JPWO2016117431A1 - 内耳性難聴治療薬 - Google Patents
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Abstract
Description
(式中、R1〜R7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、C1-6アルコキシカルボニル基、C3-8シクロアルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、C1-6アルキル基、C3-8シクロアルキル基、C6-10アリール基、5若しくは6員へテロアリール基、又は5若しくは6員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択される。)
(II)
(式中、R1は、C1-6アルキルまたはC3-6アルキニルであり、R2は、H、−CH2−OHまたは−CH2−CH2−OHであり、そしてXは、=O、(H,H)または(H,OH)である。)
本出願は、2015年1月19日付で出願した日本国特許出願2015−007849に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
本発明は、ビグアナイド系化合物(下記構造式I)またはラパマイシン誘導体(下記構造式II)またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、内耳細胞のアポトーシス抑制剤である。
(式中、R1〜R7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、C1-6アルコキシカルボニル基、C3-8シクロアルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、C1-6アルキル基、C3-8シクロアルキル基、C6-10アリール基、5若しくは6員へテロアリール基、又は5若しくは6員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択される。)
(II)
(式中、R1は、C1-6アルキルまたはC3-6アルキニルであり、R2は、H、−CH2−OHまたは−CH2−CH2−OHであり、そしてXは、=O、(H,H)または(H,OH)である。)
アポトーシス抑制の対象とする内耳細胞は特に限定されず、アポトーシスを起こしやすい内耳細胞が好ましく、アポトーシスに起因する内耳性難聴に罹患した動物由来であることがさらに好ましい。内耳性難聴は、アポトーシスに起因する内耳性難聴であれば特に限定されず、例えば、ペンドレッド症候群による難聴、老人性難聴などが例示できる。また、アポトーシス抑制の対象とする内耳細胞は、生物個体の体内に存在する細胞であっても、培養細胞であってもよい。生物個体の種は特に限定されないが、脊椎動物が好ましく、ヒトが最も好ましい。培養細胞は、樹立された細胞株であっても、初代培養細胞であっても、幹細胞から分化させた内耳細胞であってもよい。幹細胞から内耳細胞への分化誘導法の詳細は、後述する。
ビグアナイドとは、グアニジン2分子が窒素原子を共有して連なった、下記構造(III)を有する化合物である。
本明細書において、ビグアナイド系化合物は、ビグアナイドおよびビグアナイドの水素が置換された化合物の総称をいうものとする。置換基としては、特に限定されず、水素原子、ハロゲン原子、C1-6アルキル基、C3-8シクロアルキル基、C6-10アリール基、5若しくは6員へテロアリール基、5若しくは6員の非芳香族系へテロ環式基(C1-6アルキル基、C3-8シクロアルキル基、C6-10アリール基、5若しくは6員へテロアリール基、5若しくは6員の非芳香族系へテロ環式基は、ハロゲン原子、シアノ基、C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、C1-6アルコキシカルボニル基、C3-8シクロアルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい)などが例示できる。すなわち、ビグアナイド系化合物は、以下の構造式に示される化合物を含む。
(式中、R1〜R7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、C1-6アルコキシカルボニル基、C3-8シクロアルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、C1-6アルキル基、C3-8シクロアルキル基、C6-10アリール基、5若しくは6員へテロアリール基、又は5若しくは6員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択されるが、全てが水素原子ではない。)
なお、最も好ましい化合物は、下記構造式IVを有するメトホルミンである。
(3)ラパマイシン誘導体
ラパマイシンは、以下の構造式Vを有する化合物である。
