WO2016117431A1 - 内耳性難聴治療薬 - Google Patents

内耳性難聴治療薬 Download PDF

Info

Publication number
WO2016117431A1
WO2016117431A1 PCT/JP2016/050861 JP2016050861W WO2016117431A1 WO 2016117431 A1 WO2016117431 A1 WO 2016117431A1 JP 2016050861 W JP2016050861 W JP 2016050861W WO 2016117431 A1 WO2016117431 A1 WO 2016117431A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
cells
inner ear
apoptosis
alkyl
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/050861
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
誠 細谷
正人 藤岡
岡野　栄之
郁 小川
達雄 松永
Original Assignee
学校法人慶應義塾
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人慶應義塾 filed Critical 学校法人慶應義塾
Priority to EP16740038.1A priority Critical patent/EP3248597B1/en
Priority to FIEP16740038.1T priority patent/FI3248597T3/fi
Priority to DK16740038.1T priority patent/DK3248597T3/da
Priority to JP2016570589A priority patent/JP6716139B2/ja
Priority to US15/544,419 priority patent/US11058669B2/en
Priority to EP17187312.8A priority patent/EP3295939B1/en
Publication of WO2016117431A1 publication Critical patent/WO2016117431A1/ja
Priority to US15/654,267 priority patent/US11013725B2/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/155—Amidines (), e.g. guanidine (H2N—C(=NH)—NH2), isourea (N=C(OH)—NH2), isothiourea (—N=C(SH)—NH2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/439—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom the ring forming part of a bridged ring system, e.g. quinuclidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2510/00—Detection of programmed cell death, i.e. apoptosis

