BR112021004436A2 - sistema e método para separar proteínas de múltiplas subunidades em uma amostra, método para isolar uma proteína alvo em uma mistura de amostra e ligante de eletroforese capilar de afinidade - Google Patents

Abstract

"SISTEMA E MÉTODO PARA SEPARAR PROTEÍNAS DE MÚLTIPLAS SUBUNIDADES EM UMA AMOSTRA, MÉTODO PARA ISOLAR UMA PROTEÍNA ALVO EM UMA MISTURA DE AMOSTRA E LIGANTE DE ELETROFORESE CAPILAR DE AFINIDADE”. A matéria presentemente divulgada refere-se a composições, sistemas e métodos para rastrear uma ou mais espécies de polipeptídeos em uma mistura complexa de polipeptídeos, por exemplo, proteínas de múltiplas subunidades. Por exemplo, a matéria refere-se a ligantes usados em conexão com eletroforese capilar de afinidade, bem como métodos e sistemas para detectar polipeptídeos em uma mistura de multímeros que incluem anticorpos multiespecíficos, por exemplo, anticorpos biespecíficos.

Description

“SISTEMA E MÉTODO PARA SEPARAR PROTEÍNAS DE MÚLTIPLAS SUBUNIDADES EM UMA AMOSTRA, MÉTODO PARA ISOLAR UMA PROTEÍNA ALVO EM UMA MISTURA DE AMOSTRA E LIGANTE DE ELETROFORESE CAPILAR DE AFINIDADE” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório dos EUA de nº de série 62/729.384, depositado em 10 de setembro de 2018, cujos conteúdos estão incorporados neste documento a título de referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

[0002] A matéria presentemente divulgada refere-se a composições, sistemas e métodos para rastrear uma ou mais espécies de polipeptídeo em uma mistura complexa de polipeptídeos. Em particular, a matéria divulgada neste documento refere-se a ligantes usados em conexão com eletroforese capilar de afinidade, bem como métodos e sistemas para detectar polipeptídeos em uma mistura de multímeros que incluem anticorpos multiespecíficos, por exemplo, anticorpos biespecíficos.

ANTECEDENTES

[0003] Os anticorpos biespecíficos (BsAbs) têm atraído amplo interesse terapêutico nos últimos anos devido à sua capacidade única de reconhecer dois alvos de antígeno distintos. Apesar do interesse no uso terapêutico de BsAbs, sua produção comercial tem sido desafiadora porque os métodos convencionais de produção podem resultar em subprodutos indesejáveis e requerem processos de purificação complexos. Por exemplo, certos BsAbs foram gerados por meio da tecnologia "knob-into-hole", em que mutações complementares são feitas no domínio CH3 das cadeias pesadas para formar estruturas "knob" e "hole". Em contraste com a produção de anticorpos convencionais, que podem contar com a dimerização de subunidades de cadeia pesada/cadeia leve idênticas, ao usar a tecnologia knob-into-hole, grandes cadeias laterais de aminoácidos são introduzidas no domínio CH3 de uma das cadeias pesadas e essas cadeias laterais se encaixam em cavidades projetadas de forma apropriada no domínio CH3 de outra cadeia pesada. Erros de pareamento da cadeia (por exemplo, homodimerização de peptídeos de cadeia pesada idênticos ou associações impróprias de cadeia pesada/cadeia leve) podem ser observados resultando em um conjunto único de impurezas relacionadas ao produto, incluindo ambas espécies de homodímero knob-knob e hole-hole (HD). Essas variantes de homodímero podem ser desafiadoras para quantificar, pois podem estar presentes em níveis baixos e têm características físico-químicas que são altamente semelhantes ao produto de BsAb pretendido e outras variantes moleculares de BsAb.

[0004] Assim, permanece a necessidade de sistemas e técnicas para purificar e quantificar o BsAb alvo de proteínas indesejáveis produzidas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0005] A matéria presentemente divulgada refere-se a composições, sistemas e métodos para rastrear uma ou mais espécies de polipeptídeo em uma mistura complexa de polipeptídeos. Em particular, a matéria divulgada neste documento refere-se a ligantes usados em conexão com eletroforese capilar de afinidade, bem como métodos e sistemas para detectar polipeptídeos em uma mistura de multímeros que incluem anticorpos multiespecíficos, por exemplo, anticorpos biespecíficos.

[0006] Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a sistemas para separar proteínas de múltiplas subunidades em uma amostra compreendendo: a) um ligante, b) um tampão de eletrólito de fundo, c) a amostra, d) um capilar, e) um ânodo em ou perto de uma extremidade do capilar, e f) um cátodo em ou perto da outra extremidade do capilar, em que a amostra é misturada com o ligante para formar pelo menos um complexo ligante-

proteína e carregado no capilar na extremidade do ânodo do capilar, e em que o capilar é preenchido com o tampão de eletrólito de fundo misturado com o ligante.

[0007] Em certas modalidades, os sistemas da presente divulgação compreendem ainda um detector localizado próximo à extremidade do cátodo do capilar, em que o detector detecta absorbância de luz de 210 nm a 220 nm ou fluorescência induzida por laser.

[0008] Em certas modalidades, os sistemas da presente divulgação compreendem uma amostra em que a amostra compreende pelo menos um homodímero, pelo menos um heterodímero, ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, os sistemas da presente divulgação compreendem um primeiro complexo ligante-proteína, que é formado quando o ligante se liga à primeira subunidade do pelo menos um heterodímero e não se liga à segunda subunidade do pelo menos um heterodímero. Em certas modalidades, os sistemas da presente divulgação compreendem um segundo complexo ligante-proteína, que é formado quando o ligante se liga a pelo menos duas primeiras ou segundas subunidades idênticas do homodímero. Em certas modalidades, o pelo menos um complexo ligante-proteína é configurado para ter um marcador fluorescente (ou de outra forma detectável) ou uma carga alterada, massa, tamanho hidrodinâmico, mobilidade eletroforética, ou uma combinação dos mesmos quando o ligante se liga às subunidades da proteína de múltiplas subunidades. Em certas modalidades, o segundo complexo ligante-proteína tem uma mobilidade eletroforética inferior ao primeiro complexo ligante-proteína.

[0009] Em certas modalidades, os sistemas da presente divulgação compreendem um ligante onde o ligante é um polipeptídeo ou um fragmento de polipeptídeo. Em certas modalidades, o ligante é um polipeptídeo marcado com fluorescência ou um fragmento de polipeptídeo marcado com fluorescência. Em certas modalidades, o ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em um polipeptídeo CD3 humano, um polipeptídeo CD3 de camundongo, um polipeptídeo CD3 de rato, um polipeptídeo CD3 de coelho e um polipeptídeo CD3 de macaco cinomolgo. Em certas modalidades, o ligante é modificado pela adição de um ou mais aminoácidos a uma região de não ligação do ligante. Em certas modalidades, um ou mais aminoácidos são selecionados a partir do grupo que consiste em um ácido glutâmico, um ácido aspártico, e uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, os um ou mais aminoácidos adicionados são configurados para alterarem uma carga e uma massa do ligante.

[00010] Em certas modalidades, os sistemas da presente divulgação compreendem uma amostra em que a amostra é ainda misturada com o ligante em um tampão de ureia com pH baixo. Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos compreendendo ainda a mistura de um tampão de HEPES com pH alto e 0,1% de PS20 à mistura da amostra do ligante. Em certas modalidades, os sistemas da presente divulgação compreendem um tampão de eletrólito de fundo em que o tampão de eletrólito de fundo compreende ácido amino-n-capróico (EACA), uma trietileno tetramina (TETA) e hidroxipropilmetilcelulose (HPMC). Em certas modalidades, o tampão de eletrólito de fundo compreende o ligante que se liga a uma primeira subunidade do pelo menos um heterodímero dos métodos descritos acima e não se liga à segunda subunidade do pelo menos um heterodímero.

[00011] Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos para separar proteínas de múltiplas subunidades em uma amostra que compreende as etapas de: (a) criar uma mistura da amostra e de um ligante para formar pelo menos um complexo ligante-proteína, (b) aplicar a mistura a um capilar, em que o capilar é preenchido com um tampão de eletrólito de fundo misturado com o ligante, (c) aplicar uma voltagem através do capilar e (d) permitir que as proteínas de múltiplas subunidades e pelo menos um complexo ligante-proteína se movam através do capilar, em que o complexo ligante-proteína é configurado para ter um marcador fluorescente (ou detectável de outra forma), uma carga alterada, massa, tamanho hidrodinâmico, mobilidade eletroforética, ou uma combinação dos mesmos quando o ligante se liga às subunidades da proteína de múltiplas subunidades para, desse modo, separar as proteínas de múltiplas subunidades na amostra.

[00012] Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos para isolar uma proteína alvo em uma mistura de amostra que compreende as etapas de: (a) criar uma mistura da amostra e de um ligante para formar pelo menos um complexo ligante-proteína, (b) aplicar a mistura a um capilar, em que o capilar é preenchido com um tampão de eletrólito de fundo misturado com o ligante, (c) aplicar uma voltagem através do capilar, (d) permitir que as proteínas de múltiplas subunidades e o pelo menos um complexo ligante- proteína se movam através do capilar, em que o complexo ligante-proteína é configurado para ter um marcador fluorescente (ou detectável de outra forma), uma carga alterada, massa, tamanho hidrodinâmico, mobilidade eletroforética, ou uma combinação dos mesmos, quando o ligante se liga às subunidades da proteína de múltiplas subunidades, e (e) isolar a proteína alvo, que é separada das proteínas não alvo.

[00013] Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos que empregam um capilar, em que o capilar compreende uma extremidade do cátodo, uma extremidade do ânodo e um detector. Em certas modalidades, o capilar tem um diâmetro interno de cerca de 50 µm. Em certas modalidades, o capilar tem uma distância para o detector de cerca de 20 cm. Em certas modalidades, o capilar tem um comprimento total de cerca de 30 cm. Em certas modalidades, o detector está perto da extremidade do cátodo do capilar e detecta absorbância de luz de 210 nm a 220 nm ou fluorescência induzida por laser. Em certas modalidades, a voltagem é de 30 quilovolts.

[00014] Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos onde uma amostra é usada, em que a amostra compreende pelo menos um homodímero, pelo menos um heterodímero, ou uma combinação dos mesmos, em que o pelo menos um heterodímero compreende uma primeira subunidade e uma segunda subunidade, e o pelo menos um homodímero compreende pelo menos duas primeiras ou segundas subunidades idênticas. Em certas modalidades, o pelo menos um heterodímero compreende um anticorpo biespecífico. Em uma modalidade, o pelo menos um homodímero compreende um anticorpo monoclonal.

[00015] Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos que usam um ligante, em que o ligante é um peptídeo ou um fragmento de peptídeo. Em certas modalidades, o ligante é um peptídeo marcado fluorescente ou um fragmento de peptídeo marcado com fluorescência.

Em certas modalidades, o ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em um peptídeo CD3 humano, um peptídeo CD3 de camundongo, um peptídeo CD3 de rato, um peptídeo CD3 de coelho e um peptídeo CD3 de macaco cinomolgo. Em certas modalidades, o ligante é configurado para ser modificado pela adição de um ou mais aminoácidos a uma região de não ligação do ligante.

Em certas modalidades, um ou mais aminoácidos são selecionados a partir do grupo que consiste em um ácido glutâmico, um ácido aspártico, e uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, os um ou mais aminoácidos adicionados são configurados para alterarem uma carga e uma massa do ligante.

