KR20220146349A - 오토파지 활성화제를 유효성분으로 포함하는 비증후군성 상염색제-우성 난청의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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고영익
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Abstract

본 발명은 비증후군성 난청의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 비증후군성 난청, 구체적으로는 상염색체 우성 비증후군성 난청 67(DFNA67)의 직접적인 병인인 세포질 내 변이 OSBPL2 단백질 축적을 효과적으로 제어함으로써 대증적 치료에서 벗어난 근원적인 치료방법으로 이용될 수 있다. 본 발명은 또한 DFNA67과 관련된 OSBPL2 유전자 상의 새로운 프레임쉬프트 변이를 최초로 규명함으로써, 청각장애가 나타나기 전부터 DFNA67 발병의 유전적 위험성을 미연에 예측할 수 있는 신뢰도 높은 바이오마커로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

오토파지 활성화제를 유효성분으로 포함하는 비증후군성 상염색제-우성 난청의 예방 또는 치료용 조성물{A Composition for Preventing or Treating Non-syndromic Autosomal-Dominant Deafness Comprising Autophagy Activator}
본 발명은 오토파지를 활성화시켜 비증후군성 상염색제-우성 난청, 구체적으로는 DFNA67 환자의 세포질 내 축적된 변이단백질 응집체를 제거함으로써 이를 치료하는 방법에 관한 것이다.
청각 상실은 가장 흔한 감각질환으로(1), 성인형 청각 상실은 유년기 청각 상실보다 휠씬 높은 유병률을 보여 매 10년간 두배의 증가를 나타내고 있다(2). 성인형 청각 상실과 관련된 약 60개의 좌위와 약 30개의 유전자가 동정되었으며 이들은 보통 상염색체 우성으로 유전된다. 최근, 이들 유전자는 성인형 청각 상실 원인의 5-10% 만을 차지하는 것으로 나타났다(2). 상염색체 우성 청각 상실은 대개 언어습득 후 진행성의 청각 상실로 나타나 높은 주파수에서 시작하여 모든 주파수에서의 청력 상실로 이어진다. 특히, 성인 청각 상실은 전세계적으로 성인 인구의 상당한 부담으로 작용할 뿐 아니라 높은 입원률, 우울증 및 치매와 관련되어 있다(3-5). 나아가 청각 상실은 전세계적 고령화로 인해 유병률이 계속 증가하고 있으나(6), 이에 대한 효과적인 치료전략은 아직까지 개발되지 못하고 있다.
옥시스테롤-결합 단백질-유사 단백질 2 유전자(OSBPL2, MIM606731)의 돌연변이는 비-증후군 청각 상실(NSHL), 난청 비-증후군 상염색체 우성 67(DFNA67, MIM616340)(7-9)과 병인학적으로 연관되어 있다. OSBPL2 돌연변이를 가지는 환자는 5세에서 40세 사이에 언어습득 후 청각 상실과 함께 양측 대칭, 중간 내지 중증 청각 상실이 발병한다. 청각 상실은 대부분 어린 나이에 고주파수에서 시작되어 나이가 들면서 다른 주파수대로의 확장이 진행된다.
OSBPL2는 세포 내 지질 수용체인 옥시스테롤-결합 단백질(OSBP) 패밀리에 속하는 옥시스테롤-결합 단백질-관련 단백질 2(ORP2)를 인코딩한다(10). 이 패밀이의 대부분 멤버는 N-말단 플레크스트린 상동 도메인과 보존적인 C-말단 OSBP-유사 스테롤-결합 도메인을 가지지만, OSBPL2는 스테롤-결합 도메인만을 가진다(10). 인 비트로 연구 결과 OSBPL2가 22- 및 25-하이드록시콜레스테롤, 포스파티드산 및 포스파티딜이노시톨 3-포스페이트에 결합함이 밝혀졌다(11). OSBPL2는 콜레스테롤 및 중성지방 조절에 중요한 역할을 하지만(11-13); NSHL에서 OSBPL2 결핍의 원인은 완전히 알려지지 않았다. OSBPL2-결핍 돼지는 고콜레스테롤혈증과 함께 달팽이관 유모세포가 퇴행하고 고정섬모의 형태이상이 수반되는 진행성 청각 상실을 보인다(14). 나아가, 고지방식이는 청각 상실을 더 악화시키고 중증의 고콜레스테롤혈증을 야기한다. 따라서, 이러한 연구 결과를 통해 OSBPL2 소실에 의한 지질대사 이상과 청각장애 간의 관련성을 알 수 있다. 그러나, 환자는 하나의 야생형 및 하나의 돌연변이 대립형질을 가짐에 반하여 기능 이상을 보이는 녹아웃 돼지, 세포 및 제브라피쉬 모델에 대한 연구만 이루어졌기 때문에, 어떻게 OSBPL2 돌연변이가 청각 상실로 이어지는지는 여전히 불명확하다.
단백질병증은 미스폴딩 단백질의 비정상적인 축적을 원인으로 하는 모든 질환을 일컫는다(16). 단백질의 미스폴딩 및 세포 내 축적은 알츠하이머병, 파킨슨병, 군위축성 측상경화증, 프리온병 및 폴리글루타민 질환을 포함하는 퇴행성 질환과 같은 다양한 인간 질환의 주요 특징이다(16). ΔF508 돌연변이로 인한 낭포성 섬유증과 같은 몇몇 단백질병증은 미스폴딩 단백질이 분비 경로인 ER(endoplasmic reticulum) 또는 골지체에 축적되는 것을 특징으로 한다(17). 그 밖의 단백질병증은 파킨슨병과 같이 미스폴딩 단백질 응집체가 세포질 또는 핵에 축적된다(18). 단백질병증은 또한 청각 상실의 유전적 원인 중 하나이다. SLC26A4에서의 돌연변이는 내이에서 펜드린이 미스폴딩되도록 하고 달팽이관 퇴행에 따른 선천적 청각장애를 일으킨다(19, 20). 또한, COCH의 돌연변이는 미스폴딩된 코클린(cochlin)이 달팽이관 주변에 축적되도록 하여 청각 기능을 서서히 마비시킨다(21, 22).
본 발명자들은 성인 진행성 청각 상실을 가지는 가계에서 2개의 OSBPL2 돌연변이를 동정하고 이들이 돌연변이 OSBPL2 단백질의 축적을 야기함을 규명하였으며, 또한 신규한 마우스 청각 상실 모델을 구축하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
특허문헌 1. 중국 특허공개공보 제108342471호
본 발명자들은 유전성 청각 장애, 구체적으로는 OSBPL2 유전자의 돌연변이로 인한 비증후군성 난청에 대한 명확한 병인을 규명함으로써 이에 대한 효율적인 치료 조성물을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, OSBPL2 유전자의 돌연변이로 인한 비증후군성 난청이 변이 OSBPL2 단백질의 세포 내 응집을 유발하는 단백질병증(proteinopathy)임을 최초로 규명하고, 변이 단백질 축적을 억제하는 오토파지 경로의 활성화를 통해 이의 병인을 근본적으로 제거할 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 비증후군성 난청의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 비증후군성 난청의 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 오토파지 활성화제를 유효성분으로 포함하는 비증후군성 난청의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 유전성 청각 장애, 구체적으로는 OSBPL2 유전자의 돌연변이로 인한 비증후군성 난청에 대한 명확한 병인을 규명함으로써 이에 대한 효율적인 치료 조성물을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, OSBPL2 유전자의 돌연변이로 인한 비증후군성 난청이 변이 OSBPL2 단백질의 세포 내 응집을 유발하는 단백질병증(proteinopathy)임을 최초로 규명하고, 변이 단백질 축적을 억제하는 오토파지 경로의 활성화를 통해 이의 병인을 근본적으로 제거할 수 있음을 발견하였다.
본 명세서에서 용어“오토파지(autophagy)”는 세포의 생존 및 성장에 불필요하거나 유해한 세포 구성 성분을 분해하는 라이소좀-관여 이화 과정을 의미한다. 자가포식 작용이라고도 불리우는 오토파지는 세포의 생존, 분화, 발생 및 항상성 유지를 위해 필수적인 과정으로, 알츠하이머, 각막이상증 등 이상단백질의 축적 및 응집으로 인한 질환의 진행을 막기도 하고, 플라크 축적으로 인한 심혈관 질환을 개선하기도 한다.
본 명세서에서 용어“오토파지 활성화제(autophagy activator)”는 세포 내에서 오토파지를 촉진하거나 유도할 수 있는 시약, 화합물, 천연물, 단백질, 핵산분자를 포함하는 일련의 유효 성분을 포괄하는 의미이다. 오토파지 활성화제는 대조군 대비 오토파지 활성의 증가를 측정할 수 있는 당업계의 다양한 방법에 의해 탐색될 수 있으며, 예를 들어 미국 특허공개공보 제 2012/01788119호에 기재된 방법을 이용할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야에는 다양한 오토파지 활성화제들이 공지되어 있으며, 예를 들어 mTOR 경로 억제제(예를 들어 라파마이신), 비타민 D, 비타민 D 유사체, mTOR 경로 의존적 오토파지 활성화제(예를 들어 트레할로스), 카르바마제핀(Carbamazepine), 소듐 발프로에이트(Sodium Valproate), 베라파밀(Verapamil), 로페라마이드(Loperamide), 아미오다론(Amiodarone), 니모디핀(Nimodipin), 니트렌디핀(Nitrendipine), 니굴디핀(Niguldipine), 프리모자이드(Primozide), 칼파스타틴(Calpastatin), 칼펩틴(Calpeptin), 클로니딘(Clonidine), 필메니딘(Pilmenidine), 2',5'-디데옥시아데노신(2',5'-dideoxyadenosine), 미녹시딜(Minoxidil), 페니트렘 A(Penitrem A), 플루스피릴린(Fluspiriline), 트리플루오페라진(Trifluoperazine)을 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 여하한 오토파지 활성화제도 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 오토파지 활성화제는 mTOR(mechanistic target of rapamycin) 억제제인 것을 특징으로 하는 조성물.
본 명세서에서 용어 "mTOR 억제제(mTOR inhibitor)"는 mTOR 단백질의 활성 또는 발현의 저하를 야기시키는 물질을 의미하며, 이에 의해 mTOR의 활성 또는 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 경우 뿐 아니라, mTOR에 의한 오토파지의 활성 저하가 유의하게 개선될 수 있을 정도로 mTOR의 활성 또는 발현을 감소시키는 물질을 의미한다.
본 명세서에서 용어“발현의 감소”는 mTOR의 발현량이 단백질 수준 또는 유전자 수준에서 예를 들어 대조군에 비하여 20% 이상 감소한 상태, 보다 구체적으로는 30% 이상 감소한 상태, 보다 더 구체적으로는 40% 이상 감소한 상태를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어“활성의 감소”란 대조군에 비하여 mTOR의 생체내 고유한 기능이 측정 가능할 정도로 유의하게 감소하는 것을 말하며, 구체적으로는 세포 내 오토파지 활성이 유의하게 개선 또는 회복될 수 있을 정도로 mTOR의 활성이 감소하는 것을 말한다. 활성(activity)의 감소는 단순한 기능(function)의 감소 뿐 아니라 안정성(stability)의 감소로 기인한 궁극적인 활성 저해를 포함한다.
보다 구체적으로는, 상기 mTOR 억제제는 라파마이신(rapamycin), Torin 1, 에베롤리무스(everolimus), 아스코마이신, 템시롤리무스(Temsirolimus), 조타롤리무스(Zotarolimus), 리다포롤리무스(Ridaforolimus), AP23841, AZD08055, OSI027 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염으로 구성된 군으로터 선택되는 하나 이상이며, 가장 구체적으로는 라파마이신이다.
본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하면 오토파지 활성 증진을 통해 변이 OSBPL2 단백질을 제거함으로써 변이 OSBPL2 단백질의 응집 및 세포 내 축적으로 인한 청각상실 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 조성물 내의 약리성분이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 용어“대상체”는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 구체적으로는 비경구 방식으로 투여될 수 있고, 보다 구체적으로는 피하, 경피, 정맥 또는 고실 내 투여(intratympanic administration)될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료될 수 있는 비증후군성 난청은 옥시스테롤-결합 단백질-유사 단백질 2 유전자(OSBPL2)의 돌연변이에 의한 난청이다.
보다 구체적으로는, 상기 비증후군성 난청은 상염색체 우성 비증후군성 난청 67(deafness nonsyndromic autosomal dominant 67, DFNA67)이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 이에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 검출하는 제제를 유효성분으로 포함하는 비증후군성 난청의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물로 진단하고자 하는 비증후군성 난청에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열은 청각장애를 가지는 환자의 OSBPL2 유전자 상의 신규 프레임쉬프트 돌연변이인 c.180_181ACdel (p.H60Qfs*93)의 뉴클레오타이드 서열이다. 본 발명자들은 이제까지 상염색체 우성 비증후군성 난청 환자에서의 청각 장애 표현형과의 관련성이 전혀 보고되지 않았던 c.180_181ACdel 돌연변이를 최초로 발견하였다. 따라서, c.180_181ACdel 변이의 존재 여부를 진단 또는 예측 표지자로 사용할 경우, 통상적으로 OSBPL2 유전자 돌연변이로 인한 청각장애 증상이 나타나는 10대 후반 이전에도 향후 청각 장애가 발생할 유전적 위험성을 미리 예측하고 조기에 치료 전략을 수립할 수 있다.