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for inner ear deafness.
  • hair cells and spiral ganglion cells in the cochlea play an important role in hearing. Since these cells have no regenerative ability, once they die, a therapeutic effect cannot be expected. For this reason, drug treatment for hearing loss is considered difficult.
  • the therapeutic agents currently used for deafness include only circulatory improvement drugs and anti-inflammatory drugs for sudden deafness caused by circulatory disturbance or inflammation of the inner ear (Patent Publication No. 2004-123713). Development of drugs for hearing loss is expected.
  • the present invention was made for the purpose of providing a novel apoptosis inhibitor and a therapeutic agent for inner ear hearing loss.
  • One embodiment of the present invention is a drug for treating inner ear hearing loss caused by apoptosis, containing a biguanide compound represented by the following structural formula I or a rapamycin derivative represented by the following structural formula II as an active ingredient .
  • the inner ear hearing loss resulting from apoptosis may be derived from Pendred syndrome.
  • the biguanide compound may be metformin.
  • the rapamycin derivative may be rapamycin.
  • a further embodiment of the present invention is an apoptosis inhibitor containing a biguanide compound represented by the following structural formula I or a rapamycin derivative represented by the following structural formula II as an active ingredient.
  • This apoptosis inhibitor may suppress apoptosis of inner ear cells.
  • the biguanide compound may be metformin.
  • the rapamycin derivative may be rapamycin.
  • a further embodiment of the present invention is a method for examining apoptosis, comprising administering a compound represented by the following structural formula (I) or (II) to an inner ear cell in vitro, and inducing apoptosis in the inner ear cell: And a step of examining apoptosis occurring in the inner ear cell.
  • a further embodiment of the present invention is a method for screening an apoptosis inhibitor, comprising administering a compound represented by the following structural formula (I) or (II) to an inner ear cell in vitro, and causing apoptosis in the inner ear cell: And the step of examining apoptosis occurring in the inner ear cells.
  • a further embodiment of the present invention is a method for screening a drug for treating inner ear hearing loss caused by apoptosis, wherein a compound represented by the following structural formula (I) or (II) is applied to inner ear cells in vitro: An administration step, a step of inducing apoptosis in the inner ear cell, and a step of examining apoptosis occurring in the inner ear cell.
  • a further embodiment of the present invention is a therapeutic method for treating a patient having inner ear hearing loss resulting from apoptosis, wherein the patient is provided with an effective amount of a biguanide compound represented by the following structural formula I or the following structure:
  • a method of treatment comprising administering a rapamycin derivative of formula II.
  • the biguanide compound or the rapamycin derivative may be administered into the tympanic chamber.
  • the inner ear hearing loss resulting from apoptosis may be derived from Pendred syndrome.
  • the biguanide compound may be metformin.
  • the rapamycin derivative may be rapamycin.
  • R 1 to R 7 are a hydrogen atom, a halogen atom, or a halogen atom, a cyano group, a C 1-6 alkyl group, a C 1-6 alkoxy group, a C 1-6 alkoxycarbonyl group, C 3, respectively.
  • R 1 is C 1-6 alkyl or C 3-6 alkynyl
  • R 2 is H, —CH 2 —OH or —CH 2 —CH 2 —OH
  • X is ⁇ O , (H, H) or (H, OH).
  • B In one Example of this invention, it is the microscope picture which showed the result of having dyed the obtained inner ear stem cell with (a) anti-PAX2 antibody, (b) anti-PAX8 antibody, (c) anti-SOX2 antibody.
  • inner ear stem cells are cultured in suspension and cultured in the presence of FGF9 and FGF20 to express hair cell markers espin, myosin 7a, and prestin. It is the microscope picture which showed that.
  • inner ear stem cells are cultured in suspension and cultured in the presence of FGF9 and FGF20, so that GFAP, a marker of cochlear ganglion glial cells, It is the microscope picture which showed that the calbindin and beta III tubulin which are markers express. Triple staining was performed with antibodies of GFAP, calbindin and beta III tubulin.
  • it is a graph which shows that the cell viability of the inner ear cell derived from a Pendred syndrome patient iPS cell falls at the time of stress load.
  • it is a graph which shows that rapamycin suppresses the fall of the cell viability shown in FIG.
  • FIG. 10 is a graph showing that calpeptin cannot suppress apoptosis, which is the cause of the decrease in cell viability shown in FIG. 9, in one reference example of the present invention.
  • Apoptosis inhibitor relates to apoptosis of inner ear cells containing a biguanide compound (the following structural formula I) or a rapamycin derivative (the following structural formula II) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient. It is an inhibitor.
  • R 1 to R 7 are a hydrogen atom, a halogen atom, or a halogen atom, a cyano group, a C 1-6 alkyl group, a C 1-6 alkoxy group, a C 1-6 alkoxycarbonyl group, C 3, respectively.
  • An optionally substituted substituent selected from an -8 cycloalkyl group, a C 2-6 alkenyl group, a C 2-6 alkynyl group, and a phenyl group, a C 1-6 alkyl group, a C 3-8 cycloalkyl group , A C 6-10 aryl group, a 5 or 6 membered heteroaryl group, or a 5 or 6 membered non-aromatic heterocyclic group.
  • R 1 is C 1-6 alkyl or C 3-6 alkynyl
  • R 2 is H, —CH 2 —OH or —CH 2 —CH 2 —OH
  • X is ⁇ O , (H, H) or (H, OH).
  • the inner ear cells targeted for apoptosis inhibition are not particularly limited, and inner ear cells that are susceptible to apoptosis are preferable, and those derived from animals suffering from inner ear hearing loss caused by apoptosis are more preferable.
  • the inner ear deafness is not particularly limited as long as it is an inner ear deafness caused by apoptosis, and examples thereof include deafness due to Pendred syndrome and presbycusis.
  • the inner ear cells that are the target of apoptosis inhibition may be cells that exist in the body of an individual organism or cultured cells.
  • the species of the individual organism is not particularly limited, but vertebrates are preferred, and humans are most preferred.
  • the cultured cells may be established cell lines, primary cultured cells, or inner ear cells differentiated from stem cells. Details of the method of inducing differentiation from stem cells to inner ear cells will be described later.
  • the apoptosis inhibitor of the present invention can be used for inner ear cells, it is useful as a drug for treating inner ear deafness caused by apoptosis.
  • the inner ear hearing loss to be treated is not particularly limited as long as it is inner ear hearing loss caused by apoptosis, and examples thereof include hearing loss due to Pendred syndrome, senile deafness, and the like.
  • the treatment includes any of recovering the hearing loss, stopping the progress of the hearing loss, and preventing the hearing loss.
  • Biguanide compound is a compound having the following structure (III) in which two molecules of guanidine are linked by sharing a nitrogen atom.
  • the biguanide compound is a generic name for biguanides and compounds in which hydrogen of the biguanide is substituted.
  • the substituent is not particularly limited, and is a hydrogen atom, a halogen atom, a C 1-6 alkyl group, a C 3-8 cycloalkyl group, a C 6-10 aryl group, a 5 or 6 membered heteroaryl group, a 5 or 6 member.
  • a non-aromatic heterocyclic group (C 1-6 alkyl group, C 3-8 cycloalkyl group, C 6-10 aryl group, 5- or 6-membered heteroaryl group, 5- or 6-membered non-aromatic system)
  • the heterocyclic group includes a halogen atom, a cyano group, a C 1-6 alkyl group, a C 1-6 alkoxy group, a C 1-6 alkoxycarbonyl group, a C 3-8 cycloalkyl group, a C 2-6 alkenyl group, C 2-6 alkynyl group, and optionally having a substituent selected from a phenyl group). That is, the biguanide compound includes a compound represented by the following structural formula.
  • R 1 to R 7 are a hydrogen atom, a halogen atom, or a halogen atom, a cyano group, a C 1-6 alkyl group, a C 1-6 alkoxy group, a C 1-6 alkoxycarbonyl group, C 3, respectively.
  • the most preferred compound is metformin having the following structural formula IV.
  • Rapamycin derivative Rapamycin is a compound having the following structural formula V.
  • the rapamycin derivative includes a compound represented by the following structural formula.
  • rapamycin derivatives include: (1) 40-O-substituted rapamycin derivatives (eg 40-O-alkyl-rapamycin derivatives (40-O-hydroxyalkyl-rapamycin derivatives and 40-O- (2-hydroxy) -ethyl -Rapamycin)), (2) 32-deoxo-rapamycin and derivatives thereof, and 32-hydroxy-rapamycin and derivatives thereof, (3) 16-O-substituted rapamycin derivatives (eg 16-pent-2-ynyloxy-32- Deoxorapamycin, 16-pent-2-ynyloxy-32 (S or R) -dihydro-rapamycin, 16-pent-2
  • stem cells are not particularly limited, and pluripotent stem cells and inner ear stem cells can be exemplified.
  • the inner ear cell induction method will be described in detail using pluripotent stem cells as an example.
  • This inner ear cell induction method can be performed along the following flow.
  • the pluripotent stem cell is not particularly limited as long as it has differentiation pluripotency (multipotency or pluripotency), and examples thereof include embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), Muse cells, and the like. Particularly preferred are cells having totipotency.
  • the ROCK (Rho-associated ilcoiled-coil forming kinase / Rho-binding kinase) inhibitor is not particularly limited.
  • Y-27632, Fasudil hydrochloride, K-115 (rehabilitation hydrochloride hydrate), DE-104 Etc. can be exemplified.
  • the concentration of the ROCK inhibitor can be easily determined as appropriate, but is preferably 0.05% to 0.2%, more preferably 0.1%.
  • the medium used in the first step and the second step is not particularly limited as long as it can maintain pluripotent stem cells, and mTeSR1 can be exemplified.
  • the first step is preferably performed for 1 to 3 days, and more preferably for 1 to 2 days.
  • the second step is preferably performed for 1 to 3 days, and more preferably for 1 to 2 days.
  • the meaning in the absence of the ROCK inhibitor may be any concentration as long as the ROCK inhibitor is substantially absent, and may be contained at a level at which there is no effect.
  • Examples of the serum-free medium used in the third step include DMEM / F12 + B27 + N2 + GlutaMax + Nonessential aminoacid.
  • the culture in the third step is preferably performed for 2 to 6 days, more preferably 2 to 4 days, and most preferably 3 days.
  • the serum-free medium used in the fourth step can be exemplified by DMEM / F12 + B27 + N2 + GlutaMax + Nonessential aminoacid, but the same serum-free medium used in the third step is preferably used.
  • the growth factor at least one growth factor may be added from the group consisting of bFGF, FGF3, FGF10, and FGF19, but it is preferable to add all of them. Preferred concentrations for each are 10-50 ng / ml, 10-50 ng / ml, 10-50 ng / ml, 10-50 ng / ml. Further, it is preferable to culture in the presence of BMP4 in the first stage of culture and in the absence of BMP4 in the second stage.
  • the concentration of BMP4 added in the previous period is preferably 5 to 50 ng / ml.
  • the meaning of the absence of BMP4 in the later culture is that BMP4 may be substantially absent, and may be contained at a level at which there is no effect.
  • the first culture is preferably performed for 2 to 6 days, more preferably 2 to 4 days, and most preferably 3 days. Further, the late culture is preferably performed for 2 to 6 days, more preferably 2 to 4 days, and most preferably 3 days.
  • the inner ear stem cells thus obtained have the ability to differentiate into inner ear stem cells.
  • the cell mass obtained in the fourth step is dissociated into single cells.
  • the method for dissociating into single cells is not particularly limited, and for example, trypsin or actase can be used. After dissociating with an enzyme or physical treatment (such as pipetting), to remove undifferentiated cells and cell clumps, use nylon mesh etc. to select cells dissociated into single cells and remove the remaining cell clumps It is preferable to do this.
  • a culture dish coated with a coating agent is used, and the cells are cultured under hypoxic conditions in order to maintain stem cell ability (sixth step).
  • the coating agent to be used is not particularly limited, but poly-O-fibronectine is most preferable.
  • the stem cells to be cultured may be those obtained in the fourth step or those obtained in the fifth step.
  • the serum-containing medium used in this step include DMEM and F12.
  • DMEM / F12 containing N2 and B27 is most preferable in addition to serum (for example, FBS).
  • the oxygen concentration is preferably 4% to 10%, more preferably 4% to 6%, and most preferably 4%.
  • the growth factor to be added to the culture may be at least one growth factor selected from the group consisting of bFGF, EGF, and IGF1, but all are preferably added. Preferred concentrations for each are 10-30 ng / ml, 10-30 ng / ml, 10-50 ng / ml.
  • the inner ear stem cells are cultured in suspension. Specifically, first, inner ear stem cells are dissociated into single cells as in the fifth step.
  • the dissociated cells are cultured in a floating state. Therefore, a dish for floating culture that can be cultured in a non-adherent state is used as the culture dish.
  • a non-adhesive culture dish such as a plastic culture dish may be used.
  • suspension culture means culturing the target cells or cell mass without adhering to the bottom of the incubator, and adhesion culture means adhering the target cells or cell mass to the bottom of the incubator. It means to culture.
  • cells and cell clumps adhere to the bottom of the incubator means that the cells and cell clumps adhere to the bottom of the incubator through cell substrate adhesion molecules contained in ECM, A state in which cells and cell masses do not float in the culture solution even if the culture solution is shaken lightly.
  • cells and cell clusters do not adhere to the bottom of the incubator, which means that the cells and cell clusters do not adhere to the bottom of the incubator through cell-substrate adhesion molecules contained in ECM, Even if it touches the bottom surface, it means a state where cells and cell masses float in the culture solution when the culture solution is shaken lightly.
  • the bottom surface of the plastic dish is chemically treated or coated with an adhesive coating agent (gelatin, polylysine, agar, etc.) that promotes adhesion in order to promote cell adhesion to the substrate. It is preferable.
  • the bottom surface of the plastic dish may not be treated, or may be coated with an adhesion-preventing coating agent (such as poly (2-hydroxyethyl methacrylate)) to prevent cell adhesion to the temperament. preferable.
  • an adhesion-preventing coating agent such as poly (2-hydroxyethyl methacrylate)
  • the medium used for the suspension culture is not particularly limited, and examples thereof include DMEM and F12.
  • a medium containing external factors such as serum (for example, FBS), N2, B27, and growth factors is preferable.
  • F12 is used.
  • As an external factor to be added at least one growth factor may be included in the group consisting of bFGF, EGF, IGF1, Wnt3a, FGF9, FGF20, Heparin, and TGF ⁇ inhibitor, but preferably includes a growth factor and heparin. More preferably.
  • Each preferable concentration is 10 to 50, 10 to 50, 10 to 100, 10 to 50, 10 to 100, 10 to 100, 1 to 50 ng / ml, but is not particularly limited.
  • This suspension culture is preferably performed for 3 to 7 days, more preferably 4 to 6 days, and most preferably 5 days.
  • the medium to be added is not particularly limited, and examples thereof include DMEM and F12.
  • a medium containing external factors such as serum (for example, FBS), N2, B27, and growth factors is preferable, and DMEM / F12 is used as the medium.
  • FBS serum
  • N2, B27, and growth factors is preferable
  • DMEM / F12 is used as the medium.
  • an external factor to be added at least one growth factor may be included in the group consisting of bFGF, EGF, and IGF1, but it is more preferable to include all of them.
  • Preferred concentrations for each are 10-30 ng / ml, 10-30 ng / ml, 10-50 ng / ml.
  • the formed spheres are collected so as not to be broken, and adhesion culture is performed in the same medium.
  • the medium is replaced with a new medium containing external factors such as serum (eg, FBS), N2, B27, and growth factors.
  • external factors such as serum (eg, FBS), N2, B27, and growth factors.
  • T3 and / or IGF1 as an external factor to be added, and it is preferable to use the same medium as that used in the first suspension culture except for the external factor.
  • the preferred concentration of each is 10-100, 1-50 ng / ml.
  • hair cells, support cells, cochlear ganglion cells and vascular streak cells can be differentiated.
  • This culture is preferably performed for 3 days or more, more preferably 5 days or more. During this time, only the medium exchange may be performed.
  • the medium used here is not particularly limited, and examples thereof include DMEM and F12.
  • a medium containing serum (for example, FBS) and bFGF is preferable, and DMEM is most preferably used as the medium.
  • the preferred concentration of bFGF is 1-50 ng / ml.
  • This culture is preferably performed for 7 days or longer, more preferably for 10 days or longer, and most preferably for 14 days or longer. After the culture, Periotic mesenchymal cells having a fibrous cellular structure are obtained.
  • cochlear fibrocytes and vascular streak cells can be obtained.
  • This culture is preferably performed for 7 days or longer, more preferably for 10 days or longer, and most preferably for 14 days or longer.
  • Pendrin-positive cells can be obtained by adding NaHCO 3 to a new medium from which bFGF has been removed and culturing.
  • the preferred concentration of NaHCO 3 is 0.3% to 1%. This culture is preferably performed for 7 days or longer, more preferably for 10 days or longer, and most preferably for 14 days or longer.
  • apoptosis inhibitor described in (1) can be used in vivo or in vitro.
  • the apoptosis inhibitor When used in vivo, the apoptosis inhibitor can be formulated as follows, for example, in relation to the administration method.
  • the active ingredient may further contain various commonly used ingredients as required.
  • one or more pharmaceutically acceptable excipients for example, one or more pharmaceutically acceptable excipients, disintegrants, diluents, lubricants , Flavoring agents, coloring agents, sweetening agents, flavoring agents, suspending agents, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, auxiliary agents, preservatives, buffering agents, binders, stabilizers, coating agents and the like.
  • the administration route can be selected from systemic administration or local administration.
  • an appropriate administration route is selected according to the disease, symptoms and the like.
  • the drug according to the present invention can be administered by either oral route or parenteral route, but oral route is preferred.
  • parenteral routes include normal intravenous administration and intraarterial administration, as well as subcutaneous, intradermal, intramuscular and intratympanic administration.
  • transmucosal administration or transdermal administration can be performed.
  • the dosage form is not particularly limited, and various dosage forms such as tablets, capsules, powders, granules, pills, solutions, emulsions, suspensions, solutions, spirits, for oral administration, Syrups, extracts, and elixirs can be used.
  • parenteral agents include injections such as subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections; transdermal administration or patches, ointments or lotions; sublingual agents for buccal administration Oral aerosol; as well as aerosols for nasal administration; suppositories, but not limited to.
  • These preparations can be produced by known methods usually used in the preparation process.
  • the drug according to the present invention may be a sustained or sustained release dosage form.
  • the amount of the active ingredient contained in the drug can be appropriately determined depending on the dose range of the active ingredient and the number of times of medication.
  • the dose range is not particularly limited, and the effectiveness of the ingredients contained, dosage form, administration route, type of disease, subject nature (such as body weight, age, medical condition and use of other medicines), and the physician's It is appropriately selected depending on the judgment.
  • an appropriate dose is, for example, about 100 mg to 3000 mg per adult day, preferably about 2250 mg or less, more preferably about 750 mg or less, about 100 mg to 2000 mg per day for children, preferably about 1500 mg or less, and more. Preferably it is about 750 mg or less.
  • these dose modifications can be made using general routine experimentation for optimization well known in the art.
  • the above dose can be administered once to several times a day.
  • apoptosis of the inner ear cells can be suppressed.
  • concentration of the apoptosis inhibitor when added to the medium is not particularly limited, but rapamycin derivatives 0.1 nM-1.0 nM and biguanide compounds 1 mM-10 mM are preferred.
  • the method for treating inner ear hearing loss caused by apoptosis according to the present invention is a method for treating biguanide compounds and / or rapamycin derivatives in patients suffering from inner ear hearing loss caused by apoptosis. Administering.
  • the biguanide compounds and rapamycin derivatives conform to the descriptions in (2) and (3).
  • the method of administering a biguanide type compound and a rapamycin derivative is based on the method of using the apoptosis inhibitor described in (5) in vivo.
  • the method for investigating apoptosis according to the present invention comprises a step of administering a biguanide compound and / or a rapamycin derivative to an inner ear cell in vitro, a step of inducing apoptosis in the inner ear cell, and an inner ear cell. Examining apoptosis.
  • the biguanide compounds and rapamycin derivatives conform to the descriptions in (2) and (3).
  • the biguanide compound may be a lead compound synthesized using metformin or rapamycin as a seed compound, and the rapamycin derivative may be a lead compound synthesized using rapamycin as a seed compound.
  • the inner ear cells used here are as described in (1).
  • a known method can be used, and examples thereof include an epoxomicin treatment (for example, treatment with 0.5 ⁇ M epoxomicin for 24 hours).
  • a known method can be used as a method for examining the apoptosis occurring in the inner ear cells in this manner. For example, a method for detecting phosphatidylserine that has moved to the outside of the cell membrane due to apoptosis using Annexin V, 7-AAD (7-amino -actinomycin D) is detected to be able to penetrate the cell membrane, and SR-VAD-FMK (sulforhodamine-valyl-alanyl-aspartyl-fluoromethylketone), a caspase inhibitor, is fluorescently labeled to detect the presence of active caspase. Examples include a method for detecting, a method for detecting fragmented DNA, and the like.
  • the screening method for an apoptosis inhibitor substance of the present invention comprises a step of administering a biguanide compound represented by the following structural formula, which is a candidate for an apoptosis inhibitor substance, to an inner ear cell in vitro; A step of inducing apoptosis, and a step of examining apoptosis occurring in the inner ear cells. Details of each step are in accordance with (5) and (7).
  • apoptosis is similarly induced without administering the above compound to the same inner ear cells, and the resulting apoptosis is examined.
  • the proportion of cells that have undergone apoptosis is compared between when the compound is administered and when the compound is not administered, and a compound that suppresses apoptosis when the compound is administered is identified as an apoptosis inhibitor.
  • the drug screening method of the present invention comprises administering a biguanide compound represented by the following structural formula, which is a drug candidate, to inner ear cells in vitro.
  • an apoptosis inhibitor is identified and used as a drug for treating inner ear hearing loss caused by apoptosis.
  • the method for specifying an apoptosis inhibitor is according to (8).
  • Pendred syndrome was cited as an example of inner ear hearing loss caused by apoptosis, but inner ear hearing loss is not limited to this disease.
  • mononuclear cells were separated from patient peripheral blood specimens and expression vectors were introduced by electroporation by the following method.
  • About 8 ml of blood was added to a BD vacutainer blood collection tube (with ACD solution) and mixed, and an equal amount of PBS was added and mixed.
  • “Blood + PBS” was layered on top of Ficoll against the equivalent of “blood + PBS”. After centrifuging at 25 ° C. for 400 G ⁇ 30 minutes, the white turbid intermediate layer was slowly collected with a Pipetman, added with 12 ml of PBS, and centrifuged again at 25 ° C. for 200 G ⁇ 10 minutes.
  • KBM-502 After removing the supernatant by aspiration, an appropriate amount of KBM-502 was added and suspended, and the number of cells was counted. 3 ⁇ 10 6 cells were dispensed into 15 ml tubes and centrifuged at 25 ° C. for 200 g ⁇ 10 minutes. After removing the supernatant, the cells are suspended in a culture medium containing a reprogramming factor expression vector, electroporated with a Nucleofector II Device, and then suspended in a blood cell medium KBM-502 containing a CD34 antibody to obtain a mouse-derived feeder. Seeded on cells.
  • Reprogramming factor expression vectors are pCE-hOCT3 / 4 (0.63 ⁇ g), pCE-hSK (0.63 ⁇ g), pCE-hUL (0.63 ⁇ g), pCE-mp53DD (0.63 ⁇ g), pCXB-EBNA1 (0.50 ⁇ g). Mixed and introduced into cells.
  • IPS cell colonies could be obtained 3 weeks after seeding on feeder cells, and iPS cell lines derived from each patient were established from the single colonies.
  • the established iPS cell lines were confirmed for the quality of iPS cells by confirming the expression of undifferentiated markers, trigerm germ differentiation ability, and karyotype.
  • fluorescent antibody staining was carried out by performing antigen activation on fixed iPS cells on a cell culture dish, followed by mouse OCT3 / 4 antibody, rabbit anti-NANOG antibody, rat anti-SSEA3 Antibody, mouse anti-SSEA4 antibody, mouse anti-TRA1-60 antibody, and mouse anti-TRA1-81 antibody were added (500 times, 1000 times, 300 times, 500 times, 500 times, 500 times, respectively).
  • labeling was carried out using a fluorescent secondary antibody specific for each animal species IgG, and the expression of each embryo was confirmed by observation with a fluorescence microscope. The three embryo-like differentiation ability was confirmed by the following method.
  • the iPS cells cultured on the feeder cells were separated from the feeder cells using a dissociation solution, and then suspended and cultured on a low adsorption plate (Corning Ultra-Low Attachment plate) for 1 week to form embryoid bodies.
  • a dissociation solution a dissociation solution
  • a low adsorption plate Corel Ultra-Low Attachment plate
  • the formed embryoid body was collected and seeded in a well coated with poly-O-fibronectine.
  • the seeded embryoid body was continuously cultured for 3 weeks to be differentiated. Three weeks after sowing, the three embryonic differentiation ability was confirmed by fluorescent antibody staining.
  • mice immobilized on a slide are subjected to an antigen activation operation, and then mouse anti- ⁇ -3 tubulin antibody (ectodermal marker), mouse anti-SMA antibody (mesoderm marker), mouse anti-AFP Antibody (endoderm marker) was added (250 times, 150 times, 250 times, respectively). Then, it labeled using the fluorescent secondary antibody specific to each animal species IgG, and observed with the fluorescence microscope, and each expression was confirmed.
  • mouse anti- ⁇ -3 tubulin antibody ectodermal marker
  • mouse anti-SMA antibody mesoderm marker
  • mouse anti-AFP Antibody endoderm marker
  • the karyotype was determined using the G-band dyeing method, and it was confirmed that the normal karyotype was maintained in each line.
  • Y27632-containing mTeSR1 was added to the well coated with Matri ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Gel in 1) above.
  • Day 11 Medium was replaced with fresh serum-free medium (DMEM / F12 + B27 + N2 + GlutaMax + Nonessential aminoacid + bFGF, FGF3, FGF10, FGF19)
  • Day 12 Centrifuge the cells, collect the cells by centrifugation, and suspend with DMEM / F12 + N2 + B27 medium + bFGF, FGF3, FGF10, FGF19 (25 ng / ml, 25 ng / ml, 25 ng / ml, 25 ng / ml, 25 ng / ml) It became cloudy. Cells dissociated into single cells with a nylon mesh were collected and seeded in poly-O-fibronectine-coated wells.
  • Culturing was performed under hypoxic conditions (O 2 4%, CO 2 5%). Thereafter, every 3 days, the medium was changed to DMEM / F12 + N2 + B27 medium + bFGF, EGF, IGF1 (20 ng / ml, 20 ng / ml, 50 ng / ml) and passaged approximately every 6 days. .
  • the obtained cells were subjected to fluorescent antibody staining using anti-PAX2 antibody, anti-PAX8 antibody, and anti-SOX2 antibody, which are markers for inner ear stem cells.
  • the fluorescent antibody staining the cells fixed on the slide were subjected to an antigen activation operation, and then a rabbit anti-PAX2 antibody, a mouse anti-PAX8 antibody, and a goat anti-SOX2 antibody were added (50 times, 100 times, respectively). 100-fold dilution). Then, it labeled using the fluorescent secondary antibody specific for each animal species IgG, and observed with the fluorescence microscope. As a positive control, nuclear staining was performed with Hoechst.
  • DMEM / F12 + N2 + B27 medium + bFGF, EGF, IGF1, Wnt3a, FGF9, FGF20, Heparin, (+ TGF ⁇ inhibitor) concentration of each factor is 25ng / ml, 25ng / ml, 50ng / ml, 20ng / ml , 50 ng / ml, 50 ng / ml, 10 ng / ml
  • suspended culture about 20000 cells / well (96 well)
  • a low adsorption plate Corning Ultra-Low Attachment plate
  • the spheres were collected so as not to break, transferred to a plate coated with poly-O-fibronectine and cultured for adhesion (about 5-10 spheres).
  • the medium was changed to DMEM / F12 + N2 + B27 medium + T3, IGF1 (the concentration of each factor was 60 ng / ml, 10 ng / ml), and thereafter the medium was changed once every three days. Hair cells, support cells, and cochlear ganglion cells were obtained after 5 days of adhesion culture.
  • the obtained cells were stained with fluorescent antibodies using Escher, Myosin 7a, and Prestin, which are markers for hair cells, using the respective antibodies (FIG. 2). Further, fluorescent antibody staining was performed on each of the antibodies for islet1, a marker for nerve cells, p27 / Kip1, a marker for hair cells, and prestin, a marker for hair cells (FIG. 3). Further, GFAP, which is a marker for cochlear ganglia, and calbindin and beta III tubulin, which are markers for mature neurons, were stained with fluorescent antibodies using the respective antibodies (FIG. 4).
  • FIGS. 2 to 3 it was confirmed that hair cell markers, myosin 7a, espin, prestin-positive cells, and supporting cell markers p27kip1, ISLET1-expressing cells were induced.
  • FIG. 4 cells expressing GFAP expressed by calbindin positive cells and associated glia, which are markers of cochlear neurons, were obtained at the same time.
  • hair cells, supporting cells, and cochlear ganglion cells which are main cells constituting the inner ear sensory epithelial cells, are induced in a three-dimensional manner with the same arrangement as in vivo.
  • antigen-stimulating operation was performed on the cells fixed on the slide, and then rabbit anti-carbonic acid dehydrogenase II antibody, anti-aquaporin 1 antibody, anti-sodium potassium ATPase Antibody and vimentin antibody, mouse anti-connexin 26, connexin 30 antibody, goat anti-pendrin antibody were added (all diluted 100 times). Then, it labeled using the fluorescent secondary antibody specific for each animal species IgG, and observed with the fluorescence microscope.
  • Pendrin positive cells were induced from patient iPS cells and healthy person-derived iPS / ES cells by the method described above. The induced cells were cultured for 24 hours in the presence of Epoxomicin (0.5 ⁇ M) and loaded with cell stress.
  • the inner ear cells derived from patients with Pendred syndrome are less susceptible to stress than normal cells, and the cell survival rate when a load is applied is reduced.
  • Pendrin positive cells were induced from patient iPS cells and healthy person-derived iPS / ES cells by the method described above. The following operations were performed for each group on the induced cells.
  • rapamycin administration group rapamycin was administered for 3 days.
  • cell stress + rapamycin administration group after 2 days of rapamycin (0.2 nM) load, epoxomicin (0.5 ⁇ M) as cell stress was loaded for 24 hours simultaneously with rapamycin.
  • epoxomicin 0.5 ⁇ M
  • rapamycin suppresses a decrease in cell viability when a load is applied to inner ear cells derived from patients with Pendred syndrome.
  • Pendrin positive cells were induced from patient iPS cells and healthy person-derived iPS / ES cells by the method described above. The following operations were performed for each group on the induced cells.
  • rapamycin administration group rapamycin was administered for 3 days.
  • cell stress + rapamycin administration group after administration of rapamycin (0.2 nM) for 2 days, epoxomicin (0.5 ⁇ M) was loaded as cell stress at the same time as rapamycin for 24 hours.
  • epoxomicin 0.5 ⁇ M
  • Pendrin positive cells were induced from patient iPS cells and healthy person-derived iPS / ES cells by the method described above. The following operations were performed for each group on the induced cells.
  • rapamycin administration group rapamycin (0.2 nM) was administered for 3 days.
  • cell stress + rapamycin administration group after administration of rapamycin (0.2 nM) for 2 days, epoxomicin (0.5 ⁇ M) was loaded as cell stress at the same time as rapamycin for 24 hours.
  • DMSO was administered for 2 days and then only epoxomicin (0.5 ⁇ M) was loaded for 24 hours.
  • metformin administration group 1 mM and 10 mM metformin were administered for 2 days, respectively, and epoxomicin (0.5 ⁇ M) was loaded as cell stress simultaneously with metformin for 24 hours.
  • fluorescent antibody staining the cells fixed on the slide were subjected to an antigen activation operation, and then a goat anti-pendrin antibody and a rabbit anti-leaved caspase 3 antibody were added (100 times and 300 times, respectively).
  • metformin suppresses a decrease in cell viability when a load is applied to inner ear cells derived from a Pendred syndrome patient.
  • Pendrin positive cells were induced from patient iPS cells and healthy person-derived iPS / ES cells by the method described above. The following operations were performed for each group on the induced cells.
  • rapamycin administration group rapamycin was administered for 3 days.
  • cell stress + rapamycin administration group after administration of rapamycin (0.2 nM) for 2 days, epoxomicin (0.5 ⁇ M) was loaded as cell stress at the same time as rapamycin for 24 hours.
  • DMSO was administered for 2 days and then only epoxomicin (0.5 ⁇ M) was loaded for 24 hours.
  • metformin administration group 1 mM and 10 mM metformin were administered for 2 days, respectively, and epoxomicin (0.5 ⁇ M) was loaded as cell stress simultaneously with metformin for 24 hours.
  • fluorescent antibody staining the cells fixed on the slide were subjected to an antigen activation operation, and then a goat anti-pendrin antibody and a rabbit anti-leaved caspase 3 antibody were added (100 times and 300 times, respectively).
  • metformin suppresses apoptosis when a load is applied to inner ear cells derived from patients with Pendred syndrome.
  • [result] Calpeptin is a kind of calpain inhibitor, and is known to suppress apoptosis of nerve cells in neurodegenerative diseases and the like.
  • apoptosis of inner ear cells derived from iPS cells derived from Pendred syndrome patients cannot be suppressed. This indicates that it is unclear whether apoptosis of inner ear cells can be suppressed even if there is apoptosis-inhibiting activity against other cells.
  • a novel apoptosis inhibitor and a therapeutic agent for inner ear hearing loss can be provided.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本発明は、新規なアポトーシス抑制剤及び内耳性難聴治療薬を提供することを目的とする。そのための薬剤として、下記構造式Ｉに示されるビグアナイド系化合物または下記構造式ＩＩに示されるラパマイシン誘導体を有効成分として含有する薬剤とする。 （式（Ｉ）中、Ｒ1～Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ6-10アリール基、５若しくは６員へテロアリール基、又は５若しくは６員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択される。） （式（ＩＩ）中、Ｒ1は、Ｃ1-6アルキルまたはＣ3-6アルキニルであり、Ｒ2は、Ｈ、－ＣＨ２－ＯＨまたは－ＣＨ2－ＣＨ2－ＯＨであり、そしてＸは、＝Ｏ、（Ｈ，Ｈ）または（Ｈ，ＯＨ）である。）