[00016] Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos em que um primeiro complexo ligante-proteína é formado quando o ligante se liga à primeira subunidade do pelo menos um heterodímero e não se liga à segunda subunidade do pelo menos um heterodímero. Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos em que um segundo complexo ligante-proteína é formado quando o ligante se liga a pelo menos duas primeiras ou segundas subunidades idênticas do homodímero.

[00017] Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos compreendendo ainda misturar um tampão de ureia com pH baixo à mistura da amostra e do ligante. Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos compreendendo ainda a mistura de um tampão de HEPES com pH alto e 0,1% de PS20 à mistura da amostra do ligante.

Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos em que o tampão de eletrólito de fundo compreende ácido amino-n-capróico (EACA), uma trietileno tetramina (TETA) e hidroxipropilmetilcelulose (HPMC). Em certas modalidades, o tampão de eletrólito de fundo compreende o ligante que se liga a uma primeira subunidade do pelo menos um heterodímero dos métodos descritos acima e não se liga à segunda subunidade do pelo menos um heterodímero.

[00018] Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos que compreendem ainda quantificar a quantidade da proteína alvo na amostra.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00019] A Figura 1 representa anticorpos biespecíficos exemplares e impurezas relacionadas ao produto (incluindo semianticorpo e homodímeros) tendo propriedades físico-químicas semelhantes, o que torna a detecção desafiadora por métodos analíticos tradicionais.

[00020] A Figura 2 representa o mecanismo de separação teórico de uma amostra de anticorpo específico por eletroforese capilar de afinidade.

[00021] A Figura 3 representa a eletroforese capilar de afinidade exemplar para a detecção de homodímero. Formação de complexo incompleta e intermitente observada quando o ligante é misturado com a amostra antes da separação.

[00022] A Figura 4 representa um desempenho exemplar da eletroforese de afinidade com excesso de ligante adicionado ao eletrólito de fundo.

[00023] A Figura 5A representa ligantes modificados exemplares para aprimorar o desempenho da eletroforese de afinidade. A Figura 5B representa o desempenho exemplar da eletroforese de afinidade com os ligantes modificados.

[00024] A Figura 6 representa o desempenho exemplar do Peptídeo CD3 + E.

[00025] A Figura 7 representa isômeros conformacionais dependentes de pH do homodímero anti-CD3. O tratamento da amostra com pH baixo leva à confirmação única e aprimora o sinal de ruído, que também é alcançado, conforme descrito neste documento, por tratamento com pH alto.

[00026] A Figura 8 representa a recuperação aprimorada do homodímero anti-CD3 ao longo do tempo em 0,1% de PS20 na amostra.

[00027] A Figura 9 representa mecanismos de interação de oligômero exemplares.

[00028] As Figuras 10A-10B representam a identificação indireta de pico na região anti-CD3 por meio de impurezas aumentadas. 10A representa os resultados após a mistura inicial com tampão de HEPES, enquanto 10B representa os resultados após a conversão completa para conformação com pH alto.

[00029] A Figura 11 representa a formação de oligômero exemplar por interação de dois homodímeros.

[00030] A Figura 12 representa a dissociação de oligômero exemplar por pH baixo e ureia. O tampão de amostra tem pH 3,5 e inclui ureia.

A ureia e o pH baixo evitam a interação de anti-CD3 e anti-CD20 HDs (confirmado por SEC).

[00031] A Figura 13 representa uma análise da eletroforese capilar de afinidade exemplar que revela o oligômero no Padrão de Referência de BsAb.

[00032] A Figura 14 representa um método exemplar de eletroforese capilar de afinidade com pH baixo.

[00033] A Figura 15 representa o desempenho exemplar da análise de eletroforese capilar de afinidade em comparação com o método intacto de espectrometria de massa.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00034] A matéria da presente divulgação refere-se a composições, sistemas e métodos para rastrear uma ou mais espécies de polipeptídeos em uma mistura complexa de polipeptídeos. Por exemplo, mas não a título de limitação, a matéria divulgada neste documento é aplicável a métodos de eletroforese capilar de afinidade (ACE) para detectar anticorpos alvo em uma mistura de multímeros, incluindo, por exemplo, anticorpos multiespecíficos, tais como anticorpos biespecíficos. A matéria da presente divulgação também é direcionada a ligantes e sistemas de eletroforese usados para detectar e isolar tais anticorpos alvo. Os métodos de eletroforese divulgados neste documento podem ser usados isoladamente ou podem ainda ser combinados com processos de purificação convencionais e operações unitárias, como são conhecidos na técnica, para alcançar níveis particulares de pureza do anticorpo biespecífico, por exemplo, para aplicações terapêuticas e/ou diagnósticas.

[00035] Para fins de clareza de divulgação e não como forma de limitação, a descrição detalhada é dividida nas seguintes subseções:

1. Definições;

2. Ligantes para isolar e quantificar proteínas de múltiplas subunidades alvo;

3. Sistema para isolar e quantificar proteínas de múltiplas subunidades alvo; e

4. Métodos para isolar e quantificar proteínas de múltiplas subunidades alvo.

1. DEFINIÇÕES

[00036] A prática da presente divulgação empregará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular e bioquímica, que estão dentro da habilidade na técnica. Essas técnicas são totalmente explicadas na literatura, tal como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edição (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology", 4ª edição (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); e "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994).

[00037] A menos que definido de outra forma, todos os termos da técnica, notações e outras terminologias científicas usadas neste documento se destinam a ter os significados comumente compreendidos por aqueles técnicos no assunto aos quais esta divulgação refere-se. Em alguns casos, os termos com significados comumente compreendidos são definidos neste documento para maior clareza e/ou para pronta referência, e a inclusão de tais definições neste documento não deve necessariamente ser interpretada como representando uma diferença substancial sobre o que é geralmente entendido na técnica. Conforme apropriado, os procedimentos que envolvem o uso de kits e reagentes disponíveis comercialmente são geralmente realizados de acordo com os protocolos e/ou parâmetros definidos pelo fabricante, a menos que indicado de outra forma. Antes dos presentes métodos, kits e usos, portanto, serem descritos, deve ser entendido que a matéria desta divulgação não está limitada à metodologia, protocolos, linhagens celulares, espécies ou gêneros animais, construtos e reagentes específicos descritos como tais que podem, é claro, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem o propósito de descrever modalidades particulares somente, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que será limitado somente pelas reivindicações anexas.

[00038] Conforme usado neste documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um(a)", "e" e "o(a)" incluem referentes plurais a menos que o contexto dite claramente o contrário.

[00039] O termo "cerca de" ou "aproximadamente", conforme usado neste documento, pode significar dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor particular, conforme determinado por alguém técnico no assunto, que dependerá em parte de como o valor é medido ou determinado, por exemplo, as limitações do sistema de medição. Por exemplo, “cerca de” pode significar dentro de 1 ou mais de 1 desvio padrão, de acordo com a prática no valor fornecido. Onde valores particulares são descritos no pedido e nas reivindicações, a menos que indicado de outra forma, o termo "cerca de" pode significar uma faixa de erro aceitável para o valor particular, tal como ± 10% do valor modificado pelo termo "cerca de".

[00040] O termo "afinidade" refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra forma, conforme usado neste documento, "afinidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno), embora em certos contextos a interação possa envolver uma razão de interação diferente, por exemplo, no contexto de um homodímero de aCD3, a interação pode ser 2:1 porque dois antígenos ligam cada homodímero de aCD3. A afinidade de uma molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos no presente documento. Modalidades ilustrativas e exemplos específicos para medir a afinidade de ligação encontram-se descritos a seguir.

[00041] O termo "anticorpo" neste documento é usado no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpos, incluindo, mas não se limitando a, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a desejada atividade de ligação ao antígeno; bem como anticorpos desimunizados, quiméricos, humanizados e humanos e/ou anticorpos derivados de qualquer fonte animal adequada (por exemplo, de camundongos, ratos, hamsters, porquinhos-da-índia, coelhos, cabras, ovelhas, cães, cavalos, vacas, macacos, macacos e/ou galinhas)), imunoconjugados, anticorpos sintéticos, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab′), fragmentos F(ab′)2, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv), intracorpos e fragmentos de ligação ao epítopo de qualquer um dos acima.

[00042] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, sem limitação, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFv); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.

[00043] Um "anticorpo que se liga" a um antígeno de interesse é aquele que se liga ao antígeno com afinidade suficiente de tal modo que o anticorpo seja útil como um reagente de ensaio, por exemplo, como um anticorpo de captura ou como um anticorpo de detecção. Normalmente, tal anticorpo não apresenta reação cruzada significativa com outros polipeptídeos. No que diz respeito à ligação de um polipeptídeo a uma molécula alvo, o termo "ligação específica" ou "especificamente se liga a" ou é "específico para" um polipeptídeo específico ou um epítopo em um alvo de polipeptídeo específico significa uma ligação que é diferente de maneira mensurável de uma interação não específica.

A ligação específica pode ser medida, por exemplo, determinando a ligação de uma molécula alvo em comparação com a ligação de uma molécula de controle, que geralmente é uma molécula de estrutura semelhante que não tem atividade de ligação.

[00044] O termo "anticorpo anti-CD20" refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a CD20 com afinidade suficiente de tal modo que o anticorpo seja útil como um agente no direcionamento de CD20, por exemplo, como um agente nos ensaios descritos no presente documento. Em uma modalidade, a extensão da ligação de um anticorpo anti-CD20 a uma proteína não-CD20 não relacionada é menos que cerca de 10% da ligação do anticorpo a CD20, conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a CD20 tem uma constante de dissociação (Kd) de ≤ 1 M, ≤ 100 mM, ≤ 10 mM, ≤ 1 mM, ≤ 100 μM, ≤ 10 μM, ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ou ≤ 0,001 nM. Em certas modalidades, a Kd de um anticorpo que se liga a CD20, divulgado neste documento, pode ser de 10-3M ou menos, ou 10-8M ou menos, por exemplo, de 10-8M a 10-13M, por exemplo, de 10-9M a 10-13M. Em certas modalidades, a Kd de um anticorpo que se liga a CD20, divulgado neste documento, pode ser de 10-10M a 10-13M. Em certas modalidades, um anticorpo anti-CD20 se liga a um epítopo de CD20 que é conservado entre CD20 de diferentes espécies.

[00045] O termo "anticorpo anti-CD3" refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a CD3 com afinidade suficiente de tal modo que o anticorpo seja útil como um agente no direcionamento de CD3, por exemplo, como um agente nos ensaios descritos no presente documento. Em uma modalidade, a extensão da ligação de um anticorpo anti-CD3 a uma proteína não-CD3 não relacionada é menos que cerca de 10% da ligação do anticorpo a CD3, conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a CD3 tem uma constante de dissociação (Kd) de ≤ 1 M, ≤ 100 mM, ≤ 10 mM, ≤ 1 mM, ≤ 100 μM, ≤ 10 μM, ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ou ≤ 0,001 nM. Em certas modalidades, a Kd de um anticorpo que se liga a CD3, divulgado neste documento, pode ser de 10-3M ou menos, ou 10-8M ou menos, por exemplo, de 10-8M a 10-13M, por exemplo, de 10-9M a 10-13M. Em certas modalidades, a Kd de um anticorpo que se liga a CD3, divulgado neste documento, pode ser de 10 -10M a 10-13M. Em certas modalidades, um anticorpo anti-CD3 se liga a um epítopo de CD3 que é conservado entre CD3 de diferentes espécies.

