를 제공하여, Mo/Mφ와 접촉함으로써 Mo/Mφ의 재프로그래밍 및 f-Mφ의 증식 및 분화를 발생시킬 수 있음을 암시한다.
실시예 4. 혈소판-유사 세포는 인간 ES 세포 마커를 발현한다.
인간 혈소판 마커 CD41 및 CD42를 이용하여, 흐름세포측정법은 인간 제대혈로부터의 고도로 정제된 혈소판(98% 초과 순도)이 ES-관련 다능성 유전자 마커를 고도로 나타내는 것을 제시하였다. 예를 들어, 전사 인자 옥타머-결합 단백질 4(OCT4)는 세포의 98% 이상에서 발현되는 것으로 밝혀졌으며, SRY-박스 함유 유전자 2(SOX2)는 세포의 96% 이상에서 발현되는 것으로 밝혀졌다(도 4a 및 b). 존재시, 소수의 세포(0.1% 미만)가 NANOG를 발현하였다(도 4b). 유사한 데이터가 성인 인간 말초 혈액-유래 혈소판으로부터 획득되었다(도 4c).
제대혈(도 4d) 및 말초 혈액 혈소판 유사 세포(도 4f)에서의 OCT4, SOX2, Kruppel-유사 인자 4(KLF4), 및 c-골수구종증 종양유전자(C-MYC)로부터의 mRNA의 존재가 각각 실시간 PCR 및 젤 전기영동 분석에 의해 입증되었다. 각각의 젤 패널의 외부 및 우측의 값은 상대 강도 단위의 6개의 대표 샘플 중에서 밴드 강도의 평균화된 양을 나타낸다. 웨스턴 블로팅은 제대혈 혈소판-유사 세포에서 단백질 수준의 OCT4, SOX2, CRIPTO, GATA-4, 및 C-MYC의 발현을 추가로 확인하였다(도 4e). 말초 혈액 혈소판 유사 세포로부터 유사한 데이터를 획득하였다(도 4g). 각각의 웨스턴 블롯 패널 우측 및 외부의 값은 각각의 샘플 밴드로부터 평균화된 상대 강도 단위를 나타낸다. NANOG mRNA의 발현은 5/20 CB-혈소판에서 양성이었으나(도 4d), 이의 단백질 발현은 매우 낮거나 음성이었다(도 4e). mRNA 및 단백질 수준 둘 모두는 PB-혈소판에서 음성이었다(도 4f 및 g). 데이터는 혈소판-유사 세포가 성인 인간 세포의 증식 및 분화를 조절하고 재프로그래밍하는데 기여할 수 있는 "줄기세포능" 마커를 보유하는 것을 제시한다.
혈소판은 인간 유전체 DNA가 없는 무핵 세포이다. 혈소판 유사 세포 분획에서 발현된 유전자를 추가로 특성규명하기 위해, 미토콘드리아 DNA(MitoDNA)의 유전자 전사 분석과 같이 제대혈 및 말초 혈액 유래 혈소판으로부터 미토콘드리아를 정제하였다. RT2 Profiler PCR Array 분석은 체세포 줄기 세포 유지(POU5F1(OCT4) 및 SOX2), 태반 발달(HAND1, SP1, 및 VDR), 유도된 다능성 & 배아 줄기 세포(POU5F1, SOX2, 및 STAT3), 축/대칭/분할(FOXA2, GATA6, GLI2, HAND1, HOXA11, HOXA2, HOXA3, HOXA7, HOXA9, HOXB1, HOXB3, HOXB5, HOXB8, HOXC10, HOXC5, HOXC6, HOXD10, LMX1B, NOTCH2, NR2F2, PAX1, SMAD2, TBX5, TDGF1, 및 ZIC1), 배아 발달(FOXA2, GATA6, GLI2, HAND1, HOXA11, HOXA2, HOXA3, HOXA7, HOXA9, HOXA10, HOXB1, HOXB3, HOXB5, HOXB8, HOXC10, HOXC5, HOXC6, HOXD1, HOXD10, KLF4, LMX1B, MSX2, NOTCH2, PAX1, SMAD2, SOX2, SP1, TBX5, TDGF1, ZFPM2, 및 ZIC1), 외배엽, 내배엽 & 중배엽 형성 & 분화(FOXA2, GATA6, HAND1, HOXA7, HOXB13, ISL1, KLF4, SMAD2, 및 SOX9), 기관 형태형성(GLI2, HAND1, HOXA11, HOXA2, HOXA3, HOXA7, HOXB1, HOXB13, HOXB3, HOXB5, HOXB8, HOXD10, ISL1, JUN, KLF4, MSX2, MYC, NOTCH2, NR2F2, PAX1, PAX5, PAX6, PITX3, RUNX1, SMAD2, SOX2, SOX9, SP1, STAT3, TBX5, TDGF1, VDR, WT1, ZFPM2, 및 ZIC1), 혈관형성(HAND1, JUN, NR2F2, RUNX1, 및 WT1), 신경발생(DNMT3B, FOXA2, FOXP3, GLI2, HOXA2, HOXC10, HOXD10, ISL1, LMX1B, NKX2.2, NR2F2, OLIG2, PAX6, PITX3, POU4F1, SOX2, STAT3, 및 TLX3), 조혈(RB1, RUNX1, SOX6, SP1, 및 STAT1), 골형성(GLI2, HOXA2, SOX2, 및 SP1), 및 기타(EGR3, ESR1, EZH2, FOXP1, FOXP2, GATA1, IRX4, KLF2, NFATC1, PCNA, TERT, 및 WRN)를 포함하는 인간 줄기 세포-관련 전사 인자의 발현을 입증하였다(도 4h).
추가의 RT2 Profiler PCR Array 분석은 인간 혈소판의 미토콘드리아 내의 인간 줄기 세포-관련 마커, 예를 들어, 세포 주기 조절인자(AXIN1, CCNA2, CCND1, CCND2, CDK1, CDC42, EP300, FGF2, MYC, NOTCH2, PARD6A, 및 RB1), 염색체 및 염색질 조절인자(KAT8, KAT7, RB1, 및 TERT), 유전자 조절 대칭/비대칭 세포 분열(DHH, NOTCH1, NOTCH2, NUMB, PARD6A), 자가-재생 마커(HSPA9, KAT8, KAT7, NEUROG2, SOX1, 및 SOX2), 사이토카인 및 성장 인자(BMP1, BMP3, CXCL12, FGF2, 및 JAG1), 유전자 조절 세포-세포 소통(DHH, GJB1, 및 JAG1), 세포 부착 분자(CD44, CDH1, COL9A1, CTNNA1, CXCL12, 및 NCAM1), 대사 마커(ALDH2), 배아 세포 계통 마커(ACTC1, ASCL2, FOXA2, ISL1, 및 KRT15), 중간엽 세포 계통 마커(ALPI, COL1A1, COL2A1, 및 COL9A1), 신경 세포 계통 마커(CD44, NCAM1, 및 SIGMAR1), 뿐만 아니라 줄기 세포의 유지에 기여하는 신호전달 경로, 예를 들어, notch 경로(DLL3, DTX1, DTX2, EP300, HDAC2, JAG1, NOTCH1, NOTCH2, 및 NUMB) 및 Wnt 경로(ADAR, AXIN1, BTRC, CCND1, FRAT1, FZD1, MYC, 및 PPARD)와 관련된 다수의 유전자의 발현을 입증하였다.