Description

内耳性難聴治療薬
　本発明は、内耳性難聴治療薬に関する。
　内耳において、蝸牛の中にある有毛細胞、ラセン神経節細胞が聴覚に重要な役割を果たしている。これらの細胞は、再生能力がないため、一度死んでしまうと治療効果が期待できない。このため、難聴の薬物治療は困難であるとされている。
　従って、現在、難聴に使用されている治療薬には、内耳の循環障害や炎症によって生じる突発性難聴に対する、循環改善薬や抗炎症剤程度しか存在せず（特許公開２００４－１２３７１３）、他の難聴に対する薬物の開発が期待されている。
　本発明は、新規なアポトーシス抑制剤及び内耳性難聴治療薬を提供することを目的としてなされた。
　本発明の一実施態様は、下記構造式Ｉに示されるビグアナイド系化合物または下記構造式ＩＩに示されるラパマイシン誘導体を有効成分として含有する、アポトーシスに起因する内耳性難聴を治療するための薬剤である。前記アポトーシスに起因する内耳性難聴が、ペンドレッド症候群に由来してもよい。前記ビグアナイド系化合物がメトホルミンであってもよい。前記ラパマイシン誘導体がラパマイシンであってもよい。
　本発明のさらなる一実施態様は、下記構造式Ｉに示されるビグアナイド系化合物または下記構造式ＩＩに示されるラパマイシン誘導体を有効成分として含有する、アポトーシス抑制剤である。このアポトーシス抑制剤は内耳細胞のアポトーシスを抑制するものであってもよい。前記ビグアナイド系化合物がメトホルミンであってもよい。前記ラパマイシン誘導体がラパマイシンであってもよい。
　本発明のさらなる一実施態様は、アポトーシスを調べる方法であって、下記構造式（Ｉ）または（ＩＩ）に示される化合物をin vitroで内耳細胞に投与する工程と、前記内耳細胞にアポトーシスを誘導する工程と、前記内耳細胞に生じるアポトーシスを調べる工程と、を含む方法である。
　本発明のさらなる一実施態様は、アポトーシス抑制物質のスクリーニング方法であって、下記構造式（Ｉ）または（ＩＩ）に示される化合物をin vitroで内耳細胞に投与する工程と、前記内耳細胞にアポトーシスを誘導する工程と、前記内耳細胞に生じるアポトーシスを調べる工程と、を含む方法である。
　本発明のさらなる一実施態様は、アポトーシスに起因する内耳性難聴を治療するための薬剤のスクリーニング方法であって、下記構造式（Ｉ）または（ＩＩ）に示される化合物をin vitroで内耳細胞に投与する工程と、前記内耳細胞にアポトーシスを誘導する工程と、前記内耳細胞に生じるアポトーシスを調べる工程と、を含む方法である。
　本発明のさらなる一実施態様は、アポトーシスに起因する内耳性難聴を有する患者を治療するための治療方法であって、前記患者に、有効量の下記構造式Ｉに示されるビグアナイド系化合物または下記構造式ＩＩに示されるラパマイシン誘導体を投与することを含む、治療方法である。前記ビグアナイド系化合物または前記ラパマイシン誘導体が鼓室内に投与されてもよい。前記アポトーシスに起因する内耳性難聴が、ペンドレッド症候群に由来してもよい。前記ビグアナイド系化合物がメトホルミンであってもよい。前記ラパマイシン誘導体がラパマイシンであってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
　　　　　　　　　（Ｉ）
（式中、Ｒ1～Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ6-10アリール基、５若しくは６員へテロアリール基、又は５若しくは６員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択される。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
　　　　　　　　　（ＩＩ）
（式中、Ｒ1は、Ｃ1-6アルキルまたはＣ3-6アルキニルであり、Ｒ2は、Ｈ、－ＣＨ２－ＯＨまたは－ＣＨ2－ＣＨ2－ＯＨであり、そしてＸは、＝Ｏ、（Ｈ，Ｈ）または（Ｈ，ＯＨ）である。）
＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝
　本出願は、２０１５年１月１９日付で出願した日本国特許出願２０１５－００７８４９に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
（Ａ）本発明の一実施例において、得られた内耳幹細胞の位相差顕微鏡写真である。（Ｂ）本発明の一実施例において、得られた内耳幹細胞を（ａ）抗ＰＡＸ２抗体、（ｂ）抗ＰＡＸ８抗体、（ｃ）抗ＳＯＸ２抗体で染色した結果を示した顕微鏡写真である。 本発明の一実施例（有毛細胞の分化誘導）において、内耳幹細胞を浮遊培養し、ＦＧＦ９およびＦＧＦ２０存在下で培養することによって、有毛細胞のマーカーであるエスピン、ミオシン７ａ、プレスチンが発現することを示した顕微鏡写真である。（左図；三重染色）エスピン、ミオシン７ａ、プレスチン（右上）ミオシン７ａ（右下）エスピンの抗体で、染色した。 本発明の一実施例（支持細胞の分化誘導）において、内耳幹細胞を浮遊培養し、ＦＧＦ９およびＦＧＦ２０存在下で培養することによって、支持細胞マーカーであるp27kip1、ISLET１が発現することを示した顕微鏡写真である。（左図；三重染色）p27kip1、ISLET１、プレスチン（右図；二重染色）ISLET１、プレスチンの抗体で、染色した。 本発明の一実施例（蝸牛神経節細胞の分化誘導）において、内耳幹細胞を浮遊培養し、ＦＧＦ９およびＦＧＦ２０存在下で培養することによって、蝸牛神経節グリア細胞のマーカーであるＧＦＡＰ、成熟神経細胞のマーカーであるカルビンジン及びベータＩＩＩチューブリンが発現することを示した顕微鏡写真である。ＧＦＡＰ、カルビンジン及びベータＩＩＩチューブリンの抗体で、三重染色をした。 本発明の一実施例（Periotic mesenchymal 細胞の分化誘導）において、内耳幹細胞をｂＦＧＦ存在下で培養することにより、Periotic mesenchymal 細胞のマーカーであるＳ１００、ＰＯＵ３Ｆ４、カルデスモン、ＴＢＸ１８が発現することを示した顕微鏡写真である。（上左）Ｓ１００、カルデスモン、ＴＢＸ１８（上右）ｃｘ２６、ＴＢＸ１８、ＰＯＵ３ｆ４の抗体で、三重染色をした。（下図）ｂＦＧＦ存在下で長期間培養したときの位相差顕微鏡写真である。 本発明の一実施例（内耳線維細胞及びペンドリン陽性細胞の分化誘導）において、Periotic mesenchymal 細胞をｂＦＧＦ存在下で培養した後、ｂＦＧＦ非存在下で培養することにより、蝸牛線維細胞、および蝸牛血管条細胞のマーカーである炭酸脱水素酵素、アクアポリン１、ナトリウムカリウムＡＴＰアーゼ、ビメンチン、コネキシン２６および３０が発現すること、Periotic mesenchymal 細胞をｂＦＧＦ存在下で培養した後、NaHCO3存在下で培養することにより、ペンドリンが発現すること、を示した顕微鏡写真である。（上左）ＣＡＩＩとコネキシン２６（上中）ナトリウムカリウムＡＴＰアーゼとコネキシン２６（上右）アクアポリン１とコネキシン２６（下左）ビメンチンとコネキシン２６、の抗体で二重染色した。（下右）ＣＡＩＩとペンドリンの抗体で二重染色した。 本発明の一実施例において、ゲンタマイシン投与により内耳感覚上皮障害が誘導されたことを示した結果である。 本発明の一実施例において、ペンドレッド症候群患者ｉＰＳ細胞由来の内耳細胞において細胞内凝集体が形成されることを示す写真である。 本発明の一実施例において、ペンドレッド症候群患者ｉＰＳ細胞由来の内耳細胞の細胞生存率が、ストレス負荷時に低下することを示すグラフである。 本発明の一実施例において、ラパマイシンが、図９に示した細胞生存率の低下を抑制することを示すグラフである。 本発明の一実施例において、図９に示した細胞生存率の低下の原因であるアポトーシスを、ラパマイシンが抑制することを示すグラフである。 本発明の一実施例において、メトホルミンが、図９に示した細胞生存率の低下を抑制することを示すグラフである。 本発明の一実施例において、図９に示した細胞生存率の低下の原因であるアポトーシスを、メトホルミンが抑制することを示すグラフである。 本発明の一参考例において、図９に示した細胞生存率の低下の原因であるアポトーシスを、カルペプチンが抑制できないことを示すグラフである。
　以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
（１）アポトーシス抑制剤
　本発明は、ビグアナイド系化合物（下記構造式Ｉ）またはラパマイシン誘導体（下記構造式ＩＩ）またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、内耳細胞のアポトーシス抑制剤である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
　　　　　　　　　（Ｉ）

（式中、Ｒ1～Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ6-10アリール基、５若しくは６員へテロアリール基、又は５若しくは６員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択される。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
　　　　　　　　　（ＩＩ）
（式中、Ｒ1は、Ｃ1-6アルキルまたはＣ3-6アルキニルであり、Ｒ2は、Ｈ、－ＣＨ２－ＯＨまたは－ＣＨ2－ＣＨ2－ＯＨであり、そしてＸは、＝Ｏ、（Ｈ，Ｈ）または（Ｈ，ＯＨ）である。）
　アポトーシス抑制の対象とする内耳細胞は特に限定されず、アポトーシスを起こしやすい内耳細胞が好ましく、アポトーシスに起因する内耳性難聴に罹患した動物由来であることがさらに好ましい。内耳性難聴は、アポトーシスに起因する内耳性難聴であれば特に限定されず、例えば、ペンドレッド症候群による難聴、老人性難聴などが例示できる。また、アポトーシス抑制の対象とする内耳細胞は、生物個体の体内に存在する細胞であっても、培養細胞であってもよい。生物個体の種は特に限定されないが、脊椎動物が好ましく、ヒトが最も好ましい。培養細胞は、樹立された細胞株であっても、初代培養細胞であっても、幹細胞から分化させた内耳細胞であってもよい。幹細胞から内耳細胞への分化誘導法の詳細は、後述する。
　このように、本発明のアポトーシス抑制剤は、内耳細胞に用いることができることから、アポトーシスに起因する内耳性難聴を治療するための薬剤として有用である。治療の対象となる内耳性難聴は、アポトーシスに起因する内耳性難聴であれば特に限定されず、例えば、ペンドレッド症候群による難聴、老人性難聴などが例示できる。ここで、治療とは、上記難聴を回復すること、上記難聴の進行を止めること、上記難聴の予防をすることのいずれをも含むものとする。
（２）ビグアナイド系化合物
　ビグアナイドとは、グアニジン２分子が窒素原子を共有して連なった、下記構造（ＩＩＩ）を有する化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
　　　　　（ＩＩＩ）

　本明細書において、ビグアナイド系化合物は、ビグアナイドおよびビグアナイドの水素が置換された化合物の総称をいうものとする。置換基としては、特に限定されず、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ6-10アリール基、５若しくは６員へテロアリール基、５若しくは６員の非芳香族系へテロ環式基（Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ6-10アリール基、５若しくは６員へテロアリール基、５若しくは６員の非芳香族系へテロ環式基は、ハロゲン原子、シアノ基、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい）などが例示できる。すなわち、ビグアナイド系化合物は、以下の構造式に示される化合物を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
　　　　　　　　　（Ｉ）
（式中、Ｒ1～Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ6-10アリール基、５若しくは６員へテロアリール基、又は５若しくは６員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択されるが、全てが水素原子ではない。）
　なお、最も好ましい化合物は、下記構造式ＩＶを有するメトホルミンである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
　　　　　　（ＩＶ）

（３）ラパマイシン誘導体
　ラパマイシンは、以下の構造式Ｖを有する化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
　　　　　　　　　（Ｖ）