[00046] Por "domínio de ligação" entende-se uma parte de um composto ou uma molécula que especificamente se liga a um epítopo, antígeno, ligante ou receptor alvo. Os domínios de ligação incluem, mas não estão limitados a, anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, policlonais, recombinantes, humanizados e quiméricos), fragmentos de anticorpos ou porções dos mesmos (por exemplo, fragmentos Fab, Fab′2, anticorpos scFv, SMIP, anticorpos de domínio, diacorpos, minicorpos, scFv-Fc, aficorpos, nanocorpos e domínios VH e/ou VL de anticorpos), receptores, ligantes, aptâmeros e outras moléculas tendo um parceiro de ligação identificado.

[00047] O termo anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie em particular, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivada a partir de uma fonte ou espécie diferente.

[00048] O termo "agrupamento de diferenciação 3" ou "CD3", tal conforme usado no presente documento, refere-se a qualquer CD3 nativo a partir de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma, incluindo, por exemplo, cadeias CD3ε, CD3γ, CD3α, e CD3β.

[00049] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuída pela sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e vários destes podem ser ainda divididos em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados , , , , e , respectivamente.

[00050] Ao longo deste relatório descritivo e reivindicações, a palavra "compreender" ou variações como "compreende" ou "compreendendo" serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro declarado ou grupo de números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de inteiros.

[00051] Os termos "correlaciona" ou "correlacionando" referem-se à comparação, de qualquer forma, do desempenho e/ou resultados de uma primeira análise ou protocolo com o desempenho e/ou resultados de uma segunda análise ou protocolo. Por exemplo, pode-se usar os resultados de uma primeira análise ou protocolo na realização de um segundo protocolo e/ou pode- se usar os resultados de uma primeira análise ou protocolo para determinar se uma segunda análise ou protocolo devem ser realizados. No que diz respeito à modalidade da análise de expressão de gene ou protocolo, pode-se usar os resultados da análise de expressão de gene ou protocolo para determinar se um regime terapêutico específico deve ser realizado.

[00052] O termo "detecção" é usado neste documento para incluir medições qualitativas e quantitativas de uma molécula alvo, por exemplo, CD20 ou formas processadas do mesmo. Em certas modalidades, a detecção inclui identificar a mera presença da molécula alvo em uma amostra, bem como determinar se a molécula alvo está presente na amostra em níveis detectáveis.

[00053] O termo "meio de detecção", conforme usado neste documento, refere-se a uma fração ou técnica usada para detectar a presença do anticorpo detectável por meio de relatório de sinal que é então lido em um ensaio. Normalmente, um meio de detecção emprega reagentes, por exemplo, um agente de detecção, que amplifica um marcador imobilizado, tal como o marcador capturado em uma placa de microtitulação, por exemplo, avidina, estreptavidina-HRP ou estreptavidina-β-D-galactopiranose.

[00054] O termo “região Fc” é usado no presente documento para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma modalidade, uma região Fc de cadeia pesada de IgG humana se estende a partir de Cys226, ou de Pro230, até o terminal carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina C-terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra forma neste documento, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração da UE, também chamado de índice da UE, como descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

[00055] “Região estrutural” ("framework") ou “FR” referem-se aos resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável consiste geralmente em quatro domínios de FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Por conseguinte, as sequências de HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência na VH (ou VL): FR1-H1(L1)-FR2- H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

[00056] Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo intacto" e "anticorpo inteiro" são usados no presente documento indistintamente para referirem-se a um anticorpo tendo uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativo ou tendo cadeias pesadas que contêm uma região Fc, conforme definido neste documento.

[00057] Um "heteromultímero", "complexo heteromultimérico" ou "proteína heteromultimérica" refere-se a uma molécula que compreende pelo menos um primeiro polipeptídeo contendo dobradiça e um segundo polipeptídeo contendo dobradiça, em que o segundo polipeptídeo contendo dobradiça difere na sequência de aminoácidos do primeiro polipeptídeo contendo dobradiça por pelo menos um resíduo de aminoácido. O heteromultímero pode compreender um "heterodímero" formado pelo primeiro e segundo polipeptídeos contendo dobradiça ou pode formar estruturas terciárias de ordem superior onde polipeptídeos, além do primeiro e segundo polipeptídeos contendo dobradiça, estão presentes. Os polipeptídeos do heteromultímero podem interagir uns com os outros por uma ligação covalente não peptídica (por exemplo, ligação dissulfeto) e/ou uma interação não covalente (por exemplo, ligações de hidrogênio, ligações iônicas, forças de van der Waals e/ou interações hidrofóbicas).

[00058] Conforme usado neste documento, "domínio de heteromultimerização" refere-se a alterações ou adições a uma molécula biológica de modo a promover a formação de heteromultímero e impedir a formação de homomultímero. Qualquer domínio de heterodimerização tendo uma forte preferência para formar heterodímeros em vez de homodímeros está dentro do escopo da matéria presentemente divulgada. Os exemplos ilustrativos incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, o pedido de patente dos EUA 20030078385 (Arathoon et al. — Genentech; descrevendo "knob into holes"); WO2007147901 (Kjærgaard et al. — Novo Nordisk: descrevendo interações iônicas); WO 2009089004 (Kannan et al.-Amgen: descrevendo efeitos de direção eletrostática); Pedido de Patente Provisório dos EUA 61/243.105 (Christensen et al. — Genentech; descrevendo bobinas em espiral). Vide também, por exemplo, Pack, P. & Plueckthun, A., Biochemistry 31, 1579-1584 (1992) descrevendo o zíper de leucina ou Pack et al., Bio/Technology 11, 1271-1277 (1993) descrevendo o motivo hélice-volta-hélice. As frases "domínio de heteromultimerização" e "domínio de heterodimerização" são usadas de forma intercambiável neste documento.

[00059] Os termos "célula hospedeira", "linhagem celular hospedeira" e "cultura de células hospedeiras", conforme usados de forma intercambiável neste documento, referem-se a células nas quais o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e a descendência resultante desta, independentemente do número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica no conteúdo de ácido nucleico a uma célula-mãe, mas pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como rastreada ou selecionada na célula originalmente transformada é incluída no presente documento.

[00060] Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por uma célula humana ou humano ou derivada de uma fonte não humana que usa repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências de codificação de anticorpos humanos. Essa definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno não humanos.

[00061] Uma "estrutura de consenso humano" é uma estrutura que representa os resíduos de aminoácidos de ocorrência mais comum em uma seleção de sequências estruturais de VL ou VH de imunoglobulina humana.

Geralmente, a seleção de sequências de VL ou VH de imunoglobulina humana é a partir de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo conforme em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, NIH Publication 91-3242, Bethesda, MD, (1991), volumes 1-3. Em uma modalidade, para a VL, o subgrupo é o subgrupo kappa I, conforme em Kabat et al., supra. Em uma modalidade, para a VH, o subgrupo é o subgrupo kappa III, conforme em Kabat et al., supra.

[00062] Um anticorpo "humanizado" refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em certas modalidades, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e normalmente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, HVRs) correspondem às de um anticorpo não humano e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem às de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode compreender opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que foi submetido à humanização.

[00063] O termo "região hipervariável" ou "HVR", conforme usado neste documento, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência (também referidas neste documento como "regiões determinantes de complementaridade" ou "HVRs") e/ou formam alças estruturalmente definidas ("alças hipervariáveis") e/ou contêm os resíduos de contato com o antígeno ("contatos de antígeno"). A menos que indicado de outra forma, os resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos de FR) são numerados no presente documento de acordo com Kabat et al., supra. Geralmente, os anticorpos compreendem seis

HVRs: três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). HVRs exemplares deste documento incluem: (a) alças hipervariáveis que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); (b) HVRs que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); (c) contatos de antígeno que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) e 93- 101 (H3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996)); e (d) combinações de (a), (b), e/ou (c), incluindo resíduos de HVR de aminoácidos 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26- 35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) e 94-102 (H3).

[00064] Um "imunoconjugado" refere-se a um anticorpo conjugado a uma ou mais molécula(s) heteróloga(s), incluindo, mas não se limitando a, um agente citotóxico.

[00065] Um anticorpo “isolado” é um que foi separado de um componente do seu ambiente natural. Em certas modalidades, um anticorpo é purificado para mais de 95% ou 99% de pureza, conforme determinado por, por exemplo, eletroforese (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou cromatográfica (por exemplo, troca iônica ou HPLC de fase reversa). Para revisão dos métodos para avaliação da pureza do anticorpo, vide, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

[00066] Um "indivíduo" ou "paciente", conforme usado indistintamente neste documento, é um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados a, animais domésticos (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos,

cães e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos, tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas modalidades, o paciente ou indivíduo é um humano.

[00067] Um ácido nucleico “isolado” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada de um componente do seu ambiente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que normalmente contêm a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromossomica ou em uma localização cromossomal diferente da sua localização cromossomal natural.

[00068] O termo "ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo" (incluindo referências a um anticorpo específico) refere-se a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpo (ou fragmentos das mesmas), incluindo tal(tais) molécula(s) de ácido nucleico em um único vetor ou vetores separados, e tal(tais) molécula(s) de ácido nucleico presentes em um ou mais locais em uma célula hospedeira.

[00069] O termo “anticorpo monoclonal”, como usado no presente documento, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto para possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou surgindo durante a produção de uma preparação de um anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estando presentes em quantidades menores. Em contraste com preparações de anticorpos policlonais, que normalmente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante em um antígeno. Assim, o modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser preparados por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não se limitando a, métodos de hibridomas, métodos de DNA recombinante, métodos de apresentação em fagos e métodos que usam animais transgênicos que contenham todos ou parte dos loci de imunoglobulina humana, tais métodos e outros métodos exemplares para a preparação de anticorpos monoclonais sendo descritos neste documento.

[00070] Os termos "multiespecífico" e "biespecífico" significam que a molécula de ligação ao antígeno é capaz de especificamente se ligar a pelo menos dois determinantes antigênicos distintos. Normalmente, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende dois sítios de ligação ao antígeno, cada um dos quais é específico para um determinante antigênico diferente. Em certas modalidades, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica é capaz de simultaneamente ligar dois determinantes antigênicos, particularmente dois determinantes antigênicos expressos em duas células distintas. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico é um anticorpo biespecífico dependente de células T (TDB) que compreende um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD3 e um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno de superfície celular. Em algumas modalidades, o antígeno de superfície celular é um antígeno tumoral, por exemplo, CD20, FcRH5, HER2, CEA, LYPD1, LY6G6D, PMEL17, LY6E, CD19, CD33, CD22, CD79A, CD79B, EDAR, GFRA1, MRP4, RET, Steap1, TenB2, etc. Vide WO/2015/095392. Os TDBs envolvem e ativam as células T através do braço de ligação a CD3 e a presença de qualquer impureza do homodímero anti-CD3 (HD CD3) pode potencialmente desencadear a ativação indesejável de células T fora do alvo por meio de envolvimento bivalente e dimerização de TCR. Em certas modalidades,

o anticorpo biespecífico compreende menos que 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,1%, 0,05% ou 0,01% de homodímero. Em modalidades não limitantes, o anticorpo biespecífico é um anticorpo TDB e o homodímero é um homodímero CD3.

[00071] O termo "proteína", conforme usado neste documento, refere-se a qualquer proteína nativa de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. O termo abrange a proteína não processada de "comprimento total", bem como qualquer forma da proteína que resulta do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural da proteína, por exemplo, variantes de splice ou variantes alélicas.

[00072] Proteína ou polipeptídeo "purificados" (por exemplo, anticorpo), conforme usado neste documento, refere-se a um polipeptídeo que foi aumentado em pureza, de tal modo que ele existe em uma forma que é mais pura do que existe em seu ambiente natural e/ou quando inicialmente sintetizado e/ou amplificado sob condições de laboratório. Pureza é um termo relativo e não significa necessariamente pureza absoluta.

