KR20200010424A - 배아 중간엽 전구 세포를 제조하고 사용하는 방법 - Google Patents

배아 중간엽 전구 세포를 제조하고 사용하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 비-클러스터링된 줄기 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 중배엽 분화 전의 클러스터 분열이 hEMP 및 T 세포 분화에서의 수율 및 효율을 증가시킨다. 따라서, 이러한 방법은 hEMP 및 T 세포 분화의 개선된 방법의 개발을 가능하게 한다.

Description

배아 중간엽 전구 세포를 제조하고 사용하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 5월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 62/511,907 및 2017년 6월 2일에 출원된 미국 가출원 번호 62/514,467에 대한 우선권을 주장하며, 이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
인간 암은 그의 특성상 비정상적 암 세포가 되는 유전적 또는 후성적 전환을 겪은 정상 세포로 구성된다. 그리하여, 암 세포는 정상 세포에 의해 발현되는 것들과는 구별되는 단백질 및 다른 항원을 발현하기 시작한다. 이들 이상 종양 항원은 신체의 면역계에 의해 암 세포를 특이적으로 표적화하고 사멸시키는데 사용될 수 있다. 그러나, 암 세포는 면역 세포, 예컨대 T 및 B 림프구가 암 세포를 성공적으로 표적화하는 것을 방해하기 위해 다양한 메카니즘을 이용한다.
현재의 T 세포 요법은 환자에서 암 세포를 표적화하고 사멸시키기 위해 풍부화 또는 변형된 인간 T 세포에 의존한다. 환자 또는 정상 공여자 유래된 T 세포는, 이들이 자기-재생이 결여되어 있기 때문에, 본질적으로 유한하다. 줄기 세포 기원으로부터의 T 세포의 유래는 치료 용도를 위한 세포의 잠재적으로 무한한 공급원을 제공할 것이다. 만능 줄기 세포의 배아 중배엽 전구세포 및 성숙 T 세포로의 분화를 위한 효율적인 시험관내 방법에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은, 특히, 인간 배아 중간엽 전구 (hEMP) 세포, 그의 유도체를 생성하기 위한 개선된 방법, 및 T 세포의 효율적인 생성을 위한 그의 용도를 제공함으로써 이러한 필요성을 해결한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 인간 배아 중간엽 전구 (hEMP) 세포를 생성하는 방법으로서, 규정된 단세포 밀도로 비-클러스터링된 줄기 세포를 기질과 접촉시키는 단계; 세포 성장을 목적하는 전면생장률까지 가능하게 하는 배양 조건 하에 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 배양 조건을 변형시켜 목적하는 인큐베이션 시간 동안 줄기 세포의 hEMP 세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함하며; 이에 의해 hEMP 세포를 생성하는 것인 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 비-클러스터링된 줄기 세포는 인간 배아 줄기 (ES) 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포이다. 일부 실시양태에서, ES 또는 iPS 세포는 인간 기원의 것이다.
일부 실시양태에서, ES 또는 iPS 세포는 H1 세포, H9 세포, HES3 세포, HSF1 세포, HSF6 세포, ESI-017 세포, CS02iCTR-NTn1 세포, CS03iCTR-NTn1 세포, CS80iCTR-Tn3 세포, CS179iCTR-NTn1 세포, CS201iCTR-NTn4 세포, CS202iCTR-NTn2 세포, 또는 CS206iCTR-Tn5 세포이다.
일부 실시양태에서, 규정된 단세포 밀도는 약 1.5x105 내지 약 8x105개 세포/cm2이다. 특정 실시양태에서, 규정된 단세포 밀도는 약 1.89x105개 세포/cm2, 약 3.2x105개 세포/cm2, 약 3.4x105개 세포/cm2, 약 3.6x105개 세포/cm2, 약 3.79x105개 세포/cm2, 약 7.2x105개 세포/cm2, 또는 약 7.58x105개 세포/cm2이다.
일부 실시양태에서, 기질은 매트리겔(Matrigel)® 또는 재조합 인간 비트로넥틴으로 코팅되나, 마우스 배아 섬유모세포 (MEF)로는 코팅되지 않는다. 일부 실시양태에서, 기질은 웰 플레이트, 세포 배양 디쉬, 막, 백, 배양 플라스크, 역 오팔, 중합체 격자, 정적 세포 현탁액, 진탕 세포 현탁액, 또는 혈장 처리된 중합체이다. 일부 실시양태에서, 기질은 막을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포 성장을 가능하게 하는 배양 조건은 줄기 세포를 mTeSR1 배지에서 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, mTeSR1 배지는 ROCK 억제제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, mTeSR1 배지는 ROCK 억제제 Y27632를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는 약 20% 내지 약 80%의 목적하는 전면생장률까지 성장된다. 일부 실시양태에서, 전면생장률은 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이다.
일부 실시양태에서, 배양 조건을 변형시키는 단계는 세포를 엑스-비보(X-VIVO)™ 15 배양 배지에서 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 약 2 내지 약 4일이다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5 또는 약 4.0일이다. 특정 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 약 3.5일이다.
일부 실시양태에서, 방법은 hEMP 세포를 T 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 줄기 세포의 클러스터를 분열시켜 비-클러스터링된 줄기 세포를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포의 클러스터는 기계적 또는 화학적 분열에 의해 분열된다. 일부 실시양태에서, 화학적 분열은 트립신-유사 효소 (트리플(TrypLE))와 함께 인큐베이션하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 트립신-유사 효소는 트립신, 트리플 익스프레스, 트리플 셀렉트, 콜라게나제, 디스파제 또는 트립신-EDTA이다.
일부 실시양태에서, 인간 배아 중간엽 전구 (hEMP) 세포가 본원에 기재된 방법에 따라 생성된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 인간 배아 중간엽 전구 (hEMP) 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 T 세포를 생성하는 방법으로서, 규정된 단세포 밀도로 비-클러스터링된 줄기 세포를 기질과 접촉시키며, 여기서 줄기 세포는 마우스 배아 섬유모세포 (MEF)를 포함하지 않는 것인 단계; 세포 성장을 목적하는 전면생장률까지 촉진하는 배양 조건 하에 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 배양 조건을 변형시켜 목적하는 인큐베이션 시간 동안 줄기 세포의 T 세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함하며; 이에 의해 줄기 세포로부터 T 세포를 생성하는 것인 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 줄기 세포는 인간 배아 줄기 (ES) 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포이다. 일부 실시양태에서, ES 또는 iPS 세포는 인간 기원의 것이다.
일부 실시양태에서, ES 또는 iPS 세포는 H1 세포, H9 세포, HES3 세포, HSF1 세포, HSF6 세포, ESI-017 세포, CS02iCTR-NTn1 세포, CS03iCTR-NTn1 세포, CS80iCTR-Tn3 세포, CS179iCTR-NTn1 세포, CS201iCTR-NTn4 세포, CS202iCTR-NTn2 세포, 또는 CS206iCTR-Tn5 세포이다.
일부 실시양태에서, 규정된 단세포 밀도는 약 1.5x105 내지 약 8x105개 세포/cm2이다. 특정 실시양태에서, 규정된 단세포 밀도는 약 1.89x105개 세포/cm2, 약 3.2x105개 세포/cm2, 약 3.4x105개 세포/cm2, 약 3.6x105개 세포/cm2, 약 3.79x105개 세포/cm2, 약 7.2x105개 세포/cm2, 또는 약 7.58x105개 세포/cm2이다.
일부 실시양태에서, 기질은 매트리겔® 또는 재조합 인간 비트로넥틴으로 코팅되나, 마우스 배아 섬유모세포 (MEF)로는 코팅되지 않는다. 일부 실시양태에서, 기질은 웰 플레이트, 세포 배양 디쉬, 막, 백, 배양 플라스크, 역 오팔, 중합체 격자, 정적 세포 현탁액, 진탕 세포 현탁액, 또는 혈장 처리된 중합체이다. 일부 실시양태에서, 기질은 막을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포 성장을 가능하게 하는 배양 조건은 줄기 세포를 mTeSR1 배지에서 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, mTeSR1 배지는 ROCK 억제제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, mTeSR1 배지는 ROCK 억제제 Y27632를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는 약 20% 내지 약 80%의 목적하는 전면생장률까지 성장된다. 일부 실시양태에서, 전면생장률은 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이다.
일부 실시양태에서, 배양 조건을 변형시키는 단계는 세포를 엑스-비보™ 15 배양 배지에서 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 약 2 내지 약 4일이다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5 또는 약 4.0일이다. 특정 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 약 3.5일이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 T 세포를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 T 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에 기재된 임의의 측면 또는 실시양태는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 다른 측면 또는 실시양태와 조합될 수 있다. 본 개시내용이 그의 상세한 설명과 함께 기재되어 있지만, 이러한 설명은 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의된, 본 개시내용의 범주를 제한하려는 것이 아닌 예시하기 위한 것으로 의도된다. 다른 측면, 이점 및 변형도 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
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상기 및 추가의 특색은 하기 상세한 설명으로부터 첨부 도면과 함께 참조할 때 보다 분명하게 인지될 것이다. 그러나, 도면은 단지 예시 목적을 위한 것이며, 제한을 위한 것은 아니다.
도 1은 표면 발현된 CD326 및 CD56에서의 변화를 예시하는 예시적인 유동 세포측정 데이터를 제시한다.
도 2는 표면 발현된 CD326 및 CD56에서의 변화를 예시하는 예시적인 유동 세포측정 데이터의 요약 그래프를 제시한다.
도 3은 ES 또는 iPS 세포로부터의 hEMP 세포의 생성을 위한 예시적인 흐름도를 제시한다.
도 4는 매트리겔® 및 비트로넥틴 기질 상에서 표면 발현된 CD326 및 CD56에서의 변화를 예시하는 예시적인 유동 세포측정 데이터를 제시한다.
도 5는 ES 또는 iPS 세포로부터의 hEMP 세포의 생성을 위한 예시적인 흐름도를 제시한다.
도 6은 유도되고 분류된 hEMP 세포의 순도를 예시하는 유동 세포측정 데이터를 제시한다. 분류 후 순도는 비-hEMP 및 hEMP 세포 둘 다에 대해 >95%로 결정되었다.
도 7은 제4주에서의 T 세포 발생의 분석을 예시하는 유동 세포측정 데이터를 제시한다. 수확된 세포는 하기 항원에 대한 항체로 염색되었다: CD45, CD56, CD3, CD4, CD8, TCRab.
정의
본 개시내용이 보다 용이하게 이해되도록 하기 위해, 특정 용어를 먼저 하기에 정의한다. 하기 용어 및 다른 용어에 대한 추가의 정의는 본 명세서 전반에 걸쳐 제시된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.
구체적으로 언급되거나 또는 문맥으로부터 명백하지 않은 한, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해되며 "또는"과 "및" 둘 다를 포함한다.
용어 "및/또는"은 본원에 사용된 경우에 2개의 명시된 특색 또는 구성요소 각각을 다른 하나와 함께 또는 그 없이 구체적으로 개시하는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 A 및 B, A 또는 B, A (단독), 및 B (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 하기 측면 각각을 포괄하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예를 들어" 및 "즉"은 의도된 제한 없이 단지 예로서 사용되며, 본 명세서에 명시적으로 열거된 항목들만을 지칭하는 것으로 해석되어서는 안된다.
용어 "이상", "적어도", "초과" 등, 예를 들어, "적어도 하나"는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 또는 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 언급된 값 초과의 값을 포함하나 이에 제한되지는 않는 것으로 이해된다. 또한 임의의 보다 큰 수 또는 이들 사이의 분수도 포함된다.
반대로, 용어 "이하"는 언급된 값보다 작은 각각의 값을 포함한다. 예를 들어, "100개 이하의 뉴클레오티드"는 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 및 0개의 뉴클레오티드를 포함한다. 또한 임의의 보다 작은 수 또는 이들 사이의 분수도 포함된다.
용어 "복수", "적어도 2", "2 이상", "적어도 두번째" 등은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 또는 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 그 초과의 값을 포함하나 이에 제한되지는 않는 것으로 이해된다. 또한 임의의 보다 큰 수 또는 이들 사이의 분수도 포함된다.
본 명세서 전반에 걸쳐 단어 "포함하는", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형어는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 배제하지는 않는다는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 측면이 언어 "포함하는"을 사용하여 기재된 모든 경우에, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"의 용어로 달리 기재된 유사한 측면이 또한 제공되는 것으로 이해된다.
