CN111220676A - 利用毛细管电泳技术检测含聚乙二醇的蛋白质样品纯度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种利用毛细管电泳技术检测含聚乙二醇的蛋白质样品纯度的方法，该方法包括：(1)对蛋白质样品加入尿素及相关试剂进行前处理；(2)使用合适的温度对样品进行孵育；(3)进行毛细管电泳分析；(4)根据不同成分的峰面积比计算蛋白质样品的纯度。其中尿素终浓度和孵育温度均由模型确定。本发明通过加入尿素和优化孵育温度的方法解决了传统毛细管电泳测定该类药物纯度时峰型变形、难以准确定量等问题，保证了纯度测定的准确性和精密性。

Description

利用毛细管电泳技术检测含聚乙二醇的蛋白质样品纯度的 方法
技术领域
本发明涉及生物分离分析领域，特别是涉及一种利用毛细管电泳技术检测含聚乙二醇的蛋白质样品纯度的方法。
背景技术
在蛋白质样品生产开发中，不同工艺体系会产生较多工艺相关的添加剂，其来源于生产工艺的各个环节，比如在下游纯化工艺和药物处方开发过程中为了提高不同分子量蛋白质片段的分辨率和维持蛋白质分子的稳定而加入的聚乙二醇。但这些添加剂的引入可能会在样品前处理、仪器进样分析等阶段对蛋白质样品纯度的检测产生影响，从而无法得到真实和准确的纯度检测结果。所以，为了保证蛋白质样品的关键质量属性被准确检测，对于不同工艺开发体系的蛋白质药品，都应建立对应的纯度分析方法。
毛细管电泳法是蛋白质类药物纯度分析最常用的方法之一，该方法通过在样品中加入过量的十二烷基硫酸钠，促使其中所有蛋白质分子带有相同的荷质比，并将带有相同荷质比的蛋白质分子引入到充满具有分离作用的凝胶的毛细管中，通过在毛细管两端施加电压，完成样品中不同分子量蛋白质成分的分离。目前我们在试验中发现蛋白质样品处方中的聚乙二醇对毛细管电泳纯度检测的影响十分显著。当使用毛细管电泳仪检测含有一定浓度聚乙二醇的蛋白质样品时，检测结果谱图中会出现无法被其他技术手段证实的聚集体峰，从而影响蛋白质样品纯度的准确分析。目前，还没有针对聚乙二醇对毛细管电泳检测产生影响的报道和解决办法，本发明的目的在于解决了此问题。
对于蓬勃发展的生物制药行业，不同工艺开发体系的涌现势必会带来更多影响纯度分析的因素，但目前还没有适用于不同工艺开发体系的毛细管电泳分析方法的报道，国内大部分的生物药物生产商很少有独立对这方面的方法进行优化的经验与技术，所以相关性质的工作是很有必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种利用毛细管电泳技术检测含聚乙二醇的蛋白质样品纯度的方法，该方法能够克服聚乙二醇的干扰，准确的检测出处方中蛋白质样品组分的纯度。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种利用毛细管电泳技术检测含聚乙二醇的蛋白质样品纯度的方法，包括以下步骤：
(1)确定HMW期望值：对不含聚乙二醇8000的蛋白质对照品进行毛细管电泳检测，获取HMW期望值；如缺少不含聚乙二醇8000的蛋白质对照品，则默认HMW期望值为0；
(2)将HMW期望值和P值，代入到Minitab构建得出的模型中：
如P在2％～4％之间，则U在1mol/L～3mol/L之间，T在55℃～65℃之间，将P值带入到HMW＝-110.1+1.576T+21.1U+139.12P－0.296T×U－2.058T×P－30.75U×P+0.4502T×U×P模型；
如P在4％～8％之间，则U在1mol/L～3mol/L之间，T在60℃～70℃之间，将待测样品的P值带入到HMW＝2954－94.3T－89.1U+112.1P+0.7489T×T+1.304T×U－1.659T×P模型；
最后设定条件使T取最小值，即可通过Minitab软件得出尿素终浓度U和孵育温度T；