도 4h 및 4i의 레인 1 내지 6 각각은 6개의 별개의 혈소판 유사 세포 샘플로부터의 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. Clustergram에 제시된 유전자 각각은 6개의 혈소판 유사 세포 샘플 중 적어도 하나에서 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌다.
실시예 5. 혈소판 유사 세포는 인간 췌장 섬 β 세포-관련 마커를 나타낸다.
타입 1 당뇨병(T1D)은 췌장 섬 세포의 결핍을 유발하는 T 세포-매개 자가면역 질환이다. 전 세계적으로 수백만 명이 사람이 T1D를 가지며, 상이한 집단 사이에서 매년 발병률이 증가하고 있다. 인간 유도 다능성 줄기 세포(hiPSC) 또는 배아 줄기(ES) 세포주로부터 분화된 기능성 섬 세포의 섬 이식, 세포 재생의 약물-매개 촉진, 및 이식이 제안되었고, T1D를 치료하기 위한 가능성 있는 접근법으로서 시험되었다(Pagliuca FW, et al., Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell 2014, 159: 428-439; Quiskamp N, et al., Differentiation of human pluripotent stem cells into beta-cells: Potential and challenges. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2015, 29: 833-847). 그러나, 공여자의 부족, 면역 거부, 및 순환에서의 자가반응성 효과기 T 세포 및 B 세포의 지속된 존재는 이들 접근법을 통해 생성된 인슐린-생성 세포를 파괴하여 이의 치료 잠재성을 최소화할 수 있다. 이들 장벽을 우회하기 위해, 면역억제 약물, 숙주 면역 반응의 조작, 및 면역 키메라증의 구성을 포함하는 여러 접근법이 연구되고 있다.
본 발명의 연구 가설은 세포 접촉을 통한 제대혈의 혈소판 풍부 분획으로 재프로그래밍된 성체 세포가 이후에 기능성 섬 세포로 분화할 수 있는 혈소판 유도 다능성 줄기 세포(PiPS)를 생성시킬 수 있다는 것이다. 바이러스- 또는 약물-유도 형질도입에 의한 iPS 세포의 생성과 관련된 안전성 우려로 인해, 제대혈의 혈소판 풍부 분획은 단백질 및 mRNA 전달 및 형질도입을 위한 매력적인 대안일 수 있어, 훨씬 개선된 안전성 프로파일을 갖는 세포 재프로그래밍 및 면역 조절을 발생시킨다.
글루코스 항상성
일반적으로, 글루코스 섭취 후, 형질 글루코스 농도의 증가는 인슐린 방출을 촉진하고, 이는 내장(간 및 위장 조직) 및 말초 글루코스 흡수를 자극하고, 내인성(주로 간) 글루코스 생성을 억제한다. 건강한 성체에서, 혈당 수준은 70 내지 99 mg/dL의 범위 내로 엄격하게 조절되고, 특정 호르몬(예를 들어, 인슐린, 글루카곤, 인크레틴) 뿐만 아니라 중추신경계 및 말초신경계에 의해 유지되어 대사 요건을 충족시킨다. 뇌, 근육, 위장관, 간, 신장 및 지방 조직 내의 다양한 세포 및 조직은 또한 흡수, 대사, 저장 및 분비에 의해 혈당 조절과 관련된다[DeFronzo R.A., "Pathogenesis of type 2 diabetes mellitus" Med. Clin. N. Am., Vol. 88: 787-835 (2004)]; Gerich J.E., "Physiology of glucose homeostasis", Diabetes Obes. Metab. Vol. 2: 345-350, (2000)]. 정상 생리 환경 하에서, 글루코스 수준은 고-탄수화물 식사의 섭취 후에도 거의 140 mg/dL 이상으로 증가하지 않는다.
강력한 항지질분해(지방 분해 억제) 호르몬인 인슐린은 인슐린-민감성 세포로의 글루코스의 수송을 촉진하고, 췌장의 랑게르한스 섬 내에서의 글리코겐합성(글루코스의 글리코겐으로의 전환) 및 지방형성(지방 형성)을 통한 저장 화합물로의 이의 전환을 촉진함으로써 혈당 수준을 감소시키는 것으로 공지되어 있으며, β-세포는 인슐린을 생성한다.
글루코스 항상성에서 또한 역할을 하는 호르몬인 글루카곤은 낮은 정상 글루코스 수준 또는 저혈당증에 대해 반응하여 랑게르한스 섬 내에서 α-세포에 의해 생성되며, 글리코겐분해를 가속화하고, 글루코스신합성을 촉진함으로써 글루코스 수준을 증가시키는 작용을 한다. 글루코스-함유 식사 후, 글루카곤 분비는 고인슐린혈증에 의해 억제되며, 이는 간 글루코스 생성의 억제 및 정상 식후 글루코스 부하의 유지에 기여한다.
글루코스-의존성 인슐린자극 폴리펩티드(GIP) 및 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1)을 포함하는 인크레틴이 또한 인슐린 및 글루카곤에 대한 이의 효과에 의해 부분적으로 혈당 조절에 관여한다[Drucker D.J. et al., "The incretin system: glucagon-like peptide-1 receptor agonists and dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in type 2 diabetes", Lancet, Vol. 368: 1696-1705, (2006)]. GLP-1 및 GIP 둘 모두는 글루코스-의존성 호르몬으로 간주되며, 이는 이들이 글루코스 수준이 정상 공복 혈장 글루코스 수준 이상으로 증가하는 경우에만 분비됨을 의미한다. 일반적으로, 이들 호르몬은 식사에 반응하여 방출되며, 췌장 β-세포 상의 특정 수용체를 활성화시킴으로서, 이들은 인슐린 분비 자극에 도움을 준다. 그러나, 글루코스 수준이 낮은 경우, GLP-1 및 GIP 수준(및 인슐린 분비에 대한 이들의 자극 효과)이 감소된다[Drucker D.J., "The biology of incretin hormones", Cell Metab. Vol. 3: 153-165, (2006)].