구체적으로 언급되거나 또는 문맥으로부터 입증되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은, 부분적으로 값 또는 조성이 측정되거나 또는 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 좌우될, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정한 값 또는 조성에 대한 허용 오차 범위 내에 있는 값 또는 조성을 지칭한다. 예를 들어, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 기술분야에서의 실시마다 1 또는 1 초과의 표준 편차 내에 있다는 것을 의미할 수 있다. "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 최대 10%의 범위 (즉, ±10%)를 의미할 수 있다. 따라서, "약"은 언급된 값보다 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 또는 0.001% 더 크거나 또는 더 작은 범위 내에 있는 것으로 이해될 수 있다. 예를 들어, 약 5 mg은 4.5 mg 내지 5.5 mg의 임의의 양을 포함할 수 있다. 게다가, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 이 용어는 값의 최대 10배 또는 최대 5배를 의미할 수 있다. 특정한 값 또는 조성이 본 개시내용에서 제공되는 경우에, 달리 언급되지 않는 한, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"의 의미는 그 특정한 값 또는 조성에 대한 허용 오차 범위 내에 있는 것으로 가정되어야 한다.
본원에 기재된 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는, 달리 나타내지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수, 및 적절한 경우에 그의 분수 (예컨대 정수의 1/10 및 1/100)의 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 단위, 접두어 및 기호는 그의 국제 단위 시스템 (Systeme International de Unites (SI)) 채택 형태를 사용하여 제공된다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 기술분야의 통상의 기술자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Juo, "The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology", 2nd ed., (2001), CRC Press; "The Dictionary of Cell & Molecular Biology", 5th ed., (2013), Academic Press; 및 "The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology", Cammack et al. eds., 2nd ed, (2006), Oxford University Press]이 본 개시내용에서 사용된 용어 다수에 대한 일반적 사전을 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 제공한다.
"투여하는"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 작용제를 대상체에게 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 본원에 개시된 제제를 위한 예시적인 투여 경로는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의한, 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 비-비경구 경로를 통해, 예를 들어, 경구로 투여된다. 다른 비-비경구 경로는 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어, 비강내, 질, 직장, 설하 또는 국소 투여 경로를 포함한다. 또한, 투여는, 예를 들어, 1회, 복수 회, 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 항원 결합 분자, 항체, 또는 그의 항원 결합 분자는, 항원과 제1 결합 분자, 항체, 또는 그의 항원 결합 분자 사이의 상호작용이 참조 결합 분자, 참조 항체, 또는 그의 항원 결합 분자가 항원과 상호작용하는 능력을 차단, 제한, 억제, 또는 달리 저하시킨다면, 참조 항체 또는 그의 항원 결합 분자와 "교차-경쟁"한다. 교차 경쟁은 가능한 최대일 수 있으며, 예를 들어, 결합 분자의 항원에 대한 결합이 참조 결합 분자가 항원에 결합하는 능력을 완전히 차단하거나, 또는 이는 부분적일 수 있으며, 예를 들어, 결합 분자의 항원에 대한 결합이 참조 결합 분자가 항원에 결합하는 능력을 저하시킨다. 특정 실시양태에서, 참조 항원 결합 분자와 교차-경쟁하는 항원 결합 분자는 참조 항원 결합 분자와 동일하거나 또는 중복되는 에피토프에 결합한다. 다른 실시양태에서, 참조 항원 결합 분자와 교차-경쟁하는 항원 결합 분자는 참조 항원 결합 분자와 상이한 에피토프에 결합한다. 수많은 유형의 경쟁적 결합 검정, 예를 들어: 고체 상 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA); 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA); 샌드위치 경쟁 검정 (Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619); 고체 상 직접 표지 검정, 고체 상 직접 표지 샌드위치 검정 (Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); I-125 표지를 사용하는 고체 상 직접 표지 RIA (Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15), 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552), 및 직접 표지 RIA (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)가, 하나의 항원 결합 분자가 또 다른 것과 경쟁하는지를 결정하는데 사용될 수 있다.
"항원"은 면역 반응을 유발하거나, 또는 항체 또는 항원 결합 분자에 의해 결합되어 있을 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 면역 반응은 항체 생산, 또는 특정한 면역-적격 세포의 활성화, 또는 이들 둘 다를 수반할 수 있다. 관련 분야의 통상의 기술자는, 실질적으로 모든 단백질 또는 펩티드를 포함한 임의의 거대분자가 항원으로서 작용할 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 항원은 내인성으로 발현될 수 있으며, 즉, 게놈 DNA에 의해 발현될 수 있거나, 또는 재조합적으로 발현될 수 있다. 항원은 특정 조직, 예컨대 암 세포에 특이적일 수 있거나, 또는 광범위하게 발현될 수 있다. 추가로, 보다 큰 분자의 단편이 항원으로서 작용할 수 있다. 한 실시양태에서, 항원은 종양 항원이다.
용어 "동종"은, 동종 T 세포 이식과 같이, 하나의 개체로부터 유래되어, 이어서 동일한 종의 또 다른 개체에 도입되는 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "형질도입" 및 "형질도입된"은 외래 DNA가 바이러스 벡터를 통해 세포 내로 도입되는 과정을 지칭한다 (문헌 [Jones et al., "Genetics: principles and analysis," Boston: Jones & Bartlett Publ. (1998)] 참조). 일부 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, DNA 벡터, RNA 벡터, 아데노바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 엡스타인 바르 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터, 아데노바이러스 연관 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 그의 임의의 조합이다.
"암"은 신체 내 비정상 세포의 비제어된 성장을 특징으로 하는 다양한 질환의 광범위한 군을 지칭한다. 비조절된 세포 분열 및 성장은 이웃 조직을 침습하며 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 원위 부위로 전이할 수 있는 악성 종양의 형성을 초래한다. "암" 또는 "암 조직"은 종양을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 수 있는 암의 예는 면역계의 암 예컨대 림프종, 백혈병, 골수종, 및 다른 백혈구 악성종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은, 예를 들어, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 다발성 골수종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종 (NHL), 원발성 종격 대 B 세포 림프종 (PMBC), 미만성 대 B 세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종 (FL), 형질전환 여포성 림프종, 비장 변연부 림프종 (SMZL), 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) (비 T 세포 ALL 포함), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소아기 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피양암, 편평 세포암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유발된 것들을 포함한 환경적으로 유발된 암, 다른 B 세포 악성종양, 및 상기 암의 조합으로부터 유래된 종양의 종양 크기를 줄이는데 사용될 수 있다. 하나의 특정한 실시양태에서, 암은 다발성 골수종이다. 특정한 암은 화학요법 또는 방사선 요법에 대해 반응성일 수 있거나, 또는 암은 불응성일 수 있다. 불응성 암은 외과적 개입으로 치료가능하지 않은 암을 지칭하는 것이며, 암은 처음부터 화학요법 또는 방사선 요법에 대해 미반응성이거나 또는 암은 시간 경과에 따라 미반응성이 된다.
본원에 사용된 바와 같이, "항종양 효과"는 종양 부피에서의 감소, 종양 세포의 수에서의 감소, 종양 세포 증식에서의 감소, 전이 수에서의 감소, 전체 또는 무진행 생존에서의 증가, 기대 수명에서의 증가, 또는 종양과 연관된 다양한 생리학적 증상의 호전으로서 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. 항종양 효과는 또한 종양 발생의 예방, 예를 들어, 백신을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "시토카인"은 특정한 항원과의 접촉에 반응하여 하나의 세포에 의해 방출되는 비-항체 단백질을 지칭하며, 여기서 시토카인은 제2 세포와 상호작용하여 제2 세포에서의 반응을 매개한다. 시토카인은 세포에 의해 내인성으로 발현될 수 있거나, 또는 대상체에게 투여될 수 있다. 시토카인은 대식세포, B 세포, T 세포, 및 비만 세포를 포함한 면역 세포에 의해 방출되어 면역 반응을 전파할 수 있다. 시토카인은 수용자 세포에서 다양한 반응을 유도할 수 있다. 시토카인은 항상성 시토카인, 케모카인, 염증유발성 시토카인, 이펙터, 및 급성기 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인터류킨 (IL) 7 및 IL-15를 포함한 항상성 시토카인은 면역 세포 생존 및 증식을 촉진하고, 염증유발성 시토카인은 염증 반응을 촉진할 수 있다. 항상성 시토카인의 예는 IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-15, 및 인터페론 (IFN) 감마를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 염증유발성 시토카인의 예는 IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-13, IL-17a, 종양 괴사 인자 (TNF)-알파, TNF-베타, 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 2, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 가용성 세포간 부착 분자 1 (sICAM-1), 가용성 혈관 부착 분자 1 (sVCAM-1), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), VEGF-C, VEGF-D, 및 태반 성장 인자 (PLGF)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이펙터의 예는 그랜자임 A, 그랜자임 B, 가용성 Fas 리간드 (sFasL), 및 퍼포린을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 급성기-단백질의 예는 C-반응성 단백질 (CRP) 및 혈청 아밀로이드 A (SAA)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"케모카인"은 세포 화학주성 또는 지향성 이동을 매개하는 시토카인의 한 유형이다. 케모카인의 예는 IL-8, IL-16, 에오탁신, 에오탁신-3, 대식세포-유래 케모카인 (MDC 또는 CCL22), 단핵구 화학주성 단백질 1 (MCP-1 또는 CCL2), MCP-4, 대식세포 염증성 단백질 1α (MIP-1α, MIP-1a), MIP-1β (MIP-1b), 감마-유도 단백질 10 (IP-10), 및 흉선 및 활성화 조절 케모카인 (TARC 또는 CCL17)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
치료제, 예를 들어, 조작된 CAR T 세포의 "치료 유효량", "유효 용량", "유효량", 또는 "치료 유효 투여량"은, 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합되어 사용될 때, 대상체를 질환의 발병에 대해 보호하거나, 또는 질환 증상의 중증도에서의 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 또는 지속기간에서의 증가, 또는 질환을 앓는 것으로 인한 손상 또는 장애의 예방에 의해 입증되는 질환 퇴행을 촉진하는 임의의 양이다. 질환 퇴행을 촉진하는 치료제의 능력은 숙련된 진료의에게 공지된 다양한 방법을 사용하여, 예컨대 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정에서 작용제의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "림프구"는 자연 킬러 (NK) 세포, T 세포, 또는 B 세포를 포함한다. NK 세포는 선천성 면역계의 주요 구성요소를 나타내는 세포독성 (세포 독성) 림프구의 한 유형이다. NK 세포는 종양 및 바이러스에 감염된 세포를 거부한다. 이는 아폽토시스 또는 프로그램화된 세포 사멸의 과정을 통해 작용한다. 이들은 세포를 사멸시키는데 활성화를 요구하지 않기 때문에 "자연 킬러"로 명명된다. T-세포는 세포-매개-면역 (어떠한 항체도 수반되지 않음)에서 주요 역할을 한다. 그의 T-세포 수용체 (TCR)가 이들을 다른 림프구 유형으로부터 구별한다. 면역계의 특수 기관인 흉선이 T 세포의 성숙을 주로 담당한다. 6가지 유형의 T-세포, 즉: 헬퍼 T-세포 (예를 들어, CD4+ 세포), 세포독성 T-세포 (또한 TC, 세포독성 T 림프구, CTL, T-킬러 세포, 세포용해성 T 세포, CD8+ T-세포 또는 킬러 T 세포로도 공지됨), 기억 T-세포 ((i) 줄기 기억 TSCM 세포, 예컨대 나이브 세포는 CD45RO-, CCR7+, CD45RA+, CD62L+ (L-셀렉틴), CD27+, CD28+ 및 IL-7Rα+이며, 뿐만 아니라 이들은 또한 다량의 CD95, IL-2Rβ, CXCR3, 및 LFA-1을 발현하고, 기억 세포 특유의 수많은 기능적 속성을 제시함; (ii) 중심 기억 TCM 세포는 L-셀렉틴 및 CCR7을 발현하고, 이들은 IL-2를 분비하지만 IFNγ 또는 IL-4는 분비하지 않음, 및 (iii) 그러나, 이펙터 기억 TEM 세포는 L-셀렉틴 또는 CCR7을 발현하지 않지만, 이펙터 시토카인 예컨대 IFNγ 및 IL-4를 생산함), 조절 T-세포 (Treg, 억제자 T 세포, 또는 CD4+CD25+ 조절 T 세포), 자연 킬러 T-세포 (NKT) 및 감마 델타 T-세포가 존재한다. 다른 한편으로는, B-세포는 체액성 면역 (항체가 수반됨)에서 주요한 역할을 한다. 이들은 항체 및 항원을 만들고, 항원-제시 세포 (APC)의 역할을 수행하며, 항원 상호작용에 의한 활성화 후에 기억 B-세포가 된다. 포유동물에서, 미성숙 B-세포는 골수에서 형성된다.