본 발명에서 진단을 위해 검출하고자 하는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다. 뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 인코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 인코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
본 명세서에서 용어“진단”은 특정 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)의 판정, 특정 질환을 현재 개체가 가지고 있는 지 여부의 판정,특정 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)의 판정 및 개체가 향후 질환에 걸릴 위험성의 판정을 모두 포함한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 취지상“진단”은 특정 질환을 현재 개체가 가지고 있는 지 여부 또는 개체가 향후 해당 질환에 걸릴 위험성이 있는지의 판정이다.
본 명세서에서 용어“진단용 조성물”은 대상체의 청각 장애 여부를 판단하거나 향후 발병 가능성을 예측하기 위해 OSBPL2 유전자 상의 c.180_181ACdel 변이의 검출수단을 포함하는 통합적인 혼합물(mixture) 또는 장비(device)를 의미하며, 이에“진단용 키트”로 표현될 수도 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 검출하는 제제는 상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브이다.
본 명세서에서 용어“뉴클레오타이드”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 명세서에서 사용되는 용어“프라이머”는 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.
본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산, 예를 들어 상술한 OSBPL2 변이 유전자의 특정 염기서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어“상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary)인 경우 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 경우를 모두 포괄하는 의미이며, 구체적으로는 완전히 상보적인 경우를 의미한다. 본 명세서에서 용어“실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, pH 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 이러한 프라이머의 설계는 타겟 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자가 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 명세서에서 용어“프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 구체적으로, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이며, 더욱 구체적으로는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 OSBPL2 변이 유전자의 특정 염기서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 타겟 서열의 3’-말단 또는 5’-말단에 상보적인 프로브를 사용하는 것이 바람직하다.
혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다.
본 명세서에서 용어“상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 발현 억제용 핵산 분자가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어“실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 서열 특이적인 혼성화가 일어날 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 인코딩하는 아미노산 서열을 검출하는 제제는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 앱타머이다.
본 발명에 따르면, 서열목록 제2서열은 본 발명에서 규명된 신규 프레임쉬프트 돌연변이인 c.180_181ACdel에 의해 인코딩되는 아미노산 서열이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 변이 단백질을 항원-항체 반응을 이용한 면역분석(immunoassay) 방법에 따라 검출하여 청각 장애 여부를 분석하는 데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석 또는 면역염색 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 표지된 항체가 이용될 수 있다. 본 발명에서 변이 OSBPL2 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519 (1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조의 일반적 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999 등에 상세하게 기재되어 있다.
상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 강도를 분석함으로써, 상피장벽 기능을 예측할 수 있다. 즉, 개체의 시료에서 변이 OSBPL2 단백질에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우에는 개체의 청각 기능이 상실되거나 향후 상실될 위험성이 있는 것으로 판단된다.
본 명세서에서 용어“항원 결합 단편(antigen binding fragment)”은 면역글로불린 전체 구조 중 항원이 결합할 수 있는 폴리펩티드의 일부를 의미하며, 예를 들어 F(ab')2, Fab', Fab, Fv 및 scFv를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어, "특이적으로 결합(specifically binding)" 은 "특이적으로 인식(specifically recognizing)"과 동일한 의미로서, 항원과 항체(또는 이의 단편)가 면역학적 반응을 통해 특이적으로 상호작용하는 것을 의미한다.
본 발명은 항체 대신 변이 OSBPL2 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수도 있다. 본 명세서에서 용어“앱타머”는 특정 표적물질에 높은 친화력과 특이성으로 결합하는 단일 줄기의(single-stranded) 핵산(RNA 또는 DNA) 분자 또는 펩타이드 분자를 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):426-30(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):14272-7(1998)에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 비증후군성 난청의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) mTOR 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 mTOR의 활성 또는 발현량을 측정하는 단계, 상기 mTOR의 활성 또는 발현량이 감소한 경우, 상기 시험물질은 비증후군성 난청의 예방 또는 치료용 조성물로 판정한다.
본 발명의 방법으로 스크리닝된 물질이 예방 또는 치료하고자 하는 비증후군성 난청에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, mTOR 단백질을 발현하는 세포를 포함하고 있는 모든 시료로서, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어“후보물질”은 mTOR를 발현하는 세포를 포함하는 시료에 첨가되어 mTOR의 활성 또는 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화합물, 뉴클레오타이드, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시험물질을 처리한 생물학적 시료에서 mTOR의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 발현량 및 활성 측정방법에 의해 수행될 수 있다. 측정 결과, mTOR의 발현량 또는 활성이 감소한 경우 상기 시험물질은 비증후군성 난청, 구체적으로는 본 발명자들에 의해 단백질병증(proteinopathy)임이 새롭게 규명된 DFNA67의 예방 또는 치료용 조성물로 판정될 수 있다.
본 명세서에서 용어“활성 또는 발현량의 감소”는 mTOR에 의해 유도되는 오토파지 억제가 유의하게 저하되어 변이 OSBPL2 단백질의 응집 및 축적이 측정 가능한 수준으로 개선될 정도로 mTOR의 생체 내 고유한 기능 또는 발현량이 감소하는 것을 의미한다. 활성(activity)의 감소는 단순한 기능(function)의 감소 뿐 아니라 안정성(stability)의 감소로 기인한 궁극적인 활성 저해를 포함한다. 구체적으로는 대조군에 비하여 활성 또는 발현량이 20% 이상 감소한 상태, 보다 구체적으로는 40% 이상 감소한 상태, 더욱 구체적으로는 60% 이상 감소한 상태를 의미할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 오토파지 활성화제를 투여하는 단계를 포함하는 비증후군성 난청의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 이를 인코딩하는 아미노산 서열의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 비증후군성 난청의 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 비증후군성 난청의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 진단용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 비증후군성 난청, 구체적으로는 상염색체 우성 비증후군성 난청 67(DFNA67)의 직접적인 병인인 세포질 내 변이 OSBPL2 단백질 축적을 효과적으로 제어함으로써 대증적 치료에서 벗어난 근원적인 치료방법으로 이용될 수 있다.
(c) 본 발명은 또한 DFNA67과 관련된 OSBPL2 유전자 상의 새로운 프레임쉬프트 변이를 최초로 규명함으로써, 청각장애가 나타나기 전부터 DFNA67 발병의 유전적 위험성을 미연에 예측할 수 있는 신뢰도 높은 바이오마커로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 OSBPL2 돌연변이의 동정 결과를 나타낸 그림이다. 도 1a 및 1b는 청각상실의 상염색체 우성 패턴을 가지면서 증후군성 특성을 보이지 않는 YUHL3 및 YUHL457의 가계도를 각각 나타낸 그림이다. 각 대상자의 OSBPL2 유전자형을 표시하였다. M1, c.158_159AAdel(p.Gln53Argfs*100); M2, c.180_181ACdel (p.His60Glnfs*93). 도 1c는 두 가계의 각 프로밴드에 대한 순음 오디오그램 결과이며, UHL3 Ⅲ13 (여성/37) 및 YUHL457 Ⅲ-4 (여성/51)에서 양측의 감각신경성 청각 상실이 발생하였음을 알 수 있다. YUHL3 Ⅲ-13 및 YUHL457 Ⅲ-4에서 청각 장애는 각각 20대 후반과 30대 초반에 시작되었다. 중증(>70dB HL) 청각장애는 고주파수에서 주로 영향을 받으며, 하강형(down-sloping) 청각 상실을 보인다. 질환을 가진 환자는 250 및 500 Hz에서 청각 기능이 남아있었다. 붉은색, 오른쪽 귀; 파란색, 왼쪽 귀. 도 1d는 인간 OSBPL2 cDNA의 엑손 구조와 OSBPL2의 도메인 구조를 나타낸다. DFNA67를 가진 환자에서 동정된 프레임쉬프트 변이체를 표시하였으며, 본 발명에서 동정된 변이는 파란색으로 표시하였다. 도 1e는 말단이 잘린 OSBPL2 돌연변이의 서열 정렬 결과이다. DFNA67와 관련된 OSBPL2 돌연변이는 약 50개 아미노산의 N-말단 OSBPL2 및 100개 아미노산의 신규-펩타이드로 구성된 거의 동일한 융합 단백질로 나타났다. 첨가된 아미노산은 어떤 알려진 단백질과도 상동성이 없었다.
도 2는 돌연변이 OSBPL2가 세포 내 응집을 형성함을 보여주는 그림이다. 도 2a는 HeLa 또는 HEI-OC1 세포에서 OSBPL2 야생형(WT) 및 돌연변이에 대해 항-Myc 항체를 이용한 면역형광염색을 수행한 결과이다. WT OSBPL2는 세포질 내에서 균일하게 존재하는 반면, 말단이 잘린 OSBPL2 돌연변이 단백질은 대부분의 세포에서 응집된 패턴을 보였다(화살표머리). 스케일바, 20μm. 도 2b는 돌연변이 OSBPL2가 고분자량의 멀티머를 형성하며, 5 nM 바필로마이신 A1 처리 후 24시간 뒤 농도가 증가함을 보여주는 그림이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. *p<0.05, **p<0.01, ns 유의성 없음; 스튜던트 t-검정. 도 2c는 HeLa 세포에서 OSBPL2 WT 및 돌연변이 단백질에 대한 면역형광염색 결과이다. ER(Endoplasmic reticulum, YFP-ER), 골지(YFP-Golgi), 막(GFP848 membrane), 엔도좀(GFP-Rab5) 및 라이소좀(GFP-Lamp1)을 표지하였다. 공배치는 Manders 공배치 계수를 계산하여 정량하였다. 스케일바, 20μm. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. *p<0.05, ***p<0.005, 스튜던트 t-검정.
도 3은 Osbpl2 녹아웃 마우스에서 청각 상실이 발생하지 않음을 보여주는 그림이다. 도 3a는 마우스 달팽이관에서의 OSBPL2 발현을 나타낸다. OSBPL2(붉은색)를 Tuj1 또는 Myo7a(녹색)와 공-면역염색하였다. 스케일바, 20μm. 도 3b는 Osbpl2 녹아웃(KO) 마우스 제작과정을 나타낸다. Osbpl2의 3번 엑손을 타겟팅하는 단일-가이드 RNA를 선정하였다. 도 3c-3d는 Osbpl2+/+(검은색), Osbpl2+/-(파란색) 및 Osbpl2-/-(붉은색) 마우스의 출생 후(P) 120일의 ABR 및 DPOAE 역치를 나타낸 그래프이다. 유전자형에 따라 청각 기능의 유의한 차이는 나타나지 않았다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 도 3e-3f는 고지방식이(HFD)를 먹인 Osbpl2+/+(검은색) 및 Osbpl2-/-(붉은색) 마우스의 P120에서의 ABR 및 DPOAE 역치를 나타낸 그래프이다. HFD는 Osbpl2 KO 마우스에서도 청각 장애를 유발하지 않았다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. 도 3g는 2개월간 고지방식이를 먹인 Osbpl2+/+, Osbpl2+/- 및 Osbpl2+/+ 마우스의 혈청 콜레스테롤(CHOL), 중성지방(TG) 및 고밀도 지단백질(HDL) 수준을 보여주는 그림이다.
도 4는 돌연변이 OSBPL2를 발현하는 형질전환 마우스에서 청각 상실이 반복됨을 보여주는 그림이다. 도 4a는 p.Q53Rfs*100 OSBPL2를 발현하는 형질전환 마우스(hQ53R-TG)의 모식도이다. 유전자 도입 카세트는 CAG 프로모터, 3XFLAG-tagged p.Q53Rfs*100 OSBPL2 및 SV40 poly(A) tail 서열로 구성되며, 화살표는 지노타이핑을 위한 PCR 프라이머를 나타낸다. 도 4b는 (B) 항-FLAG 항체를 이용하여 hQ53R-TG 마우스의 내이, 뇌, 간 및 신장에서 p.Q53Rfs*100 OSBPL2에 대해 면역블롯팅 결과을 수행한 결과를 보여준다. 도 4c-4d는 대조군(검은색)과 hQ53R-TG(붉은색) 마우스의 P60에서의 ABR 및 DPOAE 역치를 나타낸 그래프이다. 대조군 마우스와 비교하여, hQ53R-TG 마우스는 모든 주파수에서 중증의 청각장애를 보였다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005, ns 유의성 없음; 스튜던트 t-검정. 전체 마운트된 내이에 대한 팔로이딘(녹색) 및 FLAG(붉은색) 면역염색 결과 P60의 hQ53R-TG 마우스에서 코르티기관의 심한 퇴행과 퓨로마이신에의 변이 단백질 응집이 관찰되었다(도 4e). 스케일바, 100μm. 도 4f는 hQ53R-TG 마우스에 대한 P60에서의 면역조직화학 및 조직학 분석결과이다. 항-Tuj1, 항-Myo7a 및 H&E 염색을 통해 hQ53R-TG 마우스에서 퓨로마이신 뉴런 및 유모세포의 퇴행을 확인하였다.