(3)向待测蛋白质样品中加入尿素和十二烷基硫酸钠，使用含有15.8-17.38mmol/L磷酸氢二钠和4.41-5.39mmol/L柠檬酸的缓冲溶液将蛋白质样品浓度调整到0.5–1.5mg/mL；十二烷基硫酸钠浓度调整到质量百分浓度0.64％-0.78％；尿素终浓度调整到模型计算得出的终浓度U，并加入适量N-乙基马来酰亚胺以避免蛋白质被还原；
(4)将蛋白质样品在依据模型计算得出的孵育温度T下加热十分钟充分变性以备进样；
(5)毛细管电泳实验：先将凝胶缓冲液加入毛细管中，将蛋白质样品进样，分离，检测。
在本发明的方法中，所述蛋白质样品中不同成分，如蛋白质样品单体、蛋白质单体的碎片和蛋白质单体的聚集体，由于其分子量不同，导致其在毛细管中的电泳速率不同，出峰时间也不同。先出峰的是药物单体的碎片，最后出峰的是药物单体的聚集体依据不同峰面积的占比计算得到蛋白质样品纯度。
具体的，所述蛋白质样品为蛋白质药物，例如单克隆抗体。
具体的，所述聚乙二醇的聚合度在200～8000范围内。
具体的，一种具体实施方式中，所述步骤(3)中，缓冲溶液含有15.8mmol/L磷酸氢二钠和4.9mmol/L柠檬酸。
具体的，一种具体实施方式中，所述步骤(3)中，蛋白质样品中十二烷基硫酸钠浓度调整到0.71％。
具体的，一种具体实施方式中，所述步骤(3)中，在进样分析前需将蛋白质样品的浓度调整到1mg/mL。
具体的，一种具体实施方式中，所述步骤(3)中，加入5μL 100mmol/L N-乙基马来酰亚胺。
具体的，变性处理时，蛋白质药物体系中精确的尿素终浓度和孵育温度由统计分析软件Minitab构建出的模型确定。
本发明的方法，利用Minitab的实验设计功能，将聚乙二醇终浓度(P)、尿素终浓度(U)、孵育温度(T)作为因子，蛋白质药物中高聚体成分占比(HMW)作为响应值构建模型。
利用Minitab的实验设计功能构建模型时所使用的聚乙二醇的聚合度为8000且在蛋白质药物浓度达到1mg/mL时，其终浓度范围为2％-8％。
利用Minitab的实验设计功能构建模型时，由于HMW与P、U、T之间的数学模型会根据聚乙二醇8000终浓度区间的不同而改变，所以将聚乙二醇8000的终浓度区间由2％-8％，分成2％-4％和4％-8％两个区间，并分别构建模型。
利用Minitab的实验设计功能构建模型时，U的范围在P值为2％-4％和4％-8％的模型中均取1mol/L–3mol/L。通过提供P的具体数值，并且在HMW和T尽可能低的前提下，使用模型计算得出蛋白质药物变性处理时所需的最优U值。
利用Minitab的实验设计功能构建模型时，T的范围在P值为2％-4％的模型中取55℃-65℃，在P值为4％-8％的模型中取60℃-70℃。通过提供P的具体数值，并且在HMW和T尽可能低的前提下，使用模型计算得出蛋白质药物变性处理时所需的最优T值。
具体的，所述步骤(5)中，毛细管电泳分析时采用的毛细管为总长度30.2cm，有效长度20.2cm，内径50μm的非涂层毛细管。
具体的，所述步骤(5)中，使用SCIEX PA 800Plus毛细管电泳仪进行所述电泳。
具体的，所述步骤(5)中，凝胶缓冲液为SCIEX公司的SDS-MW凝胶缓冲液。
具体的，所述步骤(5)中，凝胶缓冲液加入条件为：70.0psi，10.0min。
具体的，所述步骤(5)中，蛋白质样品进样条件为：5.0kV，20.0s。
具体的，所述步骤(5)中，电泳时毛细管温度为25℃；分离电压为15.0kV；分离时间为35min。
具体的，所述步骤(5)中，采用二极管阵列检测器(PDA)进行检测，检测波长为220nm。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供了一种利用毛细管电泳技术检测含聚乙二醇的蛋白质样品纯度的方法，解决了传统毛细管电泳测定该类药物纯度时峰型变形、难以准确定量等问题。