용어 "유전자 조작된", "조작된" 또는 "변형된"은 코딩 또는 비-코딩 영역 또는 그의 부분을 결실시킴으로써 또는 안티센스 기술에 의해 유전자에서의 결손을 유발하거나, 또는 코딩 영역 또는 그의 부분을 도입하여 단백질의 발현을 증가시키는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 세포를 변형시키는 방법을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변형되는 세포는 환자 또는 공여자로부터 수득될 수 있는 줄기 세포 (예를 들어, 조혈 줄기 세포 (HSC), 배아 줄기 세포 (ES), 유도 만능 줄기 (iPS) 세포), 림프구 (예를 들어, T 세포)이다.
"면역 반응"은 침입 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 또는 다른 비정상 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우의 정상 인간 세포 또는 조직의 선택적 표적화, 그에 대한 결합, 그에 대한 손상, 그의 파괴 및/또는 그의 척추동물체로부터의 제거를 초래하는, 면역계 세포 (예를 들어, T 림프구, B 림프구, 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 및 호중구), 및 임의의 이들 세포 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자 (Ab, 시토카인, 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.
용어 "면역요법"은 면역 반응을 유도, 증대, 억제, 또는 달리 변형시키는 것을 포함하는 방법에 의해 질환을 앓거나, 또는 질환에 걸릴 위험이 있거나 또는 그의 재발을 겪을 위험이 있는 대상체를 치료하는 것을 지칭한다. 면역요법의 예는 T 세포 요법을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. T 세포 요법은 입양 T 세포 요법, 종양-침윤 림프구 (TIL) 면역요법, 자가 세포 요법, 조작된 자가 세포 요법 (eACT™), 및 동종 T 세포 이식을 포함할 수 있다. 그러나, 관련 분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 조건화 방법이 임의의 이식 T 세포 요법의 유효성을 증대시킬 것이라는 것을 인식할 것이다. T 세포 요법의 예는 미국 특허 공개 번호 2014/0154228 및 2002/0006409, 미국 특허 번호 5,728,388, 및 국제 공개 번호 WO 2008/081035에 기재되어 있다.
면역요법의 T 세포는 관련 기술분야에 공지된 임의의 기원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 조혈 줄기 세포 집단; 유도 만능 줄기 세포 (iPS), 배아 줄기 세포 (ES)로부터 시험관내에서 분화될 수 있거나, 또는 T 세포는 대상체로부터 수득될 수 있다. T 세포는, 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양으로부터 수득될 수 있다. 추가로, T 세포는 관련 기술분야에서 입수가능한 1종 이상의 T 세포주로부터 유래될 수 있다. T 세포는 또한 통상의 기술자에게 공지된 많은 기술, 예컨대 피콜(FICOLL)™ 분리 및/또는 분리반출술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. T 세포 요법을 위한 T 세포를 단리하는 추가의 방법은 미국 특허 공개 번호 2013/0287748에 개시되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
입양 세포 전달이라고도 공지된 "eACT™"로서 약기될 수 있는, 용어 "조작된 자가 세포 요법"은 환자 자신의 T 세포가 수집되고, 후속적으로 1종 이상의 특정한 종양 세포 또는 악성종양의 세포 표면 상에 발현된 1종 이상의 항원을 인식하고 표적화하도록 유전자 변경되는 과정이다. 본원에 사용된 바와 같이, "환자"는 암 (예를 들어, 림프종 또는 백혈병)을 앓는 임의의 인간을 포함한다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "시험관내 세포"는 생체외 배양되는 임의의 세포를 지칭한다. 특히, 시험관내 세포는 T 세포를 포함할 수 있다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되며, 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하며, 단백질 또는 펩티드 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 어떠한 제한도 존재하지 않는다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 이 용어는, 관련 기술분야에서 통상적으로, 예를 들어, 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 지칭되는 단쇄, 및 관련 기술분야에서 일반적으로 단백질로 지칭되며, 그 중에는 많은 유형이 존재하는 장쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는 특히, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드, 또는 그의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "자극"은 자극 분자와 그의 동족 리간드의 결합에 의해 유도되는 1차 반응을 지칭하며, 여기서 결합은 신호 전달 사건을 매개한다. "자극 분자"는 항원 제시 세포 상에 존재하는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는, T 세포 상의 분자, 예를 들어, T 세포 수용체 (TCR)/CD3 복합체이다. "자극 리간드"는 항원 제시 세포 (예를 들어, APC, 수지상 세포, B-세포 등) 상에 존재할 때, T 세포 상의 자극 분자와 특이적으로 결합함으로써, 활성화, 면역 반응의 개시, 증식 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 T 세포에 의한 1차 반응을 매개할 수 있는 리간드이다. 자극 리간드는 항-CD3 항체, 펩티드가 로딩된 MHC 클래스 I 분자, 초효능제 항-CD2 항체, 및 초효능제 항-CD28 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "공동자극 신호"는 1차 신호, 예컨대 TCR/CD3 라이게이션과 조합되어, T 세포 반응, 예컨대, 비제한적으로, 증식 및/또는 핵심 분자의 상향조절 또는 하향 조절을 유도하는 신호를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "공동자극 리간드"는 T 세포 상의 동족 공동-자극 분자에 특이적으로 결합하는 항원 제시 세포 상의 분자를 포함한다. 공동자극 리간드의 결합은 증식, 활성화, 분화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공한다. 공동자극 리간드는 펩티드가 로딩된 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자로, 자극 분자에 의해, 예를 들어, T 세포 수용체 (TCR)/CD3 복합체의 결합에 의해 제공된 1차 신호에 추가적인 신호를 유도한다. 공동-자극 리간드는 3/TR6, 4-1BB 리간드, 톨 리간드 수용체에 결합하는 효능제 또는 항체, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD30 리간드, CD40, CD7, CD70, CD83, 포진 바이러스 진입 매개체 (HVEM), 인간 백혈구 항원 G (HLA-G), ILT4, 이뮤노글로불린-유사 전사체 (ILT) 3, 유도성 공동자극 리간드 (ICOS-L), 세포간 부착 분자 (ICAM), B7-H3과 특이적으로 결합하는 리간드, 림프독소 베타 수용체, MHC 클래스 I 쇄-관련 단백질 A (MICA), MHC 클래스 I 쇄-관련 단백질 B (MICB), OX40 리간드, PD-L2, 또는 프로그램화된 사멸 (PD) L1을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 공동-자극 리간드는, 비제한적으로, T 세포 상에 존재하는 공동-자극 분자, 예컨대, 비제한적으로, 4-1BB, B7-H3, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD7, ICOS, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), 자연 킬러 세포 수용체 C (NKG2C), OX40, PD-1, 또는 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14 (TNFSF14 또는 LIGHT)와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
"공동자극 분자"는 공동자극 리간드와 특이적으로 결합함으로써, T 세포에 의한 공동자극 반응, 예컨대, 비제한적으로, 증식을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너이다. 공동자극 분자는 4-1BB/CD137, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD 33, CD 45, CD100 (SEMA4D), CD103, CD134, CD137, CD154, CD16, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD22, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 (알파; 베타; 델타; 엡실론; 감마; 제타), CD30, CD37, CD4, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD5, CD64, CD69, CD7, CD80, CD83 리간드, CD84, CD86, CD8알파, CD8베타, CD9, CD96 (Tactile), CD1-1a, CD1-1b, CD1-1c, CD1-1d, CDS, CEACAM1, CRT AM, DAP-10, DNAM1 (CD226), Fc 감마 수용체, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, ICOS, Ig 알파 (CD79a), IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, 인테그린, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, LIGHT, LIGHT (종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14; TNFSF14), LTBR, Ly9 (CD229), 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1 (CD1 1a/CD18), MHC 클래스 I 분자, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX40, PAG/Cbp, PD-1, PSGL1, SELPLG (CD162), 신호전달 림프구성 활성화 분자, SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4 (CD244; 2B4), SLAMF6 (NTB-A; Ly108), SLAMF7, SLP-76, TNF, TNFr, TNFR2, 톨 리간드 수용체, TRANCE/RANKL, VLA1 또는 VLA-6, 또는 그의 단편, 말단절단체 또는 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "저하시키는" 및 "감소시키는"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 원래보다 적어지는 임의의 변화를 나타낸다. "저하시키는" 및 "감소시키는"은 측정 전과 측정 후 사이의 비교를 요하는 상대적인 용어이다. "저하시키는" 및 "감소시키는"은 완전한 고갈을 포함한다.
대상체의 "치료" 또는 그를 "치료하는" 것은 증상, 합병증 또는 병태, 또는 질환과 연관된 생화학적 지표의 개시, 진행, 발달, 중증도 또는 재발을 역전시키거나, 경감시키거나, 호전시키거나, 억제하거나, 저속화하거나 또는 예방하기 위한 목적으로 대상체에 대해 수행되는 임의의 유형의 개입 또는 과정, 또는 그에 대한 활성제의 투여를 지칭한다. 한 실시양태에서, "치료" 또는 "치료하는" 것은 부분 완화를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, "치료" 또는 "치료하는" 것은 완전 완화를 포함한다.
퍼센트 동일성을 계산하기 위해서는, 비교되는 서열이 전형적으로 서열 사이의 최대 매치를 제공하는 방식으로 정렬된다. 퍼센트 동일성을 결정하는데 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램의 한 예는 GAP를 포함하는 GCG 프로그램 패키지이다 (문헌 [Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387]; 위스콘신주 매디슨 소재의 위스콘신 대학, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)). 컴퓨터 알고리즘 GAP는 퍼센트 서열 동일성이 결정되어야 할 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 정렬시키는데 사용된다. 서열은 그의 각각의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 최적의 매칭 (알고리즘에 의해 결정된 "매칭된 범위")을 위해 정렬된다. 특정 실시양태에서, 알고리즘에 의한 표준 비교 행렬 (PAM 250 비교 행렬에 대해서는 문헌 [Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352]; BLOSUM 62 비교 행렬에 대해서는 문헌 [Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919] 참조)이 또한 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분열" 또는 "분열시키다"는 클러스터링된 세포의 기계적, 화학적 및/또는 효소적 해리를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 분열된 세포는 온전하지만 느슨한 세포-세포 부착 접촉 뿐만 아니라 막 부착 특성을 유지한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배양" 또는 문법적 등가물은 세포를 성장, 생존 또는 분화에 유리한 조건 하에 유지하는 과정을 지칭한다. 용어 "배양" 및 "세포 배양물" 또는 임의의 동의어는 본 출원에서 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포 밀도" 또는 "단세포 밀도"는 일정 부피 또는 표면적에서의 세포의 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포 밀도는 세포 수/6-웰 플레이트의 웰로 표현된다. 본 개시내용에 따르면, 표준 6 웰 플레이트는 대략 9.5 cm2의 표면적을 갖는다. 일부 실시양태에서, 세포 밀도는 세포 수/cm2로 표현된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배양 용기"는 세포를 배양하기 위한 무균 환경을 제공할 수 있는 임의의 컨테이너를 지칭한다. 예시적인 배양 용기는 유리, 플라스틱 또는 금속 컨테이너를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 다양한 측면이 하기 서브섹션에서 더욱 상세히 기재된다.
상세한 설명
본 개시내용에 따르면, HSC 또는 다른 줄기 세포 (배아 줄기 (ES) 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포)는 목적하는 계열로, 다수의, 아마도 무한한 수의 조작된 T 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 본 개시내용은, 특히, 인간 배아 줄기 (ES) 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포의 배아 중배엽 전구세포 (hEMP) 및/또는 T 세포로의 분화를 위한 고도로 효율적인 방법 및 그를 포함하는 조성물을 제공한다.
어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, ES 또는 iPS 세포로부터의 T 세포의 생성이 "중배엽 푸시" 또는 hEMP 유도라 칭해지는 유도 단계가 선행된다면 보다 효율적인 것으로 고려된다. 간략하게 설명하면, ES 또는 iPS 세포를 배양하고, 계대하고, 목적하는 전면생장률까지 성장시킨다. 후속적으로, 배양 조건을 hEMP 유도 배지로 변화시킨다. 일부 실시양태에서, ES 또는 iPS 세포를 배양하는 방법은 매트리겔® 또는 재조합 인간 비트로넥틴 상에서 피더를 함유하지 않는다 (즉, MEF 무함유). 놀랍게도, 본 발명자들은 비-클러스터링된 세포 배양물이 "중배엽 푸시" 또는 hEMP 유도를 위해 사용된다면 hEMP가 보다 효율적으로 생성될 수 있다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 비-클러스터링된 줄기 세포는 규정된 단세포 밀도로 기질 상에 시딩되고 유도될 수 있다. 그 결과는 효율적이며 재현가능한 중배엽 푸시이다. 중배엽 푸시로부터의 hEMP 세포의 높은 수율은 하류 적용에서 효율적이고, 신속하며, 강건한 T 세포 분화를 가능하게 한다.