　本明細書において、ラパマイシン誘導体は、以下の構造式に示される化合物を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
　　　　　　　　　　（ＩＩ）
（式中、Ｒ1は、Ｃ1-6アルキルまたはＣ3-6アルキニルであり、Ｒ2は、Ｈ、－ＣＨ２－ＯＨまたは－ＣＨ2－ＣＨ2－ＯＨであり、そしてＸは、＝Ｏ、（Ｈ，Ｈ）または（Ｈ，ＯＨ）である。）
　例えば、ラパマイシン誘導体には、（１）４０－Ｏ－置換ラパマイシン誘導体（例えば、４０－Ｏ－アルキル－ラパマイシン誘導体（４０－Ｏ－ヒドロキシアルキル－ラパマイシン誘導体や４０－Ｏ－（２－ヒドロキシ）－エチル－ラパマイシンなど））、（２）３２－デオキソ－ラパマイシンとその誘導体、および３２－ヒドロキシ－ラパマイシンとその誘導体、（３）１６－Ｏ－置換ラパマイシン誘導体（例えば１６－ペント－２－イニルオキシ－３２－デオキソラパマイシン、１６－ペント－２－イニルオキシ－３２（ＳまたはＲ）－ジヒドロ－ラパマイシン、１６－ペント－２－イニルオキシ－３２（ＳまたはＲ）－ジヒドロ－４０－Ｏ－（２－ヒドロキシエチル）－ラパマイシン）、（４）４０位の酸素基にてアシル化されるラパマイシン誘導体（例えば、４０－［３－ヒドロキシ－２－（ヒドロキシ－メチル）－２－プロピオン酸メチル］－ラパマイシン（ＣＣＩ７７９としても公知））、（５）ヘテロシクリルにより４０位にて置換されるラパマイシン誘導体（例えば、４０－エピ－（テトラゾリル）－ラパマイシン（ＡＢＴ５７８としても公知））、（６）例えばＷＯ９８０２４４１またはＷＯ０１１４３８７に記載の、いわゆるラパログ（例えば、４０－Ｏ－ホスホ－含有ラパマイシン誘導体（４０－Ｏ－ジメチルホスフィニル－ラパマイシン（ＡＰ２３５７３を含む）など））、（７）４０－Ｏ－アルコキシ－アルキル－ラパマイシン誘導体（例えば、商品名バイオリムス（バイオリムスＡ９として開示される化合物（４０－Ｏ－（２－エトキシ）－エチル－ラパマイシンを含む）、および商品名ＴＡＦＡ－９３、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３６７５またはＡＰ２３８４１として開示される化合物）が含まれるが、（８）ラパマイシンが最も好ましい。
（４）幹細胞から内耳細胞への分化誘導
　以下、幹細胞から内耳細胞への分化誘導法（以下、内耳細胞誘導法とも称する）を述べる。幹細胞は特に限定されないが、多能性幹細胞や内耳幹細胞が例示できる。以下、多能性幹細胞を例として、内耳細胞誘導法を詳述する。
　この内耳細胞誘導法は、以下の流れに沿って行うことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
［１］多能性幹細胞から内耳幹細胞への分化誘導
　多能性幹細胞から内耳幹細胞への誘導方法においては、
　　第１工程：多能性幹細胞をROCK阻害剤存在下で培養する工程
　　第２工程：ROCK阻害剤非存在下で培養する工程
　　第３工程：無血清培地で培養する工程
　　第４工程：増殖因子含有無血清培地で培養する工程
　　第５工程：単一細胞に解離する工程
　を、この順で行う。なお、工程間には、本法には本質的ではない工程が挿入されてもかまわない。
　多能性幹細胞は分化多能性（multipotencyまたはpluripotency）を有する細胞であれば特に限定されず、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞などが例示できるが、万能性（totipotency）を有する細胞が特に好ましい。
　ROCK（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）阻害剤も特に限定されず、例えば、Y-27632、Fasudil hydrochloride、K-115(リハ？スシ？ル塩酸塩水和物) 、DE-104などが例示できる。ROCK阻害剤の濃度は、適宜最適濃度を容易に決定できるが、０．０５％～０．２％が好ましく、０．１％がより好ましい。
　第１工程及び第２工程で用いる培地は、多能性幹細胞が維持できる培地であれば特に限定されず、ｍＴｅＳＲ１が例示できる。第１工程は、１～３日間行うことが好ましく、１～２日間行うことがより好ましい。第２工程は、１～３日間行うことが好ましく、１～２日間行うことがより好ましい。
　第２工程において、ROCK阻害剤非存在下の意味は、ROCK阻害剤が実質的に非存在であればよく、効果がないレベルの濃度で含まれていてもよい。
　第３工程で用いる無血清培地は、DMEM/F12+B27+N2+GlutaMax+Nonessential aminoacidなどが例示できる。第３工程の培養は、２～６日間行うことが好ましく、２～４日間行うことがより好ましく、３日間行うことが最も好ましい。
　第４工程で用いる無血清培地は、DMEM/F12+B27+N2+GlutaMax+Nonessential aminoacidなどが例示できるが、第３工程で用いる無血清培地と同じものを用いることが好ましい。増殖因子は、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１９からなる群のうち、少なくとも一つの増殖因子を添加すればよいが、全部添加することが好ましい。それぞれの好ましい濃度は、10～50ng/ml、10～50 ng/ml、10～50 ng/ml、10～50 ng/mlである。また、培養の前期にＢＭＰ４の存在化で培養し、後期にＢＭＰ４の非存在下で培養することが好ましい。前期に添加するＢＭＰ４の濃度は、5～50ng/mlが好ましい。後期の培養で、ＢＭＰ４非存在下の意味は、ＢＭＰ４が実質的に非存在であればよく、効果がないレベルの濃度で含まれていてもよい。前期の培養は、２～６日間行うことが好ましく、２～４日間行うことがより好ましく、３日間行うことが最も好ましい。また、後期の培養は、２～６日間行うことが好ましく、２～４日間行うことがより好ましく、３日間行うことが最も好ましい。このようにして得られた内耳幹細胞は、内耳幹細胞への分化能を有する。
　第５工程として、第４工程で得られた細胞塊を解離し、単一細胞にする。単一細胞に解離する方法は特に限定されず、例えばトリプシンやアクターゼを用いることができる。酵素や物理的処理（ピペッティングなど）で解離した後、未分化細胞や細胞塊を除去するため、ナイロンメッシュ等を用いて、単一細胞に解離した細胞を選択し、残存する細胞塊を除去するのが好ましい。
　また、内耳幹細胞を培養するには、コーティング剤でコートした培養皿を用い、幹細胞能の維持のために低酸素条件において細胞を培養する（第６工程）。用いるコーティング剤は特に限定されないが、poly-O-fibronectineが最も好ましい。培養する幹細胞は、第４工程で得られたものであっても第５工程で出られたものであってもよい。本工程で用いる血清入培地は、ＤＭＥＭやＦ１２などが例示できるが、血清（例えばＦＢＳなど）以外にもＮ２及びＢ２７を含有したＤＭＥＭ／Ｆ１２が最も好ましい。また、本工程の低酸素条件では、酸素濃度は、４％～１０％が好ましく、４％～６％がより好ましく、４％が最も好ましい。培養に添加する増殖因子は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ１からなる群のうち、少なくとも一つの増殖因子を添加すればよいが、全部添加することが好ましい。それぞれの好ましい濃度は、10～30ng/ml、10～30ng/ml、10～50ng/ml、である。
［２］内耳幹細胞から内耳感覚上皮(支持細胞、有毛細胞)、蝸牛神経節細胞及び血管条細胞への分化誘導
　内耳幹細胞から内耳感覚上皮、蝸牛神経節細胞及び血管条細胞への誘導方法においては、
　　第１工程：前記内耳幹細胞を浮遊培養する工程と、
　　第２工程：ＦＧＦ９およびＦＧＦ２０存在下で培養する工程と
をこの順で行う。なお、工程間には、本法には本質的ではない工程が挿入されてもかまわない。
　第１工程において、内耳幹細胞を浮遊培養する。具体的には、まず、第５工程と同様にして、内耳幹細胞を単一細胞に解離する。解離した細胞の培養は浮遊状態で行い、そのため、培養皿は、非接着状態で培養できる浮遊培養用のディッシュを用いる。例えば、細菌培養用プラスティックディッシュなどの、非接着培養用ディッシュを用いればよい。ここで、浮遊培養とは、目的の細胞や細胞塊を培養器の底面に接着させずに培養することを意味し、接着培養とは、目的の細胞や細胞塊を培養器の底面に接着させて培養することを意味する。ここで、培養中、細胞や細胞塊が培養器の底面に接着するとは、細胞や細胞塊が、ＥＣＭなどに含まれる細胞基質接着分子を通じて、培養器底面と接着している状態を意味し、培養液を軽く揺らしても細胞や細胞塊が培養液中に浮かんでこない状態を言う。一方、培養中、細胞や細胞塊が培養器の底面に接着しないとは、細胞や細胞塊が、ＥＣＭなどに含まれる細胞-基質接着分子を通じて培養器底面と接着していない状態を意味し、たとえ底面に触れていても培養液を軽く揺らすと細胞や細胞塊が培養液中に浮かんでくるような状態を言う。接着培養の際は、細胞の基質への接着を促進するために、プラスティックディッシュの底表面を化学処理したり、接着を促進する接着用コーティング剤（ゼラチン、ポリリジン、寒天など）でコートしたりすることが好ましい。浮遊培養の際は、プラスティックディッシュの底表面は処理しないか、細胞の気質への接着を阻止するための接着阻止用コーティング剤（ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）など）でコートしたりすることが好ましい。なお、接着培養であっても、目的の細胞が接着するまでに時間がかかり、ある程度の時間、浮遊状態にある場合があるが、時間がかかってもその細胞が最終的に接着する場合は、接着培養に含めることとする。浮遊培養に用いる培地は特に限定されず、ＤＭＥＭやＦ１２などが例示できるが、血清（例えばＦＢＳなど）、Ｎ２、Ｂ２７、及び増殖因子などの外部因子を含有した培地が好ましく、その培地としてＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いるのが最も好ましい。添加する外部因子としては、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ１、Ｗｎｔ３ａ、ＦＧＦ９、ＦＧＦ２０、Heparin、ＴＧＦβ阻害薬からなる群のうち、少なくとも一つの増殖因子を含めばよいが、増殖因子とヘパリンを含むことが好ましく、全部含むことがより好ましい。それぞれの好ましい濃度は、10～50、10～50、10～100、10～50、10～100、10～100、1～50 ng/mlであるが、特に限定されない。この浮遊培養は、３～７日間行うことが好ましく、４～６日間行うことがより好ましく、５日間行うことが最も好ましい。
　その後、培地を追加して、さらに浮遊培養を続ける。この培養は、３～７日間行うことが好ましく、４～６日間行うことがより好ましく、５日間行うことが最も好ましい。追加する培地は特に限定されず、ＤＭＥＭやＦ１２などが例示できるが、血清（例えばＦＢＳなど）、Ｎ２、Ｂ２７、及び増殖因子などの外部因子を含有した培地が好ましく、その培地としてＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いるのが最も好ましいが、外部因子以外は、最初の浮遊培養で用いた培地と同一のものを用いるのが好ましい。添加する外部因子としては、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ１からなる群のうち、少なくとも一つの増殖因子を含めばよいが、全部含むことがより好ましい。それぞれの好ましい濃度は、10～30ng/ml、10～30ng/ml、10～50ng/ml、である。
　ここで、形成されたスフェアを壊さないようにして回収し、同じ培地で接着培養を行う。１時間～２日後、好ましくは１時間～３６時間後、最好ましくは翌日に、培地を、血清（例えばＦＢＳなど）、Ｎ２、Ｂ２７、及び増殖因子などの外部因子を含有した新たな培地に交換する。今回、添加する外部因子としては、Ｔ３及び／又はＩＧＦ１とするのが好ましく、外部因子以外は、最初の浮遊培養で用いた培地と同一のものを用いるのが好ましい。それぞれの好ましい濃度は、10～100、1～50 ng/mlである。この培地を用いて、培養を続けることによって、有毛細胞、支持細胞、蝸牛神経節細胞及び血管条細胞を分化させることができる。この培養は、３日以上行うことが好ましく、５日以上行うことがより好ましい。この間、培地交換のみ行えばよい。
［３］内耳幹細胞から、Periotic mesenchymal 細胞を経由して、蝸牛線維細胞、血管条細胞、ペンドリン陽性細胞へと至る分化誘導
　内耳幹細胞からPeriotic mesenchymal 細胞への誘導方法においては、内耳幹細胞をｂＦＧＦ含有培地で培養する工程を含む。なお、この方法に、本発明には本質的ではない工程が挿入されてもかまわない。
　ここで用いる培地は特に限定されず、ＤＭＥＭやＦ１２などが例示できるが、血清（例えばＦＢＳなど）及びｂＦＧＦを含有した培地が好ましく、その培地としてＤＭＥＭを用いるのが最も好ましい。ｂＦＧＦの好ましい濃度は、1～50 ng/mlである。この培養は、7日間以上行うことが好ましく、10日間以上行うことがより好ましく、１４日間以上行うことが最も好ましく、培養後、線維細胞状の構造を有するPeriotic mesenchymal細胞が得られる。
　培地からｂＦＧＦを除去した新しい培地で、さらに培養を続けると、蝸牛線維細胞や血管条細胞が得られる。この培養は、７日間以上行うことが好ましく、１０日間以上行うことがより好ましく、１４日間以上行うことが最も好ましい。
　また、ｂＦＧＦを除去した新しい培地に、NaHCO3を添加して培養することによって、ペンドリン陽性細胞が得られる。NaHCO3の好ましい濃度は、０．３％～１％である。この培養は、７日間以上行うことが好ましく、１０日間以上行うことがより好ましく、１４日間以上行うことが最も好ましい。
（５）アポトーシス抑制剤の使用方法
　（１）に記載したアポトーシス抑制剤は、in vivoでもin vitroでも使用できる。
　in vivoで使用する場合、アポトーシス抑制剤は、投与方法に関連して、例えば以下のように剤型化可能である。
　まず、有効成分の他、必要に応じて、一般に用いられる各種成分をさらに含み得るものであり、例えば、1種以上の医薬的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、コーティング剤などを含み得る。
　投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状などに応じた適当な投与経路を選択する。本発明に係る薬剤は、経口経路、非経口経路のいずれによっても投与できるが、経口経路が好ましい。非経口経路としては、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内、鼓室内などへの投与を挙げることができる。さらに、経粘膜投与または経皮投与を実施することができる。
　剤形は、特に限定されず、種々の剤形、例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができる。非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤などの注射剤；経皮投与または貼付剤、軟膏またはローション；口腔内投与のための舌下剤、口腔貼付剤；ならびに経鼻投与のためのエアゾール剤；坐剤とすることができるが、これらには限定されない。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。また本発明に係る薬剤は、持続性または徐放性剤形であってもよい。
　薬剤に含有される有効成分の量は、該有効成分の用量範囲や投薬の回数などにより適宜決定できる。
　用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断など応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば大人一日あたり約１００ｍｇ～３０００ｍｇ程度、好ましくは約２２５０ｍｇ以下、より好ましくは約７５０ｍｇ以下、小児一日あたり約１００ｍｇ～２０００ｍｇ程度、好ましくは約１５００ｍｇ以下、より好ましくは約７５０ｍｇ以下である。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は1日1回～数回に分けて投与することができる。
　一方、in vitroでは、例えば細胞培養に用いる培地に添加し、その培地を、内耳細胞の細胞培養に用いることで、その内耳細胞のアポトーシスを抑制することができる。培地に添加する際のアポトーシス抑制剤の濃度は特に限定されないが、ラパマイシン誘導体０．１ｎＭ-１．０ｎＭ、ビグアナイド系化合物１ｍＭ-１０ｍＭが好ましい。
（６）アポトーシスに起因する内耳性難聴の治療方法
　本発明の、アポトーシスに起因する内耳性難聴の治療方法は、アポトーシスに起因する内耳性難聴に罹患した患者に、ビグアナイド系化合物及び/またはラパマイシン誘導体を投与する工程を含む。ビグアナイド系化合物及びラパマイシン誘導体は、（２）及び（３）の記載に準じる。また、ビグアナイド系化合物やラパマイシン誘導体を投与する方法は、（５）で記載した、アポトーシス抑制剤をin vivoで使用する方法に準じる。
（７）アポトーシスを調べる方法
　本発明のアポトーシスを調べる方法は、ビグアナイド系化合物及び/またはラパマイシン誘導体をin vitroで内耳細胞に投与する工程と、内耳細胞にアポトーシスを誘導する工程と、内耳細胞に生じるアポトーシスを調べる工程と、を含む。ビグアナイド系化合物及びラパマイシン誘導体は、（２）及び（３）の記載に準じる。
　このビグアナイド系化合物は、メトホルミンやラパマイシンをシード化合物として合成したリード化合物であってもよく、ラパマイシン誘導体は、ラパマイシンをシード化合物として合成したリード化合物であってもよい。
　ここで用いる内耳細胞は（１）の記載に準じる。
　内耳細胞にアポトーシスを誘導する方法は、公知の方法を用いることができ、例えば、エポキソミシン（Epoxomicin）処理（例えば、０．５μＭエポキソミシンで２４時間処理）等が挙げられる。
　こうして内耳細胞に生じるアポトーシスを調べる方法は、公知の方法を用いることができ、例えば、アポトーシスが生じて細胞膜外に移動したホスファチジルセリンをAnnexin Vを用いて検出する方法、7-AAD（7-amino-actinomycin D）が細胞膜を透過できるようになるのを検出する方法、カスパーゼの阻害剤であるSR-VAD-FMK（sulforhodamine-valyl-alanyl-aspartyl-fluoromethylketone）を蛍光標識して活性カスパーゼの存在を検出する方法、断片化したＤＮＡを検出する方法、などが挙げられる。
（８）アポトーシス抑制物質のスクリーニング方法
　本発明のアポトーシス抑制物質のスクリーニング方法は、アポトーシス抑制物質の候補である下記構造式に示されるビグアナイド系化合物をin vitroで内耳細胞に投与する工程と、内耳細胞にアポトーシスを誘導する工程と、内耳細胞に生じるアポトーシスを調べる工程と、を含む。各工程の詳細は、（５）及び（７）に準じる。
　これらの工程と平行して、同じ内耳細胞に上記化合物を投与しないで、同様にアポトーシスを誘導し、生じるアポトーシスを調べる。化合物を投与した場合と化合物を投与しない場合とで、アポトーシスを起こした細胞の割合を比較し、化合物を投与した場合にアポトーシスが抑制されるような化合物をアポトーシス抑制物質として特定する。
（９）アポトーシスに起因する内耳性難聴を治療するための薬剤のスクリーニング方法
　本発明の薬剤のスクリーニング方法は、薬剤の候補である下記構造式に示されるビグアナイド系化合物をin vitroで内耳細胞に投与する工程と、内耳細胞にアポトーシスを誘導する工程と、内耳細胞に生じるアポトーシスを調べる工程と、を含む。各工程の詳細は、（５）及び（７）に準じる。その後、アポトーシス抑制物質を特定し、アポトーシスに起因する内耳性難聴を治療するための薬剤とする。アポトーシス抑制物質を特定する方法は、（８）に準じる。
　本実施例では、アポトーシスに起因する内耳性難聴の一例としてペンドレッド症候群を挙げたが、内耳性難聴はこの疾患に限定されるものではない。
（１）ペンドレッド症候群患者由来のｉＰＳ細胞の内耳細胞への誘導
（１－１）ペンドレッド症候群（Pendred syndrome）患者由来のｉＰＳ細胞の樹立
　ペンドレッド症候群患者の末梢血から分離した単核球に対し、OCT3/4１, SOX2, KLF4, LIN28, L-MYC, p53shRNA発現ベクターを導入して初期化を行った。以下、その詳細を記す。