2.本发明提供了一种利用毛细管电泳技术检测含聚乙二醇的蛋白质样品纯度的方法，通过在传统毛细管电泳纯度检测方法中加入尿素和改变孵育温度，解决了高聚合度聚乙二醇无法通过换液方法去除从而导致毛细管电泳纯度检测结果异常的问题。
3.本发明提供了一种利用毛细管电泳技术检测含聚乙二醇的蛋白质样品纯度的方法，通过引入Minitab软件精确地确定了合适的尿素终浓度和孵育温度，防止尿素终浓度过低或孵育温度过低导致出现蛋白质样品无法充分变性，也防止孵育温度过高导致蛋白质样品产生碎片。
4.本发明提供了一种利用毛细管电泳技术检测含聚乙二醇的蛋白质样品纯度的方法，使用Minitab软件拟合出了涵盖聚乙二醇8000常用浓度范围的统计学模型，使得本方法可以应用在处方中含有不同浓度聚乙二醇8000的蛋白质样品的毛细管电泳检测中。
5.本发明提供了一种利用毛细管电泳技术检测含聚乙二醇的蛋白质样品纯度的方法，其电泳分离过程充分地利用毛细管的分离长度对蛋白质样品中的不同成分进行分离。本发明有助于生物制药企业在研发和生产阶段对蛋白质样品关键质量属性的检测与控制。
附图说明
图1为实施例1中聚乙二醇8000终浓度为2％的样品经本发明方法与常规方法的毛细管电泳纯度检测结果。
图2为实施例2中聚乙二醇8000终浓度为4％的样品经本发明方法与常规方法的毛细管电泳纯度检测结果。
图3为实施例3中聚乙二醇8000终浓度为6％的样品经本发明方法与常规方法的毛细管电泳纯度检测结果。
图4为实施例4中聚乙二醇8000终浓度为8％的样品经本发明方法与常规方法的毛细管电泳纯度检测结果。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
缓冲溶液的制备：取磷酸氢二钠和柠檬酸固体粉末，加入纯水配制成含15.8mmol/L磷酸氢二钠和4.9mmol/L柠檬酸的缓冲溶液。
本发明方法：待分析的蛋白质样品为赫赛汀单抗溶液(21mg/mL)，将聚乙二醇8000终浓度设定为2％(P＝2)。将P值和不含聚乙二醇的赫赛汀单抗溶液(21mg/mL)的HMW值(HMW＝0.15)带入HMW＝-110.1+1.576T+21.1U+139.12P－0.296T×U－2.058T×P－30.75U×P+0.4502T×U×P模型中，T尽量取低值，使用Minitab软件计算出所需尿素终浓度为：3mol/L，孵育温度为：64.5℃。
向蛋白质样品中加入相应质量的聚乙二醇8000、尿素和十二烷基硫酸钠，并使用缓冲溶液将蛋白质样品总体积调整到100μL且赫赛汀单抗浓度调整为1mg/mL，聚乙二醇8000终浓度为2％，尿素终浓度调整为3mol/L，十二烷基硫酸钠浓度调整为0.71％。
向样品中加入5μL 100mmol/L N-乙基马来酰亚胺并混匀，混匀后在64.5℃下孵育十分钟并冷却到室温。作为采用本发明方法的样品。
常规方法：取另一份赫赛汀单抗溶液(21mg/mL)，将聚乙二醇8000终浓度设定为2％，向样品中加入聚乙二醇8000和十二烷基硫酸钠，并使用缓冲溶液将样品总体积调整到100μL且赫赛汀单抗浓度调整为1mg/mL，聚乙二醇8000终浓度为2％，十二烷基硫酸钠浓度调整为0.71％。最后加入5μL 100mmol/L N-乙基马来酰亚胺并混匀，混匀后在60.0℃下孵育十分钟并冷却到室温。作为采用常规方法的样品。
将两份样品在同样的毛细管电泳条件下进行纯度检测，毛细管温度为25℃；分离电压为15.0kV；分离时间为35min。采用二极管阵列检测器(PDA)进行检测，检测波长为220nm，检测结果如图1所示。采用本发明方法所得样品HMW值为0.024，采用常规方法所得样品HMW值为12.526。