만능 줄기 세포
다양한 만능 줄기 세포가 본 개시내용을 실시하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 골수 (또한 제대혈 또는 말초 혈액)의 조혈 줄기 세포 (HSC)는, 모든 다른 성숙 혈액 세포 이외에도, 수임된 흉선 전구세포를 발생시킨다. 이들 흉선 전구세포는 흉선으로 이동하며, 여기서 이들은 성숙 T 세포로의 그의 발달을 시작한다. Notch 수용체의 그의 리간드 델타(Delta) 및 재기드(Jagged), 특히 흉선의 Notch1 및 델타 유사형 4를 통한 신호전달이 전사 캐스케이드 (즉, Tcf7, Gata3, Bcl11b 등)를 구동하여, 레콤비나제 활성화 유전자 RAG1 및 RAG2에 의한 TCR 유전자좌의 재배열을 초래한다. 먼저, 생산적 TCRb 재배열 (즉, TCR 단백질을 생성함)이 pTa와 쌍을 형성하여 표면으로 이동하는 단백질을 생성할 것이다. 이러한 표면 트래픽킹은 신호를 다시 세포로 전달하여, 세포가 추가의 발달을 진행하도록 한다. 표면 pTa-TCRb는 성숙 TCR에서 발생하는 것처럼 MHC와 상호작용할 필요가 없으며 - 생존 신호가 펩티드:MHC 비의존성일 수 있다. 세포는 이어서 TCRa의 재배열이 일어나고, 성공적인 알파/베타 쌍형성 및 자기-펩티드:MHC의 약한 인식에 대해 조사된 다음 (즉, 양성 및 음성 선택 또는 중추 관용), 성숙 나이브 T 세포가 되고 말초로 순환하게 된다.
일부 실시양태에서, 배아 줄기 (ES) 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포가 사용될 수 있다.
줄기 세포는 관련 기술분야에 공지된 임의의 기원으로부터 획득될 수 있다. 예를 들어, 유도 만능 줄기 세포 (iPS) 또는 배아 줄기 세포 (ES)는 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 적합한 HSC, ES 세포, iPS 세포 및 다른 줄기 세포는 또한 배양된 불멸 세포주일 수 있거나 또는 환자로부터 직접 단리될 수 있다. 줄기 세포를 단리, 발달 및/또는 배양하기 위한 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 본 개시내용을 실시하는데 사용될 수 있다.
비-클러스터링된 줄기 세포의 생성
본원에 기재된 바와 같이, 중배엽 유도 전에 비-클러스터링된 단세포 줄기 세포를 현탁 배양하는 것은 줄기 세포 분화의 증가된 효율을 초래한다. 다양한 방법이 비-클러스터링된 줄기 세포 배양물을 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, ES 또는 iPS 세포는 먼저 마우스 배아 섬유모세포 (MEF), 매트리겔® 또는 비트로넥틴 상에서 클러스터로서 배양될 수 있고, 매트리겔® 또는 비트로넥틴 코팅된 플레이트 상으로 클러스터로서 계대될 수 있다. 일부 실시양태에서, 현탁 상태의 단세포를 생성하기 위해, 클러스터는 관련 기술분야에 공지된 트립신, 트립신-유사 효소, 또는 다른 세포-세포 부착 분열제로의 분해에 의해 화학적으로 분열된다. 일부 실시양태에서, 클러스터는 현탁 상태의 단세포를 생성하기 위해 균질화 (예를 들어, 재현탁, 기계적 교반, 배지 세척, 완충제 세척, 세포 해리장치 (예를 들어 밀테니(Miltenyi) 젠틀맥스(GentleMACS)), 또는 와류)에 의해 기계적으로 분열된다.
일부 실시양태에서, 배양 조건은 단세포 성장을 촉진하도록 적합화되어, 줄기 세포가 클러스터를 형성하지 않도록 한다. 예를 들어, 줄기 세포는 현탁 상태로 성장될 수 있다.
기질
본 개시내용에 따르면, 비-클러스터링된 줄기 세포는 성장을 위해 규정된 단세포 밀도로 기질 상에 시딩된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기질"은 임의의 고체 또는 반-고체 표면 또는 지지체를 지칭한다. 예를 들어, 적합한 기질은 층, 마이크로비드, 웰 플레이트, 세포 배양 디쉬, 막, 백, 배양 플라스크, 용기, 역 오팔, 중합체 격자, 겔 또는 중합체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 적합한 기질은 목적하는 코팅으로 처리될 수 있다. 예를 들어, 적합한 기질은 매트리겔® 또는 비트로넥틴으로 코팅될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 기질은 콜라겐 (예를 들어 콜라겐 I, II, II 또는 IV), 젤라틴, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 피브리노겐, BD 매트리겔®, 기저막 매트릭스, 더마탄 술페이트 프로테오글리칸, 폴리-D-리신, 및/또는 그의 조합으로 코팅된다.
본 개시내용에 따르면, 비-클러스터링된 세포는 규정된 단세포 밀도로 기질 상에 시딩된다. 본 개시내용을 위해 적합한 단세포 밀도는 약 1.0-50 X 106개 세포/표준 6-웰 플레이트의 웰 (예를 들어, 약 1.0-40 X 106개 세포/웰, 약 1.0-30 X 106개 세포/웰, 약 1.0-20 X 106개 세포/웰, 약 1.0-10 X 106개 세포/웰, 1.0-8 X 106개 세포/웰, 약 1.0-5 X 106개 세포/웰, 약 1.0-4.5 X 106개 세포/웰, 약 1.0-4 X 106개 세포/웰, 약 1.0-3.6 X 106개 세포/웰, 약 1.0-3 X 106개 세포/웰, 약 1.0-2.5 X 106개 세포/웰, 약 1.0-2.0 X 106개 세포/웰, 약 1.0-1.5 X 106개 세포/웰, 약 1.5-10 X 106개 세포/웰, 약 1.5-8 X 106개 세포/웰, 약 1.5-4 X 106개 세포/웰, 약 1.5-3.5 X 106개 세포/웰, 약 1.5-3.0 X 106개 세포/웰, 약 1.5-2.5 X 106개 세포/웰, 약 1.5-2.0 X 106개 세포/웰)의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 규정된 단세포 밀도 (예를 들어, 약 1.8 X 106개 세포/웰, 약 3.6 X 106개 세포/웰, 약 7.2 X 106개 세포/웰)로 계대된다.
일부 실시양태에서, 세포는 약 1.5x105 내지 약 8x105개 세포/cm2 (예를 들어, 1.89x105개 세포/cm2, 약 3.2x105개 세포/cm2, 약 3.4x105개 세포/cm2, 약 3.6x105개 세포/cm2, 약 3.79x105개 세포/cm2, 약 7.2x105개 세포/cm2, 또는 약 7.58x105개 세포/cm2) 범위의 세포 밀도로 계대된다.
일부 실시양태에서, 시딩 시의 규정된 단세포 밀도는 퍼센트 전면생장률로 표현된다. 본 개시내용에 따르면, 표면 전면생장률이 1% 내지 100% (예를 들어, 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 99%)의 범위이도록 하는 규정된 세포 밀도로 시딩된다. 일부 실시양태에서, 세포는 높은 퍼센트 전면생장률 (예를 들어, 약 70-100%, 약 80%)로 계대된다. 일부 실시양태에서, 세포는 중간 퍼센트 전면생장률 (예를 들어, 약 30-70%, 약 40%)로 계대된다. 일부 실시양태에서, 세포는 낮은 퍼센트 전면생장률 (예를 들어, 약 1-30%, 약 20%)로 계대된다.
일부 실시양태에서, 세포는 성장 배지에 시딩된다. 다른 실시양태에서, 세포는 유도 배지에 시딩된다. 일부 실시양태에서, 세포는 유도 배지에 시딩되고, 본 개시내용에 따른 목적하는 전면생장률까지 성장되고, 유도 배지에 재플레이팅된다.
세포 배양 조건
본 개시내용에 따르면, ES 또는 iPS 세포는 현탁 배양에서 단세포로 성장하도록 적합화될 수 있다. 일부 실시양태에서, ES 또는 iPS 세포는 현탁 상태로 유지된다. 영양 배지에 현탁된 ES 또는 iPS 세포는, 단리된 세포가 영양 배지에 현탁 상태로 남아있도록 보장하는 순환 장치로 유지될 수 있다.
배양 배지
다양한 세포 배양 배지 및 조건이 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는 혈청-함유 또는 혈청-무함유 세포 배양 배지에서 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 혈청-무함유 배지이다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 동물 무함유 배지, 즉, 동물-유래 구성요소가 결여되어 있는 배지이다. 일부 실시양태에서, 배지는 화학적으로 규정된 배지이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "화학적으로 규정된 영양 배지"는 그의 실질적으로 모든 화학적 구성요소를 알고 있는 배지를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 규정된 영양 배지는 동물-유래 구성요소 예컨대 혈청, 혈청 유래 단백질 (예를 들어, 알부민 또는 페투인), 및 다른 구성요소를 함유하지 않는다. 일부 경우에, 화학적으로 규정된 배지는 1종 이상의 단백질 (예를 들어, 단백질 성장 인자 또는 시토카인)을 포함한다. 일부 경우에, 화학적으로 규정된 영양 배지는 1종 이상의 단백질 가수분해물을 포함한다. 다른 경우에, 화학적으로 규정된 영양 배지는 단백질, 가수분해물, 또는 미지의 조성의 구성요소를 전혀 함유하지 않는 단백질-무함유 배지, 즉, 혈청-무함유 배지이다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 규정된 배지는 1종 이상의 동물 유래 구성요소에 의해 보충될 수 있다. 이러한 동물 유래 구성요소는 소 태아 혈청, 말 혈청, 염소 혈청, 당나귀 혈청, 인간 혈청, 및 혈청 유래 단백질 예컨대 알부민 (예를 들어, 소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 특정한 조건 하에서의 특정의 바람직한 속성 또는 성장이 세포 배양을 위해 선택될 수 있다. 이러한 속성이, 확립된 세포주 (즉, 특징화된 상업적으로 입수가능한 세포주)의 공지된 특징 및/또는 형질에 기반하여 또는 실험적 평가를 통해 확인될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 것이다. 일부 실시양태에서, 세포주는 세포의 피더 층 상에서 성장하는 능력에 대해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포주는 세포의 부착성 단층으로서 성장하는 능력에 대해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 배양 배지를 포함하는 세포 배양물에서 줄기 세포 및/또는 전구 세포를 배양하는 것을 포함하는 것을 수반한다.
본 개시내용에 따르면, 인간 배아 중간엽 전구 (hEMP) 세포를 생성하는 것은 성장기 및 분화기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 성장기 동안의 배양 배지는 분화기 동안의 배양 배지와 실질적으로 상이하다. 특정 실시양태에서, mTESR1 배지는 성장기를 위해 사용되고, 엑스-비보™ 15 배지는 분화기를 위해 사용된다.
다양한 배양 배지가 활용될 수 있다. 비제한적으로 예시적인 배양 배지는 MEM (최소 필수 배지), DMEM (둘베코 변형 이글 배지), BME (이글 기초 배지), RPMI 1640, DMEM/F-12 (둘베코 변형 이글 배지: 영양 혼합물 F-12), DMEM/F-10 (둘베코 변형 이글 배지: 영양 혼합물 F-10), a-MEM (a-최소 필수 배지), G-MEM (글래스고 최소 필수 배지), FMDM (이스코브 변형 둘베코 배지), 필수 8 (E8) 배지, 녹아웃 DMEM, AIM V, mTeSR™1, 엑스-비보™ 15, 스템스팬(StemSpan), 셀그로(CellGro) 수지상 세포 배지를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 인간 배아 줄기 세포 (ES 세포) 및 유도 만능 줄기 세포 (iPS 세포)를 위한 피더-무함유 세포 배양 배지가 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 비-클러스터링된 ES 또는 iPS 세포를 생성하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용을 위해 적합한 혈청-무함유 배지는 동물-유래 구성요소가 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용을 위해 적합한 혈청-무함유 배지는 화학적으로 규정된 배지이다. 예를 들어, mTeSR™1 배지가 세포 성장을 위해 사용될 수 있다. MTeSR™1은 고도로 전문화된, 혈청-무함유 완전 세포 배양 배지이다.
특정 실시양태에서, 배양 배지는 Rho-연관 단백질 키나제 (ROCK) 경로의 억제제 (예를 들어, Y27632)가 보충된다. ROCK 억제제는 재프로그램화, 유지, 자기-재생 및/또는 분화를 보조하기 위해 사용될 수 있다.