[00073] O termo "polipeptídeo", conforme usado neste documento, refere-se a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácidos que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como a conjugação com um componente de marcação. Estão também incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica. Os termos "polipeptídeo" e

"proteína", conforme usados neste documento, especificamente abrangem anticorpos.

[00074] Uma "amostra", conforme usado neste documento, refere- se a uma pequena porção de uma quantidade maior de material. Em certas modalidades, uma amostra inclui, mas não está limitada a, células em cultura, sobrenadantes celulares, lisados celulares, soro, plasma sanguíneo, fluido biológico (por exemplo, sangue, plasma, soro, fezes, urina, fluido linfático, ascite, lavagem ductal, saliva e fluido cefalorraquidiano) e amostras de tecido. A fonte da amostra pode ser tecido sólido (por exemplo, de um órgão fresco, congelado e/ou preservado, amostra de tecido, biópsia ou aspirado), sangue ou quaisquer constituintes do sangue, fluidos corporais (tais como, por exemplo, urina, linfa, líquido cefalorraquidiano, líquido amniótico, líquido peritoneal ou líquido intersticial) ou células do paciente, incluindo células circulantes.

[00075] Por "mistura", quando refere-se a uma mistura de dois ou mais componentes, significa que cada um dos componentes na mistura essencialmente retém sua estabilidade física e química na mistura, conforme avaliado por um ou mais ensaios analíticos. Ensaios analíticos exemplares para este propósito incluem: cor, aparência e clareza (CAC), análise de concentração e turbidez, análise de partículas, cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), cromatografia de troca iônica (IEC), eletroforese de zona capilar (CZE), focalização isoelétrica capilar de imagem (iCIEF) e ensaio de potência. Em uma modalidade, a mistura mostrou ser estável por até cerca de 8 horas, ou até cerca de 12 horas, ou até cerca de 24 horas a 5 °C ou 30 °C. Em outra modalidade, a mistura foi mostrada ser estável por pelo menos cerca de 8 horas, ou pelo menos cerca de 12 horas, ou pelo menos cerca de 24 horas a 5 °C ou 30 °C.

[00076] Conforme usado neste documento, o termo "subunidade" refere-se a um componente de um multímero (por exemplo, homodímeros e heterodímeros). A subunidade pode ser um polipeptídeo que pode ter qualquer tamanho de três aminoácidos a vários milhares de aminoácidos de comprimento.

[00077] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões estruturais (FRs) conservadas e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Vide, por exemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6ª ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007).) Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno particular podem ser isolados usando um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano et al., J.

Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

[00078] O termo “valente”, confirme usado no presente documento, denota a presença de um número específico de domínios de ligação em uma molécula de ligação ao antígeno. Como tal, o termo "ligação monovalente a um antígeno" denota a presença de um (e não mais de um) sítio de ligação ao antígeno específico para o antígeno na molécula de ligação ao antígeno.

[00079] Conforme usado neste documento, o termo "tratamento" refere-se à intervenção clínica projetada para alterar o curso natural do paciente ou célula sendo tratada durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem a prevenir a ocorrência ou recorrência de uma doença ou de uma condição ou sintoma da mesma, aliviar uma condição ou sintoma da doença, diminuir quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, diminuir a taxa de progressão da doença, melhorar ou atenuar o estado da doença, e alcançar a remissão ou prognóstico aprimorado.

Em certas modalidades, métodos e composições da presente divulgação são úteis nas tentativas de atrasar o desenvolvimento de uma doença ou distúrbio.

[00080] Uma “quantidade eficaz” de um agente refere-se à quantidade que é necessária para resultar em uma alteração fisiológica na célula ou tecido ao qual é administrada.

2. LIGANTES PARA ISOLAR E QUANTIFICAR PROTEÍNAS DE MÚLTIPLAS SUBUNIDADES

ALVO

[00081] A matéria da presente divulgação é direcionada, em certas modalidades, a ligantes que podem ser usados em um ou mais ensaios analíticos. Os ensaios analíticos da presente divulgação podem, em certas modalidades, separar, isolar e/ou quantificar uma proteína alvo. Ensaios analíticos exemplares podem incluir: cromatografia de troca iônica (IEC), eletroforese de zona capilar (CZE), focalização isoelétrica capilar de imagem (iCIEF) e ensaio de eletroforese capilar de afinidade (ACE).

[00082] Em certas modalidades, os ligantes da presente divulgação são capazes de se ligar a (o que é usado neste documento para referir-se a se ligar ou ser ligado por) uma proteína alvo. Por exemplo, um ligante pode se ligar a uma proteína alvo quando a proteína alvo está em sua conformação nativa, quando está parcialmente desdobrada ou totalmente desdobrada. De acordo com a presente divulgação, um ligante não está limitado a um agente que se liga a uma região funcional reconhecida da proteína alvo, por exemplo, o sítio ativo de uma enzima, o sítio de combinação de antígeno de um anticorpo, o sítio de ligação ao hormônio de um receptor, ou um sítio de ligação ao cofator. Em certas modalidades, o ligante pode ser um agente que se liga a sequências de superfície ou internas, bem como a domínios conformacionais da proteína alvo.

Além disso, o ligante pode se ligar a uma ou mais subunidades de uma proteína alvo (por exemplo, uma primeira subunidade ou uma segunda subunidade, ou ambas). Portanto, os ligantes da presente divulgação abrangem agentes que por si próprios podem não ter função biológica aparente, além de sua capacidade de se ligarem à proteína alvo da maneira descrita acima.

[00083] Em certas modalidades, o ligante é um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo. Em certas modalidades, o ligante compreende um epítopo ligado por uma proteína alvo (por exemplo, um anticorpo).

[00084] Em certas modalidades, o ligante é configurado para ter um marcador fluorescente (ou de outra forma detectável), uma carga alterada, massa, tamanho hidrodinâmico, mobilidade eletroforética ou combinação dos mesmos em comparação com o ligante inalterado. Em certas modalidades, o ligante é um polipeptídeo marcado com fluorescência ou um fragmento de polipeptídeo marcado com fluorescência. Em certas modalidades, o ligante é modificado pela adição de um ou mais aminoácidos a uma região de não ligação do ligante. Em certas modalidades, um ou mais aminoácidos são selecionados a partir do grupo que consiste em um ácido glutâmico, um ácido aspártico, e uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, os um ou mais aminoácidos adicionados são configurados para alterarem uma carga e uma massa do ligante.

[00085] Em certas modalidades, o ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em um polipeptídeo CD3 humano, um polipeptídeo CD3 de camundongo, um polipeptídeo CD3 de rato, um polipeptídeo CD3 de coelho e um polipeptídeo CD3 de macaco cinomolgo. Em certas modalidades, o ligante é um peptídeo CD3. Em certas modalidades, o ligante é um peptídeo CD3 tendo a sequência: Ácido Pyr DGNEEMGGITQTPYKE. Em algumas modalidades, o peptídeo CD3 pode ter a sequência: Ácido Pyr DGNEEMGGITQTPYKD, ácido Pyr DGNEEMGGITQTPYKDD ou ácido Pyr DGNEEMGGITQTPYKDDD. Em modalidades não limitantes, o ligante pode incluir qualquer ligante que pode ser reconhecido por um homodímero alvo.

[00086] Em certas modalidades, a proteína alvo pode incluir uma proteína de múltiplas subunidades. As subunidades podem ser ligadas por meio de qualquer uma ou mais ligações intermoleculares (por exemplo, ligações covalentes e não covalentes) para formar a proteína de múltiplas subunidades.

Em modalidades não limitantes, a proteína de múltiplas subunidades pode ser um anticorpo. Proteína de múltiplas subunidades exemplar pode incluir anticorpos monoclonais, imunoconjugados, anticorpos sintéticos, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab′), fragmentos F(ab′) 2, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv), intracorpos e fragmentos de ligação ao epítopo de qualquer um dos acima. Em algumas modalidades, os anticorpos podem incluir anticorpos agonistas, antagonistas e neutralizantes, bem como anticorpos desimunizados, quiméricos, humanizados e humanos e/ou anticorpos derivados de qualquer fonte animal adequada (por exemplo, de camundongos, ratos, hamsters, porquinhos-da-índia, coelhos, cabras, ovelhas, cães, cavalos, vacas, macacos, primatas e/ou galinhas).

[00087] Em certas modalidades, a proteína de múltiplas subunidades pode ser uma proteína de heterodímero. A proteína de heterodímero pode compreender pelo menos um primeiro polipeptídeo contendo dobradiça e um segundo polipeptídeo contendo dobradiça, em que o segundo polipeptídeo contendo dobradiça difere na sequência de aminoácidos do primeiro polipeptídeo contendo dobradiça em pelo menos um resíduo de aminoácido. O heterodímero pode ser formado pelo primeiro e segundo polipeptídeos contendo dobradiça ou pode formar estruturas terciárias de ordem superior onde polipeptídeos, além do primeiro e segundo polipeptídeos contendo dobradiça, estão presentes. Os polipeptídeos do heteromultímero podem interagir uns com os outros por uma ligação covalente não peptídica (por exemplo, ligação dissulfeto) e/ou uma interação não covalente (por exemplo, ligações de hidrogênio, ligações iônicas, forças de van der Waals e/ou interações hidrofóbicas). Em particular, a proteína de heterodímero pode ser anticorpos biespecíficos, os quais, como entendido por um técnico no assunto e em certas modalidades, podem ser compostos de domínios de pelo menos dois ou mais anticorpos diferentes. Em modalidades não limitantes, o anticorpo biespecífico pode compreender duas cadeias pesadas diferentes (cada uma derivada de um anticorpo diferente) e duas cadeias leves diferentes (cada uma derivada de um anticorpo diferente) e/ou pode compreender cadeias pesadas e leves, cada uma compreendendo fragmentos de dois ou mais anticorpos diferentes. Além disso, o anticorpo biespecífico pode compreender cadeias pesadas e/ou leves de anticorpos desimunizados, murinos, quiméricos, humanizados e humanos, bem como combinações de cadeias pesadas e/ou leves de anticorpos humanos desimunizados, murinos, quiméricos, humanizados e fragmentos dos mesmos (por exemplo, domínios variáveis e/ou constantes dos mesmos). O anticorpo biespecífico da presente divulgação também pode compreender fragmentos de ligação ao epítopo de anticorpos (por exemplo, mas não limitado a Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab′), fragmentos F(ab′)2 e Fvs ligados por dissulfeto (sdFv)), em particular, ligados a um ou mais domínios constantes de cadeia pesada ou leve, por exemplo, um scFv ligado a domínios CH1/CH2/CH3 de cadeia pesada. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico da presente divulgação compreende um domínio Fc. Como entendido por um técnico no assunto, a presença de um domínio Fc torna o anticorpo biespecífico passível de purificação usando frações de ligação a Fc. Como é bem reconhecido na técnica, a estrutura particular e a sequência de aminoácidos dos domínios CH1-dobradiça-CH2-CH3 das cadeias pesadas determinam o tipo e subclasse de imunoglobulina. Os anticorpos biespecíficos da presente divulgação não são de forma alguma limitados a uma estrutura de cadeia pesada ou sequência de aminoácidos específicas; consequentemente, os anticorpos biespecíficos da divulgação podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse.