　まず、患者末梢血検体からの単核球の分離およびエレクトロポーレーションによる発現ベクターの導入は下記の方法で行った。ＢＤ社製バキュテイナ採血管（ＡＣＤ溶液入り）に約８　ｍｌの血液を加え混和し、これと等量のＰＢＳを加えて混和した。「血液＋ＰＢＳ」と等量のFicollに対して、「血液＋ＰＢＳ」をFicollの上に重層した。400G x 30分、25℃で遠心後、白く濁った中間層をピペットマンでゆっくりと回収し、ＰＢＳ１２ｍｌ加え、再度２００Ｇｘ１０分、２５℃で遠心した。上清を吸引して除いたのち、ＫＢＭ-５０２を適当量加えて懸濁し、細胞数を計測した。３ｘ１０6個の細胞を１５ｍｌチューブに分注し２００ｇｘ１０分、２５℃で遠心した。上清を除去後、初期化因子発現ベクターを含む培養液に細胞を懸濁して、Nucleofector II Device でエレクトロポーレーションを実施後、ＣＤ３４抗体を含む血球培地ＫＢＭ-５０２に懸濁して、マウス由来フィーダー細胞上に播種した。なお、初期化因子発現ベクターはpCE-hOCT3/4(0.63 μg)、pCE-hSK(0.63 μg)、pCE-hUL(0.63 μg)、pCE-mp53DD(0.63μg)、pCXB-EBNA1(0.50 μg)を混合して細胞に導入した。
　フィーダー細胞上に播種後３週間でｉＰＳ細胞コロニーを得ることが出来、シングルコロニーからそれぞれの患者由来のｉＰＳ細胞株を樹立した。樹立したｉＰＳ細胞株に対しては、未分化マーカーの発現、三胚葉分化能、核型の確認を行いｉＰＳ細胞としての質を確認した。
　未分化マーカーの確認においては、蛍光抗体染色は、細胞培養ディッシュ上に、固定したｉＰＳ細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、マウスOCT3/4抗体、ウサギ抗NANOG抗体、ラット抗SSEA3抗体、マウス抗SSEA4抗体、マウス抗TRA1-60抗体、マウス抗TRA1-81抗体を加えた（それぞれ、５００倍、１０００倍、３００倍、５００倍、５００倍、５００倍）。その後、それぞれの動物種ＩｇＧに特異的な蛍光２次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察し各々の発現を確認した
　三胚様分化能は以下の方法で確認を行った。フィーダー細胞上で培養したｉＰＳ細胞を解離液を用いてフィーダー細胞から分離後、低吸着プレート(Corning超低接着表面（Ultra-Low Attachment）プレート)上で１週間浮遊培養し胚葉体を形成した。1週間後、形成された胚葉体を回収し、poly-O-fibronectine でコートしたウエルに播種した。播種された胚葉体を３週間継続培養し、分化させた。播種後３週間で、三胚様分化能を蛍光抗体染色で確認した。蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、マウス抗β-3 tubulin抗体（外胚葉マーカー）、マウス抗ＳＭＡ抗体（中胚葉マーカー）、マウス抗ＡＦＰ抗体（内胚葉マーカー）を加えた（それぞれ、２５０倍、１５０倍、２５０倍）。その後、それぞれの動物種ＩｇＧに特異的な蛍光２次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察し各々の発現を確認した。
　なお、核型はＧバンド分染法を用いて行い、各々のラインで正常核型が維持されていることを確認した。
（１－２）iPS細胞から内耳幹細胞への分化誘導
［分化誘導方法］
Ｄａｙ　０
　１）１ウエル(６ウエル・プレート)をMatri Gelコーティングした。
　２）コンフルエントなFeeder-FreeヒトiPS細胞をアクターゼ処理し、ディッシュから剥離した。
　３）PBSで希釈後遠心し、細胞を回収した。
　４）上澄みをすて、ROCK阻害剤(Y27632)（10μmol/L）を加えたmTeSR1に細胞を懸濁した。
　５）ナイロンメッシュで単一細胞に解離した細胞だけを得て、血球板で細胞数を数えた。
　６）前記１）でMatri Gelコーティングしたウエルに、Y27632含有mTeSR1を加えた。
　７）１ウエルあたり2.0×104/cm2となるように解離した細胞を加えた。
Ｄａｙ　１
　ROCK阻害剤を含まないmTeSR1に培地交換した。
Ｄａｙ　２
　無血清培地（DMEM/F12+B27+N2+GlutaMax+Nonessential aminoacid）に培地交換した。以後、Ｄａｙ４まで、毎日培地交換した。
Ｄａｙ　５
　無血清培地（DMEM/F12+B27+N2+GlutaMax+Nonessential aminoacid+bFGF, FGF3, FGF10, FGF19+BMP4（25ng/ml、25 ng/ml、25 ng/ml、25ng/ml、10ng/ml））に培地交換した。以後、Ｄａｙ７まで、毎日培地交換した。
Ｄａｙ　８
　無血清培地（DMEM/F12+B27+N2+GlutaMax+Nonessential aminoacid +bFGF, FGF3, FGF10, FGF19（25ng/ml、25 ng/ml、25 ng/ml、25ng/ml））に培地交換した。以後ＤＡＹ１０まで、毎日培地交換した。
Ｄａｙ　１１
　新鮮な無血清培地（DMEM/F12+B27+N2+GlutaMax+Nonessential aminoacid+bFGF,FGF3, FGF10,FGF19）に培地交換した
Ｄａｙ　１２
　細胞をアクターゼ処理後、遠心して細胞を回収し、DMEM/F12+N2+B27培地+bFGF、FGF3、FGF10、FGF19（25ng/ml、25 ng/ml、25 ng/ml、25ng/ml）で懸濁した。ナイロンメッシュで単一細胞に解離した細胞を集め、poly-O-fibronectine コートしたウエルに播種した。培養は、低酸素条件下で（Ｏ2４％、ＣＯ2５％）で行った。以後、３日ごとに、培地をDMEM/F12+N2+B27培地+bFGF、EGF、IGF1（20ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml）に交換し、約６日ごとに継代した。
　こうしてえられた内耳幹細胞を増殖させ、コンフルエントになったディッシュを、位相差顕微鏡で撮影した（図１Ａ）。
［抗体染色］
　得られた細胞について、内耳幹細胞のマーカーである抗ＰＡＸ２抗体、抗ＰＡＸ８抗体、抗ＳＯＸ２抗体を用いて蛍光抗体染色を行った。蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ウサギ抗ＰＡＸ２抗体、マウス抗ＰＡＸ８抗体、ヤギ抗ＳＯＸ２抗体を加えた（それぞれ、５０倍、１００倍、１００倍希釈）。その後、それぞれの動物種ＩｇＧに特異的な蛍光２次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察した。ポジティブコントロールとして、ヘキストで核染色を行った。
［結果］
　図１Ｂに示すように、約８０％の細胞が、内耳幹細胞のマーカーを発現しており、この内耳幹細胞分化誘導方法が、極めて効率が高いことを示す。
（１－３）内耳幹細胞から有毛細胞、支持細胞、蝸牛神経節細胞への分化誘導
［分化誘導方法］
　（１－２）で作製した内耳幹細胞をアクターゼ処理して細胞をディッシュから剥離し、遠心して細胞を回収した。DMEM/F12+N2+B27培地+bFGF、EGF、IGF1、Wnt3a、FGF9、FGF20、Heparin、(+TGFβ阻害薬)（各因子の濃度は25ng/ml、25ng/ml、50ng/ml, 20ng/ml, 50ng/ml, 50ng/ml, 10ng/ml）を加え、低吸着プレート(Corning超低接着表面（Ultra-Low Attachment）プレート)上で浮遊培養した（約２００００細胞/well（９６well）。１日後、スフェア（細胞塊）の形成が観察され始めた。浮遊培養後５日目に培地DMEM/F12+N2+B2+bFGF、EGF、IGF1（各因子の濃度は25ng/ml、25ng/ml、50ng/ml)を等量追加した。
　浮遊培養後１０日目にスフェアを壊さないように回収し、poly-O-fibronectine コートしたプレートに移し、接着培養した（スフェア5-10個程度）。翌日にDMEM/F12+N2+B27培地+T3、IGF1（各因子の濃度は60ng/ml, 10ng/ml）に培地交換し、その後は、３日に１度で培地交換した。接着培養５日後から、有毛細胞、支持細胞、蝸牛神経節細胞が得られた。
［抗体染色］
　蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ウサギ抗ミオシンＶＩＩａ抗体、マウス抗エスピン抗体、ヤギ抗プレスチン抗体を加えた（それぞれ、２００倍、１００倍、５０倍希釈）。その後、それぞれの動物種ＩｇＧに特異的な蛍光２次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察した。
　得られた細胞について、有毛細胞のマーカーであるエスピン、ミオシン７ａ、プレスチンについて、それぞれの抗体を用いて蛍光抗体染色を行った（図２）。また、神経細胞のマーカーであるislet1、有毛細胞のマーカーであるp27/Kip1、有毛細胞のマーカーであるプレスチンについて、それぞれの抗体を用いて蛍光抗体染色を行った（図３）。また、蝸牛神経節グリア細胞のマーカーであるＧＦＡＰ、成熟神経細胞のマーカーであるカルビンジン及びベータＩＩＩチューブリンについて、それぞれの抗体を用いて蛍光抗体染色を行った（図４）。
［結果］
　図２～３に示すように、有毛細胞マーカーである、ミオシン７ａ、エスピン、プレスチン陽性細胞、および支持細胞マーカーであるp27kip1、ISLET１発現細胞が誘導されることが確認された。また、図４に示すように、同時に蝸牛神経細胞のマーカーである、カルビンジン陽性細胞とそれに付随するグリアが発現するＧＦＡＰを発現する細胞が得られた。このように、本方法では、内耳感覚上皮細胞を構成する主要細胞である有毛細胞、支持細胞、蝸牛神経節細胞が立体上に生体内と同様の配列をもって誘導されてくる。
（１－４）Periotic mesenchymal 細胞、蝸牛線維細胞及び血管条細胞、ペンドリン陽性細胞の分化誘導
　（１－２）で得られた内耳幹細胞をPOMC medium（DMEM500ml(D5796)、1M HEPES 5ml、FBS 30ml、bFGF(10ng/ml)2.0ml）に培地交換をして、通常酸素下で培養したところ、培養１０日目位からPeriotic mesenchymal細胞が観察された。その後培養を続けると、２週間後に線維細胞状の構造となった。（図５）
　線維細胞状の細胞形態になった細胞の培地をFBS(10%)+DMEM培地に培地交換し、さらに２週間程度培養すると、蝸牛線維細胞、血管条細胞が得られた。（図６）
　また、FBS(10%)+DMEM培地にNaHCO3（０．３７５％）を添加した培地を用いることによって、ペンドリン陽性細胞が得られた。（図６）
［抗体染色］
　蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ウサギ抗Ｓ１００抗体およびＰＯＵ３Ｆ４抗体、マウス抗カルデスモン抗体、ヤギ抗ＴＢＸ１８抗体を加えた（それぞれ、３倍、１００倍、１００倍、５０倍希釈）。その後、それぞれの動物種ＩｇＧに特異的な蛍光２次抗体を使って標識し、蛍光顕微鏡で観察した。
　図５に示すように、Periotic mesenchymal 細胞のマーカーであるＳ１００、ＰＯＵ３Ｆ４、カルデスモン、ＴＢＸ18の発現を認める細胞が誘導されていることが確認された。
　それぞれの誘導法で細胞誘導を行った後、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ウサギ抗炭酸脱水素酵素II抗体、抗アクアポリン１抗体、抗ナトリウムカリウムＡＴＰアーゼ抗体およびビメンチン抗体、マウス抗コネキシン２６、コネキシン３０抗体、ヤギ抗ペンドリン抗体を加えた（すべて１００倍希釈）。その後、それぞれの動物種ＩｇＧに特異的な蛍光２次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察した。
　図６に示すように、蝸牛線維細胞、および蝸牛血管条細胞に発現する炭酸脱水素酵素、アクアポリン１、ナトリウムカリウムＡＴＰアーゼ、ビメンチン、コネキシン２６および３０が発現していることから、これらの細胞が誘導されていることを確認した。また、ペンドリンが発現していることから、ペンドリン陽性細胞が誘導されていることを確認した。
（１－５）分化誘導された内耳感覚上皮細胞に対する、内耳毒性の知られているゲンタマイシンの投与
　この方法によって誘導された内耳感覚上皮細胞に対して、８０倍希釈したゲンタマイシン注射薬を１０日間投与した。本薬剤の投与によりコントロール群に比較して優位に細胞数が減少しており、ゲンタマイシン投与による細胞毒性が生体と同様におこることが示された。
（２）ペンドレッド症候群患者ｉＰＳ細胞由来の内耳細胞における細胞内凝集体の形成
［抗体染色］
　蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ヤギ抗ペンドリン抗体、マウス抗ユビキチン抗体、ウサギ抗ＬＣ３抗体を加えた（それぞれ、100倍、100倍、100倍希釈）。その後、それぞれの動物種ＩｇＧに特異的な蛍光２次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察した。
［結果］
　図８に示すように、ペンドレッド症候群患者由来の内耳細胞では、ペンドリンが凝集体を形成し、その凝集体に、ユビキチン及びＬＣ３ｂが共存する。このように、この細胞内凝集体は、ユビキチンプロテアソーム系及びオートファジーの両方で処理される。
（３）ペンドレッド症候群患者ｉＰＳ細胞由来の内耳細胞のストレスに対する脆弱性
［細胞生存率の測定］
　患者ｉＰＳ細胞および健常者由来ｉＰＳ／ＥＳ細胞から上記方法でペンドリン陽性細胞を誘導した。誘導した細胞に対してエポキソミシン（Ｅｐｏｘｏｍｉｃｉｎ）（０．５μＭ）存在下で２４時間培養し、細胞ストレスを負荷した。
　蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ヤギ抗ペンドリン抗体、ウサギ抗Cleaved Caspase 3抗体を加えた（それぞれ、１００倍、３００倍）。その後、核染色をHoechst33258（１０００倍希釈）で行い、それぞれの動物種ＩｇＧに特異的な蛍光２次抗体を使って標識した。得られた蛍光を、蛍光顕微鏡で観察し、視野内のペンドリン陽性かつCleaved caspase 3陰性細胞数をカウントした。
［結果］
　図９に示すように、ペンドレッド症候群患者由来の内耳細胞は、正常細胞よりストレスに弱く、負荷を与えたときの細胞生存率が低下している。
（４）ラパマイシンによる、上記内耳細胞の細胞生存率低下の抑制
［細胞生存率の測定］
　患者ｉＰＳ細胞および健常者由来ｉＰＳ／ＥＳ細胞から上記方法でペンドリン陽性細胞を誘導した。誘導した細胞に対して、各群に対して以下のような操作を行った。ラパマイシン投与群では、３日間ラパマイシン投与を行った。細胞ストレス＋ラパマイシン投与群では、ラパマイシン（０．２ｎＭ）負荷２日間後、ラパマイシンと同時に、細胞ストレスとしてエポキソミシン（０．５μＭ）を２４時間負荷した。一方、細胞ストレス群では、ＤＭＳＯを２日間投与したのちに、エポキソミシン（０．５μＭ）のみを２４時間負荷した。
　蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ヤギ抗ペンドリン抗体、ウサギ抗Cleaved Caspase 3抗体を加えた（それぞれ、１００倍、３００倍）。その後、核染色をHoechst33258（１０００倍希釈）で行い、それぞれの動物種ＩｇＧに特異的な蛍光２次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察し、視野内のペンドリン陽性かつCleaved caspase 3陰性細胞数をカウントした。
［結果］
　図１０に示すように、ラパマイシンは、ペンドレッド症候群患者由来の内耳細胞に負荷を与えたときの細胞生存率低下を抑制する。
（５）ラパマイシンによる、上記内耳細胞のアポトーシスの抑制
［Caspase 3陽性細胞の測定］
　患者ｉＰＳ細胞および健常者由来ｉＰＳ／ＥＳ細胞から上記方法でペンドリン陽性細胞を誘導した。誘導した細胞に対して、各群に対して以下のような操作を行った。ラパマイシン投与群では、３日間ラパマイシン投与を行った。細胞ストレス＋ラパマイシン投与群では、ラパマイシン（０．２ｎＭ）２日間投与後、ラパマイシンと同時に、細胞ストレスとしてエポキソミシン（０．５μＭ）を２４時間負荷した。一方、細胞ストレス群では、ＤＭＳＯを２日間投与したのちに、エポキソミシン（０．５μＭ）のみを２４時間負荷した。
　蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ヤギ抗ペンドリン抗体、ウサギ抗Cleaved Caspase 3抗体を加えた（それぞれ、１００倍、３００倍）。その後、核染色をHoechst33258（１０００倍希釈）で行い、それぞれの動物種ＩｇＧに特異的な蛍光２次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察し、視野内のペンドリン陽性かつCleaved caspase 3陽性細胞数をカウントした。
［結果］
　図１１に示すように、ペンドレッド症候群患者由来の内耳細胞に負荷を与えたときの細胞生存率低下はアポトーシスが原因であり、ラパマイシンは、そのアポトーシスを抑制する。
（６）メトホルミンによる、上記内耳細胞の細胞生存率低下の抑制
［細胞生存率の測定］
　患者ｉＰＳ細胞および健常者由来ｉＰＳ／ＥＳ細胞から上記方法でペンドリン陽性細胞を誘導した。誘導した細胞に対して、各群に対して以下のような操作を行った。ラパマイシン投与群では、３日間ラパマイシン（０．２ｎＭ）投与を行った。細胞ストレス＋ラパマイシン投与群では、ラパマイシン（０．２ｎＭ）２日間投与後、ラパマイシンと同時に、細胞ストレスとしてエポキソミシン（０．５μＭ）を２４時間負荷した。細胞ストレス群では、ＤＭＳＯを２日間投与したのちに、エポキソミシン（０．５μＭ）のみを２４時間負荷した。メトホルミン投与群ではそれぞれ１ｍＭ、１０ｍＭのメトホルミンを２日間投与後、メトホルミンと同時に細胞ストレスとしてエポキソミシン（０．５μＭ）を２４時間負荷した。蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ヤギ抗ペンドリン抗体、ウサギ抗Cleaved Caspase 3抗体を加えた（それぞれ、１００倍、３００倍）。その後、核染色をHoechst33258（１０００倍希釈）で行い、それぞれの動物種ＩｇＧに特異的な蛍光２次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察し、視野内のペンドリン陽性かつCleaved caspase 3陰性細胞数をカウントした。
［結果］
　図１２に示すように、メトホルミンは、ペンドレッド症候群患者由来の内耳細胞に負荷を与えたときの細胞生存率低下を抑制する。
（７）メトホルミンによる、上記内耳細胞のアポトーシスの抑制
［細胞生存率の測定］
　患者ｉＰＳ細胞および健常者由来ｉＰＳ／ＥＳ細胞から上記方法でペンドリン陽性細胞を誘導した。誘導した細胞に対して、各群に対して以下のような操作を行った。ラパマイシン投与群では、３日間ラパマイシン投与を行った。細胞ストレス＋ラパマイシン投与群では、ラパマイシン（０．２ｎＭ）２日間投与後、ラパマイシンと同時に、細胞ストレスとしてエポキソミシン（０．５μＭ）を２４時間負荷した。細胞ストレス群では、ＤＭＳＯを２日間投与したのちに、エポキソミシン（０．５μＭ）のみを２４時間負荷した。メトホルミン投与群ではそれぞれ１ｍＭ、１０ｍＭのメトホルミンを２日間投与後、メトホルミンと同時に細胞ストレスとしてエポキソミシン（０．５μＭ）を２４時間負荷した。蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ヤギ抗ペンドリン抗体、ウサギ抗Cleaved Caspase 3抗体を加えた（それぞれ、１００倍、３００倍）。その後、核染色をHoechst33258（１０００倍希釈）で行い、それぞれの動物種ＩｇＧに特異的な蛍光２次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察し、視野内のペンドリン陽性かつCleaved caspase 3陽性細胞数をカウントした。
［結果］
　図１３に示すように、メトホルミンは、ペンドレッド症候群患者由来の内耳細胞に負荷を与えたときのアポトーシスを抑制する。
（８）[参考例]カルペプチン（下記構造式ＶＩ）は上記内耳細胞のアポトーシスを抑制できない
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
　　　　　（ＶＩ）