유도 시의 목적하는 전면생장률
본 개시내용에 따르면, 비-클러스터링된 세포는 유도 배지 중에 재현탁되거나 또는 유도 배지로 전달되어 규정된 단세포 밀도로 기질 상에 플레이팅된다. 본 개시내용을 위해 적합한 단세포 밀도는 약 1.0-50 X 106개 세포/표준 6-웰 플레이트의 웰 (예를 들어, 약 1.0-40 X 106개 세포/웰, 약 1.0-30 X 106개 세포/웰, 약 1.0-20 X 106개 세포/웰, 약 1.0-10 X 106개 세포/웰, 1.0-8 X 106개 세포/웰, 약 1.0-5 X 106개 세포/웰, 약 1.0-4.5 X 106개 세포/웰, 약 1.0-4 X 106개 세포/웰, 약 1.0-3.6 X 106개 세포/웰, 약 1.0-3 X 106개 세포/웰, 약 1.0-2.5 X 106개 세포/웰, 약 1.0-2.0 X 106개 세포/웰, 약 1.0-1.5 X 106개 세포/웰, 약 1.5-10 X 106개 세포/웰, 약 1.5-8 X 106개 세포/웰, 약 1.5-4 X 106개 세포/웰, 약 1.5-3.5 X 106개 세포/웰, 약 1.5-3.0 X 106개 세포/웰, 약 1.5-2.5 X 106개 세포/웰, 약 1.5-2.0 X 106개 세포/웰)의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 비-클러스터링된 세포는 유도 배지 중에 재현탁되거나 또는 유도 배지로 전달되어 규정된 단세포 밀도 (예를 들어, 1.8 X 106개 세포/웰, 약 3.6 X 106개 세포/웰, 약 7.2 X 106개 세포/웰)로 기질 상에 플레이팅된다.
일부 실시양태에서, 비-클러스터링된 세포는 유도 배지 중에 재현탁되거나 또는 유도 배지로 전달되어, 약 1.5x105 내지 약 8x105개 세포/cm2 (예를 들어, 1.89x105개 세포/cm2, 약 3.2x105개 세포/cm2, 약 3.4x105개 세포/cm2, 약 3.6x105개 세포/cm2, 약 3.79x105개 세포/cm2, 약 7.2x105개 세포/cm2, 또는 약 7.58x105개 세포/cm2) 범위의 규정된 단세포 밀도로 기질 상에 플레이팅된다.
일부 실시양태에서, 유도 시의 규정된 단세포 밀도는 퍼센트 전면생장률로 표현된다. 본 개시내용에 따르면, 비-클러스터링된 세포는 유도 배지 중에 재현탁되거나 또는 유도 배지로 전달되어, 표면 전면생장률이 1% 내지 100% (예를 들어, 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 99%)의 범위이도록 하는 규정된 세포 밀도로 기질 상에 플레이팅된다. 일부 실시양태에서, 세포는 높은 퍼센트 전면생장률 (예를 들어, 약 70-100%, 약 80%)로 유도된다. 일부 실시양태에서, 세포는 중간 퍼센트 전면생장률 (예를 들어, 약 30-70%, 약 40%)로 유도된다. 일부 실시양태에서, 세포는 낮은 퍼센트 전면생장률 (예를 들어, 약 1-30%, 약 20%)로 유도된다.
성장기 및 분화기
일부 실시양태에서, 세포는 약 30-37℃ (예를 들어, 약 31-37℃, 약 32-37℃, 약 33-37℃, 약 34-37℃, 약 35-37℃, 약 36-37℃) 범위의 온도에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 대략 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃ 또는 37℃의 온도에서 배양된다. 본원에 기재된 임의의 온도가 성장기 및/또는 분화기를 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 성장기 및 분화기 동안 상이한 온도에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 성장기 및 분화기 동안 실질적으로 동일한 온도에서 배양된다. 본원에 기재된 임의의 배지 pH가 성장기 및/또는 분화기를 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 성장기 및 분화기를 위한 배지 pH는 상이하다. 일부 실시양태에서, 성장기 및 분화기를 위한 배지 pH는 실질적으로 동일하다.
일부 실시양태에서, ES 또는 iPS 세포는 성장기에서 성장되고 유지된다. 일부 실시양태에서, ES 또는 iPS 세포는 시딩되고, 분화기 전에 목적하는 전면생장률 (예를 들어, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90% 전면생장률)까지 성장된다. 다른 실시양태에서, ES 또는 iPS 세포는 분화기 전에 시딩되지 않는다. 특정 실시양태에서, ES 또는 iPS 세포는 분화 배지 중에 재현탁되고 목적하는 전면생장률 (예를 들어, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90% 전면생장률)로 플레이팅된다. 일부 실시양태에서, ES 또는 iPS 세포는 성장기 동안 매트리겔® 또는 비트로넥틴 상에서 배양된다. 일부 실시양태에서, ES 또는 iPS 세포는 성장기 동안 마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 상에서 배양된다.
일부 실시양태에서, 성장기를 위한 인큐베이션 시간은 약 1-6일 (예를 들어, 약 1-5일, 약 1-4일, 약 1-3일, 약 1-2일, 약 1일, 약 2일, 약 2.5일, 약 3일, 약 3.5일, 약 4일)이다. 일부 실시양태에서, 성장기를 위한 인큐베이션 시간은 2 단계로 발생하며, 여기서 배양물은 시딩된다. 일부 실시양태에서, 성장기의 각각의 단계는 약 1-6일 (예를 들어, 약 1-5일, 약 1-4일, 약 1-3일, 약 1-2일, 약 1일, 약 2일, 약 2.5일, 약 3일, 약 3.5일, 약 4일)이다. 일부 실시양태에서, 분화기는 약 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 지속된다.
일부 실시양태에서, 분화기를 위한 인큐베이션 시간은 약 1-6일 (예를 들어, 약 1-5일, 약 1-4일, 약 1-3일, 약 1-2일, 약 1일, 약 2일, 약 2.5일, 약 3일, 약 3.5일, 약 4일)이다. 일부 실시양태에서, 분화기를 위한 인큐베이션 시간은 2 단계로 발생하며, 여기서 배양물은 재플레이팅된다. 일부 실시양태에서, 분화기의 각각의 단계는 약 1-6일 (예를 들어, 약 1-5일, 약 1-4일, 약 1-3일, 약 1-2일, 약 1일, 약 2일, 약 2.5일, 약 3일, 약 3.5일, 약 4일)이다. 일부 실시양태에서, 분화기는 약 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 지속된다.
줄기 세포 분화
본 개시내용에 따른 비-클러스터링된 단세포 접근법을 사용하여 생성된 hEMP 세포는 다양한 세포 유형으로 추가로 분화될 수 있다.
중배엽 유도
액티빈 A, BMP4, VEGF 및 FGF2의 존재 하에 hESC 또는 iPSC로부터 생성된 최초 CD326-CD56+ hEMP 세포는 다능 중배엽-수임 전구세포 집단을 나타낸다. hESC 또는 iPSC의 만능성이 결여되면서, CD326-CD56+ 전구세포는 조혈, 내피, 중간엽 (골, 연골, 지방, 섬유모세포), 평활근 및 심근세포를 포함한 모든 중배엽 계열을 생성하는 그의 능력으로 특별하다. CD326-CD56+ hEMP 세포는 계열이 더욱 한정되는 중배엽 전구세포의 전구체이다.
CD326-CD56+ hEMP 세포는 BMP4, VEGF 및 bFGF의 조합 및 액티빈 A에 대한 일시적 노출로 생산될 수 있다.
hEMP 세포의 선택
hEMP로의 이행이 일어난 ESC 또는 iPSC는 CD326 EPCAM의 상실 및 CD56 NCAM의 획득을 특징으로 한다 (CD326-CD56+). 상피 마커 CD326은 인간 배아 줄기 세포주 (예를 들어, H9, H1 및 HES3) 또는 iPSC로부터의 미분화 세포에서 높은 수준으로 균일하게 발현되는 반면, CD56은 미분화 hESC 또는 iPSC에서 발현되지 않는다. 중내배엽 유도 조건에서의 분화 후에, CD326 발현의 상실 및 CD56의 획득 (CD326-CD56+)에 의해 표시되는 집단이 분명히 검출될 수 있다.
추가적으로, hEMP 분화 이후, E-카드헤린, CD326/TACSTD1, 클라우딘 3, 클라우딘 6, 클라우딘 7, 신데칸 1, 신데칸 2, 베타-카테닌, 오클루딘, 나노그, Sox 2 및/또는 OCT4는 하향조절될 수 있다. hEMP 분화 이후, Snail-1, Snail2/Slug, Twist 1, LEF1, ZEB1, MMP9, 피브로넥틴, 비멘틴 및/또는 ZEB2는 상향조절될 수 있다.
hEMP 세포 마커의 조절은 단백질 검출 방법 (예를 들어, 유동 세포측정, FACS, 웨스턴 블롯, ELISA, HPLC, LC/MS, 단백질 면역침전, 면역전기영동, 단백질 면역염색 등) 및 핵산 검출 방법 (예를 들어, mRNA 전사체 분석, 노던 블롯팅, cDNA, DNA 마이크로어레이 분석, 폴리머라제 연쇄 반응, 유전자 발현 프로파일링 등)을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다.
T 세포의 분화 및 선택
hEMP 세포는 조혈내피 세포 (예를 들어, 혈액, 내피), 심혈관 (예를 들어, 내피, 심근세포, 평활근) 및 중간엽 (예를 들어, 평활근, 섬유모세포, 골, 연골, 지방)으로 분화하는 잠재력을 갖는다. 림프성 세포는 T 세포, B 세포 및 자연 킬러 세포를 포함한다. T 세포는 골수의 조혈 줄기 세포로부터 유래한다. 조혈 줄기 세포로부터의 조혈 전구세포 (예를 들어, hEMP 세포)는 흉선에 모이고, 세포 분열에 의해 확장되어 미성숙 흉선세포의 큰 집단을 생성한다. 최초 흉선세포는 CD4도 CD8도 발현하지 않지만, 이들의 발달이 진행될수록, 이들은 이중-양성 (DP) 흉선세포 (CD4+CD8+)가 되고, 결국에는 단일-양성 (SP) 흉선세포 (CD4+CD8- 또는 CD4-CD8+)로 성숙되고, 이들은 이어서 흉선으로부터 말초 조직으로 방출된다.
본 개시내용에 따른 hEMP 세포의 증가된 효율 및 수율은 신속하며 강건한 T 계열 수임을 유도한다. 일부 실시양태에서, T 세포는 ATO 시스템에서 hEMP 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포는 렌티바이러스 형질도입 방법을 사용하여 hEMP 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포는 기질 단층을 사용하여 hEMP 세포로부터 분화될 수 있다.
hEMP 세포의 T 세포로의 분화는 CD4+CD3- 미성숙 단일 양성 (ISP) 세포 및 CD4+CD8+ (DP) 세포의 출현에 의해 나타내어진다. 보다 성숙한 CD3+TCRαβ+ 세포가 발생하고, 시간 경과에 따라 증가한다. 보다 적은 분율의 CD3+TCRγδ+ T 세포가 또한 생성되어, 점진적으로 CD8SP 및 보다 적게 CD4SP T 세포로 성숙될 수 있으며, 이는 ATO에서의 양성 선택과 일치한다.
흉선 및 ATO-유래 T 세포 전구세포의 유동 세포측정 분석을 사용하여 하기 표면 표현형을 사정할 수 있다: 초기 흉선 전구세포 (ETP; CD34+CD7-CD1a-), CD1a-pro-T (CD34+CD7+CD1a-) 및 CD1a+ pro-T (CD34+CD7+CD1a+); 또는 CD5- pro-T (pro-T1; CD34+CD7+CD5-) 및 CD5+ pro-T (pro-T2; CD34+CD7+CD5+). 흉선 및 ATO-유래 T 세포 및 전구체는 하기 표현형과 조합하여 CD14-CD56-로서 규정된다: 전체 T 계열 세포 (CD7+CD5+), 이중 음성 (DN; CD4-CD8-), CD4 미성숙 단일 양성 (CD4 ISP; CD5+CD4+CD3-), 이중 양성 (DP; CD4+CD8+), CD8SP (CD3+TCRαβ+CD8+CD4-), CD4SP (CD3+TCRαβ+CD8-CD4+), 미성숙 나이브 (CD8SP 또는 CD4SP였던 CD45RA-CD45RO+), 성숙 나이브 (CD8SP 또는 CD4SP였던 CD45RA+CD45RO-). 미성숙 및 성숙 나이브 표현형은 CD1a, CD27, CD28 및 CCR7에 대한 공동-염색에 의해 확증된다.