本明細書において、ラパマイシン誘導体は、以下の構造式に示される化合物を含む。
(式中、R1は、C1-6アルキルまたはC3-6アルキニルであり、R2は、H、−CH2−OHまたは−CH2−CH2−OHであり、そしてXは、=O、(H,H)または(H,OH)である。)
例えば、ラパマイシン誘導体には、(1)40−O−置換ラパマイシン誘導体(例えば、40−O−アルキル−ラパマイシン誘導体(40−O−ヒドロキシアルキル−ラパマイシン誘導体や40−O−(2−ヒドロキシ)−エチル−ラパマイシンなど))、(2)32−デオキソ−ラパマイシンとその誘導体、および32−ヒドロキシ−ラパマイシンとその誘導体、(3)16−O−置換ラパマイシン誘導体(例えば16−ペント−2−イニルオキシ−32−デオキソラパマイシン、16−ペント−2−イニルオキシ−32(SまたはR)−ジヒドロ−ラパマイシン、16−ペント−2−イニルオキシ−32(SまたはR)−ジヒドロ−40−O−(2−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン)、(4)40位の酸素基にてアシル化されるラパマイシン誘導体(例えば、40−[3−ヒドロキシ−2−(ヒドロキシ−メチル)−2−プロピオン酸メチル]−ラパマイシン(CCI779としても公知))、(5)ヘテロシクリルにより40位にて置換されるラパマイシン誘導体(例えば、40−エピ−(テトラゾリル)−ラパマイシン(ABT578としても公知))、(6)例えばWO9802441またはWO0114387に記載の、いわゆるラパログ(例えば、40−O−ホスホ−含有ラパマイシン誘導体(40−O−ジメチルホスフィニル−ラパマイシン(AP23573を含む)など))、(7)40−O−アルコキシ−アルキル−ラパマイシン誘導体(例えば、商品名バイオリムス(バイオリムスA9として開示される化合物(40−O−(2−エトキシ)−エチル−ラパマイシンを含む)、および商品名TAFA−93、AP23464、AP23675またはAP23841として開示される化合物)が含まれるが、(8)ラパマイシンが最も好ましい。
以下、幹細胞から内耳細胞への分化誘導法(以下、内耳細胞誘導法とも称する)を述べる。幹細胞は特に限定されないが、多能性幹細胞や内耳幹細胞が例示できる。以下、多能性幹細胞を例として、内耳細胞誘導法を詳述する。
多能性幹細胞から内耳幹細胞への誘導方法においては、
第1工程:多能性幹細胞をROCK阻害剤存在下で培養する工程
第2工程:ROCK阻害剤非存在下で培養する工程
第3工程:無血清培地で培養する工程
第4工程:増殖因子含有無血清培地で培養する工程
第5工程:単一細胞に解離する工程
を、この順で行う。なお、工程間には、本法には本質的ではない工程が挿入されてもかまわない。
内耳幹細胞から内耳感覚上皮、蝸牛神経節細胞及び血管条細胞への誘導方法においては、
第1工程:前記内耳幹細胞を浮遊培養する工程と、
第2工程:FGF9およびFGF20存在下で培養する工程と
をこの順で行う。なお、工程間には、本法には本質的ではない工程が挿入されてもかまわない。
内耳幹細胞からPeriotic mesenchymal 細胞への誘導方法においては、内耳幹細胞をbFGF含有培地で培養する工程を含む。なお、この方法に、本発明には本質的ではない工程が挿入されてもかまわない。
(1)に記載したアポトーシス抑制剤は、in vivoでもin vitroでも使用できる。
本発明の、アポトーシスに起因する内耳性難聴の治療方法は、アポトーシスに起因する内耳性難聴に罹患した患者に、ビグアナイド系化合物及び/またはラパマイシン誘導体を投与する工程を含む。ビグアナイド系化合物及びラパマイシン誘導体は、(2)及び(3)の記載に準じる。また、ビグアナイド系化合物やラパマイシン誘導体を投与する方法は、(5)で記載した、アポトーシス抑制剤をin vivoで使用する方法に準じる。
本発明のアポトーシスを調べる方法は、ビグアナイド系化合物及び/またはラパマイシン誘導体をin vitroで内耳細胞に投与する工程と、内耳細胞にアポトーシスを誘導する工程と、内耳細胞に生じるアポトーシスを調べる工程と、を含む。ビグアナイド系化合物及びラパマイシン誘導体は、(2)及び(3)の記載に準じる。
本発明のアポトーシス抑制物質のスクリーニング方法は、アポトーシス抑制物質の候補である下記構造式に示されるビグアナイド系化合物をin vitroで内耳細胞に投与する工程と、内耳細胞にアポトーシスを誘導する工程と、内耳細胞に生じるアポトーシスを調べる工程と、を含む。各工程の詳細は、(5)及び(7)に準じる。
本発明の薬剤のスクリーニング方法は、薬剤の候補である下記構造式に示されるビグアナイド系化合物をin vitroで内耳細胞に投与する工程と、内耳細胞にアポトーシスを誘導する工程と、内耳細胞に生じるアポトーシスを調べる工程と、を含む。各工程の詳細は、(5)及び(7)に準じる。その後、アポトーシス抑制物質を特定し、アポトーシスに起因する内耳性難聴を治療するための薬剤とする。アポトーシス抑制物質を特定する方法は、(8)に準じる。