프리프로글루카곤-유래 펩티드 글루카곤인 GLP1 및 GLP2는 프리프로글루카곤 유전자에 의해 인코딩되며, 이는 중추신경계, 장 L-세포, 및 췌장 및 위 α-세포에서 발현된다. 프로호르몬 전환효소(PC)에 의한 번역후 절단은 모든 이들 펩티드를 발생시키는 프리글루카곤 호르몬의 성숙을 담당한다. 각각의 조직에서의 상이한 PC 서브타입의 발현은 각각의 상이한 펩티드의 생성을 매개한다. α-세포에서, 프로단백질 전환효소 섭틸리신/켁신 타입 2(PCSK2)의 우세는 생성물 글리센틴(glicentin), 글리센틴-반복 췌장 폴리펩티드, 개재 펩티드 1 및 주요 프로글루카곤 단편과 함께 글루카곤의 생성을 발생시킨다[Dey A. et al., "Significance of prohormone convertase 2, PC2, mediated initial cleavage at the proglucagon interdomain site, Lys70-Arg71, to generate glucagon", Endocrinol., Vol. 146: 713-727, (2005)]. 장 내분비 세포에서, PCSK1/3 효소는 프리프로글루카곤 호르몬을 절단하여 글리센틴, 개재 펩티드 1 및 옥신토모둘린과 함께 GLP1 및 GLP2를 생성시킨다[Mojsov S., "Preproglucagon gene expression in pancreas and intestine diversifies at the level of post-translational processing", J. Biol. Chem., Vol. 261: 11880-11889 (1986)]. 특정 조건하에서, 섬 α 세포는 GLP-1 생성을 위한 장외 부위이다[Portha B. et al., "Activation of the GLP-1 receptor signalling pathway: a relevant strategy to repair a deficient beta-cell mass", Exptl Diabetes Res. Article 376509: 1-11, (2011)]. GLP-1의 많은 관찰된 세포 효과 중 하나는 전압-의존성 칼슘 채널을 통한 Ca2+ 유입을 개시시키고, 인슐린의 세포외 방출을 촉발시키는 β-세포 KATP 채널의 억제이다[MacDonald P.E. et al., "The multiple actions of GLP-1 on the process of glucose-stimulated insulin secretion", Diabetes, Vol. 51 (Suppl. 3): S434-S442, (2002)].
세포로의 글루코스의 수송
글루코스는 모든 세포막을 통해 용이하게 확산될 수 없으므로, 이는 대부분의 세포에 진입하기 위해 인슐린 및 수송 단백질(촉진된 글루코스 수송체[GLUT] 분자)의 계열 둘 모두로부터의 도움을 필요로 한다[Bryant, et al, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. "Regulated transport of the glucose transporter GLUT 4", Vol. 3(4): 267-277, (2002)]. GLUT는 글루코스가 더욱 용이하게 이동할 수 있는 달리 소수성인 세포막을 가로지르는 수성 포어를 형성한다. 12개의 공지된 GLUT 분자 중, GLUT4은 지방, 근육, 및 심장 조직에 대한 주요 수송체로 간주되는 반면, GLUT 1, 2, 3, 및 8은 다른 기관(예를 들어, 뇌, 간)으로의 글루코스 진입을 촉진한다. GLUT4의 활성화, 및 차례로 근육 및 지방 조직으로의 촉진된 글루코스 확산은 인슐린의 존재에 의존적인 반면, 다른 GLUT의 기능은 인슐린에 더욱 독립적이다[Uldry M. et al., "The SLC2 family of facilitated hexose and polyol transporters", Thorens B, Eur. J. Physiol. 2004; Vol. 447: 480-489, (2004)].
말초 조직에서의 대부분의 글루코스 흡수(80% 이상)는 근육에서 발생하며, 여기서 글루코스는 에너지를 위해 즉시 사용되거나 글리코겐으로서 저장될 수 있다. 골격근은 인슐린-의존적이며, 따라서 글리코겐의 생성을 조절하는 주요 효소인 글리코겐 신타제의 활성화를 위해 인슐린을 필요로 한다. 지방 조직은 말초 글루코스 흡수의 훨씬 적은 양을 담당하는 반면(2%-5%), 이는 저장된 트리글리세라이드로부터의 자유 지방산(글루코스신합성을 증가시킴)의 방출을 조절하여 근육 및 간에서의 인슐린 민감성에 영향을 줌으로써 전신 글루코스 항상성의 유지에 중요한 역할을 한다.
간은 글루코스 흡수를 촉진하기 위해 인슐린을 필요로 하지 않으나, 글루코스 생산을 조절하기 위해 인슐린을 필요로 한다. 따라서, 예를 들어, 인슐린 농도가 낮은 경우, 간 글루코스 생산이 증가한다. 또한, 인슐린은 간이 흡수된 글루코스 대부분을 글리코겐의 형태로 저장하는 것을 돕는다.
신장은 순환으로의 글루코스의 방출(글루코스신합성), 신장 에너지 요구를 충족시키기 위한 순환으로부터의 글루코스의 흡수, 및 근위 세관에서의 글루코스의 재흡수를 통해 글루코스 항상성에 역할을 한다. 신장은 또한 소변에서의 배설을 촉진함으로써 과량의 글루코스(수준이 약 180 mg/dL을 초과하는 경우, 이러한 임계값은 만성 고혈당증 동안 상승할 수 있음)의 제거를 돕는다.
인간 섬의 세포구조
인간 섬에서, 인슐린-함유 β-세포는 섬 내의 다른 세포 유형과 혼합되어 있으며, 즉, 인슐린-, 글루카곤-, 및 소마토스타틴-함유 세포는 인간 섬 전체에 걸쳐 분포되어 있는 것으로 밝혀졌다[Cabrera O. et al., "The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function", Proc. Natl Acad. Sci. U.S., Vol. 103: 2334-2339, (2006)]. 인간 섬은 명백한 구획을 나타내지 않지만, α-세포의 90%는 β-세포와 직접 접촉하며, β-세포는 섬 전체에 걸쳐 다른 내분비 세포와 자유롭게 혼합되어 있다. β, α, 및 δ-세포는 섬 내의 혈관에 동등하고 무작위적으로 접근하며, 이는 상이한 내분비 세포가 혈관 주위의 층으로 조직될 가능성을 배제한다. 이들 결과는 섬 관류의 설정 순서가 없고, 임의의 제공된 세포 유형이 자체 세포 유형을 포함하여 다른 세포 유형에 영향을 미칠 수 있다는 모델을 지지한다[G. da Silva Xavier et al.," Per-arnt-sim (PAS) domain-containing protein kinase is downregulated in human islets in type 2 diabetes and regulates glucagon secretion", Diabetologia, Vol. 54: 819-827, (2011)].
자가면역 질환으로서의 당뇨병
당뇨병은 고혈당증을 특징으로 하는 대사 질환 그룹이다. 만성 고혈당증은 안구, 신장, 신경, 심장 및 혈관을 포함하는 기관의 장기간의 손상, 기능장애, 및 잠재적 기능부전과 관련된다. 당뇨병을 치료하기 위한 이상적인 치료제는 아직 개발되지 않았다.