인공 흉선 오가노이드 (ATO)
생체내 유전자 변형된 뮤린 모델, 인간화 마우스, 및 시험관내 시스템 예컨대 OP9-DLL1 또는 최근 기재된 인공 흉선 오가노이드 (ATO)가, 줄기 세포를 변형시키거나 또는 배양하여, 암 항원에 대한 항원 수용체를 포함하여, 목적하는 성숙 T 세포를 생성할 수 있는 여러 방안을 제시한 바 있다.
본 개시내용에 따른 만능 줄기 세포 및/또는 hEMP는 OP9-DLL1 또는 인공 흉선 오가노이드 (ATO) 세포 배양 시스템에서 추가로 분화될 수 있다. ATO는 T-세포 분화를 재현하는 혈청-무함유의, 3-차원적 세포 배양 기술이다. ATO 기술은 암 및 다른 질환을 치료하기 위한 규격 조작된 T 세포를 생성하는 잠재력을 갖는다.
적합한 인공 흉선 오가노이드 (ATO) 시스템은 제대혈, 골수 및 말초 혈액 HSPC로부터의 천연 및 TCR-조작된 인간 T 세포의 고도로 효율적인 시험관내 분화 및 양성 선택을 지원한다. ATO-유래 T 세포는 나이브 표현형, 다양한 TCR 레퍼토리, 및 TCR-의존성 활성화 및 증식을 나타낸다. ATO-유래 조작된 T 세포는 또한 나이브 표현형으로 성숙되며, 게다가 시험관내 및 생체내에서 항원 특이적 종양 사멸을 제시한다. 따라서 ATO는 입양 세포 요법을 위한 성숙 나이브 및 잠재적으로 비-동종반응성인 조작된 T 세포의 생성을 위한 효율적인 방법을 제공한다. ATO 배양 시스템으로 조작된 T 세포를 생산하기 위한 예시적인 방법은, 예를 들어, 문헌 [Seet CS, He C, Bethune MT, et al. Generation of mature T cells from human hematopoietic stem/progenitor cells in artificial thymic organoids. Nature methods. 2017;14(5):521-530. doi:10.1038/nmeth.4237]에 기재되어 있으며, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
고도로 순수한 T 세포 집단은 기계적 해리에 의해 ATO로부터 용이하게 수집되며, <0.5%의 오염 기질 세포를 제거하기 위해 표준 방법에 의해 추가로 정제될 수 있다. 줄기 세포, 또는 전구 세포당 ATO 세포 수율은 시딩된 세포 (예를 들어, hEMP 세포)의 수 및 유입 세포 대 기질 세포의 비에 반비례한다.
ATO 시스템은 치료 적용을 위한 T 세포의 생성에 적합한 핵심 번역 특성 예컨대 표준화된 구성요소, 재현성 및 확장성을 보유하면서, 전구 세포 (예를 들어, hEMP 세포)로부터의 인간 T 세포의 분화 및 양성 선택을 지원할 수 있다. 본 개시내용은 흉선 및 혈액에서 발견되는 것들과 유사한 진성 나이브 T 세포의 출현에 이르게 되는, 인간 흉선에 비교된 ATO에서의 T 세포 분화의 현저한 충실도를 위한 수단을 제공한다.
본 개시내용에 따른 전구 세포가 공급된 ATO는 인간 T 세포의 강건한 시험관내 분화, 양성 선택, 및 성숙을 지원한다. ATO-유래 성숙 T 세포는 항원 자극에 대한 반응으로 항원 나이브 표현형, 다양한 TCR 레퍼토리, 및 활성화/증식을 나타낸다. ATO는 또한 종양-연관 항원에 특이적인 전구 세포로부터의 TCR-조작된 항원-특이적 T 세포의 고도로 효율적인 분화를 지원한다.
세포
본 개시내용의 세포는 관련 기술분야에 공지된 임의의 기원을 통해 수득될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 조혈 줄기 세포 집단 또는 만능 줄기 세포로부터 시험관내에서 분화될 수 있거나, 또는 T 세포는 대상체로부터 수득될 수 있다. T 세포는, 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양으로부터 수득될 수 있다. 추가로, T 세포는 관련 기술분야에서 입수가능한 1종 이상의 T 세포주로부터 유래될 수 있다. T 세포는 또한 통상의 기술자에게 공지된 많은 기술, 예컨대 피콜™ 분리 및/또는 분리반출술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 특정 실시양태에서, 분리반출술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하기 위해 세척되고, 후속 프로세싱을 위해 적절한 완충제 또는 배지에 위치된다. 일부 실시양태에서, 세포는 PBS로 세척된다. 인지될 것처럼, 세척 단계는, 예컨대 반자동화된 관류 원심분리기, 예를 들어, 코브(Cobe)™ 2991 세포 프로세서, 백스터 사이토메이트(Baxter CytoMate)™ 등을 사용함으로써 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세척된 세포는 1종 이상의 생체적합성 완충제, 또는 완충제가 함유된 또는 그를 함유하지 않는 다른 염수 용액 중에 재현탁된다. 특정 실시양태에서, 분리반출술 샘플의 바람직하지 않은 구성요소는 제거된다. T 세포 요법을 위한 T 세포를 단리하는 추가의 방법은 미국 특허 공개 번호 2013/0287748에 개시되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시양태에서, 줄기 세포는 PBMC로부터, 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써, 예를 들어, 퍼콜(PERCOLL)™ 구배를 통한 원심분리를 사용함으로써 단리된다. 일부 실시양태에서, T 세포의 특정한 하위집단, 예컨대 CD4+, CD8+, CD28+, CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포는 관련 기술분야에 공지된 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리된다. 예를 들어, 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대해 지시된 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 음성 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 지시된 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유동 세포측정을 통한 세포 분류 및/또는 선택이 사용될 수 있다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부화하기 위해서는, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로 CD8, CD11b, CD14, CD16, CD20, 및 HLA-DR에 대한 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 유동 세포측정 및 세포 분류가 본 개시내용에서 사용하기 위한 관심 세포 집단을 단리하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, CD8+ 세포는 나이브, 줄기 세포 기억, 중심 기억, 이펙터 기억, 및 이펙터 세포로, CD8+ 세포의 이들 유형 각각과 연관된 세포 표면 항원을 식별함으로써 추가로 분류된다. 일부 실시양태에서, 중심 기억 T 세포의 표현형 마커의 발현은 CCR7, CD3, CD28, CD45RO, CD62L, 및 CD127을 포함하며, 그랜자임 B에 대해 음성이다. 일부 실시양태에서, 중심 기억 T 세포는 CD8+, CD45RO+, 및 CD62L+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 T 세포는 CCR7, CD28, CD62L, 및 CD127에 대해 음성이며, 그랜자임 B 및 퍼포린에 대해 양성이다. 특정 실시양태에서, CD4+ T 세포는 하위집단으로 추가로 분류된다. 예를 들어, CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 식별함으로써 나이브, 중심 기억, 및 이펙터 세포로 분류될 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역 세포, 예를 들어, T 세포는 공지된 방법을 사용하여 단리 이후 유전자 변형되거나, 또는 면역 세포는 유전자 변형 전에 시험관내에서 활성화 및 확장된다 (또는 전구세포의 경우에는 분화됨). 또 다른 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 hEMP로 유도되기 전에 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 형질도입된 hEMP는 ATO를 통해 프로세싱된다. 또 다른 실시양태에서, 면역 세포, 예를 들어, T 세포는 키메라 항원 수용체 또는 TCR로 유전자 변형되고 (예를 들어, CAR 또는 TCR을 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입됨), 이어서 시험관내에서 활성화 및/또는 확장된다. T 세포를 활성화 및 확장하기 위한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,905,874, 6,867,041 및 6,797,514, 및 PCT 공개 번호 WO 2012/079000에 기재되어 있고, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일반적으로, 이러한 방법은 적절한 시토카인, 예컨대 IL-2가 함유된 배양 배지에서 PBMC 또는 단리된 T 세포를, 일반적으로 비드 또는 다른 표면에 부착된 자극제 및 공동자극제, 예컨대 항-CD3 및 항-CD28 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 동일한 비드에 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체는 "대리" 항원 제시 세포 (APC)로서 작용한다. 하나의 예는 인간 T 세포의 생리학적 활성화를 위한 CD3/CD28 활성화제/자극제 시스템인 더 디나비즈(The Dynabeads)® 시스템이다. 다른 실시양태에서, T 세포는 미국 특허 번호 6,040,177, 5,827,642, 및 PCT 공개 번호 WO 2012/129514에 기재된 것들과 같은 방법을 사용하여, 피더 세포 및 적절한 항체 및 시토카인으로 활성화되고 자극되어 증식하며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시양태에서, T 세포는 공여자 대상체로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 공여자 대상체는 암 또는 종양을 앓는 인간 환자이다. 다른 실시양태에서, 공여자 대상체는 암 또는 종양을 앓지 않는 인간 환자이다.
본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 본원에 기재된 벡터, 본원에 기재된 폴리펩티드, 또는 본원에 기재된 시험관내 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체, 희석제, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 아주반트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 부형제를 포함한다.
다른 실시양태에서, 조성물은 비경구 전달을 위해, 흡입을 위해, 또는 소화관을 통한, 예컨대 경구로의 전달을 위해 선택된다. 이러한 제약상 허용되는 조성물의 제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 능력 내에 있다. 특정 실시양태에서, 조성물을 생리학적 pH 또는 약간 더 낮은 pH, 전형적으로는 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내로 유지하기 위해 완충제가 사용된다. 특정 실시양태에서, 비경구 투여가 고려되는 경우에, 조성물은 제약상 허용되는 비히클 중에, 추가의 치료제의 존재 또는 부재 하에, 본원에 기재된 조성물을 포함하는 발열원-무함유의, 비경구로 허용되는 수성 용액의 형태로 존재한다. 특정 실시양태에서, 비경구 주사를 위한 비히클은 멸균 증류수이며, 여기서 본원에 기재된 조성물은, 적어도 1종의 추가의 치료제의 존재 또는 부재 하에, 적절하게 보존되는 멸균 등장성 용액으로서 제제화된다. 특정 실시양태에서, 제형은 생성물의 제어 또는 지속 방출을 제공하는 중합체성 화합물 (예컨대 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포솜과의 목적하는 분자의 제제를 수반하고, 이는 이어서 데포 주사를 통해 전달된다. 특정 실시양태에서, 목적하는 분자 또는 세포를 도입하기 위해 이식형 약물 전달 장치가 사용된다.
암 치료
본 개시내용의 방법은 대상체에서 암을 치료하기 위해, 종양의 크기를 줄이기 위해, 종양 세포를 사멸시키기 위해, 종양 세포 증식을 예방하기 위해, 종양의 성장을 예방하기 위해, 환자로부터 종양을 제거하기 위해, 종양의 재발을 예방하기 위해, 종양 전이를 예방하기 위해, 환자에서 완화를 유도하기 위해, 또는 그의 임의의 조합을 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 완전 반응을 유도한다. 다른 실시양태에서, 방법은 부분 반응을 유도한다.
치료될 수 있는 암은 혈관화되지 않은, 아직 실질적으로 혈관화되지 않은, 또는 혈관화된 종양을 포함한다. 암은 또한 고형 또는 비-고형 종양을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 암은 혈액암이다. 일부 실시양태에서, 암은 백혈구 암이다. 다른 실시양태에서, 암은 형질 세포 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 백혈병, 림프종, 또는 골수종이다. 특정 실시양태에서, 암은 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) (비 T 세포 ALL 포함), 급성 림프성 백혈병 (ALL), 및 혈구포식성 림프조직구증식증 (HLH), B 세포 전림프구성 백혈병, B-세포 급성 림프성 백혈병 ("BALL"), 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 또는 급성 육아종성 질환, 만성 또는 급성 백혈병, 미만성 대 B 세포 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종, 여포성 림프종 (FL), 모발상 세포 백혈병, 혈구포식성 증후군 (대식세포 활성화 증후군 (MAS), 호지킨병, 대세포 육아종, 백혈구 부착 결손, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 의미 불명의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군 (MDS), 급성 골수성 백혈병 (AML)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 골수성 질환, 비-호지킨 림프종 (NHL), 형질 세포 증식성 장애 (예를 들어, 증상이 없는 골수종 (무증상 다발성 골수종 또는 무통성 골수종), 형질모구성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 형질세포종 (예를 들어, 형질 세포 이혼화증; 고립 골수종; 고립 형질세포종; 수질외 형질세포종; 및 다발성 형질세포종), POEMS 증후군 (크로우-푸카세 증후군; 다카츠키병; PEP 증후군), 원발성 종격 대 B 세포 림프종 (PMBC), 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 비장 변연부 림프종 (SMZL), 전신 아밀로이드 경쇄 아밀로이드증, T-세포 급성 림프성 백혈병 ("TALL"), T-세포 림프종, 형질전환 여포성 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 또는 그의 조합이다.