［細胞生存率の測定］
　患者ｉＰＳ細胞および健常者由来ｉＰＳ／ＥＳ細胞から上記方法でペンドリン陽性細胞を誘導した。誘導した細胞に対して、各群に対して以下のような操作を行った。カルペプチン投与群では、３日間カルペプチン投与を行った。細胞ストレス＋カルペプチン投与群では、カルペプチン（５０μＭ）２日間投与後、カルペプチンと同時に、細胞ストレスとしてエポキソミシン（０．５μＭ）を２４時間負荷した。一方、細胞ストレス群では、ＤＭＳＯを２日間投与したのちに、エポキソミシン（０．５μＭ）のみを２４時間負荷した。
　蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ヤギ抗ペンドリン抗体、ウサギ抗Cleaved Caspase 3抗体を加えた（それぞれ、１００倍、３００倍）。その後、核染色をHoechst33258（1000倍希釈）で行い、それぞれの動物種ＩｇＧに特異的な蛍光２次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察し、視野内のペンドリン陽性かつCleaved caspase 3陰性細胞数をカウントした。
［結果］
　カルペプチンは、カルパイン阻害剤の一種であり、神経変性疾患などにおける神経細胞のアポトーシスを抑制することが知られている。しかしながら、図１４に示すように、ペンドレッド症候群患者ｉＰＳ細胞由来の内耳細胞のアポトーシスを抑制することができない。このことは、他の細胞に対してアポトーシス抑制活性があったとしても、内耳細胞のアポトーシスを抑制することができるかどうかは不明であることを示す。
　本発明によって、新規なアポトーシス抑制剤及び内耳性難聴治療薬を提供することができるようになった。