(1−1)ペンドレッド症候群(Pendred syndrome)患者由来のiPS細胞の樹立
ペンドレッド症候群患者の末梢血から分離した単核球に対し、OCT3/41, SOX2, KLF4, LIN28, L-MYC, p53shRNA発現ベクターを導入して初期化を行った。以下、その詳細を記す。
三胚様分化能は以下の方法で確認を行った。フィーダー細胞上で培養したiPS細胞を解離液を用いてフィーダー細胞から分離後、低吸着プレート(Corning超低接着表面(Ultra-Low Attachment)プレート)上で1週間浮遊培養し胚葉体を形成した。1週間後、形成された胚葉体を回収し、poly-O-fibronectine でコートしたウエルに播種した。播種された胚葉体を3週間継続培養し、分化させた。播種後3週間で、三胚様分化能を蛍光抗体染色で確認した。蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、マウス抗β-3 tubulin抗体(外胚葉マーカー)、マウス抗SMA抗体(中胚葉マーカー)、マウス抗AFP抗体(内胚葉マーカー)を加えた(それぞれ、250倍、150倍、250倍)。その後、それぞれの動物種IgGに特異的な蛍光2次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察し各々の発現を確認した。
[分化誘導方法]
Day 0
1)1ウエル(6ウエル・プレート)をMatri Gelコーティングした。
ROCK阻害剤を含まないmTeSR1に培地交換した。
無血清培地(DMEM/F12+B27+N2+GlutaMax+Nonessential aminoacid)に培地交換した。以後、Day4まで、毎日培地交換した。
無血清培地(DMEM/F12+B27+N2+GlutaMax+Nonessential aminoacid+bFGF, FGF3, FGF10, FGF19+BMP4(25ng/ml、25 ng/ml、25 ng/ml、25ng/ml、10ng/ml))に培地交換した。以後、Day7まで、毎日培地交換した。
無血清培地(DMEM/F12+B27+N2+GlutaMax+Nonessential aminoacid +bFGF, FGF3, FGF10, FGF19(25ng/ml、25 ng/ml、25 ng/ml、25ng/ml))に培地交換した。以後DAY10まで、毎日培地交換した。
新鮮な無血清培地(DMEM/F12+B27+N2+GlutaMax+Nonessential aminoacid+bFGF,FGF3, FGF10,FGF19)に培地交換した
Day 12
細胞をアクターゼ処理後、遠心して細胞を回収し、DMEM/F12+N2+B27培地+bFGF、FGF3、FGF10、FGF19(25ng/ml、25 ng/ml、25 ng/ml、25ng/ml)で懸濁した。ナイロンメッシュで単一細胞に解離した細胞を集め、poly-O-fibronectine コートしたウエルに播種した。培養は、低酸素条件下で(O24%、CO25%)で行った。以後、3日ごとに、培地をDMEM/F12+N2+B27培地+bFGF、EGF、IGF1(20ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml)に交換し、約6日ごとに継代した。
得られた細胞について、内耳幹細胞のマーカーである抗PAX2抗体、抗PAX8抗体、抗SOX2抗体を用いて蛍光抗体染色を行った。蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ウサギ抗PAX2抗体、マウス抗PAX8抗体、ヤギ抗SOX2抗体を加えた(それぞれ、50倍、100倍、100倍希釈)。その後、それぞれの動物種IgGに特異的な蛍光2次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察した。ポジティブコントロールとして、ヘキストで核染色を行った。
図1Bに示すように、約80%の細胞が、内耳幹細胞のマーカーを発現しており、この内耳幹細胞分化誘導方法が、極めて効率が高いことを示す。
[分化誘導方法]
(1−2)で作製した内耳幹細胞をアクターゼ処理して細胞をディッシュから剥離し、遠心して細胞を回収した。DMEM/F12+N2+B27培地+bFGF、EGF、IGF1、Wnt3a、FGF9、FGF20、Heparin、(+TGFβ阻害薬)(各因子の濃度は25ng/ml、25ng/ml、50ng/ml, 20ng/ml, 50ng/ml, 50ng/ml, 10ng/ml)を加え、低吸着プレート(Corning超低接着表面(Ultra-Low Attachment)プレート)上で浮遊培養した(約20000細胞/well(96well)。1日後、スフェア(細胞塊)の形成が観察され始めた。浮遊培養後5日目に培地DMEM/F12+N2+B2+bFGF、EGF、IGF1(各因子の濃度は25ng/ml、25ng/ml、50ng/ml)を等量追加した。
蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ウサギ抗ミオシンVIIa抗体、マウス抗エスピン抗体、ヤギ抗プレスチン抗体を加えた(それぞれ、200倍、100倍、50倍希釈)。その後、それぞれの動物種IgGに特異的な蛍光2次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察した。
図2〜3に示すように、有毛細胞マーカーである、ミオシン7a、エスピン、プレスチン陽性細胞、および支持細胞マーカーであるp27kip1、ISLET1発現細胞が誘導されることが確認された。また、図4に示すように、同時に蝸牛神経細胞のマーカーである、カルビンジン陽性細胞とそれに付随するグリアが発現するGFAPを発現する細胞が得られた。このように、本方法では、内耳感覚上皮細胞を構成する主要細胞である有毛細胞、支持細胞、蝸牛神経節細胞が立体上に生体内と同様の配列をもって誘導されてくる。
(1−2)で得られた内耳幹細胞をPOMC medium(DMEM500ml(D5796)、1M HEPES 5ml、FBS 30ml、bFGF(10ng/ml)2.0ml)に培地交換をして、通常酸素下で培養したところ、培養10日目位からPeriotic mesenchymal細胞が観察された。その後培養を続けると、2週間後に線維細胞状の構造となった。(図5)
線維細胞状の細胞形態になった細胞の培地をFBS(10%)+DMEM培地に培地交換し、さらに2週間程度培養すると、蝸牛線維細胞、血管条細胞が得られた。(図6)
また、FBS(10%)+DMEM培地にNaHCO3(0.375%)を添加した培地を用いることによって、ペンドリン陽性細胞が得られた。(図6)
[抗体染色]
蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ウサギ抗S100抗体およびPOU3F4抗体、マウス抗カルデスモン抗体、ヤギ抗TBX18抗体を加えた(それぞれ、3倍、100倍、100倍、50倍希釈)。その後、それぞれの動物種IgGに特異的な蛍光2次抗体を使って標識し、蛍光顕微鏡で観察した。
この方法によって誘導された内耳感覚上皮細胞に対して、80倍希釈したゲンタマイシン注射薬を10日間投与した。本薬剤の投与によりコントロール群に比較して優位に細胞数が減少しており、ゲンタマイシン投与による細胞毒性が生体と同様におこることが示された。
[抗体染色]
蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ヤギ抗ペンドリン抗体、マウス抗ユビキチン抗体、ウサギ抗LC3抗体を加えた(それぞれ、100倍、100倍、100倍希釈)。その後、それぞれの動物種IgGに特異的な蛍光2次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察した。
図8に示すように、ペンドレッド症候群患者由来の内耳細胞では、ペンドリンが凝集体を形成し、その凝集体に、ユビキチン及びLC3bが共存する。このように、この細胞内凝集体は、ユビキチンプロテアソーム系及びオートファジーの両方で処理される。
[細胞生存率の測定]
患者iPS細胞および健常者由来iPS/ES細胞から上記方法でペンドリン陽性細胞を誘導した。誘導した細胞に対してエポキソミシン(Epoxomicin)(0.5μM)存在下で24時間培養し、細胞ストレスを負荷した。
図9に示すように、ペンドレッド症候群患者由来の内耳細胞は、正常細胞よりストレスに弱く、負荷を与えたときの細胞生存率が低下している。
[細胞生存率の測定]
患者iPS細胞および健常者由来iPS/ES細胞から上記方法でペンドリン陽性細胞を誘導した。誘導した細胞に対して、各群に対して以下のような操作を行った。ラパマイシン投与群では、3日間ラパマイシン投与を行った。細胞ストレス+ラパマイシン投与群では、ラパマイシン(0.2nM)負荷2日間後、ラパマイシンと同時に、細胞ストレスとしてエポキソミシン(0.5μM)を24時間負荷した。一方、細胞ストレス群では、DMSOを2日間投与したのちに、エポキソミシン(0.5μM)のみを24時間負荷した。
図10に示すように、ラパマイシンは、ペンドレッド症候群患者由来の内耳細胞に負荷を与えたときの細胞生存率低下を抑制する。
[Caspase 3陽性細胞の測定]
患者iPS細胞および健常者由来iPS/ES細胞から上記方法でペンドリン陽性細胞を誘導した。誘導した細胞に対して、各群に対して以下のような操作を行った。ラパマイシン投与群では、3日間ラパマイシン投与を行った。細胞ストレス+ラパマイシン投与群では、ラパマイシン(0.2nM)2日間投与後、ラパマイシンと同時に、細胞ストレスとしてエポキソミシン(0.5μM)を24時間負荷した。一方、細胞ストレス群では、DMSOを2日間投与したのちに、エポキソミシン(0.5μM)のみを24時間負荷した。
図11に示すように、ペンドレッド症候群患者由来の内耳細胞に負荷を与えたときの細胞生存率低下はアポトーシスが原因であり、ラパマイシンは、そのアポトーシスを抑制する。