도 5는 돌연변이 OSBPL2가 라이소좀 내 결합을 유발함을 보여주는 그림이다. 도 5a는 프로테오믹스 분석으로 동정된 야생형(WT) 및 p.Q53Rfs*100 OSBPL2 간의 대표적 상호작용 인자를 나타낸 그림이다. 보라색으로 표시된 단백질은 WT 및 돌연변이 OSBPL2에서 모두 검출되었다. 파란색으로 표시된 단백질은 WT OSBPL2의 상호작용 인자이고, 붉은색으로 표시된 단백질은 돌연변이 OSBPL2에 결합하는 단백질이다. SNRPF 및 VAPB (검은색 테두리의 보라색 표시)는 WT OSBPL2의 알려진 상호작용인자이다. 도 5b는 돌연변이 OSBPL2에 대한 유전자 온톨로지 분석 결과이다. 도 5c는 p.Q53Rfs*100 OSBPL2 과발현 세포 내 LC3I에서 LC3Ⅱ로의 전환이 감소함을 보여주는 오토파지 유입 어세이 결과이다. 형질전환 48시간 뒤, 세포를 EBSS(Earle's balanced salt solution)에서 혈청을 공급하지 않고/또는 10μM 클로로퀸을 4시간 도안 처리하여 각각 오토파지를 유도하거나 억제하였다. *p<0.05 스튜던트 t-검정. 도 5d는 LysoTracker의 신호 강도가 WT OSBPL2 과발현 세포에 비해 p.Q53Rfs*100 OSBPL2 과발현 세포에서 더 증가함으로 보여주는 그림이다. 지정된 플라스미드로 형질전환된 HeLa 세포를 200 nM LysoTracker와 함께 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 스케일바, 20μm. ***p<0.005; 스튜던트 t-검정. 도 5e는 로다민-표지된 덱스트란이 WT OSBPL2 과발현 세포에 비해 p.Q53Rfs*100 OSBPL2 과발현 세포에서 더 많이 축적됨을 보여주는 그림이다. 스케일바, 20μm. ***p<0.005; 스튜던트 t-검정.
도 6은 라파마이신이 돌연변이 OSBPL2로 인한 세포 결합을 복구함을 보여주는 그림이다. 도 6a는 p.Q53Rfs*100 OSBPL2의 과발현에 의해 고분자량의 폴리유비퀴틴화된 단백질이 증가하는 반면, 3μM 라파마이신을 처리하거나 영양을 겹핍시키면 돌연변이 OSBPL2 멀티머와 폴리유비퀴틴화된 단백질이 감소함을 보여준다. HEK 293 세포를 형질전환 후 수집하였다. 단백질 시료는 항-FLAG 항체로 면역침강하고 항-유비퀴틴, 항-Myc 및 항-FLAG 항체를 이용하여 면역블롯팅하였다. FL, 전장. 도 6b는 p.Q53Rfs*100 OSPBL2의 과발현이 mTOR 인산화를 유도하는 반면, WT OSBPL2는 이를 감소시킴을 보여주는 그림이다. 돌연변이 OSPBL2의 과발현에 의한 mTOR 인산화는 3μM 라파마이신 처리에 의해 감소되었다. 밀도분석 결과는 최소 3번의 독립적 실험의 대표값이며 밴드 강도는 β-액틴에 대해 정규화하였다. **p<0.01; 스튜던트 t-검정. 도 6c-6e는 라파마이신 처리에 의해 오토파지 마커인 LC3 및 p62와 p.Q53Rfs*100 OSBPL2의 공배치가 증가함을 보여주는 그림이다. mCherry-LC3 또는 GFP-p62와 OSBPL2를 포함하는 플라스미드를 HeLa 세포에 형질도입하고 300 nM 라파마이신을 24시간 동안 처리하였다. 공배치(공배치)는 Manders 공배치 계수를 계산하여 정량화하였다. 스케일바, 20μm. *p<0.05, ** p<0.01; 스튜던트 t-검정.
도 7은 라파마이신이 hQ53R-TG 마우스의 청각 상실 표현형을 부분적으로 회복시킴을 보여주는 그림이다. 도 7a는 라파마이신(Rapa, 2 mg/kg) 투여 전략을 요약한 모식도이다. Strategy #1에선 라파마이신을 출생 후(P) 1일부터 P10까지, Strategy #2에선 P7에서 P15까지, Strategy #3에선 P30에서 P60까지 매일 복강주사하였다. 청력 검사는 P30 및 P60에 수행하였다. Rapa, 라파마이신. 도 7b 및 7c는 대조군(검은색), hQ53R-TG(붉은색) 및 Strategy #2로 라파마이신을 처리한 hQ53R-TG 마우스(파란색)의 P60에서의 ABR 및 DPOAE 역치를 보여주는 그림이다. 라파마이신 처리에 의해 hQ53R-TG 마우스에서 ABR 클릭 역치가 40 dB로 유의하게 감소하였다. 라파마이신 처리한 hQ53R-TG 마우스에서 DPOAE 증폭도 6 및 12 kH에서 회복되었다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005, ns 유의성 없음; 스튜던트 t-검정. 도 7d는 라파마이신 처리한 hQ53R-TG 마우스에서 클릭 자극에 대한 대표적인 ABR 기록 결과를 통해 라파마이신이 청각 표현형을 회복시킴을 보여주는 그림이다. 도 7e는 라파마이신을 처리하거나 처리하지 않은 hQ53R-TG 마우스에 대한 P30에서의 면역조직화학 및 조직학 분석 결과이다. Myo7a, TUJ1 및 H&E 염색 결과 유모세포 및 퓨로마이신 뉴런이 라파마이신-처리 hQ53R-TG 마우스에서 비처리 hQ53R-TG에 비해 보존됨을 알 수 있었다. 라파마이신은 항-FLAG 항체를 통해 검출되는 p.Q53Rfs*100 OSBPL2의 강도로 약화시켰다. 도 7f는 라파마이신을 처리하거나 처리하지 않은 hQ53R-TG 마우스 내이를 대조군 마우스와 비교한 주사전자 현미경(SEM) 이미지이다. 라파마이신 처리한 hQ53R-TG 마우스는 유모세포가 hQ53R-TG 미처리 마우스에 비해 부분적으로 회복되는 것으로 나타났다. 스케일바, 10μm. 도 7g는 대조군인 미처리 hQ53R-TG 및 라파마이신 처리 hQ53R-TG에 대한 투과전자 현미경 이미지이다. hQ53R-TG 마우스는 퓨로마이신 뉴런의 세포질에서 전자-밀집 구조를 보였으나(붉은 화살표), 이러한 구조는 라파마이신 처리한 hQ53R-TG 마우스에서 유의하게 감소하였다. 검은 사각형은 우측 패널의 확대된 부분이다.
도 8은 YUHL3 및 YUHL457 패밀리 중 DFNA67를 가진 환자에서 라파마이신의 효과를 보여주는 그림이다. 라파마이신(매일 2 mg) (Rapamune, Pfizer) 투여 전 및 3개월 후 YUHL3 및 YUHL457 패밀리 중 DFNA67를 가진 환자(n=5)의 순음 오디오그램을 수득하였다(도 8a-8b). 양쪽 귀에 대한 데이터를 모두 표시하였다. 모집된 환자는 초기에 중간-중증의 청각 상실을 보였다(도 8a). 3개월 후 청각 역치의 변화를 계산하였으며, 3,000 Hz에서 유의하게 개선되었다(도 8b). 데이터는 평균 ± 표준오차로 나타내었다. **p<0.01 양측 t-검정. 초기 반응만을 보이는 환자(YUHL457: IV-2)로부터 DPOA(Distortion product autoacoustic emission) 역치를 계산한 결과양쪽 귀(우측, 도 8c의 붉은색; 좌측, 도 8d의 파란색) 모두 4 kHz를 제외한 모든 주파수에서 DPOAE에 대한 양성 반응을 보였다. 점선은 배경 잡음 수준을 나타낸다. 신호 대 노이즈 비율(SNR)의 변화는 처리 3개월 후 모두 양의 값을 보였다(도 8e). 도 8f는 이명(tinnitus) 증상을 가지는 3명의 환자에서 라파마이신 처리 3개월 후 THI(Tinnitus handicap inventory) 점수를 계산한 결과이다.
도 9는 YUHL3 및 YUHL457의 OSBPL2에서 변이가 분리됨을 보여주는 그림으로, YUHL3(도 9a) 및 YUHL457(도 9b) 가계 유래 환자의 OSBPL2 변이에 대한 생어 시퀀싱 트레이스 결과이다.
도 10은 OSBPL2 돌연변이를 가지는 환자의 청각학적 표현형을 보여주는 그림이다. YUHL3 및 YUHL457 가계 유래 환자의 순음 오디오그램을 나타내었으며, OSBPL2 돌연변이를 가진 환자는 별표를 표시하였다. F, 여성; M, 남성; 붉은색, 우측귀; 파란색, 좌측 귀.
도 11은 프레임쉬프트 돌연변이가 OSBPL2 발현에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. 도 11a는 OSBPL2 mRNA의 양이 OSBPL2 돌연변이 유무에 따라 다르지 않음을 보여주는 실시간 PCR 결과이다. M1, c.158_159AAdel (p.Gln53Argfs*100); M2, c.177_178ACdel (p.His60Glnfs*93). 유전자 발현은 GAPDH 발현에 대해 정규화하였으며, 2-ΔΔCt로 계산하였고, 데이터는 평균± 표준편차로 나타내었다. 도 11b-e는 야생형(WT) 및 돌연변이 OSBPL2의 안정성 시험 결과이다. 시료는 사이클로헥사마이드(100μg/mL) 처리 후 지정된 시간에 수집하였다. p.Q53Rfs*100 돌연변이, 특히 다량체는 과발현시 OSBPL2 WT에 비하여 더 안정하였다. 데이터는 최소 3번의 독립적인 실험에 대한 대푯값으로 나타내었으며, 밴드 강도는 β-액틴에 대해 정규화하였다. 대표적인 면역블롯팅 결과는 도 11d 및 11e에 나타내었다. *p<0.05, **p<0.01, n.s. 유의성 없음; 스튜던트 t-검정.
도 12는 p.L195M이 OSBPL2의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. p.L195M 변이 단백질은 야생형(WT) OSBPL2와 유사한 발현 패턴을 나타낸 반면, 말단이 잘린 OSBPL2 단백질은 과발현시 세포질 내 응집체를 형성하였다(도 12a). 스케일바, 20μm. WT 및 p.L195M OSBPL2는 변성 조건에서 다량체 밴드를 나타내지 않은 반면, OSBPL2 neo-protein은 변성 조건에서도 다량체를 형성하였다(도 12b).
도 13은 돌연변이 OSBPL2가 야생형 OSBPL2와 상호작용함을 보여주는 그림이다. HEK 293 세포를 Myc-태깅된 OSBPL2 야생형(WT) 및 FLAG-태깅된 WT 또는 p.Q53Rfs*100 OSBPL2로 공-형질전환하였다. 36시간 뒤 전체 세포 용해물에 대해 항-Myc(도 13a) 또는 항-FLAG(도 13b) 항체로 면역침강 및 면역블롯팅을 수행하였다.
도 14는 Osbpl2 녹-아웃 마우스의 청각 표현형을 나타내는 그림이다. 도 14a는 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 형성된 삽입/삭제 대립형질을 동정한 T7E1 어세이 결과이다. F0 마우스(#13)로 추가 육종을 수행하였다. 도 14b는 #13 F0 마우스가 낳은 F1 마우스에 대한 PCR 지노타이핑 결과이다. #13 F0 마우스는 97 bp 삽입(#13-Low) 및 533 bp 삽입(#13-High)의 혼합된 유전자형을 가졌다. 두 유전자형 모두 추가 실험에 사용되었다. 도 14c는 Osbpl2+/+, Osbpl2+/- 및 Osbpl2-/-마우스의 뇌 및 내이(inner ear)를 이용한 OSBPL2의 면역블롯팅 결과이다. 도 14d는 출생 후 180까지의 Osbpl2+/+ (검은색), Osbpl2+/-(파란색) 및 Osbpl2-/-(붉은색) 마우스의 클릭 ABR 역치를 나타낸 그림이다. 도 14e는 항-Myo7a(녹색) 및 항-OSBPL2(붉은색) 항체를 이용한 면역조직화학 분석 및 주사전자현미경 관찰을 통해 P120의 Osbpl2+/- 및 Osbpl2-/- 마우스의 유모세포와 부동섬모가 정상임을 확인한결과이다. 도 14f는 P30 및 P120에서의 Osbpl2 마우스의 코르티기관에 대한 면역조직화학 및 조직학적 분석 결과이다. 항-Tuj1(녹색), 항-NF-H(붉은색) 및 H&E 염색 결과 Osbpl2+/- 및 Osbpl2-/- 마우스의 나선신경절 뉴런은 Osbpl2+/+ 마우스와 유사하였다. 또한, 유모세포는 Osbpl2+/- 및 Osbpl2-/- 마우스에서 잘 보존되었다.
도 15는 Osbpl2-/- 마우스는 고지방식이로 인해 청각 장애가 유발되지 않음을 보여주는 그림이다. 도 15a는 출생 후(P) 120일에 고지방식이(HFD)를 먹인 Osbpl2+/+ 및 Osbpl2-/- 마우스의 달팽이관을 팔로이딘(녹색)을 이용하여 면역염색한 결과이다. 내측 유모세포(IHCs)와 외측 유모세포(OHCs)의 형태는 Osbpl2+/+ 및 Osbpl2-/- 마우스 간의 유의한 차이가 없었다. 스케일바, 20μm. 도 15b는 HFD를 먹인 Osbpl2+/+ 및 Osbpl2-/- 마우스의 달팽이관 단면의 H&E 염색 결과를 나타낸다. 양 유전자형 모두에서 나선신경절 뉴런과 코르티기관의 완전한 형태가 관찰되었다. 스케일바, 100μm.