Claims (11)

  1. 　下記構造式Ｉに示されるビグアナイド系化合物または下記構造式ＩＩに示されるラパマイシン誘導体を有効成分として含有する、アポトーシスに起因する内耳性難聴を治療するための薬剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    　　　　　　　　　（Ｉ）

    （式中、Ｒ1～Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ6-10アリール基、５若しくは６員へテロアリール基、又は５若しくは６員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択される。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    　　　　　　　　　（ＩＩ）
    （式中、Ｒ1は、Ｃ1-6アルキルまたはＣ3-6アルキニルであり、Ｒ2は、Ｈ、－ＣＨ２－ＯＨまたは－ＣＨ2－ＣＨ2－ＯＨであり、そしてＸは、＝Ｏ、（Ｈ，Ｈ）または（Ｈ，ＯＨ）である。）
  2. 　前記アポトーシスに起因する内耳性難聴が、ペンドレッド症候群に由来する、請求項１に記載の薬剤。
  3. 　前記ビグアナイド系化合物がメトホルミンである、請求項１または２に記載の薬剤。
  4. 　前記ラパマイシン誘導体がラパマイシンである、請求項１または２に記載の薬剤。
  5. 　　下記構造式Ｉに示されるビグアナイド系化合物または下記構造式ＩＩに示されるラパマイシン誘導体を有効成分として含有する、アポトーシス抑制剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    　　　　　　　　　（Ｉ）

    （式中、Ｒ1～Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ6-10アリール基、５若しくは６員へテロアリール基、又は５若しくは６員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択される。）