本发明方法与常规方法的差别在于常规方法未加入尿素且孵育温度不同。由图1可知，本发明方法的检测图谱中蛋白质样品成单峰且峰形好，而常规方法的检测图谱中峰形差，有拖尾峰和肩峰出现，存在聚集体和碎片，检测数据处理的准确性差。
实施例2
缓冲溶液的制备：取磷酸氢二钠和柠檬酸固体粉末，加入纯水配制成含15.8mmol/L磷酸氢二钠和4.9mmol/L柠檬酸的缓冲溶液。
本发明方法：待分析的蛋白质为赫赛汀单抗溶液(21mg/mL)，将聚乙二醇8000终浓度设定为4％(P＝4)。将P值和不含聚乙二醇的赫赛汀单抗溶液(21mg/mL)的HMW值(HMW＝0.15)带入HMW＝-110.1+1.576T+21.1U+139.12P–0.296T×U–2.058T×P–30.75U×P+0.4502T×U×P模型中，T尽量取低值，使用Minitab软件计算出所需尿素终浓度为：3mol/L，孵育温度为：65.0℃。
向样品中加入相应质量的聚乙二醇8000、尿素和十二烷基硫酸钠并使用缓冲溶液将样品总体积调整到100μL且赫赛汀单抗浓度调整为1mg/mL，聚乙二醇8000终浓度为4％，尿素终浓度调整为3mol/L，十二烷基硫酸钠浓度调整为0.71％。
向样品中加入5μL 100mmol/L N-乙基马来酰亚胺并混匀，混匀后在65.0℃下孵育十分钟并冷却到室温。作为采用本发明方法的样品。
常规方法：取另一份赫赛汀单抗溶液(21mg/mL)，将聚乙二醇8000终浓度设定为4％，向样品中加入聚乙二醇8000和十二烷基硫酸钠并使用缓冲溶液将样品总体积调整到100μL且赫赛汀单抗浓度调整为1mg/mL，聚乙二醇8000终浓度为4％，十二烷基硫酸钠浓度调整为0.71％。最后加入5μL 100mmol/L N-乙基马来酰亚胺并混匀，混匀后在60.0℃下孵育十分钟并冷却到室温。作为采用常规方法的样品。
将两份样品在同样的毛细管电泳条件下进行纯度检测，毛细管温度为25℃；分离电压为15.0kV；分离时间为35min。采用二极管阵列检测器(PDA)进行检测，检测波长为220nm，检测结果如图2所示。采用本发明方法所得样品HMW值为0.620，采用常规方法所得样品HMW值为65.456。
本发明方法与常规方法的差别在于常规方法未加入尿素且孵育温度不同。由图2可知，本发明方法的检测图谱中蛋白质样品成单峰且峰形好，而常规方法的检测图谱的峰形差，呈现出多峰且拖尾，存在聚集体和碎片，检测数据处理的准确性差。
实施例3
缓冲溶液的制备：取磷酸氢二钠和柠檬酸固体粉末，加入纯水配制成含15.8mmol/L磷酸氢二钠和4.9mmol/L柠檬酸的缓冲溶液。
本发明方法：待分析的蛋白质为赫赛汀单抗溶液(21mg/mL)，将聚乙二醇8000终浓度设定为6％(P＝6)。将P值和不含聚乙二醇的赫赛汀单抗溶液(21mg/mL)的HMW值(HMW＝0.15)带入HMW＝2954–94.3T–89.1U+112.1P+0.7489T×T+1.304T×U–1.659T×P模型中，T尽量取低值，使用Minitab软件计算出所需尿素终浓度为：3mol/L，孵育温度为：65.6℃。
向样品中加入相应质量的聚乙二醇8000、尿素和十二烷基硫酸钠并使用缓冲溶液将样品总体积调整到100μL且赫赛汀单抗浓度调整为1mg/mL，聚乙二醇8000终浓度为6％，尿素终浓度调整为3mol/L，十二烷基硫酸钠浓度调整为0.71％。
向样品中加入5μL 100mmol/L N-乙基马来酰亚胺并混匀，混匀后在65.6℃下孵育十分钟并冷却到室温。作为采用本发明方法的样品。
常规方法：取另一份赫赛汀单抗溶液(21mg/mL)，将聚乙二醇8000终浓度设定为6％，向样品中加入聚乙二醇8000和十二烷基硫酸钠并使用缓冲溶液将样品总体积调整到100μL且赫赛汀单抗浓度调整为1mg/mL，聚乙二醇8000终浓度为6％，十二烷基硫酸钠浓度调整为0.71％。最后加入5μL 100mmol/L N-乙基马来酰亚胺并混匀，混匀后在60.0℃下孵育十分钟并冷却到室温。作为采用常规方法的样品。