[00088] Em certas modalidades, a proteína de múltiplas subunidades pode incluir uma proteína de homodímero. A proteína homodimérica pode ter pelo menos duas cadeias polipeptídicas que são idênticas ou funcionalmente equivalentes. Por exemplo, um anticorpo monoclonal CD20 ou CD3 pode incluir duas cadeias pesadas e cadeias leves idênticas. Em certas modalidades, o ligante pode se ligar à proteína de múltiplas subunidades para formar um complexo ligante-proteína. O ligante pode ter uma especificidade para um domínio de ligação da molécula de múltiplas subunidades, tal como o domínio Fc, domínio kappa ou domínio lambda. O complexo ligante-proteína pode ter pelo menos uma propriedade alterada, em comparação com a proteína de múltiplas subunidades. Em algumas modalidades, a propriedade alterada pode incluir uma carga, uma massa, um tamanho hidrodinâmico, uma mobilidade eletroforética e uma combinação dos mesmos.

3. SISTEMA PARA ISOLAR E QUANTIFICAR PROTEÍNAS DE MÚLTIPLAS SUBUNIDADES

ALVO

[00089] A presente divulgação é direcionada, em certas modalidades, a sistemas para separar proteínas, por exemplo, proteínas de múltiplas subunidades, em uma amostra. Em certas modalidades, os sistemas compreendem: a) um ligante, b) um tampão de eletrólito de fundo, c) a amostra, d) um capilar, e) um ânodo em ou próximo a uma extremidade do capilar e f) um cátodo em ou perto da outra extremidade do capilar. Em certas modalidades, o sistema compreenderá uma amostra que é misturada com o ligante para formar pelo menos um complexo ligante-proteína. Em certas modalidades, os sistemas compreendem tais complexos ligante-proteína carregados no capilar na extremidade do ânodo do capilar. Em certas modalidades, os sistemas compreendem capilares em que o capilar é preenchido com tampão de eletrólito de fundo que foi misturado com o ligante.

[00090] Em certas modalidades, os sistemas da presente divulgação compreendem ainda um detector localizado perto da extremidade do cátodo do capilar. Por exemplo, mas não como limitação, o detector detectará absorbância de luz de 210 nm a 280 nm ou fluorescência induzida por laser. Em modalidades não limitantes, o detector pode incluir um detector de fluorescência e/ou um detector de quimioluminescência. Um detector de fluorescência pode detectar um ligante marcado com uma etiqueta de fluorescência. Um detector de fluorescência pode detectar um anticorpo marcado com uma etiqueta de fluorescência.

[00091] Conforme observado acima, os sistemas da presente divulgação também compreendem uma amostra (ou são configurados para receber uma amostra). Em certas modalidades, a amostra compreende pelo menos um homodímero, pelo menos um heterodímero, ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, os sistemas da presente divulgação compreendem um primeiro complexo ligante-proteína formado quando o ligante se liga à primeira subunidade do pelo menos um heterodímero e não se liga à segunda subunidade do pelo menos um heterodímero. Em certas modalidades, os sistemas da presente divulgação compreendem um segundo complexo ligante-proteína formado quando o ligante se liga a pelo menos duas primeiras ou segundas subunidades idênticas de um homodímero. Em certas modalidades, o pelo menos um complexo ligante-proteína é configurado para ter uma carga alterada, uma massa, um tamanho hidrodinâmico, uma mobilidade eletroforética, ou uma combinação dos mesmos quando o ligante se liga às subunidades da proteína de múltiplas subunidades. Em certas modalidades, o segundo complexo ligante-proteína pode ter uma mobilidade eletroforética inferior ao primeiro complexo ligante-proteína ou vice-versa.

[00092] Em certas modalidades, os sistemas da presente divulgação compreendem um tampão de eletrólito de fundo em que o tampão de eletrólito de fundo compreende ácido amino-n-capróico (EACA), uma trietileno tetramina (TETA)

e hidroxipropilmetilcelulose (HPMC). Em modalidades não limitantes, os sistemas da presente divulgação compreendem um tampão de eletroforese capilar. Por exemplo, o tampão de eletroforese capilar compreende fosfato, formiato, citrato, acetato, piperazina-N,N′-bis(ácido 2-etanossulfônico) (PIPES), fosfato, tricina, fítico, borato/ácido bórico, Tris, ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES), ácido 4-(2- hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico (HEPES), ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico (MOPS), ácido n-ciclo-hexil-3-aminopropanossulfônico (CAPS), glicina e bicina. Vide Handbook of capillary and microchip electrophoresis and associated microtechnique, 3ª adição, Tabela 1.3 "commonly used CE buffers and their associated properties", página 25. Em algumas modalidades, os sistemas da presente divulgação compreendem aditivos de eletroforese capilar. Por exemplo, os aditivos de eletroforese capilar incluem metilcelulose, dodecil sulfato de sódio (SDS), polietilenoglicol (PEG)/óxido de polietileno (PEO) e/ou acetonitrila. Em certas modalidades, os sistemas da presente divulgação compreendem uma composição incluindo um anticorpo biespecífico que compreende menos que 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,1%, 0,05% ou 0,01% de homodímero. Em modalidades não limitantes, o anticorpo biespecífico é um anticorpo biespecífico dependente de células T (TDB) e o homodímero é um homodímero CD3. Em algumas modalidades, o anticorpo TDB compreende um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD3 e um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno de superfície celular. Os TDBs envolvem e ativam as células T através do braço de ligação a CD3 e a presença de qualquer impureza do homodímero anti-CD3 (HD CD3) pode potencialmente desencadear a ativação indesejável de células T fora do alvo por meio de envolvimento bivalente e dimerização de TCR.

4. MÉTODOS PARA ISOLAR E QUANTIFICAR PROTEÍNAS DE MÚLTIPLAS SUBUNIDADES ALVO

[00093] A presente divulgação é direcionada, em certas modalidades, a métodos para separar proteínas, por exemplo, proteínas de múltiplas subunidades, em uma amostra. Em certas modalidades, os métodos compreendem as etapas de:

(a) criar uma mistura da amostra compreendendo pelo menos uma proteína e um ligante para formar pelo menos um complexo ligante-proteína, (b) aplicar a mistura a um capilar, em que o capilar é preenchido com um tampão de eletrólito de fundo misturado com o ligante, (c) aplicar uma voltagem através do capilar, e (d) permitir que a proteína (por exemplo, uma proteína de múltiplas subunidades) e o pelo menos um complexo ligante-proteína se movam através do capilar. Em certas modalidades, o complexo ligante-proteína é configurado para ter uma carga alterada, massa, tamanho hidrodinâmico, mobilidade eletroforética, ou uma combinação dos mesmos após a ligação do ligante. Em certas modalidades, tal alteração facilita a separação das proteínas na amostra.

[00094] A presente divulgação é direcionada, em certas modalidades, a métodos para isolar uma proteína alvo em uma mistura de amostra que compreende as etapas de: (a) criar uma mistura de uma amostra compreendendo uma proteína e um ligante para formar pelo menos um complexo ligante-proteína, (b) aplicar a mistura a um capilar, em que o capilar é preenchido com um tampão de eletrólito de fundo misturado com o ligante, (c) aplicar uma voltagem através do capilar, (d) permitir que as proteínas e o pelo menos um complexo ligante-proteína se movam através do capilar. Em certas modalidades, o complexo ligante-proteína é configurado para ter uma carga alterada, massa, tamanho hidrodinâmico, mobilidade eletroforética, ou uma combinação dos mesmos após a ligação do ligante à proteína. Em certas modalidades, o método compreende ainda isolar a proteína alvo, que foi separada das proteínas não alvo presentes na amostra.

[00095] Em certas modalidades, os métodos da presente divulgação empregam um capilar, em que o capilar compreende uma extremidade do cátodo, uma extremidade do ânodo e um detector. Em certas modalidades, o detector está perto da extremidade do cátodo do capilar e detecta absorbância de luz de 210 nm a 280 nm ou fluorescência induzida por laser. Em certas modalidades, a voltagem pode ser de até 30 quilovolts. Em modalidades não limitantes, o comprimento do capilar pode aumentar para aprimorar a separação da molécula alvo em uma amostra.

[00096] Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos em que a amostra a ser analisada compreende pelo menos um homodímero, pelo menos um heterodímero, ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o pelo menos um heterodímero compreende uma primeira subunidade e uma segunda subunidade distinta. Em certas modalidades, o pelo menos um homodímero compreende pelo menos duas primeiras ou segundas subunidades idênticas. Em certas modalidades, o pelo menos um heterodímero é um anticorpo biespecífico. Em certas modalidades, o pelo menos um homodímero é um anticorpo monoclonal.

[00097] Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos em que um primeiro complexo ligante-proteína é formado onde um ligante se liga a uma primeira subunidade do pelo menos um heterodímero dos métodos descritos acima e o ligante não se liga à segunda subunidade do pelo menos um heterodímero. Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos em que um segundo complexo ligante-proteína é formado quando o ligante descrito acima se liga a pelo menos duas primeiras ou segundas subunidades idênticas de um homodímero.

[00098] Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos em que o tampão de eletrólito de fundo compreende ácido amino-n-capróico (EACA), uma trietileno tetramina (TETA) e hidroxipropilmetilcelulose (HPMC). Em certas modalidades, o tampão de eletrólito de fundo compreende o ligante que se liga a uma primeira subunidade do pelo menos um heterodímero dos métodos descritos acima e não se liga à segunda subunidade do pelo menos um heterodímero.

[00099] Em certas modalidades, os métodos da presente divulgação podem compreender o uso de tampões específicos e/ou outras etapas para minimizar a oligomerização de proteínas indesejável. Por exemplo, mas não como limitação, certas proteínas presentes na amostra em análise, por exemplo, as espécies de homodímero anti-CD3 e anti-CD20 descritas no exemplo abaixo, podem formar espécies de oligômero de alto peso molecular.

Em certas modalidades, tais espécies de oligômero podem comigrar com a proteína de interesse ou de outra forma impedir a utilidade do ensaio. Em certas modalidades, por exemplo, quando é desejável medir todos os homodímeros em uma solução, tais espécies de oligômero podem ser dissociadas antes da separação. Isso pode ser alcançado, em certas modalidades, preparando amostras em um tampão com pH baixo ou um tampão com pH alto. Em modalidades não limitantes, a ureia pode ser adicionada a uma solução para dissociar as espécies de oligômero de alto peso molecular antes da separação.

Em algumas modalidades, a concentração da solução (por exemplo, tampão de fundo, tampão de eletroforese capilar e/ou aditivos de eletroforese capilar) pode aumentar para minimizar a oligomerização de proteínas indesejável. Estas condições mostraram ser suficientes para dissociar o oligômero, mas moderadas o suficiente para manter a formação do complexo ligante-proteína, sem desnaturar a estrutura da proteína, por exemplo, BsAb.

[000100] Em certas modalidades, os métodos da presente divulgação podem compreender o uso de tampões específicos e/ou outras etapas para minimizar variantes carregadas indesejáveis da proteína de interesse. Por exemplo, mas não a título de limitação, certas proteínas presentes na amostra em análise, por exemplo, o HD anti-CD3 descrito no exemplo abaixo, podem exibir variação de carga. Em certas modalidades, tal variação de carga é dependente do pH. Em certas modalidades, o uso de certos tampões pode induzir variações de conformação que resultam em diferenças observáveis no tamanho hidrodinâmico. Por conseguinte, em certas modalidades, é desejável preparar amostras em um tampão que irá minimizar tal variação de carga ou variação conformacional. Por exemplo, mas não como limitação, um tampão com pH 3,5 pode, em certas modalidades, ser empregado para conduzir a espécie de proteína a um único estado com pH baixo. Em certas modalidades, isso é desejável, pois pode melhorar a relação sinal-ruído, diminuindo assim o limite de quantificação do ensaio. Em certas modalidades, no entanto, um tampão de HEPES com pH 7,5, por exemplo, um tampão de HEPES de 10 mM em pH 7,5 em conjunto com 0,1% de PS20, pode ser empregado para conduzir a espécie de proteína a um único estado. Em certas modalidades, isso é desejável, pois pode melhorar a relação sinal-ruído, diminuindo assim o limite de quantificação do ensaio.