도 16은 Osbpl2의 전장 유전자 삭제가 마우스의 에너지 항상성에 미치는 영향을 보여주는 그림이다 도 16a-e는 2개월 간 일반식이를 공급한 뒤, 간접 열량 분석을 수행한 결과로서, Osbpl2+/+(검은색), Osbpl2+/-(파란색) 및 Osbpl2-/-(붉은색) 마우스의 체중(도 16a), 일일 음식섭취(도 16b), 일일 활동량(도 16c), 에너지 소비(도 16d) 및 지방 조성(도 16e)을 각각 보여준다(그룹 당 n = 3-4).
도 17은 OSBPL2 돌연변이를 가지는 환자의 혈청 지질 프로파일을 보여주는 그림이다. 고밀도 지단백질(HDL), 저밀도 지단백질(LDL), 중성지방(도 17a), 지방산, 아포지단백질 A1 및 아포지단백질 B 수준(도 17b)은 대조군과 OSBPL2 돌연변이를 가진 환자들 간 다르지 않았다. 모든 환자는 YUHL3 가계의 구성원이다. M1, c.158_159AAdel(p.Gln53Argfs*100).
도 18은 p.Q53Rfs*46 뮤린 OSBPL2 단백질이 세포질 내 응집체나 다량체를 형성하지 않음을 보여주는 그림이다. 도 18a는 각각 Osbpl2 및 OSBPL2 cDNA의 158 및 159번 위치의 두 개 염기 삭제에 따른 인간(p.Q53Rfs*100) 및 마우스(p.Q53Rfs*46) OSBPL2 돌연변이 단백질의 서열 정렬 결과이다. 도 18b는 마우스 OSBPL2(mOSBPL2) 야생형(WT)과 p.Q53Rfs*46 돌연변이에 대한 면역형광분석 결과이다. 세포를 항-Myc 및 항-BiP 항체로 면역염색하였으며, WT와 p.Q53Rfs*46 OSBPL2는 세포질 내에 균일하게 존재하였다. 스케일바, 20μm. 도 18c는 WT 및 p.Q53Rfs*46 mOSPBL2의 면역블롯팅 결과를 나타낸다. 인간 p.Q53Rfs*100 OSPBL2를 과발현하는 세포에서 관찰된 다량체 밴드는 p.Q53Rfs*46 mOSPBL2를 과발현하는 세포에서 관찰되지 않았다.
도 19는 유모세포와 나선신경절 퇴행을 가진 2주령 hQ53R-TG 마우스에 대한 분석 결과이다. 도 19a는 hQ53R-TG 마우스의 PCR 지노타이핑 결과를 보여준다. 정방향 프라이머는 CAG 프로모터 영역에, 역방향 프라이머는 OSBPL2 cDNA의 코딩 영역에 대한 것이며, 앰플리콘 크기는 643 bp이다. 도 19b는 출생 후(P) 14일째에 대조군 및 hQ53R-TG 마우스에 대한 면역조직화학과 조직학 분석 결과이다. hQ53-TG 마우스와 대조군 간 유모세포, 나선신경절 또는 신경섬유에서 유의한 차이는 발견되지 않았다. 도 19c는 P28의 대조군 및 hQ53R-TG 마우스에 대한 면역조직화학과 조직학 분석 결과이다. hQ53R-TG 마우스에서는 달팽이관의 모든 영역에서 대조군 마우스에 비해 유모세포와 나선신경절 뉴런의 소실이 유의하게 나타났다.
도 20은 야생형 OSBPL2를 발현하는 형질전환 마우스는 청각 장애가 나타나지 않음을 보여주는 그림이다. 도 20a는 인간 야생형 OSBPL2를 발현하는 형질전환 마우스(hWT-TG) 제작을 위한 트랜스유전자 카세트의 모식도이다. CAG 프로모터, 3XFLAG-tagged WT OSBPL2 및 SV40 poly(A) 테일 서열로 구성되었으며 화살표는 지노타이핑을 위한 PCR 프라이머를 나타낸다. 도 20b는 hWT-TG 마우스의 PCR 지노타이핑 결과이다. 정방향 프라이머는 CAG 프로모터 영역에 대한 것이며, 역방향 프라이머는 OSBPL2 cDNA의 코딩 영역에 대한 것이다. 앰플리콘 크기는 643bp이다. 도 20c는 hWT-TG 마우스의 내이(inner ear), 뇌, 간 및 신장에서 항-FLAG 항체를 이용하여 WT OSBPL2에 대한 면역블롯팅을 수행한 결과이다. 도 20d-e는 대조군(검은색) 및 h-TG(파란색) 마우스의 P60에서의 ABR 및 DPOAE 역치를 나타낸 그림이다. 대조군 마우스에 비해, hQ53R-TG 마우스는 모든 주파수에서 중증의 청각 장애를 나타냈다. 데이터는 평균±표준편차로 표시하였다. 도 20f는 출생 후 90일까지 대조군과 hWT-TG 마우스의 클릭 ABR 역치를 나타낸다.
도 21은 야생형 및 p.Q53Rfs*100 OSBPL2-상호작용 단백질에 대해 LC/MS-MS 분석을 수행한 결과이다. 도 21a는 LC/MS-MS를 이용하여 야생형(WT)과 p.Q53Rfs*100 OSBPL2의 동정 과정을 보여주는 모식도이다. HEK 293 세포에 3XFLAG-tagged 박테리아 알칼린 포스파타아제(BAP), OSBPL2-WT 또는 OSBPL2-p.Q53Rfs*100를 형질도입하였다. 세포 용해물을 아가로스 비드가 접합된 FLAG M2 항체로 면역침강하고 3 x FLAG 펩타이드로 경쟁시킴으로써 용출하였다. 도 21b는 용출물로부터 WT 및 p.Q53Rfs*100 OSBPL2를 검출한 결과이다. 각 정제 단계는 면역블롯팅으로 확인하였다. 도 21c는 용출물에 대한 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 22는 OSBPL2와 p62/SQSTM1 간의 단백질-단백질 상호작용을 나타낸 그림이다. 도 22a는 전장(FL) p62를 야생형 (WT) OSBPL2와 함께 공-면역침강한 결과이다. 프로테오믹스 분석에서 상호작용이 확인되었음에도, p.Q53Rfs*100 OSBPL2와 p62 간의 상호작용은 거의 관찰되지 않았다. 프로테오좀 억제제인 MG132는 OSBPL2와 p62 간의 상호작용에 영향을 미치지 않았다. 도 22b는 p62의 도메인 구조를 나타낸다. PB1 또는 UBA 도메인을 삭제해도 OSBPL2와 p62 간의 상호작용은 억제되지 않았다. MG132를 사용하여 p62-ΔPB1의 발현을 증가시켰다. a 및 b에서, 형질전환 후 세포 용해물을 FLAG M2 항체-접합 아가로스 비드를 이용하여 공-면역침강하였다. FL, 전장; PB1, Phox 및 Bem1p 도메인; ZZ, 디스트로핀(Dystrophin)에 존재하는 zinc 결합 도메인, CREB-결합 단백질; LIR, LC3-상호작용 영역 모티프; UBA, 유비퀴틴 연관 도메인.
도 23은 OSBPL2-상호작용 단백질에 대한 유전자 온톨로지(GO)의 증폭분석 결과이다. 도 23a는 야생형(WT) OSBPL2의 면역침강에서 동정된 152개 단백질의 GO term을 나타낸 그림이다. 도 23b는 p.Q53Rfs*100 OSBPL2의 면역침강에서 동정된 407개 단백질의 GO term을 나타낸 그림이다. 생물학적 과정을 나타내는 GO 카테고리는 증폭을 위해 독립적으로 분석하였다. 유의하게 증폭된 GO term은 -log (p값)에 대해 나타내었다.
도 24는 OSBPL2가 미접힘 단백질 반응에 미치는 영향을 보여주는 그림이다. p.Q53Rfs*100 OSBPL2의 과발현은 미접힘 단백질 반응을 유도하지 않았다. IRE1α, BiP 및 XBP1의 발현 수준은 WT 또는 p.Q53Rfs*100 OSBPL2 어느 것에 의해서도 변하지 않았다. XBP1s, 스플라이싱된 XBP1; XBP1u, 스플라이싱되지 않은 XBP1. 밀도분석 결과는 최소 3번의 독립적인 실험의 대표값이며 밴드 강도는 β-액틴에 대해 정규화하였다. n.s. 유의성 없음; 스튜던트 t-검정.
도 25는 초기의 라파마이신 처리가 성장 지연을 유발함으로 보여주는 그림이다. 도 25a는 출생 후 10일째(P10)의 마우스 사진으로, 라파마이신은 P1에서 P10까지 매일 2mg/kg로 복강투여하였다(도 7a의 Strategy #1). 도 25b는 라파마이신을 처리하거나 처리하지 않은 경우의 hQ53R-TG 마우스의 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 26은 hQ53R-TG 마우스에 대한 라파마이신의 효과를 보여주는 그림이다. 도 26a는 출생후(P) 60일에서의 hQ53R-TG 마우스(검은색) 및 라파마이신 처리 hQ53R-TG 마우스(붉은색, n=6)의 ABR(Auditory brainstem response) 및 DPOAE(distortion product otoacoustic emission) 역치를 나타낸다. P30부터 한달간 라파마이신을 매일 투여한 경우(도 4a의 Strategy #3), hQ53R-TG 마우스의 청력은 P60에도 개선되지 않았다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 도 26b는 Strategy #2를 적용할 경우, 라파마이신 처리가 유모세포와 청각 신경섬유 퇴행을 회복시킴을 보여주는 그림이다. 전체-마운트된 달팽이관을 팔로이딘(녹색)과 항-NF-H 항체(붉은색)로 공-염색하였다. 라파마이신을 처리한 hQ53R-TG 마우스에서, 유모세포와 청각 신경섬유는 미처리 hQ53R-TG 마우스에 비해 더 잘 보존되었다. 스케일바, 50μm. Rapa, 라파마이신.
도 27은 HEK 293 세포에서 Torin1 처리에 따른 OSBPL2 야생형 (WT) 및 돌연변이 단백질에 대한 면역형광 측정 결과를 각각 보여주는 그림이다. 스케일바 50 μm.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
환자 및 감각신경 청각 장애의 진단
본 연구는 세브란스 병원 연세의료원의 임상시험윤리위원회의 승인 하에 수행되었다(IRB #4-2015-0659). 청각장애 환자 모두에게서 시험 참가 및 임상데이터 발행에 대한 서면 동의서를 받았으며, 이들을 YUHL 코호트로 등록하였다. 모든 환자 및 청각장애를 가지거나 가지지 않는 이들의 모든 가족 구성원에 대해 순음 오디오그램과 발성 오디오그램을 수행하였다. 이중벽 부스 내에서 청력측정기를 이용하여 순음 공기(250-8,000 Hz) 및 골전도(250-4,000 Hz) 역치를 측정하였다.
청각 상실의 정도는 500, 1000, 2000 및 4000 Hz에서의 공기 전도의 역치 평균치를 통해 결정하였다. 유아들을 대상으로 정상 상태의 청각 반응을 결정하였다. 측두골 전산화 단층촬영과 자기공명 이미지로 내이 기형을 평가하였다. 본 발명자들은 YUHL3 가계에서 유래한 OSBPL2 돌연변이를 가진 환자에 Rapamune(Pfizer)을 투여하는 개념증명 임상시험을 수행하였다. 이 임상시험은 세브란스 병원의 임상연구윤리위원회(IRB)(#2020-0250) 및 식약청(#33042)의 승인 하에 수행되었다. 저주파수에서 잔여 청각기능을 가지는 3명의 성인 환자는 라파마이신 2 mg을 3개월간 매일 투여받았다.
1차 평가지수(endpoint)를 Rapamune 투여 3개월 및 6개월 후에 평가하여 치료 안전성과, 저주파수 순음 오디오그램에서의 청각역치 개선 및 이명 증상의 감소의 관점에서 효율성을 결정하였다.
WES
RBC Lysis Solution, Cell Lysis Solution 및 Protein Precipitation Solution(iNtRon Biotechnology, Inc)을 이용하여 환자 및 이들의 부모의 말초혈로부터 지놈 DNA를 추출하였다. WES 및 변이 필터링은 Agilent SureSelect V5 증폭 캡쳐 킷(Agilent Technologies)과 Illumina HiSeq 2500 플랫폼(101 염기, 페어드-엔드)을 이용하여 종래 보고된 방법으로 수행하였다(23). 서열 리드를 CLC Genomic Workbench(version 9.5.3) 소프트웨어 (Qiagen)를 사용하여 인간 기준지놈 어셈블리에 대해 매핑하였다(NCBI build 3/hg19). 2개의 최소 커버를 가지는 모든 변이를 사용하였으며, 변이는 CLC Workbench의 Basic Variant Caller를 이용하여 명명하였다.