将两份样品在同样的毛细管电泳条件下进行纯度检测，毛细管温度为25℃；分离电压为15.0kV；分离时间为35min。采用二极管阵列检测器(PDA)进行检测，检测波长为220nm，检测结果如图3所示。采用本发明方法所得样品HMW值为0.775，采用常规方法所得样品HMW值为76.672。
本发明方法与常规方法的差别在于常规方法未加入尿素且孵育温度不同。由图3可知，本发明方法的检测图谱中蛋白质样品成单峰且峰形好，而常规方法的检测图谱的峰形差，呈现出多峰且拖尾，存在聚集体和碎片，检测数据处理的准确性差。
实施例4
缓冲溶液的制备：取磷酸氢二钠和柠檬酸固体粉末，加入纯水配制成含15.8mmol/L磷酸氢二钠和4.9mmol/L柠檬酸的缓冲溶液。
本发明方法：待分析的蛋白质为赫赛汀单抗溶液(21mg/mL)，将聚乙二醇8000终浓度设定为8％(P＝8)。将P值和不含聚乙二醇的赫赛汀单抗溶液(21mg/mL)的HMW值(HMW＝0.15)带入HMW＝2954–94.3T–89.1U+112.1P+0.7489T*T+1.304T*U–1.659T*P模型中，T尽量取低值，使用Minitab软件计算出所需尿素终浓度为：3mol/L，孵育温度为：67.1℃。
向样品中加入相应质量的聚乙二醇8000、尿素和十二烷基硫酸钠并使用缓冲溶液将样品总体积调整到100μL且赫赛汀单抗浓度调整为1mg/mL，聚乙二醇8000终浓度为8％，尿素终浓度调整为3mol/L，十二烷基硫酸钠浓度调整为0.71％。
向样品中加入5μL 100mmol/L N-乙基马来酰亚胺并混匀，混匀后在67.1℃下孵育十分钟并冷却到室温。作为采用本发明方法的样品。
常规方法：取另一份赫赛汀单抗溶液(21mg/mL)，将聚乙二醇8000终浓度设定为8％，向样品中加入聚乙二醇8000和十二烷基硫酸钠并使用缓冲溶液将样品总体积调整到100μL且赫赛汀单抗浓度调整为1mg/mL，聚乙二醇8000终浓度为8％，十二烷基硫酸钠浓度调整为0.71％。最后加入5μL 100mmol/L N-乙基马来酰亚胺并混匀，混匀后在60.0℃下孵育十分钟并冷却到室温。作为采用常规方法的样品。
将两份样品在同样的毛细管电泳条件下进行纯度检测，毛细管温度为25℃；分离电压为15.0kV；分离时间为35min。采用二极管阵列检测器(PDA)进行检测，检测波长为220nm，检测结果如图4所示。采用本发明方法所得样品HMW值为1.635，采用常规方法所得样品HMW值为82.782。
本发明方法与常规方法的差别在于常规方法未加入尿素且孵育温度不同。由图3可知，本发明方法的检测图谱中蛋白质样品成单峰且峰形好，而常规方法的检测图谱的峰形差，呈现出多峰且拖尾，存在聚集体和碎片，检测数据处理的准确性差。
综合以上实施例1～4的结果，我们可以看出采用本方法得出的HMW值均与不含聚乙二醇的赫赛汀单抗溶液(21mg/mL)的HMW值相近且低于采用常规方法得出的HMW值。我们可以认为Minitab构建的模型可以较好的解决聚乙二醇8000给毛细管电泳带来异常纯度结果的问题。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (14)

1.一种利用毛细管电泳技术检测含聚乙二醇的蛋白质样品纯度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)确定HMW期望值：对不含聚乙二醇8000的蛋白质对照品进行毛细管电泳检测，获取HMW期望值；如缺少不含聚乙二醇8000的蛋白质对照品，则默认HMW期望值为0；
(2)将HMW期望值和P值，代入到Minitab构建得出的模型中：