타입 1 당뇨병(T1D)
타입 1 당뇨병에서, β 세포는 자가면역 과정에 의해 파괴되며, 대체로 α-세포로 대체된다. [Unger R.H. et al., "Paracrinology of islets and the paracrinopathy of diabetes", Proc. Natl Acad. Sci., U.S., Vol. 107(37): 16009-16012, (2010)]. 이들 α-세포는 병렬된 β-세포로부터의 인슐린의 높은 국소 농도에 의해 일반적으로 제공되는 긴장 억제가 결여되어 부적절한 고글루카곤혈증을 발생시키며[Raskin P. et al. Glucagon and diabetes. The Medical Clinics of North America 62, 713 (1978)]; [Habener J. F. et al., "Alpha cells some of age", Trends in Endocrinology & Metabolism: TEM Vol. 24, 153-163 (2013)]; [Unger R.H. et al., "Glucagonocentric restructuring of diabetes: a pathophysiologic and therapeutic makeover", J. Clinical Investig. Vol. 122(1): 4-12, (2012)]; [Vuguin P.M. et al. "Novel insight into glucagon receptor action: lessons from knockout and transgenic mouse models", Diabetes, Obesity & Metabolism, Vol. 13(1), 144-150, (2011)], 이는 글루카곤 분비를 증가시키는 고혈당증의 급상승을 유발시킨다[Unger R.H. et al., "Glucagonocentric restructuring of diabetes: a pathophysiologic and therapeutic makeover", J. Clinical Investig. Vol. 122(1): 4-12, (2012)]. 정상 섬에서 인접한 β-세포가 α-세포에 주는 인슐린을 매치시키기 위해 이상 인슐린 수준이 필요하다. 이는 대상체를 죽상경화증, 및 관상 동맥 질환의 차단 저해를 야기시키는 혈관벽에서의 저밀도 지질단백질(LDL)의 축적에 따라 상기 후유증을 증가시키는 저혈당증의 빈번한 발생빈도에 노출시키는 평생의 고인슐린혈증을 발생시킨다.
T1D의 4개의 병리학적 특징은 혈당 수준, 헤모글로빈 A1C , 글루카곤 및 C-펩티드이다.
T1D의 면역 기능장애는 복잡하며, 췌장 섬 및 췌장 외부 둘 모두에 영향을 미친다. 면역계의 상이한 성분[예를 들어, CD4+, CD8+ T 세포, T 조절성 세포(Treg), B 세포, 수지상 세포(DC), 단핵구/대식세포(Mo/Mφ), 자연 살해 T 세포(NKT)]은 모두 T1D의 자가면역 반응에 활발히 기여할 것으로 예견되며, 따라서 상기 질환을 갖는 개체 전체에서 작용할 효과적이고 성공적인 치료 또는 치료법을 개발하려는 잠재적 노력을 복잡하게 만든다. 여러 임상 시험[Bach J.F., "Anti-CD3 antibodies for type 1 diabetes: beyond expectations", Lancet., Vol. 378: 459-460, (2011)]; [Wherrett D.K. et al., "Antigen-based therapy with glutamic acid decarboxylase (GAD) vaccine in patients with recent-onset type 1 diabetes: a randomized double-blind trial", Lancet., Vol. 378: 319-327, (2011)]은 T1D에 대한 요법을 개발하고 치료법을 찾는데 있어서의 장애를 강조하며, 면역계의 하나 또는 몇 가지 구성요소의 췌장 효과를 표적화하기보다는 국소 췌장 및 전신 수준 둘 모두에서의 포괄적인 면역 조절을 발생시키는 접근법의 필요성을 지적한다.
T1D에서의 자가면역을 위한 가능한 촉발제는 자가면역의 발달을 독립적으로 또는 공동으로 개시시키거나 강화시키는 작용을 할 수 있는 유전적, 후성적, 신체적, 사회적, 및 환경적 요인을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 면역계에서의 T1D-관련 기능장애는 T 세포, B 세포, 조절성 T 세포(Treg), 단핵구/대식세포, 수지상 세포(DC), 자연 살해(NK) 세포, 및 자연 살해 T(NKT) 세포를 포함하는 다수의 세포 유형 및 표적에서의 기능장애에 대해 추적되었다[Lehuen A. et al., "Immune cell crosstalk in type I diabetes", Nat Rev Immunol. Vol. 10: 501-513, (2010)]. T1D-관련 자가면역 반응의 폴리클로날 특성 및 T1D 환자에서의 면역 조절의 총체적 난제로 인해, 자가면역 반응의 하나 또는 몇 가지 구성요소만을 표적으로 하는 요법 및 시험이 T 세포에 대한 항-CD3 Ab, B 세포에 대한 항-CD19 Ab, 및 GAD 65 예방접종을 포함하는 최근의 시험이 실패한 바와 마찬가지로 실패할 가능성이 있다[Bach J.F., "Anti CD-3 antibodies for type 1 diabetes: beyond expectations", Lancet, Vol. 378: 459-460, (2011)]; [Mathieu C. et al., "Arresting type I diabetes after diagnosis: GAD is not enough", Lancet, Vol. 378: 291-292, (2011)].
줄기 세포 요법은 파괴된 췌장 섬 β-세포를 대체하는 수단으로 연구되어 왔으나, 이러한 접근법은 근본적인 자가면역 반응의 감소가 없으면 거의 효과가 없다.
T1D 환자에서의 자가면역 반응의 폴리클로날 특성 및 면역 조절의 총체적 난제로 인해[Zhao Y. et al., "Human cord blood stem cells and the journey to a cure for type 1 diabetes", Autoimmun Rev., Vol. 10: 103-107, (2010)]; [Abdi R. et al., "Immunomodulation by mesenchymal stem cells: a potential therapeutic strategy for type 1 diabetes", Diabetes, Vol. 57: 1759-1767, (2008)]; [Aguayo-Mazzucato C. et al., "Stem cell therapy for type I diabetes", Nat Rev Endocrinol., Vol. 6: 139-148, (2010)]; [Uccelli A. et al., "Mesenchymal stem cells in health and disease", Nat Rev Immunol., Vol. 8: 726-736, (2008)]; [Zhao Y. et al.," Immune regulation of T lymphocyte by a newly characterized human umbilical cord blood stem cell", Immunol Lett., Vol. 108: 78-87, (2007)], T1D에서의 근본적인 자가면역을 다루기 위한 시도는 성공적이지 못했다[Zhao Y. et al., "Human cord blood stem cells and the journey to a cure for type 1 diabetes", Autoimmun Rev., Vol. 10: 103-107, (2010)]. 이들 난제를 다루기 위해 개별적 접근법의 조합이 제안되었으나[Aguayo-Mazzucato C et al., "Stem cell therapy for type I diabetes mellitus", Nat Rev Endocrinol, Vol. 6: 139-148, (2010)]; [Zhao Y. et al., "Human cord blood stem cell-modulated regulatory T lymphocytes reverse the autoimmune-caused type 1 diabetes in nonobese diabetic (NOD) mice", PLoS ONE, Vol. 4: e4226, (2009)]; [Zhao Y. et al., "Reversal of type 1 diabetes via islet β-cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells", BMC Med. Vol. 10(3), 1-11, (2012)], 이들 접근법에 대한 고수는 여전히 복잡하고, 종종 비용이 많이 든다.
타입 2 당뇨병
타입 2 당뇨병(T2D)은 β-세포가 존재하고, 따라서 타입 1 당뇨병과 구별되는 고혈당 장애이다. 다수의 요인이 T2D의 발달에 기여하나, 호르몬 작용의 복잡한 경로에서 하나 이상의 지점에서 부적절한 인슐린 분비(인슐린 결핍) 및/또는 인슐린에 대한 감소된 조직 반응(인슐린 내성)이 중추적인 결함이다[Triplitt C.L., "Examining the mechanisms of glucose regulation", Am. J. Manag. Care, Vol. 18 (1 Suppl) S4-S10, (2012)]. 인슐린 결핍 및 인슐린 내성은 종종 공존하나, 고혈당증에 대한 기여는 T2D의 스펙트럼에 따라 매우 가변적일 수 있다.