역전사 실시간 PCR
각 환자 및 건강한 대상자로부터 TRIzol 시약을 이용하여 전혈(Whole-blood) RNA를 분리하고, 역전사를 위해 iScriptTM Select cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad, CA, USA)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 정확히 1μg의 총 RNA를 20μl의 최종부피에 첨가하였다. StepOnePlusTM 실시간 PCR 시스템 및 TaqMan Master Mix (Thermo Fisher Scientific, CA, USA)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 96-웰 플레이트에서 실시간 PCR을 수행하였다. 사용된 프로브는 GAPDH(Hs02758991_g1,) 및 OSBPL2(Hs01023271_m1, Thermo Fisher Scientific)이다. 각 PCR 반응은 3회 반복하였다. 상대적인 유전자 발현 수준은 GAPDH를 대조군으로 하여 역치 사이클(Ct) 방법으로 계산하였다: ΔCt = Ct(GAPDH)-Ct(OSBPL2). OSBPL2의 배수 변화(fold change)는 GAPDH에 대해 정규화하였으며, 2*?*ΔΔCt로 계산하였다.
플라스미드 구축 및 위치-특이적 돌연변이생성
인간 OSBPL2의 cDNA는 OriGene Technologies(MD, USA)에서 구입하여 pENTR-D-TOPO 벡터(Invitrogen, CA, USA)에 서브클로닝하였다. 발현 벡터는 N-말단에 Myc- 또는 FLAG-태그를 가지도록 LR 클로나아제(Invitrogen)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 제작하였다. OSBPL2 돌연변이 클론은 Quick Change Ⅱ XL 위치-특이적 돌연변이생성 킷(Agilent Technologies)을 이용하여 PCR-기반 위치-특이적 돌연변이생성을 통해 제작하였다. 또한, OSBPL2 cDNA를 p3XFLAG-CMV™-10(E7658, Sigma) 및 pCAGGS(RDB08938, Riken)에 클로닝하였다. p62/SQSTM1 플라스미드는 권용태 박사(서울대학교 의과대학)로부터 공급받았다. 다음의 벡터를 사용하였다: p3XFLAG507 CMV™-7(E7408, Sigma), pEYFP-Golgi(#6909-1), pEYFP-ER(#6906-1, Clontech), pCAG-mGFP-막(#14757), GFP-Rab5(#31733) 및 GFP-Lamp1(#16290, Addgene).
세포배양 및 형질감염
HEK 293 및 HeLa 세포를 10% 우태아혈청(Gibco BRL)과 페니실린(50 IU/ml)/스트렙토마이신(50μg/ml)(Gibco BRL)이 보충된 DMEM(Dulbecco’s modified essential medium, Gibco BRL, MD, USA)에서 표준 프로토콜에 따라 배양하였다(37℃, 5% CO2). HEI-OC1 세포를 10% FBS를 포함하고 항생제를 포함하지 않는 고-글루코스 DMEM(Gibco BRL)에서 허용된 조건(33℃, 10% CO2) 하에서 배양하였다. Lipofectamine PLUS(Invitrogen) 또는 Transporter™ 5 Transfection (Polysciences) 시약을 이용하여 제조자의 지시에 따라 세포에 플라스미드를 형질도입하였다
면역블롯팅, 면역침강 및 면역형광
면역블롯팅과 면역형광은 종래에 보고된 방법에 따라 수행하였다(31, 32). 항-OSBPL2(14751-1-AP, Proteintech 및 NBP1-92236, Novus), 항-Tuj1 (801201, BioLegend), 항-Myo7a(25-6790, Proteus), 항-신경필라멘트-H (AB5539, Sigma), 항-β-액틴(sc-1615, Santa Cruz Biotechnology), 항-BiP (ab21685), 항-XBP1(ab37151, Abcam), 항-Myc(2276S 및 5605S), 항- DYKDDDDK (FLAG)(8146S 및 2368S), 항-LC3A/B(4108S), 항-p62(5114S), 항-유비퀴틴(3933S), 항-IREα(14C10), 항-mTOR(7C10), 항-phospho-mTOR (Ser2448)(D9C2), 항-phospho-p70 S6 키나아제(Thr389)(108D2), 항-phospho-4E-BP1(Thr37/46)(236B4, Cell Signalling Technology) 항체, LysoTracker™ Red DND-99(Invitrogen) 및 Alexa-접합 팔로이딘 (Invitrogen)은 각 구입처에서 구입하였다.
면역블롯팅은 1:1,000로 희석된 1차 항체를 이용하여 수행하였으며, 이어서 1:2,000로 희석된 상응하는 항-이소타입 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology)와 반응시켰다. 신호는 SuperSignal West-Pico 킷(Thermo Scientific)을 이용하여 시각화하였다. 밴드 강도는 ImageJ를 이용하여 정량화하였다. EZview Red 항-FLAG M2 및 항-c-Myc 친화도 겔(Sigma)을 사용하여 공-면역침강을 수행하였다. PBS 내 10% 동키 혈청과 1% 소혈청 알부민을 포함하는 블로킹 완충액을 이용하여 배양된 세포 내의 면역형광을 검출하였다.
마우스에서 절개한 내이를 4℃에서 1시간 동안 PBS 내 4% 파라포름알데히드(PFA)에서 고정하였다. 고정된 달팽이관을 0.3% Triton X-100와 사포닌으로 30분 간 투과화한 뒤 상온에서 1시간 동안 PBS 내 5% 고트 혈청으로 블로킹하였다. 1차 항체와 형광단-태깅된 2차 항체를 1:50~1:1,000 및 1:2,000로 각각 희석하였다. Carl Zeiss LSM700 또는 LSM780 현미경으로 공초점 이미지를 수득하고 ZEN 소프트웨어로 이미지를 프로세싱하였다. Manders' 공배치 계수(MCC)를 이용하여 공배치(co-localisation)를 측정하였다. 70-형광역치 이상의 중첩 신호를 정의하기 위해, 녹색 및 적색 채널을 모두 사용하였다. 이후, 중첩 신호로부터 평균 MCC를 계산하였다.
동물 실험
동물 실험 프로토콜은 연세대학교 의과대학 동물실험윤리위원회의 승인 하에 수행되었다(#2019-553 0250). 마우스를 무-병원채 조건에서 7:00 AM에서 7:00 PM까지의 광주기로 식수와 조사(irradiated) 설치류 먹이(Cat#0006972, LabDiet, MO, USA) 또는 HFD(D12451, Research Diet, NJ, USA)를 자유롭게 식음할 수 있도록 하면서 배양하였다. 라파마이신 (Sigma)을 DMSO(100 mg/ml)에 용해시키고 -20℃에서 보관하였다. 사용 전 라파마이신을 5% PEG-400 및 5% Tween-80을 포함하는 저장 용액(1.2 mg/ml)에서 희석하였다. 각 그룹의 마우스에 매일 2.0 mg/kg을 복강 투여하였으며, 대조군 마우스에는 동일한 용량의 비이클 용액을 주사하였다.
Osbpl2 녹아웃 마우스의 제작
핵 배치 신호가 태깅된 Cas9와 Osbpl2의 3번 엑손을 타겟팅하는gRNA는 Macrogen, Inc(Seoul, Korea)에서 구입하였다. gRNA 활성(gRNA1: AATTAGTGGGATGATTGACTTGG, gRNA2: ACCAGCAAAAGTACTAGGAGTGG)은 Osbpl2를 넉-아웃하는 인 비트로 절단 반응을 통해 확인하였다. 요약하면, 증폭된 Osbpl2를 1 x NEB 3.1 완충액에서 Cas9(20 nM) 및sgRNA(40 nM)와 함께 37℃에서 90분간 배양하였다. 30% 글리세롤, 1.2% SDS 및 100 mM EDTA를 함유하는 6 x 중단 용액으로 반응을 중단시켰다. 절단 활성은 전기영동을 통해 확인하였다.
Osbpl2 녹아웃 마우스는 Macrogen에서 제작하였다. 요약하면, 암말의 혈청 고나트로핀(7.5 IU)과 인간 융모막 고나트로핀(5 IU)을 C57BL/6N 암컷 마우스에 투여하였다. 48시간 뒤, 이들 암컷 마우스를 C57BL/6N 수컷 마우스와 교배하고, 다음날 암컷 마우스를 희생시키고 수정된 배아를 수집하였다. sgRNA 및 Cas9 혼합물을 단일세포 배아에 미세주입하였다. 미세주입된 배아를 37℃에서 1-2시간 동안 배양하였다. 단일세포에 주입된 약 14-16개의 배아들을 위임신(pseudo-pregnant) 마우스의 난관에 이식하였다(ICR). F0 세대가 출생한 뒤, PCR을 통해 절단된 꼬리에 대한 지노타이핑(정방향: GGGTTTGCACACTTGTTTCC, 역방향: TCATGGACTAGCATGGGTCA)과 T7E1 어세이를 수행하였다. T7E1 양성 시료에 대해 TA 클로닝을 하고 생어 시퀀싱으로 분석하였다. F1 세대의 지노타이핑에 다음의 프라이머가 사용되었다: 정방향, TCTATAGGGGAATTTTCAGAGGC; 역방향, GCGTACCTGTGCTTTTGAATTC.
형질전환 마우스의 제작
형질전환 마우스는 Macrogen, Inc에서 제작하였으며, 3 x FLAG-tagged 야생형 또는 p.Q53Rfs*100 OSBPL2를 인코딩하는 cDNA를 AvrⅡand PvuI 제한효소 부위 사이에 닭 β-액틴 프로모터를 포함하는 pCAGGS 벡터에 서브클로닝하였다. 겔 추출을 통해 백본 절편(~1.6 kb)을 삭제하고, ~4.7kb 절편을 단일세포 배아에 미세주입하였다. 4ng/μl의 DNA를 미세조절기를 이용하여 수정란의 수컷 전핵에 직접적으로 주사하였다. F0 세대가 출생한 뒤, 꼬리를 자른 시료에 대해 PCR을 통한 도입 유전자의 지노타이핑을 수행하였다(정"??*: CTGTGCGGAGCCGAAATCTG, 역방향: ATGGTCCACACGCTGAAGTCGC). 타겟 절편의 크기는 643 bp이다.
ABR
방음 챔버에서 Tucker-Davis Technologies (TDT) RZ6 디지털 신호 프로세싱 하드웨어와 BioSigRZ 소프트웨어(Alachua, FL, USA)를 이용하여 ABR 역치를 측정하였다. 피하 바늘(전극)을 마취된 마우스의 좌우 귀의 정점과 복외측에 위치시켰다. 조정된 클릭 자극(10μs) 또는 톤 버스트(tone burst) 자극(5 ms)을 SigGenRZ 소프트웨어 및 RZ6 디지털 신호 프로세서를 이용하여 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 30 및 42 kHz에서 생성하고, 멀티필드 1(MF1) 자성 스피커(TDT)로 바깥귀길(ear canal)로 전달하였다 .
자극의 강도는 10에서 95 dB SPL까지 5 dB씩 증가시켰다. ABR 신호를 저-임피던스 Medusa Biological Amplifier 시스템 (RA4LI, TDT)에 입력하여 RZ6 디지털 신호 프로세싱 하드웨어에 전달하였다. 기록된 신호를 0.5-1 kHz band-pass 필터로 필터링하였으며, 512개 톤 버스트에 대한 ABR 파형의 평균을 구하였다. 각 주파수의 ABR 역치는 BioSigRZ 소프트웨어를 이용하여 측정하였다. 피크의 폭(mV)은 자극 수준을 증가시키면서(20-90 dB SPL) 클릭-유발된 ABR의 파형 신호를 이용하여 입력/출력(I/O) 함수로 계산하였다.
DPOAE
DPOAE는 TDT 마이크로폰-스피커 시스템의 조합을 이용하여 측정하였다. 1차 자극 음성은 RZ6 디지털 신호 프로세서와 SigGenRZ 소프트웨어를 이용하여 생성하였으며 ER 10B+ 마이크로폰(Etymotic, IL, USA) 및 이도(ear canal)에 위치시킨 MF1 스피커로 전달하였다. 1차 음(primary tone)을 1.2의 주파수 비율(f2/f1), 타겟 주파수 6, 12, 16, 18, 22, 24 및 30 kHz로 세팅하였다. f2 강도는 f1 강도와 동일하였다(L1 = L2). 1차 음에서 발생한 소리는 ER 10B+ 마이크로폰으로 수신되어 RZ6 디지털 신호 프로세서로 기록하였다. DPOAE 입력/출력(I/O) 함수는 f2/f1는 1.2, L1 = L2인 특정 주파수(6 및 30 kHz)에서 결정하였다. 1차 음의 강도는 20에서 80 dB SPL로 5 dB SPL씩 증가하였다. DP-gram을 이용하여 각 1차 음에 대한 고속 푸리에 변환(Fast Fourier Transform)을 수행하여 두 개의 2f1-f2 생성물과 노이즈 플로어의 평균 스펙트럼을 결정하였다.
SEM
내이를 절개한 뒤 2% 파라포름알데히드와 0.1 M 카코딜산나트륨 완충액(pH 7.4) 내 2.5% 글루타르알데히드로 상온에서 2시간 동안 고정시켰다. 고정 후, 달팽이관 내피와 덮개막을 분리하고 2mM 칼슘 클로라이드 및 3.5% 수크로스를 포함하는 0.1M 카코딜산나트륨 완충액(pH 7.4) 내의 2.5% 글루타르알데히드로 4℃에서 밤새 고정하였다. 고정된 시료를 0.1M 카코딜산나트륨 완충액과 2 mM 칼슘 클로라이드로 20분간 4℃에서 3회 세척하고 클로라이드 사산화 오스뮴(OsO4)/티오카보하이드라지드(OTO)로 고정시켰다. 시료를 에탄올로 탈수시키고 임계점 건조기(Leica 30 EM CPD300, Wetzlar, Germany)로 건조시킨 뒤, 스텁에 고정하고 스퍼터 코팅기(ACE600; Leica Micro시스템s)를 이용하여 백금(20-30nm)으로 코팅하였다. 백금-코팅된 표본을 스텁 홀더에 마운팅하고 Schottky 주사전자 현미경(JSM-IT500, JEOL, Tokyo, Japan)으로 이미지를 수득하였다.