如P在2％～4％之间，则U在1mol/L～3mol/L之间，T在55℃～65℃之间，将P值带入到HMW＝-110.1+1.576T+21.1U+139.12P－0.296T×U－2.058T×P－30.75U×P+0.4502T×U×P模型；
如P在4％～8％之间，则U在1mol/L～3mol/L之间，T在60℃～70℃之间，将待测样品的P值带入到HMW＝2954－94.3T－89.1U+112.1P+0.7489T×T+1.304T×U－1.659T×P模型；
最后设定条件使T取最小值，即可通过Minitab软件得出尿素终浓度U和孵育温度T；
(3)向待测蛋白质样品中加入尿素和十二烷基硫酸钠，使用含有15.8-17.38mmol/L磷酸氢二钠和4.41-5.39mmol/L柠檬酸的缓冲溶液将蛋白质样品浓度调整到0.5–1.5mg/mL；十二烷基硫酸钠浓度调整到质量百分浓度0.64％-0.78％；尿素终浓度调整到模型计算得出的终浓度U，并加入适量N-乙基马来酰亚胺；
(4)将蛋白质样品在依据模型计算得出的孵育温度T下加热5～20分钟充分变性以备进样；
(5)毛细管电泳实验：先将凝胶缓冲液加入毛细管中，将蛋白质样品进样，分离，检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白质样品为单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，缓冲溶液含有15.8mmol/L磷酸氢二钠和4.9mmol/L柠檬酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，蛋白质样品中十二烷基硫酸钠浓度调整到0.71％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述聚乙二醇的聚合度在200～8000范围内。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，在进样分析前需将蛋白质样品的浓度调整到1mg/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，在孵育温度T下加热10分钟充分变性。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，毛细管电泳分析时采用的毛细管为总长度30.2cm，有效长度20.2cm，内径50μm的非涂层毛细管。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，使用SCIEX PA 800 Plus毛细管电泳仪进行所述电泳。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，凝胶缓冲液为SCIEX公司的SDS-MW凝胶缓冲液。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，凝胶缓冲液加入条件为：70.0psi，10.0min。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，蛋白质样品进样条件为：5.0kV，20.0s。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，电泳时毛细管温度为25℃；分离电压为15.0kV；分离时间为35min。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，采用二极管阵列检测器进行检测，检测波长为220nm。
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