T2D의 병인이 췌장 섬 β-세포에 영향을 미치는 염증을 개시하는 자가면역 성분을 포함한다는 증거가 존재하며, 이는 면역 조절을 통한 인슐린 내성의 메커니즘 및 잠재적 치료에 대한 새로운 통찰을 제공한다. 일부 임상 연구는 T2D 환자[Jagannathan-Bogdan M. et al., "Elevated proinflammatory cytokine production by a skewed T cell compartment requires monocytes and promotes inflammation in type 2 diabetes", J Immunol, Vol. 186: 1162-1172, (2011)] 및 비만 환자[Sumarac-Dumanovic M. et al.," Increased activity of interleukin-23/interleukin-17 proinflammatory axis in obese women", Int J Obes (Lond), Vol. 33: 151-156, (2009)]에서의 IL-17 생성의 증가하는 수준을 나타내었다. 다른 연구는 TH1-관련 사이토카인 IL-12의 수준이 T2D 대상체에서 증가되는 것을 나타낸다[Wu H.P. et al., "High interleukin-12 production from stimulated peripheral blood mononuclear cells of type 2 diabetes patients", Cytokine, Vol. 51: 298-304, (2010)].
혈소판-유사 세포 및 인간 췌장 β 세포-관련 마커
본 발명자는 혈소판-유사 세포를 포함하는 제대혈로부터의 혈소판-풍부 분획이 말초 혈액 세포를 재프로그래밍하는데 사용될 수 있는 지의 여부, 및 재프로그래밍된 세포가 분화하여 당뇨병 대상체의 췌장 섬에서 β 세포의 현존/고갈 집단을 보충할 수 있는지의 여부를 조사하는데 관심이 있었다.
혈소판 유사 세포가 섬 β 세포의 재생에 기여할 수 있는지의 여부를 조사하기 위해, 본 발명자는 RT-PCR에 의해 인슐린 및 C-펩티드 생성, 전사 인자(MAFA, PDX1, NKX6.1, NEUROD1, 및 NGN3), KATP 채널 단백질(Sur1 및 Kir6.2) 및 글루코키나제(GCK)를 포함하는 인간 섬 β 세포-특이적 마커를 검사하였다. 제대혈로부터의 혈소판-유사 세포를 상기 기재된 바와 같이 분리시키고, 실시간 PCR 및 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
실시간 PCR 데이터는 CB-유래 혈소판(n=6)에서 인슐린, MAFA, 및 Sur1 mRNA의 발현을 나타내었다. Kir 6.2 mRNA는 대부분의 샘플(5/6)에서 제시된 반면, GSK에 대해서는 양성인 샘플이 거의 없었다(1/6)(도 5a 및 b). 동일 샘플에서, PDX1, NKX6.1, NEUROD1, 및 NGN3의 발현이 없거나 매우 약했다(도 5b). CB-유래 혈소판 유사 세포는 췌장 섬 δ 세포-방출 호르몬 소마토스타틴 및 ε 세포 마커 Ghrelin mRNA를 나타내었으며, 글루카곤 및 PPY mRNA의 발현은 매우 약하거나 없었다(도 5a). 인간 섬 세포의 RT-PCR을 양성 대조군으로서 CB-혈소판 유사 세포의 RT-PCR과 동시에 수행하였다(도 5a 및 b, 우측 패널). 각각의 패널의 우측의 값은 상대 강도 단위의 인간 섬 세포 밴드의 정량된 강도를 나타낸다.
웨스턴 블로팅은 단백질 수준의 성숙 베타 세포 마커 MAFA의 발현을 추가로 입증하였다(도 5c). 각각의 블롯의 우측에 있는 숫자는 상대 강도 단위의 확인된 단백질의 정량된 평균 양을 나타낸다.
양성 대조군으로서 새로이 분리된 인간 췌장 섬 세포를 이용하여(도 5d), 흐름세포측정법은 CD42+인슐린+(63.07%) CD42+C-펩티드+(65.14%), CD41+MAFA+(20.12%), CD42+PDX1+(0.28%), CD42+NKX6.1+(0.3%), 및 CD42+글루카곤 1+(2.82%)과 같은 제대혈 유래 혈소판 유사 세포의 프로파일에서 췌장 세포 마커의 발현을 확인하였다(도 5e 및 5f). 또한, 흐름세포측정법은 CD42+PTFA1+(13.02%), CD42+FoxA2+(0.34%), 및 CD42+Sox17+(0.48%)와 같은 정상 β-세포 발달-관련 전사 인자의 낮은 발현을 나타내었다(도 5f).
성인 인간 말초 혈액-유래 혈소판 유사 세포에서의 추가 연구는 제대혈-유래 혈소판 유사 세포에서의 것과 유사한 마커 및 패턴의 발현을 입증하였다(도 5g-j). 제대혈 유래 샘플과 대조적으로, 말초 혈액 유래 샘플의 GSK mRNA는 대부분의 샘플(5/6)에서 나타났다. SST에 대해 양성인 샘플이 거의 없었고(1/6), Sur1의 발현은 없었다(도 5g).
제대혈 유래- 및 말초 혈액 유래-샘플의 공초점 현미경검사는 혈소판의 치밀 과립 및 α 과립과 같은 세포질 내에서의 통상적인 인슐린 과립 형성이 없음을 확인하였다(도 5k). 도 5k에 제시된 바와 같이, 많은 혈소판의 시야가 인슐린(청색), 치밀 과립 마커 ADP(적색), 및 알파-과립 마커 vWF(녹색)에 대해 면역염색되었다. 형광 이미지는 과립 형성을 나타내지 않는다. 축척 막대는 5 마이크론의 길이를 나타낸다. 개별 혈소판은 약 2 마이크론의 길이이다. 상단 패널의 백색 점선 박스는 중간 패널에서 관찰된 확대된 영역을 나타낸다(도 5k 참조). 오렌지색 점선 박스는 실험군과 동일한 노출 시간으로 동형 매치된 대조군 IgG를 이용한 프로빙 후의 시야를 제시한다. 도 5k에 도시된 데이터는 6개의 별개의 실험으로부터 획득된 혈소판 유사 세포의 대표 데이터이다. 이들 데이터는 인간 혈소판에서의 섬 β-세포-관련 마커의 발현이 섬 β 세포의 분화 및 재생을 촉진하는 더 높은 잠재성을 발생시킨 것을 나타내었다.
이전 연구에서 말초 혈액 인슐린-생성 세포(PB-IPC)로 명명된 성인 인간 혈액으로부터의 신규한 세포 집단을 확인하였다. 시험관 내 및 생체 내 실험은 PB­ IPC가 당뇨병 마우스로의 이식 후 고혈당증을 감소시키고, 췌장 섬으로 이동할 수 있음을 입증하였다(Zhao Y, et al., A unique human blood-derived cell population displays high potential for producing insulin (Biochem Biophys Res Commun 2007, 360: 205-211).