한 실시양태에서, 암은 골수종이다. 하나의 특정한 실시양태에서, 암은 다발성 골수종이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 백혈병이다. 한 실시양태에서, 암은 급성 골수성 백혈병이다.
일부 실시양태에서, 방법은 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 선택되는 화학요법제는 림프구고갈 (사전조건화) 화학요법제이다. 유익한 사전조건화 치료 레지멘이, 상관성이 있는 유익한 바이오마커와 함께, 미국 특허 가출원 62/262,143 및 62/167,750에 기재되어 있으며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이들은, 예를 들어, T 세포 요법을 필요로 하는 환자에게 명시된 유익한 용량의 시클로포스파미드 (200 mg/m2/일 내지 2000 mg/m2/일) 및 명시된 용량의 플루다라빈 (20 mg/m2/일 내지 900 mg/m2/일)을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 조건화하는 방법을 기재한다. 하나의 이러한 투약 레지멘은 환자에게 치료 유효량의 조작된 T 세포를 투여하기 전 3일 동안 환자에게 약 500 mg/m2/일의 시클로포스파미드 및 약 60 mg/m2/일의 플루다라빈을 매일 투여하는 것을 포함하는, 환자의 치료를 수반한다.
다른 실시양태에서, 항원 결합 분자, 형질도입된 (또는 달리 조작된) 세포 (예컨대 CAR 또는 TCR), 및 화학요법제는 각각 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는데 유효한 양으로 투여된다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 CAR- 및/또는 TCR-발현 면역 이펙터 세포를 포함하는 조성물은 많은 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 화학요법제의 예는 알킬화제 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)™); 알킬 술포네이트 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸멜라민 예컨대 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올멜라민 레주메; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐제 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK®; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)™, 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb)) 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®, 롱-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer)); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS2000; 디플루오로메틸로미틴 (DMFO); 레티노산 유도체 예컨대 탈그레틴(Targretin)™ (벡사로텐), 판레틴(Panretin)™ (알리트레티노인); 온탁(ONTAK)™ (데니류킨 디프티톡스); 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 CAR- 및/또는 TCR-발현 면역 이펙터 세포를 포함하는 조성물은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 또는 억제하는 작용을 하는 항호르몬제 예컨대 항에스트로겐제 예컨대 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (파레스톤); 및 항안드로겐제 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체와 함께 투여될 수 있다. 또한, CHOP, 즉, 시클로포스파미드 (시톡산®), 독소루비신 (히드록시독소루비신), 빈크리스틴 (온코빈(Oncovin)®), 및 프레드니손을 포함하나 이에 제한되지는 않는 화학요법제의 조합이 적절한 경우에 투여된다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 조작된 세포 또는 핵산의 투여와 동시에 또는 그의 투여 후 1주 이내에 투여된다. 다른 실시양태에서, 화학요법제는 조작된 세포 또는 핵산의 투여로부터 1 내지 4주, 1주 내지 1개월, 1주 내지 2개월, 1주 내지 3개월, 1주 내지 6개월, 1주 내지 9개월, 또는 1주 내지 12개월 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 세포 또는 핵산을 투여하기 적어도 1개월 전에 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 2종 이상의 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
다양한 추가의 치료제가 본원에 기재된 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 잠재적으로 유용한 추가의 치료제는 PD-1 억제제 예컨대 니볼루맙 (옵디보(OPDIVO)®), 펨브롤리주맙 (키트루다(KEYTRUDA)®), 펨브롤리주맙, 피딜리주맙 (큐어테크(CureTech)) 및 아테졸리주맙 (로슈(Roche))을 포함한다.
본 개시내용과 조합하여 사용하기에 적합한 추가의 치료제는 이브루티닙 (임브루비카(IMBRUVICA)®), 오파투무맙 (아르제라(ARZERRA)®), 리툭시맙 (리툭산(RITUXAN)®), 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)®), 트라스투주맙 (헤르셉틴(HERCEPTIN)®), 트라스투주맙 엠탄신 (카드실라(KADCYLA)®), 이마티닙 (글리벡(GLEEVEC)®), 세툭시맙 (에르비툭스(ERBITUX)®), 파니투무맙 (벡티빅스(VECTIBIX)®), 카투막소맙, 이브리투모맙, 오파투무맙, 토시투모맙, 브렌툭시맙, 알렘투주맙, 겜투주맙, 에를로티닙, 게피티닙, 반데타닙, 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, 악시티닙, 마시티닙, 파조파닙, 수니티닙, 소라페닙, 토세라닙, 레스타우르티닙, 악시티닙, 세디라닙, 렌바티닙, 닌테다닙, 파조파닙, 레고라페닙, 세막사닙, 소라페닙, 수니티닙, 티보자닙, 토세라닙, 반데타닙, 엔트렉티닙, 카보잔티닙, 이마티닙, 다사티닙, 닐로티닙, 포나티닙, 라도티닙, 보수티닙, 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, 파크리티닙, 코비메티닙, 셀루메티닙, 트라메티닙, 비니메티닙, 알렉티닙, 세리티닙, 크리조티닙, 아플리베르셉트, 아디포티드, 데니류킨 디프티톡스, mTOR 억제제 예컨대 에베롤리무스 및 템시롤리무스, 헷지호그 억제제 예컨대 소니데깁 및 비스모데깁, CDK 억제제 예컨대 CDK 억제제 (팔보시클립)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
추가의 실시양태에서, CAR- 및/또는 TCR-함유 면역을 포함하는 조성물은 항염증 작용제와 함께 투여된다. 항염증 작용제 또는 약물은 스테로이드 및 글루코코르티코이드 (베타메타손, 부데소니드, 덱사메타손, 히드로코르티손 아세테이트, 히드로코르티손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 및 트리암시놀론 포함), 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID) 예컨대 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 메토트렉세이트, 술파살라진, 레플루노미드, 항-TNF 의약, 시클로포스파미드 및 미코페놀레이트를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 NSAID는 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 소듐, Cox-2 억제제 및 시알릴에이트를 포함한다. 예시적인 진통제는 아세트아미노펜, 옥시코돈, 및 프로폭시펜 히드로클로라이드의 트라마돌을 포함한다. 예시적인 글루코코르티코이드는 코르티손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론 또는 프레드니손을 포함한다. 예시적인 생물학적 반응 조절제는 세포 표면 마커 (예를 들어, CD4, CD5 등)에 대해 지시된 분자, 시토카인 억제제, 예컨대 TNF 길항제 (예를 들어, 에타네르셉트 (엔브렐(ENBREL)®), 아달리무맙 (휴미라(HUMIRA)®) 및 인플릭시맙 (레미케이드(REMICADE)®), 케모카인 억제제 및 부착 분자 억제제를 포함한다. 생물학적 반응 조절제는 모노클로날 항체 뿐만 아니라 분자의 재조합 형태를 포함한다. 예시적인 DMARD는 아자티오프린, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 페니실라민, 레플루노미드, 술파살라진, 히드록시클로로퀸, 금 (경구 (아우라노핀) 및 근육내), 및 미노시클린을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 시토카인과 함께 투여된다. 본원에 사용된 바와 같이, "시토카인"은 세포간 매개체로서 또 다른 세포에 대해 작용하는, 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질을 지칭하는 것으로 의도된다. 시토카인의 예는 림포카인, 모노카인, 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 시토카인에는 성장 호르몬 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬 예컨대 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 및 황체형성 호르몬 (LH); 간 성장 인자 (HGF); 섬유모세포 성장 인자 (FGF); 프로락틴; 태반 락토겐; 뮬러-억제 물질; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자 (NGF) 예컨대 NGF-베타; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자 (TGF) 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF) 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터류킨 (IL) 예컨대 IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, 종양 괴사 인자 예컨대 TNF-알파 또는 TNF-베타; 및 LIF 및 kit 리간드 (KL)를 포함한 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, 시토카인이라는 용어는 천연 기원으로부터의 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질, 및 천연 서열 시토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 대상체에게 본원에 개시된 변형된 T 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 종양에 대해 면역을 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 또 다른 측면은 본 출원의 조작된 면역 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 T 세포-매개된 면역 반응이다. 일부 실시양태에서, T 세포-매개된 면역 반응은 1종 이상의 표적 세포에 대해 지시된다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 CAR 또는 TCR을 포함하며, 여기서 CAR 또는 TCR은 본 개시내용에 기재된 THD를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 종양 세포이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 악성종양을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 악성종양의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 적어도 1종의 면역 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 면역 세포는 적어도 1종의 CAR 또는 TCR을 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 벡터, CAR 또는 TCR, 세포 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 방법은 CAR 또는 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 CAR 또는 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 CAR 또는 TCR을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 CAR 또는 TCR을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 요법에 사용하기 위한 공여자 T 세포는 환자로부터 수득된다 (예를 들어, 자가 T 세포 요법의 경우). 다른 실시양태에서, T 세포 요법에 사용하기 위한 T 세포로 분화될 공여자 줄기 세포는 환자가 아닌 대상체로부터 수득된다.
T 세포는 치료 유효량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, T 세포의 치료 유효량은 적어도 약 104개 세포, 적어도 약 105개 세포, 적어도 약 106개 세포, 적어도 약 107개 세포, 적어도 약 108개 세포, 적어도 약 109개, 또는 적어도 약 1010개일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, T 세포의 치료 유효량은 약 104개 세포, 약 105개 세포, 약 106개 세포, 약 107개 세포, 또는 약 108개 세포이다. 하나의 특정한 실시양태에서, CAR T 세포 또는 TCR T 세포의 치료 유효량은 약 2 X 106개 세포/kg, 약 3 X 106개 세포/kg, 약 4 X 106개 세포/kg, 약 5 X 106개 세포/kg, 약 6 X 106개 세포/kg, 약 7 X 106개 세포/kg, 약 8 X 106개 세포/kg, 약 9 X 106개 세포/kg, 약 1 X 107개 세포/kg, 약 2 X 107개 세포/kg, 약 3 X 107개 세포/kg, 약 4 X 107개 세포/kg, 약 5 X 107개 세포/kg, 약 6 X 107개 세포/kg, 약 7 X 107개 세포/kg, 약 8 X 107개 세포/kg, 또는 약 9 X 107개 세포/kg이다.
면역 관용
본 개시내용의 방법은 대상체에서 면역 관용 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 완전 반응을 유도한다. 다른 실시양태에서, 방법은 부분 반응을 유도한다.
중추 또는 말초 관용에서의 결손은 자가면역 질환을 유발하여, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병, 자가면역 다발내분비 증후군 유형 1 (APS-1) 및 면역조절이상 다발내분비병증 장병증 X-연관 증후군 (IPEX)과 같은 증후군을 초래하고, 잠재적으로 천식, 알레르기 및 염증성 장 질환의 원인이 된다. 면역 관용은 또한 예를 들어 줄기 세포 이식, 신장 이식, 간 이식 등의 이식 거부반응에서 문제가 될 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 공개, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 공개, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타내어진 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 그러나, 본원에서 참고문헌의 인용은 이러한 참고문헌이 본 개시내용에 대한 선행 기술이라는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 참조로 포함된 참고문헌에 제공된 임의의 정의 또는 용어가 본원에 제공된 용어 및 논의와 상이한 경우에는, 본 발명의 용어 및 정의가 우선한다.
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌의 내용은 명백하게 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: hEMP 유도에서의 클러스터와 단세포 사이의 비교
본 실시예는 hEMP 유도에서의 클러스터와 단세포 사이의 비교를 예시한다.
클러스터로서의 ES 세포의 전면생장 플레이트를 매트리겔® 코팅된 6-웰 플레이트로 수동으로 계대하고 웰의 20%, 40% 및 80% 등가로 플레이팅하였다. 추가적으로, ES 세포의 전면생장 플레이트를 효소적 분해에 의해 화학적으로 분열시키고 카운팅하여 세포 수/표면적을 결정하였다. 단세포를 1.8x106개 (20% 전면생장), 3.6x106개 (40% 전면생장) 및 7.2x106개 (80% 전면생장)로 시딩하였다. 대조군으로서 ES 세포를 미분화 상태로 유지하기 위해 공지된 mTeSRl 배지에서 또는 엑스-비보™-15 hEMP 푸시 배지에서 세포를 배양하였다. 모든 조건에서, 계대 동안 ES 세포의 생존을 보조하기 위해 소분자 Y27632 ROCK 억제제를 포함시켰다. 세포를 모든 조건에서 d1, d2, d3 및 d4에 수확하였다. 실험의 지도는 표 1, 2 및 3에 제시되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
hEMP로의 이행이 일어난 ES 세포는 CD326 EPCAM의 상실 및 CD56 NCAM의 획득을 특징으로 한다. 표면 발현된 CD326 및 CD56에서의 변화에 기반한 표현형 분석은, 1.8-7.2x106개 세포/6-웰 플레이트의 웰, 또는 2.53-7.58x105개 세포/cm2의 최적 밀도로 hEMP를 생성함에 있어서 단세포 접근법이 클러스터 기반 접근법보다 더 효율적이라는 것을 나타낸다. 표면 발현된 CD326 및 CD56에서의 변화를 예시하는 예시적인 유동 세포측정 데이터 및 요약 그래프가 각각 도 1 및 도 2에 제시되어 있다. hEMP 세포의 생성을 위한 예시적인 방법이 도 3에 제시되어 있다.