[細胞生存率の測定]
患者iPS細胞および健常者由来iPS/ES細胞から上記方法でペンドリン陽性細胞を誘導した。誘導した細胞に対して、各群に対して以下のような操作を行った。ラパマイシン投与群では、3日間ラパマイシン(0.2nM)投与を行った。細胞ストレス+ラパマイシン投与群では、ラパマイシン(0.2nM)2日間投与後、ラパマイシンと同時に、細胞ストレスとしてエポキソミシン(0.5μM)を24時間負荷した。細胞ストレス群では、DMSOを2日間投与したのちに、エポキソミシン(0.5μM)のみを24時間負荷した。メトホルミン投与群ではそれぞれ1mM、10mMのメトホルミンを2日間投与後、メトホルミンと同時に細胞ストレスとしてエポキソミシン(0.5μM)を24時間負荷した。蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ヤギ抗ペンドリン抗体、ウサギ抗Cleaved Caspase 3抗体を加えた(それぞれ、100倍、300倍)。その後、核染色をHoechst33258(1000倍希釈)で行い、それぞれの動物種IgGに特異的な蛍光2次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察し、視野内のペンドリン陽性かつCleaved caspase 3陰性細胞数をカウントした。
図12に示すように、メトホルミンは、ペンドレッド症候群患者由来の内耳細胞に負荷を与えたときの細胞生存率低下を抑制する。
[細胞生存率の測定]
患者iPS細胞および健常者由来iPS/ES細胞から上記方法でペンドリン陽性細胞を誘導した。誘導した細胞に対して、各群に対して以下のような操作を行った。ラパマイシン投与群では、3日間ラパマイシン投与を行った。細胞ストレス+ラパマイシン投与群では、ラパマイシン(0.2nM)2日間投与後、ラパマイシンと同時に、細胞ストレスとしてエポキソミシン(0.5μM)を24時間負荷した。細胞ストレス群では、DMSOを2日間投与したのちに、エポキソミシン(0.5μM)のみを24時間負荷した。メトホルミン投与群ではそれぞれ1mM、10mMのメトホルミンを2日間投与後、メトホルミンと同時に細胞ストレスとしてエポキソミシン(0.5μM)を24時間負荷した。蛍光抗体染色は、スライド上に固定した細胞に対して、抗原賦活化操作を行ったのち、ヤギ抗ペンドリン抗体、ウサギ抗Cleaved Caspase 3抗体を加えた(それぞれ、100倍、300倍)。その後、核染色をHoechst33258(1000倍希釈)で行い、それぞれの動物種IgGに特異的な蛍光2次抗体を使い標識し、蛍光顕微鏡で観察し、視野内のペンドリン陽性かつCleaved caspase 3陽性細胞数をカウントした。
図13に示すように、メトホルミンは、ペンドレッド症候群患者由来の内耳細胞に負荷を与えたときのアポトーシスを抑制する。
(VI)
[細胞生存率の測定]
患者iPS細胞および健常者由来iPS/ES細胞から上記方法でペンドリン陽性細胞を誘導した。誘導した細胞に対して、各群に対して以下のような操作を行った。カルペプチン投与群では、3日間カルペプチン投与を行った。細胞ストレス+カルペプチン投与群では、カルペプチン(50μM)2日間投与後、カルペプチンと同時に、細胞ストレスとしてエポキソミシン(0.5μM)を24時間負荷した。一方、細胞ストレス群では、DMSOを2日間投与したのちに、エポキソミシン(0.5μM)のみを24時間負荷した。
カルペプチンは、カルパイン阻害剤の一種であり、神経変性疾患などにおける神経細胞のアポトーシスを抑制することが知られている。しかしながら、図14に示すように、ペンドレッド症候群患者iPS細胞由来の内耳細胞のアポトーシスを抑制することができない。このことは、他の細胞に対してアポトーシス抑制活性があったとしても、内耳細胞のアポトーシスを抑制することができるかどうかは不明であることを示す。
Claims (11)
- 下記構造式Iに示されるビグアナイド系化合物または下記構造式IIに示されるラパマイシン誘導体を有効成分として含有する、アポトーシスに起因する内耳性難聴を治療するための薬剤。
(I)
(式中、R1〜R7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、C1-6アルコキシカルボニル基、C3-8シクロアルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、C1-6アルキル基、C3-8シクロアルキル基、C6-10アリール基、5若しくは6員へテロアリール基、又は5若しくは6員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択される。)
(II)
(式中、R1は、C1-6アルキルまたはC3-6アルキニルであり、R2は、H、−CH2−OHまたは−CH2−CH2−OHであり、そしてXは、=O、(H,H)または(H,OH)である。) - 前記アポトーシスに起因する内耳性難聴が、ペンドレッド症候群に由来する、請求項1に記載の薬剤。