기재된 데이터는 제대혈 혈소판-유사 세포를 포함하는 제대혈로부터의 혈소판-풍부 분획이 PB-IPC와 접촉될 수 있고, 이는 이후 기능성 섬 세포-유사 세포로 분화하도록 촉진될 수 있음을 나타낸다. 또한, 기재된 데이터는 제대혈 혈소판-유사 세포를 포함하는 제대혈로부터의 혈소판-풍부 분획과 접촉된 성체 단핵 세포가 PB-IPC를 발생시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 6. 혈소판에 의해 방출된 미토콘드리아는 인간 췌장 섬의 기능 및 생존을 개선시킨다 .
새로이 분리된 인간 췌장 섬을 Lonza(San Francisco, CA)로부터 구입하였다. 췌장 섬을 실온에서 5분 동안 0.25% 트립신/EDTA를 이용하여 단일 세포로 분리시켰다. 췌장 섬 세포(1 x 105 세포/ml)를 0.4 μm 포어 크기를 갖는 트랜스웰 배양 시스템(EMD Millipore, Billerica, MA)의 상단 삽입부에 시딩하였다. 췌장 섬을 MitoTracker Deep Red-표지된 혈소판 유사 세포와 공동 배양하였고, 이를 트랜스웰 배양 시스템의 하단 챔버에 놓았다. 섬 세포를 1, 2, 4, 6, 20, 24시간에서 동역학 흐름세포측정법을 위해 상이한 시점에 수집하였다. 7일 후, 처리 및 미처리 섬 세포를 수집하여 TC20 자동화 세포 계수기(Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 세포 생활력 및 살아 있는 세포 수를 검사하였다.
미토콘드리아를 Qproteome Mitochondria Isolation 키트(Qiagen, Hidden, Germany)를 이용하여 혈소판 유사 세포로부터 분리시켰다. 전체 췌장 섬 세포를 웰 당 125 섬 당량(IEQ)으로 트랜스웰(0.4 μm 포어 크기)의 상단 챔버에 시딩하고, 혈소판 유사 세포로부터 유래된 분리된 미토콘드리아(250 μg/ml, 하단 웰)로 37℃, 8% CO2에서 처리하고, 이를 트랜스웰의 하단 챔버에 시딩하였다. 췌장 섬 배지(Lonza)에서만 배양된 췌장 섬을 대조군으로 사용하였다. 섬의 배양 7일 후, 미토콘드리아 처리 및 미처리 섬을 흐름세포측정법, 세포 생활력, 및 인슐린/C-펩티드 방출과 같은 기능 연구를 위해 각각 수집하였다.
분리된 췌장 섬 세포를 30분 동안 37℃에서 20 μg/ml의 항-CD29 및/또는 20 μg/ml의 항-TLR4 Ab로 전처리하였다. 이후, 혈소판으로부터 분리된 MitoTracker Green-표지된 미토콘드리아(125 mg/ml)를 첨가하였다. 차단 Ab의 부재하에서 미토콘드리아와 함께 공동 배양된 섬 세포를 대조군으로 사용하였다. 5시간 후, 미토콘드리아-처리 및 미처리 섬 세포를 세척하고, PerFix-nc(원심분리 검정 없음) 키트(Beckman Coulter)를 이용하여 고정시키고, 투과화시킨 후, 흐름세포측정법을 위해 섬 β-세포 마커 인슐린으로 세포내 염색하였다.
흐름세포측정법은 혈소판 유사 세포가 기저 수준의 미토콘드리아를 방출할 수 있음을 나타내었다(도 6a). 도 6a에 제시된 바와 같이, 흐름세포측정법은 상기 기재된 바와 같이 혈소판 유사 세포로부터 획득된 게이팅된 미토콘드리아(전방 산란 및 측방 산란에 의해 결정됨)가 MitoTracker 형광 염색에 대해 양성인 것을 나타내었다.
혈소판 유사 세포를 미토콘드리아를 분리시키기 전에 아데닌 디-포스페이트(ADP), 아라키돈산(ARA), 및 트롬빈과 같은 다양한 혈소판 응집제로 자극하였다. 방출된 MitoTracker 염색된 미토콘드리아의 양을 임의의 형광 강도 단위로 정량하였다. 도 6b의 데이터는 형광 강도에 의해 측정된 바와 같은 방출된 미토콘드리아의 수준이 효능제 아데노신 디포스페이트(ADP) 및 아라키돈산(ARA)에 의해 증가되었으나, 트롬빈을 이용한 처리에 의해 감소된 것을 나타낸다(도 6b).
섬 및 혈소판 유사 세포를 트랜스웰 시스템에서 공동 배양하였다. 도 6c에 제시된 바와 같이, 인간 췌장 섬 세포를 트랜스웰의 상단 챔버에서 배양하고, 혈소판 유사 세포를 하단 챔버에 침착시켰다. 트랜스웰 공동-배양 시스템(도 6c)을 이용하여, 췌장 섬 세포를 1, 2, 4, 6, 20 또는 24시간 동안 공동-배양 후에 수거하고, 섬에 대한 미토콘드리아 결합의 동역학을 흐름세포측정법으로 결정하였다.
도 6d에 제시된 바와 같이, 흐름세포측정법 데이터는 하단 챔버에서 혈소판-유사 세포로부터 방출된 MitoTracker-표지된 미토콘드리아가 트랜스웰을 통과하여 상단 챔버 내의 췌장 섬 세포에 의해 흡수될 수 있음을 나타내었다. "수" y-축은 정량된 섬 세포를 나타내는 반면, 형광 강도(x-축)은 형광 염색된 미토콘드리아의 정량된 양을 나타낸다. 염색된 미토콘드리아를 흡수한 섬 세포의 백분율은 1시간에서 37.21%, 2시간에서 55.26%, 4시간에서 58.03%, 6시간에서 69.22%, 20시간에서 97.42%, 24시간에서 95.65%로 증가하였다.
다음으로, 섬 β 세포로의 미토콘드리아의 이동을 발생시키는 분자 메커니즘을 연구하였다. 흐름세포측정법은 혈소판 유사 세포-유래 미토콘드리아가 부착 분자 및 케모카인 수용체, 예를 들어, 섬유결합소, CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2), CXCR4, 및 케모카인 C-C 모티프 수용체 7(CCR7)을 강하게 발현하나, CD62L에 대해 음성인 것을 나타내었다(도 6e; 세로축은 각각의 부착 분자/수용체의 정량된 양을 나타내는 반면, 가로축은 MitoTracker 염색의 형광 강도를 나타냄).
흐름세포측정법에 의해, 인간 췌장 섬 β 세포는 섬유결합소 리간드 CD29(인테그린 β1), Toll-유사 수용체 4(TLR4), 및 TLR6를 발현하는 것을 나타내었다(도 6f; 세로축은 각각의 수용체의 정량된 양을 나타내는 반면, 섬 베타 세포는 가로축에서 정량된 인슐린의 발현에 의해 확인됨). 타입 II 막횡단 당단백질 CD38, 트롬보스폰딘 수용체 CD36, C-C 모티프 케모카인 리간드 2(CCL2), C-C 모티프 케모카인 수용체 CCR4, 및 CCR6의 낮거나 음성인 발현 수준이 있었다(도 6f).