[000101] Em certas modalidades, os métodos da presente divulgação podem compreender o uso de tampões específicos e/ou outras etapas para minimizar a absorção de superfície da proteína. Por exemplo, mas não como limitação, certas proteínas presentes na amostra em análise, por exemplo, o HD anti-CD3 descrito no Exemplo abaixo, podem exibir absorção de superfície indesejável. Tal absorção de superfície, por exemplo, nas paredes do frasco, pode resultar em recuperações mais baixas da área de pico do homodímero anti-CD3. Para controlar tal adsorção e aprimorar a recuperação, os métodos da presente divulgação podem incluir um detergente, por exemplo, cerca de 0,1% a cerca de 0,4% de Polissorbato 20 (PS20), na amostra. Em certas modalidades, os métodos da presente divulgação podem incluir surfactantes onde os surfactantes podem compreender tween 80, poloxamer 188 (p188), triton, SDS, Brij, PEO/PEG e/ou glicerol. Em modalidades não limitantes, os métodos da presente divulgação podem incluir caótropos, tais como sacarose, HCl de guanidina e/ou ciclodextrinas (por exemplo, vários isotipos).

[000102] Em certas modalidades, a presente divulgação é direcionada a métodos que compreendem ainda quantificar a quantidade da proteína alvo na amostra.

[000103] Além das várias modalidades representadas e reivindicadas, a matéria divulgada também é direcionada a outras modalidades com outras combinações das características divulgadas e reivindicadas neste documento. Como tal, os recursos apresentados neste documento podem ser combinados entre si de outras maneiras dentro do escopo da matéria divulgada, de modo que a matéria divulgada inclua qualquer combinação adequada dos recursos divulgados neste documento. A descrição anterior de modalidades específicas da matéria divulgada foi apresentada para fins de ilustração e descrição. Não se destina a ser exaustivo ou a limitar a matéria divulgada às modalidades divulgadas.

[000104] Será evidente para aqueles técnicos no assunto que várias modificações e variações podem ser feitas nas composições e métodos da matéria divulgada sem se afastar do espírito ou escopo da matéria divulgada.

Assim, pretende-se que a matéria divulgada inclua modificações e variações que estão dentro do escopo das reivindicações anexas e seus equivalentes.

[000105] Várias publicações, patentes e pedidos de patentes são citados neste documento, cujos conteúdos são incorporados neste documento por referência em sua totalidade.

MODALIDADES DA DIVULGAÇÃO

[000106] A seguir estão modalidades não limitantes da presente divulgação.

[000107] 1. Sistema para separar proteínas de múltiplas subunidades em uma amostra, compreendendo: a) um ligante, b) um tampão de eletrólito de fundo, c) a amostra, d) um capilar, e) um ânodo em ou próximo a uma extremidade do capilar e f) um cátodo em ou próximo à outra extremidade do capilar, em que a amostra é misturada com o ligante para formar pelo menos um complexo ligante-proteína carregado no capilar na extremidade do ânodo do capilar e em que o capilar é preenchido com o tampão de eletrólito de fundo misturado com o ligante.

[000108] 2. Sistema, de acordo com a modalidade 1, compreendendo ainda um detector localizado perto da extremidade do cátodo do capilar, em que o detector detecta absorbância de luz de 210 nm a 220 nm ou fluorescência induzida por laser.

[000109] 3. Sistema, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 2, em que a amostra compreende pelo menos um homodímero, pelo menos um heterodímero, ou uma combinação dos mesmos.

[000110] 4. Sistema, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que um primeiro complexo ligante-proteína é formado quando o ligante se liga à primeira subunidade do pelo menos um heterodímero e não se liga à segunda subunidade do pelo menos um heterodímero.

[000111] 5. Sistema, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que um segundo complexo ligante-proteína é formado quando o ligante se liga a pelo menos duas primeiras ou segundas subunidades idênticas do homodímero.

[000112] 6. Sistema, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que o pelo menos um complexo ligante-proteína é configurado para ter uma carga alterada, uma massa, um tamanho hidrodinâmico, uma mobilidade eletroforética, ou uma combinação dos mesmos quando o ligante se liga às subunidades da proteína de múltiplas subunidades.

[000113] 7. Sistema, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 6, em que o segundo complexo ligante-proteína tem uma mobilidade eletroforética inferior ao primeiro complexo ligante-proteína.

[000114] 8. Sistema, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que o ligante é um peptídeo ou um fragmento de peptídeo.

[000115] 9. Sistema, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8, em que o ligante é um peptídeo marcado com fluorescência ou um fragmento de peptídeo marcado com fluorescência.

[000116] 10. Sistema, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em um peptídeo CD3 humano, um peptídeo CD3 de camundongo, um peptídeo CD3 de rato, um peptídeo CD3 de coelho e um peptídeo CD3 de macaco cinomolgo.

[000117] 11. Sistema, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 10, em que o ligante é modificado pela adição de um ou mais aminoácidos a uma região de não ligação do ligante.

[000118] 12. Sistema, de acordo com a modalidade 11, em que os um ou mais aminoácidos são selecionados a partir do grupo que consiste em um ácido glutâmico, um ácido aspártico, e uma combinação dos mesmos.

[000119] 13. Sistema, de acordo com qualquer uma das modalidades 11 a 12, em que os um ou mais aminoácidos adicionados são configurados para alterar uma carga e uma massa do ligante.

[000120] 14. Sistema, de acordo com qualquer uma das modalidades 11 a 13, em que a amostra é ainda misturada com o ligante em: (A) um tampão de ureia com pH baixo; ou (B) um tampão de HEPES com pH alto em combinação com 0,1% de Polissorbato 20.

[000121] 15. Sistema, de acordo com qualquer uma das modalidades 11 a 14, em que o tampão de eletrólito de fundo compreende ácido amino-n-capróico (EACA), uma trietileno tetramina (TETA) e hidroxipropilmetilcelulose (HPMC).

[000122] 16. Método para separar proteínas de múltiplas subunidades em uma amostra, compreendendo as etapas de: (a) criar uma mistura da amostra e de um ligante para formar pelo menos um complexo ligante-proteína, (b) aplicar a mistura a um capilar, em que o capilar é preenchido com um tampão de eletrólito de fundo misturado com o ligante, (c) aplicar uma voltagem através do capilar e (d) permitir que as proteínas de múltiplas subunidades e o pelo menos um complexo ligante-proteína se movam através do capilar, em que o complexo ligante-proteína é configurado para ter uma carga alterada, uma massa, um tamanho hidrodinâmico, uma mobilidade eletroforética, ou uma combinação dos mesmos quando o ligante se liga às subunidades da proteína de múltiplas subunidades para, assim, separar as proteínas de múltiplas subunidades na amostra.

[000123] 17. Método para isolar uma proteína alvo em uma mistura de amostra, compreendendo as etapas de: (a) criar uma mistura da amostra e de um ligante para formar pelo menos um complexo ligante-proteína, (b) aplicar a mistura a um capilar, em que o capilar é preenchido com um tampão de eletrólito de fundo misturado com o ligante, (c) aplicar uma voltagem através do capilar, (d) permitir que as proteínas de múltiplas subunidades e o pelo menos um complexo ligante-proteína se movam através do capilar, em que o complexo ligante-proteína é configurado para ter uma carga alterada, uma massa, um tamanho hidrodinâmico, uma mobilidade eletroforética, ou uma combinação dos mesmos quando o ligante se liga às subunidades da proteína de múltiplas subunidades, e (e) isolar a proteína alvo, que é separada das proteínas não alvo.

[000124] 18. Método, de acordo com as modalidades 16 ou 17, em que o capilar compreende uma extremidade do cátodo, uma extremidade do ânodo e um detector.

[000125] 19. Método, de acordo com a modalidade 18, em que o detector está próximo à extremidade do cátodo do capilar e detectar absorbância de luz de 210 nm a 220 nm ou fluorescência induzida por laser.

[000126] 20. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 16 a 19, em que a voltagem é de 30 quilovolts.

[000127] 21. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 16 a 20, em que a amostra compreende pelo menos um homodímero, pelo menos um heterodímero ou combinação dos mesmos, em que o pelo menos um heterodímero compreende uma primeira subunidade e uma segunda subunidade, e o pelo menos um homodímero compreende pelo menos duas primeiras ou segundas subunidades idênticas.

[000128] 22. Método, de acordo com a modalidade 21, em que o pelo menos um heterodímero compreende um anticorpo biespecífico.

[000129] 23. Método, de acordo com a modalidade 21, em que o pelo menos um homodímero compreende um anticorpo monoclonal.

[000130] 24. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 16 a 23, em que o ligante é um peptídeo ou um fragmento de peptídeo.

[000131] 25. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 16 a 24, em que o ligante é um peptídeo marcado com fluorescência ou um fragmento de peptídeo marcado com fluorescência.

[000132] 26. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 16 a 24, em que o ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em um peptídeo CD3 humano, um peptídeo CD3 de camundongo, um peptídeo CD3 de rato, um peptídeo CD3 de coelho e um peptídeo CD3 de macaco cinomolgo.

[000133] 27. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 16 a 24, em que o ligante é configurado para ser modificado pela adição de um ou mais aminoácidos a uma região de não ligação do ligante.

[000134] 28. Método, de acordo com a modalidade 27, em que os um ou mais aminoácidos são selecionados a partir do grupo que consiste em um ácido glutâmico, um ácido aspártico, e uma combinação dos mesmos.

[000135] 29. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 27 a 28, em que os um ou mais aminoácidos adicionados são configurados para alterar uma carga e uma massa do ligante.

[000136] 30. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 16 a 29, em que um primeiro complexo ligante-proteína é formado quando o ligante se liga à primeira subunidade do pelo menos um heterodímero e não se liga à segunda subunidade do pelo menos um heterodímero.

[000137] 31. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 16 a 30, em que um segundo complexo ligante-proteína é formado quando o ligante se liga a pelo menos duas primeiras ou segundas subunidades idênticas do homodímero.

[000138] 32. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 16 a 31, compreendendo ainda: (A) misturar um tampão de ureia com pH baixo à mistura da amostra e do ligante; ou (B) misturar um tampão de HEPES com pH alto em combinação com 0,1% de Polissorbato 20 à mistura da amostra e do ligante.

[000139] 33. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 16 a 32, em que o tampão de eletrólito de fundo compreende ácido amino-n-capróico (EACA), uma trietileno tetramina (TETA) e hidroxipropilmetilcelulose (HPMC).

[000140] 34. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 16 a 33, compreendendo ainda quantificar a quantidade da proteína alvo na amostra.

[000141] 35. Ligante de eletroforese capilar de afinidade compreendendo uma região de ligação, em que a referida região de ligação se liga ou está ligada por uma proteína de interesse e uma modificação, em que a referida modificação facilita o isolamento da proteína de interesse.

[000142] 36. Ligante, de acordo com a modalidade 35, em que a proteína de interesse é um homodímero.

[000143] 37. Ligante, de acordo com a modalidade 35, em que a proteína de interesse é um heterodímero.

[000144] 38. Ligante, de acordo com a modalidade 35, em que a região de ligação é um polipeptídeo.

[000145] 39. Ligante, de acordo com a modalidade 35, em que a região de ligação é uma molécula pequena.

[000146] 40. Ligante, de acordo com a modalidade 35, em que a modificação é a adição de um marcador fluorescente ou a adição de um ou mais aminoácidos ao ligante.