TEM
달팽이관을 0.1 M 포스페이트 완충액(pH 7.4) 내 2% 파라포름알데히드와 2% 글루타르알데히드에서 12시간 동안 고정하고, 0.1 M 포스페이트 완충액으로 세척 후, 0.1M 포스페이트 완충액 내 1% OsO4로 2시간 동안 고정한 뒤 에탄올로 탈수시킨 후 프로필렌 옥사이드로 2시간 동안 침윤시켰다. 표본을 Poly/Bed 812 킷(Polysciences)으로 포매하고 전자현미경 오븐(TD-700, DOSAKA, Japan)에서 65℃로 12시간 동안 중합화하였다. 조직 블록을 다이아몬드 칼이 장비된 초박편절단기를 이용하여 200nm로 자르고 광학현미경 관찰을 위해 톨루이딘 블루로 염색하였다. 관찰하고자 하는 영역을 초박편절단기를 이용하여 80nm 절편으로 자르고, 구리 격자에 올려놓은 뒤, 3% 우라닐 아세트산으로 30분간, 3% 리드 구연산으로 7분간 이중 염색하고, Megaview Ⅲ CCD 카메라(Soft imaging 시스템-Germany)가 장비된 투과전자 현미경(JEM-1011, JEOL, Tokyo, Japan)을 이용하여 80 kV의 가속전압에서 이미지를 수득하였다.
WT 및 돌연변이 OSBPL2 간의 상호작용
p3XFLAG-OSBPL2 WT, p.Q53Rfs*100 또는 박테리아 알칼린 포스파타아제를 발현하는 HEK 293 세포로부터 단백질(75 mg)을 추출하고 80μL의 FLAG M2 아가로스 비드(Sigma)와 함께 48시간 동안 4℃에서 회전 진탕기로 배양하였다. 아가로스 비드를 용해 완충액으로 4회 세척하여 비-특이적 결합을 억제하였다. 이어서 150 ng/μL3 x FLAG 펩타이드를 포함하는 200μL의 용출 완충액을 첨가하고 시료를 밤새 배양하였다. 용출액은 면역블롯팅, 코마시블루 염색 및 은염색을 이용하여 분석하고 Nano LC-MS/MS를 하였다. 펩타이드를 C18 프리컬럼(75μm x 2cm, nanoViper, Acclaim PepMap100, Thermo Fisher Scientific) 및 분석 C18 컬럼(75 μm x 50 cm, PepMap RSLC, Thermo Fisher Scientific)에서 분리하였다. 펩타이드는 Easy nLC 1000(Thermo Fisher Scientific) 및 나노-전기방사 선원을 가지는 Orbitrap Fusion Lumos 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)로 구성된 LC-MS/MS 시스템을 이용하여 분석하였다. MS/MS 스펙트럼을 Uniprot 인간 데이터베이스에 대해 아래의 소프트웨어 분석 프로토콜을 이용하여 분석하였다. 모든 단백질의 역위 서열은 FDR 계산을 위해 데이터베이스에 첨부되었다.
ProLuci를 이용하여 5 ppm의 전구체 질량 오류 및 200 ppm의 절편 이온 질량 오류를 가지는 펩타이드를 동정하였다(33). 출력 데이터 파일을 필터링하고 DTASelect(The Scripps Research Institute, CA, USA)를 이용하여 분류함으로써 단백질 목록을 만들었으며, 단백질 동정을 위해 2 이상의 펩타이드를 할당하고 위양성률은 0.01 미만이었다(34). 질량분석 프로테오믹스 데이터를 PRIDE partner repository(데이터세트 식별번호 PXD021514)를 이용하여 ProteomeXchange Consortium에 제출하였다.
GO 분석
WT 및 p.Q53Rfs*100 OSBPL2의 상호작용 인자는 DAVID(Database for Annotation, Visualisation and Integrated Discovery)를 이용하여 분석하였다. DAVID의 온라인 버전(v6.8)의 기능적 주석 도구를 분자적 기능, 세포 구성 및 생물학적 과정을 반영하는 기본값 파라미터와 GO 카테고리를 이용하여 구동하였다(http://david.abcc.ncifcrf.gov/). p<0.05 인 경우 유의성을 가지는 것으로 간주하였다.
추가적인 mTOR 억제제에 의한 응집 변화의 관찰
배양된 HEK 293 세포에 대해 면역형광분석을 수행하였다. 형질전환된 HEK293 세포를 PBS에서 4% 파라포름알데히드에 10분간 고정시키고 고정된 세포를 0.1% Triton X-100으로 10분간 투과화한 뒤 10% 동키 혈청과 1% 소혈청알부민으로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 1차 항체 및 형광단-태깅된 2차 항체를 각각 1:50~1:1,000 및 1:2,000로 희석하였다. Carl Zeiss LSM700 또는 LSM780 현미경을 이용하여 공초점 이미지를 수득하였다.
통계적 분석
모든 정량 데이터는 최소 3번의 독립적 실험으로부터 수득하였다. 두 그룹 간의 차이에 대한 통계적 유의성은 t-검정 또는 다중 비교를 위한 본페로니 교정과 함께 변수의 이원분석을 하여 검사하였다. GraphPad Prism 7.0 소프트웨어를 이용하였으며, p값이 0.05 미만일 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
실험결과
전장-엑솜 시퀀싱(WES)을 통해 OSBPL2 돌연변이를 동정하였다.
678개 가계(family)를 연세대학교 청각장애(YUHL) 코호트에 등록시켰다. 청각 상실의 유전적 원인을 탐색하기 위해, 가장 흔히 돌연변이가 발생하는 2개 유전자인 GJB2 및 SLC26A4에 대한 사전 스크리닝 후(23), 청각 장애를 가지는 202개 패밀리에 대한 WES를 수행하였다. 202개 가계 중 2개의 가계에서 잠재적 병인인 OSBPL2 돌연변이를 검출하여 청각 상실 원인의 1.0%(2/202)가 OSBPL2에 의해 유발됨을 알 수 있었다. 이들 두 가계에서 YUHL3 Ⅲ-13, IV-Ⅱ 및 YUHL457 Ⅲ-4 환자에 대해 WES를 수행하였다(도 1a 및 1b). 가계도에 기반하여 이들 가계에서 상염색체 우성 유전이 예상되었다(도 1a 및 1b). 우선 WES 데이터를 통해 청각 상실과 관련된 것으로 알려진 121개 유전자에서 비유사(nonsynonymous) 변이 또는 스플라이스 변이체를 조사하여 OSBPL2에서 다음의 이형접합 프레임쉬프트 변이를 발견하였다; YUHL3에서 c.158_159AAdel(p.Gln53Argfs*100, p.Q53Rfs*100) 및 YUHL457에서 c.180_181ACdel(p.His60Glnfs*93, p.H60Qfs*93)(표 1, 도 1 및 도 9). c.180_181ACdel 변이는 dbSNP, EPS 또는 gnomAD를 포함한 어떠한 공공 데이터에서도 보고되지 않은 것임을 확인하였다(표 1). 또한, 이 변이는 국립중앙인체자원은행 및 질병통제예방센터에서 수득한 627명의 한국인 환자의 전장-지놈 시퀀싱 데이터세트에서도 검출되지 않았다(표 1). 본 발명자들은 생어 시퀀싱을 수행하여 이들 OSBPL2 변이가 두 개 가계의 발병으로 분리되었는지를 조사한 결과, 이들 변이가 YUHL457 IV-6 및 V-1를 제외하고 청각상실 표현형을 가지는 구성원들에서 함께 존재함을 발견하였다(표 1, 도 1, 도 9a 및 9b). OSBPL2 유전자에서 동정된 c.180_181ACdel(p.H60Qfs*93) 변이는 ClinVar(accession # SCV001424910)에 제출되었다.
OSBPL2 돌연변이를 가지는 환자는 대칭형, 진행성 및 하강형(down-sloping) 감각신경 청각 상실을 보였으며, 증상은 10대 후반에서 20대에 시작되었다(도 1c, 1d 및 도 10). 청각 장애가 시작되는 시점은 다양하지만, 청각 소실은 초기 20년까지는 시작되지 않았다. 청각 상실은 환자가 결국 달팽이관 이식을 필요로 할 정도의 중증에 다달았다. YUHL3 가계의 구성원인 Ⅱ-5, Ⅲ-4, Ⅲ-13 및 IV-11과 YUHL457 가계의 구성원인 Ⅲ-4 및 Ⅲ-6는 달팽이관 이식을 받았다.
결과는 뛰어나서 open-set 청취가 가능했고 문장 이해 점수는 80에서 100% 사이였다. 청각 신경병증에서는 달팽이관 이식 결과가 유의한 개선을 보이지 않으므로, 이러한 결과를 통해 OSBPL2 돌연변이에 기인한 청각 상실의 병인은 청각 신경병증이 아님을 알 수 있었다.
Figure pat00001
acDNA 돌연변이는 인간cDNA 기준서열 NM_144498.2에 따라 번호를 붙임
bdbSNP 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP).
cNHLBI Exome Sequencing Project (http://evs.gs.washington.edu/EVS/).
dgnomAD 브라우저(http://exac.broadinstitute.org/).
eThe Korean Reference Genome Database.
fPolyPhen-2 HumVar 예측 점수(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/).
동정된 변이들이 OSBPL2 발현에 미치는 효과
본 발명자들은 2개의 프레임쉬프트 돌연변이를 발견하였으며, 그 중 하나는 종래 알려진 것이었다. 따라서, 4개의 프레임쉬프트 돌연변이가 NSHL과 관련되어 있으며 이들 모두는 OSBPL2의 3번 엑손에 2개 염기쌍의 삭제가 나타나 말단이 잘리고 아미노산이 추가되어 길이가 거의 비슷한 단백질이 만들어진다(도 1e 및 1f). OSBPL2에서의 프레임쉬프트 돌연변이가 OSBPL2 mRNA 발현 감소로 이어지는지를 조사한 결과 OSBPL2 돌연변이를 가지는 환자와 그렇지 않은 환자 간 mRNA 발현량은 차이가 없음을 확인하였다(도 11a).
다음으로, 이형(heterologous) 시스템에서 야생형(WT) 및 돌연변이 OSBPL2의 안정성을 비교하였다. OSBPL2를 과발현하는 HEK 293 세포에 사이클로헥사마이드(100μg/ml)를 12시간 동안 처리하여 단백질 합성을 차단하였다. 웨스턴 블롯 분석 결과 돌연변이 OSBPL2를 발현하는 세포에서는 다량체 크기의 밴드가 나타났으며, 이는 WT OSBPL2 발현 세포에서는 거의 관찰되지 않았다. 또한 돌연변이 OSBPL2, 특히 다량체는 WT 단백질보다 더 안정하였다(도 11b - 11e).
동정된 돌연변이가 OSBPL2 발현에 미치는 영향을 추가적으로 조사하기 위하여, 면역형광분석을 통해 HEK 293, HEI-OC1 및 HeLa 세포 내 WT 및 돌연변이 OSBPL2를 시각화하였다. WT OSBPL2를 모든 세포주의 세포질에서 확산시켰다(도 2a 및 도 12a). 말단이 잘린 OSBPL2 돌연변이 단백질인 p.R50Afs*103, p.Q53Rfs*100 및 p.H60Qfs*93는 과발현시 모든 세포주에서 응집체를 형성하였으나, 미스센스 변이체인 p.L195M는 세포질에서의 응집을 형성하지 않고 WT 단백질과 유사한 배치 패턴을 보였다(도 2a 및 도 12a). 웨스턴 블롯 분석 결과 역시 말단이 잘린 OSBPL2를 과발현하는 세포에서 다량체 밴드를 나타냈으나, WT 또는 p.L195M OSBPL2 과발현 세포에서는 그렇지 않아(도 2b 및 도 12b), p.L195M 미스센스 변이가 다른 말단이 잘린 돌연변이와는 상이한 병인을 가짐을 알 수 있었다. 다량체에 해당하는 밴드는 라이소좀 억제제인 바필로마이신 A1 처리 후 증가하였다(도 2b). OSBPL2는 사량체(tetramer)를 형성하는 것으로 알려졌으므로(12), 말단이 잘린 돌연변이 단백질이 옥시스테롤 결합 도메인이 결핍되었음에도 여전히 WT OSBPL2 단백질과 상호작용하는지를 조사하였다(도 1e). 공-면역침강 결과 p.Q53Rfs*100가 WT 단백질과 함께 이량체를 형성할 수 있음을 확인함으로써(도 13a 및 13b), 돌연변이 단백질이 우성-음성일 수 있음을 알 수 있었다.
나아가, WT OSBPL2가 ER 마커와 공배치되는 반면, p.Q53Rfs*100 OSBPL2는 엔도좀 및 라이소좀 마커와 공배치됨을 관찰하였다(도 2c).
Osbpl2 녹아웃 마우스는 청각 상실이 나타나지 않았다.