어떠한 분자가 미토콘드리아와 섬 β 세포 사이의 상호작용에 관여하는지 결정하기 위해, 혈소판-유래 미토콘드리아를 CD29 및/또는 TLR4에 대한 차단 항체의 존재하에서 췌장 섬과 공동 배양하였다. 도 6g에 제시된 바와 같이, 데이터는 섬 β 세포에 의한 MitoTracker-표지된 미토콘드리아의 흡수가 CD29 및/또는 TLR4 Ab를 이용한 차단에 의해 현저히 감소된 것을 나타내었고, 이는 CD29 및 TLR4가 인간 섬 β 세포에 의한 미토콘드리아의 부착 및 흡수에 기여한다는 것을 나타낸다.
섬 β 세포에 대한 혈소판 유사 세포-유래 미토콘드리아의 생물학적 효과를 결정하기 위해, 트립신/EDTA-분리된 단일 췌장 섬 β 세포를 도 6c에 제시된 바와 같이 트랜스웰에서 혈소판과 공동 배양하였다. 결과는 세포 생활력 및 살아 있는 세포 수 둘 모두가 대조군 섬 세포에 비해 7일 동안의 공동 배양 후에 실질적으로 증가한 것을 나타내었다(도 6h 및 i). 미토콘드리아 처리된 섬은 미처리 대조군 섬과 비교하는 경우 세포 생활력에서 40% 초과의 증가를 가졌다(도 6h). 살아 있는 세포의 전체 수는 약 2.4 x 104 세포/mL에서 약 4.5 x 104 세포/mL로 증가하였다(도 6i).
전체 췌장 섬(트립신 처리된 분리된 세포와 반대됨)을 도 6j에 개략적으로 제시된 바와 같이 트랜스웰에서 분리된 미토콘드리아와 공동 배양하였다. 데이터는 섬 세포 생활력이 7일 동안 미토콘드리아의 존재하에서 통계적으로 유의한 양만큼 증가한 것을 나타내었다(도 6k). 평균 섬 크기의 정량화는 췌장 섬이 미토콘드리아를 이용한 처리 후에 통계적으로 유의한 양으로 확대된 것을 나타내었다(P = 0.026, 도 6l).
섬 β 세포의 C-펩티드 방출을 또한 연구하였다. 웰 당 125 IEQ의 새로이 분리된 인간 췌장 섬(Lonza, San Francisco, CA)(상단 삽입부)을 8% CO2에서 37℃에서 트랜스웰 삽입부를 갖는 12-웰 조직 배양-처리된 플레이트에서 혈소판-유래 미토콘드리아(250 μg/ml, 하단 웰)로 처리하였다. 췌장 섬 배지(Lonza)에서 배양된 미처리 췌장 섬을 대조군으로 사용하였다. 7일 후, 미토콘드리아-처리 및 미처리 췌장 섬을 각각 2 ml 코니컬 튜브(conical tube)로 수집하고, Kreb 완충액(137 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 25 mM NaHCO3, 0.1% BSA)으로 2회 세척한 후, 37℃ 조건에서 글루코스의 부재하에서 30분 동안 1 ml Kreb 완충액과 함께 인큐베이션하였다. Kreb 완충액을 제거한 후, 췌장 섬을 37℃ 조건에서 1시간 동안 300 μl Kreb 완충액/웰 중 상이한 농도의 글루코스(5.5 및 16.7 mM) 및/또는 10 μM 톨부타미드(Sigma)와 함께 인큐베이션하였다. 상층액을 인큐베이션 후에 각각의 그룹으로부터 수집하였다. 각각의 그룹의 C-펩티드 수준을 제조업체의 프로토콜에 따라 Quantikine ELISA 키트(R & D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 각각 검사하였다.
흐름세포측정법은 C-펩티드+Ki67+ 섬 β 세포의 백분율이 트랜스웰에서 7일 동안 혈소판-유래 미토콘드리아를 이용한 처리 후에 실질적으로 농축되었음을 나타내었다(도 6m). 배지 단독에서의 대조군 인간 섬의 약 23.38% ± 3.13가 C-펩티드 및 Ki67에 대해 양성인 반면, 미토콘드리아-처리된 인간 섬의 44.35% ± 8.15가 C-펩티드 및 Ki67에 대해 양성이었다.
기능 분석은 미토콘드리아-처리된 췌장 섬 β 세포가 상이한 인슐린 분비촉진제, 예를 들어, 높은 글루코스(16.7 mM) 및 톨부타미드에 반응하여 C-펩티드 방출을 유의하게 개선시킨 것을 입증하였다. 미토콘드리아 처리는 미토콘드리아 처리의 부재하에서의 대조군 섬 그룹의 기능적 결함을 교정하는 것을 나타내었다(도 6n). 섬 세포에 의한 인슐린의 분비를 자극하는 것으로 추측되는 톨부타미드는 5.5 mM 글루코스의 존재하에서 대조군 섬 세포에 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, 톨부타미드는 대조군에 비해 미토콘드리아-처리된 섬 세포에서 인슐린 분비를 유의하게 증가시켰다(도 6n, 우측 패널). 이론으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, 이들 데이터는 췌장 섬 β-세포 기능이 혈소판-유래 미토콘드리아를 이용한 처리 후에 개선되는 것을 나타낸다.
당뇨병 환자 췌장 조직의 추가의 면역조직화학 연구는 싱글렛(singlet) 또는 클러스터 형태의 췌장 섬 내의 혈소판의 존재를 나타내었다(도 6o). 인슐린 염색된 섬 세포(적색) 및 염색된 혈소판 유사 세포(녹색)는 서로 근접하여 발견되며, 개별 및 클러스터링된 혈소판을 갖는다. 이론으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, 당뇨병 환자에서 국소 혈소판으로부터의 미토콘드리아 방출은 섬 β-세포 기능의 개선을 발생시킬 수 있다.
기재된 발명은 이의 특정 구현예를 참조로 하여 기재되었으나, 본 발명의 진정한 사상 및 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 변화가 이루어질 수 있고 동등물이 대체될 수 있음이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 또한, 특정 상황, 물질, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 기재된 본 발명의 객관적 사상 및 범위에 채택하기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 모든 상기 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 해당하는 것으로 의도된다.

Claims (55)

  1. (a) 대상체로부터 췌장 섬 세포의 집단을 분리시키는 단계;
    (b) 제대혈로부터 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획을 분리시키는 단계로서, 상기 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획은 미토콘드리아를 포함하며, 상기 혈소판-유사 세포가 Sur1, 및 OCT3/4, NANOG, NKX6.1, MAFA, Kir6.2, PD-L1, CD270, Galectin 9, TGF-β1, AIRE, CCR3, CXCR4, 및 CCL2 중 하나 이상에 대해 양성이고, CXCL10, CCR4, CCR5, CCR7, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CD62L, 및 CXCL1 중 하나 이상에 대해 음성인 세포의 집단을 포함하는 것인, 단계; 및
    (c) 단계 (a)의 대상체로부터 분리된 췌장 섬 세포의 집단과 단계 (b)의 혈소판 풍부 분획을 시험관 내에서 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉이 췌장 섬 세포에 의한 미토콘드리아의 흡수(uptake)를 포함하며, 상기 접촉이 단계 (b)의 혈소판 풍부 분획과 접촉되지 않은 대조군 췌장 섬 세포에 비해 세포 생활력(cell viability), 살아 있는 세포 수, 세포 크기, 및 C-펩티드 방출 중 하나 이상을 증가시키기 위해 췌장 섬 세포를 재프로그래밍하는, 단계를 포함하는,
    췌장 섬 세포를 기능적으로 재프로그래밍하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, Ficoll-Paque 구배 분획으로부터 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획을 분리시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획이 전체 세포, 미세입자, 엑소솜, 용해된 세포, 및 알파 과립 중 하나 이상을 추가로 포함하는 방법.