[000147] 41. Ligante, de acordo com a modalidade 35, em que a modificação fornece um marcador fluorescente, uma carga alterada, massa, tamanho hidrodinâmico, mobilidade eletroforética, ou uma combinação dos mesmos quando o ligante se liga à proteína alvo.

EXEMPLO

[000148] Os exemplos a seguir são meramente ilustrativos da matéria divulgada atualmente e não devem ser considerados como limitantes de forma alguma.

EXEMPLO 1: MÉTODO DE ELETROFORESE CAPILAR DE AFINIDADE (ACE) ALTAMENTE

ESPECÍFICA PARA DETECÇÃO DE HOMODÍMEROS EM PRODUTOS BIESPECÍFICOS

[000149] Neste exemplo, a especificidade e afinidade do alvo BsAb para o antígeno foram exploradas para alcançar uma separação com base nas diferenças na mobilidade eletroforética usando eletroforese de zona capilar (CZE).

MATERIAIS E MÉTODOS

[000150] As amostras de proteínas foram preparadas de tal modo que a amostra final contenha 3 g/L de proteína, 50 mM de formiato, 2M de ureia, 0,1% de PS20 e 50 µM de peptídeo CD3, pH 3,5 ("Prep de pH baixo") ou 3 g/L de proteína, 10mM de HEPES, 0,1% de PS20 e 50 µM de peptídeo CD3, pH 7,5 ("Prep de pH alto”).

[000151] As proteínas foram separadas por CZE usando um instrumento Sciex PA800 Plus equipado com um detector de UV e filtro de 214 nm. A separação foi realizada em cartucho capilar com cartucho de 20/30 cm (comprimento capilar até o detector/comprimento total). O capilar em si era um capilar de sílica fundida sem revestimento com um diâmetro interno de 50 µm.

[000152] As amostras foram separadas de acordo com as estratégias convencionais do processo CZE, exceto conforme descrito neste documento. Em suma, as amostras são injetadas usando uma injeção de pressão por 20 segundos a 0,5 psi. As amostras são separadas aplicando uma tensão de 30 kV por 30 minutos. O eletrólito de fundo contém 400 mM de tampão de ácido amino-n-capróico (EACA) com 2 mM de trietileno tetramina (TETA), 0,5% de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) e 50 µM de peptídeo CD3, a pH 5,7.

RESULTADOS

[000153] Desempenho do Método CZE: Na eletroforese de zona capilar clássica, as espécies migram e se separam com base nas diferenças de velocidade sob a influência de um campo elétrico aplicado. Como o homodímero e as espécies biespecíficas (Figura 1) são altamente semelhantes em ambas as propriedades de carga e tamanho hidrodinâmico, a separação dessas espécies por esses métodos CZE pode ser insuficiente (Figuras 2 e 3).

[000154] ACE com o peptídeo CD3: Aplicando os princípios de afinidade CZE, um peptídeo CD3 foi adicionado à mistura da amostra para alcançar separação adicional entre essas espécies (Figura 2). Quando o peptídeo foi misturado com a amostra antes da separação, o tempo de migração das espécies de ligação a CD3 alterou devido à alteração aparente na carga ou no tamanho hidrodinâmico, ou uma combinação de ambos. No entanto, o perfil de separação resultante mostra um formato de pico pobre que é consistente com a ligação incompleta. Isso também pode ser devido a uma maior constante de dissociação para o complexo de peptídeo anti-CD3-CD3.

[000155] Para aprimorar o formato de pico e conduzir à ligação completa e sustentada do peptídeo CD3, o peptídeo foi incluído tanto na amostra como no eletrólito de fundo a uma concentração de 50 µM (Figura 4).

[000156] Modificando o peptídeo CD3: Conforme mostrado na Figura 4, o uso do peptídeo CD3 resultou na separação entre o HD anti-CD3 e o anticorpo biespecífico. Essas espécies, no entanto, não foram totalmente (ou inicialmente) resolvidas. Como a quantificação precisa de baixo nível do homodímero anti-CD3 era desejada, foi buscada resolução adicional entre as duas espécies. Para conseguir isso, o peptídeo CD3 foi modificado pela adição de vários aminoácidos de baixo ponto isoelétrico (pI) (por exemplo, ácido glutâmico e ácido aspártico) ao N- terminal de não ligação do peptídeo. Este processo adiciona efetivamente carga e massa ao peptídeo e, em última análise, altera a carga e a massa do complexo peptídeo-anticorpo ligado.

[000157] O peptídeo CD3 foi modificado usando várias etiquetas de aminoácidos, incluindo a adição de um ácido glutâmico, bem como de um, dois e três ácidos aspárticos (Figura 5A). Esses peptídeos foram então usados na separação ACE que é apresentada na Figura 5B. Quanto maior a carga e a contribuição de massa do peptídeo CD3, maior a resolução entre as espécies. Esses peptídeos CD3 modificados, no entanto, também proporcionaram maior separação dentro de variantes carregadas de homodímero e espécies biespecíficas. Esta resolução aumentada dentro das diferentes variantes carregadas do homodímero diminui o sinal geral para a razão de ruído dos picos de homodímero, tornando a integração desta região mais desafiadora e, em última análise, diminuindo a sensibilidade e o limite de quantificação do ensaio. Como tal, as modificações no peptídeo forneceram equilíbrio entre alcançar resolução suficiente para minimizar a interferência do biespecífico e maximizar o sinal da espécie de homodímero anti-CD3.

Por exemplo, e não como limitação, a única etiqueta de ácido glutâmico (ou seja, CD3-E) forneceu separação adequada entre as espécies anti-CD20 e anti-CD3, sem comprometer a sensibilidade e, como tal, foi selecionada para este ensaio (Figura 6).

[000158] Tratamento da amostra de ureia e com pH baixo: Descobriu-se que as espécies de homodímero anti-CD3 e anti-CD20 formam uma espécie de oligômero de alto peso molecular quando presentes em solução juntas (Figura 9). Esse oligômero comigrou com o BsAb e não foi detectável por este ensaio de afinidade de uma maneira quantificável. Especificamente, o oligômero de alto peso molecular foi detectado indiretamente por meio do desaparecimento de aCD3 HD conforme HD aCD20 é adicionado à amostra. Como o oligômero de alto peso molecular e o BsAb comigram, as espécies de oligômero de alto peso molecular não foram quantificáveis na presença de BsAb. Para medir todas as espécies de homodímeros em solução, esses oligômeros precisam ser dissociados antes da separação. Isso foi alcançado preparando amostras em um tampão com pH baixo com 2M de ureia. Estas condições mostraram dissociar o oligômero, mas suaves o suficiente para manter a formação do complexo peptídeo-anticorpo e sem desnaturar a estrutura de BsAb.

[000159] Além disso, as variantes carregadas do HD anti-CD3 mostraram ser dependentes do pH. A carga do BsAb (e variantes de carga associadas) pode ter um estado de carga geral diferente e distribuição de carga em função do pH. O estado geral de carga (por exemplo, número total de cargas) e a localização de carga (por exemplo, campo de carga, enterrada, exposta ao solvente) podem ser diferentes entre condições com pH alto e baixo. Ao preparar amostras em um tampão de pH 3,5, as espécies são direcionadas para uma única conformação com pH baixo. Isso aprimora a relação sinal-ruído, diminuindo assim o limite de quantificação do ensaio (Figura 7).

[000160] pH alto e 0,1% de PS20 na matriz da amostra para aprimorar a recuperação de HDaCD3: O HD anti-CD3 demonstrou ser adsorvido ao frasco ao longo do tempo, resultando em menores recuperações da área de pico do homodímero anti-CD3. Para controlar a adsorção e melhorar a recuperação de anti-CD3-HD, 0,1% de Polissorbato 20 (PS20) foi adicionado à matriz da amostra.

(Figura 8).

[000161] Identificação indireta de pico na região anti-CD3 por meio de impurezas aumentadas (Figuras 10A-10B). Com um tampão de amostra de HEPES de 10 mM em pH 7,5 e 0,1% de PS20, a resolução aprimorada foi observada entre BsAb, meio mAb aB e homodímero (Figura 10A), incluindo após permitir tempo para a conversão completa para uma conformação com pH alto (Figura 10B).

[000162] A formação de oligômeros por interação de dois homodímeros foi observada em ACE e cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). Por exemplo, a ACE mostrou que os HDs anti-CD3 e anti-CD20 podem interagir e formar novos picos que comigram com o BsAb (Figura 11). Os picos próximos, "Complexo HD" ou "Oligômero", comigram com o BsAb em ACE, mas migram em formas de alto peso molecular por SEC. Portanto, por SEC, eles não comigram com o BsAb, eles migram antes do BsAb juntamente com outras formas ou agregados de alto peso molecular. Por SEC, no entanto, os complexos HD não são distinguíveis de outros agregados relacionados com o BsAb. Tal interação foi evitada por pH baixo e ureia. Por exemplo, a interação de anti-CD3 e anti-CD20 HDs foi evitada e dissociada por pH baixo (por exemplo, pH 3,5) e ureia (Figura 12). O tratamento com baixo pH revela um homodímero que foi previamente oligomerizado e indetectável por outros métodos (Figura 13).

[000163] Além disso, várias modificações podem ser realizadas para aprimorar o desempenho da eletroforese capilar de afinidade. Por exemplo, conforme mostrado na Figura 14, a concentração do tampão de fundo pode aumentar com/sem modificações da amostra (por exemplo, ajuste de pH, tratamento de ps20, adição de ligantes, tratamento de ureia e etc.) A Figura 14 representa um método exemplar de eletroforese capilar de afinidade com pH baixo. Os sistemas e métodos divulgados forneceram um desempenho aprimorado de ACE (Figura 15).

Claims (41)

REIVINDICAÇÕES

1. SISTEMA PARA SEPARAR PROTEÍNAS DE MÚLTIPLAS SUBUNIDADES EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender: a) um ligante, b) um tampão de eletrólito de fundo, c) a amostra, d) um capilar, e) um ânodo em ou próximo a uma extremidade do capilar, e f) um cátodo em ou próximo da outra extremidade do capilar, em que a amostra é misturada com o ligante para formar pelo menos um complexo ligante-proteína e carregado no capilar na extremidade do ânodo do capilar, e em que o capilar é preenchido com o tampão de eletrólito de fundo misturado com o ligante.

2. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente um detector localizado próximo à extremidade do cátodo do capilar, em que o detector detecta absorbância de luz de 210 nm a 220 nm ou fluorescência induzida por laser.

3. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela amostra compreender pelo menos um homodímero, pelo menos um heterodímero, ou uma combinação dos mesmos.

4. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por um primeiro complexo ligante-proteína ser formado quando o ligante se liga à primeira subunidade do pelo menos um heterodímero e não se liga à segunda subunidade do pelo menos um heterodímero.

5. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por um segundo complexo ligante-proteína ser formado quando o ligante se liga a pelo menos duas primeiras ou segundas subunidades idênticas do homodímero.

6. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por pelo menos um complexo ligante-proteína ser configurado para ter uma carga alterada, uma massa, um tamanho hidrodinâmico, uma mobilidade eletroforética, ou uma combinação dos mesmos quando o ligante se liga às subunidades da proteína de múltiplas subunidades.

7. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo segundo complexo ligante-proteína ter uma mobilidade eletroforética inferior ao primeiro complexo ligante-proteína.

8. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo ligante ser um peptídeo ou um fragmento de peptídeo.

9. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo ligante ser um peptídeo marcado com fluorescência ou um fragmento de peptídeo marcado com fluorescência.

10. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo ligante ser selecionado a partir do grupo que consiste em um peptídeo CD3 humano, um peptídeo CD3 de camundongo, um peptídeo CD3 de rato, um peptídeo CD3 de coelho, e um peptídeo CD3 de macaco cinomolgo.

11. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo ligante ser modificado pela adição de um ou mais aminoácidos a uma região de não ligação do ligante.

12. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelos um ou mais aminoácidos serem selecionados a partir do grupo que consiste em um ácido glutâmico, um ácido aspártico, e uma combinação dos mesmos.

13. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12, caracterizado pelos um ou mais aminoácidos adicionados serem configurados para alterar uma carga e uma massa do ligante.

14. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pela amostra ser adicionalmente misturada com o ligante em: (A) um tampão de ureia com pH baixo; ou (B) um tampão de HEPES com pH alto em combinação com 0,1% de Polissorbato 20.

15. SISTEMA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo tampão de eletrólito de fundo compreender ácido amino-n-capróico (EACA), uma trietileno tetramina (TETA) e hidroxipropilmetilcelulose (HPMC).

16. MÉTODO PARA SEPARAR PROTEÍNAS DE MÚLTIPLAS SUBUNIDADES EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender as etapas de: (a) criar uma mistura da amostra e de um ligante para formar pelo menos um complexo ligante-proteína, (b) aplicar a mistura a um capilar, em que o capilar é preenchido com um tampão de eletrólito de fundo misturado com o ligante, (c) aplicar uma voltagem através do capilar, e (d) permitir que as proteínas de múltiplas subunidades e o pelo menos um complexo ligante-proteína se movam através do capilar, em que o complexo ligante-proteína é configurado para ter uma carga alterada, uma massa, um tamanho hidrodinâmico, uma mobilidade eletroforética, ou uma combinação dos mesmos quando o ligante se liga às subunidades da proteína de múltiplas subunidades para, assim, separar as proteínas de múltiplas subunidades na amostra.

17. MÉTODO PARA ISOLAR UMA PROTEÍNA ALVO EM UMA MISTURA DE AMOSTRA, caracterizado por compreender as etapas de: (a) criar uma mistura da amostra e de um ligante para formar pelo menos um complexo ligante-proteína,

(b) aplicar a mistura a um capilar, em que o capilar é preenchido com um tampão de eletrólito de fundo misturado com o ligante, (c) aplicar uma voltagem através do capilar, (d) permitir que as proteínas de múltiplas subunidades e o pelo menos um complexo ligante-proteína se movam através do capilar, em que o complexo ligante-proteína é configurado para ter uma carga alterada, uma massa, um tamanho hidrodinâmico, uma mobilidade eletroforética, ou uma combinação dos mesmos quando o ligante se liga às subunidades da proteína de múltiplas subunidades, e (e) isolar a proteína alvo, que é separada das proteínas não alvo.

18. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 17, caracterizado pelo capilar compreender uma extremidade do cátodo, uma extremidade do ânodo e um detector.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo detector estar perto da extremidade do cátodo do capilar e detectar absorbância de luz de 210 nm a 220 nm ou fluorescência induzida por laser.

20. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pela voltagem ser 30 quilovolts.

21. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizado pela amostra compreender pelo menos um homodímero, pelo menos um heterodímero, ou uma combinação dos mesmos, em que o pelo menos um heterodímero compreende uma primeira subunidade e uma segunda subunidade, e o pelo menos um homodímero compreende pelo menos duas primeiras ou segundas subunidades idênticas.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o pelo menos um heterodímero compreender um anticorpo biespecífico.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o pelo menos um homodímero compreender um anticorpo monoclonal.

24. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 23, caracterizado pelo ligante ser um peptídeo ou um fragmento de peptídeo.

25. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 24, caracterizado pelo ligante ser um peptídeo marcado com fluorescência ou um fragmento de peptídeo marcado com fluorescência.

26. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 24, caracterizado pelo ligante ser selecionado a partir do grupo que consiste em um peptídeo CD3 humano, um peptídeo CD3 de camundongo, um peptídeo CD3 de rato, um peptídeo CD3 de coelho, e um peptídeo CD3 de macaco cinomolgo.

27. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 24, caracterizado pelo ligante ser configurado para ser modificado pela adição de um ou mais aminoácidos a uma região de não ligação do ligante.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelos um ou mais aminoácidos serem selecionados a partir do grupo que consiste em um ácido glutâmico, um ácido aspártico, e uma combinação dos mesmos.

29. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 28, caracterizado pelos um ou mais aminoácidos adicionados serem configurados para alterar uma carga e uma massa do ligante.

30. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 29, caracterizado por um primeiro complexo ligante-proteína ser formado quando o ligante se liga à primeira subunidade do pelo menos um heterodímero e não se liga à segunda subunidade do pelo menos um heterodímero.

31. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 30, caracterizado por um segundo complexo ligante-proteína ser formado quando o ligante se liga a pelo menos duas primeiras ou segundas subunidades idênticas do homodímero.

32. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 31, caracterizado por compreender ainda: (A) misturar um tampão de ureia com pH baixo à mistura da amostra e do ligante; ou (B) misturar um tampão de HEPES com pH alto em combinação com 0,1% de Polissorbato 20 à mistura da amostra e do ligante.

33. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 32, caracterizado pelo tampão de eletrólito de fundo compreender ácido amino-n-capróico (EACA), uma trietileno tetramina (TETA) e hidroxipropilmetilcelulose (HPMC).

34. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 33, caracterizado por compreender ainda quantificar a quantidade da proteína alvo na amostra.

35. LIGANTE DE ELETROFORESE CAPILAR DE AFINIDADE, caracterizado por compreender uma região de ligação, em que a referida região de ligação se liga ou está ligada por uma proteína de interesse e uma modificação, em que a referida modificação facilita o isolamento da proteína de interesse.

36. LIGANTE, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pela proteína de interesse ser um homodímero.

37. LIGANTE, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pela proteína de interesse ser um heterodímero.

38. LIGANTE, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pela região de ligação ser um polipeptídeo.

39. LIGANTE, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pela região de ligação ser uma molécula pequena.

40. LIGANTE, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pela modificação ser a adição de um marcador fluorescente ou a adição de um ou mais aminoácidos ao ligante.

41. LIGANTE, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pela modificação fornecer um marcador fluorescente ou uma carga alterada, massa, tamanho hidrodinâmico, mobilidade eletroforética, ou uma combinação dos mesmos quando o ligante se liga à proteína alvo.

Petição 870210022468, de 09/03/2021, pág. 122/138 Produto pretendido: Potenciais impurezas relacionadas ao produto:

Anticorpo Meio Anticorpo Homodímero Homodímero Meio Anticorpo Biespecífico Anti-CD20 Anti-CD20 Anti-CD3 Anti-CD3 Anti-CD20/CD3 1/16

Propriedades físico-químicas semelhantes (pl, MW, hidrofobicidade)

FIGURA 1

Mecanismo de Separação Teórico , Separação CZE

Petição 870210022468, de 09/03/2021, pág. 123/138 ,

,

Ligante +CD3 ,

, 2/16

,

Absorbância e ,

, Nenhum Ligante

,

Tempo (min)

FIGURA 2

Estratégia inicial: Empregar um ensaio de CZE de heterogeneidade de carga bem caracterizado e robusto usado em toda a indústria

Adicione o Peptídeo B, um peptídeo 15-mer, ao frasco de amostra

,

,

,

mAb + peptídeo mAb–peptídeo , Peptídeo HD aB + B

, Peptídeo BsAb + B

HD aB ,

,

, , , , , , , , , ,

mAb: a dissociação do peptídeo ocorre durante a separação

FIGURA 3

Ligante B

Petição 870210022468, de 09/03/2021, pág. 125/138 , Excipiente Ligante HD , Ant-CD3 +CD3 , ,

, Ligante BsAb + CD3 , , 4/16

, HD Anti-CD3 , ,

, ,

, , , , , , , , ,

FIGURA 4

Carga Peptídeo Massa (Da) ,

Peptídeo , ,

, ,

, ,

, ,

, ,

FIGURA 5A

,

,

, 1% HD aB

,

,

, Peptídeo B

,

, , , , , , , , , , ,

FIGURA 5B

, Peptídeo Espécie-1 "Ligado" , Espécies "não ligadas"

Petição 870210022468, de 09/03/2021, pág. 127/138 , HD CD20 Não Covalente HD CD20 Covalente Agrupamento CD20 Pro-A ,

, Peptídeos Espécie-2 "Ligados" , HD aCD3 6/16

Agrupamento Pro-A ,

, Otimizado-50 uM CD3-E em BGE ,

, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,

FIGURA 6

, , ,

Petição 870210022468, de 09/03/2021, pág. 128/138 , , , , , , Homodímero aCD3 , , pH alto, 33°C , , , 7/16

, pH baixo , , , , Água , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,

FIGURA 7

(Zoom da região do HD) 0,5% de Spike do HD

Petição 870210022468, de 09/03/2021, pág. 129/138 +PS20, t=20 horas

+PS20, t=0 horas 8/16 t=20 horas t=0 horas

FIGURA 8

FIGURA 9

Espécie anti-CD3 ,

Petição 870210022468, de 09/03/2021, pág. 131/138 ,

,

, HD e Spike do Meio Anticorpo ,

, Spike de Meio Anticorpo aCD3 , 10/16

, Spike do HD aCD3 ,

,

,

, , , , , , , , , , , ,

FIGURA 10A

,

Petição 870210022468, de 09/03/2021, pág. 132/138 Padrão de Referência ,

1% de Spike do HD aCD3 , no Padrão de Referência

2% de Spike de Meio Anticorpo aCD3 , no Padrão de Referência

Absorbância (AU) 11/16

, 2% de Meio Anticorpo aCD3, 1% de Spike do HD aCD3 no Padrão de Referência

,

Tempo (min)

FIGURA 10B

Petição 870210022468, de 09/03/2021, pág. 133/138 HD aCD3

Sem BsAb HD aCD20

HD aCD3 Sem BsAb

HD aCD3 12/16

HD aCD20 HD aCD20 1:1 ambos HDs Oligômero 1:1 ambos HDs

HD aCD20 HD aCD3

FIGURA 11

Petição 870210022468, de 09/03/2021, pág. 134/138 HD aCD3

HD aCD20 Sem BsAb

HD aCD3 Sem BsAb

HD aCD3 13/16

HD aCD20 HD aCD20 Sem formação 1:1 ambos HDs de oligômero 1:1 ambos HDs

FIGURA 12

,

Petição 870210022468, de 09/03/2021, pág. 135/138 , , , , HD aCD3 , HD "total" , aCD20 pH 3,5, 2M de ureia , , 14/16

HD aCD3 "livre" pH 7,5 , , , ,

, , , , , , , , , , , , , , ,

FIGURA 13

,

,

Petição 870210022468, de 09/03/2021, pág. 136/138 HD aCD3 , HAb aCD3 HD aCD20 HAb aCD3

Padrão de Calibração , (BsAB + 1% de HD aCD3)

Controle de Ensaio (BsAb) ,

Em branco 15/16

,

, , , , , , , , , , , , , ,

Condições da amostra: Eletrólito de fundo:

3 g/L em 50 mM de Formiato, 2M de ureia. 0,1% 400 mM de EACA, 2 mM de TETA, 0,05% de de PS20, 50 uM de Peptídeo B+E, pH 3,5 HPMC, 50 uM de Peptídeo B+E, pH 5,7

FIGURA 14

HD aCD3

,

, ％ de HD aCD3

,

,

, EM intacta

,

,

Dados Pt

HD aCD20 ％ de HD aCD20

EM intacta

Dados Pt

FIGURA 15