실시예 2: 중배엽 푸시에서의 매트리겔® 및 비트로넥틴의 비교, 및 세포 확장의 평가
본 실시예는 매트리겔® 또는 비트로넥틴의 존재 하의 hEMP 유도의 비교를 제공한다. 뮤린 육종 세포에 의해 생산된 미규정 생성물인 매트리겔®의 hEMP 유도 과정으로부터의 제거의 효과를 조사하기 위해, 중배엽 푸시 실험을 수행하였다.
단세포를 매트리겔® (조직 배양 처리 플레이트) 또는 재조합 인간 비트로넥틴 (비-조직 배양 처리 플레이트)으로 코팅된 6-웰 플레이트에 5% 또는 40% 전면생장률로 시딩하였다. 세포를 3일 동안 성장시키고, 세포의 일부를 계대하고, 새로운 코팅된 플레이트 상에 5% 또는 40% 밀도로 재플레이팅하고, 추가로 3일 동안 성장시켰다. 세포를 수확하여 CD326 및 CD56 발현에 대해 사정하였다. 실험 설계의 요약이 표 4에 제시되어 있다.
Figure pct00003
도 4에 제시된 바와 같이, 매트리겔® 및 비트로넥틴 코팅된 표면에서의 등가의 hEMP 표현형을 시험된 모든 실험 조건에서 관찰하였다. 재조합 인간 비트로넥틴은 ES 세포로부터 hEMP를 분화시키기 위한 기질로서 매트리겔®과 적어도 등가이다. 흥미롭게도, 표 5 및 표 6에 요약된 바와 같이, 40%의 초기 시딩 밀도에서 d3에서의 5% 밀도로의 분할은 유입 ES 세포 수로부터의 대략 10배 (13.31)의 hEMP의 확장을 가능하게 하였다. 시딩 단계를 포함한, hEMP 세포의 생성을 위한 예시적인 방법이 도 5에 제시되어 있다.
Figure pct00004
실시예 3: hEMP 세포의 T 세포로의 분화
본 개시내용의 비-클러스터링된 세포 접근법에 따라 생성된 hEMP 세포를 사용하여 시험관내 시스템 (예를 들어, ATO 시스템)에서의 T 세포 분화의 효율을 증가시킬 수 있다. hEMP 세포를 기재된 바와 같이 유도하고, FACSAria 퓨전 (BD)으로 분류하였다. 분류 후 순도는 비-hEMP 및 hEMP 둘 다에 대해 >95%로 결정되었다 (도 6). T 세포 분화를 RPMI 1640 (코닝(Corning), 버지니아주 마나사스), 2% 제노프리 B27 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 뉴욕주 그랜드 아일랜드), PBS로 재구성된 30 μM L-아스코르브산 2-포스페이트 세스퀴마그네슘 염 수화물 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (제미니 바이오-프로덕츠(Gemini Bio-Products), 캘리포니아주 웨스트 새크라멘토), 1% 글루타맥스 (써모피셔 사이언티픽, 뉴욕주 그랜드 아일랜드), 5 ng/ml rhFLT3L, 5 ng/ml rhIL-7, 및 50ng/ml SCF (페프로테크(Peprotech), 뉴저지주 록키 힐)로 구성된 혈청 무함유 ATO 배양 배지 ("RB27")를 사용하여 유도하였다. 2% 제노프리 B27은 B27을 대체하였다.
50ml 원추형 바이알 내 ATO당 0.5x106개의 MS5-hDL4 세포를 1x104개의 정제된 hEMP 세포와 합치고, 스윙 버킷 원심분리기에서 5 min. 동안 500 g에서 원심분리하였다. 상청액을 조심스럽게 제거하고, 세포 펠릿을 짧은 와류에 의해 재현탁시켰다. 각각의 ATO에 대해, 0.4 μm 밀리셀 트랜스웰 인서트 (이엠디 밀리포어(EMD Millipore), 매사추세츠주 빌러리카; Cat. PICM0RG50)를 웰당 1 ml의 RB27을 함유하는 6-웰 플레이트에 위치시켰다. ATO를 플레이팅하기 위해, 인서트를 꺼내어 플레이트의 에지에 두어 과량의 배지를 빼내었다. 세포 슬러리를 ATO당 5 μl로 조정하고, 20 μl 피펫 팁으로 빨아들이고, 피펫 팁의 단부에서 방울져 떨어지게 하여, 셀 인서트 상에 서서히 침적시킴으로써 플레이팅하였다. 셀 인서트를 다시 1 mL의 RB27을 함유하는 웰에 위치시켰다. 배지를 셀 인서트 주위로부터 흡인한 다음, 새로운 RB27/시토카인 1 ml로 대체함으로써 3-4일마다 완전히 교체하였다. ATO를 이러한 방식으로 최대 8주 동안 배양하였다. 각각의 웰에 FACS 완충제 (PBS/0.5% 소 혈청 알부민/2mM EDTA)를 첨가하고, 피펫팅에 의해 ATO를 짧게 분해시킨 다음, 70 μm 나일론 스트레이너를 통해 통과시킴으로써 ATO 세포를 수확하였다.
수확된 세포를 암실의 4C에서 30' 동안 하기 항원에 대한 항체로 염색하였다: CD45, CD56, CD3, CD4, CD8, TCRab (바이오레전드(Biolegend)). 세포를 PBS로 세척하고, T-세포 발생의 분석을 위해 포르테사 X20 (BD)으로 분석하였다. 제4주에서의 세포의 예가 도 7에 제시되어 있다.

Claims (47)

  1. 인간 배아 중간엽 전구 (hEMP) 세포를 생성하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하며:
    (a) 규정된 단세포 밀도로 비-클러스터링된 줄기 세포를 기질과 접촉시키는 단계;
    (b) 세포 성장을 목적하는 전면생장률까지 가능하게 하는 배양 조건 하에 줄기 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 배양 조건을 변형시켜 목적하는 인큐베이션 시간 동안 줄기 세포의 hEMP 세포로의 분화를 유도하는 단계;
    이에 의해 hEMP 세포를 생성하는 것인
    방법.
  2. 제1항에 있어서, 줄기 세포가 인간 배아 줄기 (ES) 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포인 방법.
  3. 제2항에 있어서, ES 또는 iPS 세포가 인간 기원의 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, ES 또는 iPS 세포가 H1 세포, H9 세포, HES3 세포, HSF1 세포, HSF6 세포, ESI-017 세포, CS02iCTR-NTn1 세포, CS03iCTR-NTn1 세포, CS80iCTR-Tn3 세포, CS179iCTR-NTn1 세포, CS201iCTR-NTn4 세포, CS202iCTR-NTn2 세포, 또는 CS206iCTR-Tn5 세포인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 규정된 단세포 밀도가 약 1.5x105 내지 약 8x105개 세포/cm2인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 규정된 단세포 밀도가 약 1.89x105개 세포/cm2, 약 3.2x105개 세포/cm2, 약 3.4x105개 세포/cm2, 약 3.6x105개 세포/cm2, 약 3.79x105개 세포/cm2, 약 7.2x105개 세포/cm2, 또는 약 7.58x105개 세포/cm2인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 기질이 매트리겔(Matrigel)® 또는 재조합 인간 비트로넥틴으로 코팅되나, 마우스 배아 섬유모세포 (MEF)로는 코팅되지 않는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 기질이 웰 플레이트, 세포 배양 디쉬, 막, 백, 배양 플라스크, 역 오팔, 중합체 격자, 정적 세포 현탁액, 진탕 세포 현탁액, 또는 혈장 처리된 중합체인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 기질이 막을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 성장을 가능하게 하는 배양 조건이 줄기 세포를 mTeSR1 배지에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, mTeSR1 배지가 ROCK 억제제 Y27632를 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 목적하는 전면생장률이 약 20% 내지 약 80%인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 전면생장률이 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70% 또는 약 80%인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 조건을 변형시키는 단계가 엑스-비보(X-VIVO)™ 15를 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 시간이 약 2 내지 약 4일인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 인큐베이션 시간이 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5 또는 약 4.0일인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 인큐베이션 시간이 약 3.5일인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, hEMP 세포를 T 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 줄기 세포의 클러스터를 분열시켜 비-클러스터링된 줄기 세포를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 줄기 세포의 클러스터가 기계적 또는 화학적 분열에 의해 분열되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 화학적 분열이 트립신-유사 효소와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 트립신-유사 효소가 트립신, 트리플 익스프레스, 트리플 셀렉트, 콜라게나제, 디스파제, 트립신-EDTA인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 인간 배아 중간엽 전구 (hEMP) 세포.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 인간 배아 중간엽 전구 (hEMP) 세포의 집단을 포함하는 조성물.
  25. T 세포를 생성하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하며:
    (a) 규정된 단세포 밀도로 비-클러스터링된 줄기 세포를 기질과 접촉시키며, 여기서 줄기 세포는 마우스 배아 섬유모세포 (MEF)를 포함하지 않는 것인 단계;
    (b) 세포 성장을 목적하는 전면생장률까지 촉진하는 배양 조건 하에 줄기 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 배양 조건을 변형시켜 목적하는 인큐베이션 시간 동안 줄기 세포의 T 세포로의 분화를 유도하는 단계;
    이에 의해 줄기 세포로부터 T 세포를 생성하는 것인
    방법.
  26. 제25항에 있어서, 줄기 세포가 인간 배아 줄기 (ES) 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포인 방법.
  27. 제26항에 있어서, ES 또는 iPS 세포가 인간 기원의 것인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, ES 또는 iPS 세포가 H1 세포, H9 세포, HES3 세포, HSF1 세포, HSF6 세포, ESI-017 세포, CS02iCTR-NTn1 세포, CS03iCTR-NTn1 세포, CS80iCTR-Tn3 세포, CS179iCTR-NTn1 세포, CS201iCTR-NTn4 세포, CS202iCTR-NTn2 세포, 또는 CS206iCTR-Tn5 세포인 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 규정된 단세포 밀도가 약 1.5x105 내지 약 8x105개 세포/cm2인 방법.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 규정된 단세포 밀도가 약 1.89x105개 세포/cm2, 약 3.2x105개 세포/cm2, 약 3.4x105개 세포/cm2, 약 3.6x105개 세포/cm2, 약 3.79x105개 세포/cm2, 약 7.2x105개 세포/cm2, 또는 약 7.58x105개 세포/cm2인 방법.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 기질이 매트리겔® 또는 재조합 인간 비트로넥틴으로 코팅되나, 마우스 배아 섬유모세포 (MEF)로는 코팅되지 않는 것인 방법.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 기질이 웰 플레이트, 세포 배양 디쉬, 막, 백, 배양 플라스크, 역 오팔, 중합체 격자, 정적 세포 현탁액, 진탕 세포 현탁액, 또는 혈장 처리된 중합체인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 기질이 막을 포함하는 것인 방법.
  34. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 성장을 가능하게 하는 배양 조건이 줄기 세포를 mTeSR1 배지에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, mTeSR1 배지가 ROCK 억제제 Y27632를 포함하는 것인 방법.
  36. 제25항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 목적하는 전면생장률이 약 20% 내지 약 80%인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 전면생장률이 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70% 또는 약 80%인 방법.
  38. 제25항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 조건을 변형시키는 단계가 엑스-비보™ 15를 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
  39. 제25항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 시간이 약 2 내지 약 4일인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 인큐베이션 시간이 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5 또는 약 4.0일인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 인큐베이션 시간이 약 3.5일인 방법.
  42. 제25항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 줄기 세포의 클러스터를 분열시켜 비-클러스터링된 줄기 세포를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 줄기 세포의 클러스터가 기계적 또는 화학적 분열에 의해 분열되는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 화학적 분열이 트립신-유사 효소와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 트립신-유사 효소가 트립신, 트리플 익스프레스, 트리플 셀렉트, 콜라게나제, 디스파제, 트립신-EDTA인 방법.
  46. 제25항 내지 제45항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 T 세포.
  47. 제25항 내지 제45항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 T 세포의 집단을 포함하는 조성물.
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