- 前記ビグアナイド系化合物がメトホルミンである、請求項1または2に記載の薬剤。
- 前記ラパマイシン誘導体がラパマイシンである、請求項1または2に記載の薬剤。
- 下記構造式Iに示されるビグアナイド系化合物または下記構造式IIに示されるラパマイシン誘導体を有効成分として含有する、アポトーシス抑制剤。
(I)
(式中、R1〜R7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、C1-6アルコキシカルボニル基、C3-8シクロアルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、C1-6アルキル基、C3-8シクロアルキル基、C6-10アリール基、5若しくは6員へテロアリール基、又は5若しくは6員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択される。)
(II)
(式中、R1は、C1-6アルキルまたはC3-6アルキニルであり、R2は、H、−CH2−OHまたは−CH2−CH2−OHであり、そしてXは、=O、(H,H)または(H,OH)である。) - 内耳細胞のアポトーシスを抑制する、請求項5に記載のアポトーシス抑制剤。
- 前記ビグアナイド系化合物がメトホルミンである、請求項5または6に記載のアポトーシス抑制剤。
- 前記ラパマイシン誘導体がラパマイシンである、請求項5または6に記載のアポトーシス抑制剤。
- アポトーシスを調べる方法であって、
下記構造式(I)または(II)に示される化合物をin vitroで内耳細胞に投与する工程と、
前記内耳細胞にアポトーシスを誘導する工程と、
前記内耳細胞に生じるアポトーシスを調べる工程と、
を含む方法。
(I)
(式中、R1〜R7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、C1-6アルコキシカルボニル基、C3-8シクロアルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、C1-6アルキル基、C3-8シクロアルキル基、C6-10アリール基、5若しくは6員へテロアリール基、又は5若しくは6員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択される。)
(II)
(式中、R1は、C1-6アルキルまたはC3-6アルキニルであり、R2は、H、−CH2−OHまたは−CH2−CH2−OHであり、そしてXは、=O、(H,H)または(H,OH)である。) - アポトーシス抑制物質のスクリーニング方法であって、
下記構造式(I)または(II)に示される化合物をin vitroで内耳細胞に投与する工程と、
前記内耳細胞にアポトーシスを誘導する工程と、
前記内耳細胞に生じるアポトーシスを調べる工程と、
を含む方法。
(I)
(式中、R1〜R7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、C1-6アルコキシカルボニル基、C3-8シクロアルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、C1-6アルキル基、C3-8シクロアルキル基、C6-10アリール基、5若しくは6員へテロアリール基、又は5若しくは6員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択される。)
(II)
(式中、R1は、C1-6アルキルまたはC3-6アルキニルであり、R2は、H、−CH2−OHまたは−CH2−CH2−OHであり、そしてXは、=O、(H,H)または(H,OH)である。)
- アポトーシスに起因する内耳性難聴を治療するための薬剤のスクリーニング方法であって、
下記構造式(I)または(II)に示される化合物をin vitroで内耳細胞に投与する工程と、
前記内耳細胞にアポトーシスを誘導する工程と、
前記内耳細胞に生じるアポトーシスを調べる工程と、
を含む方法。
(I)
(式中、R1〜R7は、水素原子、ハロゲン原子、又は、それぞれハロゲン原子、シアノ基、C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、C1-6アルコキシカルボニル基、C3-8シクロアルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、及びフェニル基から選ばれる置換基を有していてもよい、C1-6アルキル基、C3-8シクロアルキル基、C6-10アリール基、5若しくは6員へテロアリール基、又は5若しくは6員の非芳香族系へテロ環式基、から独立に選択される。)
(II)
(式中、R1は、C1-6アルキルまたはC3-6アルキニルであり、R2は、H、−CH2−OHまたは−CH2−CH2−OHであり、そしてXは、=O、(H,H)または(H,OH)である。)
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