내유모세포, 외유모세포, 지지세포, 신경절 신결세포 및 선조혈관 상피를 포함하는 뮤린 내이에서 OSBPL2가 광범위하게 발현되었다(도 3a). 이형접합 OSBPL2 돌연변이는 반수부족(haploinsufficiency) 또는 우성-음성 효과에 의해 상염색체 우성 청각 상실에 이를 수 있으므로, 우선 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 Osbpl2 녹아웃(KO, Osbpl2-/-) 마우스를 제작하였다. 가이드 RNA를 Osbpl2의 3번 엑손을 타겟팅하도록 설계하여(도 3b) OSBPL2의 3번 엑손에 인간에서 동정된 프레임쉬프트 돌연변이가 발생하도록 하였으며(표 1), 생성된 대립형질을 T7E1 어세이로 스크리닝하였다(도 14a). Osbpl2 타겟팅 여부는 제노타이핑과 웨스턴 블롯으로 확인하였다(도 14b 및 14c). Osbpl2+/- 및 Osbpl2-/- 마우스는 야생형 형제들과 크게 다르지 않았다. Osbpl2+/- 및 Osbpl2-/- 마우스의 청각 민감도는 출생 후(P) 180일까지 30일 간격으로 클릭 자극 또는 순음에 대한 ABR(Auditory Brainstem Response) 역치를 측정함으로써 결정하였다. 모든 주파수에서 클릭 및 순음 자극에 대한 Osbpl2+/- 및 Osbpl2-/- 마우스의 ABR 역치를 Osbpl2+/+ 마우스와 비교하였다(도 3c 및 도 14d). 외부 유모세포의 달팽이관 증폭기능을 반영하는 DPOAE(Distortion product otoacoustic emission) 역치는 유전자형에 따른 유의한 차이를 보이지 않았다(도 3d). 전체-마운트 면역형광 및 주사전자 현미경(SEM) 관찰 결과 Osbpl2+/- 및 Osbpl2-/- 마우스 내 OHC의 고정섬모 다발은 P120에 Osbpl2+/+ 마우스에 필적하였다(도 14e). 조직학 및 면역형광염색 결과 전반적인 달팽이관 형상과 퓨로마이신 뉴런(SGN)은 유전자형에 따른 차이를 보이지 않았다(도 14f). 돼지 모델에서 고지방식이(HFD)는 청각장애를 더 악화시켰으므로, Osbpl2+/- 및 Osbpl2-/- 마우스에서 HFD가 청각 상실을 유도하는지를 조사하였다. 그러나, Osbpl2+/- 및 Osbpl2-/- 마우스는 젖을 땐 후 16주까지 HFD를 먹여도 청각 상실이나 다른 형태적 변화를 나타내지 않았다(도 3e, 3f, 도 15a 및 15b). 나아가, 2개월 간 HFD를 먹인 Osbpl2-/- 마우스에서도 고콜레스테롤혈증이 나타나지 않았으며(도 8g), Osbpl2+/- 및 Osbpl2-/- 마우스의 중성지방, 고밀도 지단백질, 음식섭취, 활동성, 체중, 지질 조성 및 에너지 소모는 Osbpl2+/+ 마우스와 전반적으로 유사하였다(도 8g 및 도 16a - 16e). 이형접합 OSBPL2 돌연변이를 가지거나 가지지 않는 환자에서의 혈청 지질도 조사하였다. OSBPL2 상에 이형접합 c.158_159AAdel를 가지는 환자는 해당 대립형질을 가지지 않는 대조군 환자와 지질 및 지단백질 수준이 유사하여(도 17a - 17f), 이들 환자에서의 청각 상실은 지질대사 이상으로 인한 것이 아님을 확인하였다. 이러한 발견은 OSBPL2의 기능이 정상적인 청각기능이 필수적이 아님을 보여줄 뿐 아니라, 반수부족(haploinsufficiency) 또는 우성-음성 효과도 Osbpl2+/- 또는 Osbpl2-/- 마우스의 청각 상실의 원인이 아님을 나타낸다.
p.Q53Rfs*100를 발현하는 형질전환 마우스는 청각장애가 재발하였다.
Osbpl2-/- 마우스가 청각 장애와 고콜레스테롤혈증을 보이지 않았기 때문에, 말단이 잘린 OSBPL2가 WT OSBPL2에서는 관찰되지 않는 추가적인 기능을 획득했을 수 있다고 가정하고, 이를 조사하기 위해 인간 환자에서 동정된 프레임쉬프트 돌연변이가 도입된 녹-인(knock-in) 마우스 또는 인간 돌연변이 OSBPL2 형질전환 마우스 모델을 제작하였다. Osbpl2 cDNA의 158번 및 159번 위치의 두 개의 AA 염기를 삭제하여 인간 c.158_159AAdel (p.Q53Rfs*100) 돌연변이를 모방하자, 생성된 단백질(p.Q53Rfs*46)은 46개 아미노산으로 짧아졌다(도 18a). 또한, 마우스의 p.Q53Rfs*46 OSPBL2는 세포질에서 응집이나 다량체를 형성하지 않았다(도 10b 및 10c). 따라서, N-말단에 FLAG-태깅된 p.Q53Rfs*100 OSBPL2 돌연변이를 발현하는 형질전환 마우스 모델을 제작하였다(도 4a, hQ53R-TG). 도입 유전자는 지노타이핑(도 19a)으로 확인한 결과 내이와 뇌에서 고발현되었다(도 4b). hQ53R-TG 마우스는 생장 및 번식이 가능하고, 예측된 멘델 비율에 따라 출생하였으며, 유의한 기형은 보이지 않았다. 또한, P14에 hQ53R-TG 마우스의 코르티기관에서 달팽이관의 형성과 외형의 어떠한 명확한 결점도 관찰되지 않았다(도 19b). 그러나, Osbpl2-/- 마우스와 달리 hQ53R-TG 마우스는 P60에 모든 주파수에서 그들의 대조군 형제에 비해 유의하게 높은 ABR 및 DPOAE 역치를 보였다(도 4c 및 4d). 달팽이관에 대한 면역형광염색을 통해 청각 유모세포와 SGN에서 도입 유전자의 발현을 관찰하였으며, 팔로이딘 염색 결과 hQ53R-TG에서의 유모세포 퇴행을 확인하였다(도 4e). 면역형광 및 조직학 분석 결과 h53R-TG 마우스의 코르티기관에서 유모세포가 심각하게 퇴행하고 SGN이 유의하게 감소하였음을 확인하였다(도 4f 및 도 19c). 또한, 본 발명자들은 N-말단에 FLAG-태깅된 야생형 OSBPL2를 발현하는 형질전환 마우스 모델을 제작하였다(도 20a - 20c, hWT-TG). 그러나, hQ53R-TG 마우스와 달리 hWT-TG 마우스는 P90까지도 청각 장애가 나타나지 않았다(도 20d - 20f). 이러한 결과를 통해 p.Q53Rfs*100 OSBPL2 돌연변이 단백질의 발현으로 인해 달팽이관이 퇴행되고 청각 기능이 소실됨을 알 수 있었다.
말단이 잘린 OSBPL2 돌연변이는 라이소좀 내 항상성이 결여되고 오토파지 활성에 결함이 생긴다.
4개의 병인성 OSBPL2 돌연변이가 말단이 잘린 거의 동일한 단백질을 형성하고 이들이 세포질 내 응집체를 형성하였으므로(도 1e-f 및 도 12), 돌연변이 OSBPL2의 기능을 조사하고 이의 상호작용체(interactome)를 동정하기 위한 단백질 분석을 수행하였다(도 21). HEK 293 세포를 N-말단에 FLAG-태깅된 WT 및 p.Q53Rfs*100 OSBPL2를 일시적 형질도입하였다.
항-FLAG 비드를 이용한 친화도 정제 후, 액상 크로마토그래피와 고해상도 질량분석기(LC MS/MS)를 이용하여 단백질 용출액을 분석하였다. WT 또는 돌연변이 OSBPL2에 대한 상호작용인자로서 152개 및 407개 단백질을 각각 동정하였다. 이들 중 인간 Reference Interactom(http://www.interactome-atlas.org/)에서 WT OSBPL2의 상호작용인자로서 보고된 VAPB 및 SNRPF를 분리하였다(도 5a). 흥미롭게도, 자사포식소체(autophagosome) 카고 단백질인 p62/SQTM1(24)도 역시 WT 및 돌연변이 OSBPL2의 상호작용인자인 것으로 나타났다(도 5a). 공-면역침강을 이용하여 이러한 상호작용을 확인한 결과 p.Q53Rfs*100 OSBPL2과 p62 사이의 상호작용은 WT OSBPL2 및 p62 간의 상호작용에 비하여 매우 약함을 관찰하였다(도 22a). p62는 ZZ 도메인, LIR 모티프 또는 이들 모두를 포함하는 영역을 통해 WT OSBPL2와 상호작용하였다(도 22b). 유전자 온톨로지(GO) 분석 결과 p.Q53Rfs*100와 배타적으로 상호작용하는 단백질은 단백질 안정화, 거대자가포식, 엔도좀 형성, TORC1 신호 조절 및 유비퀴틴화에 관여하는 것으로 나타났다(도 5b 및 도 23).
p.Q53Rfs*100가 엔도좀 및 오토파지 관련 단백질과 상호작용하였으므로, 먼저 전체 LC3 수준 및 LC3Ⅱ/LC3I 비율을 측정함으로써 WT 및 돌연변이 OSBPL2가 오토파지 유입에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 과발현 of p.Q53Rfs*100 OSBPL2의 과발현은 세포질 LC3I에 대한 활성의 막-결합 LC3Ⅱ의 비율을 감소시켰다(도 5c). 또한, p.Q53Rfs*100 OSBPL2의 과발현은 산성지향성(acidotropic) 염료인 LysoTracker 신호를 증가시키고(도 5d) 주입된 덱스트란의 분해를 저해하였다(도 5e).
OSBPL2 단백질의 면역침강 결과 p.Q53Rfs*100 OSBPL2를 과발현하는 세포에서 WT OSBPL2 과발현 세포에 비하여 고분자량의 폴리유비퀴틴화된 단백질 수준이 증가하였음을 확인하였다(도 6a). 흥미롭게도, 라파마이신 처리에 의해 폴리유비퀴틴화된 단백질 수준과 p.Q53Rfs*100의 다량체-크기의 밴드가 모두 감소하였다(도 6a). p.Q53Rfs*100 OSBPL2의 과발현은 mTOR 인산화를 증가시켰으나(도 6b), IRE1α, BiP 및 XBP1와 같은 미접힘 단백질 반응과 관련된 단백질의 발현은 변화시키지 않았다(도 24). p.Q53Rfs* 100 OSBPL2에 의한 mTOR 인산화 증가 역시 라파마이신 처리에 의해 다시 감소되었다(도 14b). p.Q53Rfs*100 OSBPL2는 부분적으로 LC3 및 p62와 공배치되었으며, 이러한 경향은 라파마이신 처리에 의해 강화되었다(도 6c-6f).
라파마이신은 hQ53R-TG 마우스와 DFNA67 환자에서 부분적으로 청각 상실 표현형을 복구한다
라파마이신이 인 비트로에서 p.Q53Rfs*100의 다량체 밴드를 감소시켰으므로, 본 발명자들은 라파마이신이 hQ53R-TG 마우스의 청각 장애를 복구할 수 있는지를 조사하고자 하였다. hQ53R-TG 마우스의 청각 장애는 P21에서부터 감지되었으므로, 라파마이신을 P1부터 시작하여 매일 투여하였으나(도 7a, Strategy #1), 성장 장애로 인해 P10에 주사를 중단하였다(도 25). 라파마이신을 P30부터 한달 간 매일 투여하였으나, P60에서 청력을 측정한 결과 효능을 보이지 않았다(도 7a, Strategy #3 및 도 26a). 따라서, 본 발명자들은 P7에서 P15까지 라파마이신을 매일 투여 후 P30에 청각 민감도를 측정하였다(도 7a, Strategy #2). 흥미롭게도, hQ53R-TG 마우스에서의 라파마이신 처리는 특히 낮은 주파수에서 ABR 및 DPOAE 역치를 모두 유의하게 감소시켰다(도 7b-7d). 조직학 및 명역형광분석 결과 hQ53R-TG 마우스에 라파마이신을 처리하자 미처리 군에 비해 유모세포와 SGN가 보호되었다(도 7a 및 도 26b). 또한, p.Q53Rfs*100 OSBPL2 발현은 라파마이신 처리에 의해 유의하게 감소하였다(도 7e). P60에 달팽이관의 SEM 관찰을 통해 hQ53R-TG 마우스의 고정섬모가 대조군 마우스에 비해 퇴행되었으나, 라파마이신 처리에 의해 부분적으로 회복됨을 확인하였다(도 7f). 투과전자 현미경(TEM) 관찰 결과 1형 SGN의 세포질 내 불용성 단백질 침착물과 유사한 방대한 전자-밀집구조가 나타났으나, hQ53R-TG 마우스에 대한 라파마이신 처리에 의해 이러한 구조는 현저히 감소하였다(도 7g).
이러한 발견에 기반하여, 본 발명자들은 YUHL3 및 YUHL457 가계의 OSBPL2 돌연변이를 가지는 환자에 라파마이신(Rapamune, Pfizer)을 투여하는 개념증명(proof-of-concept) 임상시험을 수행하였다. 중간 내지 중증의 청각장애를 보이는 5명의 성인 환자에 3개월간 하루 1회 2 mg의 라파마이신을 투여하였다(도 8a).