    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
    　　　　　　　　　（ＩＩ）
    （式中、Ｒ1は、Ｃ1-6アルキルまたはＣ3-6アルキニルであり、Ｒ2は、Ｈ、－ＣＨ２－ＯＨまたは－ＣＨ2－ＣＨ2－ＯＨであり、そしてＸは、＝Ｏ、（Ｈ，Ｈ）または（Ｈ，ＯＨ）である。）
  6. 　内耳細胞のアポトーシスを抑制する、請求項５に記載のアポトーシス抑制剤。
  7. 　前記ビグアナイド系化合物がメトホルミンである、請求項５または６に記載のアポトーシス抑制剤。
  8. 　前記ラパマイシン誘導体がラパマイシンである、請求項５または６に記載のアポトーシス抑制剤。
  9. 　アポトーシスを調べる方法であって、
    　下記構造式（Ｉ）または（ＩＩ）に示される化合物をin vitroで内耳細胞に投与する工程と、
    　前記内耳細胞にアポトーシスを誘導する工程と、
    　前記内耳細胞に生じるアポトーシスを調べる工程と、
    　を含む方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
    　　　　　　　　　（Ｉ）
    （式中、Ｒ1～Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ6-10アリール基、５若しくは６員へテロアリール基、又は５若しくは６員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択される。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
    　　　　　　　　　（ＩＩ）
    （式中、Ｒ1は、Ｃ1-6アルキルまたはＣ3-6アルキニルであり、Ｒ2は、Ｈ、－ＣＨ２－ＯＨまたは－ＣＨ2－ＣＨ2－ＯＨであり、そしてＸは、＝Ｏ、（Ｈ，Ｈ）または（Ｈ，ＯＨ）である。）
  10. 　アポトーシス抑制物質のスクリーニング方法であって、
    　下記構造式（Ｉ）または（ＩＩ）に示される化合物をin vitroで内耳細胞に投与する工程と、
    　前記内耳細胞にアポトーシスを誘導する工程と、
    　前記内耳細胞に生じるアポトーシスを調べる工程と、
    　を含む方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
    　　　　　　　　　（Ｉ）
    （式中、Ｒ1～Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ6-10アリール基、５若しくは６員へテロアリール基、又は５若しくは６員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択される。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
    　　　　　　　　　（ＩＩ）
    （式中、Ｒ1は、Ｃ1-6アルキルまたはＣ3-6アルキニルであり、Ｒ2は、Ｈ、－ＣＨ２－ＯＨまたは－ＣＨ2－ＣＨ2－ＯＨであり、そしてＸは、＝Ｏ、（Ｈ，Ｈ）または（Ｈ，ＯＨ）である。）
  11. 　アポトーシスに起因する内耳性難聴を治療するための薬剤のスクリーニング方法であって、
    　下記構造式（Ｉ）または（ＩＩ）に示される化合物をin vitroで内耳細胞に投与する工程と、
    　前記内耳細胞にアポトーシスを誘導する工程と、
    　前記内耳細胞に生じるアポトーシスを調べる工程と、
    　を含む方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
    　　　　　　　　　（Ｉ）
    （式中、Ｒ1～Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ6-10アリール基、５若しくは６員へテロアリール基、又は５若しくは６員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択される。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
    　　　　　　　　　（ＩＩ）
    （式中、Ｒ1は、Ｃ1-6アルキルまたはＣ3-6アルキニルであり、Ｒ2は、Ｈ、－ＣＨ２－ＯＨまたは－ＣＨ2－ＣＨ2－ＯＨであり、そしてＸは、＝Ｏ、（Ｈ，Ｈ）または（Ｈ，ＯＨ）である。）
PCT/JP2016/050861 2015-01-19 2016-01-13 内耳性難聴治療薬 WO2016117431A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16740038.1A EP3248597B1 (en) 2015-01-19 2016-01-13 Therapeutic agent for sensorineural hearing loss
FIEP16740038.1T FI3248597T3 (fi) 2015-01-19 2016-01-13 Terapeuttinen aine sensorineuraaliseen kuulonmenetykseen
DK16740038.1T DK3248597T3 (da) 2015-01-19 2016-01-13 Terapeutisk middel til sensorineuralt høretab
JP2016570589A JP6716139B2 (ja) 2015-01-19 2016-01-13 内耳性難聴治療薬
US15/544,419 US11058669B2 (en) 2015-01-19 2016-01-13 Therapeutic agents for inner ear hearing impairment
EP17187312.8A EP3295939B1 (en) 2015-01-19 2016-01-13 Therapeutic agent for treating sensorineural hearing loss
US15/654,267 US11013725B2 (en) 2015-01-19 2017-07-19 Therapeutic agents for inner ear hearing impairment

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015-007849 2015-01-19
JP2015007849 2015-01-19

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US15/544,419 A-371-Of-International US11058669B2 (en) 2015-01-19 2016-01-13 Therapeutic agents for inner ear hearing impairment
US15/654,267 Continuation US11013725B2 (en) 2015-01-19 2017-07-19 Therapeutic agents for inner ear hearing impairment

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016117431A1 true WO2016117431A1 (ja) 2016-07-28

Family

ID=56416978

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2016/050861 WO2016117431A1 (ja) 2015-01-19 2016-01-13 内耳性難聴治療薬

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11058669B2 (ja)
EP (2) EP3295939B1 (ja)
JP (2) JP6716139B2 (ja)
DK (1) DK3248597T3 (ja)
ES (1) ES2928593T3 (ja)
FI (1) FI3248597T3 (ja)
PT (1) PT3248597T (ja)
WO (1) WO2016117431A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020521467A (ja) * 2017-05-26 2020-07-27 カイト ファーマ インコーポレイテッドＫｉｔｅ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ 胚性間葉系始原細胞の製造方法及び使用方法
US11147248B2 (en) 2017-09-21 2021-10-19 Keio University Method for producing acoustic trauma deafness model animal, and acoustic trauma deafness model animal produced by the same
WO2021251419A1 (ja) * 2020-06-09 2021-12-16 株式会社オトリンク 内耳有毛細胞の製造方法、薬剤の評価方法、及び細胞分化誘導用組成物

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101785455B1 (ko) * 2016-03-16 2017-11-20 전남대학교산학협력단 귀리 추출물을 유효성분으로 포함하는 난청의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
CN108310386A (zh) * 2018-04-09 2018-07-24 南方医科大学 mTOR信号通路抑制剂在制备预防或治疗非遗传性听力障碍药物中的用途
KR20220146349A (ko) * 2021-04-23 2022-11-01 연세대학교 산학협력단 오토파지 활성화제를 유효성분으로 포함하는 비증후군성 상염색제-우성 난청의 예방 또는 치료용 조성물

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003519655A (ja) * 2000-01-14 2003-06-24 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア リンパ増殖症候群の緩和および阻害のためのｏ−メチル化ラパマイシン誘導体
JP2004099537A (ja) * 2002-09-10 2004-04-02 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd 難聴疾患の予防又は治療剤
JP2004123713A (ja) * 2002-08-05 2004-04-22 Mitsubishi Pharma Corp 突発性難聴の予防及び／又は治療のための医薬
JP2010527361A (ja) * 2007-05-17 2010-08-12 キネックス ファーマシューティカルズ， エルエルシー キナーゼカスケードを調節するための組成物の調製のための方法ならびにその使用方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3963495B2 (ja) 1995-05-22 2007-08-22 生化学工業株式会社 アポトーシス惹起抑制剤
EP0937082A2 (en) 1996-07-12 1999-08-25 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Materials and method for treating or preventing pathogenic fungal infection
ES2219388T3 (es) 1999-08-24 2004-12-01 Ariad Gene Therapeutics, Inc. 28-epi-rapalogos.
US7387614B2 (en) 2003-08-26 2008-06-17 University Of Maryland, Baltimore Drug delivery to the inner ear and methods of using same
NZ563003A (en) 2005-04-27 2011-03-31 Univ Florida Use of a farnesyl transferase inhibitor to enhance autophagic protein degradation in protein conformation disorders
WO2008022256A2 (en) * 2006-08-16 2008-02-21 Blagosklonny Mikhail V Methods and compositions for preventing or treating age-related diseases
TWI457336B (zh) 2006-12-28 2014-10-21 Kinex Pharmaceuticals Llc 調節激酶級聯之組成物及方法
KR101390607B1 (ko) 2008-07-14 2014-05-19 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 귀 질환 치료를 위한 제어 방출형 아폽토시스 조절 조성물 및 방법
CN102612564B (zh) 2009-04-10 2015-08-26 齐海燕 新的抗衰老试剂及其鉴别方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003519655A (ja) * 2000-01-14 2003-06-24 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア リンパ増殖症候群の緩和および阻害のためのｏ−メチル化ラパマイシン誘導体
JP2004123713A (ja) * 2002-08-05 2004-04-22 Mitsubishi Pharma Corp 突発性難聴の予防及び／又は治療のための医薬
JP2004099537A (ja) * 2002-09-10 2004-04-02 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd 難聴疾患の予防又は治療剤
JP2010527361A (ja) * 2007-05-17 2010-08-12 キネックス ファーマシューティカルズ， エルエルシー キナーゼカスケードを調節するための組成物の調製のための方法ならびにその使用方法

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FANG, BIN ET AL.: "Rapamycin alleviates cisplatin-induced ototoxicity in vivo", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 448, no. 4, 2014, pages 443 - 447, XP055438585 *
GLUTZ, ANDREA ET AL.: "Metformin Protects Auditory Hair Cells from Gentamicin-Induced Toxicity in vitro", AUDIOLOGY & NEUROTOLOGY, vol. 20, no. 6, September 2015 (2015-09-01), pages 360 - 369, XP009502616 *
HARRIS, KELLY CARNEY ET AL.: "Prevention of noise-induced hearing loss with Src-PTK inhibitors", HEARING RESEARCH, vol. 208, no. 1-2, 2005, pages 14 - 25, XP005105480 *
HAYASHI, KEN ET AL.: "Molecular crosstalk between Nrf2/ Keapl signaling pathway, autophagy and necrosis in auditory cells", OTOLARYNGOLOGY - HEAD AND NECK SURGERY, vol. 145, no. 2, August 2011 (2011-08-01), pages 221, XP055438587 *
JUNG, HAK HYUN ET AL.: "Protective role of antidiabetic drug metformin against gentamicin induced apoptosis in auditory cell line", HEARING RESEARCH, vol. 282, no. 1-2, 2011, pages 92 - 96, XP028126678 *
LECLERC, GILLES M. ET AL.: "Metformin induces apoptosis through AMPK-dependent inhibition of UPR signaling in ALL lymphoblasts", PLOS ONE, vol. 8, no. 8, 2013, pages e74420, XP055438583 *
LEITMEYER, KATHARINA ET AL.: "Inhibition of mTOR by rapamycin results in auditory hair cell damage and decreased spiral ganglion neuron outgrowth and neurite formation In Vitro", BIOMED RESEARCH INTERNATIONAL, vol. 21, no. 2, 31 March 2015 (2015-03-31), pages 1 - 11, XP055438590 *
OISHI, NAOKI ET AL.: "Metformin protects against gentamicin-induced hair cell death in vitro but not ototoxicity in vivo", NEUROSCIENCE LETTERS, vol. 583, 2014, pages 65 - 69, XP029088678 *
ROSA, CONDE DE LA ET AL.: "Oxidative stress induced apoptosis is inhibited by metformin via an ERK and Src dependent pathway in rat hepatocytes", EUROPEAN JOURNAL OF GASTROENTEROLOGY & HEPATOLOGY, vol. 18, no. 1, 2006, pages A50 - A51, XP009502617 *
See also references of EP3248597A4 *
WOLTMAN, ANDREA M. ET AL.: "Rapamycin induces apoptosis in monocyte- and CD 34-derived dendritic cells but not in monocytes and macrophages", BLOOD, vol. 98, no. 1, 2001, pages 174 - 180, XP055438588 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020521467A (ja) * 2017-05-26 2020-07-27 カイト ファーマ インコーポレイテッドＫｉｔｅ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ 胚性間葉系始原細胞の製造方法及び使用方法
JP7014820B2 (ja) 2017-05-26 2022-02-01 カイト ファーマ インコーポレイテッド 胚性間葉系始原細胞の製造方法及び使用方法
JP2022058672A (ja) * 2017-05-26 2022-04-12 カイト ファーマ インコーポレイテッド 胚性間葉系始原細胞の製造方法及び使用方法
US11147248B2 (en) 2017-09-21 2021-10-19 Keio University Method for producing acoustic trauma deafness model animal, and acoustic trauma deafness model animal produced by the same
WO2021251419A1 (ja) * 2020-06-09 2021-12-16 株式会社オトリンク 内耳有毛細胞の製造方法、薬剤の評価方法、及び細胞分化誘導用組成物

Also Published As

Publication number Publication date
EP3248597A1 (en) 2017-11-29
US11013725B2 (en) 2021-05-25
US20170333403A1 (en) 2017-11-23
EP3248597B1 (en) 2024-03-13
EP3248597A4 (en) 2018-10-10
US11058669B2 (en) 2021-07-13
DK3248597T3 (da) 2024-04-08
ES2928593T3 (es) 2022-11-21
JPWO2016117431A1 (ja) 2017-11-02
FI3248597T3 (fi) 2024-04-17
JP6708346B2 (ja) 2020-06-10
US20170340586A1 (en) 2017-11-30
JP2017200923A (ja) 2017-11-09
EP3295939A1 (en) 2018-03-21
EP3295939B1 (en) 2022-09-21
PT3248597T (pt) 2024-03-25
JP6716139B2 (ja) 2020-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6708346B2 (ja) 内耳性難聴治療薬
KR102487142B1 (ko) 만능 세포를 분화시키는 방법
JP7029144B2 (ja) 腺性下垂体又はその前駆組織の製造方法
CN104321062B (zh) 干细胞微粒
JP2020146060A (ja) 中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロンのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化の方法
US9347041B2 (en) Method for preparing corneal endothelial cell
Okumura et al. Cell surface markers of functional phenotypic corneal endothelial cells
AU2016216570B2 (en) Differentiated pluripotent stem cell progeny depleted of extraneous phenotypes
CN111269885A (zh) 制备端脑或其前体组织的方法
JP6468843B2 (ja) ヒト網膜前駆細胞の表現型プロファイル
JP2022088676A (ja) 幹細胞由来外胚葉系統前駆体を分化する方法
WO2021201175A1 (ja) 下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞の分離法
KR20200046099A (ko) 줄기 세포-유도 외배엽 계통 전구체의 분화 방법
JP6954531B2 (ja) 高機能分化誘導細胞の濃縮方法及び高機能分化誘導細胞集団
Konovalova et al. Phenotypical differences in neuronal cultures derived via reprogramming the fibroblasts from patients carrying mutations in parkinsonian genes LRRK2 and PARK2
JP6615616B2 (ja) アダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16740038

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016570589

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15544419

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2016740038

Country of ref document: EP