  4. 삭제
  5. 제3항에 있어서, 전체 세포가 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 림프성 공통전구세포(CLP), 골수성 공통전구세포(CMP), 거대핵세포-적혈구 전구체, 과립구-단핵구 전구체, 거대핵세포 계통-위임된(lineage-committed) 전구체, 거대핵세포, 및 혈소판-유사 세포 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 혈소판-유사 세포가 OCT3/4, NANOG, NKX6.1, MAFA, Sur1, Kir6.2, PD-L1, CD270, Galectin 9, TGF-β1, AIRE, CCR3, CXCR4, 및 CCL2에 대해 양성이고, CXCL10, CCR4, CCR5, CCR7, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CD62L, 및 CXCL1에 대해 음성인 세포의 집단을 포함하는 방법.
  7. (a) 대상체로부터 췌장 섬 세포의 집단을 분리시키는 단계;
    (b) 제대혈로부터 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획을 분리시키는 단계로서, 상기 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획은 미토콘드리아를 포함하며, 상기 혈소판-유사 세포가 Sur1, 및 OCT3/4, NANOG, NKX6.1, MAFA, Kir6.2, PD-L1, CD270, Galectin 9, TGF-β1, AIRE, CCR3, CXCR4, 및 CCL2 중 하나 이상에 대해 양성이고, CXCL10, CCR4, CCR5, CCR7, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CD62L, 및 CXCL1 중 하나 이상에 대해 음성인 세포의 집단을 포함하는 것인, 단계;
    (c) 단계 (a)의 대상체로부터 분리된 췌장 섬 세포의 집단과 단계 (b)의 혈소판 풍부 분획을 시험관 내에서 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉이 췌장 섬 세포에 의한 미토콘드리아의 흡수(uptake)를 포함하며, 상기 접촉이 단계 (b)의 혈소판 풍부 분획과 접촉되지 않은 대조군 췌장 섬 세포에 비해 세포 생활력, 살아 있는 세포 수, 세포 크기, 및 C-펩티드 방출 중 하나 이상을 증가시키기 위해 췌장 섬 세포를 재프로그래밍하는, 단계;
    (d) 치료적 유효량의 췌장 섬 세포 집단을 함유하는 세포 생성물을 생성시키는데 효과적인 배양 조건하에서 시험관 내에서 단계 (c)의 재프로그래밍된 췌장 섬 세포를 확장시키는 단계; 및
    (e) 세포 생성물과 약학적으로 허용되는 담체를 제형화하여 약학적 조성물을 형성시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되는,
    약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 고혈당증 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 혈소판-유사 세포가 OCT3/4, NANOG, NKX6.1, MAFA, Sur1, Kir6.2, PD-L1, CD270, Galectin 9, TGF-β1, AIRE, CCR3, CXCR4, 및 CCL2에 대해 양성이고, CXCL10, CCR4, CCR5, CCR7, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CD62L, 및 CXCL1에 대해 음성인 세포의 집단을 포함하는 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 고혈당증 질환이 자가면역 질환인 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 자가면역 질환이 당뇨병인 약학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 자가면역 질환이 타입 1 당뇨병인 약학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 접촉이 단계 (b)의 혈소판 풍부 분획과 접촉되지 않은 췌장 섬 세포의 대조군 집단에 비해 세포 생활력, 살아 있는 세포 수, 세포 크기, 및 C-펩티드 방출을 증가시키기 위해 췌장 섬 세포의 집단을 재프로그래밍하는데 효과적인 방법.
  15. 삭제
  16. 제1항에 있어서, 미토콘드리아가 T 세포에 대한 면역 조절 활성을 발휘하기에 효과적인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 미토콘드리아가 CD4+PD1+ T 세포의 백분율을 증가시키기에 효과적인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 미토콘드리아에 의한 췌장 섬 세포 집단의 접촉이 췌장 섬 세포 집단의 기능 및 생존을 개선시키는데 효과적인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 미토콘드리아에 의한 췌장 섬 세포 집단의 접촉이 췌장 섬 베타 세포 집단의 기능을 개선시키는데 효과적인 방법.
  20. 제8항에 있어서, 췌장 섬 세포의 집단이 증가된 세포 생활력, 살아 있는 세포 수, 세포 크기, 및 C-펩티드 방출을 갖도록 기능적으로 재프로그래밍된 약학적 조성물.
  21. 제8항에 있어서, 혈소판-유사 세포를 포함하는 혈소판 풍부 분획이 전체 세포, 미세입자, 엑소솜, 용해된 세포, 및 알파 과립 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물.
  22. 삭제
  23. 제8항에 있어서, 미토콘드리아가 T 세포에 대한 면역 조절 활성을 발휘하기에 효과적인 약학적 조성물.
  24. 제8항에 있어서, 미토콘드리아가 CD4+PD1+ T 세포의 백분율을 증가시키기에 효과적인 약학적 조성물.
  25. 제8항에 있어서, 미토콘드리아에 의한 췌장 섬 세포 집단의 접촉이 췌장 섬 세포 집단의 기능 및 생존을 개선시키는데 효과적인 약학적 조성물.
  26. 제8항에 있어서, 미토콘드리아에 의한 췌장 섬 세포 집단의 접촉이 췌장 섬 베타 세포 집단의 기능을 개선시키는데 효과적인 약학적 조성물.
  27. 혈소판-유사 세포 미토콘드리아를 포함하며, 제1항의 방법에 의해 제조되며, 미토콘드리아가 Sur1, 및 OCT3/4, NANOG, NKX6.1, MAFA, Kir6.2, PD-L1, CD270, Galectin 9, TGF-β1, AIRE, CCR3, CXCR4, 및 CCL2 중 하나 이상에 대해 양성이고, CXCL10, CCR4, CCR5, CCR7, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CD62L, 및 CXCL1 중 하나 이상에 대해 음성인 기능적으로 재프로그래밍된 췌장 섬 세포.
  28. 제27항에 있어서, 미토콘드리아가 OCT3/4, NANOG, NKX6.1, MAFA, Sur1, Kir6.2, PD-L1, CD270, Galectin 9, TGF-β1, AIRE, CCR3, CXCR4, 및 CCL2에 대해 양성이고, CXCL10, CCR4, CCR5, CCR7, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CD62L, 및 CXCL1에 대해 음성인 췌장 섬 세포.
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