결론적으로, 3,000 Hz에서의 순음 오디오그램에서 보는 바와 같이 청각장애는 회복되었다(도 8b). 초기에 DPOAE에 대한 반응을 보였던 한명의 환자(YUHL457: IV-2)에서 신호 대 노이즈 비율이 쌍방으로 증가하였다(도 8c-8e). 5명 중 3명의 환자에서 이명(Tinnitus)이 발견되었으며, THI (Tinnitus Handicap Inventory) 설문지에 따를 때 경증 내지 중간의 청각 장애를 가진 2명의 환자에서 증상이 개선되었으며, 중증의 청각 장애를 보인 한명의 환자에서는 증상 변화가 없었다(도 8f)(25). 3명의 환자에서 주요 부작용이나 기타 안전성 문제는 치료 후 3개월간 발견되지 않았다.
이를 종합하면, 오토파지 결함이 hQ53Q-TG 마우스에서 청각 장애의 원인이 되었으며, OSBPL2 돌연변이로 인한 청각상실의 치료에 라파마이신이 효과적인 치료조성물이 될 수 있음을 알 수 있다.
응집된 돌연변이 OSBPL2 p.Q53Rfs*100는 Torin1에 의해 효율적으로 감소한다
HEK293 세포에서 야생형(WT) 및 돌연변이 OSBPL2에 대한 면역형광분석을 수행하기 위해 세포를 항-Myc (OSBPL2) 항체로 면역염색하였다. WT OSBPL2는 세포질에 균일하게 존재하한 반면, 말단이 제거된 OSBPL2 돌연변이 단백질은 대부분의 세포에서 응집된 형태를 보였다. 그러나, 1 μM의 Torin1을 처리하자 응집된 변이 OSBPL2가 현저하게 감소하였으나, WT OSBPL2에는 영향을 미치지 않았다(도 27).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
참고문헌
1. Dror AA, and Avraham KB. Annu Rev Genet. 2009;43:411-37.
2. Cunningham LL, and Tucci DL. The New England journal of medicine. 2017;377(25):2465-73.
3. Livingston G, Sommerlad A, Orgeta V, Costafreda SG, Huntley J, Ames D, et al. Lancet (London, England). 2017;390(10113):2673-734.
4. Lin FR, and Ferrucci L. Arch Intern Med. 2012;172(4):369-71.
5. Mener DJ, Betz J, Genther DJ, Chen D, and Lin FR. J Am Geriatr Soc. 2013;61(9):1627-9.
6. Goman AM, Reed NS, and Lin FR. JAMA Otolaryngol Head Neck Surg. 2017;143(7):733-4.
7. Xing G, Yao J, Wu B, Liu T, Wei Q, Liu C, et al. Genetics in medicine : official journal of the American College of Medical Genetics. 2015;17(3): 210-8.
8. Wu N, Husile H, Yang L, Cao Y, Li X, Huo W, et al. BMC medical genetics. 2019;20(1):43.
9. Thoenes M, Zimmermann U, Ebermann I, Ptok M, Lewis MA, Thiele H, et al. Orphanet J Rare Dis. 2015;10:15.
10. Lehto M, Laitinen S, Chinetti G, Johansson M, Ehnholm C, Staels B, et al. J Lipid Res. 2001;42(8):1203-13.
11. Hynynen R, Suchanek M, Spandl J, B
Figure pat00002
ck N, Thiele C, and Olkkonen VM. J Lipid Res. 2009;50(7):1305-15.
12. Wang H, Ma Q, Qi Y, Dong J, Du X, Rae J, et al. Mol Cell. 2019;73(3):458-73.e7.
13. Escajadillo T, Wang H, Li L, Li D, and Sewer MB. Mol Cell Endocrinol. 2016;427:73-85.
14. Yao J, Zeng H, Zhang M, Wei Q, Wang Y, Yang H, et al. J Genet Genomics. 2019;46(8):379-87.
15. Wang H, Lin C, Yao J, Shi H, Zhang C, Wei Q, et al. Cell Death Dis. 2019;10(9):627.
16. Paulson HL. American journal of human genetics. 1999;64(2):339-45.
17. Gee Heon Y, Noh Shin H, Tang Bor L, Kim Kyung H, and Lee Min G. Cell. 2011;146(5):746-60.
764 18. Dubnikov T, Ben-Gedalya T, and Cohen E. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017;9(3).
19. Jung J, Kim J, Roh SH, Jun I, Sampson RD, Gee HY, et al. Nature communications. 2016;7:11386.
20. Choi HJ, Lee HJ, Choi JY, Jeon IH, Noh B, Devkota S, et al. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020;17:188-97.
21. Bae SH, Robertson NG, Cho HJ, Morton CC, Jung DJ, Baek JI, et al. Human mutation. 2014;35(12):1506-13.
22. Jung J, Kim HS, Lee MG, Yang EJ, and Choi JY. Human mutation. 2015; 36(12):1168-75.
23. Jung J, Lee JS, Cho KJ, Yu S, Yoon JH, Yung Gee H, et al. Scientific reports. 2017;7:45973.
24. S
Figure pat00003
nchez-Mart
Figure pat00004
n P, and Komatsu M. Journal of cell science. 2018;131(21).
25. Conlon B, Langguth B, Hamilton C, Hughes S, Meade E, Connor CO, et al. Sci Transl Med. 2020;12(564).
26. Freeman S, Mateo S
Figure pat00005
nchez S, Pouyo R, Van Lerberghe PB, Hanon K, Thelen N, et al. EMBO Rep. 2019;20(9):e47097.
27. Fu X, Sun X, Zhang L, Jin Y, Chai R, Yang L, et al. The Journal of clinical investigation. 2018;128(11):4938-55.
28. Ye B, Wang Q, Hu H, Shen Y, Fan C, Chen P, et al. Autophagy. 2019;15(6): 998-1016.
29. Ebrahimi-Fakhari D, Saffari A, Wahlster L, Lu J, Byrne S, Hoffmann GF, et al. Brain. 2015;139(2):317-37.
30. Esposito A, Falace A, Wagner M, Gal M, Mei D, Conti V, et al. Brain. 2019;142(12):3876-91.
31. Gee HY, Tang BL, Kim KH, and Lee MG. The Journal of biological chemistry. 2010;285(46):35519-27.
32. Son EJ, Ma J-H, Ankamreddy H, Shin J-O, Choi JY, Wu DK, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2015;112(12):3746-51.
33. Xu T, Park SK, Venable JD, Wohlschlegel JA, Diedrich JK, Cociorva D, et al. Journal of proteomics. 2015;129:16-24.
34. Tabb DL, McDonald WH, and Yates JR, 3rd. J Proteome Res. 2002;1(1):21-6.
<110> Industry-academic cooperation foundation yonsei university <120> A Composition for Preventing or Treating Non-syndromic Autosomal-Dominant Deafness Comprising Autophagy Activator <130> PDPB214168k01 <150> KR 10-2021-0053234 <151> 2021-04-23 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1441 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgaacggag aggaagaatt ctttgatgcc gtcacaggct ttgattctga taactcttct 60 ggggaatttt cagaggcaaa tcagaaagtc acgggaatga ttgacttaga caccagcaaa 120 aataatagga ttgggaaaac tggggagagg ccctctcaag agaacggaat tcagaaacag 180 gacatcgctg ccggctccca tgttcagcag aagcgacttc agcgtgtgga ccatcctgaa 240 gaagtgtgtt ggcctggagc tgtccaagat cacgatgcca atcgccttca acgagcctct 300 gagcttcttg cagcggatca cggagtacat ggagcacgtg tacctcatcc acagggcctc 360 ctgccagccc cagcccctgg agaggatgca gtctgtggct gcttttgctg tttcggctgt 420 ggcttcccag tgggagagga ccggcaaacc atttaatcca ctcttgggag aaacgtatga 480 attaatcagg gaagatttag gattcagatt tatatcggaa caggtcagtc accacccccc 540 catcagtgcg ttccactcgg aaggtctcaa ccatgacttc ctgttccatg gctccatcta 600 ccccaagctc aagttctggg gcaaaagcgt ggaggcggag ccccgaggca ccatcaccct 660 ggagctgctc aaacataatg aagcctacac ctggaccaac cccacctgct gcgtccacaa 720 cgtcatcatc gggaagctgt ggatagagca gtatgggaca gtggagattt taaaccacag 780 aactggacat aagtgtgtgc ttcactttaa accgtgtgga ttatttggaa aagaacttca 840 caaggtggaa ggacacattc aagacaaaaa caaaaagaag ctctttatga tctatggcaa 900 atggacggaa tgtttgtggg gcatagatcc tgtttcgtat gaatccttca agaagcagga 960 gaggagaggt gaccacctga gaaaggccaa gctggatgaa gactccggga aggctgacag 1020 cgacgtggct gacgacgtgc ctgtggccca ggagaccgtg caggtcattc ctggcagcaa 1080 gctgctctgg aggatcaaca cccggccccc caactctgcc cagatgtata atttcaccag 1140 tttcactgtg agcctcaacg agctggagac aggcatggag aagaccctgc cacccacgga 1200 ctgccgcctg cgccctgaca tccgcggcat ggagaatggc aacatggatc tggccagcca 1260 ggagaaggag cggctggagg agaagcagag agaagcacgg agggagcggg ccaaggagga 1320 ggcagagtgg cagacgaggt ggttctaccc aggcaataac ccctacactg ggacccccga 1380 ctggttgtat gcaggggatt actttgagcg gaatttctcc gactgcccag atatctactg 1440 a 1441 <210> 2 <211> 151 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asn Gly Glu Glu Glu Phe Phe Asp Ala Val Thr Gly Phe Asp Ser 1 5 10 15 Asp Asn Ser Ser Gly Glu Phe Ser Glu Ala Asn Gln Lys Val Thr Gly 20 25 30 Met Ile Asp Leu Asp Thr Ser Lys Asn Asn Arg Ile Gly Lys Thr Gly 35 40 45 Glu Arg Pro Ser Gln Glu Asn Gly Ile Gln Lys Gln Asp Ile Ala Ala 50 55 60 Gly Ser His Val Gln Gln Lys Arg Leu Gln Arg Val Asp His Pro Glu 65 70 75 80 Glu Val Cys Trp Pro Gly Ala Val Gln Asp His Asp Ala Asn Arg Leu 85 90 95 Gln Arg Ala Ser Glu Leu Leu Ala Ala Asp His Gly Val His Gly Ala 100 105 110 Arg Val Pro His Pro Gln Gly Leu Leu Pro Ala Pro Ala Pro Gly Glu 115 120 125 Asp Ala Val Cys Gly Cys Phe Cys Cys Phe Gly Cys Gly Phe Pro Val 130 135 140 Gly Glu Asp Arg Gln Thr Ile 145 150

Claims (13)

  1. 오토파지 활성화제를 유효성분으로 포함하는 비증후군성 난청의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 오토파지 활성화제는 mTOR(mechanistic target of rapamycin) 억제제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 mTOR 억제제는 라파마이신(rapamycin), Torin 1, 에베롤리무스(everolimus), 아스코마이신, 템시롤리무스(Temsirolimus), 조타롤리무스(Zotarolimus), 리다포롤리무스(Ridaforolimus), AP23841, AZD08055, OSI027 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염으로 구성된 군으로터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 비증후군성 난청은 옥시스테롤-결합 단백질-유사 단백질 2 유전자(OSBPL2)의 돌연변이에 의한 난청인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 비증후군성 난청은 상염색체 우성 비증후군성 난청 67(deafness nonsyndromic autosomal dominant 67, DFNA67)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 또는 이에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 검출하는 제제를 유효성분으로 포함하는 비증후군성 난청의 진단용 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 검출하는 제제는 상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 인코딩하는 아미노산 서열을 검출하는 제제는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 앱타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 6 항에 있어서, 상기 비증후군성 난청은 옥시스테롤-결합 단백질-유사 단백질 2 유전자(OSBPL2)의 돌연변이에 의한 난청인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 비증후군성 난청은 상염색체 우성 비증후군성 난청 67(deafness nonsyndromic autosomal dominant 67, DFNA67)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 다음의 단계를 포함하는 비증후군성 난청의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법:
    (a) mTOR 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 mTOR의 활성 또는 발현량을 측정하는 단계, 상기 mTOR의 활성 또는 발현량이 감소한 경우, 상기 시험물질은 비증후군성 난청의 예방 또는 치료용 조성물로 판정한다.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 비증후군성 난청은 옥시스테롤-결합 단백질-유사 단백질 2 유전자(OSBPL2)의 돌연변이에 의한 난청인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 비증후군성 난청은 상염색체 우성 비증후군성 난청 67(deafness nonsyndromic autosomal dominant 67, DFNA67)인 것을 특징으로 하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10016400B2 (en) * 2014-10-08 2018-07-10 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Composition including rapamycin as active ingredient for preventing or treating hearing loss
ES2928593T3 (es) * 2015-01-19 2022-11-21 Univ Keio Agentes terapéuticos para el deterioro auditivo del oído interno
CN111655228B (zh) * 2017-05-03 2024-02-09 听治疗有限责任公司 预防和治疗听力损失的组合物和方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108342471A (zh) 2018-03-27 2018-07-31 吴柒柱 常染色体显性非综合征听力损失耳聋osbpl2基因突变体

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